Las nanopartículas de magnetita (Fe3O4) han despertado un gran interés en el campo de la biotecnología

debido a su alta relación superficie/volumen, que puede utilizarse para anclar cantidades relativamente altas
de moléculas específicas, y porque pueden manipularse fácilmente utilizando un campo magnético externo,
debido a su alto momento magnético en comparación con otros óxidos de hierro. Se pueden sintetizar de
manera inorgánica utilizando diferentes procesos pero, generalmente, a altas temperaturas y presiones, lo
que implica altos costes de producción. Además, estas magnetitas producidas químicamente no suelen
presentar todas las características deseables (alta magnetización, tamaños y morfologías adecuadas,
biocompatibilidad o alta estabilidad química) para ciertas aplicaciones biomédicas. Las bacterias
magnetotácticas (MTB) sintetizan magnetosomas, compuestos de Fe3O4 monocristalino envuelto por una
membrana, mediante un estricto control genético en el que intervienen proteínas únicas llamadas proteínas
asociadas a magnetosomas (MAPs). Este proceso de biomineralización controlada (BCM) da como resultado
nanopartículas de magnetita con estructuras cristalinas perfectas, alta pureza química, morfologías alargadas
y una estrecha distribución de tamaños entre 30 y 120 nm, que hace que estos cristales sean de dominio
magnético único y, en consecuencia, la nanopartícula magnética ideal. Sin embargo, no es posible escalar a
nivel industrial el cultivo de MTB debido a sus exigentes condiciones nutricionales y su lento crecimiento, por
lo que los magnetosomas no pueden obtenerse en grandes cantidades. De hecho, este es el cuello de botella
para la aplicación de los magnetosomas en nanotecnología. En este contexto, una de las alternativas
propuestas es la biomimética, es decir, la producción in vitro de nanopartículas magnéticas similares a los
magnetosomas mediante la utilización de MAPs, dado que la interacción preferencial de MAPs con el cristal
de magnetita se ha sugerido para explicar las propiedades únicas de las magnetitas producidas por las MTB.
Sin embargo, todavía hay muchas incógnitas relacionadas con las estructuras y funciones de la mayoría de
las MAPs. Por lo tanto, desde un punto de vista biológico, así como para la aplicación práctica de estas
nanopartículas de magnetita biomiméticas (BMNPs), comprender este proceso de BCM, el único conocido
hasta ahora en el dominio Bacteria, representa un desafío de extraordinaria importancia. En este sentido, en
el Capítulo I de esta Tesis Doctoral, se estudian por primera vez las funciones combinadas de dos MAPs
diferentes, MamC y Mms6 de Magnetococcus marinus MC-1, para sintetizar magnetitas biomiméticas.
Nuestros resultados muestran que MamC y Mms6 tienen funciones diferentes, pero complementarias, en la
nucleación y el crecimiento de magnetita in vitro. MamC parece controlar la cinética de la nucleación de los
cristales, combinando efectos ionotrópicos y molde, mientras que Mms6 parece controlar preferiblemente la
cinética del crecimiento de los cristales al actuar como reservorio de Fe. El efecto combinado de estas MAPs
produce cristales bien facetados, de gran tamaño (30 ± 10 nm) y con mejores propiedades magnéticas que
las nanopartículas inorgánicas o producidas en presencia de sólo una de estas dos proteínas, indicado por
una mayor temperatura de bloqueo y, por tanto, un mayor momento magnético por partícula. Por tanto, estas
nuevas BMNPs con propiedades magnéticas mejoradas podrían ser potencialmente útiles en aplicaciones
nanotecnológicas.

Los capítulos II a V se centran en la evaluación in vitro (II, III, IV) e in vivo (V) de las BMNPs, producidas en
presencia de MamC, como potenciales nanoportadores para terapias antitumorales, ya que esta MAP había
sido previamente purificada y ampliamente estudiada por nuestro grupo. El capítulo II incluye la
caracterización fisicoquímica de estas BMNPS y su funcionalización con el fármaco quimioterapéutico
doxorrubicina (DOXO). Estas BMNPs se caracterizaron como nanopartículas superparamagnéticas (a 300 K)
de 30-40 nm, compuestas por ~95% en peso de magnetita y ~5% en peso de MamC, con un área superficial
específica de 90 m2/g. Además, los grupos funcionales de MamC expuestos en la superficie de la partícula
confieren a las partículas un punto isoeléctrico de 4.4 y, por tanto, una fuerte carga negativa a pH fisiológico
(pH 7.4). Esto permite su unión estable a moléculas cargadas positivamente a pH 7.4, como DOXO (DOXO-
BMNPs), en base a interacciones electrostáticas, siguiendo el modelo de Langmuir-Freundlich, que muestra
que la superficie de la magnetita es energéticamente heterogénea y exhibe una cooperatividad positiva. Por
el contrario, cuando el pH disminuye (pH 5), estas interacciones electrostáticas se debilitan y DOXO se libera
hasta ~35% de la cantidad inicialmente adsorbida en solo 4 horas. Además, estas BMNPs son cito y
hemocompatibles, mientras que DOXO-BMNPs muestran citotoxicidad en la línea celular de carcinoma
gástrico humano GTL-16 de una manera dependiente de la dosis. En el Capítulo III, el estudio in vitro de
DOXO-BMNPs, iniciado en el Capítulo II, se completó con la adsorción estable del anticuerpo monoclonal
(mAb) DO-24 en estos nanoensamblajes (DOXO-mAb-BMNPs). Este mAb reconoce el receptor Met/HGF
humano, sobreexpresado en muchos tipos de cáncer, por lo que su unión a DOXO-BMNPs proporciona un
sistema de quimioterapia dirigida. La adsorción de DOXO y/o el mAb no interfirió en las propiedades
magnéticas de las partículas, ya que los diferentes nanoensamblajes mostraron la misma temperatura de
bloqueo que las BMNPS. Por otro lado, DOXO-mAb-BMNPs reconocen selectivamente el receptor Met, se
unen eficientemente a las células tumorales Met+ y descargan DOXO en sus núcleos de manera más eficiente
que DOXO-BMNPs, ejerciendo citotoxicidad que, además, aumentó con la exposición celular a un gradiente
de campo magnético (GMF). Además, la liberación de DOXO a pH 5 (microambiente tumoral), ya analizada
en el Capítulo II, se combinó con un campo magnético alterno (AMF), lo cual produjo un aumento en la
liberación de DOXO por la hipertermia generada. Por lo tanto, estos datos representan un enfoque potencial
de doble transporte y liberación controlados (mediados por el mAb y magnético) y una terapia combinada
(quimioterapia e hipertermia).

