LIBRO DE RESÚMENES


Pósters XXXVII Congreso SEBBM

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Granada 2014 Pósters

Primera edición: Septiembre 2014

© los autores, 2014

XXXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular
Publica: Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM)

Producción editorial: Rubes Editorial, S.L.

Sicilia, 253 – 6º 4ª. 08025 Barcelona

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Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Índice

Agradecimientos ....................................................................... 5

Comité organizador ..................................................................... 6

Junta Directiva de la SEBBM .............................................................. 7

Socios protectores de la SEBBM ............................................................ 7

Conferencias plenarias ................................................................... 8

Simposios ............................................................................ 11

S1 Biomedicina molecular ............................................................ 11

S2 Biotecnología de plantas y productos de valor añadido ...................................... 15
S3 Estructura y función de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Pósters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

P00 II Workshop sobre la Innovación Docente en la Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular ...... 24
P01 Apoptosis .................................................................... 27
P02 Bases moleculares de la patología ................................................... 33
P03 Biología del desarrollo ........................................................... 50
P04 Biología molecular computacional ................................................... 53
P05 Biomembranas y bioenergética ..................................................... 55
P06 Bioquímica de la nutrición ........................................................ 62
P07 Bioquímica perinatal ............................................................ 66
P08 Bioquímica y biología molecular de plantas ............................................ 68
P09 Biotecnología molecular .......................................................... 76
P10 Estructura y función de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
P11 Genómica y proteómica ........................................................... 103
P12 Metabolismo del nitrógeno ........................................................ 112
P13 Neurobiología molecular .......................................................... 117
P14 Parasitología molecular ........................................................... 125
P15 Radicales libres y estrés oxidativo ................................................... 133
P16 Regulación de la expresión génica y dinámica del genoma .................................. 141
P17 Regulación metabólica ........................................................... 149
P18 Señalización celular ............................................................. 159
P19 Transgénesis en mamíferos ........................................................ 173
P20 Transportadores de membrana ...................................................... 175

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Granada 2014 Pósters

Agradecimientos

Nuestro agradecimiento a las entidades públicas y privadas que han colaborado económicamente en la realización del XXXVII
Congreso de la SEBBM.

Ministerio de Economía y Competitividad

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Junta de Andalucía
Universidad de Granada
Parque de las Ciencias
Turismo Ciudad de Granada

Fundación BBVA
Fundación Lilly
Fundación Ramón Areces
L’Oréal – For Women in Science
FEBS
PABMB

Bio-Rad
Canvax

BIOTOOLS
Condalab
Cultek
Ecogen
Eppendorf
Gilson
Izasa-Werfen
Neuron
Panreac Applichem
Sarstedt
StabVida
Vitro
Fisher Scientific
Sigma

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Pósters
Comité organizador
Presidente
Juan Luis Ramos (Estación Experimental del Zaidín, CSIC,
Granada - Abengoa Research, Sevilla)
Comité ejecutivo
Federico Mayor Menéndez (presidente de la SEBBM, Centro
Biología Molecular «Severo Ochoa», Universidad Autónoma
de Madrid)
Miguel Alaminos Mingorance (Facultad de Medicina,
Universidad de Granada)
María Dolores Girón González (tesorera, Facultad de
Farmacia, Universidad de Granada)
Tino Krell (Estación Experimental del Zaidín, CSIC,
Granada)
Irene Díaz Moreno (responsable de Congresos y Cursos de
la SEBBM, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis,
cicCartuja, CSIC-Universidad de Sevilla)
Miguel Ángel Navarro Carretero (Instituto de Parasitología y
Biomedicina «López-Neyra»-CSIC, Granada)
Enrique de la Rosa Cano (responsable de Grupos de la
SEBBM, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC,
Madrid)
Joaquín Ros i Salvador (coordinador de la Comisión Asesora
de Congresos SEBBM, Facultad de Medicina, Universidad
de Lérida)
Rafael Salto González (secretario, Facultad de Farmacia,
Universidad de Granada)
María Dolores Suárez Ortega (vicepresidenta, Facultad de
Farmacia, Universidad de Granada)
Otros miembros del Comité organizador - Junta Directiva de
la SEBBM
Alicia Alonso Izquierdo (vicepresidenta y Responsable de
Relaciones Internacionales de la SEBBM, Departamento
de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad del País
Vasco)
Juan P. Bolaños Hernández (responsable del Portal
Electrónico de la SEBBM, Instituto de Biología Funcional y
Genómica, IBFG, Universidad de Salamanca)
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XXXVII Congreso SEBBM
Carme Caelles Franch (responsable de Jóvenes de la
SEBBM, IRB-Barcelona, Universidad de Barcelona)
Marta Cascante Serratosa (responsable de Cónsules de la
SEBBM, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona)
Crisanto Gutiérrez Armenta (tesorero de la
SEBBM, Centro Biología Molecular «Severo Ochoa», CSIC-
UAB, Madrid)
Almudena Porras Gallo (secretaria Científica Electa de la
SEBBM, Facultad Farmacia, Universidad Complutense de
Madrid)
Isabel Varela Nieto (secretaria Científica de la SEBBM,
Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-Universidad
Autónoma de Madrid)
Otros miembros del Comité organizador - Comité local:
Mª José Alejandre Pérez (Facultad de Ciencias, Universidad
de Granada)
Matilde Barón Ayala (Estación Experimental del Zaidín,
CSIC, Granada)
Andrés Belver Cano (Estación Experimental del Zaidín,
CSIC, Granada)
Francisco Gamarro Conde (Instituto de Parasitología y
Biomedicina «López-Neyra», CSIC, Granada)
Juan José Lázaro Paniagua (Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada)
Ana Linares Gil (Facultad de Ciencias, Universidad de
Granada)
Eduardo López-Huertas León (Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada)
Esperanza Ortega Sánchez (Facultad de Medicina,
Universidad de Granada)
Mariam Sahrawy Barragán (Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada)
Luisa María Sandalio González (Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada)
Alberto M. Vargas Morales (Facultad de Farmacia,
Universidad de Granada)
Granada 2014 Pósters

Junta directiva de la SEBBM

Presidente Enrique de la Rosa Cano (2010-2014)

Federico Mayor Menéndez (2012-2016) [Grupos Científicos]

Vicepresidenta Juan Luis Ramos Martín (2010-2014)

Alicia Alonso Izquierdo (2010-2014) [Empresa y Patrocinadores]
[Relaciones exteriores y COSCE]
Juan Pedro Bolaños Hernández (2012-2016)
Secretaria [Página web]
Isabel Varela Nieto (2010-2014)
[Divulgación] Carmen Caelles Franch (2012-2016)
[Jóvenes Investigadores]
Tesorero
Crisanto Gutiérrez Armenta (2012-2016) Irene Díaz Moreno (2012-2016)
[Congresos y Cursos]
Vocales
Marta Cascante Serratosa (2010-2014) Secretaria Electa
[Cónsules] Almudena Porras Gallo (2012-2014)

Socios protectores de la SEBBM

Los Socios protectores de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) contribuyen al progreso de la ciencia.

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Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Conferencias Plenarias

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Granada 2014
Conferencia inaugural Alberto Sols –
Fundación BBVA
CP01-1 (R01-1)
Selfish genes vs selfish metabolism: how
environmental bacteria conquer the chemical space
Víctor de Lorenzo
Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid-Cantoblanco, ES
Bacteria that colonize sites polluted by industrial waste are capable of
metabolizing synthetic and recalcitrant chemicals that have been in the
biosphere for only a few years. This capability is orchestrated by the
integration of environmental and physiological signals into regulatory
systems that tightly control the expression of genes that are in charge of
degrading such molecules. The emergence of these capabilities is due not
only to the adaptation of catabolic enzymes acting on new substrates, but
also to the emergence of new regulators that firmly control the expression
of the genes involved in the production of catabolic enzymes.
This scenario provides a good case to examine how transcriptional factors
that respond to small molecules can adjust their specificity to novel signals,
the significance of the effects of individual changes on overall behaviour of
the evolving regulators and the role of other environmental and physiological
circumstances in the process. Biological bottlenecks for biodegradation of
recalcitrant compounds include [i]unfavourable thermodynamics of (bio)
chemical reactions at stake, [ii] lack of specificity of existing pathways and
enzymes for novel substrates, and [iii] physicochemical stress encountered
in polluted sites. Besides these limitations, bacterial cells also experience
increased endogenous oxidative stress during metabolism of aromatic
compounds, which is exacerbated when enzymes meet suboptimal substrates.
Two experimental systems were employed to examine this issue. First, we studied
the regulation of the TOL plasmid-encoded upper and lower operons of the soil
bacterium Pseudomonas putida mt-2, a toluene and m-xylene degrader, on the
background of endogenous production of reactive oxygen species (ROS) during
the process. ROS-responsive dyes and flow cytometry helped to quantify stress
associated to each metabolic block and its relationship with redox metabolism.
We also examined oxidative stress brought about by the still-evolving
2,4-dinitrotoluene biodegradative pathway in Burkholderia sp. DNT. The dnt
pathway of this bacterium apparently evolved from a precursor naphthalene
degradation route and the first enzyme (2,4-dinitrotoluene dioxygenase)
maintains some activity towards its earlier substrate [1]. Examination of both
in vivo reactions and the associated regulatory system suggests that ROS
production is the first bottleneck that evolving pathways have to overcome for
dealing with novel compounds [2]. Evolutionary consequences [3] -and some
hints for engineering new biocatalysts [4] will be discussed.
References
[1] de las Heras, A., Chavarría, M. and de Lorenzo V. Mol Microbiol 2011;
[2] Pérez-Pantoja, D., Nikel P.I., Chavarría M. and de Lorenzo, V.
[3] de Lorenzo, V. BioEssays 2014; 36: 226-35.Phil Trans B Roy Soc
2013; 368: 20120377.
Conferencia plenaria L’Oréal-UNESCO
For Women in Science
CP02-1 (R02-1)
Structures and mechanisms of bacterial
transcriptional regulation via oligomeric proteins
Xiadong Zhang
Centre for Structural Biology, Imperial College London, Londres, UK
Bacterial gene transcription depends on the binding of RNA polymerase
to a wide range of sigma factors that recognize specific promoter DNA
Conferencias Plenarias
sites to achieve specificity. Two classes of sigma factors exist in bacteria.
The σ70 −class includes most sigma factors and the RNAP σ70 -promoter
complex can often spontaneously converts to the open complex, which
is competent for transcription. In contrast, the complex between RNAP
and its major variant sigma factor σ54 remains as a closed complex
which is incompetent for transcription until ATP hydrolysis-dependent
remodelling by activator proteins occurs. The activator proteins, which
belong to the AAA+ protein family, bind remotely to the DNA sequences
upstream of the transcriptional starting site and contact RNAP-σ54
through DNA looping. Most AAA+ activators contain three domains: a
N-terminal regulatory domain, a central AAA+ domain and a C-terminal
DNA binding domain. The regulatory domain senses environmental
changes and controls the activities of the AAA+ domain while the AAA+
domain contacts RNAP-σ54 and uses ATP binding and hydrolysis to
remodel the closed complex. In addition, bacteria gene transcription can
be inhibited though simple blockage of promoter sites.
Over the last few years we have used a combination of X-ray crystallography,
cryo-electron microscopy single particle analysis and functional analysis to
understand why RNAP-σ54 remains as a closed complex, how the AAA+
activator interacts with and induces changes in RNAP-σ54 that ultimately
lead to transcriptional activation and how binding and hydrolyzing ATP are
coupled to the activation process. I will present our results and explain why
RNAP-σ54 is unable to proceed to transcription, how a hexameric AAA+
protein interacts with and remodels the asymmetric RNAP-σ54-DNA using
ATP binding and hydrolysis, how these activators are organised at the
enhancer-binding site and how their ATPase activity is controlled by both
the regulatory and DNA-binding domains. In addition, I will discuss how
oligomeric proteins interact with their DNA operators in order to achieve
repressive functions.
Conferencia plenaria Leloir
CP03-1 (R03-1)
The brain speaks back to the ear: molecules,
physiology and pathology of the efferent
olivocochlear-hair cell synapse
Ana Belén Elgoyhen
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología
Molecular, Dr. Héctor N. Torres, CONICET, Buenos Aires, AR
In bringing information about the world to an individual, sensory
systems perform a series of common functions. Each system responds
with some specificity to a stimulus and each one employs some
specialized receptor cells at the periphery to translate specific stimuli
into electrical signals that all neurons can use. That initial electrical
event begins the process by which the central nervous system constructs
an orderly representation of for example, sounds, odors, tastes and
objects. Thus, basic sound detection begins when sound waves strike
the eardrum, which transmits that physical stimulus to the organ of Corti
within the cochlea, the sensory epithelium of the mammalian inner ear.
Here the primary receptor cells known as inner hair cells transform the
information into electrical signals that are sent to the central nervous
system by the auditory nerve. However, unlike vision, touch and the
chemical senses, sound processing is modulated by efferent signals that
travel in reverse, from the brain back to the inner ear. One fundamental
question in auditory neuroscience is what role(s) this feedback plays in
our ability to hear. The presentation will overview our work over the
years which has contributed to elucidate the molecules which operate at
this efferent olivocochlear-hair cell synapse, how the synapse operates
to fine tune amplification in the inner ear and the role of the efferent
system in protection from acoustic trauma.
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Conferencias Plenarias XXXVII Congreso SEBBM

posttranscriptional regulation of gene expression. Examples will be

Conferencia plenaria Niemeyer - PABMB
CP04-1 (R04-1)
Caveolin-1, a pleiotropic molecular switch
in cancer development and progression
Andrew F.Q. Quest
Laboratorio de Comunicaciones Celulares, Centro de Estudios
Moleculares de la Célula (CEMC), Centro de Estudios Avanzados
en Enfermedades Crónicas (ACCDiS), Programa de Biología Celular
y Molecular, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile,
Santiago de Chile, CL
Cancer is a leading cause of human suffering and death worldwide,
whereby most patient deaths are caused by metastatic dissemination rather
than primary tumor growth. Understanding the mechanisms that favor
such development is currently an area of great interest given the potential it
holds for designing successful therapeutic intervention strategies. A central
dogma in cancer research over the last decades has been that changes at the
molecular level, referred to as “gain-of-function” in oncogenes or “loss-
of-function” in tumor suppressor genes, contribute to the genesis of this
disease. Because it is generally thought that any given protein will belong to
one or the other category, but not to both, treatment strategies will in general
terms seek to enhance tumor suppressor and block oncogene function.
Paradoxically, Caveolin-1 (CAV1), a member of the caveolin family of
scaffolding proteins, is implicated in cancer development and progression
both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. In recent years,
research from this laboratory has sought to shed light on this enigma. Tumor
suppression by CAV1 was linked to E-cadherin-dependent suppression of
genes, including survivin and cyclooxygenase-2, and augmented apoptosis.
However, in the absence of E-cadherin, CAV1 promotes metastasis. More
recent studies implicate CAV1 tyrosine phosphorylation and activation
of a novel Rab5-Rac1 signaling axis in enhanced tumor cell migration,
invasion and metastasis. In the presence of E-cadherin, signaling via this
pathway and metastasis are suppressed. Thus, CAV1 switches roles in an
E-cadherin-dependent manner. Understanding such context-dependent
variations in protein function has important ramifications for our basic
understanding of signal transduction processes and cancer, as well as for
the development of successful strategies to treat the disease.
Acknowledgements: FONDECYT-FONDAP 15130011, FONDECYT
1130250, ACT1111 (AFGQ).
presented that highlight the role of structural changes and conformational
dynamics in the recognition of the 3’ splice site RNA during eukaryotic
pre-mRNA splicing, translational regulation and RNA stability.
Conferencia plenaria de clausura
Fundación Ramón Areces
CP06-1 (R06-1)
Understanding the role of proteolysis in disease
Charles S. Craik
University of California San Francisco, San Francisco, US
Virtually any biological process can be linked to a proteolytic event. With
approximately 2% of the human genome encoding a protease a plethora
of these enzymes exist, several of which have already been shown to play
roles in diverse physiological processes including development, innate and
adaptive immunity, cell cycle regulation and apoptosis. In situations where
a unidirectional signal is required, the hydrolysis of a peptide bond can
provide an irreversible, one-way event in a complex signaling pathway.
Similarly, the genomes of most other organisms ranging from viruses and
microorganisms to metazoans have 2 to 4% of their genomes dedicated to
proteases. In cases where there is a direct link between the proteolytic event
and disease, significant opportunities exist for therapeutic intervention. For
these reasons, there has been a great deal of interest in protease biology and
in dissecting the complex regulation, localization and activation of protease
function.
Identifying the actual proteases involved in physiological events,
locating the natural substrates of the enzymes and selectively regulating
their activity is of prime importance to the field. This talk will focus on
a highly important subset of the large area of proteolysis to provide a
window into this rich area of research. Methodologies will be presented
that allow the global activity of proteolysis to be determined in complex
biological systems and permit the non invasive imaging of protease activity
in various disease states. These efforts to understand the mechanism of
proteolysis in a biological context and in several cases, the relationship
between proteolysis and disease are providing insights regarding how best
to regulate proteolysis in infectious diseease and cancer.

Conferencia plenaria FEBS National

Lecture
CP05-1 (R05-1)
Dynamics of protein-RNA interactions in
posttranscriptional regulation of gene expression
Michael Sattler
Institute of Structural Biology, Helmholtz Zentrum München,
Neuherberg, and Center for Integrated Protein Science Munich and
Biomolecular NMR, Technische Universität München, Garching,
München, DE
Eukaryotic multi-domain proteins play crucial roles in the regulation of
gene expression and cellular signaling. The structure of these proteins often
depends on dynamic domain arrangements that are modulated by binding
to RNA and/or other proteins. We employ integrated structural biology
combining solution techniques such as NMR-spectroscopy and small
angle scattering experiments with crystallography to study the structure
and dynamics of multi-domain proteins involved in various aspects of

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Granada 2014 Pósters

Simposio 1:
Biomedicina molecular

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Simposios
S1.1 Enfermedades moleculares
S1.1-1 (R1.1-1)
Pancreatic cancer: From molecular
understanding to personalized treatment
Manuel Hidalgo
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES
Pancreatic cancer remains one of the most deadly cancers. Over the last
few years, the genomic landscape of pancreatic cancer as well as precursor
pancreatic cancer lesions have been deciphered in great depth. These studies
show that PDA develops as the consequence of accumulation of mutations in
key oncogenes and tumour suppressor genes. The disease, once established,
is characterized by high complexity, heterogeneity and genomic instability.
Despite this facts, some patients harbour actionable mutations which targeting
has resulted in significant clinical benefit. Indeed, one of the most active
areas of research in PDA is the development of strategies and approaches
to personalize the treatment of patients. This is a complex field that can be
tackle from many complementary angles. Our group has been interested in
using patient derive xenogaft (PDX) models, aka Avatar mouse models, to
guide cancer treatment. A piece of freshly collected tumour is implanted in
immunodeficient mouse models, expanded, treated with different anticancer
agents alone and in combination to select the most effective drug/regimen to
treat the patient cancer. Our data show that the approach is highly predicted
but, because of complexity and cost issues, not widely applicable to clinical
practice at the present stage. To solve some of these limitations we are working
on different aspects. One area is technological development to increase the take
rate of tumours and to speed time to engraftment and expansion time.
Currently, these figures are approximately 60-80 % and 5-7 months. Studies
are in progress to optimize this aspect. Another key question is the selection
of agents, both alone and in combination, to be tested in the model. In this
regard, it is important to integrate biomarker assessment in the tumour to
pre-select a series of treatment candidates that can then be tested in the PDX
models. To this end, we have now integrated next generation sequencing
and assessment of copy number variation in patient’s tumour. These studies
provide us with an unbiased overview of the tumour genomic landscape.
From this data, using different bioinformatics and biological methods we
extract the most relevant drug targets that are then bench tested against the
patient Avatar mouse model to select the most effective treatment.
Another area of great interest in PDA therapeutics is the cancer
microenvironment. PDA is known for a flourish cancer stroma composed of
extracellular matrix and cells including inflammatory, immune and cancer
associate fibroblast. Strategies aiming to eliminate the cancer stroma with
agents such as hyaluronidase and Hh inhibitors among others have received
substantial attention. nabPTX, an agent proposed to target SPARC, one of
the key elements in the PDA stroma, has shown improvement in overall
survival and has received regulatory approval for this disease. Agents in
this category will also be reviewed.
Finally, strategies to target the cancer stem cell will be presented.
Laboratory studies have shown the presence of a small percentage of cells
in PDA tumours with stem properties. These cells can be identified by
membrane markers and are considered to be resistant to chemotherapy and
radiotherapy. It is possible, that CSC is responsible for cancer failure after
definitive chemotherapy and radiotherapy and there is significant interest
in developing agents to selectively eliminate these cells.
S1.1-2 (R1.1-2)
Assessing the therapeutic role of Vav
oncoproteins in high-incidence diseases
Xosé R. Bustelo, Salvatore Fabbiano, Javier Robles, Luis Francisco
Lorenzo, María Barreira, Mauricio Menacho-Márquez
Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca, ES
Although there is a wide consensus regarding the potential therapeutic
role of Rho/Rac GDP/GTP exchange factors (GEFs), we have no formal
12
XXXVII Congreso SEBBM
demonstration that such idea is true for most high-incidence diseases.
Tackling this issue has been in fact rather difficult so far, since the human
genome contains more than 70 GEFs that, in many cases, are coexpressed
in the same cell types and tissues. Due to this, it is of paramount importance
to utilize “disease-mimetic” animal models to characterize unequivocally
the spectrum of GEF-dependent diseases, identify the best therapeutic
targets of the GEF family for specific high-incidence diseases or disease
subtypes and, in addition, unveil the GEF-dependent Achilles’ heels
present in those diseases that can be used to devise new ways to attack
them pharmacologically. In our lab, we are addressing the above issues
using as working model the Vav GEF subfamily. The three members of
this subfamily present in mammalian species (Vav1, Vav2, Vav3) are
characterized by being directly regulated by phosphorylation on specific
tyrosine residues. Due to this, these GEFs are specialized in connecting
stimulated upstream protein tyrosine kinases with the activation of
downstream Rho/Rac GTPases during both normal and pathophysiological
signaling responses. To this end, we are using both standard and “second-
generation” genetically modified mice to assess the pros and cons of the
inactivation of these proteins in a number of high-incidence diseases. Using
this approach, we have discovered that two Vav subfamily members (Vav2
and Vav3) play critical roles in breast and skin primary tumorigenesis,
the metastasis of cancer cells to the lung, obesity, and obesity-linked
comorbodities (i.e., metabolic syndrome, liver esteatosis, type II
diabetes). We have also discovered that the inactivation of any of those
two proteins also leads to negative effects in the cardiovascular system.
However, such collateral defects can be easily bypassed by treatments
with currently available anti-hypertension therapies. Finally, the dissection
of the role of Vav proteins in these diseases has allowed us to discover
biological programs and gene signatures that have favored the molecular
understanding of those diseases, the identification of new targets, and the
diagnosis of some of those diseases. In this talk, we will provide an overall
view of the progress made in these areas.
S1.1-3 (R1.1-3)
Muerte celular, senescencia y autofagia
en la pérdida de audición relacionada
con la edad: regulación por IGF-1
Isabel Varela-Nieto1, Adelaida Celaya2, Alejandro Gibaja2, Sara
Pulido2, Rocio de Iriarte2, Marta Magariños3
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM),
IdiPAZ y CIBERER, Madrid, ES, 2Instituto de Investigaciones
Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) y CIBERER, Madrid, ES,
3
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM),
Facultad de Ciencias (UAM) y CIBERER, Madrid, ES
La deficiencia congénita en el factor de crecimiento similar a la insulina
tipo 1 (IGF-1) es una enfermedad rara humana que produce alteraciones
severas del crecimiento y sordera neurosensorial. Este factor neurotrófico
es fundamental en la diferenciación postnatal tardía de la cóclea, su
ausencia causa muerte por apoptosis de las neuronas auditivas tipo I, y
otras alteraciones celulares en el receptor periférico y en las vías auditivas
centrales. Entre los mecanismos implicados se ha descrito la activación
de quinasas de estrés (MAPK8/9 y 14-FoxP3) y la inhibición de rutas de
supervivencia (AKT), de proliferación (MAPK1/3-FoxM1/p27Kip) y de
diferenciación celular (MEF2).
El IGF-1 en la edad adulta es un protector ótico, mantiene la fisiología
coclear y promueve la supervivencia de las neuronas auditivas. Durante
el envejecimiento, se produce senescencia neuronal, un aumento en la
expresión de genes de la maquinaria autofágica (Becn1, Atg4b yAtg5) y
en los niveles de marcadores proteicos de autofagosomas (LC3-II y p62),
neuroinflamación y una disminución en los niveles de IGF-1 que progresa
pari pasu con la pérdida auditiva relacionada con la edad (ARHL).
El componente neurodegenerativo de la ARHL empeora en situaciones
patológicas de déficit de IGF-1, agudizándose el fenotipo molecular,
celular y funcional, e incluso predispone al receptor auditivo a sufrir un
mayor daño cuando se somete a estrés.
Granada 2014
En conclusión, el IGF-1 es un neuroprotector ótico que favorece la
supervivencia celular, mientras que su déficit promueve procesos de
inflamación que producen un aumento del daño en la cóclea.
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos FP7-innova2 AFHELO
y la MCA TARGEAR.
S1.2 Señalización celular «cascadas
y dianas»
S1.2-1 (R1.2-1)
The loss of memory in Alzheimer disease
Jesús Ávila de Grado
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES
Memory impairment in Alzheimer disease (AD) could be related to a defect
in the function of hippocampal region of an AD patient. In this region,
dentate gyrus plays an important role in the formation of new memories.
The study of neurogenesis in dentate gyrus, in mouse models for AD, has
indicated some important features that could also take place in Alzheimer
disease patients.
S1.2-2 (R1.2-2)
The role of the JNK pathway in insulin resistance
Carme Caelles
Universidad de Barcelona, Barcelona, ES
During the last decade, the c-Jun N-terminal kinase (JNK) has emerged as
a major regulator of the insulin signalling and, hence, glucose homeostasis.
By directly targeting the insulin receptor substrate (IRS)-1 and -2 for
serine phosphorylation, JNK inhibits insulin signalling at very early steps.
Actually, JNK is activated by insulin and acts as a negative feedback
mechanism to turn off insulin signal under physiological conditions.
However, abnormal JNK activation due to stress, such as oxidative or
endoplasmic reticulum stress, or pro-inflammatory signals induces, by this
IRS-phosphorylation dependent mechanism, insulin resistance. In fact, the
insulin-sensitizing drugs and peroxisome-proliferator activated receptor
(PPAR) γ ligands thiazolidinediones (TZDs) restore glucose homeostasis
through inhibition of JNK, further supporting the role of this kinase as a
major mediator of obesity-induced insulin resistance. In addition to the
role of JNK in peripheral insulin-target tissues, JNK activity also regulates
insulin action in pancreatic β-cells. In this regard, in vivo ectopic activation
of JNK this cell type renders a glucose-intolerance phenotype in mice due
to the impairment of glucose- and insulin-induced insulin secretion and
gene transcription. Moreover, results form these mice demonstrate a direct
action of TZDs on pancreatic β-cells as TZD treatment inhibits this ectopic
JNK activation and, thereby, restores insulin signalling and glucose- and
insulin-induced secretion in pancreatic islets, and glucose tolerance in the
mice.
S1.2r-3 (R1.2-3)
Deciphering the insights of poly(ADP-ribosylation)
in metastasis
Francisco Javier Oliver Pozo
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES
Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are a group of DNA-dependent
nuclear enzymes (also named ARTD) which catalyze the synthesis and
transfer of negatively charged ADP-ribose moieties from nicotinamide-
Simposios
adenine-dinucleotide (NAD+) to a number of target protein substrates,
leading to the alteration of chromatin associated proteins. PARP-1, the
founder member, is an active player in tumor adaptation to metastasis
and PARP inhibitors, recognized as promising therapeutic agents against
homologous recombination deficient tumors, have novel properties
responsible for the anti-metastatic actions in different tumor settings.
Poly(ADP-ribosyl)ation modulates pro-metastasic activities such as
hypoxic response, angiogenesis and epythelial to mesenchymal transition
(EMT).
Furthermore, key transcription factors are fine-tuned through this action,
helping to the adaptation of tumor to a hostile microenvironment, the
recruitment of new vessels, and stimulate the cellular changes promoting
EMT.
In this presentation we summarized some of the findings that focalize on
PARP-1’s action on tumor aggressiveness, suggesting new therapeutic
opportunities against an assembly of tumors not necessarily bearing DNA
repair defects.
S1.3 Ingeniería tisular y medicina
regenerativa
S1.3-1 (R1.3-4)
BIOLAMINATION for customised, rapid tissue
fabrication: printer optional
Robert Brown
University College London. Institute of Orthopaedics &
Musculoskeletal Sciences, RNOH, Stanmore Campus, Londres, UK
A quiet revolution is happening under the umbrella of tissue engineering as
we begin to understand that there are two distinct approaches available for
producing tissues. Not surprisingly, the approach we select has a profound
effect on the technology we use. Firstly, and most familiar, is the idea of
growing tissues by cultivation of cells in/on a substrate (often in bioreactors).
Secondly we can directly fabricate simple living tissues, in the same way
we ‘make’ cell-phones. In this case there is little or no contribution from
the cells, though they are incorporated as one of the basic building blocks.
Fabricating tissues directly is a concept which has entered largely from public
excitement around the extension of ideas in 3D bio-printing to incorporate
living cells and proteins into the system. In fact 3D cell-printing is only one
of a family of approaches which is better termed BIO-LAMINATION, in
which thin layers (micron scale) of ‘proto-tissue’ are laid down in series to
build up a stack and produce the gross-scale tissue.
In fact although bio-printing provides the popular image, it is presently
far from the most effective example of fabrication by bio-lamination, as
technical problems of cell survival and natural matrix polymerisation are
complex.
Other bio-lamination approaches include electro-spinning and cell and
matrix layering. Although attractive, the need for bio-printing and spinning
approaches to assemble the X-, Y-, AND Z-planes simultaneously creates
a technical hurdle. Matrix and cell layering techniques avoid this by firstly
mass-fabricating the X-Y plane layers, then stacking them to give the
Z-plane in a separate stage. Cell-rich constructs are fabricated by expansion
of cell sheets on specialised surfaces, matrix-rich X-Y layers by rapid co-
compression of cells and matrix proteins (eg collagen). Bio-lamination
fabrication has the capacity to mass produce real tissues (cells embedded
in a native extracellular matrix) in minutes. They can be mass- produced
reproducibly, economically, with simple or complex stacks of tissue
layers. They are already available for 3D tissue drug or disease screening,
customised grafts and advanced drug delivery. But however we produce the
component laminae, they require a number of special processing features.
These include the need (i) to incorporate living cells INTO the fabric of
the matrix at time zero (so no cell-seeding stage but conditions must be
13
Simposios
non-lethal): (ii) to fabricate the matrix primarily from a natural (eg protein)
fibre network; (iii) to provide tight, monitored controls such that the layers
are definable and reproducible when mass produced: (iv) to produce simple
constructs in minutes (rather than days/weeks). Where these criteria can
be met, new opportunities for high impact applications become possible.
S1.3-2 (R1.3-5)
Tejidos artificiales. Del laboratorio a la clínica
Antonio Campos
Facultad de Medicina, Universidad de Granada, Granada, ES
La ingeniería tisular constituye un ámbito de investigación multidisciplinaria
que, sustentada en la histología, tiene por objeto la construcción de tejidos
artificiales. Para la elaboración de los mismos, son necesarias células madre
con capacidad de proliferación y diferenciación selectiva, así como de
biomateriales de distinta naturaleza capaces de reproducir las propiedades
biomecánicas de los tejidos nativos. En la necesidad de articular las
propiedades biológicas de las células y las propiedades derivadas de
la naturaleza físico-química de los biomateriales radica el éxito de la
ingeniería tisular y, por tanto, la construcción de un tejido artificial idóneo
para la terapéutica. Un ejemplo de articulación específica es la construcción
de una córnea artificial en la que son necesarios biomateriales de calidad
óptica y células diferenciadas para el revestimiento y la regulación del
transporte iónico a partir del humor acuoso. El desarrollo de la ingeniería
tisular está llamado a generar una importante actividad industrial de base
nanotecnológica, al configurarse, además de como herramienta terapéutica,
como sustituto de los animales de experimentación en el contexto de la
legislación europea.
14
XXXVII Congreso SEBBM
S1.3-3 (R1.3-6)
Cardiac reverse remodelling by epigenetic ways
Susana González
CNIC, Instituto de la Salud Carlos III, Madrid, ES
The most important determinant of cardiovascular health is a person’s
age. Cardiovascular disease (CVD) is a scourge of the developed world,
where it is the leading cause of morbidity and mortality. Despite the
significant progress on many fronts in the cardiovascular field, heart failure
is a particularly debilitating form of cardiovascular disease, with a 50%
death rate in 5 years after diagnosis [Harvey and Leinwand, 2011]. Thus,
numerous gaps in our current knowledge of cardiac aging remain to be
filled. The role of epigenetic circuits has been extensively studied in cardiac
development and inherited cardiac disease [Chang and Bruneau, 2012].
In contrast, critical non-inherited epigenetic modifications controlling
age-associated homeostatic cardiac function in cardiovascular
pathophysiology remain poorly understood. Most studies of
atherosclerosis or cardiomyopathies have been performed in young mice,
while studies of genetic and pharmacological interventions that extend
lifespan rarely assessed whether CVD or heart function was improved
[North and Sinclair, 2012]. Given that the epigenetic Polycomb-member
Bmi1 is central transcriptional instructor in adult stem cell maintenance
[Luis et al., 2012], but unknown cardiac implication, and regulates
lifespan in mammals by targeting components of key longevity pathways
such as p16INK4a, we have explored the possible implication of Bmi1
in the maintenance of adult cardiac function. Using a combination
of conditional knockout models and biochemical analysis, we have
demonstrated that Bmi1 protects against dilated cardiomyopathy (DCM)
by repressing cardiac senescence.
Granada 2014 Pósters

