FACULTAD DE VETERINARIA

MÁSTER EN VIROLOGÍA

TRABAJO DE FIN DE MÁSTER

Diseño y caracterización de aptámeros para el diagnóstico

precoz del VIH

Autora: Ana Valadés Alcaraz

Tutora: África Holguín Fernández

Curso 2019-2020
 FACULTAD DE VETERINARIA

MÁSTER EN VIROLOGÍA

TRABAJO DE FIN DE MÁSTER

Diseño y caracterización de aptámeros para el diagnóstico

precoz del VIH.

Realizado en el Laboratorio de Epidemiología Molecular del VIH-1

(Servicio de Microbiología y Parasitología) del Instituto Ramón y Cajal de
Investigación Sanitaria (IRYCIS) en el Hospital Universitario Ramón y
Cajal de Madrid.

Autora: Ana Valadés Alcaraz. Tutora: África Holguín Fernández

Curso 2019-2020
 AGRADECIMIENTOS

Después de acabar el Trabajo Fin de Grado y aventurarme en este nuevo

capítulo de mi vida, sigo teniendo que dar las GRACIAS a muchas personas que me
han acompañado en este camino.

Gracias a la Dra. África Holguín Fernández, por seguir teniéndome a su lado en

su laboratorio y por transmitirme que, cambiando el punto de vista, un problema se
convierte en un reto. Gracias a todo el equipo "Epimol", miembros del laboratorio,
sobre todo a Ana R. Galet y Marina Rubio Garrido, con quienes he trabajado día a día
viviendo momentos de estrés, pero sobretodo muchos momentos de alegría. Gracias
a Roberto Reinosa, creador del programa bioinformático empleado en este trabajo y a
toda la Unidad de Aptámeros, en concreto a Mª Elena Martín, Victor Manuel González,
Miriam Barragán y Marta García, quienes me han enseñado y guiado en todos los
ensayos que tuvieran que ver con los aptámeros. Gracias a la Fundación IRYCIS del
Hospital Ramón y Cajal por permitirme volver al Laboratorio después del confinamiento
por el coronavirus. Gracias a la Fundación Alonso por donar una generosa cantidad
de dinero para poder realizar este proyecto.

Gracias a mis profesores del Máster de Virología, en especial a la coordinadora

María Isabel Simarro, que con su ayuda hizo posible mi vuelta al Laboratorio después
del confinamiento. Gracias a mis compañeros del máster, por las horas de trabajos y
por compartir risas y unas cuantas quedadas de cañas y Fanta de naranja.

Sigo dando las Gracias a todos mis profesores del colegio y la carrera, en
especial a Teresa Ruano por hacer que me interesaran las Matemáticas y la Biología,
y a Manuel H. Cutuli, que hizo que me apasionara la Microbiología. Gracias a mis
amigas, sobre todo a Carmen Sánchez Pérez, a quien considero mi hermana y que, a
pesar de la distancia, hemos seguido apoyándonos en todo mutuamente; a Raquel
López, por nuestra vida paralela en ACNH y nuestro amor a Disney y el chocolate, y a
Cristina Martínez Pindado por descubrirme series, las sagas de Sarah J. Maas y por
los momentos de risa infinita. Gracias a mi amor, Álvaro G. Valor, por transmitirme
que las cosas suceden por algo y que todo trabajo tiene su recompensa.

Por último, y más importante, Gracias a mi familia, en especial a mis padres Ana
Isabel Alcaraz y Manuel Valadés, por su amor, sus valores, su esfuerzo y la educación
que me han dado.

Mil gracias a todos vosotros y a los que hoy ya faltan.

 ÍNDICE DE CONTENIDOS

ABREVIATURAS .......................................................................................................... I
RESUMEN................................................................................................................... III
ABSTRACT .................................................................................................................IV
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1
1.1. ORIGEN Y EPIDEMIOLOGÍA DEL VIH. ............................................................. 1
1.2. CLASIFICACIÓN DEL VIH. ................................................................................ 2
1.3. ESTRUCTURA Y GENOMA DEL VIH. ............................................................... 3
1.4. CICLO REPLICATIVO. ....................................................................................... 3
1.5. PROTEÍNA TRANSMEMBRANA DE LA ENVUELTA DEL VIH-1/VIH-2:
GP41/GP36. .............................................................................................................. 5
1.6. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DEL VIH................................. 6
1.7. APTÁMEROS. .................................................................................................... 8
2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .............................................................................. 8
3. MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................... 9
3.1. FASES DEL PROYECTO. .................................................................................. 9
3.2. FASE 1: DESCARGA, ALINEAMIENTO Y TRADUCCIÓN DE LAS
SECUENCIAS DE LAS PROTEÍNAS GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-2). ....................... 9
3.3. FASE 2: CONSERVACIÓN DE LAS PROTEÍNAS GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-
2)............................................................................................................................. 10
3.4. FASE 3: ELECCIÓN DE PÉPTIDOS CONSERVADOS EXPUESTOS. ............ 11
3.5. FASE 4: SELECCIÓN DE APTÁMEROS: SELEX Y ELONA. ........................... 12
3.6. FASE 5: CARACTERIZACIÓN DE APTÁMEROS MEDIANTE ENSAYOS
ELONA. ................................................................................................................... 14
3.7. FASE 6: ELONA SANDWICH CON MUESTRAS DE SANGRE SECA VIH
NEGATIVAS............................................................................................................ 15
3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS. ............................................................................. 16
4. RESULTADOS ....................................................................................................... 16
4.1. FASE 1: SECUENCIAS ANALIZADAS. ............................................................ 16
4.2. FASE 2: CONSERVACIÓN DE GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-2). ....................... 17
4.2.1. Conservación de GP41 (VIH-1) y GP36 (VIH-2) entre variantes. ............... 17
4.2.2. Conservación de la estructura secundaria de la proteína Gp41 (VIH-1). .... 20
4.3. FASE 3: PÉPTIDOS CONSERVADOS, EXPUESTOS Y SOLUBLES DE GP41
Y GP36 PARA LA SELECCIÓN DE APTÁMEROS. ................................................ 20
4.4. FASE 4: SELECCIÓN DE APTÁMEROS DE GP41/GP36 POR ENSAYOS
ELONA .................................................................................................................... 24
4.5. FASE 5: CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LOS APTÁMEROS FRENTE A
LAS PROTEÍNAS PR, RT E IN DEL VIH. ................................................................ 24
 4.5.1 Afinidad ....................................................................................................... 25
4.5.2 Sensibilidad ................................................................................................ 26
4.5.3 Especificidad............................................................................................... 27
4.5.4 Mejor combinación de aptámeros ............................................................... 27
4.6. FASE 6: EFICACIA PRELIMINAR DIAGNÓSTICA DE LOS APTÁMEROS. ..... 28
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 30
6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 34
7. CONCLUSIONS ..................................................................................................... 35
8. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 36
9. APÉNDICES ........................................................................................................... 40
Apéndice 1.1. Localización de anticuerpos humanos sobre la secuencia y dominios
de Gp41 .................................................................................................................. 40
Apéndice 3.1. Proceso SELEX detallado ............................................................... 41
Apéndice 3.2. Ensayo ELONA de las rondas 3 y 6 detallado ................................. 42
Apéndice 3.3. Esquema del ELONA de afinidad de RT del VIH-1 .......................... 43
Apéndice 3.4. Esquema del ELONA de sensibilidad y especificidad de PR
VIH-1. ...................................................................................................................... 43
Apéndice 3.5. ELONA Sandwich y esquema con las diferentes combinaciones de
aptámeros frente a la PR VIH-1............................................................................... 44
Apéndice 3.6. ELONA Sandwich empleando aptámeros frente a la PR del VIH-1 y
muestras DBS lisadas con dos tampones de lisis ................................................... 45
Apéndice 4.1. Aptámeros disponibles en el laboratorio previos a este TFM ........... 46
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Personas que viven con VIH a nivel global................................................. 1

Figura 1.2. Clasificación del VIH. ................................................................................. 2
Figura 1.3. Estructura (A) y genoma (B) del VIH .......................................................... 4
Figura 1.4. Ciclo biológico del VIH ............................................................................... 4
Figura 1.5. Dominios de la proteína Gp41 (A) y su estructura 3D (B) ........................... 5
Figura 1.6. Evolución de los test diagnósticos de VIH. ................................................. 7
Figura 1.7. Estructura de un aptámero ......................................................................... 8
Figura 3.1. Fases del proyecto inicial planteado......................................................... 10
Figura 3.2. Proceso SELEX con una proteína ............................................................ 12
Figura 3.3. Esquema de un ensayo ELONA ............................................................... 14
Figura 3.4. Esquema del ELONA Sandwich. .............................................................. 15
Figura 4.1. Conservación de los cuatro grupos del VIH-1 en la proteína Gp41 .......... 21
Figura 4.2. Conservación de cada dominio de la estructura secundaria de la proteína
Gp41 (VIH-1) (A) y conservación media entre los cuatro grupos de VIH-1 (B) ............ 22
Figura 4.3. ELONA de las rondas 3 y 6 del SELEX en placa (A) y de la ronda 3 del
SELEX en resina (B) de los péptidos GP41.1 y GP41.3 ............................................. 24
Figura 4.4. Afinidad de los aptámeros frente a las proteínas PR (A), IN (B) y RT (C) del
VIH-1 .......................................................................................................................... 26
Figura 4.5. Sensibilidad de los aptámeros AptGI6.1F y AptGI6.16F frente a la PR del
VIH-1 .......................................................................................................................... 27
Figura 4.6. Combinaciones de aptámeros de PR del VIH-1 en un ELONA
Sandwich .................................................................................................................... 28
Figura 4.7. Análisis preliminar mediante ELONA Sandwich de la eficacia diagnóstica de
los dos aptámeros frente a la PR del VIH-1 empleando DBS de pacientes VIH negativos
en distintas condiciones .............................................................................................. 29
Figura 5.1. Estado del desarrollo de las fases del proyecto de investigación en el que
se integra este TFM .................................................................................................... 30

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 4.1. Secuencias de Gp41/Gp36 empleadas en este estudio ............................. 18

Tabla 4.2. Número y porcentaje de aa altamente conservados (≥90% y 100%) por
variante del VIH-1 y VIH-2 .......................................................................................... 19
Tabla 4.3. Características de los péptidos conservados de Gp41 (VIH-1) y Gp36
(VIH-2) ........................................................................................................................ 23
 ABREVIATURAS

aa Aminoácido
ADN Ácido desoxirribunocleico
ARN Ácido ribunocleico
ARNm ARN mensajero
ARV Antirretroviral
Bma Tampón o buffer de lisis MA1
Bn Tampón o buffer de lisis Nuclisens EasyMag
C-HR C-terminal heptad-repeat o región hepta-helicoidal C-terminal.
CRF Circulant recombinant forms o formas recombinantes circulantes
CN Control negativo
CP Control positivo
CT Extremo C-terminal intraviral
DBS Dried blood specimens o muestras de sangre seca
dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato
ELONA Enzyme-linked oligonucleotide assays
EpiMolVIH Laboratorio de Epidemiología Molecular del VIH
FP Péptido de fusión
FPPR Región próxima al péptido de fusión
IL Immune-dominant linker o region de unión inmunodominante
IN Integrasa
IRYCIS Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria
LANL Los Alamos National Laboratory
LTR Long terminal repeat o repetición terminal larga
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
min Minutos
MPER Región de membrana proximal externa
MUSCLE Multiple Sequence Comparision by Log Expectation
N-HR N-terminal heptad-repeat o región hepta-helicoidal N-terminal
NIH National Institute of Health
nt Nucleótido
OMS Organización Mundial de la Salud
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDB Protein Data Bank o base de datos de proteínas
PR Proteasa

I
qPCR Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real
RT Retrotranscriptasa
seg Segundos
T-20 Enfuvirtida
TAE Tampón tris-acetato-EDTA
TAR Tratamiento antirretroviral
TFM Trabajo fin de máster
TM Región transmembrana
URF Unique recombinant forms o formas recombinantes únicas
SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana

