26/2/2020 Inmunoprecipitación: 7 claves para un ensayo exitoso - Abyntek Biopharma
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INMUNOPRECIPITACIÓN: 7
CLAVES PARA UN ENSAYO
EXITOSO
por Abyntek | Mar 8, 2018 | Anticuerpos, Aplicaciones, Investigación |
La inmunoprecipitación es un inmunoensayo de uso frecuente que se vale de
anticuerpos inmovilizados sobre un soporte sólido para aislar, a partir de una
muestra compleja, una proteína especí ca.
Las aplicaciones de la inmunoprecipitación van desde el estudio de presencia o
abundancia relativa de una determinada proteína, hasta estudios de funcionalidad
e interacción entre proteínas y estudios de modi caciones postraduccionales o de
per les de expresión.
En esta entrada os traemos algunas claves y aspectos críticos para un ensayo de
inmunoprecipitación exitoso.
7 CLAVES PARA UN ENSAYO DE INMUNOPRECIPITACIÓN
EXITOSO
1.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Antes de llevar a cabo el protocolo de inmunoprecipitación, es necesario extraer
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deberá estabilizar la conformación nativa de la proteína, inhibir la actividad
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enzimática, evitar la desnaturalización del sitio de unión al anticuerpo y asegurar la
máxima liberación del antígeno a partir de las células o tejidos de partida.
Para evitar fenómenos de proteólisis, desnaturalización y desfosforilación, una vez
extraído el antígeno de la muestra original, éste deberá conservarse en frío.
También reduciremos el riesgo de estos fenómenos añadiendo inhibidores de
fosfatasas y proteasas al bu er de lisado.
A continuación, el antígeno extraído deberá ser preaclarado mediante puri cación
con proteína A o G para eliminar otros antígenos no deseados que puedan estar
incluidos en la muestra, y que podrían dar lugar a uniones no especí cas.
2.- SELECCIÓN DE LOS ANTICUERPOS
Como norma general para los ensayos de inmunoprecipitación, se optará por un
anticuerpo policlonal como anticuerpo de captura. La razón principal es que los
anticuerpos policlonales se unen a múltiples epítopos de una misma proteína
diana, y forman inmunocomplejos más fuertes que los anticuerpos monoclonales.
Podéis ampliar la información sobre los pros y contras de los anticuerpos
policlonales y monoclonales en esta entrada.
3.- MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS
Los anticuerpos policlonales que se utilicen en los ensayos de inmunoprecipitación
pueden estar en forma de antisuero, precipitados con sulfato amónico, o
puri cados por a nidad con proteína A o G. Estos último resultan preferentes ya
que al presentar un mayor grado de pureza son más especí cos y por lo tanto con
ellos se reducirán las uniones no especí cas y el ruido de fondo.
4.- TÍTULO DE LOS ANTICUERPOS
La titulación de los anticuerpos resulta un paso fundamental para optimizar el
resultado de nuestro ensayo de inmunoprecipitación. De esta manera evitaremos
que el inmunoensayo resulte ine ciente (por falta de anticuerpo) o no especí co
(por exceso de anticuerpo).
5.- CONTROLES
Como siempre, para la correcta interpretación de los resultados, también el los
ensayos de inmunoprecipitación resulta esencial incluir una serie de controles
tanto positivos como negativos.
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6.- PASOS DE LAVADO
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Los pasos de lavado son críticos para la obtención de un resultado especí co. Con
ellos eliminaremos las proteínas que no se hayan unido al anticuerpo, evitando así
señales inespecí cas.
Es necesario optimizar los pasos de lavado, ya que un exceso de lavado podría
llevarnos a una reducción de las uniones antígeno-anticuerpo.
7.- BUFFERS
Además del bu er de lisado del que hemos hablado en el punto 1, hay que
seleccionar adecuadamente el reto de bu ers que se utilizarán en el ensayo de
inmunoprecipitación como el bu er de unión, el de lavado y el de elución.
Bu er de unión
Generalmente, las interacciones antígeno-anticuerpo se dan en prácticamente
cualquier bu er con un pH cercano al neutro como PBS o TBS, aunque en
determinados casos habrá que valorar el uso de bu ers de unión más especí cos.
Bu er de lavado
Deberá favorecer unas condiciones en las que se mantenga la interacción con la
proteína de interés, pero se evite la unión de proteínas no especí cas.
Generalmente se parte de bu ers con concentraciones salinas y pH siológico
como PBS o TBS, y se añaden los reactivos que en cada caso sean necesarios.
Bu er de elución
El bu er de elución deberá tener la fuerza y el pH necesarios para asegurar la
correcta elución de las proteínas a partir de los beads.
Para terminar esta entrada, os recordamos este post relacionado sobre Solución de
problemas en Inmunoprecipitación (IP) que puede resultaros de interés.
Español
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