Simposio 2:
Biotecnología de plantas y productos de valor añadido

15
Simposios
S2.1 Ingeniería genética de plantas
S2.1-1 (R2.1-1)
The creation and utility of synthetic genotypes
in plants: boundaries between metabolic
engineering and synthetic biology
C. Zhu1, T. Capell1, Paul Christou2
1
Department of Plant Production and Forestry Science, ETSEA,
University of Lleida-Agrotecnio Center, Lleida, ES, 2Department of
Plant Production and Forestry Science, ETSEA, University of Lleida-
Agrotecnio Center, Lleida, ES. Institució Catalana de Recerca i
Estudis Avançats, Barcelona, ES
An engineered extended ketocarotenoid pathway in rice and maize will be
used as an example to illustrate how synthetic biology principles and multi-
gene transfer can result in the formation of new molecular entities with
useful biological properties. The creation of specialized novel sequestering
structures facilitates the accumulation of metabolic precursors which can
subsequently be decorated be different ketolases and hydroxylases to produce
diverse combinations of ketocarotenoids in an organ- or tissue-specific
manner. The quantitative and qualitative carotenoid and ketocarotenoid
profiles of particular transgenic lines depend on the expression of the
integrated transgene complement. Thus the generation and characterization
of a combinatorial transgenic population is a pre-requisite to select specific
lines with particular chemodiversity. We will discuss the fundamental
mechanisms that underpin these experiments and we will highlight animal
feeding trials to demonstrate the effects of diets fortified with particular
combinations of target metabolites on products derived from such animals.
S2.1-2 (R2.1-2)
Hydrogen peroxide signal transduction in plants.
Gathering the pieces
Frank van Breusegem
Ghent University, Ghent, BE
Different biotic and abiotic stresses adversely affect plant growth and
development leading to worldwide yield losses. A common theme
within these environmental factors is the perturbation of reactive oxygen
species (ROS) homeostasis. Despite the great economic importance,
the signal transduction mechanisms of the oxidative stress response in
plants are poorly understood. We conducted several genetic and chemical
screens, together with proteomic approaches in order to obtain a more
comprehensive overview on the different components of the network that
govern the oxidative stress response. Theses efforts identified several genes
as new members of the oxidative stress gene network in plants, together
with small molecules that are able to interfere with specific events during
the oxidative stress response in plants.
The potential of these genes and molecules for providing abiotic stress
tolerance in commercially relevant plants will be assessed in the future.
S2.1-3 (R2.1-3)
Transcriptional networks and epigenetic
regulation at the core of the plant circadian clock
Paloma Mas
Centro de Regulación en AgriGenómica (CRAG). Consorcio CSIC-
IRTA-UAB-UB, Bellaterra, Barcelona, ES
The circadian clock is a biological time keeper mechanism able to regulate
biological rhythms with a period of approximately 24-hours. In many
organisms, transcriptional and translational feedback loops underlie the
circadian function at the core of the clock. In Arabidopsis, the evening
oscillator component TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1) was
proposed to activate morning-expressed oscillator genes. In our studies,
16
XXXVII Congreso SEBBM
we have shown that TOC1 does not function as an activator but rather
as a general repressor of oscillator gene expression. Repression occurs
through TOC1 rhythmic association to the promoters of the oscillator
genes, demonstrating that the morning and evening oscillator loops are
connected through the repressing activity of TOC1. Chromatin remodeling
has also emerged as a crucial regulatory mechanism in a number of cellular
processes including the circadian clock. Indeed, the circadian oscillation
of core clock genes correlates with the sequential accumulation of Histone
acetylation and trimethylation. Inhibition of these marks abolishes
oscillator gene expression, indicating that they are critical for gene
activation. Increased clock-repressor binding was observed when Histone
trimethylation was blocked, suggesting that this mark might regulate the
progression from activation to repression. The histone methyltransferase
SET DOMAIN GROUP 2/ARABIDOPSIS TRITHORAX RELATED 3
(SDG2/ATXR3) contributes to this regulation because oscillator gene
expression, Histone trimethylation and repressor binding are altered in
plants mis-expressing SDG2/ATXR3. Our future research goal is to fill
the existing gap in the plant circadian field by identifying other molecular
determinants responsible for particular histone marks at the core of the
clock and their relevance controlling plant responses to the environment.
S2.2 Biología de sistemas y biología
sintética
S2.2-1 (R2.2-1)
Directed enzyme evolution: rational thoughts
for non-rational experiments
Miguel Alcalde
Institute of Catalysis, ICP-CSIC, Cantoblanco, Madrid, ES
Over the past 20 years, directed evolution has been seen to be the most
reliable approach to protein engineering. This tool that has revolutionized
the manner in which proteins are manipulated in the laboratory in order
to improve their application in distinct industrial settings and to engineer
complex metabolic pathways opening a research ground in synthetic biology.
By mimicking the mutation, recombination and selection processes that
occur naturally in evolution, in vitro evolution provides a means of directing
the evolution of genes toward specific goals in a manner that may not occur
in a natural environment. Here, we summarize some successful examples
from our laboratory to tailor ligninolytic genes (laccases, peroxidases,
peroxygenases) in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This lecture
will pay special attention to the use of the DNA recombination machinery of
S. cerevisiae to accelerate artificial evolution, complementing the traditional
in vitro methods to generate tailor-made enzymes.
References
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Granada 2014
S2.2-2 (R2.2-2)
Microbial life-styles and adaptive changes
of macromolecular synthesis
Soren Molin
Department of Systems Biology and Novo Nordisk Foundation
Center for Biosustainability, Denmark Technical University of
Denmark, Lyngby, DK
Bacteria belonging to the genus Pseudomonas posses a broad metabolic
repertoire, which allows them to grow in a wide variety of environments.
This versatile potential for growth and persistence is reflected in the large
genome sizes in Pseudomonas bacteria and in a parallel large number of
regulatory genes. Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen
living in the environment, and under some conditions it has the capacity
to colonize humans, where it may develop life long persistent infections.
Moving from the outer environment to a human environment constitutes
a significant change of living conditions challenging the regulatory and
metabolic repertoire of the bacteria.
In patients suffering from the genetic disorder cystic fibrosis (CF) P.
aeruginosa frequently develops persistent infections of the airways, and
over periods of thousands of bacterial generations mutations accumulate in
the bacterial populations, which gradually increase the persistence fitness
resulting in severe chronic lung infections. In a large study of more than 40
young CF patients we have investigated the evolutionary dynamics of more
than 50 different strains of P. aeruginosa, from which we have sequenced
more than 600 genomes covering airway residence times from 1-10 years.
One of the striking observations made from this investigation is that
adaptive mutations in genes encoding global regulatory proteins, including
RNA polymerase associated sigma factors, are very frequent in CF isolates
obtained from patients with early stage P. aeruginosa airway infections. We
are currently studying the relationship between the phenotypes associated
with some of these regulatory mutations and the microbial life-style in CF
airways, and examples of such relationships will be presented. It will be
documented how specific mutations in regulatory genes may switch the
phenotype from one typical life-style to another more compatible with
the novel environment. It is hypothesized that this pattern of mutational
changes observed in infecting bacterial populations may represent bacterial
adaptive evolution in many other scenarios, where bacteria move from one
environment to another.
S2.2-3 (R2.2-3)
The polyhydroxyalkanoate systems metabolism;
much more than a bioplastic production
María A. Prieto
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES
Polyhydroxyalkanoate (PHA) are one of the current alternatives to
petroleum-based plastics. From an industrial standpoint, PHAs are
attracting extensive interest as technical-grade polymers due to their
singular set of properties: (i) substitution potential for industrial
thermoplastics such as polypropylene, polyethylene, polyvinylchloride
and polyethylene terephthalate, (ii) biodegradability both in aerobic and
anaerobic conditions, including aquatic environments, (iii) biobased,
renewable origin, (iv) biocompatibility with cells and tissues and (vi)
structural diversity.
The physiology of PHA production has aroused much interest since the
ability to accumulate these compounds is widespread among bacteria
and PHA metabolism influences many cell activities. This is of particular
interest with respect to model bacterial strains such as Pseudomonas putida
KT2440, an outstanding candidate for the development of microbial chassis
with specialized phenotypes. The use of cutting-edge technologies such
as transcriptomics, proteomics and metabolic flux analyses has improved
our understanding of the interplay between PHA metabolism, which is
extremely context-dependent, and other cell functions.
PHA granules represent supramolecular complexes that carry granule
associated proteins (GAPs), essential protein components of the PHA
Simposios
metabolic machinery. Aside from the carbon and energy stockpiling
function ascribed to the polymers themselves, GAPs play a critical
physiological role in PHA metabolism and granule formation. Phasins
form part of the mediation element network responsible for granule
localization and segregation. PHA synthase and depolymerase are also
attached to the granules, and operate a continuous metabolic cycle that
ensures the turnover of the accumulated polymer and plays a key role in
the maintenance of metabolism homeostasis.
PHAs, traditionally considered bacterial reservoirs of carbon and energy,
are now recognized as having many physiological roles. In P. putida, PHA
production ensures a more robust metabolism and improves bacterial
fitness. Acting as a futile cycle, PHA metabolism balances the storage vs.
spillage equilibrium of both carbon and energy, thus determining cell size
and morphology. PHA metabolism is controlled by the network of local
and global regulators controlling the pathways involved in carbon and
nitrogen assimilation.
PHAs are valuable nutrients for producer strains, but since they can be
extracellularly degraded they are also useful to the wider microbial
community.The predation of PHA- producers by bacterial predators
such as B.dellovibrio bacteriovorus has an important effect on microbial
population dynamics since PHA granules and free HA oligomers are
released into the environment. These can be then incorporated into the
microbial metabolism of not-necessarily accumulating/degrading strains,
enhancing their biological fitness.
The system-wide nature of PHA metabolism makes it a real challenge to
design PHA-producing bacteria using synthetic biology strategies.
S2.3 Hispano-Mexicano
S2.3-1 (R2.3-0)
Biotecnología de anticuerpos: mejora y desarrollo
de nuevos antivenenos
Alejandro Alagón Cano
Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autonóma de
México, México DF, MX
S2.3-2 (R2.3-1)
Structure and function of bacterial
fructosyltransferases: fructans in traditional
mexican fermentation products
Agustín López-Munguía
Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, MX
Fructansucrases (GH68) are enzymes that catalyze the transfer of the
fructosyl unit of sucrose to a growing fructan polymer. Depending on the
chemical nature of the resulting fructosidic bond, these enzymes may be
classified as levansucrases (LS) when the resulting polymer (levan) is
linked through β (2→6) bonds or inulosucrases (IS) when β (2→1) linked
fructosyl units are formed in the main chain (inulin). We first reported the
unusual mosaic structure of inulosucrase (IslA) in Leuconostoc citreum
CW28, a strain isolated from Pozol, a corn traditional lactic fermentation
product traditionally consumed in the south of México. IslA, which is
highly specific for inulin synthesis, has a b-propeller catalytic domain
with high identity to SacB, the levansucrase from Bacillus subtilis.
However, IslA also bears additional domains in both, the amino and
carboxyl terminal regions, domains already described in glucansucrases
from lactic acid bacteria. Glucansucrases are enzymes that carry out the
synthesis of glucans from sucrose, in an analogous mechanism. The same
structural features found in IslA were later identified and characterized in
several bacterial strains, including the industrial dextran producing strain
(Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F) as well as in the sequenced
17
Simposios
genome of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293.
Both glucans and fructans are present in pulque, a traditional fermentation
product that dates back to the Mesoamerican culture. Pulque is obtained
from aguamiel, a sap extracted from various agave species.
In this conference several aspects related with the structural properties
of these glycosyltransferases, are described, as well as their role in the
traditional Mexican fermented products and their potential applications in
fructan synthesis.
S2.3-3 (R2.3-2)
LINE-1 retrotransposition in Fanconi anemia
patients
José Luis García Pérez
GENYO-University of Granada, Granada, ES
It is becoming increasingly evident that Long Interspersed Element-1
(LINE-1 or L1) retrotransposons have played an important role in shaping
the structure and function of mammalian genomes. L1s are members of
the non-long-terminal-repeat (non-LTR) retrotransposon family, which are
widely spread in the human genome. New L1 mobilization events have
18
XXXVII Congreso SEBBM
resulted in a variety of genetic disorders providing a constant source of
human genetic diversity. L1 might ensure its evolutionary transmission to
new generations through the accumulation of new insertions during early
embryonic development or in germ cells. Thus, L1 insertions can act as
mutagens in the embryonic phase. In fact, endogenous L1s are expressed
in Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and human induced pluripotent
stem cells (hiPSCs). Additionally, others and we have shown that engineered
human L1s can retrotranspose in hESCs and iPSCs at a low level. In sum,
these data reveal that both hESCs and hiPSCs are an excellent model to study
LINE-1 accumulation and its genomic impact in humans.
On the other hand, it is well established that L1 retrotransposition occurs
by a mechanism known as target site-primed reverse transcription (TPRT),
which requires both the L1-encoded endonuclease and reverse transcriptase
activities. However, it has been reported that L1 can mobilize through an
endonuclease-independent pathway (ENi), in which the element inserts at
sites of DNA disrepair. Notably, recent data from our lab has demonstrated
that the mobilization of L1 is de-regulated in Fanconi Anemia (FA)
patients, including the ENi pathway. FA is a rare disease characterized
by infant mortality and genomic instability, suggesting that de-regulated
LINE-1 retrotransposition may affect genomic fluidity in FA patients.
Granada 2014 Pósters

Simposio 3:
Estructura y función de proteínas

19
Simposios
S3.1 Receptores y proteínas
de membrana
S3.1-1 (R3.1-1)
Transportadores heteroméricos de aminoácidos:
hacia su estructura atómica
Albert Rosell1, Lukasz Kowalczyk1, Joana Fort1, Ekaitz Errasti1,
Paola Bartoccioni1, Elena Alvarez-Marimon1, Meritxell Costa2,
Marcel Meury3, Guillem Portella1, Laura Pérez4, Arturo Rodríguez-
Banqueri1, Ana Obando1, Antonio Zorzano5, Modesto Orozco6,
Xavier Carpena7, José Luis Vázquez-Ibar8, Juan Fernández-Recio4,
Dimitrios Fotiadis4, Ignacio Fita7, Manuel Palacín9
1
IRB Barcelona, Barcelona, ES, 2IRB Barcelona y Swiss National
Centre of Competence in Research TransCure, University of
Bern, Bern, CH, 3Swiss National Centre of Competence in
Research TransCure, University of Bern, Bern, CH, 4Barcelona
Supercomputing Center, Barcelona, ES, 5IRB Barcelona y
Universidad de Barcelona, Barcelona, ES, 6IRB Barcelona,
Barcelona Supercomputing Center y Universidad de Barcelona,
Barcelona, ES, 7Department of Structural Biology, Instituto de
Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, 8IRB
Barcelona y Institute of Biology and Technology Saclay (iBiTec-S),
Gif-sur-Yvette Cedex, FR, 9IRB Barcelona, Universidad de Barcelona
y CIBERER, Barcelona, ES
Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) son el único
ejemplo conocido de transportadores de solutos constituidos por dos
subunidades unidas por un puente disulfuro. En metazoos, la subunidad
pesada es responsable del tráfico del heterodímero a la membrana
plasmática mientras que la subunidad ligera es el transportador. Los
HAT están involucrados en patologías como aminoacidurias, cáncer,
infección viral y adicción a cocaína. En los últimos siete años se ha
incrementado el conocimiento estructural de estos transportadores de
forma notable. El ectodominio de la subunidad pesada humana 4F2hc
(4F2hc-ED) se ha resuelto a 2.1Å revelando homología estructural con
amilasas bacterianas. 4F2hc-ED adolece de los residuos catalíticos clave
pero mantiene la hendidura catalítica para la que no se conocen ligandos.
Homólogos bacterianos con baja identidad de secuencia (<20% con las
subunidades ligeras como el intercambiador arginina/agmatina AdiC
de E. coli) han sido resueltos a 3.0 Å y revelan un plegamiento de tipo
LeuT, característico de varias familias de transportadores de solutos. La
expresión del heterodímero 4F2hc/LAT2 humano en Pichia ha permitido
obtener el primer modelo a baja resolución de un HAT (21 Å) por tinción
negativa, análisis por docking y confirmación por entrecruzamiento de
residuos de cisteina. Este modelo ha revelado por primera vez la posición
relativa de 4F2hc-ED sobre la subunidad ligera, ofreciendo una explicación
estructural de la estabilización del complejo. Se presentarán las estrategias
que estamos siguiendo para resolver la estructura atómica de homólogos
bacterianos más robustos y de HAT eucariotas. Estas estructuras facilitarán
la comprensión del papel de 4F2hc en la actividad del transportador
asociado y la conexión funcional con integrinas.
S3.1-2 (R3.1-2)
Implicación del transportador ABCG2 en la
infección por el parásito Leishmania
Francisco Gamarro, David León-Guerrero, Jenny Campos-Salinas,
José Ignacio Manzano, Elena González-Rey, Mario Delgado, José
María Pérez-Victoria, Santiago Castanys
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES
Las proteínas ABC (ATP-binding cassette) constituyen una de las mayores
familias a lo largo de toda la escala biológica, desempeñando una gran
diversidad de funciones, entre otras el transporte activo de moléculas a través
20
XXXVII Congreso SEBBM
de las membranas. Los sustratos conocidos son estructuralmente diversos,
encontrando entre ellos lípidos y fármacos. En el parásito Leishmania,
responsable de la segunda enfermedad parasitaria en importancia
conocida como leishmaniasis, existen 42 genes de la familia ABC. Hemos
caracterizado un nuevo transportador ABC de Leishmania, denominado
ABCG2 implicado en el proceso de infección. Los análisis realizados con
parásitos que expresan una versión inactiva del transportador (DN) o con
parásitos mutantes nulos para ABCG2 mostraron que este transportador es
necesario para la exposición de fosfatidilserina (PS) en la cara externa de
la membrana plasmática del parásito. Este fenotipo se correlacionó con una
deficiente capacidad de infectar macrófagos peritoneales. Se ha descrito
que la exposición transitoria de PS en la superficie del parásito es necesaria
para el proceso de infección celular. Además, los estudios de infección
en un modelo experimental de leishmaniasis cutánea mostraron que los
animales infectados con parásitos DN no desarrollaban ninguna lesión,
mostrando una inflamación y carga parasitaria más baja que los animales
infectados con los parásitos control. Todos estos resultados evidencian
la implicación del transportador ABCG2 en la exposición de PS en la
membrana del parásito, en la infección y virulencia de Leishmania.
S3.1-3 (R3.1-3)
Transferencia de electrones entre proteínas:
de la cinética a la molécula única
Carlos Gómez-Moreno1, Carlos Marcuello2, Rocio de Miguel3, Marta
Martínez Júlvez4, Anabel G Lostao5
1
Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2Instituto de Nanociencia
de Aragón Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3CEA, Paris,
FR, 4BIFI. Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES,5Instituto
de Nanociencia de Aragón/ Fundación ARAID, Universidad de
Zaragoza, Zaragoza, ES
El proceso de transferencia de electrones entre proteínas constituye la
base de muchas reacciones que son fundamentales para los seres vivos. La
fotosíntesis, la respiración, la fijación de nitrógeno, la desaturación de los
ácidos grasos, etc., son ejemplos representativos. En ellos, las proteínas que
intercambian electrones deben interaccionar durante un muy breve espacio
de tiempo para que el electrón/es pase(n) de una proteína a la otra. Durante
más de 25 años nuestro grupo ha investigado el mecanismo mediante el cual
se produce el reconocimiento entre las proteínas que deben interaccionar.
El trabajo se ha centrado en el estudio de la enzima Ferredoxina NADP+
reductasa, que interviene en la producción de NADPH en la fotosíntesis
y sus proteínas complementarias, la Ferredoxina (Fd) y la Flavodoxina
(Fld), todas ellas de la cianobacteria Anabaena PCC 7119. Técnicas
cinéticas, tanto en estado estacionario como preestacionario (inducida por
láser y de flujo interrumpido) junto con el empleo de muestras mutadas
en posiciones concretas han permitido concluir que la interacción seinicia
mediante la orientación de las superficies de reconocimiento por atracción
electrostática seguida por una reorganización de ambas moléculas mediante
interacciones hidrofóbicas.
La cristalización y resolución de la estructura del complejo entre la FNR
y la Fd de Anabaena han ratificado nuestra propuesta al determinar que
los grupos propuestos para la interacción están próximos en el complejo y
que los centros redox se encuentran a distancias que son compatibles con
la reacción.
Recientemente hemos iniciado una línea de trabajo que se apoya en el uso
de la Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM) para estudiar el proceso
de interacción desde el punto de vista de la molécula individual. La razón
de esta decisión está en la esperanza de que la observación directa de las
moléculas que interaccionan permita mostrar detalles del proceso que no
son asequibles mediante el estudio del conjunto de los componentes de la
reacción.
Se ha desarrollado una estrategia que permite inmovilizar las proteínas
con la orientación adecuada para que se produzca la interacción con
su pareja y medir la eficiencia del proceso de acercamiento así como
la magnitud de la fuerza ejercida. Los resultados de la medida de las
fuerzas intermoleculares de los complejos transitorios entre las proteínas
Granada 2014
implicadas en la transferencia de electrones se interpretan de acuerdo
con el modelo propuesto anteriormente que indicaba que la interacción
FNR:Fd es más fuerte y específica que la que se presenta en la FNR:Fld.
Las mayores fuerzas de ruptura medidas entre la FNR y la Fd frente a las
obtenidas entre la FNR y la Fld indican la mayor mecanoestabilidad del
complejo entre la FNR y su pareja natural la Fd.
S3.2 Macromoléculas en la enfermedad
y vacunas
S3.2-1 (R3.2-1)
Vacunas contra enfermedades prevalentes
Mariano Esteban
Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, ES
La vacunación es la estrategia más efectiva y menos cara para controlar
y erradicar las enfermedades humanas. Muchas enfermedades han sido
controladas mediante vacunación, pero hay otras para las que no hay vacunas
disponibles. Anualmente cerca de 2 millones (M) de personas mueren a
causa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), cerca de 3M de
tuberculosis, 700.000 de malaria, más de 7M por cáncer, 12M están infectadas
de leishmania y 170M con hepatitis C (HCV). Además, enfermedades en
personas de avanzada edad, como Alzheimer y Parkinson, sin tratamientos
efectivos disponibles, están siendo abordadas mediante vacunación. Las
dificultades en el desarrollo de vacunas se deben al desconocimiento de
la patología del microorganismo, diseño del inmunógeno, protocolos de
inmunización, y a la definición de la correlación inmune de protección. Con
los nuevos avances tecnológicos derivados de la biología de sistemas y las
aproximaciones inmunológicas, el enfoque de las vacunas ha cambiado.
Nuestro grupo se embarcó hace varios años en el desarrollo de vacunas para
enfermedades para las que no hay vacunas, utilizando vectores poxvirales.
De las lecciones aprendidas de la biología del vector poxviral virus vaccinia
modificado de Ankara (MVA) y de los estudios en el desarrollo de vacunas,
hemos generado y patentado varios candidatos vacunales contra VIH/SIDA,
hepatitis C (HCV), chikungunya, malaria, leishmania, cáncer de próstata,
y algunos han entrado en ensayos clínicos, como con VIH. De hecho,
hemos producido un candidato vacunal para VIH-1 (MVA-B) que ha sido
utilizado en dos ensayos clínicos de fase I en España, con buenos resultados
inmunológicos. En la conferencia, presentaremos la descripción de vectores
atenuados de poxvirus, interacción con el hospedador, preclínica y clínica
frente a modelo de patógenos y estado de vacunas.
S3.2-2 (R3.2-2)
dUTPases, the unexplored family of signalling
molecules
José R. Penadés1, Alberto Marina2
1
Institute of Infection Immunity and Inflammation, Universidad de
Glasgow, Glasgow, UK, 2Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-
CSIC), Valencia, ES
Deciphering the molecular mechanisms that control relevant cellular
processes is of utmost importance to understand how viruses, prokaryotic
and eukaryotic cells work. The diversity of living organisms suggests that
there are novel regulators still to be discovered, which may uncover new
regulatory paradigms. dUTPases (Duts) are assumed to be ubiquitous
enzymes regulating cellular dUTP levels to prevent misincorporation of
uracil into DNA. Recently however, Duts have been involved in the control
of several relevant cellular processes, including transfer of mobile genetic
elements, regulation of the immune system, autoimmunity or apoptosis,
suggesting that they perform regulatory functions. This talk aims at
investigating the unexplored impact of Duts as novel signalling molecules.
Simposios
S3.2-3 (R3.2-3)
NETs – from infection to autoimmunity
Arturo Zychlinski
Max Planck Institute for Infection Biology, Berlín, DE
Neutrophils are one of the first lines of defence of the immune system agains
tmicrobes. These cells kill microorganisms effectively by phagocytosis and
by the formation of extracellular structures, called Neutrophil Extracellular
Traps (NETs). NETs are made of chromatin and specific neutrophil
proteins and are released after a unique cell death program that requires the
production ofradical oxygen species (ROS) and the relocation of neutrophil
elastase to the nucleus. NETs help limit and control infection and also can
activate the acquired immune system. Thus, formation of NETs appears to
be necessary for an efficient clearing of microbes but can also initiate and
exacerbate autoimmune responses.
S3.3 Interacción proteína/proteína
y complejos multiproteicos
S3.3-1 (R3.3-1)
Structural characterisation of the chaperone
Hsp70 folding network
José María Valpuesta
Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Colmenar Viejo, Madrid, ES
The 70 kDa heat shock proteins (Hsp70s) form a family of highly
conserved molecular chaperones present in all domains of life and in most
subcellular compartments of eukaryotic cells. Hsp70s, acting in concert
with J Hsp40s and nucleotide exchange factors (NEFs) assist a multitude of
different cellular protein-folding processes during protein maturation and
quality surveillance [1,2]. Besides, Hsp70s can interact with other major
chaperones like Hsp90s, Hsp110s and CCT [3-6], in some cases via other
co-chaperones, which act as physical linkers.
We have been working over the last years in characterizing, using mostly
electron microscopy and image processing, the interaction of Hsp70s with
some of these chaperones and co-chaperones in an effort to understand the
interactions that take place between these proteins, that act in coordination,
forming part of an assembly line, to make the protein folding process a
more efficient one.
References
[1] Kampinga, H.H., and Craig, E.A. The HSP70 chaperone machinery: J
proteins as drivers of functional specificity. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;
11: 579-92.
[2] Hartl, F.U., Bracher, A., and Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in
protein folding and proteostasis. Nature 2011; 475: 324-32.
[3] Schuermann, J.P., Jiang, J., Cuéllar, J., Llorca, O. Wang, L., Taylor,
A.B., Demeler, B.,Morano, K., Hart, P.J., Valpuesta, J.M., Lafer, E.M. and
Sousa, R. Structure of the Hsp110:Hsc70 Nucleotide Exchange Complex.
Mol Cell 2008; 31: 232-43.
[4] Cuéllar, J., Martín-Benito, J, Scheres, S.H.W., Sousa, R., Moro, F.
López-Viñas, E., Gómez-Puertas, P., Muga, A, Carrascosa, J.L. and
Valpuesta, J.M. The structure of a CCT:Hsc70NBD complex suggests a
mechanism for Hsp70 delivery of substrates to the chaperonin. Nat Struct
Mol Biol 2008; 15: 858-64.
[5] Cuéllar, J., Perales-Calvo, J.,Muga, A., Valpuesta, J.M. and Moro, F.
Structural insights into the chaperone activity of the 40 kDa heat shock
protein DnaJ. Binding and remodeling of a native substrate. J Biol Chem
2013; 288: 15065-74.
[6] Lorenz, O.R., Freiburger, LRutz, , D.A., Krause, M., Zierer, B.K.
Alvira, S. Cuéllar, J., Valpuesta, J.M, Madl, T., Sattler, M, and Buchner, J.
Modulation of the Hsp90 chaperone cycle by a stringent client protein. Mol
Cell 2014; 53: 941-53.
21
Simposios
S3.3-2 (R3.3-2)
Descubriendo interacciones entre enzimas
proteolíticas, sus inhibidores y ligandos proteicos
por MS-proteómica funcional
Francesc Xavier Avilés1, G. Covaleda1, S. Tanco1, O. Tort1, A. Otero1,
J. Vendrell1, J. Lorenzo1, M. Alonso del Ribero2, M.A. Chávez2
1
Instituto de Biotecnología y de Biomedicina y Dpto. de Bioquímica,
Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona, ES, 2Centro de
Estudios de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana,
La Habana, CU
Actualmente se tiende hacia una visión integrada de las enzimas proteolíticas
(proteasas) y acompañantes moleculares in vivo, especialmente en el
contexto genómico-proteómico-interactómico. Ello también se da en unas
de sus variantes más frecuentes como son las metaloproteasas y, dentro de
ellas, en las metalocarboxipeptidasas (MCP). El fuerte incremento en el
número de MCP detectadas en la última década pone en evidencia de que
aún no se comprende su acción simultánea o específica sobre sustratos,
extensible a sus restricciones por ligandos e inhibidores naturales. El hecho
de que tales sustratos, y sus efectores, sean frecuentemente de naturaleza
proteica, añade grados adicionales de sofisticación a estas interacciones
(p.e. a niveles químico-físicos, de capacidad de discriminación y cinéticos),
así como en la modulación de actividades y especificidades que promueven
[1-3].
Hoy en día podemos evaluar en cerca de 30, el número de variantes
de dichas enzimas MCP, clasificadas entre formas M14A, B y C, y las
recientemente emergentes formas citosólicas (tipo CCP) para la subfamilia
M14D [4,5]. Dado que todas ellas parecen conservar el dominio “canónico”
de metalocarboxipeptidasa y los sitios de reconocimiento equivalentes,
es un desafío real la comprensión de la relación compleja entre ellas, su
interacción discriminativa con sustratos naturales (peptídicos o proteicos,
dado que son proteasas), y con los inhibidores proteicos ambientales.
También lo es para diseñadores de fármacos la generación de ligandos que
específicamente las controlen [2].
Las MCP, como otras proteasas, tienen otra propiedad característica
interactómica: actúan de forma transiente sobre sustratos proteicos,
promoviendo cortes sobre ellos que afectan fuertemente su conformación
y funcionalidad. Cómo detectar dichas interacciones transientes no suele
ser una tarea fácil, aunque factible [6-8]. También se suele desconocer el
papel que juegan en la naturaleza numerosos inhibidores proteicos de ellas,
que se encuentran en sistemas biológicos muy diversos. Se discutirá casos
recientes de descubrimiento de dichos inhibidores y/o ligandos-sustratos, y
de estrategias proteómicas e interactómicas, basadas en espectrometría de
masas, así como de biología estructural seguidas para su identificación y
caracterización [3,6,8-10]. También, si cabe, se presentarán datos de Maldi-
MS-Imagen (MS-imagen de tejidos) para alguna de dichas biomoléculas.
Bibliografía
[1] Arolas, JL, Vendrell, J, Avilés, FX, Fricker LD: Curr Pharm Des 2007;
13: 349-66.
[2] Fernandez D, Pallares I, Vendrell J, Aviles FX: Biochimie 2010; 92:
1484-500. // Fernandez D, Pallares I, Covaleda G, Vendrell J, Aviles FX:
Curr Med Chem 2013; 20: 1595-608.
[3] Covaleda G, Alonso-del-Rivero MA, Chávez MA, Avilés FX, Reverter
D: J Biol Chem 2012; 287: 9250-8.
[4] Rodriguez de la Vega M, Sevilla RG, Hermoso A, Lorenzo J, Tanco S,
Diez A, Fricker Ll D, Bautista JM, Aviles FX: FASEB J 2007; 20: 851-65.
// Rodriguez de la Vega M, Lorenzo J, Aviles FX, Bautista JM: FASEB J
2013; 27: 424-31.
22
XXXVII Congreso SEBBM
[5] Otero A, Rodriguez de la Vega M, Tanco S, Lorenzo J, Aviles FX,
Reverter D: FASEB J 2012; 26: 3754-64.
[6] Yanes O, Villanueva J, Querol E, Aviles FX: Nature Protoc 2007; 2:
119-130. // Sanglas L et al.: PNAS 2009; 106: 1743-47.
[7] Morell M, Czihal P, Otvos L, Aviles FX, Ventura S: Proteomics 2008;
8: 3433-42.
[8] Van Damme P, et al., Aviles FX, Gevaert K: Nature Meth 2010; 7: 512-
5.
[9] Tanco S, Lorenzo J, Garcia-Pardo J, Degroeve S, Martens L, Aviles FX,
Gevaert K, Van Damme P: Mol Cell Proteom 2013; 12: 2096-110.
[10] Alonso del Rivero M, Reytor ML, Trejo SA, Chávez MA, Avilés FX,
Reverter D: Structure 2013; 21: 1118-26.
S3.3-3 (R3.3-3)
Force generation by FtsZ bacterial cytoskeletal
protein: what we have learned from single
filament analysis
Marisela Vélez
ICP, CSIC, Madrid, ES
FtsZ is a bacterial cytoskeletal protein that polymerizes on the inner surface
of the bacterial membrane and contributes to generate the force needed
for cell division. In the presence of GTP the individual protein monomers
interact longitudinally to form filaments that can then aggregate to form
higher order structures on the membrane surface. These filament aggregates
are dynamic and exchange monomers from the solution. The final outcome
of this dynamic rearrangement on the surface is the generation of force that
bends the cell membrane inward.
The rich self-assembling behavior of the protein is reproduced in vitro
on supported lipid membranes using isolated proteins. Reversible GTP-
induced polymerization observed with Atomic Force Microscopy (AFM)
showed that the type of attachment to the surface and the type of lipid
present on the membrane determine the shape of the filament aggregates
observed.
The detailed structural and dynamic information obtained with the AFM
has allowed comparing the experimental results with theoretical models
that describe the polymerization in terms of a simple set of monomer-
monomer interactions. Experimental results controlling the orientation
of the monomers on the surface, together with molecular dynamics
simulations and theoretical models have revealed that filament curvature,
twist, orientation and the strength of the surface attachment are all
important for determining the amount of force that the filaments can exert
on the surface.
References
Mateos-Gil , P.; Paez ,A.; Hörger, I, Rivas, G.; Vicente, M.; Tarazona, P.
and Vélez, M. “Depolymerization dynamics of individual filaments of
bacterial cytoskeletal protein FtsZ”. PNAS 2012; 109 (21): 8133 8.
González de Prado Salas, P., Encinar, M., Vélez, M. and Tarazona, P.
“FtsZ protein on bilayer membranes: effects of specific lateral bonds“. Soft
Matter 2013; 9: 6072.
Encinar, M.; Kralicek, A.; Martos, A.; Krupka, M.; Alonso, A.; Cid, Sa.;
Rico, A.; Jiménez, M.; Vélez, M. “Polymorphism of FtsZ filaments on lipid
surfaces: role of monomer orientation”. Langmuir 2013; 29: 9436-46.
González de Prado Salas, P., Hörger, I., Martín-García, F., Jesús Mendieta,
Alvaro, A., Encinar, M., Gómez-Puertas, P., Vélez, M., and Tarazona, P.
“Torsion and curvature of FtsZ”. Soft Matter 2014; 10: 1977-86.
Granada 2014 Pósters