Aminoácidos:

A Alanina
C Cisteína
D Ácido aspártico
E Ácido glutámico
F Fenilalanina
G Glicina
H Histidina
I Isoleucina
K Lisina
L Leucina
M Metionina
N Asparagina
P Prolina
Q Glutamina
R Arginina
S Serina
T Treonina
V Valina
W Triptófano
Y Tirosina

II
 RESUMEN

El diagnóstico del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tiene un periodo

ventana de dos semanas utilizando pruebas moleculares. En este trabajo se empleó
una nueva tecnología molecular basada en aptámeros, más barata y sencilla que las
anteriores. Primero se analizó la conservación de las proteínas Gp41 (VIH-1) y Gp36
(VIH-2) con un nuevo programa bioinformático desarrollado en el laboratorio
(EpiMolVIH), que permitió escoger 10 péptidos altamente conservados entre variantes
del VIH para seleccionar aptámeros específicos (método SELEX). Posteriormente se
realizó la caracterización de la sensibilidad, especificidad y mejor combinación de dos
aptámeros previamente seleccionados en EpiMolVIH frente a la proteasa (PR) del VIH
(AptGI6.1F and AptGI6.1F) y un análisis preliminar de su eficacia diagnóstica empleando
muestras de sangre seca mediante distintos ensayos ELONA. Se observó que Gp36
estaba más conservada que Gp41, difiriendo su conservación entre variantes y
dominios. Además, se identificaron los dominios de Gp41 más conservados. Asimismo,
se caracterizaron los dos aptámeros seleccionados frente a la PR, presentando
AptGI6.1F la mayor sensibilidad. Las mejores combinaciones de aptámeros en ELONA
Sandwich incluyeron AptGI6.1F como aptámero detector. Por último, se observó que los
tampones de lisis empleados en las muestras interferían en la detección de PR en los
ELONA.

Palabras clave: VIH, glicoproteína transmembrana (Gp41), conservación, aptámeros y

ensayo ELONA.

III
 ABSTRACT

Human immunodeficiency virus (HIV) diagnosis has a window period of two weeks
after using molecular tests. In this project, a new, cheaper and simpler aptamer-based
molecular technology was used. Firstly, the conservation of Gp41 (HIV-1) and Gp36
(HIV-2) proteins was analyzed with a new bioinformatics program developed in the
laboratory (EpiMolVIH), which allowed the selection of 10 highly conserved peptides
across HIV-variants for aptamers selection (SELEX method). Later, sensitivity, specificity
and the best combination of two aptamers against HIV protease (PR) previously
available in EpiMolVIH (AptGI6.1F and AptGI6.1F) were studied by different ELONA
assays and a preliminary analysis of their diagnostic efficacy using dried blood samples
was performed. Results shown that Gp36 was more conserved than Gp41, and the
conservation differed between variants and Gp41-domains. The most conserved Gp41
domains were also identified. Moreover, the two available aptamers against HIV-1 PR
were characterized, AptGI6.1F presenting the highest sensitivity. The best aptamer
combinations in ELONA Sandwich included AptGI6.1F as detector aptamer. Finally, it
was detected that lysis buffers used in samples interfered with the PR detection in
ELONA.

Key words: HIV, transmembrane glycoprotein (Gp41), conservation, aptamers and

ELONA assay.

IV
 1. INTRODUCCIÓN

1.1. ORIGEN Y EPIDEMIOLOGÍA DEL VIH.

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del síndrome

de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y se describió por primera vez en 1983 (Barré-
Sinoussi et al., 1983). Es un lentivirus perteneciente a la familia Retroviridae,
caracterizada por poseer una enzima, retrotranscriptasa (RT), que tiene como función
transcribir el ácido ribonucleico (ARN) en ácido desoxirribonucleico (ADN) proviral, el
cual se insertará en el genoma de la célula infectada (Murphy et al., 1995).
Aproximadamente 38 millones de personas viven con VIH en el mundo. En 2019
hubo un total de 1,7 millones de nuevos infectados y 690.000 muertes relacionadas con
SIDA a nivel global, siendo el este y sur de África las regiones con más infectados
(Figura 1.1) (UNAIDS, 2020). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció
para el 2020 el objetivo 90:90:90, que consistía en conseguir que el 90% de la población
con VIH supiese que estaba infectada, que el 90% de las personas infectadas estuviese
en tratamiento antirretroviral (TAR) y que el 90% de las personas tratadas tuvieran una
carga viral o viremia controlada y suprimida. Actualmente se ha establecido un nuevo
objetivo para el 2030, pasando del 90:90:90 al 95:95:95 (https://www.unaids.org/es/
keywords/data-0).

Figura 1.1. Personas que viven con VIH a nivel global. Tomada de https://aidsinfo.unaids.org.

1
1.2. CLASIFICACIÓN DEL VIH.

El VIH se ha clasificado en dos tipos: tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2). El VIH-1 se

identificó en 1983 y causa la mayoría de las infecciones (Barré-Sinoussi et al., 1983). El
VIH-2 se identificó en 1986, es menos patogénico que el VIH-1 y más cercano
filogenéticamente al virus de la inmunodeficiencia del simio (Clavel et al., 1986). El VIH-
1 se clasifica en cuatro grandes grupos: M (main), O (outlier), N (no-M, no-O) y P
(Plantier et al., 2009). Los grupos O, N y P tienen baja prevalencia y está restringida a
África subsahariana, occidental y central. El grupo M se ha expandido desde África al
resto de los continentes, causando el 99% de las infecciones globales (Hemelaar et al,
2019). En base a su homología genética, los virus del grupo M se han clasificado en 10
subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J, K, L), 8 sub-subtipos (A1, A2, A3, A4, A5, A6, F1, F2)
(Robertson et al., 2000; Salminen, 2000; Leitner et al., 2005; Yamaguchi et al., 2019) y
en múltiples recombinantes entre subtipos, incluyendo 102 formas recombinantes
circulantes (CRF, Circulating Recombinant Forms) (https://www.hiv.lanl.gov/content/
sequence/HIV/CRFs/CRFs.html) e innumerables formas recombinantes únicas (URF,
Unique Recombinant Forms) (Figura 1.2). Para definir un nuevo subtipo o CRF, su
secuencia completa se debe identificar en tres o más pacientes no relacionados
epidemiológicamente. Los URF se encuentran en individuos aislados o en grupos de
personas relacionadas epidemiológicamente. El subtipo B del VIH-1 es el mayoritario en
América del Norte y Europa occidental mientras que el resto de los subtipos (subtipos
no-B) y recombinantes (CRF y URF) predominan en países con mayores tasas de
infección, causando cerca del 90% de los 38 millones de infecciones a nivel mundial
(Hemelaar et al, 2019). El VIH-2 se ha clasificado en 9 grupos (A-I) y 2 recombinantes
(CRF01_AB y URF), siendo los grupos A y B los mayoritarios (Figura 1.2) (Visseaux et
al., 2016).

Figura 1.2. Clasificación del VIH. CRF, formas recombinantes circulantes y URF, formas
recombinantes únicas.

2
1.3. ESTRUCTURA Y GENOMA DEL VIH.

El VIH es un virus esférico con un diámetro aproximado de 100nm. Presenta un

núcleo cónico característico y una bicapa lipídica obtenida de la membrana de la célula
infectada. En esta membrana se encuentran dos glicoproteínas de la envuelta del virión
denominadas Gp41 y Gp120. En la cara interna de la membrana se encuentra la matriz
formada por la proteína P17 y una cápside viral cónica formada por la proteína P24.
Esta cápside encierra las dos copias de ARN que conforman el genoma del virión, cada
una de 10.000 nucleótidos (nts) aproximadamente, que están estabilizadas en forma de
ribonucleoproteína gracias a la proteína de la nucleocápside. (Figura 1.3A).
El genoma del VIH cuenta con los genes típicos de los retrovirus: gag, pol y env. El
gen gag codifica las proteínas estructurales del virus que darán lugar a la nucleocápside,
la cápside y la matriz, entre otras. El gen pol codifica la proteasa (PR), RT e integrasa
(IN), enzimas esenciales en su ciclo biológico. La RT está implicada en transcribir el
ARN viral en ADN proviral, la IN integra ese ADN en el genoma de la célula infectada y
la PR se encarga del proceso de maduración del virus que ha salido de la célula
infectada por gemación. Por ello, estas proteínas son las principales dianas de los
fármacos antirretrovirales (ARV) en uso terapéutico. El gen env codifica las proteínas de
la envuelta Gp41 y Gp120, que participan en la entrada del virus en la célula. Además,
el VIH cuenta con 6 genes reguladores: tat, rev, nef, vif, vpr y vpu (vpx en el caso de
VIH-2). Por último, también presenta repeticiones terminales largas (LTR, Long Terminal
Repeats) en los extremos 5’ y 3’, que contienen múltiples sitios de unión a factores de
transcripción, son necesarias para que el material genético viral se integre en el genoma
de la célula infectada y para estimular la transcripción basal (Figura 1.3B) (Muesing et
al., 1985).

1.4. CICLO REPLICATIVO.

El ciclo replicativo del VIH se puede dividir en dos etapas: temprana y tardía. En la
etapa temprana, el virus penetra en la célula huésped, se desencapsida, se
retrotranscribe, y se integra en el genoma de la célula huésped. Tras la integración, el
VIH puede permanecer latente o puede comenzar la fase tardía, transcribiéndose el
genoma viral integrado y sintetizándose más copias del genoma vírico junto con los ARN
mensajeros (ARNm) virales, los cuáles dan lugar a poliproteínas y proteínas esenciales
del VIH empleando la maquinaria celular. Tras su procesamiento, ocurre el ensamblaje
posterior de las partículas víricas, su liberación y la maduración final del virus fuera de
la célula gracias a la PR viral (Figura 1.4) (Alcamí y Coiras, 2011).

3
A

Figura 1.3. Estructura (A) y genoma (B) del VIH. Figura adaptada de German Advisory
Committee Blood, 2016 (A) y de Foley et al., 2018 (B).

Figura 1.4. Ciclo biológico del VIH. Figura adaptada de Shattock y Rosenberg, 2012.

4
1.5. PROTEÍNA TRANSMEMBRANA DE LA ENVUELTA DEL VIH-1/VIH-2:
GP41/GP36.

La proteína Gp41/Gp36 es una glicoproteína que se localiza en la membrana del

virión del VIH-1/VIH-2 en forma de trímeros junto con la glicoproteína Gp120/Gp105.
Tiene como función fusionar la membrana del virión con la membrana de la célula
huésped, permitiendo la entrada del material genético y las proteínas internas del virus
en la célula. Consta de 345 (Gp41) o 351 (Gp36) aminoácidos (aa), que en VIH-1 se
pueden dividir en diferentes dominios (Figura 1.5A). Entre ellos, está el dominio del
péptido de fusión (FP), necesario para unirse a la membrana de la célula; la región
próxima al péptido de fusión (FPPR), dos regiones de repeticiones hepta-helicoidales
N-HR (N-terminal heptad repeat o región hepta-helicoidal N-terminal) y C-HR (C-terminal
heptad repeat o región hepta-helicoidal C-terminal), entre las se encuentra la región IL
(immune-dominant linker o región de unión inmunodomiante), que es más móvil que las
regiones hepta-helicoidales y que contiene un puente disulfuro (Figura 1.5B). También
incluye una región de membrana proximal externa (MPER), que es una buena diana
para fármacos ARV como la enfuvirtida (T-20) e inmunógenos, ya que contiene epítopos
a los que se pueden unir anticuerpos neutralizantes de amplio espectro como por
ejemplo son el 2F5, 4E10, Z13 y 10E8 (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/
maps/ab/gp160.html) (Apéndice 1.1). Además, presentan una región transmembrana
(TM) y un extremo C-terminal (CT) intraviral. Estas dos últimas regiones carecen de
anticuerpos conocidos dirigidos a ellas al no estar expuestas y encontrarse en la
membrana e interior del virus.
A

Puente
disulfuro

Figura 1.5. Dominios de la proteína Gp41 (A) y su estructura 3D (B). (A) Tomada de Louis et
al., 2016. En negro, el número de aa y en rojo la posición de aa en la secuencia de referencia
HXB2 (subtipo B, nº de acceso del GenBank K03455). (B) Los colores azul, amarillo y verde
representan los tres monómeros de la proteína Gp41 (referencia: 6OLP de la base de datos PDB
https://www.rcsb.org) que conforman el trímero. FP, péptido de fusión; FPPR, región próxima al
péptido de fusión; N-HR, región hepta-helicoidal N-terminal; IL, región de unión
inmunodominante; C-HR, región hepta-helicoidal C-terminal; MPER, región de membrana
proximal externa.