Sin embargo, la evaluación de las interacciones de estos nanotransportadores con entornos biológicos es
imprescindible para su segura y eficiente aplicación in vivo. En este contexto, en el Capítulo IV se realizó una
investigación fundamental sobre la formación de proteínas corona (PC) alrededor de estos
nanotransportadores después de su incubación en plasma humano. Las BMNPs o DOXO-BMNPs se
sumergieron en plasma humano y se observó una cubierta de PC unida de manera estable (PC-BMNPs y PC-
DOXO-BMNPs). En particular, el fibrinógeno se detectó como la proteína plasmática más abundante en las
PC de las DOXO-BMNPs. Esto representa potenciales ventajas, en primer lugar, eliminar el exceso de
fibrinógeno plasmático que está involucrado en la resistencia a la quimioterapia y, en segundo lugar, proteger
a las partículas de la fagocitosis, prolongando así su tiempo de circulación. Además, la adsorción de PC a las
BMNPs no alteró las propiedades magnéticas de las partículas, redujo su polidispersidad y mejoró su
estabilidad coloidal, lo que redujo la toxicidad de las BMNPs en macrófagos humanos y mejoró su
internalización en diferentes líneas celulares. Estos datos representan un estudio preliminar sobre las
interacciones seguras y ventajosas que se producen entre las BMNPs/DOXO-BMNPs y el plasma humano,
que permitieron el diseño de los experimentos in vivo realizados en el Capítulo V. En este Capítulo se
evaluaron in vivo la orientación y concentración magnética de fármacos en sitios diana y la hipertermia
magnética producidas por las BMNPs o DOXO-BMNPs. Las BMNPs mostraron una alta biocompatibilidad sin
evidencia de alteraciones en los órganos. Bajo la influencia de un GMF, aumentó la internalización celular de
las BMNPs en cortos períodos de tiempo, permitiendo una acumulación más rápida de DOXO en los núcleos
de las células. Después de la inyección intravenosa de DOXO-BMNPs en ratones BALB/c con carcinomas
mamarios inducidos por células 4T1 y la aplicación de un GMF se acumuló una alta concentración de
nanopartículas en el tumor y el crecimiento tumoral se inhibió significativamente. Por otro lado, la inyección
de DOXO-BMNPs in situ en carcinomas mamarios 4T1 inducidos en ratones, junto con la aplicación de un
AMF, también provocó una disminución significativa del volumen tumoral mediada por la hipertermia producida
por las nanopartículas y el consecuente aumento de la liberación de DOXO, que fue más eficiente que en los
ratones solo tratados con DOXO soluble o con el AMF. En consecuencia, estos nanoportadores basados en
BMNPs son potencialmente efectivos para el tratamiento local del cáncer, consistente en la orientación
magnética de fármacos combinada con hipertermia magnética para aumentar su eficiencia.

Finalmente, en el Capítulo VI, se utilizaron nanopartículas magnéticas en el contexto de la nanorremediación

de aguas, diseñando un nuevo nanosistema magnético que combinara las ventajas del material magnético y
el utilizado como soporte. En particular, se produjo un nuevo material magnético híbrido compuesto por
nanopartículas magnéticas inorgánicas (MNPs) precipitadas en membranas de la cáscara de huevo (ESM),
abundantes desechos biológicos de la industria de procesamiento de alimentos, como adsorbente verde para
la preservación de los recursos naturales. Específicamente, se investigó la eliminación de metales pesados
de ambientes acuosos utilizando estas ESM magnéticas (MESM). Las fibras de la ESM, que actuaron como
una superficie activa para la nucleación de partículas, fueron decoradas con MNPs para facilitar su recolección
utilizando un campo magnético externo sin la necesidad de un tratamiento adicional. En este contexto, se
produjeron largas hebras de MNPs a lo largo de las fibras de la ESM en presencia de un campo magnético,
mientras que en su ausencia se formaron aglomerados de partículas más pequeñas con una disposición
aleatoria. Las MESMs presentaron gran capacidad para mejorar la eliminación de Pb de agua contaminada,
mostrando un efecto sinérgico entre las MNPs y la ESM en la adsorción Pb. Sin embargo, la interacción con
Pb fue mucho mayor para las MNPs de MESM, lo que aumentó la eficiencia de eliminación más de 10 veces
en comparación con la del componente ESM solo. Estos resultados sugieren que las MESMs podrían utilizarse
como agentes de nanorremediación eficientes en la separación/eliminación de iones de metales pesados u
otros contaminantes en aguas contaminadas, siendo fácilmente recuperables magnéticamente y reutilizables.