Pósters

23
Pósters
P00. II Workshop sobre la Innovación
Docente en la Enseñanza de la
Bioquímica y la Biología Molecular
P00-1 (R00-2)
Ciencia para Todos. Una experiencia para
aprender divulgando
Pilar Roca, J. Oliver, A. Valle
Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS.
Universitat de les Illes Balears, Palma de Mallorca, ES
Entre las competencias genéricas que debemos evaluar los profesores de
grados de Ciencias está la trasmisión de información, ideas, problemas
y soluciones a público especializado y no especializado. Un grupo de
profesores de la UIB nos planteamos trabajar esta competencia en nuestras
asignaturas, por lo que pensamos en desarrollar un encuentro entre jóvenes
universitarios y estudiantes de primaria, secundaria y bachillerato, de esta
manera nació CIENCIA PARA TODOS. La experiencia tenía un doble
objetivo: fomentar las vocaciones científicas y la difusión de la Ciencia,
y utilizar el encuentro para que los estudiantes de grado aprendieran
divulgando.
Entre las actividades del encuentro podemos señalar experiencias
científicas, exposiciones (mujeres y ciencia, alimentación equilibrada,
animales exóticos, minerales, plantas carnivoras), talleres de visualización
de moléculas, juegos científicos. Además se presentó el blog que recoge los
experimentos propuestos. Los alumnos en el desarrollo de la actividad se
implicaron de manera activa tanto en el planteamiento de las experiencias
de laboratorio (usando materiales caseros o que puedan encontrar en los
colegios e institutos), como en el montaje y presentación a las personas que
acudieron al encuentro.
En el evento participaron 250 estudiantes de la UIB, y recibimos más de
3.500 visitantes. La evaluación del grado de satisfacción por parte de los
visitantes fue muy alta, al igual que de los alumnos de la UIB. Mientras que
los profesores que participaron con sus asignaturas estamos ya trabajando
en el encuentro de 2015.
Agradecimientos: alumnos de Facultad de Ciencias y Escuela Politécnica
de la UIB, profesores y personal de administración que nos ayudaron en
el montaje y desarrollo de la misma. FECYT (FCT-13-7535), ICE-UIB.
P00-2 (R00-1)
La bicicleta de Krebs, una iniciativa estudiantil
para el aprendizaje del metabolismo (y más)
Hugo Pineda1, Lola Nevado1, Sara Bernárdez1, Mª Jesús Pacheco1,
Juan J. Criado1, Florencio Palomas1, Miguel Ángel Medina Torres2
1
Alumnos de la asignatura optativa Bioquímica Metabólica de la
Licenciatura en Biología de la Universidad de Málaga en el curso
2012-13, Málaga, ES, 2Universidad de Málaga, Andalucía Tech,
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de
Ciencias, e IBIMA (Instituto de Biomedicina de Málaga). Unidad
741, CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES
Bioquímica Metabólica es una asignatura que se ha ofertado como optativa
de segundo ciclo en la Licenciatura de Biología y como asignatura de libre
configuración en las Licenciaturas de Química e Ingeniería Química de la
Universidad de Málaga durante todos los años de vigencia del último plan
de estudios de licenciaturas, actualmente en vías de extinción. Configurada
alrededor de tres bloques o unidades temáticas (Regulación integrada
del metabolismo, Regulación de los ejes centrales del metabolismo y
Metabolismo en acción), la asignatura siempre se ha caracterizado por
su sistema de auténtica evaluación continuada, por su flexibilidad y
libertad en el desarrollo de sus contenidos y por ofrecer a los alumnos un
espacio propio para convertirse en protagonistas corresponsables de la
configuración de la asignatura. Ello ha brindado ocasión para el desarrollo
24
XXXVII Congreso SEBBM
de numerosas iniciativas estudiantiles para la enseñanza-aprendizaje del
metabolismo perfectamente exportables a otros ámbitos de la docencia
universitaria. En este marco de referencia se encuadra La bicicleta de
Krebs, una iniciativa alentada por los cinco alumnos que firman esta
comunicación y que consiguió la activa participación de más de la mitad de
los alumnos inscritos en el curso 2012-13 (que fue el que contó con mayor
número de matriculados en la asignatura). En palabras de los promotores
de esta iniciativa: “¿Quién no ha pensado alguna vez: “¡Qué aburrimiento
de clase!”? ¿No habrá algún modo de aprender esto de una forma más
amena y divertida? Aunque a veces nos hagan creer que no, sí que la hay”.
La bicicleta de Krebs es un buen ejemplo de que hay respuestas positivas
a esta última pregunta. Una respuesta, además, que en este caso ha sido
encontrada, creada, desarrollada y llevada a cabo por los propios alumnos.
P00-3 (R00-5)
Hacia un enfoque evolutivo en la enseñanza
de la Bioquímica
Juan Antonio Aguilera Mochón
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I. Universidad de
Granada, Granada, ES
La célebre sentencia de Dobzhansky, “nada tiene sentido en Biología
si no es a la luz de la Evolución”, apenas se aplica, sorprendente y
lamentablemente, en la enseñanza de la Bioquímica.
Para empezar, hay que hacer ver a los alumnos que lo que existe no es
una Bioquímica, sino una enorme diversidad de bioquímicas (que se
desarrollan, es cierto, en torno a una unidad muy notable).
Nuestros alumnos estudian el ciclo del citrato, el código genético, los
mecanismos de control… sin plantearse nunca por qué son como son, esto
es ¿cómo y por qué surgieron en la evolución? Por ejemplo, ¿por qué el
código genético tiene precisamente esos aminoácidos, y no otros, y no más,
y sólo de la serie L...?
Sin embargo, hay razones para sospechar que el ciclo del citrato pudo
empezar funcionando al revés, que el código genético coevolucionó con
las rutas de biosíntesis de aminoácidos y se congeló, que no es indiferente
desde el punto de vista evolutivo que la inducción o la represión génicas se
realicen a través de mecanismos de control positivo o negativo, etc.
Un alumno de Bioquímica que no tenga idea de cómo pudo y puede la
evolución “inventar” nuevas actividades enzimáticas y nuevas rutas tiene
un entendimiento de corto alcance de la “lógica molecular de lo viviente”.
Para que esa visión sea suficientemente comprensiva, es necesaria, además,
una reflexión sobre el problema del origen de la vida.
La visión evolutiva (hasta donde nos es posible en la actualidad) de la
Bioquímica mejora de manera decisiva la comprensión de la vida.
Este enfoque evolutivo se ha aplicado con éxito durante años en la
asignatura “Bioquímica evolutiva”, impartida por el Dpto. de Bioquímica
y Biología Molecular I de la Universidad de Granada.
P00m-4
Servicio de Texto Orientado iBiotecSTO:
multiplataforma interactiva para la docencia
de Biotecnología
Maximino Manzanera Ruiz1, Alberto Vargas2, Rafael Salto2, Antonio
Suarez2, Margarita Aguilera1, Juan Ignacio Vilchez1, Cristina García-
Fontana1
1
Dept. Microbiología. Universidad de Granada, Granada, ES, 2Depto
Bioquímica y Biología Molecular II. Universidad de Granada,
Granada, ES
Proponemos el uso de un libro digital interactivo en formato de
multiplataforma para la materia de Biotecnología Farmacéutica que
sea accesible a través de tabletas, ordenadores y móviles inteligentes
(smartphones). A través de esta propuesta estamos generando un material
bibliográfico de actualidad, mediante un sistema que permite una puesta
Granada 2014
al día constante de contenidos, gracias a la incorporación rápida y
especializada de contenidos de forma constante por parte del profesor.
Igualmente consideramos que es especialmente útil para la docencia de esta
materia el suministro de información en formato vídeo. Este formato permite
una mejor comprensión y asimilación de conceptos por parte del alumnado
que en caso contrario pueden ser confusos y llevar a interpretaciones erróneas.
Estas interpretaciones erróneas son difíciles de detectar hasta la evaluación
de los estudiantes, lo que implica un cierto grado de insatisfacción por parte
del alumnado, así como por parte del profesorado en cuanto a la adquisición
de conocimientos y competencias del estudiante de esta materia.
A través de esta solicitud pretendemos lograr el suministro de herramientas
didácticas con los siguientes objetivos:
(i) Generar un material bibliográfico en español actualizable en sus
contenidos.
(ii) Suministrar contenidos digitales tales como vídeos y esquemas animados.
(iii) Desarrollar un sistema de autoevaluación continuo por parte del
alumnado con actividades para el desarrollo de las competencias propuestas
en la Guía Docente de la materia.
P00-5
Diseño de clases prácticas de Bioquímica
Metabólica: estudio metabólico comparativo
de las situaciones de ayuno y alimentación
María del Mar Sola Zapata, José Luis Periago Mínguez, Paloma
Hortelano de la Lastra
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad
de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES
En los Grados de Farmacia y NHyD de la UGR, los contenidos docentes
de metabolismo se imparten en la asignatura Bioquímica Metabólica con
4,5 ECTS teóricos y 1,5 ECTS prácticos. Hemos diseñado unas clases
prácticas que pretendemos sean formativas y amenas al mismo tiempo.
El planteamiento general consiste en desarrollar un estudio comparativo
de algunos parámetros bioquímicos en dos situaciones metabólicas
claramente diferenciadas, ayuno y alimentación. Se han elegido algunos
compuestos y actividades enzimáticas que principalmente se afectan por
el ayuno y que ilustran claramente la regulación adaptativa de las rutas
metabólicas. Durante cuatro clases presenciales de laboratorio, explicadas
por un profesor, se realizan: a) Las determinaciones de las concentraciones
(supuestamente séricas) de glucosa, 3-hidroxi-butirato y glicerol mediante
espectrofotometría; b) La determinación cualitativa de la concentración
sérica de ácidos grasos libres mediante cromatografía en capa fina y c)
La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática de la
glucosa 6-fosfatasa hepática. Una quinta clase se dedica a la integración
metabólica de los resultados obtenidos. El material utilizado como muestra
biológica es diferente en cada caso. Tuvimos en consideración que la
metodología estuviera adaptada a los aún escasos conocimientos técnicos
que los alumnos poseen en ese momento, tratando de impedir así que la
complicación metodológica desviara la atención del alumno de los aspectos
metabólicos de las prácticas que, creemos, constituyen el principal objetivo
de esta asignatura. Estas clases se han impartido durante los últimos tres
cursos académicos con un considerable grado de satisfacción de los
alumnos y de los profesores del departamento responsables de ellas.
P00-6 (R00-4)
Utilización de códigos QR en el aprendizaje del
sistema endocrino mediante trabajo en grupo y
presentación en vídeo
Gracia Morales Kucharski, Ana María Sánchez Moral
Universidad Europea de Madrid, Villaviciosa de Odón, ES
Objetivos: Como objetivo principal se busca que los alumnos sean capaces
de adquirir conocimiento sobre el tema propuesto mediante la búsqueda
Pósters
autónoma de información. Pero además se quieren conseguir otros dos
objetivos relacionados íntimamente con el anterior:
1. Desarrollar la capacidad de comunicación del conocimiento adquirido
a otros alumnos.
2. Utilización de nuevas tecnologías (códigos QR, vídeos, uso de internet)
para comunicar lo aprendido.
Se pretende con estos objetivos conseguir que el alumno elabore un
pensamiento estructurado y sintético ya que debe ser capaz de explicar
a sus compañeros el tema propuesto usando un lenguaje científico pero
suficientemente claro.
Descripción: Los alumnos se dividen para formar grupos de trabajo. A
cada grupo de trabajo se le asignará una glándula del sistema endocrino.
Se les facilitan guiones o apuntes que pueden utilizar para guiarse durante
la elaboración del tema asignado. Asimismo se les facilita bibliografía que
deben consultar para realizar el trabajo.
Una vez elaborado el tema deben grabar un vídeo en el que presentan
el tema elaborado. La grabación se realiza con un teléfono móvil y las
explicaciones pueden realizarse de manera oral ayudándose con diapositivas
del tipo power point o con la aplicación o medios que consideren oportunos
(dibujos, etc.)
El vídeo se cuelga en una web (youtube, moodle, etc.) a la que el resto
de grupos puede acceder con una clave, de manera que no esté abierta de
modo general.
Cada grupo de trabajo se identifica con un código QR. La lectura de este
código muestra cuál es el tema que desarrolla este grupo. El tema, a su vez,
se identifica con otro código QR. La lectura de este segundo código lleva
a una dirección URL (normalmente de youtube) en la que se encuentra el
vídeo con la presentación del tema.
La exposición de los códigos QR (mediante una impresión de los mismos)
se realiza en el aula habitual el día que se determine.
La evaluación de los conocimientos adquiridos por los alumnos se realiza
mediante una prueba objetiva de tipo test. Además, se pretende que los
alumnos dentro de un grupo evalúen el trabajo del resto de componentes
del grupo siguiendo una rúbrica.
P00-7
Bioquímica Estructural y Metabólica: Un libro
adaptado para la docencia de la Bioquímica en la
Facultad de Farmacia de la Universidad
de Granada
Alberto M. Vargas Morales, Fermín Sánchez de Medina Contreras
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de
Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES
Hemos escrito y editado, en octubre de 2013, un libro de texto de
Bioquímica (Bioquímica Estructural y Metabólica, Ed. Técnica AVICAM,
Granada, 2013) con el principal objetivo de que sea utilizado como
manual de apoyo al estudio por los alumnos de las asignaturas básicas con
contenidos bioquímicos, Bioquímica Estructural y Bioquímica Metabólica,
de los Grados de Farmacia, Nutrición Humana y Dietética (NHyD) y
Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CyTA) de la Universidad de
Granada. El libro está dividido en dos partes diferenciadas para ajustarlo a
la distribución docente que la Bioquímica tiene en los Planes de Estudios
de estos Grados. Nos propusimos la elaboración de este libro como
iniciativa de acercamiento docente al alumno que comienza los estudios
universitarios, dado que la mayoría de los magníficos textos de Bioquímica
con los que contamos no son consultados por los alumnos porque exceden
sus requerimientos en contenidos y grado de dificultad. Por esta razón,
nuestro planteamiento se basaba en cubrir principalmente los siguientes
objetivos:
- Abarcar de forma resumida todos los objetivos docentes de Bioquímica de
las asignaturas básicas en los Grados de Farmacia, NHyD y CyTA.
- Concretar la información imprescindible.
- Utilizar un lenguaje asequible adaptado al alumno de los primeros cursos
universitarios.
- Amenizar el texto con gran número de esquemas e ilustraciones.
25
Pósters
- Destacar ejemplos y aplicaciones en Farmacia y Nutrición, para lo que se
han incorporado Recuadros adicionales al texto.
La utilización de este libro durante varios cursos académicos nos permitirá
valorar el grado de consecución de nuestros propósitos docentes.
P00-8 (R00-3)
Proyecto Netbooks Uno a Uno: entrenamiento
de docentes de escuelas secundarias de
Argentina para el desarrollo y uso efectivo
de recursos informáticos en el aula
Ayelen Toro1, Virginia Revora2, Pablo Calzadilla3, Lucía Chemes4,
Silvina Ponce Dawson5, Cristina Caputo5, Roberto Gabriel Pozner1
1
Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas
y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR, 2IIB-
INTECh (CONICET), San Martín, AR, 3Unidad de Biotecnología
1, IIB-INTECh (CONICET), Chascomús, AR, 4Fundación Instituto
Leloir, Buenos Aires, AR, 5Departamento de Física, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos
Aires, AR
El Programa Conectar-Igualdad fue creado en Argentina en 2010 para
reducir las brechas digitales, educativas y sociales en el país y consiste en
la adjudicación de netbooks a alumnos y docentes de escuelas secundarias
de gestión estatal. El Programa pretende el uso de las netbooks en la
escuela y los hogares y se propone lograr una sociedad alfabetizada en las
nuevas TIC.
Para impulsar un uso efectivo de estas nuevas herramientas digitales se
diseñó un curso de capacitación destinado a docentes de escuela media de
asignaturas relacionadas con ciencias.
El curso consistió en 4 encuentros de 4 horas de duración cada uno, se
realizaron tutoriales que incluían diferentes secuencias didácticas diseñadas
para usar programas específicos. En el caso de los docentes de Química
Biológica, se trabajó con los programas Excel, Image J, Chemsketch y
Avogadro.
El primer encuentro se enfocó en el uso general de la netbook y se
detectó una gran disparidad de saberes en el uso de las PC, dificultando la
capacidad de atención de los docentes que tenían habilidades previas. Sin
embargo, a lo largo del curso la heterogeneidad del grupo se redujo debido
a la complejidad creciente de las aplicaciones.
A modo de cierre, los docentes realizaron un trabajo final que consistió
en una presentación en modalidad póster de alguna actividad, que cada
docente debía desarrollar con sus estudiantes utilizando la netbook.
Los trabajos presentados muestran que los objetivos del curso se cumplieron
satisfactoriamente, ya que pudieron plasmar sus aprendizajes en el aula y
cuáles consideraban que eran las ventajas y desventajas de su uso. En las
conclusiones de dichos trabajos la mayoría coincidió en el aspecto positivo
de la incorporación de las netbooks en el aula ya que genera entusiasmo en
los estudiantes.
P00-9
Trabajando competencias docentes mediante el
diseño, realización y presentación de un taller de
criminología para secundaria y bachillerato
Adamo Valle, Pilar Roca, Jordi Oliver
Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat
de les Illes Balears. Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición
(CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
Entre las competencias genéricas de los planes de estudio del grado
de Bioquímica están la de fomentar el trabajo en equipo, la capacidad
organizativa y la expositiva. Dentro del marco del proyecto FECYT
“Ciencia para todos” nos planteamos que los alumnos de la asignatura
Métodos y Técnicas en Biología Molecular de tercer curso, diseñasen
un “Taller de criminología” y lo presentasen a alumnos de secundaria y
26
XXXVII Congreso SEBBM
bachiller. El taller debía consistir en un conjunto de experimentos para
determinar la identidad de un asesino a partir de las pruebas halladas
en una escena del crimen. Las actividades debían de ser sencillas, de
bajo coste y que fuesen comprensibles para el público en general. Los
alumnos en grupos de 6 bajo supervisión del profesor prepararon el
material y las actividades, que se filmaron e implementaron en un blog
para poder ser consultadas y utilizadas por profesores de secundaria.
Los alumnos plantearon el taller de criminología como un escenario
distribuido en tres espacios: la escena del crimen donde se recogían
las pruebas (pelo, huellas dactilares, detección de sangre con luminol);
el laboratorio de criminología, donde se analizaban las pruebas (grupo
sanguíneo, DNA, pelo, etc.) y la pizarra de los sospechosos donde
por descarte debían de identificar el asesino. Mediante encuesta se
evaluó la opinión de los alumnos que visitaron el taller, así como la
de los alumnos de grado que participaron en la actividad. El taller
de criminología fue una de las actividades mejor valoradas por los
visitantes, y nuestros alumnos reconocieron haber trabajado aspectos
relacionados con competencias del grado como el trabajo en equipo, la
capacidad organizativa y expositiva.
Agradecimientos: alumnos del grado de Bioquímica (BQ3) de la UIB.
FECYT, ICE-UIB.
P00-10
Análisis del modelo de reparto de tareas
en un trabajo en grupo reglado (TEG-R) para
alumnos de Genética de primer curso de Grado
de Biología
Oscar de Luis
Área de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. de Ciencias Básicas
de la Salud, Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón (Madrid), ES
En 2010 se presentó una adaptación del Aprendizaje Basado en
Problemas para la evaluación continua de la asignatura de Genética del
Grado de Biología de la U. Rey Juan Carlos. La actividad consiste en la
elaboración, por parte de un grupo de trabajo, de una memoria escrita
consistente en un resumen analítico y un análisis crítico de un artículo
científico publicado en inglés, en revista con índice JCR. La defensa en
público de la memoria por parte de todos los componentes del grupo es
obligatoria. Esta herramienta ha sido perfeccionada para profundizar en la
evaluación, calificación y adquisición por el alumnado de las competencias
generales de la asignatura. Con los datos del período 2009-2013 se valoró
en un reciente estudio la adecuación de esta actividad. Sin embargo, no
se contempló determinar si el modelo de organización interna libremente
elegido por cada grupo de trabajo puede ser o no determinante a la hora
de alcanzar las competencias propuestas y una calificación adecuada. Con
los datos del período 2011-2014 se han detectado tres tipos principales de
organización interna: una dinámica grupal cohesionada donde todos los
componentes del equipo trabajan globalmente, una dinámica de reparto
de tareas por partes temáticas reconocibles de corte más individualista, y
una dinámica de reparto de tareas por fragmentos no temáticos de la carga
de trabajo. Cabría esperar que a mayor cohesión interna en el grupo de
trabajo los resultados fueran mejores por que se alcanzan mejor todas las
competencias por parte de cada miembro del equipo, pero si establecemos
como criterio de eficiencia obtener una calificación superior a la media
del curso se observa que el modelo de reparto temático de tareas permite
la máxima eficiencia en la calificación. Estos datos preliminares permiten
proponer una relación entre el esfuerzo y el rendimiento en cada tipo de
organización. Se propone también modificar el protocolo de seguimiento
del profesor y el cuestionario de autovaloración obligatorio de los alumnos
para obtener datos más precisos con los que contrastar la hipótesis esfuerzo-
rendimiento.
Granada 2014
P00-11
Oportunidades de formación en biomedicina y
biotecnología a nivel europeo: el Curso “Towards
a Scientific Career: an Introductory Course for
Research in Biomedicine and Biotechnology -
BIOMED-TECH”
Inmacualda Llamas Company1, María Dolores González Girón2,
Fernando Hernández-Mateo3, Rafael Salto González2
1
Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad
de Granada, Granada, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada,
Granada, ES, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES
Los programas intensivos Erasmus han ofrecido hasta ahora la oportunidad
de desarrollar actividades de formación en campos concretos. Nosotros
hemos aprovechado este marco para realizar dos ediciones de un curso que
tiene el objetivo principal de dirigir alumnos hacia una carrera profesional
en el ámbito de la investigación en Biomedicina y Biotecnología. Para ello,
en las diferentes ediciones del programa hemos seleccionado alumnos de
las Universidades de Granada (España), Universidad de Nottingham (Reino
Unido), Universidad de Bayreuth (Alemania) y Universidad de Nova Lisboa
(Portugal), que han convivido durante 2 semanas y que han recibido un
programa intensivo de orientación y formación en el área de Biomedicina
y Biotecnología. El programa se ha estructurado mediante una serie de
mesas redondas con charlas impartidas por profesores procedentes de las 4
universidades implicadas y figuras relevantes en el área de conocimiento.
Además se han realizado visitas a empresas del área y así, como empresas
agregadas al proyecto, han participado Abbott Laboratories S.A., Bio-
Iliberis R&D, Neuron Bio y la Fundación MEDINA. La formación de
los alumnos se ha completado con la realización de talleres prácticos
sobre quorum sensing, síntesis de neoglicoproteínas, bioinformática y
mutagénesis sitio específica de proteínas. Los profesores del curso han
tutorado a los alumnos y los han asesorado en cómo orientar su actividad
profesional hacia la investigación en Biomedicina y/o Biotecnología,
conocer aspectos prácticos de la carrera científica académica y en la
industria, analizar los perfiles científicos profesionales y establecer una red
inicial de contactos en instituciones públicas así como en la industria. El
hecho de que se hayan seleccionado alumnos de último curso de grado, de
master y alumnos de doctorado ha posibilitado establecer un proceso de
mentorización entre ellos. Otros resultados alcanzados, en este caso para
el profesorado ha sido el facilitar la cooperación entre universidades y con
la industria y establecer procedimientos docentes para la motivación del
alumnado hacia la investigación como salida profesional.
Actividad financiada por el Organismo Autónomo de Programas
Educativos Europeos (OAPEE) 2012-1-ES1-ERA10-0083 y 2013-1-ES1-
ERA10-74542, El Vicerrectorado de Relaciones Internacionales y el
Campus de Excelencia CEI-BIOTIC de la Universidad de Granada.
P00-12
La Bio(Química) en la vida cotidiana: método
para estimular el interés de los estudiantes
Rafael Salto González1, Luisa Carlota López Cara2, María del Mar
Sola Zapata1, Alberto Manuel Vargas Morales1, María Dolores Girón
González1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de
Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departamento
de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de Farmacia,
Universidad de Granada, Granada, ES
Divulgar de forma atractiva la ciencia y hacerla asequible a todos los
públicos no siempre es fácil, especialmente si el área de conocimiento tiene
una cierta complejidad, lo que hace que sea difícil de comprender para
el estudiante. Tal es el caso de asignaturas como Bioquímica Estructural,
Pósters
Bioquímica Metabólica y Química Orgánica I y II. Todas están situadas en
el primer y segundo curso de los Grados que se imparten en la Facultad de
Farmacia de la Universidad de Granada. Pensamos que las competencias
adquiridas por los alumnos en su etapa preuniversitaria no siempre son
las más apropiadas o no son suficientes para obtener el rendimiento
adecuado en estas asignaturas. Nuestra misión como profesores es que el
alumno adquiera las competencias específicas de nuestras asignaturas de la
manera más asequible y dinámica utilizando todos los recursos que estén a
nuestra disposición. Las técnicas y herramientas empleadas para despertar
el interés y motivar a los estudiantes son numerosas. Cuando durante la
docencia de una asignatura, le indicamos al estudiante direcciones de
internet donde pueden consultar modelos tridimensionales o vídeos de
técnicas de biología molecular entre otros, comprobamos que despiertan
más interés que un libro de consulta o divulgativo como La doble hélice de
James D. Watson donde se narran de forma dinámica los experimentos que
llevaron a la dilucidación de la estructura del DNA. Una forma amena y
divertida para introducir el conocimiento en las aulas es referirnos al cine,
a la televisión o a los periódicos para ilustrar con ejemplos ciertos aspectos
de la asignatura. Las películas y series de gran audiencia ofrecen contextos
donde situados los conceptos químicos y bioquímicos nos permiten mostrar
a los estudiantes la realidad o la ficción de ejemplos más o menos cotidianos
que están acostumbrados a ver pero que no han terminado de asimilar. Los
profesores que presentan esta propuesta saben por experiencia, que ciertos
procesos químicos y bioquímicos siempre son recordados por los alumnos
cuando recurrimos a casos de la vida cotidiana o del cine y televisión.
Durante el primer año de implantación se ha aumentado en un 20% el
rendimiento académico de los alumnos.
Proyecto 2013-80. Vicerrectorado de Ordenación Académica y
Profesorado. Secretariado de Innovación Docente. Universidad de
Granada.
P01. Apoptosis
P01-1
Investigating the membrane topology of BAX/BAK
and the role of mitochondrial membrane lipids in
BAX/BAK activation
Héctor Flores Romero, Juan García-Valero, Ane Landajuela, Olatz
Landeta, Itsasne Bustillo, Miguel García-Porras, Oihana Terrrones,
Gorka Basañez
Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES
Mitochondrial outer membrane (MOM) permeabilization is the point of
no return in many forms of apoptotic cell death. The lethal effect of MOM
permeabilization is twofold, as it allows activation of pro-apoptotic caspase
enzymes and also damages normal mitochondrial function. The BCL-2
family members BAX/BAK are crucial effectors of MOM permeabilization
that adopt inactive conformations in healthy cells. It is well established
that functional BAX/BAK activation is a complicated process, involving
profound conformational changes in these proteins, and culminating with
assembly of a protein-permeable pore in the MOM. However, our current
structural knowledge of BAX/BAK primarily originates from studies with
the protein in solution, although the active locus of these proteins is at
the MOM. In addition, increasing evidence indicates that selected MOM-
localized lipids modulate the BAX/BAK-driven MOM permeabilization
pathway during apoptosis.Given the inherent complexity of the cellular
apoptotic network, we use in vitro reconstituted systems bearing
physiological relevance to try elucidating the membrane topology of BAX/
BAK, and their functional modulation by apoptosis-related lipid effectors.
27
Pósters
P01-2 (R01-3)
Cathepsin D promotes the cleavage of PARP-1
mediated by inactivation of BRCA1 in MCF-7
cells
Juan M. Esteve1, Ghita Ghislat2, Erwin Knecht2
1
Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad CEU Cardenal
Herrera, Castellón de la Plana, ES, 2Centro de Investigación
Príncipe Felipe, Valencia, ES
The breast cancer type 1 susceptibility protein (BRCA1) is a tumor
suppressor involved in the maintenance of genetic stability in response to
DNA damage, due to the control of cell cycle progression and activation
of DNA repair pathways. Cells with BRCA1 mutations manifest DNA
synthetic lethality and apoptosis after pharmacological inhibition of poly
(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), a nuclear enzyme that contributes
to the resolution of DNA breaks. Hence, PARP-1 inhibitors represent a
potential novel strategy for the treatment of BRCA1-mutated malignancies.
Our study demonstrates that the silencing of BRCA1 activates the cleavage
of PARP-1, and slows the cell cycle since it increases the percentage of
cells in G1 phase and reduces that in the S + G2/M phase of the cell cycle.
In relation to the mechanism of PARP-1 fragmentation, it has been shown
that caspases-3 and -7 cleave and, consequently, inactivate PARP-1 and
DNA repair, thereby contributing to apoptotic cell death. However, in
MCF-7 cells silenced for BRCA1, we show that the PARP-1 cleavage was
not accomplished by caspases-3 and -7. What type of proteases could then
be responsible for cleavage of PARP-1? The fact that lysosomal proteases,
cathepsins, can be released from lysosome and function in the cytosol
to regulate apoptosis, and that BRCA1 decreases the 52 kDa form of
cathepsin D (CD), suggest a potential role of CD on PARP-1 cleavage. In
this sense, we found that levels of three forms of CD (procathepsin D, the
52 kDa form which leaves the Golgi apparatus and is targeted to lysosomes
(and also to secretion in cancer cells); a lysosomal enzymatically-active
intermediate of 48 kDa; and a lysosomal active mature form of 34 kDa)
were increased in BRCA1-silenced MCF-7 cells, but mainly precursor and
intermediate forms. Furthermore, we also observed that BRCA1 silencing
enhances CD mRNA levels, and our preliminary results suggest no changes
in relation to the rate of the intracellular degradation of CD protein, leading
to the conclusion that BRCA1 inactivation increases CD levels mainly
by the control of its synthesis and not of its degradation. Finally, we
demonstrate that the cleavage of PARP-1 and cell cycle slowing mediated
by silencing of BRCA1 are dependent on CD in MCF-7 cells, and this
PARP-1 fragmentation is accomplished by the catalytic activity of CD. In
summary then, tumor suppressor protein BRCA1 inhibits PARP-1 cleavage
and negatively regulates CD synthesis in MCF-7 cells, and this PARP-1
cleavage is positively regulated by CD. Our results provide new data for
understanding the molecular and cellular mechanisms by which BRCA1
is involved in DNA repair, as well as to explain how PARP-1 inhibitors
trigger apoptosis in BRCA1-mutated cells.
P01r-3
Does sulforaphane protect against MPP+/PQ
oxidative stress effect in mouse embryonic
fibroblasts through the activation of Nrf2/Keap1
pathway?
Elisa Pizarro Estrella1, J.M. Bravo San Pedro2, R. Gómez Sánchez3,
S.M.S. Yakhine-Diop1, M. Rodriguez-Arribas1, R.A. González-Polo1,
J.M. Fuentes1
1
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y
Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES,
2
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y
BIología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia
28
XXXVII Congreso SEBBM
Ocupacional. Universidad de Extremadura. Cáceres, ES. IMSERM,
U848, Institut Gustave Roussy, Université Paris Sud, Villejuif,
Paris, FR, 3Department of Cell Biology, Center for Molecular
Medicine, University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL
Several studies have demonstrated the ability of Nrf2 transcription factor
to control the cytoprotective adaptive response in the brain using PD
models. In this sense, brain samples from animals with neurodegeneration
by oxidative stress have shown that increased nuclear Nrf2 may have a
protective effect on dopaminergic neurons in the SNpc, and on the other
hand, in MEFs it is has been observed the induction of antioxidant defenses
from this pathway after exposure to inducing agents. The chemical
characteristics of the agents which have the ability to interact with the Nrf2/
Keap1 pathway show differences from each other in the chemical structure
or how to interact (directly or indirectly) with the pathway. Sulforaphane
(SFN) is a naturally isothiocyanate presents in cruciferous plants. This
substance shows in its structure a highly electrophilic central carbon (-N =
C = S) which can easily react with the sulfhydryl groups of Keap1 to form
dithiocarbamates, so in this fact lies its ability to promote the translocation
of the transcription factor Nrf2 to the nucleus. However, it has been found
that this substance can play a dual role, as a chemotherapeutic agent or as a
promoter of antioxidant defenses.
Based on this powerful cellular defense of Nrf2 factor against oxidative
stress and based on the chemical features offered by SFN, the aim of
this work was to determine whether the activation of this axis exerted a
protective effect or not against MEFs induced PQ and MPP+ cytotoxicity
and on the other way, if that substance could modulate another celular
processes such as autophagy, apoptosis or acetylation, thinking that this
model could be used to elucidate the Nrf2 potential role as a molecular
therapeutic target value.
This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054);
Instituto de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041).
M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad de
Extremadura. R.G-S. was supported by a FPU predoctoral fellowship
(Ministerio de Educación, Spain), E.P-E. was supported by a predoctoral
fellowship (CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P.
was supported by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud
Carlos III, Spain).
P01-4
IfDotMeter®: a new tool for immunofluorescence
analysis
Mario Rodríguez Arribas1, Elisa Pizarro Estrella1, Rubén Gómez
Sánchez2, Sokhna Maryama Seidina Yakhine Diop1, Alejandro
Cristo3, Antonio Grajera Hidalgo4, José Manuel Bravo San Pedro5,
José Manuel Fuentes Rodríguez1, Rosa Ana González Polo1
1
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y
Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES,
2
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Department of Cell Biology,
Center for Molecular Medicine, University Medical Center, Utrecht,
NL, 3IEEE Aerospace and Electronic Systems. Universidad
de Extremadura, Cáceres, ES, 4Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y
Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES,
5
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). INSERM, U848, Institut Gustave
Roussy, Université Paris Sud, Villejuif, Paris, FR
Most of laboratories interested in autophagy use different imaging
software for managing and analyzing heterogeneous parameters from
immunofluorescence experiments (LC3-puncta quantification and
determination of number and size of lysosomes, among others). In this
sense, one helpful solution would be some software working in user’s
Granada 2014
laptop or workstation able to access to all image settings and provide a
quick and easy-to-use analysis of these data.
For this reason, we have designed an application called IFDOTMETER®
which runs on the major operating systems because it has been
programmed using Java (Sun Microsystems) as the computer platform.
Briefly, IFDOTMETER® software has been created to quantify a variety
of biological hallmarks, including mitochondrial morphology, nuclear
condensation, cell area, quantification of number or size of different
puncta staining and so on. Once specific parameters have been defined,
IFDOTMETER® allows you to analyze a large number of images in an
objective and automatic way, without the supervision of researcher.
Results obtained are stored in a spreadsheet. Thus, researchers can perform
a comprehensive and precise analysis of a high number of images in an
automated manner, making easier than before this routine chore. Here
we will show results obtained with IFDOTMETER® applying different
treatments and staining in different cell lines to demonstrate that this new
tool would be useful to the scientific community because of both being
more objective and saving time.
This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054);
Instituto de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041).
M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad
de Extremadura. E.P-E. was supported by a predoctoral fellowship
(CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P. was supported
by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud Carlos III,
Spain). Authors thank FUNDESALUD for providing helpful assistance.
P01-5
Nuevas funciones génicas en apoptosis
y autofagia celular identificadas mediante
genómica funcional
Felipe Xosé Pimentel Muiños
Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC).
CSIC-Universidad de Salamanca, Salamanca, ES
Previamente en el laboratorio hemos diseñado un sistema de alto
rendimiento para identificar funcionalmente moléculas capaces de inducir
diferentes modalidades de muerte celular al ser sobreexpresadas. Este
abordaje se basa en el uso de sistemas robóticos que facilitan el manejo
sistemático de genotecas de cDNA clonadas en vectores de expresión, y en
la transfección de los clones en células susceptibles y en combinación con
GFP. Tras el escrutinio de 135.000 clones de una genoteca humana, hemos
identificado un total de 90 elementos genéticos cuya expresión induce
muerte celular. De forma interesante, aunque la mayoría son capaces de
provocar muerte celular apoptótica, otros inducen formas de muerte celular
morfológicamente atípica, diferentes de la apoptosis.
Dentro de los clones apoptóticos hemos identificado el transportador
mitocondrial de fosfato, y trabajo adicional demostró que esta molécula
forma parte del poro de transición de permeabilidad que media la liberación
de citocromo c y la activación de las caspasas en algunos paradigmas de
apoptosis. Por otro lado, dentro de los clones atípicos hemos descubierto
una nueva proteína transmembrana denominada TMEM59. Estudios
adicionales indicaron que esta molécula induce un fenómeno atípico de
autofagia celular implicado en defensa contra agentes infecciosos, y no
parece tener un papel fisiológico en muerte celular. Por tanto, a través de
un sistema no sesgado de identificación funcional hemos podido adscribir
funciones celulares nuevas, bien a genes conocidos que previamente no se
habían implicado en una determinada función (transportador de fosfato),
o a genes nuevos cuya función fisiológica se desconocía por completo
(TMEM59), demostrando el potencial de este tipo de aproximaciones para
anotar funcionalmente el genoma.
Pósters
P01-6
Apoptotic efficacy of etomoxir in HL60 human
acute myeloid leukemia cells. Cooperation with
arsenic trioxide and glycolytic inhibitors, and
regulation by oxidative stress and protein kinase
activities
María Cristina Estañ Omaña1, Eva Calviño Vanegas1, Susana Calvo
Alonso1, María del Carmen Boyano-Adánez2, Elena de Blas1,
Eduardo Rial1, Patricio Aller1
1
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES,
2
Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES
Fatty acid synthesis and metabolism are frequently exacerbated in
leukemia cells, and may therefore represent a target for therapeutic
intervention. Therefore, we analyzed the pro-apoptotic and chemo-
sensitizing action of the fatty acid oxidation inhibitor etomoxir (Eto) in
HL60 human acute myeloid leukemia cells. Etomoxir caused negligible
lethality at concentrations up to 100 μM, but greatly potentiated apoptosis
induction by the anti-leukemic agent arsenic trioxide (ATO) and, with
lower efficacy, by other anti-tumour drugs (etoposide, cisplatin). Etomoxir
dose-dependently inhibited mitochondrial respiration while stimulating
glycolysis, but caused minimal alterations in intracellular nucleotide pools
(ATP, ADP, AMP). In addition, etomoxir caused moderate oxidative stress
and stimulated the LKB-1/AMPK pathway, all of which might in part
explain the chemo-sensitizing capacity of the drug with ATO. Etomoxir
also cooperated with the glycolytic inhibitor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) to
induce apoptosis, and the combined etomoxir/2-DG treatment stimulated
Akt and ERK phosphorylation/activation. Apoptosis generation by
etomoxir plus 2-deoxy-D-glucose was further increased by co-treatment
with ATO, a response apparently explained by the capacity of ATO to
prevent defensive Akt and ERK activation. In summary, co-treatment
with etomoxir may represent an interesting strategy to increase the cyto-
reductive efficacy of ATO and 2-deoxy-D-glucose, as well as of etomoxir
itself which, although clinically important anti-tumour agents, exhibit
limited efficacy in monotherapy.
P01-7
Mecanismos involucrados en el efecto
antiapoptótico de leptina en placenta humana
a término
Ayelen Rayen Toro1, Antonio Pérez Pérez2, Victor Sanchez
Margalet2, Bernardo Maskin3, Cecilia Varone1
1
IQUIBICEN - Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autonoma de
Buenos Aires, AR, 2Departamento de Bioquímica Médica y Biología
Molecular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 3Hospital Nacional
“Profesor A. Posadas”, Buenos Aires, AR
Durante la implantación embrionaria se genera un diálogo materno fetal
que involucra la acción de múltiples reguladores, siendo uno de ellos la
leptina. Esta proteína de 16 kDa fue descubierta en tejido adiposo con la
función de regular el balance energético del organismo. También se expresa
en placenta humana donde podría tener efectos sobre el crecimiento,
la supervivencia, la angiogénesis y la inmunomodulación placentaria.
Resultados previos de nuestro grupo demostraron que la leptina aumenta la
proliferación celular y supervivencia en células placentarias.
El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la leptina sobre la apoptosis
de células placentarias.Se utilizaron como modelos de trabajo explantos