5
1.6. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DEL VIH.

El diagnóstico del VIH ha evolucionado mucho a lo largo de los años (Figura 1.6).
Las pruebas serológicas del VIH se usan generalmente para el diagnóstico del virus en
adultos y en niños mayores de 18 meses (WHO, 2016). Se basan en una prueba de
cribado (screening) inicial serológica (inmunoensayo de 4ª o 5ª generación) que permite
detectar anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 y la proteína de la cápside del VIH-1
(antígeno P24). P24 es la primera proteína del virus que aparece en sangre y su
detección ayuda a reducir el periodo ventana (tiempo entre la infección y la aparición de
anticuerpos o seroconversión), que suele ser en torno a 21 días. La diferencia entre
ambos ensayos diagnósticos serológicos es que en los ensayos de 4ª generación se
obtiene un único resultado, sin diferenciar si ha sido positivo por la unión de los
anticuerpos o del antígeno P24, mientras que en los ensayos de 5ª generación sí hace
esta distinción, permitiendo establecer la etapa de infección en la que se encuentra el
paciente (Alexander, 2016). El diagnóstico serológico positivo requiere la realización de
una prueba de cribado positiva que siempre ha de ser confirmada, siendo la más
extendida el inmunoblot o electrotransferencia (Western Blot). Ésta permite discriminar
entre las especificidades de reactividad de anticuerpos frente a distintas proteínas del
virus. Para el diagnóstico de la infección por VIH mediante transmisión vertical en niños
menores de 18 meses, las técnicas serológicas convencionales no deben emplearse ya
que los anticuerpos específicos frente al VIH transferidos por vía placentaria por su
madre pueden interferir en la interpretación del resultado y dar falsos positivos (WHO,
2010).
Actualmente podemos reducir el periodo ventana para la detección del virus a cerca
de 2 semanas gracias a los nuevos ensayos moleculares que detectan el genoma viral
y que están basados en la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (qPCR),
más caros y complejos que los ensayos serológicos. Sin embargo, se sigue buscando
la manera de acortar más este periodo para diagnosticar lo más precozmente al paciente
y así poder empezar el TAR lo antes posible para preservar su sistema inmune y
disminuir la cantidad de virus en sangre, que es muy alta durante la primoinfección. Así
se evitaría que en ese tiempo el paciente VIH positivo infectara a sus parejas sexuales
por desconocer que está infectado, permitiéndole tomar medidas preventivas.
Las qPCR actuales son el método más sensible para el diagnóstico, aunque no se
realizan de manera rutinaria en adultos y niños mayores de 18 meses por su mayor
coste y complejidad con respecto a las pruebas serológicas. Además, requieren
laboratorios especializados, cadena de frío, y personal capacitado, lo que limita su
implementación durante la rutina clínica en países con infraestructuras limitadas.

6
Asimismo, pueden generar falsos positivos en el diagnóstico por la manipulación y
amplificación del genoma viral o generar falsos negativos por variabilidad genética del
VIH en zonas virales que hibridan con cebadores y/o sondas del qPCR diagnóstico.
Por tanto, se necesitan nuevas herramientas moleculares que detecten al virus lo
antes posible para detectar infecciones agudas durante las dos primeras semanas de
infección. Una estrategia interesante es sustituir el diagnóstico precoz del VIH basado
en la detección de anticuerpos (pruebas serológicas) o detección del genoma viral
(prueba molecular qPCR), por otro tipo de prueba molecular basada en la detección de
péptidos de proteínas del VIH que estén altamente conservados entre las diferentes
variantes del virus. Para ello, se podría basar en la tecnología de aptámeros que se
explica a continuación.

Figura 1.6. Evolución de los test diagnósticos de VIH. Adaptada de Alexander, 2016.

7
1.7. APTÁMEROS.

Los aptámeros son oligonucleótidos de cadena sencilla (ARN o ADN) o moléculas

peptídicas que son capaces de unirse a una molécula diana con alta especificidad y
afinidad debido a su específica estructura tridimensional. Los aptámeros
oligonucleotídicos comprenden tamaños de entre 70 y 100 nts, que constan de una
región central de tamaño variable (30-60 nts) y secuencia aleatoria que es flanqueada
por regiones de secuencia conocida para su amplificación por PCR (Figura 1.7). Son
una alternativa a los anticuerpos monoclonales, tanto en el ámbito diagnóstico por su
aplicación como sensores moleculares, como en el ámbito terapéutico, ya que son
capaces de interferir en las funciones biológicas de las moléculas diana. Sus ventajas
frente a los anticuerpos son tener una producción sencilla y menos costosa, su
capacidad de ser modificados para aumentar su estabilidad, poder desnaturalizarse y
utilizarse repetidamente, y no ser inmunogénicos. Desde que en los años 80 se
descubrió que ciertos ácidos nucleicos del VIH y de adenovirus eran capaces de unirse
a ciertas proteínas (Sullenger et al., 1990), se han seleccionado aptámeros frente a
diversas proteínas del VIH, principalmente Gp120, RT e IN, entre otras. Sin embargo, la
mayoría de los estudios de aptámeros del VIH tienen como objetivo principal el
tratamiento y no existe en la actualidad ningún ensayo diagnóstico en el mercado
basado en aptámeros (Bala et al., 2018).

Figura 1.7. Estructura de un aptámero. Nts, nucleótidos.

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

La realización de este trabajo se basa en la tecnología de los aptámeros para intentar

reducir el periodo ventana de las técnicas de diagnóstico molecular actuales, así como
su coste y dificultad experimental. Se eligió la glicoproteína transmembrana como diana
de los aptámeros al ser esencial en el ciclo biológico del virus, permitiendo la entrada
del virión en la célula huésped. Esto la convierte en una buena diana diagnóstica y
terapéutica. Además, no hay estudios actuales sobre la conservación de esta proteína
que incluyan todas las variantes del VIH-1 y VIH-2. Por ello, los objetivos propuestos
para este trabajo fueron los siguientes:
8
 1. Análisis del grado de conservación de la proteína Gp41/Gp36 entre las variantes
del VIH-1/VIH-2 para la identificación de péptidos altamente conservados y expuestos,
empleando un nuevo programa bioinformático desarrollado en el laboratorio (programa
EpimolVIH) con el fin de seleccionar aptámeros frente a estas proteínas.
2. Seleccionar aptámeros específicos del VIH-1, del VIH-2 y comunes a ambos
virus, capaces de reconocer y unirse a las proteínas Gp41/Gp36.
3. Caracterizar la afinidad, sensibilidad, especificidad y mejor combinación de los
aptámeros seleccionados dirigidos a Gp41/Gp36 y de otros ya seleccionados frente a la
PR, RT e IN viral mediante distintos ensayos ELONA.
4. Evaluación inicial de la eficacia diagnóstica de los mejores aptámeros
seleccionados con distintos paneles de muestras de pacientes VIH negativos y positivos.

Aunque estos eran los objetivos iniciales planteados en este Trabajo Fin de Máster
(TFM), debido al confinamiento y a la parada de la parte experimental, se pudieron
cumplir los objetivos 1 y 2, parcialmente el objetivo 3 y se pudo realizar un primer ensayo
del 4.

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. FASES DEL PROYECTO.

Para lograr los objetivos indicados, se plantearon distintas fases en las que dividir el
trabajo a realizar durante el proyecto (Figura 3.1).

3.2. FASE 1: DESCARGA, ALINEAMIENTO Y TRADUCCIÓN DE LAS SECUENCIAS

DE LAS PROTEÍNAS GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-2).

Entre octubre y noviembre de 2019 se descargaron de la base de datos Los Alamos

National Laboratory (LANL, https://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/search/
search.html) las secuencias de nts de la región codificante de las proteínas Gp41 (VIH-
1) y Gp36 (VIH-2) disponibles de todas las variantes del VIH (tipos, grupos, subtipos,
sub-subtipos y CRF). Las secuencias de los URF no se incluyeron en el estudio. Se
realizó un filtro escogiendo una secuencia por paciente y todas las secuencias
seleccionadas se agruparon por variante en diferentes archivos .fasta. Utilizando el
programa MEGA v6.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis: https://www.
megasoftware.net/) se alinearon las secuencias con la función MUSCLE (Multiple

9
Sequence Comparision by Log Expectation) con respecto a la secuencia de referencia
del VIH-1 (aislado HXB2, subtipo B, número de acceso del GenBank K03455) o del VIH-
2 (aislado BEN, subtipo A, número acceso del GenBank M30502), eliminando las
inserciones. Las secuencias de nts de Gp41 del VIH-1 se recortaron quitando la región
TM y CT debido a que no están expuestas y, por tanto, no serían regiones interesantes
desde un punto de vista diagnóstico. De esta manera, tras traducir las secuencias a aa,
quedaron 172 aa de Gp41 (VIH-1) y 351 aa de Gp36 (VIH-2), ya que en VIH-2 no se ha
establecido cuántos aa abarcan cada dominio. Las secuencias de aa se guardaron en
archivos .fasta manteniendo la división de grupos, subtipos, sub-subtipos y CRF. Las
secuencias con codones de parada en posiciones inusuales se eliminaron y se
excluyeron los grupos, subtipos, sub-subtipos y CRF con menos de cinco secuencias
para el estudio de conservación, excepto el grupo P, por ser necesario para establecer
el consenso de conservación del VIH-1.

Figura 3.1. Fases del proyecto inicial planteado.

3.3. FASE 2: CONSERVACIÓN DE LAS PROTEÍNAS GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-2).

Los archivos .fasta generados en el paso anterior se introdujeron en una nueva

herramienta bioinformática (programa EpiMolVIH) desarrollado en Java y diseñado por
un colaborador del laboratorio, Roberto Reinosa Fernández. Esta herramienta
bioinformática permite el estudio de la variabilidad genética del VIH empleando
secuencias del VIH-1 y VIH-2 en formato .fasta a nivel de nts o aa, permitiendo analizar
a la vez miles de archivos .fasta que pueden contener un número ilimitado de

10
secuencias, habiendo comprobado que puede analizar 100.000. El programa EpiMolVIH
es capaz de: (1) filtrar y separar las secuencias descargadas en diferentes archivos
.fasta en función de la variante, nombre, país, año y número de acceso; (2) generar
alineamientos y traducir las secuencias de nts a aa eliminando, si se desea, los huecos
o gaps que puedan contener; (3) contar el número de secuencias por archivo .fasta y
calcular la frecuencia de mutación en alineamientos de nts o la frecuencia de
sustituciones de aa; (4) rastrear y seleccionar genes o regiones concretas del virus; (5)
presentar datos de forma clara y concisa a través de tablas y listas con las mutaciones
de resistencia a ARV, polimorfismos naturales asociados a variante, grado de
conservación a nivel de nts y aa, homología y selección de péptidos conservados.
Para analizar la conservación de las proteínas Gp41 (VIH-1) y Gp36 (VIH-2) se utilizó
la función “Conservación” del programa EpimolVIH que creó tablas seleccionando el aa
con mayor porcentaje de conservación en cada posición de las proteínas de interés para
cada variante analizada. Con esta misma función se generó otra tabla similar a la
anterior con: (1) la secuencia consenso del grupo M del VIH-1, que tiene en cada
posición el aa más frecuente del alineamiento que incluye las secuencias consenso de
cada subtipo puro, sub-subtipo y CRF; (2) la secuencia consenso final del VIH-1, con el
aa más frecuente del alineamiento entre las secuencias consenso del grupo M, N, O y
P; y (3) la secuencia consenso del VIH-2, con el aa más frecuente del alineamiento de
las secuencias consenso de los grupos y CRF del VIH-2. En este estudio se
consideraron como aa conservados aquellos con una conservación ≥90% y se
definieron los distintos grados de conservación con un código de colores: blanco (≤50%),
verde claro (≥90–<100%), y verde oscuro (100%).