placentarios a término, los cuales se obtuvieron del tejido trofoblástico de
placentas humanas derivadas de partos vaginales normales. Los explantos
fueron incubados en DMEM-F12 sin SFB durante 24h para inducir la
muerte celular, como control se incubaron los explantos en DMEM-F12
con SFB al 10%. Por Western Blot y qRT-PCR se analizó la expresión de
distintas proteinas involucradas en el proceso de apoptosis, y se evaluó la
fragmentación del DNA.
29
Pósters
Encontramos que en presencia de leptina disminuye la proteina p53
y su isoforma fosforilada en Ser46, indicadora de activación de la vía
apoptótica. También evaluamos el efecto de leptina sobre mediadores pro y
antiapoptóticos. Hallamos que leptina disminuye la expresión de Bax y Bid,
y genera un aumento en la expresión de Bcl-2. Asimismo, el tratamiento
con leptina disminuye la activación de Caspasa-3. Comprobamos dicho
efecto analizando el fragmento clivado de PARP-1, el cual disminuye en
presencia de leptina. Confirmamos el efecto antiapoptótico de leptina,
estudiando la fragmentación del DNA, la cual disminuye con el tratamiento
con leptina.
Todos estos resultados refuerzan la noción de la leptina como una importante
citoquina placentaria, con la función de promover la supervivencia de las
células trofoblásticas.
P01-8 (R01-4)
Lack of oligonucleosomal DNA degradation
during caspase-dependent cell death is a
common trait of human glioblastoma multiforme-
derived cells due to improper activation of
DFF40/CAD
María Sánchez Osuna1, Fina Martinez-Soler2, Sònia Pascual-Guiral1,
Mercè Garcia-Belinchón1, Victoria Iglesias-Guimarais1, Elisenda
Casanelles1, Gerard Plans3, Jordi Bruna3, Avelina Tortosa3, Victor J.
Yuste1
1
Cell Death, Senescence and Survival Group, Dept. Bioquímica
i Biologia Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de
Medicina, UAB - Centro de Investigación Biomédica en Red sobre
Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Barcelona, ES,
2
Department of Basic Nursing, Institut d’Investigació Biomèdica
de Bellvitge-Universitat de Barcelona, Barcelona, AF,3Unit of
Neuro-Oncology, Services of Neurology and Neurosurgery, Hospital
Universitari de Bellvitge, Barcelona, ES
Apoptosis is a tightly regulated process characterized by oligonucleosomal
DNA degradation and nuclear fragmentation. These apoptotic hallmarks
appear when the Caspase-activated DNase (DFF40/CAD) becomes
activated. Here, we show different human glioblastoma multiforme-
derived (hGBM) cells in which caspase-dependent cell death occurs in the
absence of oligonucleosomal DNA degradation. After apoptotic stimuli,
hGBM-derived cells activate the executioner caspases, thus processing
and inhibiting ICAD, the inhibitor of DFF40/CAD. However, injured
cells do not hydrolyze their DNA into oligonucleosome-sized pieces.
Moreover, most injured hGBM cells display heterogeneous nuclear
alterations characterized by highly compacted chromatin, in the absence
of the classical apoptotic nuclear fragmentation. Both in vivo and in vitro
approaches demonstrate that higher levels of DFF40/CAD endonuclease
make hGBM cells competent to undergo oligonucleosomal DNA
degradation after apoptotic stimuli. Intriguingly, the overexpression of
DFF40/CAD does not alter the nuclear morphology observed in apoptotic
wild type hGBM cells. Altogether, these data highlight a new apoptotic
paradigm where nuclear alterations are DFF40/CAD-independent despite
proper caspase activation. This is the first time reporting a common trait
in hGBM cells which may be taken into consideration to design effective
chemotherapy to target these extremely aggressive tumors.
Work supported by Ministerio de Economía y Competitividad, European
Regional Development Fund (ERDF) Grant SAF2012-31485 and
Generalitat de Catalunya Grant 2009SGR-346.
S-O, M. holds an FPU fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación
(MICINN).
30
XXXVII Congreso SEBBM
P01r-9
Mitochondrial pathway mediators as
pharmacological targets to improve cisplatin
therapeutic utility
Laura Prieto García1, Sandra Sancho Martínez1, José Miguel López
Novoa1, Francisco López Hernández2
1
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL) y
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina
Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología
y Farmacología, Universidad de Salamanca, Salamanca, ES,
2
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL),
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina
Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y
Farmacología, Universidad de Salamanca e Instituto de Estudios
de Ciencias de la Salud de Castilla y León (IECSCYL), Unidad de
Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES
Cisplatin is a chemotherapeutic drug widely used against a variety of
cancers. Its clinical utility is limited by its side effects, result of cisplatin
action in normal cells. Cisplatin toxicity is determined by target tissue and
cell accumulation, subcellular handling and trafficking through diverse
subcellular structures. This drug causes cell death both by apoptosis and
necrosis linked to cisplatin concentration. For a better control of cisplatin’s
side effects, pathways leading to activation of both types of cell death need
to be clarified in order to identify suitable pharmacological targets and
implement appropriate treatments with a theranostic approach. The aim of
this work is to establish a hierarchy in cisplatin cytotoxic mechanisms and
to clarify the role of the mitochondrial pathway in this process.
We used cultured human lymphoma (Jurkat T cells) to investigate the
biochemical and phenotypic characteristics of the death mode induced
by increasing concentrations of cisplatin. For this purpose the cells were
treated for 4, 8, 12 and 18 hours with different concentrations of cisplatin
(0-1000 microM). In order to put in perspective the main pathways of cell
death induced by cisplatin we used different stable trasfectants of Jurkat
cells in which main mitochondrial pathway proteins were modified, such
as Jurkat Bcl-2 (which presents overexpression of an antiapoptotic protein
Bcl-2), Jurkat C9DN (which presents overexpression of a catalytically
inactive form of caspase 9) and their control carrying the empty vector
(pcDNA3.0). Our results indicate that concentrations of cisplatin inducing
a necrotic-like cell death mode are capable of activating the apoptotic
machinery. We demonstrate that caspase 9 activity and antiapoptotic Bcl-
2 protein play a critical role in the cytotoxicity mechanism induced by
cisplatin, accordingly with the increase in the viability and reduction in the
apoptotic proteins expression. This knowledge may allow us to develop
drugs that block cisplatin-induced apoptosis and minimize cisplatin-
induced necrosis.
P01-10 (R01-7)
Familial Parkinsonism with G2019S LRRK2
mutation displays a susceptibility to the MPP+
neurotoxin by an mTOR-dependent autophagy
Sokhna M.S. Yakhine Diop1, José Manuel Bravo-San Pedro2, Rubén
Gómez-Sánchez3, Elisa Pizarro-Estrella1, Mario Rodríguez-Arribas1,
Ana Gómez-Martin4, Ana Aiastui5, Ana Gorostidi5, Adolfo López de
Munain6, José Manuel Fuentes-Rodríguez1, Rosa Ana González-Polo1
1
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y
Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Caceres, ES,
2
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y
Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Cáceres,
ES. INSERM, U848. Institut Gustave Roussy. Université Paris
Sud, Villejuif, Paris, FR, 3Centro de Investigación Biomédica
Granada 2014
en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED).
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética,
F. Enfermería y T.O., Universidad de Extremadura, Cáceres,
ES. Department of Cell Biology, Center for Molecular Medicine,
University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL, 4Centro
de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Departemento de Enfermería,
Centro Universitario Plasencia, Universidad de Extremadura,
Plasencia, ES, 5Centro de Investigación Biomédica en Red sobre
Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture
Plataform/Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia
Institute, Donostia Universitary Hospital , San Sebastián, ES,
6
Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture Plataform/
Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia Institute,
Donostia Universitary Hospital. Department of Neurology, Hospital
Donostia. Ilundain Fundazioa, Department of Neurosciences,
University of the Basque Country UPV-EHU, San Sebastián, ES
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized
by mitochondrial dysfunction, oxidative stress and later neuronal death.
Several genetics and environmental factors have been implicated in the
pathogenesis of PD.
MPP+ is a neurotoxin widely used to induce parkinsonian cellular model,
it is responsible for cellular damage at different levels, apoptotic death,
depletion of mitochondrial potential membrane and deregulation of cellular
recycling machinery.
In this study, we characterized the MPP+-induced toxicity in fibroblasts
from PD patients with G2019S LRRK2 and control individuals without this
mutation. Obtained results show that MPP+ induces a mTOR-dependent
autophagy in both fibroblasts cells. Further, cell death to MPP+ was higher
in mutant fibroblasts which exhibited a basal level of mTOR-independent
autophagy due to the G2019S LRRK2 mutation.
Inhibition of autophagosome-lysosome fusion by Bafilomycin A1
exacerbated the response to MPP+ exposure in both cell lines, but inhibition
of early state autophagy by 3-methyladenine lessened this difference
between both cell types.
This finding confirms the important implication of the interaction of
genetics and environmental factors in the PD etiology and may help to get
a better understanding in the pathogenic mechanism of this disease.
This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054); Instituto
de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041). RA.G-P.
was supported by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud
Carlos III, Spain). A.A. was supported by ISCIII (CA00/01506; Ministerio
de Economia y Competitividad) and Instituto Biodonostia and A.G was
supported by the Ilundain Fundazioa. A.L.M. received research support by
the Association Francaise contre les Myopathies (Ref. 12642), the Spanish
Ministry of Health (FIS PS09-00660), the Ilundain Foundation, Isabel Gemio
Foundation, Diputacion Foral de Gipuzkoa (DFG09/001), and SAIOTEK
(SAIO12-PE12BN008). RAG-P received research support from Ministerio
de Ciencia e Innovación, Spain (PI11/00040). JM. F received research
support from the Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain, CIBERNED
(CB06/05/004), Consejería, Economía, Comercio e Innovación Junta de
Extremadura (GRU10054), Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain
(PI12/02280). The authors also thank FUNDESALUD for helpful assistance.
P01r-11 (R01-6)
2-phenylethynesulfonamide (PES) uncovers a
non-necroptotic necrotic cell death regulated by
oxidative stress and p53
Paolo Mattiolo1, Ares Barbero-Farran1, Víctor José Yuste2, Jacint
Boix1, Judit Ribas Fortuny1
1
Departament de Medicina Experimental, Universitat de Lleida,
Lleida, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
UAB, Campus de Bellaterra, ES
Pósters
2-phenylethynesulfonamide (PES) or pifithrin-μ is a promising anticancer
agent with preferential toxicity for cancer cells. The type of cell death and
the molecular cascades activated by this compound are controversial. Here,
we demonstrate PES elicits a caspase- and BAX/BAK-independent non-
necroptotic necrotic cell death, since it is not inhibited by Necrostatin-1.
This process is characterized by an early generation of reactive oxygen
species (ROS) resulting in p53 up-regulation. Accordingly, thiolic
antioxidants protect cells from PES-induced death. Furthermore, inhibiting
the natural sources of glutathione with L-buthionine-sulfoximine (BSO)
strongly synergizes with PES in triggering cytotoxicity. Genetically
modified p53-null or p53 knocked-down cells show resistance to PES-
driven necrosis. The predominant localization of p53 in chromatin-
enriched fractions added to the up-regulation of the p53-responsive gene
p21, strongly suggest the involvement of a transcription-dependent p53
program. On the other hand, we report an augmented production of ROS
in p53-positive cells that, added to the increased p53 content in response
to PES-elicited ROS, suggests that p53 and ROS are mutually regulated
in response to PES. In sum, p53 up-regulation by ROS triggers a positive
feedback loop responsible of further increasing ROS production and
reinforcing PES-driven non-necroptotic necrosis.
P01-12 (R01-2)
Influencia de FBWX7 en la adquisición
de resistencia a paclitaxel en cáncer de mama
Jessica Gasca Bellido1, Rainiero Ávila Polo2, Mª Luz Flores de
Mera1, Servando Giráldez3, María Tortolero3, Francisco Romero3,
Miguel A. Japón Rodríguez4, Carmen Sáez Torres4
1
1Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario
Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Rota, ES,
2
Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario
Virgen del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES, 3Departamento de
Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla,
Sevilla, ES, 4Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital
Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla y
Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen
del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES
Paclitaxel es un fármaco antimitótico que pertenece al grupo de los taxanos
que se emplea en el tratamiento del cáncer metastásico de mama, aunque
su utilidad es limitada debido a la aparición de resistencia a esta sustancia.
La relación entre la parada de mitosis inducida por paclitaxel y la posterior
supervivencia (o muerte) de la célula no se conoce completamente, aunque
diversos estudios indican que podría estar implicado el sistema ubicuitina/
proteasoma (UPS) que controla el ciclo celular mediante degradación de
diversos reguladores del ciclo. FBXW7 forma parte del complejo de la
ubicuitín ligasa SCFFBXW7 y es responsable de la unión a los sustratos. Esta
ligasa ubicuitina para su posterior degradación a oncoproteínas como c-Myc,
Ciclina E, Notch1, c-Jun y Mcl1, entre otras. Se han encontrado mutaciones
o pérdida de función de FBXW7 en numerosos cánceres, por lo que se
considera generalmente que FBXW7 es un supresor tumoral. En este trabajo
hemos evaluado el posible papel de FBXW7 en la adquisición de resistencia
a taxanos en el cáncer de mama. Estudiamos los niveles de expresión de
FBXW7 y de los sustratos Aurora A, Ciclina E y Mcl1 mediante análisis
inmunohistoquímico en algunas líneas celulares y en 380 cánceres de mama
observando que la disminución de expresión de FBXW7 se correlaciona
estadísticamente con un aumento en la expresión de los sustratos estudiados,
así como con el grado tumoral más agresivo. También estudiamos el
efecto del silenciamiento y la sobreexpresión en algunas líneas celulares
confirmando la influencia de FBXW7 sobre los sustratos mencionados y su
efecto en la muerte por apoptosis tras tratamiento con paclitaxel. Además,
la sobreexpresión de FBXW7 en una línea celular resistente a paclitaxel
derivada de células MDA-MB-468 provocó un aumento de la muerte
celular y una clara disminución de la proteína anti-apoptótica Mcl1 tras
el tratamiento con paclitaxel. Por lo tanto, nuestros datos parecen indicar
que FBXW7 podría influir en la adquisición de la resistencia a taxanos
principalmente a través de su papel en la regulación de Mcl1.
31
Pósters
P01-13 (R01-5)
La 2-deoxiglucosa y la privación de glucosa
inducen diferentes formas de muerte celular
Clara Lucía León-Annicchiarico, Silvia Ramírez-Peinado, Raffaella
Iurlaro, Cristina Muñoz-Pinedo
Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge IDIBELL,
Barcelona, ES
La 2-deoxiglucosa (2DG) es un medicamento ampliamente utilizado en la
investigación básica y actualmente en ensayos clínicos como un inhibidor
de la glicólisis, eficaz como agente antitumoral frente a tumores sólidos.
Debido al efecto de la 2DG en ruta de la glicólisis, el principal efecto que
se le atribuye es privar a las células de ATP. No obstante, hemos visto que el
efecto tóxico está mediado por el estrés del Retículo Endoplasmático más
que por el estrés bioenergético.
Estudiamos los efectos de la inhibición de la glicólisis inducida por la 2DG
y por la privación de glucosa en diferentes líneas celulares de sarcomas
y observamos que ambos tratamientos promueven diferentes formas
de muerte celular. En la línea celular de rabdomiosarcoma Rh4, ambos
estímulos inducen estrés del retículo endoplasmático y en ambos casos el
siRNA de ATF4, una proteína involucrada en el estrés reticular, protege
de la muerte celular. Además, ambos estímulos regulan de forma similar
la expresión de Noxa y de las proteínas antiapoptóticas de la familia
Bcl-2; especialmente con bajada de Mcl-1. Sin embargo, la 2DG y la
privación de glucosa promueven formas de muerte celular diferentes; la
muerte celular por 2DG pudo ser prevenida por inhibidores de caspasas,
mientras que la privación de glucosa indujo muerte celular independiente
de caspasas. Éste tipo de necrosis no fue consecuencia de una caída en
el ATP, sugiriendo un papel para una necrosis programada o necroptosis.
Sin embargo, la necrostatina-1 o los antioxidantes no redujeron la muerte
celular. Por el contrario, la Ciclosporina A, inhibidor del poro de transición
de permeabilidad mitocondrial, protegió de la muerte inducida por la
privación de glucosa.
Por otro lado, encontramos que sólo las líneas celulares derivadas de los
rabdomiosarcomas, fueron sensibles a la 2DG y a la privación de glucosa,
mientras que líneas celulares de liposarcomas o leiomiosarcomas son
sensibles a la falta de glucosa pero no a la 2DG. Nuestros resultados indican
que el tratamiento con la 2DG no es análogo a la privación de glucosa y que
la 2DG podría ser eficaz en el tratamiento de rabdomiosarcomas.
P01r-14 (R01-8)
Dissecting the molecular mechanism of cell
death in transformed cells during photothermal
therapy using gold nanoprisms
Marta Pérez Hernández1, Pablo del Pino2, Scott G. Mitchell3,
Beatriz Pelaz4, Eva M. Gálvez5, Jesús M. de la Fuente6, Julián
Pardo7
1
Instituto Universitario de Nanociencia de Aragón (INA),
Universidad de Zaragoza. Aragon Health Research Institute (IIS
Aragón), Edificio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon
(CIBA), Zaragoza, ES, 2Instituto Universitario de Nanociencia de
Aragón (INA), Universidad de Zaragoza. Fundación Araid , Zaragoza,
ES, 3Instituto Universitario de Nanociencia de Aragon (INA),
Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 4Instituto de Nanociencia
de Aragón, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 5Instituto de
Carboquímica, CSIC, Zaragoza, ES, 6Instituto de Nanociencia de
Aragón, Universidad de Zaragoza Fundación Araid, Zaragoza, ES,
7
Instituto de Nanociencia de Aragón, Universidad de Zaragoza.
Fundación Araid. Aragon Health Research Institute (IIS Aragon),
Edificio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon (CIBA),
Zaragoza, ES
Gold nanoparticles (NPs) are promising vehicles to specifically deliver
drugs to cancer cells and in addition to their use in drug targeting, gold NPs
can be used as “heaters” during photothermal therapy of solid carcinomas
using near-infrared (NIR) laser light.[1,2] We have previously shown that
32
XXXVII Congreso SEBBM
functionalization of gold nanoprisms (NPRs) with glucose selectively
enhances their cellular uptake in transformed cells.[3] Here we reveal for
the first time the molecular mechanism of apoptosis during photothermal
therapy in transformed cells following irradiation with NIR laser light.[4]
To this aim we have established conditions to readily induce apoptosis
on mouse embryonic fibroblast (MEF) cells transformed with the SV40
virus and analyzed the mechanism of apoptosis using MEFs from different
knock out mice, which are deficient in proteins involved in the different
routes of apoptosis (Bak and Bax, Bid, caspase-3 or caspase-9). Our results
show that “hot” NPRs activate the intrinsic mitochondrial pathway of
apoptosis mediated by Bak and Bax through the activation of the BH3-
only protein Bid and that apoptosis and cell death is dependent on the
presence of both caspase-9 and caspase-3. Our findings demonstrate how
the functionalization and dose of NPRs, as well as laser power density
and irradiation time exposure, must be regulated to specifically induce
apoptotic cell death. Moreover the molecular mechanism presented here
may help to predict the efficacy of NP-based photothermal therapy to treat
cancer patients.
References
[1] B. Pelaz, V. Grazu, A. Ibarra, C. Magen, P. del Pino, J.M. de la Fuente.
Langmuir 2012; 28: 8965.
[2] C. Bao, N. Beziere, P. del Pino, B. Pelaz, G. Estrada, F. Tian, V.
Ntziachristos, J. M. de la Fuente and D. Cui. Small 2012; 9: 68.
[3] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, B. Pelaz, E. M. Galvez, J. M. de la
Fuente, J. Pardo (under review).
[4] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, S. G. Mitchell, B. Pelaz, E. M Gálvez,
J. M. de la Fuente, Julián Pardo (under review).
P01-15
New oleanolic acid derivatives, with different
polarity, increase apoptotic effects in B16-F10,
murine melanoma cells
Fernando Jesús Reyes Zurita1, Marta Medina ODonnell2, Rosa Ferrer
Martín1, Eva Rufino Palomares1, Amalia Pérez Jiménez1, Leticia
García Salguero1, Pedro P. Medina1, Samuel Martín Fonseca2,
Francisco Rivas2, Andrés Parra2, Juan Peragón3, José Antonio
Lupíañez1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of
Science, University of Granada, Granada, ES, 2Department of
Organic Chemistry, Faculty of Science, University of Granada,
Granada, ES, 3Depatment of Experimental Biology, Biochemistry
Section, University of Jaen, Jaén, ES
Oleanolic acid (3β-hydroxyolean-12-e-28-oic acid), a natural hydroxylated
pentacyclic triterpene acid isolated from olive-pressing residues, has been
investigated together with some its derivatives regarding the induction of
apoptosis in B16-F10 melanoma cells. This study examines the response
of B16-F10 murine melanoma cells to oleanolic acid and three derivatives
with an increasing polarity (28-Benzyloleanolic acid, 3-Pthaloyl,
28-Benzylolanolic acid and 3-(3,3-Dimethylglutaryl), 28-Benzyloleanolic
acid). The compounds tested induce citotoxicity with IC50 concentrations
between 9.8 to 48.5 μg/mL in a increasing form, depending on the
polarity of the compounds. These results shown that the three derivatives
were more citotoxic that its precursor oleanolic acid. At these drugs
concentrations, all the products tested, induced over 95% of apoptosis,
measure by FACS analysis with annexine V FICT staining. Most of these
compounds, which also exhibited anti-proliferative effects, generated
mitochondrial disturbs, probably involving the activation of an intrinsic
apoptotic route. These mitochondrial disturbs was confirmed by FACS
analysis using rhodamine 123. Morphological changes including cell
shrinkage, chromatin condensation, and loss of nuclear architecture were
observed by Hoechst stained. These finding support a role of oleanolic acid
derivatives as tumor suppressant and as possible new therapeutic tools for
aberrant cell proliferation in skin and may be used as chemopreventives or
chemotherapeutics in melanoma process development.
Granada 2014
This study has been supported by the grants from Ministerio de Ciencia
e Innovación (Feder-Interconecta Program and CTQ2009-13898) and
the Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa (Junta de Andalucía)
research groups CVI-157 and FQM-7372.
P01-16
The activation of DFF40/CAD and the
cytoplasmic release of nuclear histones during
caspase-dependent apoptotic cell death
Raquel Larramona-Arcas, Laura Martínez-Escardó, María
Sánchez-Osuna, Víctor José Yuste Mateos
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular - Instituto de
Neurociencias, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de
Barcelona, Barcelona, ES
The activation of Caspase-Activated DNase (CAD) prompts to the
cytoplasmic release of nucleosomes (DNA and histones). The inhibition
of CAD blocks double-strand oligonucleosomal DNA fragmentation
and histone release. Previous results obtained in our laboratory pointed
to an unexpected apoptotic behavior in glioblastoma-derived cells,
where histones release occurs in the absence of double-strand DNA
fragmentation. Then, we took advantage of different human glioblastoma-
and neuroblastoma-derived cells, over-expressing or not human CAD.
Only CAD over-expressing cells treated with an apoptotic insult, such
as staurosporine, displayed oligonucleosomal DNA fragmentation during
apoptosis. Then, we compared both, CAD over-expressing and empty
vector-transfected cells, through Western blot. First, we determined the best
condition to perform the subcellular fractionation with different detergents.
The results obtained revealed a correlation between a high expression
of CAD and the release of the histone core variant H2B in several cell
lines, including glioblastoma-derived U87MG and neuroblastoma-derived
IMR-5 cells. Moreover CAD influenced the internucleosomal histone
H1.2 variant release in glioblastoma-derived LN18 and IMR-5 but not in
U87MG cells. Interestingly, CAD-overexpressing U87MG cells were the
only CAD-transfected cells that remained unable to hydrolyze their DNA
into oligonucleosome-sized pieces during apoptosis. Furthermore, a time
course of staurosporine treatment in IMR-5 cells revealed that H1.2 variant
release occurred already at three hours after apoptotic insult.
Supported by MINECO/FEDER Grant SAF2012-31485 and Generalitat de
Catalunya (2009SGR-346). This study corresponds to the work performed
by R.L.-A. under the “Master of Neurosciences” program from UAB.
P01-17 (R01-1)
Cellular senescence in tissue remodelling: from
physiology to pathology
Daniel Muñoz Espín, Manuel Serrano Marugán
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, ES
Recent discoveries are re-defining our view of cellular senescence as a
trigger of tissue remodeling that acts during normal embryonic development
and upon tissue damage. In the case of developmental processes, abrogation
of senescence is partially compensated by apoptosis but still results in
detectable developmental abnormalities. To achieve tissue renewal,
senescent cells arrest their own proliferation, recruit phagocytic immune
cells, and promote the mobilization of nearby progenitor cells that repopulate
the tissue. This sequence of events (senescence, followed by clearance and
then regeneration) may not be efficiently completed in aged or pathological
contexts, thereby resulting in the accumulation of senescent cells. Increasing
evidence indicates that both pro-senescent therapies and anti-senescent
therapies can be beneficial. In cancer and during active tissue repair,
pro-senescent therapies contribute to minimize the damage by limiting
proliferation and fibrosis, respectively. Conversely, anti-senescent therapies
may help to eliminate post-repair senescent areas and recover tissue function.
Pósters
P02. Bases moleculares de la patología
P02r-1
La quinasa humana VRK1 regula la estabilidad
de los Cuerpos de Cajal protegiendo a Coilina
de su degradación en el proteasoma
Lara Cantarero Abad, Marta Sanz García, Pedro A. Lazo
Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de
Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca
(IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES
Los Cuerpos de Cajal (CB) son suborgánulos nucleares implicados
en el procesamiento del RNA, importante en el proceso de splicing. El
ensamblaje de los CB, junto con su proteína scaffold Coilina, se regula a
través del ciclo celular. La quinasa humana VRK1, la actividad de la cual
también es regulada dependiendo del ciclo celular, interacciona y fosforila
a Coilina en el residuo serina 184, regulando la estabilidad de los CB. Así,
el silenciamiento de esta quinasa, o la falta de suero en el medio, inactivan
a VRK1 causando una pérdida en la fosforilación de Coilina y provocando
el desensamblaje de estos suborgánulos nucleares; efecto rescatado por una
VRK1 activa pero no por la quinasa inactiva. La pérdida de fosforilación
de Coilina y posterior desensamblaje de los CB, son recuperados por los
inhibidores del proteasoma. La falta de VRK1 provoca la ubiquitinación,
a través de la lisina 48, de Coilina en el núcleo. Este proceso es mediado
en parte por Mdm2, y el exporte al citosol para su degradación en el
proteasoma; de tal forma que este proceso se interrumpe al inhibir el
exporte nuclear con LeptomicinaB. De este modo, VRK1 protege a Coilina
de su degradación y es una quinasa esencial para el mantenimiento de la
estructura de los Cuerpos de Cajal y su regulación en el ciclo celular.
P02-2
Phosphorylation of mineralocorticoid receptor
at residue S839 impairs aldosterone-dependent
gene transactivation coupling in a dominant
negative manner
Ruben Jimenez-Canino, Miguel X. Fernandes, Teresa Giraldez,
Diego Alvarez de la Rosa
Department of Physiology and Centre for Biomedical Research of the
Canary Islands (CIBICAN), University of La Laguna, La Laguna, ES
The mineralocorticoid receptor (MR) is a member of the nuclear receptor
family of transcription factors that transduces the biological effects of the
steroid hormone aldosterone, including the regulation of transepithelial
sodium reabsorption and blood pressure. Aldosterone interaction with
MR ligand binding domain (LBD) is responsible for nuclear translocation,
dimerization and gene transactivation. It has recently been demonstrated
that phosphorylation of S843, a residue near the aldosterone binding
pocket, inactivates human MR, presumably by reducing affinity for the
hormone. In this work we examined the mechanisms involved in MR
modulation by S843p. To that end we used mouse MR phosphomimetic
mutant S839D (equivalent to S843 in human) cotransfected with wild
type MR in different proportions in COS-7 cells. MR-S839D is inactive
and significantly decreases wild type MR activity when both forms are
coexpressed. Assuming that MR/MR-S839D dimer formation follows a
binomial distribution, our results are consistent with a dominant negative
role of MR-S839D in the dimer. Surprisingly, aldosterone is able to induce
nuclear translocation of MR-S839D, although at a slower rate than wild
type receptors. Therefore aldosterone is still able to bind to MR-S839D but
it is inefficient for gene transactivation. Structure modeling of MR LBD
and docking experiments show that S839D mutation or S839p produce
the same effect, namely a small decrease in agonist docking energy.
Taken together, these results suggest that the effect of S839p cannot be
33
Pósters
fully explained by decreased aldosterone binding affinity and may imply a
defect in transactivation coupling.
P02m-3
Initial age-associated metabolic alterations in
different adipose tissue depots: effect of caloric
restriction
Patricia Corrales-Cordón1, Yurena Vivas-García1, Cristina Martínez-
García1, Adriana Izquierdo Lahuerta1, Carmen Martínez Martínez1,
Maria Jesús Obregón Perea2, Manuel Ros Pérez1, Gema Medina-
Gómez1
1
Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2Instituto de
Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, Madrid, ES
Changes in the body composition such as high adiposity and sarcopeny
occur during ageing. These changes are usually associated to metabolic
alterations like insulin resistance, type 2 diabetes and metabolic syndrome.
The fat tissue is not homogeneous and the distribution and function of the
different deposits of white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue
(BAT) change throughout life. In this study, we have studied different
WAT and BAT depots during the first stage of ageing with the objective
to detect the initial signals of alteration. Moreover, we have studied the
effect of the long-term caloric restriction (CR) and its benefits. 3 and 12-
month-old mice fed ad lib and 12-month-old mice fed ad lib with a 20%
CR have been used. The older animals showed insulin resistance and lower
adiponectin levels in plasma compared with the younger mice. We have
studied expression of different lipid metabolism genes and their regulation
in epididimal WAT (eWAT), subcutaneous WAT (scWAT) and BAT. In
these initial stages of ageing, expression of Glut4, IRSs and lipogenesis and
lipolysis genes were decreased in scWAT of 12-month-old animals, but not
in eWAT. Although visceral WAT has been described as the most dangerous
tissue from the metabolic point of view, our data could suggest an earlier
metabolic alteration in scWAT than in eWAT, which were retrieved by long-
term CR. In addition, functional markers of BAT (DIO2, LPL, PGC1α)
also showed changes in these first stages of ageing, Furthermore, UCP-
1 expression was significantly lower in scWAT of aged mice compared
with younger mice, suggesting an age-related loss of sWAT browning.
Our findings suggest that initial age-related metabolic alterations occur in
scWAT, where CR could attenuate them.
Acknowledgements: MINECO (BFU2012-33594), CAM (S2010/BMD-
2423).
P02-4 (R02-3)
La expresión hepática de la ciclooxigenasa-2
(COX-2) protege de la esteatosis, adiposidad
y resistencia a la insulina inducida por dieta rica
en grasa
Daniel E. Francés1, Omar Motiño2, Águeda Fernández-González3,
Ana Fernández-Álvarez4, Carme Cucarella5, Rafael Mayoral6,
María Fernández-Velasco7, Luis Castro- Sánchez2, Lisardo Boscá8,
Cristina E. Carnovale1, Marta Casado9, Ángela M. Valverde3,
Paloma Martín-Sanz8
1
Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET), Rosario, AR,
2
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM,
Madrid, ES, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols,
CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes
y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERdem), Madrid,
ES, 4Fundación Instituto Leloir, IIBBA-CONICET, Buenos Aires,
AR, 5Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia,
ES, 6Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Hepáticas y Digestivas (CIBERehd); Department of Medicine,
University of California, Madrid, ES, 7Instituto de Investigación
34
XXXVII Congreso SEBBM
Hospital Universitario La PAZ, IDIPAZ, Madrid, ES, 8Instituto de
Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM; Centro de
Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y
Digestivas (CIBERehd), Madrid, ES, 9Instituto de Biomedicina de
Valencia (IBV-CSIC); Centro de Investigación Biomédica en Red de
Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Valencia, ES
La resistencia a la insulina (RI) participa en la fisiopatología de enfermedades
relacionadas con la obesidad como la diabetes mellitus tipo 2 y la enfermedad
de hígado graso no alcohólica. Además, la RI está asociada con un estado de
inflamación crónica leve que contribuye significativamente a su desarrollo.
Las ciclooxigenasas 1 y 2 (COX-1 y COX-2) catalizan el primer paso en
la biosíntesis de los prostanoides. COX-1 se expresa constitutivamente
en diversos tejidos, mientras que la expresión de COX-2 es inducida por
diferentes estímulos. Los hepatocitos adultos son incapaces de inducir la
expresión de COX-2 independientemente de los factores proinflamatorios
presentes. Se ha analizado el papel de la expresión hepática de COX-2 en
ratones transgénicos (hCOX-2-Tg) en un modelo de RI y de alteración de
la homeostasis energética inducido por una dieta rica en grasa. Nuestros
resultados muestran que la expresión de COX-2 en el hepatocito protege
frente a la RI, esteatosis hepática y obesidad, en parte debido a una mayor
sensibilidad a la insulina, un aumento en la tolerancia a la glucosa, y de la
relación adiponectina/leptina. Asimismo, se observó una disminución de la
esteatosis hepática, adiposidad y en el área de los adipocitos, de los niveles
de triglicéridos y ácidos grasos libres tanto hepáticos como plasmáticos, y de
las citoquinas proinflamatorias. Los ratones hCOX-2-Tg exhibieron también
un incremento en el gasto energético, inducción de la termogénesis y de los
niveles de expresión de genes implicados en la oxidación de ácidos grasos,
así como un aumento en la señalización de insulina hepática (fosforilación
del receptor de insulina y AKT). Resultados similares se obtuvieron en líneas
celulares hepáticas murinas y humanas que sobreexpresan COX-2. Nuestros
datos demuestran que la expresión constitutiva de COX-2 en hepatocitos
protege frente a la RI hepática, la adiposidad e inflamación en ratones hCOX-
2-Tg sometidos a una dieta rica en grasa.
P02r-5
Ethanol by activating the innate immune
receptors TLR4, promotes neuroinflammation,
myelin dysfunctions, synaptic alterations and
epigenetic modifications in adolescent mice with
binge ethanol drinking
Jorge Montesinos Selfa, Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora,
Ana Isabel Gil Tebar, Clara Mar Guarch Pérez, Consuelo Guerri
Sirera
Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES
Adolescence is a brain maturation period from childhood to adulthood.
Plastic and dynamic processes occur in specific brain regions, such as the
prefrontal cortex (PFC) in which overproduction of axons and synapses,
followed by rapid pruning along with ongoing myelination of axons,
enhances neuronal conduction and communication. We demonstrated
that ethanol by activating the innate immune receptors toll-like receptor 4
(TLR4) induces neuroinflammation and brain damage. Considering that the
developmental brain is vulnerable to the effects of ethanol, we investigate
whether intermittent ethanol intoxication promotes TLR4-dependent pro-
inflammatory processes, leading to myelin and synaptic dysfunctions and
epigenetic alterations. For this aim, we used wild-type (WT) and TLR4
deficient (TLR4-/-) adolescent mice exposed intermittently to ethanol (3.0
g/kg) during 2 weeks. The levels of pro-inflammatory mediators as well as
different myelin and synaptic proteins were assessed in the PFC 24h after
the last ethanol administration. Our results demonstrate that binge ethanol
treatment activated TLR4 pathway (MAPKs, p-p65) triggering the up-
regulation of several pro-inflammatory mediators (iNOS, COX-2), cytokines
(IL-1β, TNF-α) and chemokines (MCP1, MIP1α). Ethanol treatment also
decreased myelin protein levels (PLP, CNPase, MAG, MBP, NG-2) and
synaptic-related proteins levels (synapsin, syntaxin, SNAP-25) in PFC of
Granada 2014
WT mice, while no differences were observed in TLR4-/- PFC. Electron
microscopy studies showed that ethanol treatment damages myelin
sheath and alters synaptic structure in WT PFC. Ethanol treatment also
increased HAT activity, the levels of acetylated H3 and H4 and upregulated
the expression of immediate-early-genes related to plasticity and drug
addiction (bdnf, c-fos, egr1, fosb) in a TLR4-dependent manner. These
findings suggest that activation of TLR4 signaling by intermittent ethanol
intoxication during adolescence alters synaptic plasticity, causes myelin
and synaptic derangements and induces epigenetic modifications, that
could be associated to addictive behaviour.
Supported by SAF-2012-33747 and ERAB (EA-13-08).
P02r-6
The innate immune receptors TLR4 participate in
ethanol-induced proteolytic dysfunctions in glial
cells
Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora, Consuelo Guerri Sirera
Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES
Ethanol is a neurotoxic compound and its abuse induces brain damage
and can lead to neurodegeneration. Ethanol triggers inflammatory
processes in glial cells, upregulating cytokines and other inflammatory
mediators through the activation of Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling.
Recent evidence indicates the role of protein degradation pathways in
neurodegeneration and in alcoholic liver disease, but how these processes
affect the brain remains elusive. We have recently demonstrated that
chronic ethanol consumption alters the two major protein degradation
pathways, the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagy-
lysosome pathway (ALP), in mouse brain, and that TLR4 participates in
these proteolytic dysfunctions. With this study, we aim to evaluate the
effect of an acute dose of ethanol (50 mM) on WT and TLR4-/- mice glial
cells at different time points, through the use of techniques such as western
blot, flow cytometry or confocal and electron microscopy. Our results
show that a single dose of ethanol induces an overexpression of several
autophagy markers (ATG12, LC3-II and CTSB). Ethanol also produces an
increase in the number of autophagic vacuoles and lysosomes, which is
accompanied by a basification of the lysosomal pH. These changes in the
ALP could be in part due to a reduction of the phosphorylation levels of
the autophagy inhibitor mTOR. Ethanol also alters the UPS and induces
the formation of the immunoproteasome, by promoting the expression of
several of its inducible subunits (β1i, β5i and PSME1). Interestingly, only
minor changes in the proteolytic pathways were found between control and
ethanol-treated TLR4-/- mice glial cells. Together, these results indicate
that a single dose of ethanol is capable of affecting proteolytic pathways in
the brain in a TLR4-dependent manner. These findings could provide new
insight into the mechanisms underlying ethanol-induced brain damage.
Supported by SAF2012-33747, PNSD, RTA-Network, RD12-0028-007.
P02r-7
Disfunción OXPHOS y diferenciación celular
Laura Llobet1, Eldris Iglesias1, Alba Pesini1, Virginia Borobia1, Sonia
Emperador1, Ester López-Gallardo1, Julio Montoya1, Eduardo Ruiz-
Pesini2
1
Universidad de Zaragoza - CIBERER, Zaragoza, ES, 2Universidad
de Zaragoza - CIBERER - ARAID, Zaragoza, ES
Las líneas celulares transmitocondriales han sido un excelente modelo
para el estudio de las mutaciones patológicas en el mtDNA, ya que
reproducen exactamente el ambiente genómico humano. Sin embargo
presentan algunos inconvenientes como son la aneuploidía (por derivarse
generalmente de líneas celulares tumorales) y la falta de capacidad de
diferenciación. Estos problemas pueden ser soslayados utilizando células
madre adultas, euploides y fácilmente diferenciables. Nosotros hemos
Pósters
estudiado las células madre derivadas del tejido adiposo, su conversión
a adipocito y sus propiedades como célula diferenciada, prestando una
especial atención a los cambios en parámetros mitocondriales. La dificultad
en la preparación de estos modelos consiste en la generación del estado
rho0, carente de mtDNA, previo a la construcción del cíbrido. Mientras
trabajamos en la resolución de este problema, podemos simular diferentes
mutaciones en el mtDNA, preferentemente en los genes para los RNA de
transferencia, mediante el uso de distintos xenobióticos. Concretamente,
hemos elegido el linezolid, un antibiótico de amplio espectro que se une
a la subunidad grande ribosomal y ha demostrado ser un potente inhibidor
de la transcripción mitocondrial. De esta manera, es posible analizar el
efecto de una disfunción en la expresión de genes mitocondriales sobre la
diferenciación celular y su función como célula madura.
Financiación: Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI10/00662 y PI11/01301).
P02m-8 (R02-7)
Potenciación de la capacidad de quemar grasas
del tejido adiposo marrón como terapia contra
la obesidad y la diabetes de tipo 2
María Calderón-Domínguez, Raquel Fucho, Joan Francesc Mir,
Minéia Weber, Anna Orozco, Dolors Serra, Laura Herrero
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Institut de