3.4. FASE 3: ELECCIÓN DE PÉPTIDOS CONSERVADOS EXPUESTOS.

Observando las regiones conservadas de las proteínas Gp41 (VIH-1) y Gp36 (VIH-
2) en las tablas generadas en este TFM, se seleccionaron péptidos conservados que
fueran: exclusivos de VIH-1, exclusivos de VIH-2 o conservados en ambos tipos de virus.
Para comprobar si esos péptidos se encontraban expuestos en la estructura
tridimensional (3D) de las proteínas de estudio, se usó el programa Cn3D del NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml) y la estructura 3D disponible
online de dos proteínas Gp41: 6OLP (https://www.rcsb.org/structure/6OLP) y 2LP7
(https://www.rcsb.org/structure/2LP7). Al no existir la estructura cristalográfica de la
proteína Gp36, se generó un modelo 3D de la proteína con el programa SWISS-MODEL
(https://swissmodel.expasy.org/) utilizando la secuencia de referencia BEN del VIH-2.
También se estudió la solubilidad en agua de los péptidos conservados con PepCalc

11
(https://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php), así como su hidrofobicidad con la
aplicación de ThermoFisher (https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/
protein-biology/peptides-proteins/custom-peptide-synthesis-services/peptide-analyzing-
tool.html). De esta manera, se obtuvo la lista definitiva de péptidos conservados,
expuestos, con buena solubilidad en agua y menos hidrofóbicos con los que poder
seleccionar los posibles aptámeros de las proteínas Gp41/Gp36.

3.5. FASE 4: SELECCIÓN DE APTÁMEROS: SELEX Y ELONA.

Los aptámeros generalmente se obtienen a partir de librerías de oligonucleótidos

mediante un método in vitro denominado SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment), que permite seleccionar aquellos oligonucleótidos de la
librería que se unen con más afinidad a la molécula diana (Figura 3.2.). En este
proyecto, las moléculas diana a reconocer fueron los péptidos conservados de las
proteínas Gp41 (VIH-1) y Gp36 (VIH-2) seleccionados tras el estudio de su exposición,
solubilidad e hidrofobicidad.
El método SELEX se llevó a cabo como se ha descrito previamente en otros estudios
(García-Recio et al., 2016) utilizando como diana los péptidos biotinilados encargados
(Proteogenix) y resuspendidos en PBS. Se realizaron dos selecciones empleando dos
sistemas de inmovilización del péptido: unido a placas de 96 pocillos (m96, Nunc) o a
resina estreptavidina-agarosa (Solulink). Todo el proceso SELEX detallado con
cantidades y concentraciones se encuentra en el Apéndice 3.1. Para la selección, se
utilizó una librería de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla denominada RND35
(IBA), formada por distintas secuencias con una región central de 35 nts aleatorios
flanqueados por dos secuencias denominadas F5 y R5, que permitirán su posterior
amplificación.

Figura 3.2. Proceso SELEX con una proteína. Adaptada de Zhou y Rossi, 2017. ADNss, ADN
de cadena simple.

12
 Para la ronda 1 de selección, se desnaturalizó con calor la librería RND35 y se enfrió
para promover la formación de las estructuras terciarias de los aptámeros. Después se
incubó con los péptidos previamente inmovilizados e incubados en una cámara fría
durante la noche anterior. Tras realizar tres lavados y eliminar los aptámeros que no se
unieron a los péptidos, se amplificaron los aptámeros mediante una reacción en cadena
de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) con los cebadores denominados
F5 y R5 (Shi et al., 2014), obteniendo un primer amplificado (PCR1). A continuación, se
realizó una PCR de distintos ciclos para decidir cuál producía un mejor amplificado sin
perder especificidad. Una vez elegido el mejor ciclo, se realizó una nueva PCR (PCR2)
y, los aptámeros resultantes purificados por precipitación con sales y etanol, se
emplearon en una nueva ronda de selección. Todo este trabajo se llevó acabo en la
Unidad de Aptámeros del Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS)
del Hospital Ramón y Cajal, siendo guiada y enseñada por los técnicos y responsables
de la Unidad.
Este método SELEX se repitió durante seis rondas, realizando en las rondas 3 y 6 un
ensayo denominado ELONA (Enzyme-linked oligonucleotide assays) (Figura 3.3) para
observar si en la PCR2 de esas rondas había enriquecimiento de la librería de
aptámeros seleccionada frente al péptido de interés y generada en las PCR2 de esas
rondas. Todo el proceso del ensayo ELONA detallado con cantidades y concentraciones
se encuentra en el Apéndice 3.2. Para realizar el ELONA, se inmovilizaron los péptidos
en una placa m96 y se incubaron toda la noche en agitación en la cámara fría. Al día
siguiente se hizo una nueva PCR (ronda 3: PCRr3, ronda 6: PCRr6) tomando como
molde la PCR1 de las rondas 3 (PCRr3) y 6 (PCRr6), usando los ciclos elegidos en la
PCR de ciclos y los mismos cebadores, pero marcados con digoxigenina en el extremo
5’, molécula con la que se quería marcar la librería de aptámeros para la detección de
la proteína viral. A continuación, se lavó la placa m96 y se bloquearon los pocillos con
la proteína albúmina de suero bovino (BSA, Bovine serum albumina) para cubrir los
huecos que hubieran podido quedar en la base de los pocillos. Posteriormente, el
amplificado de la PCRr3 y PCRr6 se desnaturalizó con calor y se estructuró en hielo
para ser incubado en los pocillos con los péptidos de interés. Después se incubó el
anticuerpo antidigoxigenina unido a la peroxidasa del rábano (PHR, Roche) y, por último,
se añadió el sustrato de la peroxidasa (ABTS, Roche), provocando una reacción cuyo
producto generaba color que se medía en el rango de 405 nm. Esta absorbancia se
midió cada 10 min durante una hora con un lector de microplacas multimodo de
fluorescencia Infinite M Plex (https://www.medicalexpo.es/prod/tecan/product-80772-
835525.html). Entre cada incubación se realizaron 3 lavados con PBS-Tween 0,1%. En

13
todas las PCR del SELEX y en los ELONA se usó H2O como control negativo (-) y
RND35 como control positivo (+).

Figura 3.3. Esquema de un ensayo ELONA. RT, retrotranscriptasa; BSA, albúmina de suero
bovino; PHR, peroxidasa del rábano; ABTS, sustrato de la peroxidasa.

3.6. FASE 5: CARACTERIZACIÓN DE APTÁMEROS MEDIANTE ENSAYOS ELONA.

Para hallar la afinidad de los aptámeros por su proteína se realizaron 3 ensayos

ELONA como el descrito en el epígrafe 3.5, aunque con alguna modificación (Apéndice
3.3). En este caso lo que se inmovilizó en la placa m96 fue la proteína recombinante RT
VIH-1 (referencia: 3555), suministrada por el AIDS Reagent Program del National
Institute of Health (NIH) americano (https://www.aidsreagent.org/). Se utilizó la misma
cantidad de proteína (100ng) y distintas diluciones seriadas 1:2 de aptámeros marcados
con digoxigenina (800nM – 12,5nM).
Para establecer la sensibilidad de los aptámeros, se empleó otro tipo de ensayos
ELONA (Apéndice 3.4), utilizando la misma concentración del aptámero marcado con
digoxigenina (cinco veces mayor a la constante de afinidad o KD) y distintas diluciones
seriadas 1:2 de la proteína PR VIH-1 (referencia: 11781; 100ng – 3,125ng). En este caso
se inmovilizaron en los pocillos de la placa las cinco diluciones seriadas de PR y se
utilizó 100ng de la proteína BSA como control negativo (CN).
La especificidad de los aptámeros por la proteína de interés se comprueba mediante
ensayos ELONA (Apéndice 3.5) en los que se inmovilizan en la placa tanto la proteína
de interés como otras proteínas: proteínas diferentes, como puede ser la BSA, otras
proteínas del mismo tipo de virus y proteínas similares de virus diferentes que tengan la
misma función de la proteína de interés. Para el estudio de especificidad de los
aptámeros frente a la PR de VIH-1 se utilizó la BSA del ensayo de sensibilidad.
Para conocer cuál era la mejor combinación de aptámeros frente a la PR VIH-1,
se realizó otro ensayo denominado ELONA Sandwich (Figura 3.4, Apéndice 3.6). Si en
los anteriores ELONA era la proteína recombinante la que se inmovilizaba en la placa,

14
en el ELONA Sandwich se inmovilizó un primer aptámero sin marcar denominado
capturador (0,5µM), con el que posteriormente se incubó la PR (100ng) y, después, se
añadió un segundo aptámero marcado con digoxigenina denominado detector
(concentración cinco veces mayor a la KD) con el fin de que se uniera a la proteína y
aumentar la señal de los anteriores ELONA que sólo utilizaban un aptámero.

Figura 3.4. Esquema del ELONA Sandwich. RT, retrotranscriptasa; BSA, albúmina de suero
bovino; PHR, peroxidasa del rábano; ABTS, sustrato de la peroxidasa.

3.7. FASE 6: ELONA SANDWICH CON MUESTRAS DE SANGRE SECA VIH

NEGATIVAS.

Tras caracterizar la mejor combinación de aptámeros en el ELONA Sandwich, el paso

siguiente fue optimizar el ensayo con muestras VIH negativas para comprobar si el
ensayo era sensible y así poder testar en un futuro muestras VIH positivas. En el
laboratorio se disponía de muestras de sangre seca recogidas en papel de filtro (DBS,
Dried blood specimens) de personas VIH negativas y positivas, por lo que se decidió
emplearlas en este tipo de Elona Sandwich, a la espera de probar otro tipo de muestras
más adelante. Para ello, como primer paso, se usaron DBS de pacientes VIH negativos
eluidos con tampón de lisis (50µl) a los que se añadió la PR (100ng). Esto se conoce
como muestras dopadas, siendo este DBS dopado sería similar a una muestra VIH
positiva. Para saber si la sangre seca daba un fondo alto, se usaron DBS de pacientes
VIH negativos, pero sin añadirles proteína. Las muestras se lisaron con dos tampones
de lisis diferentes para decidir cuál era el mejor: tampón Nuclisens EasyMag (Bn) y
tampón MA1 (Bma). Se añadieron también al ensayo los dos tampones con la PR, pero
sin DBS para comprobar que el tampón no interfería en la detección de la proteína por
parte de los aptámeros. Por último, como CP se usó la proteína de interés sola con cada
pareja de aptámeros, como CN1 la proteína BSA (200ng) y como CN2 la PR, pero sin
aptámero detector (Apéndice 3.7).

15
3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS.

Los datos obtenidos se presentaron como una media de 3 medidas independientes

en experimentos separados ± la desviación estándar. Estos datos fueron analizados
usando el programa GraphPad Prism v.8.0.1 y la significancia estadística (p<0,05) se
obtuvo mediante un T test pareado cuando sólo se comparaba un valor con respecto al
control y mediante ANOVA cuando se comparaban diferentes variables entre sí. En
función de la p valor, se usaron los siguientes símbolos en las gráficas para indicar las
diferencias estadísticamente significativas: (*), p=0,0xxx; (**), p=0,00xx; (***), p=0,000x,
y (****), p<0,0001. En los ELONA de afinidad se realizó una regresión no lineal
mostrando que los datos respondían a una curva de unión a un sitio (one-site binding)
con una ecuación y = (x 𝑥 Bmax) / (x + KD), donde Bmax es la capacidad de unión
máxima del aptámero por su proteína diana, y la KD, o constante de afinidad, es la
concentración del aptámero necesaria para alcanzar la mitad de la capacidad de unión
máxima.

4. RESULTADOS

4.1. FASE 1: SECUENCIAS ANALIZADAS.

Para realizar este proyecto, se descargaron un total de 10.968 secuencias de la

glicoproteína transmembrana del VIH de la base de datos LANL. Una vez descartadas
las secuencias con codón de parada en posiciones inusuales, se emplearon en este
estudio un total de 10.738 secuencias, siendo 10.453 de Gp41 (VIH-1) y 285 de Gp36
(VIH-2) (Tabla 4.1). Entre las secuencias de VIH-1, 100 pertenecían a los grupos no-M
(N, O y P) y 10.353 al grupo M, no existiendo en LANL secuencias Gp41 de las
siguientes variantes del grupo M: sub-subtipo A5, subtipo F, CRF30_0206, CRF66_BF,
CRF75_BF, CRF84_A1D, CRF94_cpx, CRF97_01B y CRF100_0107. Tampoco existían
secuencias Gp36 del grupo E ni del I. Las variantes con mayor representación del grupo
M del VIH-1 fueron los subtipos B (51.6%) y C (20.6%), el recombinante CRF01_AE
(9.6%), el sub-subtipo A1 (3%) y el recombinante CRF02_AG (2%). En el VIH-2 el grupo
más representado fue el A (84,9%). Tras excluir las variantes con menos de cinco
secuencias, se utilizaron finalmente en el siguiente estudio de conservación un total de
10.579 secuencias de 64 variantes entre tipos, subtipos, sub-subtipos y CRF.

16
4.2. FASE 2: CONSERVACIÓN DE GP41 (VIH-1) Y GP36 (VIH-2).

4.2.1. Conservación de GP41 (VIH-1) y GP36 (VIH-2) entre variantes.

Tras analizar las secuencias de las proteínas Gp41 (VIH-1) y Gp36 (VIH-2)
empleando la función “Conservación” del programa bioinformático EpiMolVIH, se obtuvo
el porcentaje de los aa con una conservación ≥90% en todas las variantes analizadas
(Tabla 4.2). Del consenso de la proteína Gp41 (VIH-1), generado con las cuatro
secuencias consenso de los grupos M, N O y P, un total de 83 (48,3%) de los 172 aa de
Gp41 tuvieron una conservación ≥90% y ningún aa conservado al 100%. El consenso
de la proteína Gp36 (VIH-2), generado con las 3 secuencias consenso de los grupos A
y B y del recombinante CRF01_AB, tuvo mayor conservación que el consenso de VIH-
1. Contó con 212 (60,4%) de sus 351 aa conservados (≥90%), y 45 aa (12,8%)
conservados totalmente (100%).
Los grupos del VIH-1 con la proteína Gp41 más conservada al tener mayor % de aa
con ≥90% conservación fueron el N (89,5%) y P (89,5%) vs. el O (68%) y el M (68%). El
grupo con mayor porcentaje de aa conservados en todas sus secuencias (100%) fue el
P (89,5%), seguido del N (77,3%), O (38,4%) y M (0%). En los subtipos y CRF del grupo
M del VIH-1 el porcentaje de aa con conservación ≥90% osciló entre 58,1% (CRF46_BF,
8 secuencias) y 95,3% (CRF83_cpx, 11 secuencias) y el porcentaje de aa conservados
al 100% osciló entre el 7% (subtipo B, 5341 secuencias) y 91,9% (CRF60_BC, cinco
secuencias).
La variante de VIH-2 con mayor tasa de aa conservados de la proteína Gp36
≥90%/100% fue el CRF01_AB (86%/86%), seguido del grupo B (71,8%/46,6%) y el
grupo A (65% /15,7%).

17
Tabla 4.1. Secuencias de Gp41/Gp36 empleadas en este estudio. En rojo, variantes con
menos de cinco secuencias. *, Variante incluida en el estudio, aunque tenga menos de cinco
secuencias; Nº, número; secs, secuencias, y CRF, formas recombinantes circulantes.

18
Tabla 4.2. Número y porcentaje de aa altamente conservados (≥90% y 100%) por variante
del VIH-1 y VIH-2. Nº, número; secs, secuencias; AA, aminoácidos, y CRF, formas
recombinantes circulantes.

19
4.2.2. Conservación de la estructura secundaria de la proteína Gp41 (VIH-1).

Una vez determinados los aa más conservados de la proteína Gp41 (VIH-1), se

procedió a localizarlos en cada dominio de su estructura secundaria (Figura 1.5A),
identificando 3 niveles de conservación con un código de colores para tener una visión
global de la conservación de la proteína Gp41 (Figura 4.1). Tras sumar el valor de
conservación de cada residuo en cada dominio de la estructura y dividir por el nº total
de residuos que conforman cada dominio, observamos que la conservación de los
dominios difería entre variantes y tipo de estructura (Figura 4.2A). Todos los dominios
en todos los grupos y en el consenso de VIH-1 tenían una conservación ≥68%. En el
consenso de VIH-1, el dominio de Gp41 con mayor conservación fue N-HR (85,2%),
seguido de FPPR (83,8%), FP (82,9%) y MPER (81.9%), mientras que los dominios
menos conservados fueron IL (70.5%) y C-HR (68,0%). Al comparar la conservación de
los dominios de cada uno de los 4 grupos, se observó que el consenso del grupo M
presentaba menor conservación con respecto a los otros tres grupos, aunque sus
dominios más conservados fueron FPPR (95,8%) y N-HR (94,7%) y el dominio menos
conservado fue C-HR (78,9%). El grupo N contaba con los dominios FP (98,9%) y FPPR
(98,8%) más conservados con respecto a los otros grupos. A su vez, el grupo O tenía el
dominio MPER (95,5%) mejor conservado con respecto a los otros grupos. Por último el
grupo P tenía los dominios N-HR (98,7%) e IL (95,3%) mejor conservados. Se calculó
la conservación media total de cada una de las estructuras entre los 4 grupos (Figura
4.2B), siendo el dominio N-HR el más conservado (96,3%) y el dominio C-HR el menos
conservado (88,1%). Los dominios FP (94,1%), FPPR (93,1%) y MPER (90,1%) tuvieron
una conservación ≥90%.

4.3. FASE 3: PÉPTIDOS CONSERVADOS, EXPUESTOS Y SOLUBLES DE GP41 Y

GP36 PARA LA SELECCIÓN DE APTÁMEROS.

Tras analizar la conservación de las proteínas Gp41 y Gp36 se seleccionaron 10

posibles péptidos conservados. No se indican sus secuencias de aa por motivos de
confidencialidad, pero oscilaron entre 5 y 15 aa y se localizan en los dominios FP, FPPR,
N-HR y MPER. En Gp41 se eligieron los péptidos GP41.1 (común al VIH-1 y VIH-2),
GP41.2, (específico del VIH-1) y GP41.3. Éste último podría reconocer tanto al VIH-1
como al VIH-2 o bien ser sólo específico del VIH-1, según se confirme con los ensayos
ELONA si el único cambio de aa en VIH-2 afecta a su reconocimiento por los futuros
aptámeros que se seleccionen frente a este péptido. Para Gp36 se seleccionaron los
péptidos GP36.1-GP36.7 (específicos del VIH-2) (Tabla 4.3).

20
21

Figura 4.1. Conservación de los cuatro grupos del VIH-1 en la proteína Gp41. Nº, número; secs, secuencias; HXB2, secuencia de referencia (subtipo
B, nº de acceso del GenBank K03455); FP, péptido de fusión; FPPR, región próxima al péptido de fusión; N-HR, región hepta-helicoidal N-terminal; IL,
región de unión inmunodominante; C-HR, región hepta-helicoidal C-terminal; MPER, región de membrana proximal externa.

21
 A

B
22

Figura 4.2. Conservación de cada dominio de la estructura secundaria de la proteína Gp41 (VIH-1) (A) y conservación media entre los cuatro
grupos de VIH-1 (B). Nº, número; secs, secuencias; aa, aminoácidos; HXB2, secuencia de referencia (subtipo B, nº de acceso del GenBank K03455);
FP, péptido de fusión; FPPR, región próxima al péptido de fusión; N-HR, región hepta-helicoidal N-terminal; IL, región de unión inmunodominante; C-
HR, región hepta-helicoidal C-terminal; MPER, región de membrana proximal externa.

22
 Tabla 4.3. Características de los péptidos conservados de Gp41 (VIH-1) y Gp36 (VIH-2). *, Péptidos empleados en este TFM; aa, aminoácidos.

PÉPTIDO ESPECIFICIDAD SOLUBILIDAD HIDROFOBICIDAD LOCALIZACIÓN DEL PÉPTIDO

GP41.1* VIH-1 + VIH-2 Pobre Muy baja

GP41.2* VIH-1 Pobre Moderada

23

VIH-1 y
GP41.3* posible VIH-2
Pobre Muy baja

GP36.1 VIH-2 Pobre Alta

GP36.2 VIH-2 Pobre Moderada
GP36.3* VIH-2 Buena Muy Baja
GP36.4 VIH-2 Buena Muy Baja
GP36.5 VIH-2 Buena Moderada
GP36.6* VIH-2 Pobre Moderada
VIH-2 y
GP36.7 Pobre Moderada
posible VIH-1

23
 En este TFM se escogieron para Gp41 los péptidos conservados GP41.1, GP41-2 y
GP41.3 por estar expuestos y, aunque presentaron una solubilidad pobre, fueron
hidrofílicos (baja hidrofobicidad). Por otro lado, de los péptidos de Gp36 expuestos en
bucles (GP36.1, GP36.3, GP36.6 y GP36.7), se escogió GP36.3 por tener buena
solubilidad y ser muy hidrofílico, y GP36.6 por ser hidrofílico a pesar de ser poco soluble.

4.4. FASE 4: SELECCIÓN DE APTÁMEROS DE GP41/GP36 POR ENSAYOS ELONA

Una vez comprados los péptidos GP41.1, GP41.2, GP41.3, GP36.3 y GP36.6 se
intentaron disolver en PBS (concentración final de 1mg/ml) y se observó que GP41.1,
GP41.3 y GP36.6 se disolvieron bien, mientras que GP41.2 no se disolvió. Se decidió
no disolver el péptido GP36.3 y seguir sólo con GP41.1 y GP41.3 para optimizar el
tiempo disponible a nivel experimental. La primera estrategia que se utilizó fue el método
SELEX en placa y tras realizar los ELONA de las rondas 3 y 6 no se observó
enriquecimiento de la librería de aptámeros (Figura 4.3A). Por ello, se cambió de
estrategia empleando el SELEX en resina. En la segunda semana de septiembre de
2020 la selección se encontraba en la ronda 4 de SELEX en resina, al no observarse
tras la ronda 3 un enriquecimiento de la librería de aptámeros en el ELONA (Figura
4.3B).
A B

Figura 4.3. ELONA de las rondas 3 y 6 del SELEX en placa (A) y de la ronda 3 del SELEX
en resina (B) de los péptidos GP41.1 y GP41.3. El control positivo (CP) era la librería de
oligonucleótidos RND35 y el control negativo (CN) agua (H2O). Abs, absorbancia; nm,
nanómetros.

4.5. FASE 5: CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LOS APTÁMEROS FRENTE A

LAS PROTEÍNAS PR, RT E IN DEL VIH.