Biomedicina de la Universitat de Barcelona-IBUB, Universitat de
Barcelona - CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición-
CIBEROBN, Instituto de Salud Carlos III, Barcelona, ES
En el 2009, cinco grupos de investigación independientes identificaron que
el tejido adiposo marrón (TAM), que se pensaba exclusivo de roedores y
neonatos, no sólo estaba presente sino también activo en humanos adultos.
Curiosamente observaron que su actividad disminuía en pacientes obesos y
diabéticos, lo que indica que este tejido participa en la termogénesis inducida,
ya sea por el frío o por la dieta. Esto situó al TAM en el punto de mira, ya
que cualquier estrategia capaz de eliminar el exceso de lípidos de la obesidad
podría ser beneficioso para la salud. Por esta razón nos centramos en la
oxidación de los ácidos grasos (FAO, fatty acid oxidation), y su enzima clave,
la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). En el presente trabajo proponemos
que un aumento de la FAO en el TAM reduciría los niveles de los lípidos y
mejoraría el fenotipo obeso y diabético. Para ello sobrexpresamos en una
línea celular de adipocitos marrones la forma mutante permanentemente
activa de la CPTIA, la CPTIAM, la cual es insensible a su inhibidor
fisiológico, el malonil-CoA. Observamos que los adipocitos marrones que
sobreexpresan la CPT1AM muestran un aumento en la FAO, en la expresión
de la proteína UCP1,y reduce el incremento del contenido de triglicéridos
inducido por el palmitato. Además de recuperar los niveles de marcadores
proinflamatorios y marcadores relacionados con el síndrome metabólico, en
comparación con las células GFP control. En conclusión, hemos conseguido
mejorar el fenotipo obeso y diabético a través del aumento de la FAO en
nuestro modelo celular, con el propósito de dar un nuevo enfoque terapéutico
para el tratamiento de la diabetes inducida por la obesidad.
P02-9
Increased serum- and glucocorticoid-
inducible kinase 1 (SGK1) activity potentiates
mineralocorticoid/NaCl-induced renal but not
cardiac fibrosis
Catalina Sierra Ramos1, Guadalberto Hernández Hernández1,
Eduardo Salido2, Diego Álvarez de la Rosa1
1
Department of Physiology, Centre for Biomedical Research of the
Canary Islands-CIBICAN, University of La Laguna, La Laguna, ES,
2
Centre for Biomedical Research of the Canary Islands-CIBICAN
- Centre for Biomedical Research on Rare Diseases-CIBERER,
University of La Laguna, La Laguna, ES
35
Pósters
The mineralocorticoids aldosterone and deoxycorticosterone acetate
(DOCA) stimulate renal tubular salt reabsorption, increase salt appetite,
induce extracellular volume expansion, and elevate blood pressure.
Mineralocorticoid excess induces deleterious effects on cardio-
renal function, including the development of fibrosis. The effects of
mineralocorticoids on renal tubular Na+ reabsorption and salt appetite
involve the serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1). The
present experiments explored the involvement of excess SGK1 activity
in the development of mineralocorticoid/NaCl-induced cardiac and renal
fibrosis. To this end, transgenic mice (Tg.SGK1), made with a bacterial
artificial chromosome containing the SGK1 gene with a point mutation
rendering the kinase constitutively active, and their wild-type littermates
were uninephrectomized, treated with DOCA and given 1% NaCl in the
drinking water for 6 weeks. The treatment led to a significant increase in
blood pressure in both genotypes, slightly more pronounced in Tg.SGK1
mice. Histology after 6 weeks treatment revealed marked glomerular,
perivascular and tubulointerstitial fibrosis in the kidney cortex, which
was significantly greater in Tg.SGK1 mice. In contrast, treated animals
developed cardiac fibrosis without significant differences between
genotypes. Enhanced SGK1 activity without DOCA/NaCl treatment did
not produce fibrosis. Our results demonstrate that increased SGK1, while
not sufficient to induce fibrosis without added stimuli, plays a decisive role
in tissue-specific mineralocorticoid/NaCl-induced fibrosis.
P02-10 (R02-1)
Una dieta rica en cacao atenúa la resistencia
a la insulina en las ratas ZDF
Isabel Cordero-Herrera1, María Angeles Martín Arribas1, Fernando
Escrivá Pons2, Carmen Alvarez Escolá2, Luis Goya Suárez1, Sonia
Ramos Rivero1
1
Departamento de Metabolismo y Nutrición. Instituto de Ciencia
y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC), Madrid, ES,
2
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Facultad de
Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM). CIBER de
Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES
La resistencia a la insulina es una de las principales características de la
diabetes tipo 2 (1). El cacao presenta ciertos efectos antidiabéticos (2,3),
pero aún no se conoce con exactitud el mecanismo molecular de acción por
el cual ejerce dichas actividades beneficiosas sobre la señalización de la
insulina en el hígado.
El objetivo de este trabajo fue investigar el potencial preventivo de una
dieta rica en cacao sobre la señalización de la insulina en una situación
prediabética en el hígado de las ratas ZDF (14 semanas de vida). La dieta
rica en cacao (10%) mejoró la hiperglucemia y la respuesta al test de
tolerancia a la glucosa, a la vez que disminuyó el peso corporal. Además,
el cacao previno el aumento de la fosforilación en Ser307 y Ser636/639 de
IRS-1 respecto a los animales ZDF que recibían la dieta control, mostrando
valores similares a los de las ratas control (ZLean). De manera similar, los
animales alimentados con la dieta rica en cacao mostraron unos niveles de
p-GSK3, p-GS y glucógeno comparables a los de las ratas ZLean.
Por su parte, los valores de PEPCK, aumentados en las ratas ZDF,
regresaron a niveles control en aquellos animales que recibían la dieta rica
en cacao, mientras que GK y GLUT-2 no parecieron modificarse en ningún
caso. Estos datos sugieren que una dieta rica en cacao podría mejorar la
resistencia a la insulina al prevenir la atenuación de la señalización de la
hormona que se produce en el hígado en la diabetes tipo 2.
Bibliografía
Klover & Mooney: Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 753-8.
Cordero-Herrera et al.: Mol Nutr Food Res 2013, 57: 974-85.
Cordero-Herrera et al.: Food Chem Toxicol 2014, 64: 10-19.
Agradecimientos: AGL2010-17579, CSD2007-00063.
36
XXXVII Congreso SEBBM
P02r-11
Identification of bone morphogenetic protein 9
(BMP9) as a novel fibrogenic factor
José Manuel Muñoz Félix1, Nuria Perretta-Tejedor1, Cristina Cuesta1,
José Miguel López-Novoa1, Sabine Bailly2, Carlos Martínez-Salgado3
1
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto
“Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de
Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto
de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca,
ES, 2Inserm, U1036 - Commissariat a` l’Energie Atomique et
aux Energies Alternatives, Université de Grenoble, Grenoble,
FR,3Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto
“Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de
Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto
de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL,
Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca,
Salamanca, ES
Tubulointerstitial fibrosis, a common endpoint of chronic kidney disease,
is characterized by the presence of myofibroblasts and an excessive
accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins in the tubular
interstitium. Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) is a cytokine
with a relevant contribution to fibrotic development. We have previously
observed an increased expression of the TGF-β type I receptor ALK1 in
fibrotic kidneys after unilateral ureteral obstruction (UUO), and the bone
morphogenetic protein-9 (BMP9) is a strong ligand for ALK1 in endothelial
cells. Thus, we aim to identify the effect of BMP9 on ECM protein
expression and its possible involvement in renal fibrosis development.
We used mouse embryo fibroblasts (MEFs) stimulated with BMP9. We
analyzed collagen I, fibronectin and connective tissue growth factor
(CTGF) expressions; we evaluated expression of phosphorylated Smads
(BMPs induced-Smad1/5/8) and TGF-β1-induced Smad2/3. UUO was
performed in BMP9 deficient mice and their respective controls, and renal
tissue fibrosis was analyzed by Red Sirius and Masson´s trichrome staining.
BMP9 (20 ng/ml) induced an increase in collagen I, fibronectin and CTGF
expression in MEFs, as well as an increase in Smad1/5/8 phosphorylation
–normally induced through ALK1/2/3/6 receptors- and in Smad2/3
phosphorylation –induced by ALK4/5/7 receptors. Inhibition of both groups
of receptors with SB431542 (ALK4/5/7 inhibitor) and dorsomorphin-1
(ALK1/2/3/6 inhibitor) reduced BMP-9-induced ECM protein expression.
Obstructed kidneys from Bmp9-/- mice developed less renal fibrosis than
their respective controls.
Our data suggest that BMP9 regulates renal fibrosis stimulating ECM
protein expression by MEFS, due to an activation of receptors that
phosphorylate Smad1/5/8 and Smad2/3 proteins.
P02r-12
Depleción del DNA mitocondrial (mtDNA) debida
a una mutación en el gen MT-TW
Sonia Emperador1, Ester López-Gallardo1, Cristina Ruiz-Ruiz2, Alba
Pesini2, Maria Dolores Fuentes2, Laura Llobet2, Eldris Iglesias2,
Eduardo Ruiz-Pesini3, Julio Montoya1
1
Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2Universidad de
Zaragoza, Zaragoza, ES, 3ARAID-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES
Mutaciones en genes que codifican para tRNAs mitocondriales son
responsables de causar un número importante de patologías en humanos.
En este trabajo presentamos el caso de un niño con síndrome de Leigh en
el que, mediante secuenciación del mtDNA completo, encontramos una
inserción de una timina en la posición 5537, que corresponde al gen MT-
TW. Esta mutación había sido previamente descrita en otro paciente con
enfermedad mitocondrial.
Para confirmar el efecto funcional de esta mutación, construimos cíbridos
transmitocondriales usando la línea rho0 de carcinoma de pulmón humano
A549. En estos cíbridos observamos una caída en la actividad y cantidad del
complejo respiratorio IV, disminución de la cantidad de ATP mitocondrial
Granada 2014
y ausencia de síntesis mitocondrial de proteínas. De forma más llamativa,
detectamos una pérdida completa del mtDNA. Un hallazgo similar se había
ya descrito en cíbridos NT2 portadores de la m.3243A>G en MT-TL1.
Nuestros resultados sugieren que mutaciones patológicas de genes que
codifican tRNA mitocondriales, en fondos genéticos nucleares particulares,
podrían llevar a depleción del mtDNA. Por lo que quizás se deba secuenciar
estos genes en los síndromes de depleción.
Financiación: ISCIII; FIS (PI10-00662; PI 11-01301); CIBERER.
P02-13
Sistema OXPHOS, nucleótidos de pirimidina,
y la enfermedad de Alzheimer
Alba Pesini1, Eldris Iglesias1, Nuria Garrido2, M. Pilar Bayona-
Bafaluy2, Laura Llobet1, Sonia Emperador1, Ester López-Gallardo1,
Antonio Galarreta2, Julio Montoya1, Eduardo Ruiz Pesini2
1
Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2Universidad de
Zaragoza, Zaragoza, ES
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa
crónica y progresiva, clínicamente caracterizada por la pérdida de memoria
y el declinar cognitivo. Los sellos histopatológicos de la enfermedad
son el acúmulo de placas extracelulares de péptido beta-amiloide, los
ovillos neurofibrilares intracelulares compuestos por la proteína tau
hiperfosforilada, la pérdida de sinapsis y la degeneración neuronal.
Una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) ha sido
implicada en la patogénesis de AD. De hecho, la cadena transportadora
de electrones podría tener un papel relevante en la formación de las
membranas celulares y de las sinapsis entre las neuronas, ya que la cadena
respiratoria participa en la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina,
que son claves en la producción de fosfolípidos, principal compuesto de
todas las membranas.
Para estudiar cómo afectaría la disfunción en el sistema OXPHOS a la
producción de neuritas y diferenciación neuronal, utilizamos la línea
celular de neuroblastoma SK-N-BE(2)C. Cultivamos y diferenciamos esta
línea celular en ausencia o presencia de azida sódica (NaN3) o carbonyl
cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), que disminuirían
o aumentarían, respectivamente, el flujo de electrones a través de la cadena
respiratoria y por lo tanto quizás podrían alterar negativa o positivamente
la síntesis de nucleótidos de pirimidina.
En un primer paso hemos puesto a punto las concentraciones de las drogas
que afectan el consumo de oxígeno, pero no la viabilidad celular.
Financiación: Instituto de Salud Carlos III [FIS-PI 10/00662 y PI
11/01301], Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS), Asociación
de Enfermos de Patología Mitocondrial (AEPMI) y Universidad de
Zaragoza-Banco de Santander (UZ2012-BIO-01).
P02r-14
Efecto estimulador de la leptina sobre
la producción de sialofosfoproteína dentinaria
(DSSP) en la pulpa dental humana
Jenifer Martin Gonzalez1, Antonio Pérez-Pérez2, Flora Sánchez
Jiménez2, Juan José Segura Egea1, Víctor Sánchez Margalet2
1
Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología,
Universidad de Sevilla, sevilla, ES, 2Departamento de Bioquímica,
Biología molecular e Inmunología, Facultad de Medicina,
Universidad de Sevilla, sevilla, ES
Objetivo: La leptina, un mediador de la respuesta inflamatoria, y su receptor
(LEPR) se expresan en la pulpa dental humana. La sialofosfoproteina
dentinaria (DSPP) es una proteína implicada en la odontogénesis y en la
respuesta reparativa dentino-pulpar. Esta investigación tiene como objetivo
describir la localización inmunohistoquímica de LEPR y estudiar el efecto
Pósters
de la leptina sobre la expresión de la sialofosfoproteina dentinaria (DSPP)
por las células pulpares humanas.
Metodología: Veinticinco muestras de pulpa dental humana se obtuvieron
de terceros molares recién extraídos libres de caries y sin restauración. Las
muestras de pulpa fueron procesadas y la mineralización producido por
odontoblastos en respuesta a la leptina se determinó mediante el análisis
de la expresión de DSPP por inmunoblot y por PCR a tiempo real (qRT-
PCR). La localización de LEPR en la pulpa dental fue examinada por
inmunohistoquímica usando anticuerpo monoclonal anti-LEPR humano.
Resultados: La immunoreactividad para los anticuerpos anti-LEPR
se localizó especialmente en el estrato odontoblástico y a nivel de la
predentina. La leptina estimuló de forma dosis-dependiente la expresión de
DSPP en la pulpa humana. El análisis del Western blot de las muestras de
pulpa estimuladas con leptina reveló la presencia de una proteína de peso
molecular aparente ~ 100 kDa, correspondiente al peso molecular estimado
de la DSPP. La expresión del ARNm de la DSPP se confirmó por análisis
de qRT-PCR , y el tamaño de los fragmentos amplificados (280 pares de
bases) fue confirmado por electroforesis en gel de agarosa.
Conclusión: Por primera vez se ha demostrado que los odontoblastos
humanos expresan el receptor de leptina (LEPR) y que la interacción de
la leptina con este receptor estimula la producción por el odontoblasto
de sialofosfoproteína dentinaria (DSPP). Estos hallazgos sugieren
que la leptina juega un papel en la respuesta defensiva pulpar y en la
dentinogénesis.
P02-15 (R02-5)
Obesity-related glycogen mishandling in human
adipose tissue: a key feature of metabolic stress
Sonia Fernández-Veledo1, Victoria Ceperuelo-Mallafre1, Xavier
Duran1, Kelly Roche1, Catalina Núñez-Roa1, Marta Montori-Grau2,
Lourdes Garrido-Sánchez3, Francisco J. Tinahones3, Anna Mª
Gomez-Foix2, Joan Vendrell1
1
Hospital Universitari de Tarragona Joan XXIII - IISPV - URV
- CIBERDEM, Tarragona, ES, 2Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular, Institut de Biomedicina de la Universitat de
Barcelona-IBUB, Universitat de Barcelona - CIBERDEM, Barcelona,
ES, 3Hospital Universitario Virgen de la Victoria - CIBERObn,
Malaga, ES
Background: Obesity leads to excess lipid storage in adipocytes resulting
in the derangement of carbohydrate metabolism. It is well-known that
hepatic glycogen is increased under pathologic circumstances associated
with obesity such as insulin resistance. Though at low levels, studies in
murine models revealed that adipose tissue (AT) might contain glycogen
stores. However, to date the physio(patho)logical role of glycogen
metabolism in human adipose tissue remains unexplored.
Methodology: Glycogen accumulation was studied in human adipocytes
and adipose tissue from lean and obese patients by different methodological
approaches (PAS, immunofluorescence and TEM). PTG, the only glycogen-
associated regulatory subunit (PP1-GTS) reported in murine adipocytes,
was overexpressed by adenoviral transfection in human adipocytes to
explore the metabolic effects of enforced glycogen deposition. Glycogen
metabolism gene expression was analyzed in subcutaneous (SAT) and
visceral (VAT) AT from lean and obese subjects in two independent cohorts.
Results: Hypoxia, which has been related to obesity-related AT dysfunction,
promotes glycogen accumulation in human adipocytes. Enforced glycogen
deposition by PTG adenoviral overexpression, modified adipokine secretion
and caused insulin resistance in human adipocytes. Human myocytes
cultured with Ad-PTG adipocyte conditioned media also shown a decrease
in insulin responsiveness. Clinical studies in two human independent
cohorts revealed that obesity is associated with changes in AT glycogen
metabolism gene expression being PPP1R3E the most predominant PP1-
GTS isoform in human fat depots. An increased level of glycogen synthase
protein expression that correlates with enhanced glycogen deposition was
detected in SAT from obese patients.
37
Pósters
Conclusions: Increased glycogen deposition in AT in obesity modifies the
endocrine function of human adipocytes and might contribute to obesity-
related comorbidities.
P02-16
Influencia de xenobióticos ambientales
en la neuropatía óptica hereditaria de Leber
Ester Lopez Gallardo1, Luis Diez2, Sonia Emperador1, Iñigo
Martinez-Romero2, Laura Llobet2, Eldris Iglesias2, Alba Pesini2,
Eduardo Ruiz-Pesini2, Julio Montoya2
1
Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras
(CIBERER), Zaragoza, ES, 2Dto. Bioquímica y Biología Molecular-
Facultad de Veterinaria-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES
El genoma mitocondrial contiene 37 genes, todos ellos esenciales para el
buen funcionamiento del sistema de fosforilación oxidativa. Mutaciones
en estos genes pueden causan un déficit de energía y causar enfermedades
mitocondriales. Los efectos y la severidad de las enfermedades
mitocondriales pueden variar enormemente. Las mutaciones patológicas
son usualmente heteroplásmicas mientras que los polimorfismos neutros
son homoplásmicos. Sin embargo, hay algunas excepciones, por ejemplo,
las mutaciones que causan LHON (Neuropatía Óptica Hereditaria de
Leber) son homoplásmicas en la mayoría de los casos. Esta enfermedad
muestra una penetrancia incompleta, por ello, es importante investigar qué
factores genéticos y/o ambientales modulan la expresión del fenotipo. En
el presente trabajo hemos usado el modelo de cíbridos transmitocondriales
portadores de una mutación causante de LHON (3460/ND1) para estudiar
la combinación de dicha mutación con varias xenobióticos (factores
ambientales) y qué importancia puede tener en el desencadenamiento
de la patología del paciente. Los resultados obtenidos muestran que
dicha mutación en presencia de los xenobióticos analizados (rotenona,
capsaicina, anonacina) muestra diferencias en la función mitocondrial.
Financiación: Instituto de Salud Carlos III-FIS (PI10-00662; PI 11-
02301), Fundación ARAID-Programa de Apoyo a la I+D+I para jóvenes
investigadores 2010, y Centro de Investigación en Red en Enfermedades
raras (CIBERER). CIBERER es una iniciativa de ISCIII.
P02-17
AD0157, a pyrrolidinedione fungal metabolite,
inhibits angiogenesis by targeting the Akt
signaling pathway
Melissa García-Caballero1, Librada Cañedo2, Antonio Fernández-
Medarde2, Miguel Ángel Medina Torres3, Ana R. Quesada3
1
Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de
Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA
(Biomedical Research Institute of Málaga), Málaga, ES, 2Biomar
Microbial Technologies, Parque Tecnológico de León, Armunia
(León), ES, 3Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento
de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and
IBIMA (Biomedical Research Institute of Málaga). Unidad 741,
CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES
In the course of a screening program for the inhibitors of angiogenesis
from marine sources, AD0157, a pyrrolidinedione fungal metabolite,
was selected for its angiosupressive properties. AD0157 inhibited the
growth of endothelial and tumor cells in culture in the micromolar range.
Our results show that subtoxic doses of this compound inhibit certain
functions of endothelial cells, namely, differentiation, migration and
proteolytic capability. Inhibition of the mentioned essential steps of in vitro
angiogenesis is in agreement with the observed antiangiogenic activity,
substantiated by using two in vivo angiogenesis models, the chorioallantoic
membrane and the zebrafish embryo neovascularization assays, and by the
ex vivo mouse aortic ring assay. Our data indicate that AD0157 induces
38
XXXVII Congreso SEBBM
apoptosis in endothelial cells through chromatin condensation, DNA
fragmentation, increases in the subG1 peak and caspase activation. The
data shown here altogether indicate for the first time that AD0157 displays
antiangiogenic effects, both in vitro and in vivo, that are exerted partly by
targeting the Akt signaling pathway in activated endothelial cells. The fact
that these effects are carried out at lower concentrations than those required
for other inhibitors of angiogenesis makes AD0157 a new promising
drug candidate for further evaluation in the treatment of cancer and other
angiogenesis-related pathologies.
Our experimental work is supported by grant P12-CTS-1507 (Andalusian
Government and FEDER) and funds from group BIO-267 (Andalusian
Government). The “CIBER de Enfermedades Raras” is an initiative from
the ISCIII (Spain). This communication has the support of a travel grant
“Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía
Tech”.
P02r-18
Regulación de la expresión génica por Wnt3A
en fibroblastos de colon humano
Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González-Sancho
Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES
Las vías de señalización por factores Wnt son esenciales en muchos
procesos del desarrollo humano, y también para mantener la homeostasis
del tejido adulto. La vía Wnt/β-catenina o canónica es la mejor conocida,
aunque también existen vías no canónicas, independientes de β-catenina.
En el colon, la vía canónica tiene una importancia fundamental y aparece
desregulada en la práctica totalidad de cánceres colorrectales. Los factores
Wnt son secretados por los fibroblastos pericriptales y actúan sobre las
células epiteliales de la mucosa colónica. Sin embargo, no se sabe si estos
factores actúan también de forma autocrina sobre los propios fibroblastos
que los secretan, alterando su patrón de expresión génica. Para intentar
resolver esta incógnita, nuestro grupo se propuso estudiar el efecto de
Wnt3A, que activa la vía canónica, sobre la línea de fibroblastos primarios
de colon CCD18-Co. Para ello utilizamos una técnica de secuenciación
masiva de alta resolución (RNAseq), seguida de un análisis bioinformático.
El análisis estadístico nos proporcionó una lista de genes regulados
diferencialmente, de los que una muestra ha sido validada mediante qPCR
y western blot. Dos de los genes validados se regulan a tiempos cortos,
lo que sugiere un posible mecanismo transcripcional directo. También
aparecen genes que codifican proteínas de la propia vía Wnt/β-catenina, o
muy relacionadas con ella. De esta lista se han seleccionado varios genes
que serán sometidos a un estudio más profundo con el fin de analizar el
mecanismo de su regulación por factores Wnt y el efecto de sus cambios
de expresión sobre el fenotipo, proliferación o capacidad tumorogénica de
los fibroblastos de colon.
P02-19
Cocoa enriched-diet attenuates loss of beta
cell mass and function in Zucker diabetic rats
by preventing beta cell oxidative stress and
apoptosis
Elisa Fernández-Millán1, Isabel Cordero-Herrera2, Sonia Ramos2,
Fernando Escrivá3, Carmen Alvarez3, Luis Goya2, María Angeles
Martín3
1
CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM),
Madrid, ES, 2Dpto. de Metab. y Nutr., ICTAN (CSIC), Madrid,
ES, 3Dpto. Bioq. y Biol. Mol. II, Fac. Farmacia, UCM - CIBER de
Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES
Oxidative stress has been largely implicated in the pathogenesis of
pancreatic beta cell failure observed in type 2 diabetes (T2D). Consequently,
identification of natural antioxidant compounds that enhance or preserve
Granada 2014
islet beta cell mass and function is considered an emerging strategy to
prevent or treat T2D [1]. We have recently showed that flavanol epicatechin
and microbial-derived flavonoid metabolites from cocoa may have anti-
diabetic potential by promoting survival and function of pancreatic beta
cells in vitro [2]. However, it is unknown whether this effect can be
achieved in vivo. Therefore, in this work we investigated the effect of a
cocoa-rich diet preventing β-cell deterioration in an animal model of T2D
and the mechanisms involved.
Male Zucker diabetic (ZDF) rats were fed control or 10% cocoa enriched
diets in the pre-diabetic state (from 6 to 14 weeks of life) and Zucker lean
(ZL) rats were used as control. Glucose tolerance test (GTT), beta cell
mass, beta cell apoptosis and pancreatic markers of apoptosis and oxidative
stress were evaluated. Animals fed with cocoa rich diet improved fasting
hyperglycemia, hyperinsulinemia and GTT. Besides, histopathological
study of the pancreas of these animals indicated that cocoa feeding
preserved beta cell mass and prevented beta cell apoptosis. Finally, we
showed that cocoa diet enlarged the pancreatic concentration of enzymatic
and non-enzymatic endogenous antioxidant defences preventing thus
oxidative stress in ZDF rats.
These findings provide the first in vivo evidence that a cocoa-rich diet may
delay the development of T2D in the ZDF rat by preventing pancreatic
oxidative stress and beta cell apoptosis. Therefore, cocoa flavonoids
could be considered as candidates to ameliorate hyperglycemia and delay
deterioration of beta cell mass and function in T2D.
References
[1] Robertson, RP. Theraphy Discov Med 9:132-137 (2010)
[2] Fernández-Millán et al. Food Chem Toxicol 66:245-253 (2014)
Acknowledgments: Grants AGL2010–17579, CSD2007-00063, BFU2011-
25420 from Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) and
CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM,
ISCIII) Spain.
P02r-20
DICKKOPF-1 (DKK-1) reduce el potencial
tumorogénico de células de sarcoma de Ewing
Lorena Paule, Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González-
Sancho
Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES
El sarcoma de Ewing es la segunda causa de cáncer de hueso en niños
y adultos jóvenes. Se caracteriza por la presencia de translocaciones
cromosómicas, que en aproximadamente el 90% de los casos ocurren entre
los cromosomas 11 y 22 y generan la proteína de fusión EWS/FLI1, que
es un factor de transcripción aberrante con propiedades oncogénicas. Los
factores Wnt activan, entre otras, la vía de señalización Wnt/β-catenina que
se encuentra desregulada en numerosos cánceres humanos. Nuestro grupo
ha demostrado previamente que esta vía está constitutivamente inhibida en
sarcoma de Ewing debido a la acción de EWS/FLI1. Asimismo, la expresión
de DICKKOPF-1 (DKK-1), un inhibidor extracelular de la vía Wnt/β-
catenina y a la vez gen diana de la misma, es inhibida transcripcionalmente
por EWS/FLI1. En este trabajo hemos reexpresado DKK-1 en cuatro
líneas celulares de sarcoma de Ewing con el fin de determinar la
relevancia funcional de su silenciamiento en esta neoplasia. Experimentos
de proliferación y supervivencia usando MTS no han mostrado un
efecto significativo de DKK-1 sobre el crecimiento y la sensibilidad a
quimioterápicos (vincristina y doxorubicina, habituales en el tratamiento
de este tumor) de las líneas A673, TC-71, A4573 y TTC-466 de sarcoma
de Ewing. Por el contrario, experimentos en ratones inmunodeprimidos
demostraron que la presencia de DKK-1 ralentiza el crecimiento de
tumores generados por células A673 y TC-71. En consecuencia, para
intentar determinar los genes responsables de este efecto antitumoral de
DKK-1 hemos realizado un estudio transcriptómico, mediante RNAseq,
que estamos analizando en la actualidad y que esperamos contribuya a
esclarecer el mecanismo de acción de este supresor tumoral.
Pósters
P02-21
Las células madre neurales (hNSC) un modelo
para el estudio del papel de los polimorfismos
mitocondriales en la enfermedad de Parkinson
Eldris Iglesias, Laura Llobet, Alba Pesini, Sonia Emperador, Ester
López-Gallardo, Julio Montoya, Eduardo Ruiz-Pesini
Universidad de Zaragoza-CIBERER, Zaragoza, ES
La enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa
causada por la destrucción de las neuronas dopaminérgicas. Muchos
factores se han relacionado con esta enfermedad, tales como mutaciones
en genes nucleares (nDNA), algunos de los cuales están implicados en
la replicación y expresión del DNA mitocondrial (mtDNA), mutaciones
directamente en el mtDNA y, finalmente, la acción de diversos xenobióticos
que causan la disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS)
muchos de cuyos componentes están codificados en el mtDNA. Por lo
tanto, el mtDNA parece jugar un papel importante en la PD.
El desarrollo de un modelo de células neuronales dopaminérgicas estable
y fiable es especialmente necesario para el estudio de la patogénesis de
esta enfermedad y el desarrollo de estrategias terapéuticas. Las células
madre neurales (hNSC) constituyen células euploides con potencial para
diferenciarse en neuronas dopaminérgicas. En este trabajo presentamos la
caracterización genética de genes nucleares y mitocondriales asociados a
PD y los cambios genéticos moleculares y bioquímicos que se producen
tras la diferenciación a neuronas, en particular en relación al sistema
OXPHOS.
Financiación: ISCIII; FIS 10-00662, 11-01301; CIBERER.
P02r-22
Role of mitochondria ROS generation in ethanol-
induced TLR4/NLRP3 inflammasome activation
and cell death in astroglial cells
Silvia Alfonso-Loeches, Juan Uneña, M Jose Morillo, Jorge Oliver-de
la Cruz, Consuelo Guerri Sirera
Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES
Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) are innate
immunity sensors that provide an early/effective response to pathogenic
or injury conditions. We have reported that ethanol-induced TLR4
activation triggers signaling inflammatory responses in glial cells, causing
neuroinflammation and brain damage. However, it is uncertain if ethanol
is able to activate NLRs /inflammasome in astroglial cells, which is the
mechanism of activation, and whether there is crosstalk between both
immune sensors in glial cells. Here we show that chronic ethanol treatment
increases the co-localization of caspase-1 with GFAP+ cells, and up-
regulates IL-1β and IL-18 in the frontal medial cortex in WT, but not in
TLR4 knock-out mice. We further show that cultured cortical astrocytes
expressed several inflammasomes (NLRP3, AIM2, NLRP1 and IPAF),
although NLRP3 mRNA is the predominant form. Ethanol, as ATP and
LPS treatments, up-regulates NLRP3 expression, and causes caspase-1
cleavage and the release of IL-1β and IL-18 in astrocytes supernatant.
Ethanol-induced NLRP3/caspase-1 activation is mediated by mitochondrial
(m) ROS generation because when using a specific mitochondria ROS
scavenger, the mito-TEMPO (500 mM) or NLRP3 blocking peptide (4mg/
ml) or a specific caspase-1 inhibitor, Z-YVAD-FMK (10 mM), abrogates
mROS release and reduces the up-regulation of IL-1β and IL-18 induced
by ethanol or LPS or ATP. Confocal microscopy studies further confirm
that ethanol, ATP or LPS promotes NLRP3/caspase-1 complex recruitment
within the mitochondria to promote cell death by caspase-1-mediated
pyroptosis, which accounts for ≈ 73 % of total cell death (≈22%) and the
remaining (≈25%) die by caspase-3-dependent apoptosis. Suppression of
the TLR4 function abrogates most ethanol effects on NLRP3 activation
and reduces cell death. These findings suggest that NLRP3 participates,
39
Pósters
in ethanol-induced neuroinflammation and highlight the NLRP3/TLR4
crosstalk in the neuropathological processes associated with alcohol abuse.
Supported by SAF2012-33747; RED-RTA, ERAB, EA 13 08.
P02r-23
Role of the mineralocorticoid receptor in mouse
skin development
Julia Boix Tarín, Elena Carceller Zazo, Lisa Sevilla, Paloma Pérez
Sánchez
Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES
The mineralocorticoid receptor (MR) is a transcription factor that plays a
key role in ion and water homeostasis. Structurally and functionally it has
a high similarity with the glucocorticoid (GC) receptor (GR). Both MR and
GR are steroid ligand-dependent intracellular receptors that belong to the
nuclear hormone receptor superfamily.
MR can bind the natural ligand aldosterone and GCs with similar affinities.
Given that endogenous GC plasma levels exceed those of aldosterone by
100-fold, one mechanism preventing continuous MR occupation by GCs
is the enzyme 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11βHSD2).
11βHSD2 converts active GCs into inactive metabolites, unable to bind
MR, thus favoring the Aldosterone-MR signaling pathway.
It is known that GCs exert a critical role in skin function through GR.
However, no much is known regarding MR in skin biology. Previous work
demonstrated that the skin phenotype of mice overexpressing either MR or
GR in epidermal keratinocytes was highly similar. Both transgenic mouse
models featured atrophic skin, a reduced number of hair follicles, and
impaired epidermal maturation, suggesting that MR may play a role in skin
development, analogously to GR.
We have analyzed MR expression during mouse skin development at
the mRNA and protein level. Our data showed a transient peak of MR
expression around embryonic (E) day 16.5 (E16.5), which decreased
thereafter. Since epidermal barrier formation starts at E16.5, the observed
peak suggested a role for MR in this process.
To evaluate the consequences of MR inactivation in developing skin, we
generated MR knock-out mice using a strategy based upon generalized
Cre-mediated recombination of MRloxP/loxP mice. We examined MR+/+,
MR+/- and MR-/- mouse skin at different embryonic and early postnatal
stages. Histopathological analysis of skin samples revealed no major
defects of MR-/- mice but rather subtle differences in the expression of
keratinocyte-specific markers. Collectively, our findings indicate that i)
MR is expressed at relatively low levels during normal skin development,
ii) its constitutive ablation does not have a major impact for skin function
at the perinatal age, and iii) GR may functionally compensate for MR loss
during mouse skin development.
P02r-24
Effects of corticosteroids in keratinocytes in vivo
and in vitro
Elena Carceller Zazo, Julia Boix Tarín, Lisa Sevilla, Paloma Pérez
Sánchez
Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES
Synthetic glucocorticoids (GCs) are effectively and largely used in therapy
for skin inflammatory diseases, however, chronic treatments or high doses
produce common undesirable side effects, such as skin atrophy.
The biological and therapeutical effects of endogenous and synthetic
GCs are mediated by binding to the glucocorticoid receptor (GR), a
ligand-dependent transcription factor of the nuclear hormone receptor
superfamily. The mineralocorticoid receptor (MR) also belongs to this
superfamily and can bind both mineralocorticoids and GCs with similar
affinities. GR and MR regulate the gene expression through binding to
identical DNA sequences located at regulatory regions of their target genes,
making difficult to discriminate the specific actions of each receptor.
40
XXXVII Congreso SEBBM
The aim of this study was to analyze the effects of GR and MR agonists in
keratinocytes by using in vitro and in vivo approaches.
Cultured keratinocytes were treated with the synthetic GC analog
dexamethasone (Dex) and the natural mineralocorticoid aldosterone
(Aldo), individually or combined, to evaluate their effects on gene
expression. The anti-inflammatory gene Tsc22d3/Gilz, a known GR- and
MR-target in other cell types, was up-regulated to a similar extent by each
ligand but the combined treatment showed no additive effects.
We also analyzed the effects of Dex, Aldo or Dex plus Aldo after topical
application to adult mouse dorsal skin for one week. Skin samples
were analyzed by histopathology by hematoxilin/eosin staining and
immunohistochemistry using specific epidermal markers. Whereas Dex
treatment in mice resulted in epidermal thinning, as previously described,
Aldo elicited no major effects. However, combined Dex plus Aldo treatment
partially counteracted the Dex-induced epidermal hypoplasia. Since these
approaches do not clarify which receptor is mediating Dex or Aldo effects,
and to unequivocally elucidate the role of each of these transcription factors
on keratinocyte function, we have performed experiments using GR- and
MR- keratinocyte-specific knock-out mice and cell lines.
P02-25
Generación de knock-outs de FKTN y FKRP
en la línea muscular C2C12 de ratón mediante
la tecnología “TALEN” para el estudio de
distroglicanopatías
Marcos Rubio Fernández1, Madalina Raducu1, Miriam Aza
Carmona1, Cristina Susín Lara1, Lourdes Yuste Pérez1, Laura
Rodríguez Alonso1, José Martín Nieto2, Jesús Cruces Pinto1
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas
UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, 2Departamento de Fisiología,
Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de
Alicante, Alicante, ES
Mutaciones en los genes FKTN (fukutin) y FKRP (fukutin-related protein),
que codifican dos proteínas muy relacionadas, son causantes de un
conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo denominadas
actualmente como distrofias musculares-distroglicanopatías (MDDG, de
sus siglas en inglés). La falta de función de estas proteínas conduce a la
hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-DG). Esta proteína sirve de
anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes órganos y
tejidos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-DG sufre una importante
y masiva O-glicosilación postraduccional en residuos de serina/treonina
de su conocido “dominio mucina”, generando diferentes tipos de cadenas
tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetil-galactosaminilglicanos. A
través de estos residuos se realiza la interacción con proteínas de la MEC
como laminina, agrina y perlecano, así como con las proteínas sinápticas
neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta la fecha, la función de estas
proteínas FKTN y FKRP en la O-glicosilación del α-DG sigue siendo
desconocida. En un intento de elucidar sus funciones, hemos generado
una serie de mutantes knock-out (KO), tanto para FKTN como para FKRP
en la línea celular C2C12 de mioblastos de ratón, utilizando la tecnología
“TALEN” (transcription activator-like effector endonuclease). Un número
significativo de estos mutantes KO son defectivos en la O-glicosilación del
α-DG, tras ser analizados mediante western blotting y citometría de flujo,
utilizando anticuerpos contra las cadenas glicosílicas del α-DG. El objetivo
final de este estudio es analizar mediante glicómica comparada los residuos
glicosílicos afectados en el α-DG por la falta de función de ambas proteínas
frente a la línea celular C2C12 silvestre.
Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI12/0157.
Granada 2014
P02-26
Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin:
pore formation and resealing of injured plasma
membrane by endocytosis of the pore
David González Bullón, Asier Etxaniz Iriondo, Kepa Belloso Uribe, Aitor
Etxebarria Gallego, César Martín Plágaro, Helena Ostolaza Etxabe
Departamento Bioquímica y Biología Molecular, Unidad de Biofísica
(Centro Mixto, CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES
The adenylate cyclase toxin (ACT), the causative agent of whooping
cough in humans, is an essential virulence factor secreted by the Gram
negative bacteria Bordetella pertussis. The toxin suppresses the bactericidal
activities of phagocytic cells due to its capacity to rapidly convert cellular
ATP into cAMP. This conversion is achieved by the translocation into the
target cell cytosol of the toxin N-terminal catalytic domain (AC domain, ≈
aminoacids 1-400). Meanwhile, the toxin C-terminal domain (RTX domain,
approximately the last 1300 residues), which mediates toxin binding to the
target cell membrane, remains in the cell membrane forming cation-selective
pores, which permeabilize cell membranes perturbing ion homeostasis
and inducing both haemolysis and cytolysis of nucleated cells. Here we
provide evidence that ACT pores formed by the toxin C-terminal portion are
internalized from the cell membrane. In sum, our findings uncover a linkage
between cell permeabilisation by ACT and how cells protect themselves
from a microbial toxin insult and may survive, and provide new valuable
insights to the current understanding of ACT action on target cells.
P02r-28
Asociación de polimorfismos de VAV2 y VAV3 con
factores de riesgo cardiovascular inducidos por
hipertensión y diabetes
Nuria Perretta Tejedor1, Cristina Cuesta2, José Manuel Muñoz Félix2,
Luis García-Ortiz3, Manuel A Gómez Marcos3, José Ignacio Recio
Rodríguez3, Rogelio González-Sarmiento4, José Miguel López-
Novoa2, Carlos Martínez-Salgado5
1
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina
Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad de Salamanca,
Salamanca, ES, 2Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular,
Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad
de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca,
Salamanca, ES, 3IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca
- Unidad de Investigación, Centro de Salud La Alamedilla ,
Salamanca, ES, 4Centro de Investigación del Cáncer, Universidad
de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca ,
Salamanca, ES, 5Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular,
Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad
de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca -
IECSCYL, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de
Salamanca, Salamanca, ES
Hipertensión, diabetes y obesidad son factores de riesgo para el desarrollo
de enfermedades cardiovasculares, una de las principales causas de muerte
en el mundo. Hay pocos datos sobre la influencia de polimorfismos
genéticos en estas enfermedades. Los factores intercambiadores de guanina
VAV2 y VAV3 juegan un papel importante en la homeostasis vascular in
vivo. Por ello, hemos evaluado la asociación de los polimorfismos de VAV2
(rs 602990) y VAV3 (rs7528153) con la predisposición al riesgo y daño
cardiovascular inducido por hipertensión y diabetes.
Hemos extraído DNA de sangre periférica de 384 pacientes (152 hipertensos,
66 diabéticos y 166 no diabéticos no hipertensos). Los polimorfismos
fueron detectados mediante qPCR con sondas TaqMan. Hemos analizado
en esos mismos pacientes la presión sistólica y diastólica, presión de pulso,
glucemia basal, disfunción endotelial, retinopatía, hipertrofia ventricular
izquierda y riesgo cardiovascular.
El genotipo CT del polimorfismo de VAV3 Sher298Thr está asociado con
un riesgo reducido de desarrollar hipertensión, diabetes, obesidad y daño
Pósters
cardiovascular (p=0.011, odds ratio (OR)=0.495, intervalo 0.313-0.784),
y el genotipo TT de este polimorfismo está asociado con un incremento de
la glucemia basal en pacientes no diabéticos y no fumadores (p=0.043,
OR=3.700, intervalo 1.266-10.815). El polimorfismo de VAV2 Val584Met
está asociado con un aumento de la presión de pulso en pacientes fumadores
portadores del alelo TT (p=0.016, OR=5.538, intervalo 1.022-30.019) y con un
riesgo reducido de desarrollar síndrome metabólico en pacientes no fumadores
portadores del alelo TT (p=0.05, OR=0,408, intervalo 0.180-0.927).
Nuestros resultados sugieren que el genotipo CT del polimorfismo de
VAV3 Sher298Thr está relacionado con un riesgo reducido de desarrollar
hipertensión, diabetes, obesidad y daño cardiovascular. Por otra parte,
variantes polimórficas de los genes VAV2 y VAV3 parecen estar asociados
con la presencia o ausencia de factores de riesgo cardiovascular inducidos
por hipertensión o diabetes.
P02-29
Estudio de expresión de marcadores proteicos de
la EMT en líneas celulares de cáncer colorrectal
Sara Fernández Mojón1, Rubén López-Cortés1, Laura Muinelo
Romay2, Emilio Gil Martín1, Almudena Fernández Briera1
1
Grupo BB1, Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología,
Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2Grupo de Oncología Médica
Traslacional, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de
Compostela, Santiago de Compostela, ES
La pérdida del fenotipo epitelial y la adquisición del mesenquimal, proceso
conocido como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT), es un evento
que lidera la progresión de los tumores epiteliales, otorgando a las células
tumorales un aumento de movilidad y potencial invasivo. Son muchos
los marcadores moleculares involucrados en este proceso, de entre los
cuales, nuestro interés radica en los productos de la acción de la enzima
α(1,6)fucosiltransferasa [α(1,6)FT], por su presumible implicación en la
malignización del cáncer colorrectal (CCR).
En este trabajo nos hemos propuesto monitorizar la expresión de varios
marcadores proteicos de la EMT en un panel de líneas celulares de CCR;
asimismo, hemos estudiado el efecto del silenciamiento del gen de la α(1,6)
FT (FUT8) en las líneas isogénicas Sw480 y Sw620. Una vez testado el éxito
del silenciamiento por RT-qPCR, se ha procedido a valorar la expresión
mediante western blot de los marcadores de la EMT seleccionados.
Nuestra hipótesis reside en que la enzima α(1,6)FT modula la expresión
y grado de funcionalidad de ciertas proteínas de membrana vinculadas
a la EMT y, por ende, la progresión maligna de los tumores. Las líneas
Sw480 y Sw620 son un buen sistema modelo para testar esta hipótesis por
su origen respectivo en un tumor primario y una lesión metastásica del
mismo paciente.
Los resultados preliminares apuntan a que no parece haber una correlación
entre estos clásicos biomarcadores de la EMT y el grado de malignidad
celular, lo que podría corresponderse con la posible heterogeneidad
genotípica y mecanística de la carcinogénesis colorrectal.
Estudio financiado mediante el Contrato-Programa CN 2011/024, Xunta
de Galicia.
P02-30
Análisis de posibles proteínas que interaccionan
con la fukutina
Marcos Rubio Fernández1, Sandra Gutiérrez Vindel1, Cristina Susín
Lara1, Lourdes Yuste Pérez1, José Martín Nieto2, Jesús Cruces
Pinto1
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas
UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, 2Departamento de Fisiología,
Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de
Alicante, Alicante, ES
41
Pósters
La fukutina, una proteína codificada por el gen FKTN, se ha relacionado
con un conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo
denominadas actualmente como distrofias musculares-distroglicanopatías
(MDDG, de sus siglas en inglés). La falta de función de la fukutina conduce
a la hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-DG). Esta proteína actúa
como anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes
tejidos y órganos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-DG sufre
importantes y masivas O-glicosilaciones postraduccionales en residuos de
serinas/treoninas de su conocido “dominio mucina”, generando diferentes
tipos de cadenas tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetil-
galactosaminilglicanos. A través de estos residuos se realiza la interacción
con proteínas de la MEC como laminina, agrina y perlecano, así como
con las proteínas sinápticas neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta
la fecha, la función de la fukutina en la O-glicosilación del α-DG es
desconocida.
En un intento de elucidar su función, en este trabajo hemos procedido
a sobreexpresar esta proteína en la línea celular humana HEK293T,
purificarla y analizar mediante espectrometría de masas las proteínas
que coeluyen con ella. Hemos seleccionado una serie de proteínas
potencialmente interesantes, centrándonos preferentemente el estudio de la
proteína CMAS (citidina monofosfo-N-ácido acetilneuramínico sintetasa).
Esta enzima cataliza la síntesis de CMP-Neu5Ac, un sustrato utilizado por
diferentes si aliltransferasas para la adición de ácido siálico, el cual está
presente en muchas de las cadenas de O-glicanos del α-DG.
Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI12/0157.
P02-31 (R02-4)
Calpain-cathepsin crosstalk leads to
photoreceptor cell death in an animal model of
retinitis pigmentosa
Alberto M. Hernández-Pinto1, Natalia Rodríguez-Muela2, Lucía
García Ledo1, Patricia Boya1, Enrique J. de la Rosa1
1
Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES, 2Harvard
Department of Stem Cell & Regenerative Biology, Boston, US
Retinitis pigmentosa (RP) comprises a large group of inherited retinal
dystrophies that are clinically similar but genetically heterogeneous. At the
cellular level, loss of photoreceptor cells is frequently found in association
with the disease progression, and causes visual decline and blindness. The
cellular changes leading to photoreceptor cell death in the retina of animal
models, as well as of RP patients, are not well characterized. In this work,
we have analyzed the order of events leading to photoreceptor death in the
rd10 mouse, that carries a spontaneous mutation in the Pde6b gene coding
a misfunctional rod-specific cGMP phosphodiesterase. As a consequence,
intracellular cGMP levels are increased, inducing a sustained calcium
influx through the cGMP-gated channels.
In this study, we have measured the role of calcium influx in the activation
of caspases, calpains, and cathepsin throughout the neurodegenerative
process by flow cytometry, confocal microscopy and enzymatic assays. To
determine the role of calcium and cGMP in the photoreceptor death, we
have used a calcium ionophore (A23187) and a PDE6 inhibitor (zaprinast)
to simulate the rd10 phenotype in C57bl/6 mice (WT) retinal explants.
Rd10 retinas showed an early increase in the calcium levels followed by
an over-activation of type 2-calpains without changes in the levels of its
endogenous inhibitor calpastatin. Subsequently, exogenous activation of
cathepsin B and Lysosomal DNAse was detected in the retinas, suggesting
an impairment of the lysosomal system prior to cell death, measured
by TUNEL staining. Retinas treated with Zaprinast or A23187 partially
or totally mimicked this calcium-calpain-cathepsin pattern. Inhibition
of calpains or cathepsins in specific stages of the degenerative process
clearly rescued photoreceptors both in vitro andin vivo. Throughout all
this process, caspases remained inactive, suggesting an alternative non-
apoptotic pathway to cell death in this model of RP.
42
XXXVII Congreso SEBBM
P02-32
Desmosomal-plaque related genes and non-
small-cell lung cancer: desciphering other
cellular functions
Joel Martín Padrón1, Laura Boyero Corral2, Miriam Yagüe Capilla2,
Pedro Medina Vico2, Mª Esther Fárez Vidal3
1
University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular
Biology III - Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO,
Granada, ES, 2University of Granada, Departement of Biochemistry
and Molecular Biology I - Centre for Genomics and Oncological
Research-GENYO, Granada, ES, 3University of Granada, Departement
of Biochemistry and Molecular Biology III, Granada, ES
Despite advances in early detection and standard treatment, Non-Small-
Cell Lung Cancer (NSCLC) is often diagnosed at an advanced stage and
carries a poor prognosis. Greater knowledge of the molecular origins and
progression of lung cancer may lead to improvements in the treatment and
prevention of the disease.
There is considerable evidence for the importance of desmosomes and their
constituents in cancer. A role has been proposed for these adhesion genes
in susceptibility to cancer and metastasis, and there is increasing evidence
that the modulation of desmosomes is an important step in the initiation
and invasiveness of human malignancies.
In addition to the well-known structural role of desmosome genes,
evidences such as their dual subcellular localization, the interaction with
single-stranded DNA and translation initiation factors, etc. suggest there is
a poorly understood role of these proteins in signaling pathways.
PKP1 is up-regulated in primary Squamous-cell lung cancer (SCC) tissues
suggesting a putative contribution in tumorigenesis. In order to gain
greater insight into the multifuntional role of some desmosomal proteins
in NSCLC tumours, we have investigated transient inhibition of the PKP1
desmosomal plaque protein in several SCC lines of lung cancer in order
to unveil role of desmosomal-plaque proteins in NSCLC carcinogenesis.
PKP1 knockdown suppressed proliferation, produced cell cycle arrest and
an increment in apoptosis. Evidence suggests potential pro-oncogenic
functions of PKP1 desmosomal-plaque protein, probably due to an
unknown regulatory role in the nucleus, where it has also been found.
P02-33
Perfil de MicroRNA en respuesta al tratamiento
con doxorubicina en cáncer de mama
Eduardo Tormo1, Begoña Pineda1, Eva Serna2, Sandra Ballester1,
Octavio Burgués3, Ana Lluch4, Pilar Eroles1
1
Instituto de investigación INCLIVA, Valencia, ES, 2Unidad Central
de Investigación, Universidad de Valencia-INCLIVA, Valencia, ES,
3
Departamento de Patología, Hospital Clínico Universitario de
Valencia, Valencia, ES, 4Departamento de Hematología y Oncología,
Hospital Clínico Universitario de Valencia, Valencia, ES
Antecedentes: El tratamiento con quimioterapia es la norma en los
cánceres de mama triple negativo (CMTN), un subgrupo de cáncer que
carece de una diana específica. Se han observado claramente dos tipos de
respuesta: respuesta patológica completa o recaída en los tres primeros
años tras el tratamiento. Sin embargo, los mecanismos que conducen a
estas respuestas, así como los marcadores que permitan la identificación y
la diferenciación de estos grupos antes del tratamiento son desconocidos.
Por otra parte, existen evidencias de una expresión aberrante de microRNA
en diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama. Los microRNA,
modulan la expresión de oncogenes y supresores de tumor y también están
implicados en la promoción de resistencia a los medicamentos contra el
cáncer.
Objetivo: Estudiar los microRNA que se expresan diferencialmente en
respuesta al tratamiento con doxorubicina en líneas de células de cáncer
de mama.
Métodos: Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 y MDA-
MB-468 (CMTN) y MCF7 (luminal-A) fueron expuestas a tratamiento con
Granada 2014
doxorubicina. Se realizó un análisis de microarrays (GeneChip miRNA 2.0
array) para identificar el conjunto de microRNAs comúnmente modificados
y aquellos regulados de forma diferencial. Los genes y las vías reguladas
por estos microRNA fueron analizados in silico.
Resultados: Los análisis de PCA y Heat Maps mostraron 13 microRNAs
modificados en las tres líneas, 25 en CMTN y 69 en la línea luminal-A.
Este patrón está relacionado con el subgrupo de cáncer de mama con más
fuerza que con el tratamiento específico. Curiosamente, las hebras “star”
de microRNA fueron modificadas en un porcentaje muy alto en todos los
grupos, y el análisis teórico de los genes diana reveló que los procesos y
vías relacionadas con el cáncer fueron los más afectados. Entre las vías
destacan: uniones adherentes, adhesión focal, ERBB, MAPK, PI3K y la
vía WNT, y entre los procesos celulares: proliferación, supervivencia,
angiogénesis, invasión y metástasis.
Conclusión: El perfil de microRNA en líneas celulares de cáncer de mama
se modifica ampliamente por el tratamiento con doxorrubicina y las hebras
“star” de los microRNA juegan un papel fundamental. Los genes y las vías
sobre las que actúan están relacionados con procesos de cáncer, por lo que
estos microRNA podrían ser relevantes en la respuesta al tratamiento y en
el desarrollo de resistencias.
P02-34
Differential localization of desmosomal plaque-
related proteins in non-small-cell-lung cancer
Laura Boyero Corral1, Mercedes Gómez-Morales2, Joel Martín-
Padrón1, Pedro P. Medina1, Esther Fárez-Vidal3
1
Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, and
Department of Biochemistry and Molecular Biology 1 - School
of Sciences - Granada University, Granada, ES, 2Department of
Pathology, School of Medicine, Granada University, Granada,
ES, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology 3 and
Immunology, School of Medicine, Granada University, Granada, ES
Squamous cell carcinomas and adenocarcinomas are the most frequent
forms of lung carcinoma, and have different prognoses and therapeutic
approaches.
During recent years, accumulating evidence has supported an important
role for several junctional proteins in carcinogenesis, tumour invasion
and metastasis. Contact between epithelial cells is mediated by several
types of cell–cell junction, which are composed of complex arrays
of transmembrane and plaque proteins and are connected typically to
cytoskeletal components. Desmosomes are cell–cell complexes found
primarily in epithelial tissues.
Previously, our group showed differentially expressed gene sequences
corresponding to severl desmosomal plaque-related proteins as a function
of tumour type, stage and differentiation grade in non-small-cell-lung
cancer (NSCLC).
The staining pattern of some desmosomal proteins differed between
squamous-cell carcinomas and adenocarcinomas. Expression of these
proteins marked intercellular junctions that are characteristic of the
squamous stratum of stratified flattened epithelium and of neoplasias with
this type of differentiation. We observed more intense staining of these
proteins in better differentiated areas.
In order to gain greater insight into the specific function of some
desmosomal proteins in NSCLC tumours, we have investigated the
subcellular localization of one of these proteins in lung squamous-cell
carcinomas by immunocytochemistry.
PKP1 was localized on membrane and desmosomal plaque, and mainly on
the nucleus of the cells. PKP1 knock-down caused specific inhibition of
PKP1 on immunostained cells in comparison with scramble cells.
These results may suggest other functions of PKP1 in cellular regulation
and cancer. Our evidence indicates that PKP1 is a potential target for
diagnosis and treatment of NSCLC.
Pósters
P02r-35
Interacción funcional entre las vías de TGF-β
y HGF durante la transición epitelio-mesénquima
en células progenitoras hepáticas
María García-Álvaro1, Laura Almalé1, Annalisa Addante1, Daniel
Caballero1, Celia Sequera1, Héctor Romero1, Jessica Segales2,
Carlos Sánchez2, César Roncero1, Margarita Fernández1, Eduardo
Rial2, Isabel Fabregat3, Blanca Herrera1, Aránzazu Sánchez1
1
Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos
(IdISSC) - Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de
Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES,2Centro
de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 3Laboratori
d´Oncologia Molecular, Universitat de Barcelona, Institut
d´Investigació Biomèdica de Bellvitge, Barcelona, ES
Las células ovales son progenitores bipotenciales de hígado adulto que
se expanden en situaciones de daño crónico y son responsables de la
reparación del daño hepático. Sin embargo, se ha postulado que son el
origen de un subgrupo de carcinomas hepatocelulares.
Para comprender los mecanismos subyacentes a su conversión maligna,
analizamos la potencial interacción entre las vías de TGF-β y HGF en el
contexto de un proceso de EMT. Para ello, hemos utilizado un modelo
in vitro de célula oval con un receptor Met inactivo (células Met-/-) y su
control (células Metflx/flx). El fenotipo mesenquimal estable (post-EMT) se
obtuvo mediante tratamiento crónico con TGF-β.
Las células ovales post-EMT muestran una cinética de crecimiento
similar a la de sus parentales, un fenotipo más inmaduro y una mayor
capacidad migratoria/invasiva. Además, presentan alteraciones en la
señalización disparada por TGF- β resistencia a la apoptosis y al estrés
oxidativo inducidos por esta citoquina. Este fenotipo resistente está
asociado a cambios significativos en el perfil de expresión de genes pro- y
anti-oxidantes. Además, el perfil bioenergético muestra una disminución
en el índice OCR/ECAR, sugiriendo la adquisición de un fenotipo más
glicolítico.
Curiosamente, la ausencia de Met resulta en un proceso de senescencia tras
la inducción de EMT, lo que sugiere que Met es necesario para la expansión
de estas células. Por otra parte, las células ovales post-EMT presentan una
señalización y respuesta al HGF alteradas.
En conclusión, nuestros resultados muestran una profunda alteración en
el fenotipo de la célula oval y sus propiedades funcionales después de la
EMT inducida por TGF-β. Además, apuntan a una interacción funcional
relevante entre las vías de HGF y TGF-β en este contexto.
P02-36
El déficit de IGF-I predispone a la pérdida
auditiva inducida por ruido
Adelaida Celaya1, Lourdes Rodríguez-de la Rosa1, Julio Contreras2,
Isabel Varela-Nieto1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-
UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades
Raras-CIBERER, Madrid, ES, 2Instituto de Investigaciones
Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-UAM - Centro de Investigación
Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER - Facultad De
Veterinaria, UCM, Madrid, ES
La deficiencia del factor de crecimiento similar a insulina tipo I (IGF-I)
causa sordera neurosensorial sindrómica en el hombre (ORPHA73272,
OMIM608747), situación que se reproduce en ratones modificados
genéticamente que no expresan este gen. El IGF-I es un agente neurotrófico
durante el desarrollo y neuroprotector en el adulto. Los niveles de IGF-I
circulante descienden de forma fisiológica con el envejecimiento lo que se
ha asociado con deterioro cognitivo en el hombre.
Nuestro objetivo ha sido estudiar si el déficit parcial en este factor
predispone a la pérdida auditiva y los mecanismos moleculares
responsables de la potencial respuesta agravada al daño. Para ello se ha
estudiado la susceptibilidad de ratones Igf1+/– y Igf1+/+ al daño causado
43
Pósters
por exposición excesiva al ruido a diferentes edades, utilizando técnicas
neurofisiológicas (potenciales auditivos del tronco cerebral), morfológicas
(histología coclear, cuantificación estereológica de células ciliadas) y
moleculares (RT-qPCR, Western blotting).
Los ratones de 1-3 meses de edad de ambos genotipos resultaron
igualmente sensibles al daño, por el contrario los ratones Igf1+/– de 6
meses de edad presentaron una mayor susceptibilidad al daño inducido
por ruido que los ratones Igf1+/+. Con respecto a los animales control, los
ratones Igf1+/– presentaron un incremento de umbrales auditivos acusado e
irreversible, una mayor pérdida de células ciliadas, así como alteraciones
en las principales vías de señalización del IGF-I y en la expresión génica
de marcadores celulares y moleculares de neuroinflamación. En su
conjunto los resultados sugieren una mayor activación de la respuesta
inflamatoria tras el trauma acústico en la situación de déficit parcial en
IGF-I.
Estos resultados apoyan la idea de que bajos niveles de IGF-I predisponen
a una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido y contribuyen a
identificar las dianas moleculares que participan en este proceso. Así, las
terapias basadas en IGF-I podrían contribuir a prevenir o mejorar la pérdida
auditiva inducida por ruido.
Agradecimientos: Este trabajo ha recibido el apoyo del SAF2011-24391,
de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña 2012 y del
proyecto AFHELO (FP7, European Union). LRR disfruta de contrato del
CIBERER y AC de AFHELO.
P02-37 (R02-8)
Increased oxidative stress and impaired
antioxidant response in Lafora disease
Carlos Romá Mateo1, Carmen Aguado2, Jose Luis Garcia Gimenez3,
José Santiago Ibañez Cabellos4, Marta Seco Cervera3, Federico
Pallardó3, Erwin Knecht2, Pascual Sanz5
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC) y CIBERER, Valencia,
ES, 2Centro de Investigación Principe Felipe y CIBERER, Valencia,
ES, 3FIHCUV-INCLIVA y CIBERER, Valencia, ES,4FIHCUV-INCLIVA
y Sistemas Genómicos S.A, Valencia, ES, 5Instituto de Biomedicina
de Valencia, CSIC y CIBERER, Valencia, ES
Lafora Disease (LD, OMIM 254780, ORPHA501) is a fatal
neurodegenerative disorder characterized by the presence of glycogen-
like intracellular inclusions called Lafora bodies and caused, in the vast
majority of cases, by mutations in either EPM2A or EPM2B genes,
encoding respectively laforin and malin. In the last years, several reports
have revealed molecular details of these two proteins and have identified
several processes affected in LD, but the pathophysiology of the disease
still remains largely unknown. Since autophagy impairment has been
reported as a characteristic treat in both Lafora disease cell and animal
models, and since there is a link between autophagy and mitochondrial
performance, we sought to determine if mitochondrial function could
be also altered in those models. Using fibroblasts from LD patients,
deficient in laforin or malin, we found mitochondrial alterations,
oxidative stress and a deficiency in antioxidant enzymes involved in the
detoxification of reactive oxygen species (ROS). Similar results were
obtained in brain tissue samples from transgenic mice deficient in either
the EPM2A or EPM2B genes. Furthermore, in a proteomic analysis of
brain tissue obtained from Epm2b-/- mice, we observed an increase in a
modified form of peroxirredoxin-6, an antioxidant enzyme involved in
other neurological pathologies, thus corroborating an alteration of the
redox condition. These data support that oxidative stress produced by
an increase in ROS production and an impairment of the antioxidant
enzyme response to this stress play an important role in the development
of LD.
44
XXXVII Congreso SEBBM
P02-38 (R02-2)
Adipose tissue as a regulator of metabolic
flexibility
Sam Virtue
Institute of Metabolic Science (IMS), Addenbrooke’s Hospital,
University of Cambridge, Cambridge, UK
The focus of this talk is on how disruptions in the ability of organisms
to appropriately store and release lipid can impact on whole organism
metabolic health. Both healthy mice and humans preferentially use
carbohydrate in the fed state and switch to utilising a greater degree of
lipid in fasted state. The ability to perform the switch between utilising
carbohydrate and lipid can be defined as ‘metabolic flexibility’. While
metabolic flexibility has been extensively studied in humans, data from
rodent models with alterations in metabolic flexibility are relatively rare.
The transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ
(PPARγ) is essential for adipogenesis. PPARγ has been implicated in the
regulation of both carbohydrate and lipid metabolism and is therefore an
excellent candidate for controlling metabolic flexibility. PPARγ2 is the
adipose tissue-specific isoform of PPARγ and has greater transcriptional
activity than PPARγ1. Despite the known role of PPARγ as a target for
the thiazolidinedione class of anti-diabetic drugs, young mice (4 months
of age) lacking PPARγ2 had surprisingly normal carbohydrate metabolism
based on glucose and insulin tolerance tests.
In this talk, data from mice lacking PPARγ2 will be used to demonstrate
how reductions in metabolic flexibility can be detected in mice using
indirect calorimetry. The lower metabolic flexibility of the PPARγ2 KO
mouse indicated that these animals may have impaired lipid handling, a
phenotype which was subsequently confirmed; with PPARγ2 KO mice
having reduced rates of lipolysis, and dramatically reduced capacity for
whole-organism lipid clearance. Finally, the relationship between reduced
adipose tissue capacity for both lipid uptake and release and human
metabolic health will be discussed.
P02r-39
Generación de células madre pluripotentes
inducidas (iPSC) para el estudio de
enfermedades mitocondriales
Teresa Galera Monge, Francisco Zurita Díaz, Cristina González
Páramos, Rafael Garesse Alarcón, M. Esther Gallardo Pérez
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas
UAM-CSIC - CIBERER, Madrid, ES
Las enfermedades mitocondriales (EM) constituyen un amplio grupo
de enfermedades genéticas multisistémicas cuyo nexo de unión es una
disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa. La falta de modelos
experimentales adecuados para el estudio de dichas enfermedades, ha
dificultado el avance en el desarrollo de nuevas terapias. En este sentido, la
reprogramación de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas
(iPSC) mediante la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción,
OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC, ha abierto enormes posibilidades. Por
ello, el objetivo general de este trabajo ha consistido en la generación
de iPSC a partir de fibroblastos de pacientes con EM para el estudio y
tratamiento potencial de las mismas. Para este fin, hemos establecido una
colección de fibroblastos procedentes de biopsias de piel de pacientes con
EM e individuos sanos. A continuación, se han generado líneas de iPSC
a partir de dichos fibroblastos mediante el uso de vectores retrovirales o
métodos no integrativos tipo virus Sendai. Así, hemos generado 16 líneas
de IPSC portadoras de distintas mutaciones en genes mitocondriales
codificados en el DNA mitocondrial o nuclear asociadas a distintas EM:
Síndrome de Leigh, atrofia óptica sindrómica y EM producidas por
defectos de comunicación intergenómica. Actualmente, estamos realizando
la confirmación, molecular y funcional, de la pluripotencia de las líneas
generadas, para posteriormente, diferenciarlas y caracterizarlas en los tipos
celulares diana. La disponibilidad de iPSC como modelo experimental
Granada 2014
de las EM nos permitirá mejorar el conocimiento de los mecanismos
fisiopatológicos de estas enfermedades y podrá suponer la apertura de
nuevas vías para la identificación de tratamientos farmacológicos y
de terapia celular.
P02-40
La leptina revierte parcialmente el efecto
Warburg en la línea de cáncer de mama MCF-7
María del Mar Blanquer-Rosselló, Raquel García-Belmonte, Jordi
Oliver, Pilar Roca, Adamo Valle
Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional - IUNICS - Universitat
de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición
(CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
El efecto Warburg consiste en la preferencia de las células tumorales por
el uso de la vía glucolítica en detrimento de la fosforilación oxidativa
mitocondrial. Al tratarse de una característica metabólica diferencial y
dada su importancia para sostener el elevado anabolismo del tumor en
crecimiento, la reprogramación metabólica se plantea como una diana
interesante en la lucha contra el cáncer. La leptina es una hormona
producida por el tejido adiposo blanco con una importante función en
la homeostasia energética. Se ha observado que la leptina aumenta la
proliferación y supervivencia de las células de cáncer de mama tanto in
vitro como in vivo. No obstante, se desconoce la influencia que la leptina
puede tener sobre el metabolismo de estas células. En este estudio nos
planteamos evaluar la influencia de la leptina sobre el efecto Warburg en
la línea de cáncer de mama MCF-7. Se analizó el consumo de oxígeno
mediante un electrodo tipo Clark, la producción de lactato mediante un
método enzimático y los niveles de ATP mediante luminometría en células
tratadas con leptina en respuesta a distintas dosis de 2-deoxiglucosa
y oligomicina. Se analizó también mediante western blot los niveles
y el grado de fosforilación de la AMPK, proteína sensora del estado
energético; y la actividad de la PDH mediante un ensayo enzimático
con inmunocaptura. Los resultados indicaron que la leptina revierte
parcialmente el efecto Warburg en las células MCF-7, induciendo un
metabolismo más aeróbico y una mayor dependencia de la mitocondria
para la síntesis de ATP. No obstante, las células con leptina mostraron
una mayor capacidad para activar la glucólisis al inhibir la fosforilación
oxidativa.
Financiado por CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea
“Una manera de hacer Europa”.
P02r-41
Mutaciones y polimorfismos mitocondriales
en pacientes mexicanos con cáncer de próstata
Victoria Edwina Campos García1, Sandra Viridiana Salgado
Hernández1, Jorge Ramírez Salcedo2, Patricia Ramírez Noguera2,
Sandra Díaz Barriga Arceo2, Rosalba Bonilla Sánchez3, Sergio Ureta
Sánchez4, José Francisco Montiel Sosa2
1
B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento de Bioquímica y
Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México,
Cuautitlan Izcalli, MX, 2PhD. en Ciencias Biomédicas, Instituto
de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México,
Distrito Federal, MX, 3Q.F.B. Departamento de Bioquímica y
Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México,
Cuautitlán Izcalli, MX, 4MD. Médico Urólogo, Hospital Español,
Distrito Federal, MX
En México, el cáncer de próstata es un importante problema de salud
pública con altos costes sociales, este tipo de neoplasia tiene una tasa
de mortalidad anual de 121.57 por cada 100 mil hombres. Los factores
predisponentes de dicha patología son la edad y antecedentes familiares
positivos pero poco se sabe acerca de la etiología de la enfermedad. Se
ha estudiado que las mutaciones a nivel ADN mitocondrial (ADNmt) en
Pósters
pacientes con cáncer de próstata (CaP), son prospectos a ser herramienta
útil para la detección de la enfermedad. Actualmente en México no se
había realizado una investigación profunda de las mutaciones en el
mtDNA asociadas al CaP. Analizamos tres muestras de tejido prostático
obtenidos mediante una biopsia transrectal. Se amplificó todo el genoma
mitocondrial mediante la técnica de PCR punto final, de una muestra; las
demás muestras solo se amplificaron la región MT-ND5. Posteriormente
se recurrió a la técnica de secuenciación bidireccional y finalmente se
examinó la presencia de variantes de la secuencia entre el tejido sano y
enfermo del mtDNA. Sólo una muestra mostró dos mutaciones asociadas
al CaP, en el locus MT-CO1, alelo G6261A produciendo un cambio
de aminoácido de manera non-syn:A-T y en el locus MT-ND5, alelo
C12705T cuyo cambio de aminoácido es syn:I-I. Esta misma muestra
mostró mutaciones en el locus MT-ATP 6, alelo A9300G con un cambio
de aminoácido non-syn:A-T asociada a la miopatìa y en el locus MT-
RNR1, alelo A663G con cambio de aminoácido 12S rRNA relacionada al
riesgo de arterioesclerosis coronaria. Dichas variaciones son las primera
reportadas en México. Dicha investigación es apenas un preámbulo
para entender el cáncer de próstata, su inicio, progreso y desarrollo de
metástasis en pacientes mexicanos.
P02-42
Metabolomic analysis of serum samples from
diabetic patients with and without cardiovascular
disease and control subjects
Beatriz García-Fontana1, Caridad Díaz Navarro3, Pedro
Rozas-Moreno4, Olga Genilloud3, Francisca Vicente Pérez3,
José Pérez del Palacio3, Sonia Morales-Santana1,2,
Manuel Muñoz-Torres1
1
Unidad de Metabolismo Óseo-RETICEF, Servicio de Endocrinología,
Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital
Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2Servicio de Proteómica,
Fundación para la Inverstigación Biosanitaria de Andalucía
Oriental –Alejandro Otero– FIBAO, Granada, ES, 3Fundación
MEDINA, Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos
Innovadores en Andalucía - Parque Tecnológico de Ciencias de la
Salud, Granada, ES, 4Servicio de Endocrinología, Hospital General
de Ciudad Real, Ciudad Real, ES
Metabolomics is an emerging and powerful discipline that provides an
accurate and dynamic image of the phenotype of mammalian systems
through the study of endogenous and exogenous metabolites in cells, tissues
and biofluids. The aim of this project is to analyze the metabolomic profiles
obtained by mass spectrometry of serum samples from type 2 diabetes
mellitus (T2DM) patients with and without cardiovascular disease (CVD)
and control subjects, in order to find new molecular pathophysiological
processes related to the onset of disease as well as new biomarkers for
CVD and diabetes.
In this study we analyzed 9 serum samples from T2DM patients with
CVD, 10 serum samples from T2DM patients without CVD and 10
serum samples from healthy subjects. These samples were analyzed by
liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry
(LC-HRMS). The raw LC-HRMS data were converted into mass peak
lists which were compared across cromatographic runs and subjected
to statistical analysis (t-test, fold change analysis, principal component
analysis and partial least square-discriminant analysis). Thus, the peaks
whose intensity levels vary significantly between different groups are
detected.
The principal component analysis (PCA) successfully clustered the samples
according to the aforementioned groups. PCA loading plot revealed that
phospholipids were the main discriminatory metabolites. The role of these
molecules as biomarkers and their involvement in glucose and insulin
pathways will also be discussed in this study.
45
Pósters
P02r-43 (R02-6)
Dissecting the role of the epidermal growth factor
receptor (EGFR) in diethylnitrosamine-induced
hepatocarcinogenesis in mice
Daniel Caballero Díaz1, Judit López-Luque1, Alba Marín-Martínez1,
Adoración Martinez-Palacián2, María García-Álvaro2, Annalisa
Addante2, María García-Bravo3, Esther Grueso4, Jose-Carlos
Segovia3, César Roncero2, Margarita Fernández2, Aránzazu
Sanchez2, Isabel Fabregat5
1
Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Barcelona,
ES, 2Dep. of Biochemistry and Molecular Biology II, School
of Pharmacy, Complutense University of Madrid and Instituto
de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos,
IdISSC, Madrid, ES, 3Cell Differentiation and Cytometry Unit
- Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de
Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas-
CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de
Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed
Unit. CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, 4Division
of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE,
5
Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department
of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of
Barcelona, LHospitalet de Llobregat, ES
Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers and
its incidence is increasing. Hepatocarcinogenesis is a multistep process
that involves genetic and environmental factors. It is necessary to elucidate
the interaction and cross-regulation of these factors that synergistically
contributes to HCC development. In HCC there is a disruption of the
balance between cell death and survival signaling pathways. Different
physiological pro-apoptotic molecules are down-regulated, or inactivated,
due to an over-activation of anti-apoptotic signals that impairs their
functions. At the same time, some pro-survival pathways are over-activated.
One of these de-regulated survival signals is the epidermal growth factor
receptor (EGFR) pathway. On the one hand, different EGF-like ligands
are over-expressed in HCC, contributing to EGFR activation during HCC
progression. On the other hand, it has been shown that human HCC tissues
over-express EGF family receptors.
To investigate the role of the EGFR in the process of hepatocarcinogenesis our
group generated a transgenic mice that expressed specifically in hepatocytes
a truncated form of the EGFR (Alb1-ΔEGFR). These mice were treated with
diethylnitrosamine (DEN) to induce liver tumorigenesis. By histological
techniques the livers of the mice were analyzed at different times after
treatment with DEN. Transgenic mice showed a delay in the appearance and
in the growth of tumors, as well as less inflammation and less extracellular
matrix deposition in liver parenchyma. The results suggest that the EGFR
pathway plays an important role in the process of hepatocarcinogenesis.
Further work is required to elucidate the molecular mechanisms by which
EGF contributes to liver tumor cell growth and survival.
P02r-44
Associating the decrease on neuronal viability
induced by amyloid-beta 1-40 and 1-42 with
reactive oxygen species production and the
disregulation of the expression of synaptic
proteins
Marta Domínguez-Prieto, Ana Velasco, José M. Medina
Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de
Castilla y León), Salamanca, ES
Amyloid-beta (Aβ) accumulation together with tau protein
hyperphosphorylation are the main molecular events presumably responsible
for neurodegeneration observed in Alzheimer’’’’s disease. In this work, we
studied the effect of three Aβ peptides: Aβ 25-35, Aβ 1-40, Aβ 1-42, on
cell viability and reactive oxygen species (ROS) production in rat neurons
46
XXXVII Congreso SEBBM
in primary culture. Our results showed that the three peptides significantly
decreased neuronal viability, but only Aβ 25-35 and Aβ 1-42 produced
a significant increase on ROS production. In addition, we performed
immunohistochemistry against Aβ in order to observe its localization within
the neuron, showing that the distribution pattern differed depending on the
Aβ peptide, Aβ 25-35 being internalized into neurons but Aβ 1-40 and Aβ
1-42 remaining mostly outside the cells. In order to get inside the mechanism
involved in the cell damage induced by Aβ peptides, we analized changes in
the expression of synaptic proteins, such as synaptophysin, synaptotagmin
and PSD-95, by western-blot. Our results showed the occurrence of a
disregulation on the expression of these proteins. Since the changes in ROS
production cannot fully explain the decrease on cell viability observed in our
experiments, we propose that the disruption of synaptic structure must be
involved in neuronal death induced by amyloid-beta.
P02r-45
Bisphenol A exposure during adulthood alters the
expression of tryptophan hydroxylase type II but
not type I in the prefrontal cortex of rat: Possible
alterations in local serotonin synthesis
Beatriz Castro Bohórquez, Pilar Sánchez Medina, Jesús Manuel
Torres De Pinedo, Esperanza Ortega Sánchez
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e
Inmunología, Universidad de Granada, Granada, ES
Background: Bisphenol A (BPA) is able to produce neurological and
behavioral dysfunctions by mechanisms that remains unknown. Serotonin
(5-HT) system is essential for prefrontal cortex (PFC) function, an important
area for cognitive control and complex behaviors. Alterations in precortical
serotonergic signalling have been implicated in the pathogenesis of a wide
range of neuropsychiatric disorders. Tryptophan hydroxylase (Tph), which
is expressed as two isozymes (Tph1 and Tph2), catalyzes the rate-limiting
step in 5-HT synthesis and is considered one of the leading target genes for
psychiatric and behavioral disorders. Tph2 is specifically expressed in the
brain, whereas Tph1 is responsible for 5-HT synthesis in peripheral tissues.
Objective: Our objective was to evaluate the effects of adult exposure to
BPA on precortical Tph isozymes expression.
Methods: Adult male and female Wistar rats were inyected subcutaneously
during 4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental
Protection Agency (EPA) reference dose. At 30 min after the final
administration, rats were euthanized and the brains were stored at -80°C
until analysis. Quantitative RT-PCR was used to quantify mRNA levels of
Tph1 and Tph2 in the PFC. Protein levels were quantified by Western blot.
Results: BPA increased mRNA and protein levels of Tph2 in the PFC of
both male and female rats. No significant differences in Tph1 expression
were observed after BPA treatment.
Conclusion: We demonstrated for the first time that BPA, at a dose
considered safe by the EPA, modifies Tph2 expression in the PFC of adult
rats. Consequently, local synthesis of 5-HT might be altered. Given the role
of 5-HT in several psychopathologies, further studies will be required to
determine the impact of this finding.
P02-46
Dissecting the role of the epidermal growth factor
receptor (EGFR) in the molecular mechanisms
that control liver regeneration in mice
Judit López-Luque1, Adoración Martínez-Palacián2, Eva Crosas-
Molist1, Joaquim Moreno-Càceres1, Daniel Caballero-Díaz1,
María García-Bravo3, Esther Grueso4, Jose-Carlos Segovia3, César
Roncero2, Margarita Fernández2, Aránzazu Sánchez2, Isabel
Fabregat5
1
Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Hospitalet
de Llobregat, ES, 2Dep. of Biochemistry and Molecular Biology
Granada 2014
II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and
Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San
Carlos-IdISSC, Madrid, ES, 3Cell Differentiation and Cytometry
Unit. Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de
Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas-
CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de
Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed
Unit - CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, 4Division
of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE,
5
Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department
of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of
Barcelona, Barcelona, ES
Liver regeneration (LR) is a very complex and well-orchestrated
phenomenon. The proliferation of hepatocytes is the main mechanism
during LR, in response to mitogenic signals. Among them, epidermal
growth factor (EGF) and hepatocyte growth factor (HGF) play essential
roles. However, additional studies are necessary to understand if EGF and
HGF pathways compensate one to each other in some aspects or if, on
the contrary, they play unique roles during LR. Moreover, Ttansforming
growth factor-beta (TGF-β) is important at the end of LR as it inhibits
proliferation and maintains the liver in its correct size.
To elucidate the specific role of the EGFR pathway during LR after
partial hepatectomy (PH) in mice, we have generated a transgenic mouse
expressing a truncated form of the EGFR (Alb1-ΔEGFR) specifically in
hepatocytes. The regenerative process after 2/3 hepatectomy in transgenic
mice (ΔEGFR) was compared with that of wt mice (WT). Lack of EGFR
kinase activity correlated with a delay in proliferation in regenerating
hepatocytes, coincident with a higher activation of the TGF-β pathway.