Debido a que en esta fase de los resultados se empezaron a incluir en el proyecto

varios aptámeros seleccionados frente a péptidos conservados en otras proteínas del
VIH (PR, RT e IN), se exponen a continuación los resultados previos a la fecha de

24
comenzar este TFM para una mayor comprensión de los datos (Apéndice 4.1). Se
dispone de nueve aptámeros seleccionados frente al VIH disponibles en el laboratorio:
dos aptámeros frente al mismo péptido de la PR común en VIH-1 y VIH-2 (AptGI6.1F y
AptGI6.16F); tres frente al mismo péptido de la RT común en VIH-1 y VIH-2 (AptWG5.2F,
AptWG5.9F y AptWG5.12F); uno frente a un péptido de la RT específico de VIH-1
(AptLL6.6F); dos frente al mismo péptido de la RT específico del VIH-2 (AptIE6.18R y
AptIE6.23R), y otro frente a un péptido de la IN común en VIH-1 y VIH-2 (AptPE5.1F).
Para realizar el objetivo 3 de este TFM se hicieron un total de 20 ensayos ELONA
empleando los dos aptámeros AptGI6.1F y AptGI6.16F frente a la PR viral y los cuatro
(AptWG5.2F, AptWG5.9F, AptWG5.12F y AptLL6.6F) dirigidos frente a la RT del VIH-1.

4.5.1 Afinidad

Para saber si los aptámeros tenían una buena afinidad por su proteína, se realizaron
ensayos ELONA de afinidad con los que se pudo medir la Bmax (capacidad de unión
máxima del aptámeros por su proteína) y la KD (concentración del aptámero necesaria
para alcanzar la mitad de Bmax). Por tanto, un mejor aptámero sería aquel con una
Bmax mayor y una KD menor. Para la PR, el aptámero AptGI6.1F tuvo una Bmax
superior a la del aptámero AptGI6.16F (1,81 ± 0,17U vs. 1,53 ± 0,12U) y, por tanto, una
KD más baja (10,04 ± 4,66nM vs. 15,43 ± 4,86nM respectivamente) (Apéndice 4.1 y
Figura 4.4A). Esto significa que el aptámero AptGI6.1F es más afín a la PR viral. El
aptámero AptPE5.1F tuvo una Bmax (1,14 ± 0,09U) inferior a las de los aptámeros de
PR y, por tanto, una mayor KD (92,55 ± 29,2nM) (Apéndice 4.1 y Figura 4.4B). En
cuanto a la RT, cuyo ensayo de afinidad se realizó durante este TFM, no se consiguieron
resultados en un primer intento de caracterización de la afinidad de los cuatro aptámeros
frente a la RT de VIH-1, tanto en los comunes a ambos virus (AptWG5.2F, AptWG5.9F
y AptWG5.12F) como en el específico de VIH-1 (AptLL6.6F). Los resultados muestran
valores de absorbancia más altos a menor concentración de los aptámeros, no pudiendo
obtener la curva esperada. Esto sugiere un fallo experimental (Figura 4.4C). Al no haber
tiempo para repetir el ensayo y con el objetivo de avanzar en el resto de experimentos,
se decidió continuar la caracterización de los aptámeros de la PR, los cuales eran más
afines por su proteína.

25
 A B

Figura 4.4. Afinidad de los aptámeros frente a las proteínas PR (A), IN (B) y RT (C) del VIH-
1. Los datos de PR e IN eran previamente conocidos. Abs, absorbancia; nm, nanómetros; nM,
nanomolar; PR, proteasa; IN, integrasa.

4.5.2 Sensibilidad

Para determinar la menor cantidad de proteína PR del VIH-1 necesaria para que sus
aptámeros alcancen la mayor capacidad de unión, se realizó un ELONA de sensibilidad.
(Figura 4.5). El ELONA muestra que los dos aptámeros seleccionados frente a la PR
del VIH-1 reconocían esta proteína de forma dependiente a la concentración de la
misma. Así, el aptámero AptGI6.1F tuvo una sensibilidad de 12,5ng de PR con respecto
a un CN de 100ng de la proteína BSA (0,15 ± 0,01 vs. 0,06 ± 0,01; p=0,0025) que
equivale a 1,25pmoles de PR. El aptámero AptGI6.16F tuvo una sensibilidad de 25ng
de PR con respecto al CN (0,27 ± 0,01 vs. 0,08 ± 0,01; p = 0,0026) que equivale a
2,5pmoles de PR. Por tanto, el aptámero más sensible a la PR del VIH-1 fue el aptámero
AptGI6.1F.

26
Figura 4.5. Sensibilidad de los aptámeros AptGI6.1F y AptGI6.16F frente a la PR del VIH-1.
(*) Diferencia significativa con p=0,0xxx; (**) diferencia significativa con p=0,00xx. CN, control
negativo de 100ng de BSA; Abs, absorbancia; nm, nanómetros; ng, nanogramos; PR, proteasa.

4.5.3 Especificidad

Como un primer análisis de la especificidad de nuestros 2 aptámeros de PR

(AptGI6.1F y AptGI6.16F) se usó la misma cantidad de la proteína BSA del ensayo de
sensibilidad como CN (Figura 4.5). Ambos aptámeros mostraron diferencias
significativas de especificidad con respecto al CN, como lo indicaban sus valores de
absorbancia: 1,21 ± 0,08 vs. 0,08 ± 0,01; p=0,0054, para el aptámero AptGI6.1F, y 0,95
± 1,14 vs. 0,08 ± 0,01; p=0,0226 para el aptámero AptGI6.16F. Estos resultados
indicaron que ambos aptámeros se unen a la PR de VIH-1 de manera específica en
comparación con la BSA. Por falta de tiempo no se pudo comprobar la especificidad con
otras proteínas pero se estudiará en el futuro.

4.5.4 Mejor combinación de aptámeros

Para comprobar cuál era la mejor combinación de aptámeros de PR en un ELONA

sándwich se utilizaron las cuatro combinaciones (C) posibles de aptámero capturador
(inmovilizado en la placa) y detector (añadido tras incubar la proteína viral): C1
(AptGI6.1F+AptGI6.1F), C2 (AptGI6.1F+AptGI6.16F), C3 (AptGI6.16F+AptGI6.1F) y C4
(AptGI6.16F+AptGI6.16F) (Figura 4.6). Como se observa en la gráfica, las cuatro
combinaciones de ambos aptámeros reconocían bien en el ELONA Sandwich a la PR
viral en comparación con el reconocimiento de un primer CN de proteína BSA: C1 (1,62
± 0,005 vs. 0,12 ± 0,01 p<0,0001); C2 (1,35 ± 0,06 vs. 0,11 ± 0,01, p<0,0001); C3 (1,59
± 0,08 vs. 0,11 ± 0,002, p<0,0001), y C4 (1,34 ± 0,10 vs. 0,10 ± 0,01, p<0,0001)

27
respectivamente. Observamos resultados similares con respecto a un segundo CN
incluido en el experimento, donde se añadió 100ng de PR viral pero sin el aptámero
detector, lo que daría absorbancias bajas: C1 (1,62 ± 0,005 vs. 0,15 ± 0,02, p<0,0001);
C2 (1,35 ± 0,06 vs. 0,15 ± 0,02, p<0,0001); C3 (1,59 ± 0,08 vs. 0,12 ± 0,01, p<0,0001),
y C4 (1,34 ± 0,10 vs. 0,12 ± 0,01, p<0,0001). De las cuatro combinaciones, encontramos
diferencias significativas entre C1 y C2 (1,62 ± 0,005 vs. 1,35 ± 0,06; p=0,0082), entre
C1 y C4 (1,62 ± 0,005 vs. 1,34 ± 0,10; p=0,0042), entre C2 y C3 (1,35 ± 0,06 vs 1,59 ±
0,08; p=0,0225), y entre C3 y C4 (1,59 ± 0,08 vs. 1,34 ± 0,10; p=0,0117). Estos datos
demostraron que las dos mejores combinaciones de aptámeros fueron C1
(AptGI6.1F+AptGI6.1F) y C3 (AptGI6.16F+AptGI6.1F) teniendo la primera un valor de
absorbancia algo mayor, aunque sin diferencia significativa (1,62 ± 0,005 vs. 1,59 ± 0,08;
p>0,9999).

Figura 4.6. Combinaciones de aptámeros de PR del VIH-1 en un ELONA Sandwich. (*)

Diferencia significativa con p=0,0xxx; (**) diferencia significativa con p=0,00xx; (****), diferencia
significativa con p<0,0001. El rombo indica que no lleva aptámero detector. PR, proteasa
(100ng); CN1, control negativo primero con 200ng de BSA; CN2, control negativo segundo con
100ng de PR sin aptámero detector; Abs, absorbancia; nm, nanómetros.

4.6. FASE 6: EFICACIA PRELIMINAR DIAGNÓSTICA DE LOS APTÁMEROS.

Tras confirmar cuales eran las mejores parejas de los aptámeros capturadores y
receptores en el ELONA Sandwich frente a la PR (C1: AptGI6.1F+AptGI6.1F y C3:
AptGI6.16F+AptGI6.1F) se hizo un primer y único ensayo preliminar para probar la

28
eficacia diagnóstica de ambas combinaciones en un primer tipo de muestras a analizar:
la sangre seca o DBS VIH negativo (Figura 4.7). En la gráfica aparecen las siguientes
condiciones: (a) DBS dopado lisado con tampón Bn, (b) PR con tampón Bn, (c) DBS
lisado con tampón Bn, (d) DBS dopado lisado con tampón Bma, (e) PR con tampón
Bma, (f) DBS lisado con tampón Bma, (g) CP, (h) CN1 y (i) CN2. Los datos muestran
que no hubo diferencias significativas de detección de PR entre a y d en C1 y C3 lo que
sugiere que no hay diferencias entre los tampones de lisis. Tampoco se encontraron
diferencias significativas entre el DBS dopado y sin dopar (condiciones a vs. c y b vs. d)
en C1 y C3. Estos datos podrían sugerir que en el DBS hay proteínas que causan
interferencias en la detección del VIH por ELONA Sandwich si los niveles de
absorbancia del DBS dopado fueran similares al CP (condición g). Sin embargo, sí se
encontraron diferencias significativas entre a vs. g y d vs. g en C1 (0,11 ± 0,03 vs. 1,93
± 0,02; p<0,0001, y 0,54 ± 0,02 vs. 1,93 ± 0,02; p<0,0001) y C3 (0,15 ± 0,07 vs. 1,72 ±
0,24; p<0,0001, y 0,62 ± 0,07 vs. 1,72 ± 0,24; p=0,0002). Esto indica que los tampones
de lisis podrían interferir en la detección más que otras proteínas de la sangre, hecho
que se confirma al haber diferencias significativas entre b vs. g y e vs. g en C1 (0,08 vs.
1,93 ± 0,02; p<0,0001, y 0,09 vs. 1,93 ± 0,02; p<0,0001) y C3 (0,09 vs. 1,72 ± 0,24;
p<0,0001, y 0,11 vs. 1,72 ± 0,24; p<0,0001). Por lo tanto, los tampones de lisis interfieren
en la detección de la PR y por eso las condiciones a y d no alcanzaron los valores del
CP.

Figura 4.7. Análisis preliminar mediante ELONA Sandwich de la eficacia diagnóstica de los
dos aptámeros frente a la PR del VIH-1 empleando DBS de pacientes VIH negativos en
distintas condiciones. (***) Diferencia significativa con p=0,000x; (****) diferencia significativa
con p<0,0001. El rombo indica que no lleva aptámero detector. CP, control positivo con 100ng
de PR; CN1, control negativo primero con 200ng de BSA; CN2, control negativo segundo con
100ng de PR, pero sin aptámero detector; Abs, absorbancia; nm, nanómetros; ng, nanogramos;
PR, proteasa; BSA, albúmina de suero bovino; DBS (dried blood specimens), sangre seca
recogida en papel de filtro; Bn, tampón Nuclisens; Bma, tampón MA1.