ΔEGFR mice also showed higher basal inflammation and differences in lipid
metabolic changes during LR, being not able to induce the transient lipid
accumulation in hepatocytes which precedes the peak of the proliferative
phase. In spite of this delay in proliferation, ΔEGFR mice fully regenerated
the liver, which means that other signaling pathways can be compensating
the lack of EGFR signaling. In this line of evidence, HGF levels and Met
(HGF receptor) phosphorylation were higher in ΔEGFR animals after PH.
In summary, EGF plays diverse roles in liver after PH, but attenuation of its
signaling is not crucial for the final regeneration of the liver.
P02-47
Identificación de una firma de miRNA asociada
a la recurrencia temprana en cáncer de mama
Luís G. Pérez-Rivas1, José M. Jerez2, Rosario Carmona3, Vanessa
de Luque1, Luís Vicioso4, M Gonzalo Claros3, Enrique Viguera5,
Bella Pajares1, Alfonso Sánchez1, Nuria Ribelles1, Emilio Alba1,
José Lozano6
1 remodeling of body fat composition agent. Parallel, osteoblastogenesis in
Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina
de Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 2Dpto. Lenguajes y Ciencias de la
Computación, Universidad de Málaga-UMA, Málaga, ES,3Plataforma
Andaluza de Bioinformática, Universidad de Málaga-UMA, Málaga,
ES, 4Servicio de Anatomía Patológica, Instituto de Biomedicina de
Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 5Dpto de Biología Celular, Genética
y Fisiología Animal, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 6Dpto.
Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga-UMA,
Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina de
Málaga-IBIMA, Málaga, ES
La aparición de metástasis es un evento frecuente en pacientes operadas
de cáncer de mama y suele estar asociado a una mayor mortalidad. El
análisis de largas series de pacientes con amplio seguimiento ha puesto
de manifiesto que la probabilidad de recaída no es constante en el tiempo,
sino que sigue un patrón bimodal con un primer pico de incidencia a los
18-24 meses tras la cirugía (recurrencia temprana), seguido de un segundo
pico de menor magnitud a los 60 meses aprox. (recurrencia tardía); pasado
este periodo, el riesgo de recaída disminuye drásticamente. Por tanto, son
necesarios marcadores moleculares que permitan detectar con precisión
aquellas pacientes que presentan mayor riesgo de recurrencia temprana y
Pósters
diferenciarlas de aquellas con menor probabilidad de desarrollar metástasis.
Con este propósito, hemos analizado tumores procedentes de 71 pacientes
operadas de cáncer de mama atendiendo a los patrones de expresión de
1106 microRNA (miRNA), pequeñas moléculas de RNA implicadas en
el control de la expresión génica y que suelen encontrarse desreguladas
en varias enfermedades, incluyendo cáncer. Se ha identificado y validado
un grupo de cinco miRNA cuya expresión está disminuida en tumores
de pacientes con recurrencia temprana y menor supervivencia libre de
progresión. Notablemente, esta firma de miRNA permite discriminar
eficientemente entre pacientes con bajo y alto riesgo de recaída temprana.
El análisis de posibles mRNA dianas empleando la información existente
en varias bases de datos públicas sugiere una relación entre estos cinco
miRNA y la capacidad proliferativa y pro-angiogénica del tumor.
P02-48
Maslinic acid is able to inhibit the
osteoblastogenesis and adipogenesis in two
different cell lines
Eva E. Rufino Palomares1, Amalia Pérez-Jiménez2, Fernando J.
Reyes-Zurita1, Leticia E. García-Salguero1, Juan Peragón3, Pedro P.
Medina1, José A Lupiáñez1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad
de Granada, Granada, ES, 2Biomaslinic, Enterprise, S.L, Granada,
ES, 3Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén,
Jaén, ES
Maslinic acid (MA) is a pentacyclic triterpene acid widely present in
dietary plants and especially abundant in olive fruit skins. Thecompound
has attracted much interest owing to its provenpharmacologic safety and
its many biologic activities, such asanti-inflammatory, antiviral, antioxidant
and antidiabetogenic activities as well as anticancer and antiastrocytoma
properties. Moreover, some studies showed that this compound increase
growth performance in animals. In this study, the MA effects on adipogenesis
and osteoblastogenesis was determined in order to analyze some of the
most important parameters related to obesity and metabolic syndrome.
Results obtained indicated that the MA had a significant inhibitory effect
on adipogenesis in the model pre-3T3-L1 adipocytes. This result coincided
with the antagonistic effect of the compound on PPARγ and increased Ca2+
cytoplasmic levels in presence of MA.Taken together, these results suggest
that this compound inhibits the formation of adipose tissue.Furthermore,
it was also observed that the MA slightly increased glucose uptake in pre-
adipocytes 3T3-L1. This suggests that this compound might exert a beneficial
effect in states of insulin resistance or hyperglycemia. The results alsoshowed
that MA, in human mesenchymal cells (hMSCs) derived from bone marrow,
inhibited the adipogenesis, confirming its potential as anti-obesity and
hMSC cells was analyzed, finding a weak induction of molecular markers
that may be indicative of that MA positively affect bone regeneration.
This study has been supported by the Feder-Interconecta Program by means
of an investigation contract between University of Granada Foundation,
Bio-157 research group and Biomaslinic S.L. company.
P02-49
Cambios en el reclutamiento de la subunidad
ribosomal 40S por poblaciones de herogeneidad
genética creciente del ARN del virus
de la hepatitis C
Samuel Prieto Vega1, Celia Perales2, Sunnie R Thompson3, Raquel
Romero García4, J.I. Esteban5, Esteban Domingo2, Jordi Gómez
Castilla6
1
Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC), Armilla, ES,
2
CBMSO Madrid, Madrid, ES, 3Dpt. Microbiology UAB Alabama,
47
Pósters
Birmingham Alabama, US, 4Hospital Universitario Puerta del Mar,
Cádiz, ES, 5Institut de Recerca Hospital Universitari Vall Hebron,
Barcelona, ES, 6Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC),
CIBERehd, Armilla, ES
La región genómica 5’ del virus de la hepatitis C contiene una zona de
unión al ribosoma. Este dominio y sus flancos son ricos en elementos
estructurales (estructuras 1ª, 2ª y 3ª) identificados in vitro por factores
bioquímicos y biofísicos: interacción con micro ARN hepático miR-122,
sensibilidad a RNAsas dependientes de estructura (RNAsa III y P), luz
UV-c. Se obtuvieron poblaciones heterogéneas de ARNin vitro por PCR
mutagénica y transcripción in vitro y en un cultivo, creciendo el virus
en presencia de ribavirina. Evaluamos el efecto de la variabilidad en
poblaciones de ARN (HCV1-540) y de heterogeneidad genética creciente,
en los motivos simples a los distintos niveles estructurales y evaluamos
los cambios en la unión al ribosoma. El efecto de la heterogeneidad
poblacional en el reconocimiento de los distintos factores varió a los
distintos niveles estructurales, siendo especialmente perjudicial para la
unión a la secuencia de miR-122 (estructura 1ª) y en el procesamiento por
la RNasa P en la estructura tipo tRNA (estructura 3ª). El efecto sobre la
RNasa III que reconoce ARN de doble cadena (estructura 2ª), fue menor,
pero permitió identificar un cambio conformacional inducido por el
incremento mutacional, validado en geles nativos y con RNasas de simple
y doble cadena T1 y V1. Se evaluó la kd para la union de 40S a cada
población de heterogeneidad creciente in vitro obteniendo una pérdida de
la afinidad por la subunidad 40S de hasta 3 veces con el incremento de
las mutaciones. En cultivo celular, con y sin ribavirina, la acción de la
selección natural sobre este dominio esencial para el virus, fue la de un
incremento de la afinidad a la subunidad ribosomal 40S. Concluimos que
el reconocimiento molecular, in vitro, de las estructuras 2ª es más estable
que en las estructuras 1ª y 3ª y el dominio complejo RBS es el más sensible
al incremento en la tasa de mutación. En cultivo, el virus puede aprovechar
el incremento en la tasa de mutación durante su replicación para facilitar la
selección de mutantes más activos en dominios esenciales como el RBS.
P02r-50
Epigenetic regulation in dilated cardiomyopathy
Alicia González, Ileana B. González, Arturo Bujarrabal, Susana
González
Faculty of Medicine, University of Castilla-La Mancha, Ciudad
Real, ES. Fundación Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares, CNIC, Madrid, ES
Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the most common forms
of cardiomyopathy with an estimated prevalence of 1/2500. DCM
is characterized by left ventricular enlargement (LVE) and systolic
dysfunction with an ejection fraction <50%. This disease commonly results
in congestive heart failure with signs and symptoms such as shortness of
breath, edema and increased heart rate, leading to death.
DCM is a common reason for heart transplantation in adults and children.
The mortality remains high without effective treatments. Further analysis
focusing on the development of cardiomyopathy are required in order to
improve treatment approaches and prognosis.
Recent studies in our group show that BMI1 protein, which belongs
to the epigenetic regulator Polycomb group, seems to be involved in
cardiomyopathy development. In order to study what happens at very early
stages of the disease, we have generated mice with conditional deletion
of BMI1 (cKO Bmi1) in heart. This cKO Bmi1 mice has been obtained
by crossing a cKO Bmi1 fl/fl mouse with mice bearing different cardiac
specific CRE, such as αMYH6-CREERT, inducible in adult myocardium by
tamoxifen administration.
The present work focuses on the caracterization of early stages of BMI1-
mediated dilated cardiomyopathy and the elucidation of the most important
genes and proteins involved in cardiac dysfunction and heart failure.
48
XXXVII Congreso SEBBM
P02-51
Utilización de iPSC como modelo de estudio
de una nueva enfermedad rara
Pilar Mollinedo Sedano1, José Antonio López-Escamez2, Silvia
Torices del Val1, Verónica Ramos-Mejía2, Pedro J. Real-Luna2, José
Luis Fernández-Luna1, Domingo Gonzalez-Lamuño3
1
FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2Centre for Genomics and
Oncological Research-GENYO, Granada, ES, 3Universidad de
Cantabria, Santander, ES
Las nuevas tecnologías de análisis genómico y los nuevos modelos
de enfermedad mediante reprogramación celular están siendo de gran
importancia en el estudio de las enfermedades raras. Si bien estas
enfermedades son de baja prevalencia (menos de 5 casos por cada 10.000
personas), en su conjunto (más de 7000 patologías distintas) tienen
una notable incidencia en la población (afectan al 7% de la población
mundial). Nuestro grupo está estudiando el caso de una niña de 7 años
con sospecha clínica de un síndrome de poliendocrinopatía autoinmune
(síndrome APECED), asociado a mutaciones en el gen AIRE. Sin embargo,
la ausencia de mutaciones en este gen y la identificación de un cuadro
clínico más complejo con miopatía, infecciones intestinales recurrentes y
alteraciones conductuales, indica una entidad patológica nueva. Mediante
CGH array de alta resolución (400K) se ha identificado una duplicación
bialélica de 4.1 Kb en el cromosoma 21 que incluye el gen LINC00315
(long intergenic nonprotein coding RNA, Gene ID: 246704), un potencial
regulador transcripcional. Con el fin de profundizar en el estudio genético
de esta patología analizamos el exoma completo de la paciente y de sus
padres. Se aportarán datos sobre ambos estudios. Simultáneamente
estamos desarrollando un modelo de enfermedad transduciendo células
mononucleares de la paciente con vectores virales reprogramadores
(iPSC,induced pluripotent stem cells). Estas iPSC se diferenciarán a
distintos linajes celulares (músculo, linfocitos, epitelio, neuronas) con
relevancia en la patología estudiada, con el fin de identificar alteraciones
en el patrón de diferenciación o maduración celular que permitan explicar
al menos parte del cuadro clínico de la paciente. Este modelo podría ser
utilizado para el desarrollo de estrategias terapéuticas, tanto genéticas
como farmacológicas. Presentaremos datos preliminares de este modelo
celular.
P02-52
Identificación de variantes génicas relevantes
de la vía de NFκB y sus consecuencias
funcionales en pacientes con artritis reumatoide
Silvia Torices del Val1, Ignacio Varela Egocheaga2, Thaidy Moreno
Rodríguez2, Pilar Mollinedo Sedano1, Alejandro Balsa Criado3, Dora
Pascual Salcedo3, Lorena Álvarez Rodríguez1, Marcos López Hoyos1,
José Luis Fernández Luna1, Víctor Martínez Taboada1
1
FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2IBBTEC, Universidad de
Cantabria, Santander, ES, 3Hospital La Paz, Madrid, ES
NFκB es uno de los principales moduladores de las respuestas inmune
e inflamatoria. Diversos estudios en pacientes con artritis reumatoide
(AR) sugieren que NFκB es esencial para la expresión de citocinas
proinflamatorias y de enzimas que promueven la destrucción articular.
Nuestra hipótesis de trabajo es que pueden existir mutaciones en los
principales genes involucrados en la regulación de NFκB que pueden tener
consecuencias funcionales relevantes y por tanto asociarse bien con la
susceptibilidad a padecer AR, o bien con el pronóstico de la enfermedad.
Para comprobar esta hipótesis, hemos analizado por medio de técnicas de
secuenciación de nueva generación 158 genes reguladores de la vía NFκB
en 66 pacientes con AR y en 30 controles sanos, obteniendo un total de
942 variantes génicas. Seleccionamos trece de estas variantes, afectando
a 10 genes (TLR10, TLR1, TLR7, TLR8, NLRP7, NFκBIZ, NOD2, TNIP1,
TRIP6 y BCL10) de acuerdo a la presencia de diferencias estadísticamente
significativas en la frecuencia del polimorfismo entre la población control
y los pacientes con AR, la frecuencia alélica de la mutación en la población
Granada 2014
general, el impacto del polimorfismo a nivel de la proteína y la función
reguladora que estos genes tienen en la ruta NFκB. Estas variantes fueron
confirmadas en una cohorte de 400 pacientes con AR y 200 controles
sanos mediante secuenciación masiva. A fin de determinar las posibles
consecuencias funcionales de las variantes, se han comenzado estudios
para determinar el nivel de actividad de NFκB mediante ensayos con
luciferasa como gen reportero y expresión de citocinas pro-inflamatorias
por PCR cuantitativa. Presentaremos datos preliminares sobre la posible
participación de algunas de estas variantes génicas en el desarrollo o
evolución de la artritis reumatoide.
P02-53
Data mining en Drosophila para la identificación
y caracterización de nuevos genes implicados
en la biogénesis de la función OXPHOS
Sara Palacios Zambrano, Ramiro Vicente, Paula Clemente Pérez,
Susana Peralta, Lucía Echevarría, Rafael Garesse, Miguel Angel
Fernández-Moreno
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Madrid, Alcobendas, ES
La mitocondria es un orgánulo celular de origen endosimbionte que juega
un papel central en el metabolismo de la célula hospedadora destacando su
implicación en: (i) la síntesis de la mayor parte de la energía (ATP) celular
(ii) la regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS),
(iii) el control de la homeostasis del Ca2+ intracelular y (iv) el control del
proceso de muerte programada o apoptosis.
Entre estas funciones, se considera la síntesis de ATP mediante el
sistema cadena respiratoria (CR)/OXPHOS como la más relevante y
cuya disfunción genera las denominadas enfermedades mitocondriales.
El CR/OXPHOS está formado por numerosas subunidades estructurales,
de las que 13 están codificadas en el propio genoma mitocondrial
(mtDNA) y más de 80 en el DNA nuclear. Para la biogénesis de este
sistema se requieren, además, los elementos que las ensamblan y los
numerosos componentes de la maquinaria de replicación y decodificación
del genoma mitocondrial. Mutaciones en cualquiera de ellos pueden
provocar defectos responsables de numerosas patologías denominadas
enfermedades mitocondriales.
En más de la mitad de las patologías mitocondriales de base genética se
desconoce el gen o genes causantes. La identificación de genes no descritos
implicados en defectos OXPHOS es uno de los retos actuales en este área.
En este sentido, la utilización de Drosophila como modelo puede suponer
una herramienta adicional para ello. Drosophila posee una molécula de
mtDNA similar a la de mamíferos y conserva los mismos elementos
responsables de su replicación, transcripción, mantenimiento, etc. El
rastreo de diferentes bases de datos nos han permitido identificar la
presencia de genes esenciales para la función OXPHOS situados sobre
bicistrones, es decir, codificados en un mismo mRNA, recordando
una organización procariota. Los ortólogos en mamíferos de algunos
de esos genes han sido recientemente caracterizados en el laboratorio.
Para caracterizar otros nuevos candidatos procederemos a utilizar
aproximaciones de interferencia de RNA y de generación de knock-outs
mediante el sistema CRISPR/Cas.
P02-54
Los sistemas toxina-antitoxina controlan
la infección por Salmonella typhimurium
Damián Lobato Márquez1, Inmaculada Moreno Córdoba1, Viginia
Figueroa2, Francisco García del Portillo2, Ramón Díaz Orejas1
1
Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC), Madrid, ES,
2
Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES
Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es una
bacteria patógena intracelular Gram-negativa que puede persistir en el
Pósters
organismo infectado durante un período prolongado de tiempo. Es el
agente causal de enfermedades humanas de diversa severidad, desde
gastroenteritis hasta infección sistémica crónica. Como la mayoría de las
bacterias, esta especie contiene en su genoma sistemas toxina-antitoxina
(TA). Los sistemas TA son módulos formados, generalmente, por dos
genes adyacentes, que están agrupados formando un operón. Uno de los
genes codifica una antitoxina, que puede ser un RNA o una proteína, y
el otro una toxina que es siempre una proteína estable capaz de interferir
con la proliferación o viabilidad de la bacteria. La activación de estos
sistemas está asociado a la respuesta a estrés, y más recientemente se
ha visto que pueden favorecer la supervivencia del patógeno durante la
infección.
Nosotros hemos realizado una búsqueda sistemática y un análisis funcional
de los sistemas TA de S. typhimurium, determinando que la mayoría de
los sistemas TA identificados son funcionales. Además, hemos analizado,
utilizando un modelo de infección de fibroblastos, el papel de estos
sistemas en la persistencia intracelular. El análisis ha permitido identificar
un subgrupo de sistemas TA que se expresan en la célula huésped y cuya
presencia favorece la supervivencia y/o proliferación limitada de S.
typhimurium en el interior de la célula infectada. Los datos demuestran un
papel activo de un grupo de sistemas TA en la persistencia de Salmonella
en fibroblastos infectados.
P02-55
Expresión, caracterización enzimática e interés
biomédico de la pirrolin 5-carboxilato sintetasa
humana, una enzima clave en la biosíntesis
de prolina y ornitina
Juan Manuel Escamilla Honrubia1, Clara Marco Marín1, Nadine
Gougeard2, Vicente Rubio3
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES,
2
Centro para Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades
Raras CIBERER-ISCIII, Valencia, ES, 3Instituto de Biomedicina de
Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER-ISCIII, Valencia, ES
La ∆1-pirrolin-5-carboxilato sintetasa (P5CS) es un enzima bifuncional
que cataliza los dos pasos iniciales de la biosíntesis de novo de prolina y
ornitina (y a través de ornitina, arginina) en animales y plantas, siendo su
déficit un error congénito transmitido con herencia recesiva en unos casos
y dominante en otros. Con la finalidad de establecer las características
bioquímicas y funcionales de esta enzima e intentar determinar su
estructura, así como para explorar los efectos de las mutaciones clínicas,
tratando de entender su dominancia o recesividad, hemos expresado la
P5CS recombinante humana como proteína de fusión con MBP, de la que
eliminamos luego la MBP por procedimientos estándar. Nuestro sistema de
expresión usa baculovirus/células de insecto Sf9, no habiendo tenido éxito
con sistemas de expresión bacteriana y escaso rendimiento con la expresión
usando células HEK293. Hemos generado, estables y activas, las dos formas
de “splicing” alternativo de la enzima, determinando las características
cinéticas de sus dos reacciones parciales (glutamato 5-quinasa, G5K; y
glutamil 5-fosfato reductasa, G5PR) y de la global, estudiando su grado de
acoplamiento, y corroborando que sólo la isoforma más corta experimenta
retroinhibición por ornitina. Probamos que la estructura cuaternaria de la
enzima es hexamérica, de acuerdo con la dominancia negativa propuesta
para explicar los casos de herencia dominante. Los ensayos con mutantes
dominantes han demostrado tendencia a la rápida desagregación. Los
experimentos cristalográficos no han generado por el momento resultados
positivos.
Ayudas Prometeo 2009/051 (Generalitat Valenciana) y BFU2011-
30407(MINECO). N. Gougeard es contratada CIBERER.
49
Pósters
P02-56
A novel liquid chromatography coupled with a
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method
to assess LpxC inhibition
Caridad Díaz Navarro1, Victoria Knight-Connoni2, Kevin Barry2, Olga
Genilloud1, Francisca Vicente Pérez1, José Pérez del Palacio1
1
Fundación MEDINA, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Granada, ES, 2Cubist, Lexington, MA, Lexington, US
LpxC, an essential enzyme for lipid A biosynthesis in gram-negative
bacteria, represents an attractive target for therapeutics. However,
antibacterial drug discovery efforts focused on inhibitors of LpxC have
found that the enzyme assay is not suitable for high-throughput screening
using conventional technologies such as assays with radiolabeled substrates
involving charcoal or TLC separation and fluorescence-based methods that
detect the free amine in the reaction product by coupling to fluorescamine.
These methods are cumbersome and vulnerable to false-positive hits due to
fluorescence quenching.
In this work we present a novel liquid chromatography coupled with a
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method which offers a fast,
sensitive, and reliable alternative to the typical LpxC inhibition assay. It
employs mass spectrometry to directly detect product with high sensitivity.
Using this system, the data collected illustrate enzyme concentration
linearity and standard kinetics for conditions used in screening for LpxC
inhibitors. Additional validation experiments, such as DMSO tolerance and
reference inhibitor (Chir90) testing, were also carried out successfully.
This method represents the first communication of a methodology for the
separation of the enzymatic reaction product by mean of conventional
high pressure liquid chromatography (HPLC) which makes feasible the
implementation of a screening for antibacterial inhibitors of the LpxC
using a high-throughput mass spectrometry assay in many drug discovery
setups.
P02-57
El sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer
y el envejecimiento
Jorge de la Rosa1, Carlos López-Otín2, Juan Cadiñanos3
1
Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias (IMOMA)
- Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto
Universitario de Oncología (IUOPA), Universidad de Oviedo ,
Oviedo, ES, 2Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de
Asturias (IMOMA), Oviedo, ES, 3Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular, Instituto Universitario de Oncología (IUOPA),
Universidad de Oviedo, Oviedo, ES
Los avances producidos en los últimos años en torno al envejecimiento han
sido favorecidos por el estudio de los denominados síndromes progeroides
humanos, cuyos pacientes desarrollan de manera prematura y exacerbada
múltiples alteraciones características de la edad avanzada. Las conocidas
como laminopatías progeroides se engloban dentro de este grupo de
patologías y, mayoritariamente, se deben a defectos en el procesamiento de
la proteína de la envuelta nuclear, denominada lamina A. Esta proteína es
sintetizada como un precursor, la prelamina A, que debe sufrir una serie de
modificaciones post-traduccionales hasta dar lugar a la proteína madura. En
la última etapa de su procesamiento interviene la proteasa Zmpste24, cuya
participación se conoce desde hace más de una década gracias al trabajo del
laboratorio de Carlos López-Otín, de la Universidad de Oviedo. Entonces,
la generación de ratones deficientes en esta proteasa puso de manifiesto
la incompatibilidad de los defectos en el sistema Zmpste24/prelamina
A con el desarrollo normal del organismo. Más recientemente, estudios
realizados por el mismo grupo con este modelo murino han permitido el
desarrollo de nuevas terapias para combatir estas enfermedades. Dado
que el envejecimiento y el cáncer son procesos íntimamente relacionados,
el sistema Zmpste24/prelamina A podría estar también implicado en el
desarrollo tumoral. Sin embargo, la corta esperanza de vida de los ratones
50
XXXVII Congreso SEBBM
deficientes en Zmpste24 en relación al tiempo de desarrollo de los procesos
tumorales ha dificultado el abordaje de esta cuestión.
El presente trabajo, surgido de la colaboración entre los laboratorios de
López-Otín y Juan Cadiñanos, del Instituto de Medicina Oncológica y
Molecular de Asturias, y enmarcado dentro del proyecto de tesis doctoral de
Jorge de la Rosa, ha permitido estudiar la implicación de este enzima y su
sustrato en el cáncer. Para ello se generaron ratones mosaico de Zmpste24,
en los que aproximadamente la mitad de las células del organismo carecen
de esta proteasa y, por tanto, acumulan prelamina A. Sorprendentemente,
estos ratones son fértiles y no experimentan síntomas de envejecimiento
acelerado, pese a que las células con prelamina A persisten en proporciones
similares a las células normales. En consecuencia, resultan prometedores
tanto el desarrollo de terapias génicas y celulares como el suplemento de
factores sistémicos para el tratamiento de estas enfermedades. Asimismo,
la esperanza de vida normal de estos ratones permitió estudiar la relevancia
del sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer. La aplicación de distintos
protocolos de carcinogénesis en ratones mosaico y ratones control permitió
observar que los primeros presentaban un menor número de tumores
infiltrantes. Igualmente, el silenciamiento de ZMPSTE24 en distintas células
tumorales humanas redujo significativamente su capacidad invasiva. Estos
resultados sugieren por primera vez que la proteasa ZMPSTE24 podría ser
una diana antitumoral.
P03. Biología del desarrollo
P03-1
Single-enhancer KO to study the formation
of the epaxial musculature during mouse
embryonic development
Macarena López Mayorga1, Natalia Moncaut2, Maria Rosa Giráldez
Perez1, Lydia Teboul3, Cristina Bernal Lozano1, Ana Castro Cañal1,
Jaime Carvajal García-Valdecasas1
1
Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Sevilla, ES, 2The
Institute of Cancer Research , London, UK, 3MRC-Harwell,
Oxfordshire, UK
The determination and specification of skeletal muscle in vertebrates is
orchestrated by the myogenic regulatory factors Myf5, Mrf4, MyoD and
Myogenin. Myf5 is the first to be expressed in the embryo, initiating and
co-ordinating the myogenic cascade. In absence of Myf5, progenitors
fail to be specified at the correct time but activation of MyoD rescues the
phenotype and myogenesis progresses. Myf5/MyoD KO animals lack all
skeletal muscles.
Myf5 transcription is controlled by over 25 regulatory elements which
drive expression in a specific spatiotemporal manner. Although their
contribution to the expression pattern is well defined we still lack an
understanding on the role of the different subpopulations of muscle
progenitor cells. Furthermore, there is still no connection between the
spatiotemporal activation of Myf5 and its function within a particular set
of myogenic precursors. The Early Epaxial Enhancer (EEE) operates in the
dermomyotomal dorsomedial lip and is the first enhancer to activate Myf5.
In order to address these questions we have generated a new enhancer-
specific KO strain in which the EEE has been targeted. By RNA-seq, we
have identified three gene-networks that show clear differences between the
WT and KO embryos; two of these networks are involved in myogenesis.
qPCR has been used to validate the data and preliminary analyses of the
expression patterns of some of the genes in these networks also confirms
these findings. Crucially, we have crossed this new allele into the MyoD KO
strain and show that in the absence of MyoD rescue, specific back muscles
are lost or severely reduced, resulting in severe scoliosis of the spine.
We are now in the process of identifying all the muscle groups that may
be affected in this double KO as this will allow us to generate a map of the
musculature that originates from the dorsomedial lip of the dermomyotome.
Granada 2014
P03-2
Adhesion to the Fibronectin synergy site could be
critical for platelet function
María Benito Jardón, Joaquín Lilao Garzón, Mercedes Costell
Rosselló
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universitat de
Valencia, Burjassot, ES
Fibronectin (FN) is a core component of many extracellular matrices
(ECM) where it regulates a variety of cell activities through direct
interactions with integrins. The fibrillar organization of FN precedes
the assembly of other ECM proteins. FN fibrillogenesis is a cell driven
process that requires integrins, which bind the RGD motif in the 10th
type III module (FNIII10). The RGD motif can bind αvβ3 and α5β1 on
mesenchymal cells and αIIbβ3 integrins on platelets. While the RGD site
is sufficient for αvβ3 to bind and assemble FN, it has been claimed that
α5β1 also requires residues in the flanking module (FNIII9), called synergy
site, for FN binding and fibrillogenesis. Aimed at studying the role of the
synergy site in vivo, we generated a mouse strain in which key residues of
the synergy site were mutated (FNSyn mice). Surprisingly, FNSyn mice
are born without apparent phenotype indicating that this site is not essential
for α5β1 binding during embryogenesis. However, a slight increase in the
tail bleeding time and a pronounced delay in skin wound closure suggest
a critical role of the synergy site for platelet and skin cell adhesion to FN.
To eliminate a potential compensatory effect of αvβ3 integrins, we crossed
the FNSyn mice with a mouse strain lacking the expression of β3 integrins.
The β3 integrin-null mice suffer from a Glanzmann-like thrombasthenia,
a bleeding disorder that was exacerbated in the double mutants. About
87% of β3 integrin-null mice are born and of those around 20% will die
in the following weeks. However, when mice lack β3 integrins as well as
the FN-synergy site the 96,2% succumb before E17.5 (151 mice analyzed
at E17.5-P21) of severe hemorrhages and a failure to separate blood and
lymphatic vessels. These findings demonstrate that β3 integrins only
partially compensate the lack of a functional FN-synergy site. We are
currently testing how the synergy site promotes adhesion and will discuss
these results and the implications for human hemostasis at the meeting.
P03-3 (R03-19-1)
Developmental origin of the coronary
endothelium. Of elephants and blind men
Ramón Muñoz-Chápuli
Universidad de Málaga, Málaga, ES
The developmental origin of the coronary endothelium has been the matter
of a debate in recent years. The classical view of a sprouting of the coronary
arteries from the aortic root was abolished 30 years ago by the evidence of
a “coronary ingrowth”, i.e. a primary coronary capillary plexus appears in
the subepicardium, surrounds the truncus arteriosus and finally connects
with the aortic lumen. The question then was the origin of the subepicardial
capillary plexus. Different hypothesis have been postulated to explain this
origin, basically angioblasts migrating from the developing liver, outgrowth
of the sinus venosus endocardium, angiogenesis from the ventricular
endocardium or cells delaminating from the epicardium. This latter option
has been particularly controversial, since experimental evidence has been
provided either supporting or ruling out an epicardial contribution to the
coronary endothelium. We have studied coronary development in a number
of murine transgenic lines, and we have concluded that the embryonic and
the neonatal coronary endothelium is a mosaic of endocardial-derived and
epicardial-derived cells, in a ratio of about 3:1, receiving later a postnatal
contribution from circulating endothelial progenitors. As in the Indian
story of the elephant and the blind men, different reports had detected only
a part of the whole picture, attributing to the coronary endothelium a single
origin. The endothelial developmental heterogeneity could be relevant in
order to explain the existence of atherosclerotic lesion–prone sites in the
coronary arteries.
Pósters
P03-4
Dose dependent pitx2 loss of function impairs
zfhx3, wnt8a and calcium handling; novel links
to atrial arrhythmogenesis
Estefanía Lozano-Velasco1, Francisco Hernández-Torres1, Jorge
Domínguez Macías1, Leif Hove-Madsen2, Juan Cinca3, Amelia
Aránega Jiménez1, Diego Franco Jaime1
1
Departamento Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén,
ES, 2CSIC-ICCC, Barcelona, ES, 3Hospital Sant Pau, Barcelona, ES
Atrial fibrillation (AF) is the most common cause of arrhythmogenesis in
humans yet the genetic cause of AF remains elusive. Recent genome-wide
association studies (GWAS) have reported risk variants in four distinct
genetic loci (4q25, 1q21, 16q22 and 16q13) which have been associated
with AF. Among them, the most significant are 4q25 risk variants, which
are located in the vicinity of the PITX2 gene. Given the key developmental
role of Pitx2 during cardiogenesis and particularly its role in pulmonary
vein deployment, it has been postulated that Pitx2 dysfunction might be the
molecular link to AF.
Experimental evidences in distinct laboratories, including ours,
have demonstrated that Pitx2 loss of function predisposes to atrial
arrhythmogenesis. However, the molecular mechanisms driven by Pitx2
in this context remain somehow elusive, proposing either embryonic
or mature gene expression defects. In order to get further insights into
the molecular mechanisms driven by Pitx2 and their putative relation
with novel AF GWAS associated genes, we have generated a new Pitx2
conditional mouse line, by intercrossing Sox2Cre and Pitx2floxed mice.
Epiblast deletion of Pitx2 leads to the generation of heterozygous and
systemic null Pitx2 null mutants, respectively. As expected, embryonic
mortality and cardiac defects were similarly observed in Sox2CrePitx2 null
mice as those previously reported for Pitx2 knock-out mice.
Molecular analyses of the left atrial appendage in heterozygous
Sox2CrePitx2 mice (20-30% reduction in Pitx2 expression) and atrial-
specific NppaCrePitx2 null mice (60-70% reduction in Pitx2 expression)
demonstrate that AF GWAS associated genes such as Zfhx3, Kcnn3
and Wnt8a are severely impaired while other such as Cav1, Synpo2l or
Prrx1 are not. Surprisingly, beta-adrenergic signaling is not altered in
these models whereas multiple calcium handling genes such as Serca2a,
calsequestrin, phospholamban are severely impaired in atrial-specific
NppaCrePitx2 null mice but not in heterozygous Sox2CrePitx2 mice.
Functional assessment of calcium handling further underscores these
findings. Importantly, neither Zfhx3 nor Wnt8a gain-of-function or loss-
of-function experiments impairs Pitx2 expression, suggesting that Pitx2 is
upstream of these genes. Furthermore, these data suggest a dose–dependent
relation between Pitx2 expression and the susceptibility to display basal
or only inducible electrophysiological defects. We are currently studying
the hierarchical between Pitx2, AF GWAS associated genes and calcium
handling, as well as to putative involvement of post-transcriptional
modulators such as microRNAs.
P03-5 (R03-19-6)
Filopodia mediate Hedgehog transport
and signalling
Isabel Guerrero Vega
CSIC - UAM, Madrid, ES
The Hedgehog (Hh) signalling pathway is a highly conserved regulator
of patterning during development and homeostatic events in adult organs.
Hh also directs tissue-patterning acting as a morphogen. To signal in a
concentration dependent manner requires a graded distribution of Hh
from producer to receptive cells. During production, Hh undergoes two
lipid modifications resulting in a highly hydrophobic molecule with a
cholesterol tag at the C-terminal and a Palmitoylation at the N-terminal.
Hh lipid modifications are needed to achieve a graded distribution, but
constrains its extracellular movement, leading to debate about how Hh is
transported to target cells. We show that Hh and most of the extracellular
51
Pósters
components of the Hh signaling localize in filopodia-like structures
or cytonemes arising at the basolateral side of Drosophila wing disc
and abdomen epithelia. In vivo imaging, using actin reporters, and
membrane markers, such as the CD4 or the Hh co-receptor Ihog fused to
fluorescent tags, shows that these cytonemes are very dynamic and their
extension correlates spatially and temporally with the formation of the
Hh gradient. Mutant conditions for proteins required for actin dynamics
affect both cytoneme formation and Hh gradient extension. In addition,
in vivo vesicle-like structures are visualized moving along cytonemes
in anterograde direction. Immunoelectron microscopy also shows Hh,
the Hh co-receptor Ihog, and other Hh pathway components located in
extracellular vesicles of heterogeneous size (ranging from 50 to 250 nm)
at the Drosophila wing imaginal disc. These vesicles present Hh in the
outer side of the double membrane. Biochemical characterization of the
exosomal fraction of Drosophila cultured cells indicates the presence
of active Hh and co-receptor Ihog together with exosome markers.
Furthermore, RNA interference for genes necessary for production/
release of exovesicles has a direct effect over Hh secretion and signaling
in vivo and in vitro, indicating that Hh is transported in bonafide
exosomes. We propose that a Hh intracellular trafficking in the producing
cells allows Hh to be released in exosomes and cytonemes. In our view
this membrane anchored Hh dispersion could represent an advantage for
a lipid-modified molecules to be spatially regulated to form a gradient.
Furthermore, we show that this signaling mechanism based on cell-cell
contact is similar to the synaptic process in neuronal cells.
P03r-6
Caracterización del tejido linfoide asociado al
intestino en ratones SAMP8 propensos
al envejecimiento
Alba Garcia-Just1, Lluïsa Miró2, Anna Pérez-Bosque1, Concepció
Amat1, Miquel Moretó1
1
Departament de Fisiologia, Facultat de Farmàcia, Institut de
Nutrició i Seguretat Alimentària, Universitat de Barcelona,
Barcelona, ES, 2APC Europe, Granollers, Barcelona, ES
El envejecimiento es un proceso caracterizado por un incremento de
la susceptibilidad a determinadas enfermedades y patologías. En este
sentido, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) tiene un papel
fundamental en las funciones de barrera y de defensa frente a patógenos
externos. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar el
GALT en distintas etapas del desarrollo, en un modelo de ratones
senescentes, para su utilización futura en estudios de los efectos de la
dieta sobre indicadores mucosales (intestinales) de envejecimiento. Se
han utilizado ratones propensos al envejecimiento de la cepa SAMP8
y resistentes al envejecimiento acelerado (SAMR1). Se han obtenido
los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) y las placas de Peyer
(PP) del intestino delgado, a las 3 semanas, a los 4 y 9 meses. Se ha
realizado el recuento linfocitario de los dos tejidos y la cuantificación
de la actividad SA-β-galactosidasa (indicador de senescencia) por
citometría de flujo. Los ratones SAMP8 presentan una disminución del
peso de los GLM a los 4 y 9 meses, con una reducción significativa
del número de leucocitos respecto a los SAMR1 (69% y 57%,
respectivamente; p<0,05). En las PP, se observa una reducción del 35%
(p<0,05) pero sólo a los 9 meses de edad. En ambos grupos, la actividad
SA-β-galactosidasa de los linfocitos ganglionares aumenta con la edad,
siendo mayor en los ratones SAMP8 que en los SAMR1 (p<0,05).
Estos resultados demuestran que el envejecimiento se caracteriza
por una inmunosupresión en el GALT, que podría explicar la mayor
susceptibilidad a infecciones y patologías asociadas al envejecimiento.
Asimismo estos resultados sugieren que los ratones SAMP8 son un
buen modelo para el estudio de la senescencia.
52
XXXVII Congreso SEBBM
P03-7 (R03-19-3)
Spiracle formation and tissue remodeling
during Drosophila development: a vertex model
approach
Javier Argüello, Kai Dierkes, Arturo D’Angelo, Jerome Solon
Cell and Developmental Biology Group, Biomechanics of
Morphogenesis, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona,
ES
Strong efforts are being made to understand how large-scale tissue
movements emerge during morphogenesis. In this study, we analyze how
the development of spiracles in embryos of the fruit fly Drosophilacould
generate forces inducing tissue remodeling. High-resolution time-lapse
movies of tomato-E-cadherin and histone-RFP expressing embryos show
a simultaneous migration of spiracles and posterior epidermal cell layers
toward the posterior part of the embryo. To explain the mechanics of
this process, we discuss two different interplays of forces: (A) during its
development, spiracles push the tissue; (B) the tissue is originally moving
and pulls the spiracles.
The dynamics of the system is computationally simulated under both
conditions using a 2D vertex model that takes into account the surface
elasticity of cells, contractility of the acto-myosin cortex and adhesion
between neighbor cells, as well as the boundary conditions of pushing (A)
or pulling (B). Tissue movements within the simulations of the two different
cases (A and B) are then compared with the in vivo situation using Particle
Image Velocimetry (PIV). We show meaningful differences between the
simulations and the experimental evidences when the tissue is pulled, while
the pushing boundary condition generates a general movement close to in
vivo. Our work suggests that tissue flow is the consequence of pushing
forces generated during the formation of spiracles in Drosophila.
P03r-8
miRNAs 212 and 132 are involved in morphine
effects on cell proliferation through BDNF
regulation
Ada Jiménez González, Adrián García Concejo, Raquel E. Rodríguez
Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de
Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES
Morphine effects on cell proliferation in Central Nervous System
(CNS) have been studied over the last years. It is known that this drug
alters the proliferative cell expression patterns. In the present work, we
have analyzed whether morphine is triggering these changes in zebrafish
development through epigenetic factors such as miRNAs 212 and 132
and their involvement on BDNF expression. These miRNAs appear in the
same genetic cluster and have important roles through different pathways
on CNS development. To studied miRNA 132 levels during zebrafish
development, we performed qPCR in several developmental stages,
finding an increase and decrease of its levels along the development. We
also checked the effects of morphine and the involvement of miRNA 132 in