29
 5. DISCUSIÓN

Este trabajo se ha centrado en el diseño y caracterización de aptámeros para el

diagnóstico precoz del VIH. Forma parte de un proyecto FIS en marcha con título:
“Impacto de la variabilidad genética del VIH en el diagnóstico molecular y monitorización
de la terapia empleando técnicas moleculares point of care comerciales y en desarrollo”
liderado por el Laboratorio de Epidemiología Molecular del VIH (EpiMolVIH) del IRYCIS
en el Hospital Ramón y Cajal de Madrid, donde realicé la parte experimental. Las fases
del proyecto de investigación en el que se dividió este TFM (Figura 3.1) se desarrolla a
continuación (Figura 5.1). El laboratorio ya había identificado antes de comenzar este
TFM los péptidos más conservados en las proteínas virales P24/P26, PR, RT e IN de
las fases 1-3, y la Unidad de Aptámeros del IRYCIS, subcontratada en el proyecto para
la síntesis de aptámeros, había terminado la fase 4 para varias proteínas, pero no para
Gp41/Gp36. Durante mi TFM participé en las fases 1-4 para las proteínas virales
Gp41/Gp36, realizando la fase 4 bajo la enseñanza y supervisión de la Unidad de
Aptámeros, parte de la fase 5 para las proteínas PR y RT y parte de la fase 6 para la
PR. La finalización de las fases 4, 5 y 6 se realizará durante mi futura Tesis Doctoral
que continuaré en el mismo laboratorio gracias a un contrato predoctoral.

PROTEÍNAS DEL
FASE 1 FASE 2 FASE 3 FASE 4 FASE 5 FASE 6
VIH-1/VIH-2
Gp41/Gp36 TFM TFM TFM TFM y Apt Tesis Tesis
P24/P26 EpiMolVIH EpiMolVIH EpiMolVIH Apt Tesis Tesis
PR EpiMolVIH EpiMolVIH EpiMolVIH Apt TFM/Tesis TFM/Tesis
RT EpiMolVIH EpiMolVIH EpiMolVIH Apt TFM/Tesis Tesis
IN EpiMolVIH EpiMolVIH EpiMolVIH Apt Tesis Tesis

Figura 5.1. Estado del desarrollo de las fases del proyecto de investigación en el que se
integra este TFM. En naranja se muestra el trabajo experimental realizado previamente en el
laboratorio EpiMolVIH, en rojo el realizado en la Unidad de Aptámeros, en azul el realizado en
este TFM y en verde las tareas a realizar en mi futura Tesis Doctoral. Gp41/Gp36, proteína
transmembrana de la envuelta del VIH-1/VIH-2; P24/P36, proteína de la cápsida viral en VIH-
1/VIH-2; PR, proteasa; RT, retrotranscriptasa; IN, integrasa; TFM, trabajo fin de máster;
EpiMoVIH, Laboratorio de Epidemiología Molecular del VIH-1; Apt, Unidad de Aptámeros.

Debido a la situación provocada por el estado de alarma, las prácticas fueron

interrumpidas desde el mes de marzo a junio y no se pudieron llevar a cabo todos los
objetivos indicados al no permitirnos estar en el laboratorio. Sin embargo, durante el
teletrabajo se terminaron los objetivos 1 y 2 y, tras la vuelta al laboratorio en junio, se
empezaron los objetivos 3 y 4, que no han podido ser terminados por falta de tiempo.
Por ello, sólo pudimos analizar la sensibilidad, especificidad, mejor combinación de

30
aptámeros en un ELONA Sandwich y hacer el primer ensayo de la eficacia diagnóstica
de los aptámeros frente a la PR viral.
A nuestro conocimiento, este estudio describe la conservación de las proteínas
transmembrana virales (Gp41/Gp36) del VIH a nivel de aa en el mayor número de
secuencias y variantes virales hasta la fecha. Así se ha empleado un total de 10.579
secuencias de 64 variantes (tipos, subtipos, sub-subtipos y CRFs) del VIH disponibles
en el momento de estudio en la base de datos LANL. Los resultados también se
analizaron en el contexto de los dominios de la estructura secundaria de la proteína
Gp41 (Figura 1.5). Ambos procesos se llevaron a cabo empleando una nueva
herramienta bioinformática desarrollada en el laboratorio (programa EpimolVIH) y
testada durante el inicio del proyecto con dicha finalidad. Este programa ha resultado
ser muy útil y práctico, generando tablas y figuras de manera automática y exponiendo
los resultados de manera clara y fácil de entender. Dada la elevada importancia en el
ciclo viral de esta proteína durante la entrada del VIH a la célula, los resultados
proporcionan información de alto impacto desde el punto de vista diagnóstico y
terapéutico, al permitir identificar las regiones en la proteína con mayor conservación
que ayuden al diseño de fármacos frente al virus. Además, debido a que la variabilidad
genética es un reto para el desarrollo de vacunas (Carr, 2006), los nuevos datos también
permitirían entender mejor la interacción del virus con los anticuerpos neutralizantes de
amplio espectro esenciales para el control del virus por vacunación.
Los resultados han mostrado que el grado de conservación de la proteína puede
diferir entre variantes y entre sus dominios, como se mostró en estudios anteriores del
grupo de investigación (Holguín et al., 2007). Se observó que la proteína Gp36 (VIH-2)
tenía un mayor porcentaje de aminoácidos con conservación ≥90% que la proteína Gp41
(VIH-1), lo cual se podría explicar por el menor número de secuencias disponibles del
VIH-2 en LANL, por existir menos infecciones a nivel mundial (entre uno y dos millones)
y ser menos transmisible y virulento que el VIH-1 (Azevedo-Pereira y Santo-Costa,
2016). Por otro lado, la mayor tasa de aa totalmente conservados de los grupos no-M
del VIH-1 se debe probablemente a la misma razón, ya que son variantes muy poco
prevalentes y, en el caso de los grupos P y N, han infectado a muy pocas personas. Lo
mismo pasa en la mayor parte de los CRF, que cuentan con muy pocas secuencias,
aunque en este caso no siempre se debe a una baja prevalencia, sino a que son cepas
que circulan mayoritariamente en países donde la secuenciación no está disponible o la
investigación en gp41 es escasa.
Tras estudiar la conservación de cada dominio de la estructura secundaria de Gp41,
se observó que todos los dominios tenían una conservación superior al 80% (media de
los cuatro grupos de VIH-1). Esto es normal para proteínas con una función importante

31
en el ciclo del virus, y más en una proteína que tiene distintas conformaciones antes y
después de la fusión de las membranas celular y viral que permite la entrada del virus
en la célula (Pancera et al., 2014). Los resultados de conservación reflejaron que los
dominios de Gp41 mejor conservados fueron el dominio N-HR (96,3%), el dominio FP
(94,1%), el FPPR (93,1%) y MPER (90,1%). Es importante destacar que precisamente
los dominios N-HR, FP y FPPR de Gp41 han sido implicados recientemente en la
interacción con el inhibidor de la fusión en uso clínico T-20, que evita la entrada del virus
a la célula (Xu et al., 2019). Hasta hace poco sólo se conocían anticuerpos
neutralizantes de amplio espectro que reconocían epítopos del dominio MPER, pero al
año pasado se describió que la plasticidad conformacional del péptido de fusión facilita
también el reconocimiento del virus por anticuerpos neutralizantes de amplio espectro
(Yuan et al., 2019).
En este TFM también se pretendió caracterizar la afinidad, sensibilidad, especificidad
y mejor combinación de varios aptámeros seleccionados dirigidos frente al VIH-1
mediante distintos ensayos ELONA para así poder empezar la evaluación inicial de la
eficacia diagnóstica de los mejores aptámeros seleccionados con distintos paneles de
muestras de pacientes VIH negativos y positivos. La falta de tiempo que hubo para
repetir ensayos y así tener un buen apoyo estadístico, hizo centrar la mayor parte de los
experimentos en los aptámeros de la PR que a excepción del ensayo preliminar de
evaluación diagnóstica realizado por duplicado, el resto de los ensayos se hicieron por
triplicado. Según los ensayos de afinidad y sensibilidad, el aptámero AptGI6.1F de la
PR resultó ser mejor opción que el aptámero AptGI6.16F, comprobándose además al
probar todas las combinaciones posibles en el ELONA Sandwich que era el mejor
aptámero detector independientemente de cuál de los dos fuera el aptámero capturador.
Por último y tras realizar el primer análisis de eficacia diagnóstica, se observó que los
tampones Bn y Bma podrían inhibir la unión del aptámero a la PR, lo que sugiere la
necesidad de probar tampones alternativos o modificar el porcentaje de detergente
empleado para evitar que la PR se degrade.
En una visión general, contamos con un total de 9 aptámeros ya seleccionados para
las diferentes proteínas del gen pol del VIH (PR, RT e IN) y está en proceso la selección
final de los aptámeros frente a las proteínas Gp41/Gp36 y P24/P26, dos proteínas con
gran importancia diagnóstica. Por un lado, la proteína Gp41/Gp36 es la glicoproteína
transmembrana que se encuentra expuesta y contra la que se generan anticuerpos
neutralizantes de amplio espectro frente al virus, objetivo final de cualquier vacuna. Por
otro lado, la proteína P24/P26 es la primera proteína en aparecer en sangre y la más
numerosa en el virión (2000 copias por cápsida), siendo el antígeno detectado en los
inmunoensayos de 4ª y 5ª generación (Alexander et al; 2016).

32
 Actualmente los estudios de aptámeros frente al VIH están más centrados en su uso
terapéutico que en su uso diagnóstico (Bala et al., 2018), por lo que este proyecto
representa una línea de trabajo muy interesante. En concreto, durante la revisión
bibliográfica realizada para este TFM, solo se encontró un artículo científico sobre
aptámeros frente a la PR y su objetivo era terapéutico (Duclair S et al., 2015). Si
identificamos los mejores de los 9 aptámeros frente al VIH disponibles en el laboratorio
que sean capaces de reconocer al virus con alta afinidad, sensibilidad y especificidad,
podrían ser potencialmente usados en un futuro kit diagnóstico tras optimizar el ELONA
Sandwich y, una vez optimizado, identificar otras tecnologías de detección superiores
para conseguir detectar niveles de esas proteínas presentes en 1 virión. Actualmente el
grupo está trabajando en alternativas que emplean como señal secundaria un polímero
unido a la peroxidasa PHR y para lo cual se necesitaría encargar aptámeros biotinilados
en lugar de estar marcados con digoxigenina (De la Serna et al., 2018).
Como limitaciones de este TFM se encuentran la diferencia en la cantidad de
secuencias disponibles para cada variante del VIH-1 y VIH-2 en LANL, que fluctuó desde
0 a un máximo de 5341 (subtipo B de VIH-1), habiendo muchas más secuencias de VIH-
1 que de VIH-2 por la baja prevalencia de este último. Por otro lado, se desconocían los
aa que correspondían a cada dominio de la proteína Gp36 (VIH-2) en la bibliografía.
Además, algunos reactivos y aptámeros, necesarios en los ensayos, tardaron mucho en
llegar debido al estado de alarma, así como las proteínas del VIH-1 y VIH-2, llegadas
desde el NIH de Estados Unidos en el mes de agosto. Por otro lado, a pesar de los
objetivos ambiciosos de este TFM y de las limitaciones presentadas, se han conseguido
unos resultados esperanzadores, que podrán ser continuados durante mi Tesis
Doctoral, y ha permitido seguir avanzando en el desarrollo y optimización del programa
bioinformático EpiMolVIH empleado para el análisis de secuencia que ha ido en paralelo
con este estudio. Además tras el TFM se escribirá un artículo científico sobre la
conservación de la envuelta del VIH-1 y VIH-2, en el que se incluirá tanto GP41/Gp36
como Gp120/Gp105, y un estudio de los polimorfismos naturales asociados a cada
variante tras actualizar e incluir las secuencias con fecha actual.

33
 6. CONCLUSIONES

1) A nuestro conocimiento, este estudio describe la conservación de las

glicoproteínas transmembrana virales (Gp41/Gp36) del VIH-1/VIH-2 a nivel de aa en el
mayor número de secuencias (10.579) y variantes virales (64) estudiadas hasta la fecha.
2) Los resultados han mostrado que el grado de conservación de la proteína puede
diferir entre variantes del VIH y dominios de la proteína, siendo Gp36 más conservada
que Gp41, quizás por el menor número de secuencias disponibles en las bases de
datos.
3) Se han identificado los cuatro dominios de Gp41 más conservados en todos los
grupos del VIH-1 (dominios N-HR, FPPR, FP y MPER), con más del 90% de
conservación de aa, lo que les hace posiblemente las mejores dianas terapéuticas y
diagnósticas.
4) Se ha calculado la sensibilidad y especificidad de dos aptámeros frente a la PR
del VIH, encontrando que el aptámero AptGI6.1F tiene una mejor sensibilidad que el
aptámero AptGI6.16F, pudiendo capturar 1,25pmoles de la PR.
5) Las combinaciones de aptámeros que detectaban la PR más eficazmente en
ELONA Sandwich incluyeron el aptámero AptGI6.1F como detector,
independientemente de cuál fuera el aptámero capturador.
6) Los dos tampones de lisis empleados en la preparación de la muestra
interfirieron en la detección de la PR por parte de los aptámeros, lo que sugiere la
necesidad de probar tampones alternativos o modificar el porcentaje de detergente
empleado para evitar que la PR se degrade.
7) Dada la elevada importancia en el ciclo viral de la proteína Gp41/Gp36 durante
la entrada del VIH en la célula humana, los resultados encontrados proporcionan
información de alto impacto diagnóstico y clínico. Así, la identificación de las regiones
más conservadas de Gp41/Gp36 entre variantes podría ayudar al diseño de fármacos
frente al virus y a mejorar el diseño de vacunas dirigidas frente a esta proteína. Además,
el uso de aptámeros capaces de reconocer dominios protéicos virales altamente
conservados entre variantes del VIH podría resultar una estrategia molecular muy
prometedora para el diagnóstico precoz del virus y en una futura terapia frente al VIH.

34
 7. CONCLUSIONS

1) To our knowledge, this study describes the conservation of HIV-1/HIV-2 viral

transmembrane glycoproteins (Gp41/Gp36) at aminoacidic level in the largest number
of sequences (10,579) and viral variants (64) to date.
2) The results have shown that the protein conservation can differ between variants
and protein domains, being Gp36 more conserved than Gp41, maybe due to the lower
number of available sequences in sequences database.
3) We identified the four most conserved Gp41 domains (N-HR, FPPR, FP and
MPER) in all HIV-1 groups, with more than 90% amino acid conservation, which possibly
makes them the best therapeutic and diagnostic targets.
4) We calculated sensitivity and specificity of two aptamers against HIV PR, showing
that AptGI6.1F aptamer had a better sensitivity than AptGI6.16F aptamer, being able to
capture 1,25pmoles of PR.
5) The best aptamer combinations in ELONA Sandwich assays included AptGI6.1F
as detector aptamer, detecting HIV PR more efficiently, regardless which one was used
as capturing aptamer.
6) The two lysis-buffers used for sample preparation interfered with PR detection by
the aptamers, suggesting the need of testing alternative buffers or modifying the
detergent percentage used to prevent PR degradation.
7) Due to the high importance of Gp41/Gp36 protein in viral cycle during HIV entry
into human cell, the found results provide information of high diagnostic and clinical
impact. The identification of the most conserved protein domains across HIV-1/HIV-2
variants could help during the design of anti-HIV drugs and vaccines directed against
this viral protein. Moreover, the use of aptamers able to recognize highly conserved viral
protein domains across HIV variants could be a promising molecular strategy for early
viral diagnosis and in future therapy against HIV.

35
 8. BIBLIOGRAFÍA

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39
 9. APÉNDICES
40

Apéndice 1.1. Localización de anticuerpos humanos sobre la secuencia y dominios de Gp41. AA, aminoácidos; HXB2, secuencia de referencia (subtipo
B, nº de acceso del GenBank K03455); FP, péptido de fusión; FPPR, región próxima al péptido de fusión; N-HR, región hepta-helicoidal N-terminal; IL, región
de unión inmunodominante; C-HR, región hepta-helicoidal C-terminal; MPER, región de membrana proximal externa.

40
Apéndice 3.1. Proceso SELEX detallado.

1) Inmovilización de 1µg de cada péptido de interés biotinilado (Proteogenix) y disuelto

en PBS con 100µl de Coating Buffer (Seracare) en dos pocillos de una placa m96
(0,5µg/pocillo).
2) Incubación con agitación a 4ºC en cámara fría durante toda la noche.
3) Lavar al día siguiente los pocillos tres veces con 200µl de PBS/Mg 1mM (tampón de
selección).
4) Incubar a 95ºC 10 min y otros 10 min en hielo para estructurar la librería de
oligonucleótidos RND35 [stock: 100µM] (IBA). Estos oligonucleótidos presentan una
región central de 35 nts aleatorios flanqueados por dos regiones conservadas F5 y
R5, que permitirán su posterior amplificación empleando cebadores específicos de
esas zonas.
5) Plaquear 25µg de la librería RND35 entre los dos pocillos e incubar una hora en
agitación a temperartura ambiente.
6) Realizar tres nuevos lavados para eliminar los aptámeros no unidos al péptido de
interés.
7) Preparar mix de la PCR1 (Volumen final=50µl) con cebadores F5 y R5 (0,8µM),
dNTPs (0,2mM), MgCl2 (3mM) y Taq ADN polimerasa (Biotools).
8) Plaquear los 50µl de mix de PCR previamente calentada (95ºC, 10min) e incubada
en estufa con agitación (80ºC, 5min) en los pocillos.
9) PCR de 10 ciclos de amplificación (95ºC 30seg / 57ºC 20seg / 72ºC 30seg).
10) PCR de ciclos: PCR1 (2µl) y mix de PCR (50µl, mismas condiciones que PCR1 pero
con 5, 10 y 15 ciclos). Revelar amplificados en gel de agarosa 3x en tampón TAE.
Elegir ciclo con mejor amplificado sin perder especificidad.
11) PCR2: mismas condiciones que PCR1 con el número de ciclos elegido en la PCR
de ciclos, pero aumentando el volumen final a 400µl.
12) Cuantificar 5µl del amplificado PCR2 en el espectrofotómetro NanophotometerTM
PVC (IMPLEN). Precipitar el resto del amplificado con sales (Acetato sódico 0,3M
+ MgCl2 10mM) y etanol. Resuspender precipitado en PBS/Mg 1mM (volumen
necesario para obtener 25µg). Realizar las siguientes rondas de selección a partir
de esta nueva librería de oligonucleótidos.
El mismo proceso se realiza para la selección en resina, con la diferencia de que se
utilizan tubos eppendorf de 1,5ml y que después de cada lavado se centrifugan a 2300g.

41
Apéndice 3.2. Ensayo ELONA de las rondas 3 y 6 detallado.

1) PCR3r3 y PCR3r6: mismos cebadores que PCR1 (Apéndice 3.1) pero marcados con
digoxigenina. Añadir 2µl de PCR1 de las rondas 3 y 6 como molde y número de ciclos
elegido en PCR de ciclos (paso 10, Apéndice 3.1). Visualización y cuantificación del
amplicón en gel de agarosa 3x.
2) Inmovilizar 1 µg/pocillo de cada péptido con 100µl de Coating Buffer. Incubar a 4ºC
con agitación durante toda la noche.
3) Al día siguiente realizar tres lavados con 200µl de PBS-Tween 0,1% y bloquear con
200µl de PBS/Mg + BSA 0,5%, dejando incubar la placa en agitación a temperatura
ambiente durante una hora.
4) Mientras ocurre la incubación, calentar el amplicón de PCR3 a 95ºC 10min y enfriar
otros 10min en hielo para estructurar los aptámeros.
5) Realizar tres lavados y plaquear 100µl del amplicón de PCR3 en cada pocillo. Incubar
durante una hora en agitación a temperatura ambiente.
6) Realizar tres lavados e incubar la placa con 100µl del anticuerpo anti-digoxigenina
peroxidasa (Roche) con PBS/Mg + BSA 0,2% (dilución 1:1000) durante una hora en
agitación a temperatura ambiente.
7) Revelar con 100µl de ABTS (sustrato de la peroxidasa) y leer a 405nm de
absorbancia en el Lector de microplacas multimodo de fluorescencia Infinite M Plex
(https://www.medicalexpo.es/prod/tecan/product-80772-835525.html) tomando 6
medidas cada 10 min.

42
Apéndice 3.3. Esquema del ELONA de afinidad de RT del VIH-1. Pasos 2-6 del
ELONA de las rondas de selección (Apéndice 3.2). RT, retrotranscriptasa; ng;
nanogramos; mg, miligramos; ml, mililitros; nM, nanomolar.

Apéndice 3.4. Esquema del ELONA de sensibilidad y especificidad de PR VIH-1.

Pasos 2-6 del ELONA de las rondas de selección (Apéndice 3.2). PR, proteasa; CN,
control negativo con BSA, albúmina de suero bovino (100ng); mg, miligramos; ng;
nanogramos; ml, mililitros; nM, nanomolar.

43
Apéndice 3.5. ELONA Sandwich y esquema con las diferentes combinaciones de
aptámeros frente a la PR VIH-1. PR, proteasa; CN1, primer control negativo con 200ng
de BSA, albúmina de suero bovino; CN2, segundo control negativo con PR pero sin
aptámero detector; mg, miligramos; ng; nanogramos; ml, mililitros; nM, nanomolar.

1) Inmovilizar 100µl de aptámeros sin marcar (concentración final de 0,5 µM/pocillo)

previamente estructurados como en paso 4 Apéndice 3.2, junto con 50µl del tampón
sciSPOT Oligo B2 (Scienion), 39,1µl de H2O y 0,9µl de MgCl2 [100mM] Incubar a 4ºC
con agitación durante toda la noche.
2) Realizar al día siguiente tres lavados con 200µl de PBS-Tween 0,1% y bloquear con
200µl de PBS/Mg + BSA 0,5%, dejando incubar la placa en agitación a temperatura
ambiente durante una hora.
3) Hacer tres lavados y plaquear 100µl de PR (100ng) y BSA (200ng) con PBS/Mg 1mM
en los pocillos correspondientes. Incubar una hora en agitación a temperatura
ambiente.
(Pasos 4-7 iguales Apéndice 3.2)

44
Apéndice 3.6. ELONA Sandwich empleando aptámeros frente a la PR del VIH-1 y
muestras DBS lisadas con dos tampones de lisis. PR, proteasa; DBS, muestras de
sangre seca o dried blood specimens; CN1, control negativo primero con BSA, albúmina
de suero bovino (200ng); CN2, control negativo segundo con PR pero sin aptámero
detector; Bn, tampón de lisis Nuclisens EasyMag; Bma, tampón de lisis MA1; mg,
miligramos; ng; nanogramos; ml, mililitros; nM, nanomolar.

Para realizar el ELONA Sandwich empleando muestras clínicas, se hacen los mismos
pasos del Apéndice 3.5, a excepción del paso 3, ya que se deben lisar las muestras
antes de añadirlas al ensayo de la siguiente manera:

1) Recortar dos círculos de la tarjeta de papel Whatman que lleva la sangre seca
(DBS).
2) Añadirlos a 1,5 ml de tampón de lisis.
En este TFM empleamos dos tampones diferentes: Bn (Tampón de lisis
Nuclisens EasyMag de Biomerieux) y Bma (Tampón de lisis MA1: 10mM HEPES,
pH 7,9; 10mM KCl; 0,1mM EDTA; 0,1mM EGTA; 1mM DTT; una pastilla de
inhibidores de proteasa por cada 10ml de tampón y 6,25% NP40).
3) Incubar los dos círculos, cada uno con un tampón, con agitación durante 30 min
en rotamix intelli-mixer (ELMI).
4) Después, realizar tres lavados y plaquear según esquema.
5) Incubar una hora en agitación a temperatura ambiente.

45
46

Apéndice 4.1. Aptámeros disponibles en el laboratorio previos a este TFM. PR, proteasa; RT, retrotranscriptasa; IN, integrasa; nM, nanomolar; KD,
constante de afinidad.

46