the opioid pathway by knocking down the mu opioid receptor, finding that
the levels of miRNA 132 changed between the control group and morphine
treated embryos. These results indicate that morphine is triggering its
proliferation effects through a different pathway than the one triggered
by the mu receptor. Futhermore, when we studied miRNA 132 in miRNA
212 morphants we found an increase in these levels, which suggests that
miRNA 132 is trying to balance the absence of miRNA 212. Besides, we
have found changes in BDNF protein expression levels in morphine treated
embryos and when the mu opioid receptor and miRNA 212 were knocked
down at 48 hpf. These results suggest that BDNF, an essential neurotrophin
for the correct development of the CNS, has an important role in the
mechanisms triggered by morphine, leading to a better understanding of the
influence of morphine in the mechanisms of pain and addiction processes.
Granada 2014
P03r-9
Changes in dopaminergic development in
zebrafish embryos after morphine exposure
mediated by miRNA-212 and miRNA-29a
Adrián García Concejo, Ada Jiménez González, Raquel E. Rodríguez
Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de
Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES
Several studies have shown that the levels of expression of miRNA-212
are modified after drug exposure, which may indicate a relation between
this molecule and the appearance of tolerance. In addition, miR-
29a has been related to Notch signaling, which is known to mediate
dopaminergic differentiation at the early stages of Central Nervous
System development. We have performed a study of the expression levels
of miR-212 during the normal development of zebrafish embryos, to
determine the stages in which this miRNA is more expressed. Our results
have shown that after morphine exposure the levels of microRNAs 29a
and 212 are altered, pointing to a relation between these two molecules.
To analyze a possible cross-talk between Notch and opioid signaling we
used DAPT, an inhibitor of the metalloproteases needed to activate this
pathway, and mindbomb mutants, where Notch pathway is disrupted, in
addition to oprm1 morphants (lacking opioid signaling). Our results show
that these two cascades are antagonic when influencing dopaminergic
differentiation. Using a luciferase assay, we have also demonstrated,
that miR-212 effectively represses oprm1 expression by interacting
with the 3’UTR of the mRNA. We hence proposed a mechanism by
which morphine is regulating the expression of mu opioid receptor and
inducing the appearance of tolerance. Finally, the expression patterns of
some dopaminergic markers, such asth, pitx3 and nurr1, were modified,
leading to a totally new pattern of expression, with all these genes being
expressed in the midline. The understanding of these mechanisms that
involve both signaling pathways could lead to unravel the initial stages
of the addictive process.
P04. Biología molecular computacional
P04-1 (R04-3)
Predicted structure and function of divergent
members of prokaryotic flavin adenine
dinucleotide synthetase (FADS) proteins
Inmaculada Yruela1, Patricia Ferreira2, Bruno Contreras-Moreira3,
Milagros Medina2
1
Estación Experimental de Aula Dei, Consejo Superior
de Investigaciones Científicas (EEAD-CSIC), Instituto de
Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza,
ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular,
Universidad de Zaragoza, Instituto de Biocomputación y Física de
Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, ES, 3Estación Experimental
de Aula Dei, Consejo Superior de Investigaciones Científicas
(EEAD-CSIC), Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas
Complejos (BIFI), Fundación ARAID, Zaragoza, ES
Flavin adenine dinucleotide synthetases (FADSs) are well-known as a
group of prokaryotic bifunctional enzymes that carry out the dual functions
of riboflavin phosphorylation to produce flavin mononucleotide (FMN)
and its subsequent adenylylation to generate FAD (hereafter FADS-type I).
An extensive bioinformatics survey using the available genomes in public
databases revealed that certain gram-positive pathogenic bacteria (i.e.
Listeria monocytonegens, Listeria welshimeri, Lactobacillus plantarum,
Bacillus cytotoxicus) and plant chloroplasts contain also variants of
FADS sequences, named FADS-type II and plant-like FADS, respectively.
Both variants of FADS proteins constitute distinct evolutionary classes
characterized by shorter and non-conserved C-terminal domains. The
Pósters
putative structures and functions of the C-terminal domains of the FADS-
type II from Listeria monocytonegens (LmFADS-typeII) and plant-like
FADS from Glycine max. have been investigated. Previous results pointed
out that the C-terminus domain of plant-like FADS proteins could contain a
catalytic activity (i.e. hydrolase or phophatase), but different to that of their
prokaryotic counterparts [1]. On the contrary, our recent investigations
suggest that the C-terminus domain of LmFADS-type II might be related
with the pathogenic activity of gram-positive bacteria, in particular with
the defence of bacteria against the lytic action of host lysozimes [2]. This
work is a contribution to our understanding of the evolutionary history of
FADS enzymes.
References
[1] I. Yruela, S. Arilla-Luna, M. Medina, B. Contreras-Moreira.
Evolutionary divergence of chloroplast FAD synthetase proteins (2010)
BMC Evol. Biol. 10:311.
[2] S. Leysen, L. Vanderkelen, S.D. Weeks, C.W. Michiels and S.V.
Strelkov. Structural basis of bacterial defense against g-type lysozyme-
based innate immunity (2013). Cell. Mol. Life Sci. 70:1113-1122.
P04-2 (R04-5)
Late-replicating heterochromatin fuels genome
evolution
Daniel Rico
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES
Asynchronous DNA replication of the genome has been associated
with different mutation rates and copy number variation (CNV) in
human populations. The late replication is generally associated to
heterochromatic regions that tend to suffer high replicative stress. CNVs
typically involve intermediate to large regions, providing a potential
substrate for the generation of new genes through gene duplication.
We have elucidated the possible relevance of the association of CNV
regions with later DNA replication times on gene birth and evolution.
Our analyses show that most human genes duplicated in the Primate
lineage are located in late replicating CNV regions. We have traced
the relationship between replication timing and the evolutionary age of
duplicated genes. Strikingly, we have found that the more recently a gene
has been duplicated the later it is replicated in human and mouse cells.
These results suggests that the currently active accumulation of CNVs
in late replicating regions has being also persistently and extensively
influencing genome evolution throughout animal history. We propose
a new evolutionary model [1] based on these observations in which
chromatin structure and replication dynamics conditions gene birth and
the rising of new protein functions.
References
[1] Juan,D. Rico, D, et al. (2013) Late-replicating CNVs as a source of new
genes. Biol Open, 2, 1402–1411.
P04-3
The human DNA damage response network
database of proteins
Eduardo Andrés León1, Ildefonso Cases2, Ana M. Rojas Mendoza1
1
Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario
Virgen del Rocio/CSIC/Universidad de Sevilla - Computational
Biology and Bioinformatics, Sevilla, ES, 2Genomics and
Bioinformatics Platform of Andalusia, Cartuja Scientific and
Technology Park INSUR Building, Sevilla, ES
The DNA damage response (DDR) is an essential signaling network that
protects the integrity of the genome. This network is built upon a repertoire
of distinct but often overlapping sub-networks, where sometimes the same
components have different roles in precise spatial and temporal scenarios.
Perturbations of this network produce genomic instability, which is
53
Pósters
inherently related to aging (Fernandez-Capetillo 2010), disease (Ciccia and
Elledge 2010), and cancer, reviewed in (Lukas, Lukas et al. 2011).
Despite its importance, evolutionary studies addressing the emergence of
this network were restricted to few protein families (On, Xiong et al. 2010).
In this line, we have recently provided the largest systematic analyses of
the human DDR network and have analysed its evolutionary properties
(Arcas, Fernandez-Capetillo et al. 2014).
To complement this study, we have built a resource to explore these data,
in an evolutionary context.
From this database, it is possible to select genes according with its function
in a particular pathway or network, according with post translational
modifications (PTMs) where the gene acts as a target or a modifier and also
by sequence similarity. When searching for PTMs, affected residues and
links to Pubmed articles are provided.
In this tool, it is easy to find DDR proteins that emerged at the same age,
or involved in same networks/pathways, and also affected by similar
PTM modifiers. When a DDR protein is selected, a detailed view displays
information regarding its emergence and conservation across 47 species,
the overall agreement with the taxonomic tree, and the position of a post-
translationaly modified residue in a structure when available.
This resource is available at: http://ddr.cbbio.es.
References
Arcas, A., O. Fernandez-Capetillo, I. Cases and A. M. Rojas (2014).
“Emergence and evolutionary analysis of the human DDR network:
implications in comparative genomics and downstream analyses.” Mol
Biol Evol 31(4): 940-961.
Ciccia, A. and S. J. Elledge (2010). “The DNA damage response: making it
safe to play with knives.” Mol Cell 40(2): 179-204.
Fernandez-Capetillo, O. (2010). “Intrauterine programming of ageing.”
EMBO Rep 11(1): 32-36.
Lukas, J., C. Lukas and J. Bartek (2011). “More than just a focus: The
chromatin response to DNA damage and its role in genome integrity
maintenance.” Nat Cell Biol 13(10): 1161-1169.
On, T., X. Xiong, S. Pu, A. Turinsky, Y. Gong, A. Emili, Z. Zhang, J.
Greenblatt, S. J. Wodak and J. Parkinson (2010). “The evolutionary
landscape of the chromatin modification machinery reveals lineage specific
gains, expansions, and losses.” Proteins 78(9): 2075-2089.
P04-4 (R04-6)
Bioinformatics approaches for personalized
cancer therapy: from Pan-Cancer projects
to Patient Derived Xenograft (PDX) models
Elena Piñeiro-Yañez, Héctor Tejero, Javier Perales-Patón, Fátima
Al-Shahrour
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES
The dawn of the age of personalized cancer treatment provides the promise
to identify the right drug for the individual that will greatly improve the
patient’s outcome. It is well known that cancer drugs work only in small
subset of patients. For many of these agents, there are putative markers of
response in the literature but very few are been used in clinical practice.
More importantly, new anticancer agents are targeted to specific cancer
genes and are expected to be effective only in tumors in which these genes
are mutated or otherwise abnormal.
The success of personalized treatment of cancer patients depends on
matching the most effective therapeutic regimen with the characteristics of
the individual patient, balancing benefit against risk of adverse events. The
primary challenge in achieving this goal is the heterogeneity of the disease,
recognizing that the majority of cancers are not single diseases but rather
an array of disorders with distinct molecular mechanisms.
High-throughput technologies such as next-generation sequencing have
the capacity to dissect this heterogeneity and now doing an unbiased
interrogation of the human genome, which allows strategies to search for
novel, previously unsuspected, biomarkers of drug response and afford
54
XXXVII Congreso SEBBM
opportunities to match therapies with the characteristics of the individual
patient’s tumor.
In our laboratory, we have focused on developing an integrative
bioinformatics approach to demonstrate the value in integrating genomic
and clinical data with available drugs, to refine and to improve therapeutic
strategies for cancer patients.
We present a multi-disciplinary integrative effort that will convert the
information contained in multidimensional genomic data into useful
biomarkers that can classify patient tumors by prognosis and to identify the
drivers of tumor behavior that are optimal targets for therapy.
P04-5 (R04-4)
Full-LengtherNext: Una herramienta para
caracterizar transcriptomas de organismos
no modelo
Pedro Seoane Zonjic1, Noé Fernandez-Pozo1, Darío Guerrero-
Fernandez2, Rocío Bautista2, M. Gonzalo Claros1
1
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 2Plataforma Andaluza
de Bioinformática, Centro de Supercomputación y Bioinfomática,
Edificio de Bioinnovación, Universidad de Málaga, Málaga, ES
Los estudios de transcriptomas ensamblados de novo en especies no
modelo carecen de secuencias genómicas que sirvan de referencia para
evaluar su calidad. Esta carencia impide, por ejemplo, distinguir con
claridad entre un transcrito correcto y uno artefactual, y tampoco permite
distinguir fácilmente entre polimorfismos y errores de ensamblaje. Por
otro lado, sin una referencia, también resulta difícil determinar el mejor
ensamblaje posible dentro de un conjunto dado, ni tampoco se puede saber
con precisión el porcentaje de transcritos encontrados respecto al total de
genes. Por otra parte, saber si se ha ensamblado un transcrito que puede
codificar una proteína completa es muy útil para los trabajos de laboratorio
posteriores. Por todo esto se ha desarrollado Full-LengtherNext con una
arquitectura capaz de hacer frente con eficacia y de forma escalable los
requisitos de análisis de posensamblaje de la NGS. Con este programa (1)
se clasifican los transcritos entre secuencias completas, N- o C-terminales,
e internas), (2) se reconstruye el marco abierto de lectura del transcrito
y se corrigen los posibles cambios de fase debidos al ensamblaje, (3) se
identifica el subconjunto de transcritos sin anotar que podrían codificar
proteínas nuevas propias de la especie en estudio, (4) se extraen algunos
posibles RNA no codificantes, (5) se comparan distintos ensamblajes
de novo de un transcriptoma para seleccionar el mejor, (6) se obtiene el
transcriptoma representativo más cercano al transcriptoma completo
teórico del organismo de estudio. Este programa ya ha sido usado con éxito
en los análisis de los transcriptomas de, por ejemplo, pino marítimo, olivo,
lenguado común y lenguado senegalés.
P04-6 (R04-2)
Supercomputing methods for macromolecular
crystallographic Ab Initio Phasing
Isabel Usón Finkenzeller
ICREA ; IBMB-CSIC, Barcelona, ES
Crystallographic analysis does not produce a direct image as in microscopy,
as only the diffracted intensities and not the phases of the scattered X-rays
are physically measurable. So far, in spite of its being computationally very
demanding, crystallography has largely turned its back on supercomputing.
Our group develops and implements crystallographic phasing methods
exploiting massive computing.
ARCIMBOLDO: from atomic resolution phasing[1] to a general ab initio
structure solution overcoming previous size and resolution barriers. Our
method enforces secondary structure rather than atomicity through a
combination of location of model fragments (alpha-helices) with PHASER
[2] and density modification with SHELXE [3]. The method has been
Granada 2014
called after the Italian painter Arcimboldo [4], who composed portraits
out of fruits and vegetables. While most collections of fragments remain a
“still-life”, but some are correct enough for density modification to reveal
the protein’s portrait.
BORGES takes the principle ones step further, by enforcing unspecific
tertiary -rather tan secondary- structure. Like in Borges’ “Library of Babel”,
the information we need is bound to be contained already in the PDB but
how to exploiting this information while the structure is still unknown? Our
characteristic vector (CV) formalism, developed to extract folds from the
PDB allows detailed analysis of local folds.
SUBIX: from a geometric solution of nucleic acids to the analysis
and prediction of packing and the information derived from packing
interactions.
References
[1] Sheldrick, Hauptman, Weeks, Miller & Usón. International Tables for
Macromolecular Crystallography vol. F, (eds., M.G. Rossmann and E.
Arnold) 333–345 (Boston, 2001).
[2] McCoy, et al. J. Appl. Crystallogr. 40, 658–674 (2007).
[3] Sheldrick. Z. Kristallogr. 217, 644–650 (2002).
[4] Rodríguez, Grosse, Himmel, González, M de Ilarduya. Becker,
Sheldrick & Usón Nature Meth. 6, 651–654 (2009).
[5] Sammito, Millán, Rodríguez, M de Ilarduya, Meindl, De Marino,
Petrillo, Buey, de Pereda, Zeth, Sheldrick & Usón. Nature Meth. 10, 1099-
1101 (2013).
P04-7 (R04-7)
The exocyst 3D architecture by live cell imaging
in yeast cells
Devos Damien
CABD, Sevilla, ES
The structural characterization of macromolecular complexes is central to
understand the mechanism of action of these assemblies and to pursue in the
search of new treatments for human diseases. Macromolecular complexes
can be composed of proteins, DNA, lipid, or any other molecules and
their combination. We use integrative structure modeling to solve the
structure of macromolecular complexes with important function in a cell.
In this talk, I will introduce a new method to solve the structure of multi-
protein complexes. We used fluorescent microscopy in live cell to solve
the structure of the exocyst. The structure reveals important structural,
functional and evolutionary features of this important complex in the
eukaryotic cell. This macromolecular modeling protocol has the potential
to reveal important aspects of multi-component complexes.
P04-8 (R04-1)
DNA: When computational chemistry meets
computational biology
Modesto Orozco
Institut for Research in Biomedicine, Barcelona, ES
DNA is the key molecule of life: an exquisite combination of chemical
simplicity and biological richness that has fascinated generations of
scientists. DNA is also the meeting point of chemistry and biology, and
the discovery of the structure of the DNA fiber more than 50 years ago
by Watson and Crick can be considered as the foundation of molecular
biology. For a theoretician, DNA is one of the greatest challenges, and
a textbook example of a multi-resolution and multi-physics problem. I
will summarize in my talk how we can use theoretical methods based
on solid physical principles to gain information on the biology of
DNA, how computational chemistry meets computational biology, and
how first principles can explain not only chromatin structure, but also
functionality.
Pósters
P05. Biomembranas y bioenergética
P05-1
Cross-talk between R513 methylation and S516
phosphorylation of the cardiac voltage-gated
sodium channel
Pedro Beltran Álvarez1, Ferran Feixas2, Sílvia Osuna2, Ramon
Brugada1, Sara Pagans1
1
Institut Investigació Biomèdica de Girona Dr. Josep Trueta,
Department of Medical Sciences School of Medicine, University of
Girona , Girona, ES, 2Institut de Química Computacional i Catàlisi
(IQCC) and Departament de Química, Universitat de Girona,
Campus Montilivi, Girona, ES
Introduction: we have previously provided the first evidence of arginine
methylation within the voltage-gated ion channel superfamily. R513,
R526 and R680 in the alpha subunit of the cardiac voltage-gated sodium
channel (Nav1.5) were found mono- or dimethylated [1]. The functional
relevance of Nav1.5 arginine methylation is underscored by the fact that
R513H, R526H and R680H are known Nav1.5 mutations causing sudden
cardiac death syndromes. Objectives of the current work: 1) to describe the
cross-talk between Nav1.5 arginine methylation and phosphorylation; and
2) to describe regulation of arginine methylation by mutations in residues
adjacent to R513 leading to cardiac disease.
Results: methylation and phosphorylation reactions were done in
vitro using PRMT3 and PKA, and synthetic peptides. Reactions were
monitored by MALDI-TOF. Phosphorylation of S516 completely inhibited
R513 methylation by PRMT3. Methylation of R513 reduced S516
phosphorylation rate by 4 orders of magnitude. Overall, our results suggest
an interdependence of Nav1.5 arginine methylation and phosphorylation [2].
The mutation G514C, which has been described in a patient with cardiac
conduction disease, blocked R513 methylation by PRMT3, but did not
change S516 phosphorylation rate in vitro. We speculate that G514C leads
to S516 hyperphosphorylation due to blockade of R513 methylation in vivo.
Conclusions: our work provides the first insights into how arginine
methylation of voltage-gated ion channels is regulated, the first evidence
of PKA inhibition by arginine methylation, and opens the door to
pharmaceutical intervention to balance methylation-phosphorylation
equilibria in Nav1.5 cardiopathological states.
References
[1] Beltran-Alvarez P, et al. J Proteome Res 2011.
[2] Beltran-Alvarez P, et al. In preparation.
P05r-2
How redox proteins form transient complexes in
photosynthesis and respiration
Blas Moreno-Beltrán1, Antonio Díaz-Quintana1, Katiuska González-
Arzola1, Alejandra Guerra-Castellano1, Adrián Velázquez-Campoy2,
Pedro M. Nieto3, Marcellus Ubbink4, Miguel A De la Rosa1, Irene
Díaz-Moreno1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Instituto de
Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad
de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3Instituto de Investigaciones Químicas,
cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 4Institute of
Chemistry, Leiden University, Leiden, NL
Protein complex formation is at least a two-step process in which the
formation of a final, well-defined complex entails the initial formation
of a dynamic encounter complex. The lifetime of the protein complex
is determined by the dissociation rate. Highly transient complexes, with
lifetimes on the order of milliseconds, exhibit moderate or low binding
affinities, with dissociation constants in the mM–mM range. Electron
55
Pósters
transfer (ET) reactions mediated by soluble redox proteins exchanging
electrons between large membrane complexes in photosynthesis and
respiration are excellent examples of transient interactions.
Here, experimental approaches based on dia and paramagnetic NMR
spectroscopy are combined with NMR restraint- or charge-driven docking
simulations to study the molecular recognition processes in ET complexes,
using the cyanobacterial Cf-Cc6 interaction in photosynthesis and the plant
Cc1-Cc adduct in respiration, as physiological model systems. Both ET
ensembles exhibit optimal coupling between the redox centers although
they might differ in their dynamic behavior. Needless to say that such an
integrative methodology opens new perspectives in our understanding of
the dynamic, transient adducts formed between proteins beyond the model
systems herein analyzed.
References
Díaz-Moreno et al. (2014) BBA – Bioenergetics doi: 10.1016/j.
bbabio.2014.03.009.
Moreno-Beltrán et al. Under review.
P05-3
Dos estrategias en la evolución de la
transferencia de electrones al fotosistema I:
diatomeas versus sistemas verdes
Manuel Hervás, Pilar Bernal-Bayard, Fernando P. Molina-Heredia,
Alejandro Torrado, José María Ortega, Leonor Puerto-Galán,
Mercedes Roncel, José A. Navarro
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de
Sevilla y CSIC, cicCartuja, Sevilla, ES
En algas verdes unicelulares y cianobacterias, la plastocianina (Pc) y el
citocromo c6 (Cc6) actúan como transportadores alternativos de electrones
entre los complejos de membrana b6f y fotosistema I (PSI) en fotosíntesis.
Sin embargo, en algas rojas y diatomeas el Cc6 actúa en general como único
transportador entre estos complejos. La reducción del PSI en eucariotas implica
la formación de un complejo transitorio inicial, que tiene que reorganizarse
hacia una configuración optimizada antes de la propia transferencia electrónica.
Sin embargo, comparada con los sistemas verdes (algas y plantas), la diatomea
Phaeodactylum presenta una menor eficiencia, tanto en la formación del
complejo como en la transferencia en sí, debido a que la intensidad de la
interacción electrostática entre el Cc6 y el PSI está atenuada respecto a las
fuertes propiedades electrostáticas de donadores y PSI en los sistemas verdes.
El paso de reajuste implica un conjunto preciso y específico de interacciones,
que se ven afectadas negativamente en reacciones cruzadas entre donadores
y PSI de diatomeas, algas verdes y plantas. Nuestros análisis cinéticos y
estructurales indican que la evolución en los dos grandes linajes fotosintéticos
eucariotas implicó cambios paralelos y complementarios en los donadores y
el PSI. En la línea evolutiva que conduce a las plantas superiores, una fuerte
interacción electrostática determina un intercambio lento del donador, lo
que limita la transferencia de electrones al fotosistema. En diatomeas, una
interacción electrostática más débil facilita, sin embargo, un intercambio más
rápido del Cc6, para dejar así paso a la unión de una nueva molécula donadora.
P05r-4
Membrane Association of Autophagy Proteins
LC3, GABARAP and GATE-16
Zuriñe Antón*1, Javier H. Hervás*1, Ane Landajuela1, L. Ruth
Montes1, José F. Rodríguez2, Félix M. Goñi1, Alicia Alonso1
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa,
ES, 2Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid, ES
Macroautophagy mediates the degradation of long-lived proteins
and organelles through the de novo formation of double-membrane
autophagosomes that sequester cytoplasm and deliver it to the vacuole/
56
XXXVII Congreso SEBBM
lysosome. Approximately 20 Atg (autophagy-related) proteins have
been identified in mammals that are essential in the initial stages of the
preautophagosomal structure (PAS) formation and autophagosome
elongation. Among them, the yeast ubiquitin-like system (Atg7, Atg3
and Atg8) is relatively well characterized. Several Atg8 homologues are
known in mammals, divided into the LC3 and GABARAP/GATE-16
subfamilies. It has been shown that LC3 membrane association is mediated
by the covalent attachment of LC3 to phosphatidylethanolamine (PE). The
resulting lipidated protein then drives autophagosome maturation steps
including cargo capture, growth and closure of the organelle, and lysosome
targeting or recognition. This protein-lipid covalent binding is essential
for autophagosome elongation, but its mechanism remains unknown.
In the present study, we have focused on the molecular mechanisms
by which LC3/GABARAP and GATE-16 conjugate with membranes
leading to autophagosome elongation. With this purpose, we have
performed experiments of protein-protein and protein-lipid interaction
using model membranes such as SUV (small unilamellar vesicles), LUV
(large unilamellar vesicles) and GUV (giant unilamellar vesicles). Both
mammalian ubiquitin-like system and PE-maleimide conjugated human
Atg8 homologs have been used. In order to obtain this information, circular
dichroism spectroscopy, sucrose gradient floatation, protein-lipid overlay
(lipid dot-blot), lipid monolayer experiments and vesicle aggregation
measurements have been carried out. The various proteins interact in
specific ways with membranes of different lipid compositions.
*Both authors have contributed equally in this work.
P05-5
Sphingosine induces the aggregation
of imine-containing peroxidized vesicles
Noemi Jimenez-Rojo, Ana R. Viguera, Alicia Alonso, Felix M. Goñi
Unidad de Biofisica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES
Lipid peroxidation plays a central role in the pathogenesis of many
diseases like atherosclerosis and multiple sclerosis. We have analyzed the
interaction of sphingosine with peroxidized bilayers in model membranes.
Cu2+ induced peroxidation was checked following UV absorbance at
245 nm, and also using the novel Avanti snoopers®. Mass spectrometry
confirms the oxidation of phospholipid unsaturated chains. Our results
show that sphingosine causes aggregation of Cu2+- peroxidized vesicles.
We observed that aggregation is facilitated by the presence of negatively-
charged phospholipids in the membrane, and inhibited by anti-oxidants e.g.
BHT. Interestingly, long-chain alkylamines (C18, C16) but not their short-
chain analogues (C10, C6, C1) can substitute sphingosine as promoters
of vesicle aggregation. Furthermore, sphinganine but not sphingosine-1-
phosphate can mimic this effect. Formation of imines in the membrane
upon peroxidation was detected by 1H-NMR and it appeared to be
necessary for the aggregation effect. 31P-NMR spectroscopy reveals that
sphingosine facilitates formation of non-lamellar phase in parallel with
vesicle aggregation. The data might suggest a role for sphingosine in the
pathogenesis of atherosclerosis.
P05r-6
Efecto dual de la secreción de cardiolipinas
en el alveolo
Alba de Lorenzo1, Olga Cañadas2, Belén García-Fojeda2, Cristina
Casals2
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad
Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid - CIBER
de Enfermedades Respiratorias, Madrid, ES
La cardiolipina (CL) es un fosfolípido aniónico de las membranas de
bacterias Gram negativas que también se encuentra en la membrana
mitocondrial interna de células eucariotas y desempeña un papel clave para
Granada 2014
la función e integridad estructural mitocondrial. Sin embargo, se ha descrito
que en pacientes con neumonía se produce la liberación de cardiolipina
mitocondrial al fluido alveolar, que puede alterar la función pulmonar [1].
Sin embargo, estudios recientes han indicado que fosfolípidos aniónicos
podrían presentar una acción inmunomoduladora beneficiosa en el pulmón
[2]. Nuestra hipótesis es que las CL liberadas al fluido alveolar en procesos
infecciosos e inflamatorios podrían tener un efecto perjudicial o beneficioso
en función de su concentración.
Los objetivos de este estudio han sido: 1) Estudiar el efecto de la CL humana
1`,3`-Bis-(1,2-dilinolenil-sn-glicero-3-fosfo)-sn-glicerol [(18:2)4-CL] en la
función tensoactiva del surfactante pulmonar; y 2) Determinar el umbral de
concentración a partir del cual este lípido presenta un posible efecto en la
respuesta inflamatoria de macrófagos al lipopolisacárido bacteriano (LPS).
Los resultados indican que concentraciones de (18:2)4-CL superiores al
6% molar relativo a los fosfolípidos del surfactante (~1 μmol/ml) alteran
significativamente la actividad de adsorción interfacial del surfactante
pulmonar. El mecanismo de inactivación reside en que (18:2)4-CL
incrementa la fluidez de las membranas de surfactante como se demuestra
por calorimetría diferencial de barrido y anisotropía de fluorescencia. En
contraste, nuestros resultados indican que concentraciones muy bajas de
cardiolipina (0.67 nmol/ml) bloquean la secreción de TNF-α, expresión de
iNOS y la fosforilación de Akt, MAPKs e ikBα en macrófagos alveolares
estimulados con LPS. Este efecto inmunomodulador de la cardiolipina
sucede tanto a nivel extracelular como intracelular.
En conjunto, los resultados indican que las cardiolipinas secretadas por el
huésped en procesos infecciosos podrían tener una acción dual, beneficiosa
o dañina para el huésped, en función de la concentración de este lípido en
el fluido alveolar.
Bibliografía
[1] Ray, N.B., L. Durairaj, B.B. Chen,…., and R.K. Mallampalli. Dynamic
regulation of cardiolipin by the lipid pump Atp8b1 determines the severity
of lung injury in experimental pneumonia. Nat Med, 16(10): 1120-7, 2010.
[2] Kuronuma K, Mitsuzawa H, Takeda K, Nishitani C, Chan ED, Kuroki Y,
Nakamura M, Voelker DR. “Anionic pulmonary surfactant phospholipids
inhibit inflammatory responses from alveolar macrophages and U937 cells
by binding the lipopolysaccharide-interacting proteins CD14 and MD-2.”
J Biol Chem. 284(38):25488-24500,2009.
P05r-7
How phosphorylation affects Cytochrome c
structure and function
Alejandra Guerra-Castellano1, Blas Moreno-Beltrán1, Javier López-
Prados2, Francisco Rivero-Rodríguez1, Pedro M. Nieto2, Adrián
Velázquez-Campoy3, Antonio Díaz-Quintana1, Miguel Ángel De la
Rosa1, Irene Díaz-Moreno1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Instituto de
Investigaciones Químicas, cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC,
Sevilla, ES, 3Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas
complejos, BIFI, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES
Post-translational modifications of proteins stand out as regulatory
mechanisms for the majority cell metabolic processes. One of the most
usual modifications is phosphorylation, which alters the physical features
of proteins and affects their interactions with other proteins.
Cytochrome c (Cc) phosphorylation relates to some pathological situations,
such as ischemia or cancer [1]. Cc acts as an electron carrier in the
mitochondria. Under oxidative stress conditions, it promotes Programmed
Cell Death (PCD). Both functions are regulated by phosphorylation of the
residues Thr, Ser and Tyr at positions 28, 47 and 48, respectively [2-4].
Since the specific Cc-phosphorylating kinases are still unknown, we have
made three phosphomimetic mutations. Two of them replace Thr28 and Ser47
by Asp. To mimic Tyr48 phosphorylation, we resorted to the evolved tRNA
technique by replacing the Tyr48-encoding triplet for an AMBER codon.
Then, we incorporated a non-canonical amino acid (p-carboxymethyl-L-
Pósters
phenylalanine, pCMF) that emulates phosphotyrosine, with the help of a
tRNA specific for the AMBER stop codon. These mutations induce drastic
changes not only on the redox potential, dynamics and stability of Cc, so
affecting its biological function.
References
[1] Hüttemann M et al. Adv. Exp. Med. Biol. (2012) 748, 237-264.
[2] Yu, H et al. Biochim. Biophys. Acta (2008) 1777, 1066-1071.
[3] García-Heredia, JM et al. J. Biol. Inorg. Chem. (2011) 16, 1155-1168.
[4] Zhao et al. Mol. Cell. Proteomics. (2011) 10, 1-14.
Work supported by JAE Programme (JaePre_2011_01248), ESF 2007-
2013, Andalusian Government (CVI-BIO198), Ministry of Economy and
Competitiveness (BFU2009-07190 and BFU2012-31670), European
Bio-NMR Project (2012-2013) BIO-NMR-00130 and the Centro de
Investigación Tecnología e Innovación (CITIUS).
P05-8
Amyloid-membrane interactions revealed
by model lipid vesicles
Cristina Fernández, Mercedes Jiménez, Germán Rivas, Rafael
Giraldo
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES
We have recently reported that engineering RepA-WH1, a bacterial
DNA-toggled protein conformational switch (dWH1→WH1) sharing
some analogies with nucleic acid-promoted PrPc→PrPSc replication [1],
constitutes a suitable synthetic model system to study protein amyloidosis
in bacteria [2, 3]. Although amyloidogenesis has been the focus of intense
research, the origin of the amyloid toxicity remains unclear. One proposed
mechanism of cytotoxicity is lipid membrane permeabilization.
In this work we have studied the aggregation of the bacterial RepA-WH1
prionoid in the presence of cytomimetic model systems (large and giant
unilamellar lipid vesicles, LUVs, and GUVs respectively) [4]. Confocal
microscopy images of protein encapsulated into GUVs show association
and aggregation of the protein preferentially to lipid vesicles containing
acidic phospholipids. We have also observed that RepA-WH1 elicits
membrane disruption using a dye release assay on LUVs [5]. The extent
of leakage was dependent on protein concentration.We have been able
to directly measure the process of membrane permeation and leakage by
time-elapsed imaging of dye filled GUVs upon the addition of protein. This
process is fast and over the course of the experiment most of the vesicles
remain intact, suggesting the assembly of defined pores by RepA-WH1.
This model system has allowed us to test several compounds that have been
described to modulate amyloid formation. Knowledge of the effect of the
RepA-WH1 prionoid on membrane integrity, will provide insight into the
basis for cell death caused by amyloid proteins.
References
[1] Silva et al. Trends Biochem. Sci. 2008; 33(3):132-140.
[2] Giraldo, et al. Prion 2011; 5:60-64.
[3] Fernández-Tresguerres, et al. Mol Microbiol. 2010; 77:1456-1469.
[4] Butterfield and Lashuel. Angew Chem Int Ed. 2010; 49:5628-5654.
[5] van Rooijen, et al. Biochim. Biophys. Acta 2009;1788:1271-1278.
P05-9
Permeabilización de membranas fosfolipídicas
por el lipopéptido liquenisina
Antonio Ortiz, Jonathan R. Coronel, José A. Teruel, Francisco J.
Aranda
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de
Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES
Se ha aislado una liquenisina de los medios de cultivo de Bacillus
licheniformis. Nuestra liquenisina consiste en un lipopéptido formado
57
Pósters
fundamentalmente por una porción hidrofílica con un anillo peptídico
de siete aminoácidos (Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Ile), y una porción
hidrofóbica constituida por un β-hidroxiácido graso de 14-16 átomos de C.
Esta estructura le confiere un marcado carácter anfipático. Se ha observado
que liquenisina permeabiliza membranas modelo de POPC induciendo
la liberación de la sonda fluorescente carboxifluoresceína. Esta acción
está modulada por la composición de la membrana, tanto de fosfolípidos
(como fosfatidiletanolamina), o esteroles como el colesterol. Estos efectos
son evidentes a concentraciones bastante inferiores a la cmc, y sugieren
la formación de estructuras agregadas del lipopéptido en la bicapa que
podrían comportarse como poros de permeabilización selectiva. Por otra
parte, en estudios con eritrocitos humanos se ha visto que liquenisina es
capaz de causar la hemólisis, también a concentraciones por debajo de su
cmc. A partir de estudios cinéticos comparativos, se ha observado que la
salida de iones K+ de los eritrocitos precede a la salida de la hemoglobina
y, además, la hemólisis se puede evitar de modo eficaz mediante la adición
a la solución externa de protectores osmóticos de tamaño igual o superior
a 32 Å. Las evidencias indican que la hemólisis inducida por liquenisina
sigue un mecanismo de tipo coloide-osmótico, que implica la formación de
poros de membrana, en el sentido más amplio del término. Estos resultados
ayudan a establecer una base molecular para la función biológica de
liquenisina.
P05r-10 (R05-4)
Targeting myeloid cells with liposomal
nanocarriers for therapeutic purposes
Jon Ander Nieto-Garai1, Susana Benet2, Maria Pino2, Eneritz
Bilbao1, Itziar Erkizia2, Julia G. Prado2, Javier Martinez-Picado3,
Nuria Izquierdo-Useros*2, Maier Lorizate*1
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco,
Leioa, ES, 2AIDS Research Institute IrsiCaixa, Badalona, ES,3AIDS
Research Institute IrsiCaixa and ICREA, Badalona, ES
We have recently discovered the mechanism followed by HIV-1 to
enter mature dendritic cells (mDCs) and infect bystander CD4+T cells
in lymphoid tissues, which relies on Siglec-1 (CD169) cell receptor
recognition of sialyllactose exposed on HIV-1 membrane gangliosides.
Here, we aimed to engineer stable nanoliposomes mimicking HIV-1 to
target Siglec-1 expressed on mDCs and other myeloid cells for therapeutic
compound delivery to key anatomical sanctuaries.
Fluorescent POPC nanoliposomes were prepared with increasing
concentrations of sialyllactose-containing gangliosides GM1 and GM3.
Nanoliposomes stability assays and further characterization were performed
using fluorimetric determination and quasi-elastic light scattering based
size determination. Siglec-1+ mDCs and activated monocytes were
exposed to the same concentration of nanoliposomes and capture was
analyzed with FACS or confocal microscopy. Statistical differences were
determined using a paired t-test.
Fluorescent nanoliposomes containing GM1 or GM3 specifically targeted
mDCs and activated monocytes with equal efficiency as fluorescent HIV-1
viral like particles. Ganglioside nanoliposomes were retained within the same
intracellular sac-like compartment where HIV-1 accumulates. Conversely,
nanoliposomes devoid of gangliosides where not stored. An increase of
the ganglioside content in the liposome formulation leads to an improved
capture efficiency in a dose dependent manner. Nanoliposome specificity
for Siglec-1 was demonstrated by blocking capture with two specific mAbs
against Siglec-1 (P≤.0007) or with soluble sialyllactose (P≤.004).
We have developed a stable nanoliposome formulation with a potent
and specific capacity to target Siglec-1 expressing myeloid cells. This
technology could be crucial for delivering small therapeutic molecules to
lymphoid tissues.
Funding: amfAR Mathilde Krim Fellowship 108676-55-RKRL.
*Dual Seniorship
58
XXXVII Congreso SEBBM
P05-11
Short-chain sphingolipids preferentially insert
into tumor cell membranes and promote
chemotherapeutic drug uptake
Dalila Ciceri1, Lilia R. Pedrosa2, Félix M. Goñi1, Gerben A. Koning2,
F.-Xabier Contreras1
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco,
Leioa, ES, 2Laboratory Experimental Surgical Oncology Section
Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus Medical Center,
Rotterdam, NL
Insufficient drug delivery into tumor cells severely limits the therapeutic
efficacy of chemotherapy. Co-delivery of liposome-encapsulated drug
and synthetic short-chain sphingolipids (SCS) greatly improves drug
bioavailability by enhancing intracellular drug uptake. However, whether
SCS insert preferentially into tumor cells and the molecular mechanisms
used by those lipids to improve drug uptake is still mysterious. Here, we
show that SCS have high affinity for tumor cells and that upon insertion
those lipids have specific membrane remodeling activities that favor
drug binding and uptake. We found in a set of in vivo experiments that
external addition of new clickable SCS analogues either in free form or
in a liposomal formulation show more affinity for tumor cells than for
healthy ones. Furthermore, biophysical experiments show that SCS have
membrane-remodeling properties. Transbilayer lipid distribution of lipids
by SCS at one side of the membrane has been monitored using a pyr-
SM analogue. External addition of SCS in organic solution to preformed
plasma membrane like liposomes induces transbilayer lipid motion of pyr-
SM within the membrane. Our results demonstrate how SCS are likely to
function on drug delivery, preferentially inserting into tumor cells, and
subsequently altering the biophysical features of cell membranes leading to
transitory membrane packaging imperfections that trigger amphiphilic drug
uptake. Our assays validate the usage of SCS in liposomal chemotherapy
to promote cell-specific targeting, tumor cell membrane remodeling and
finally drug release.
P05-12
Gene knockout of the coupling proteins in
pIP501 and CloDF13 plasmids
Itziar Alkorta1, Marina Garcia-Moreno1, Itxaso Álvarez-Rodríguez1,
Ines Probst2, Christina Steck2, Elisabeth Grohmann2
1
University of the Basque Country, Department of Biochemistry and
Molecular Biology (UPV/EHU) and Biophysics Unit (CSIC, UPV/
EHU), University of the Basque Country, Leioa, ES, 2Albert-Ludwigs
University Freiburg, Institute of Biology II, Microbiology, Freiburg,
DE
Type IV secretion systems (T4SSs) are bacterial multiprotein complexes
specialised in the transfer of proteins or DNA-protein complexes across
cell membranes. They are essential for conjugation, bacterial-induced
tumour formation in plant cells, toxin secretion, cell-to-cell translocation
of virulence factors, and intracellular activity of mammalian pathogens. By
enabling conjugative DNA delivery, these systems contribute to the spread
of antibiotic resistance genes among bacteria. The secretion substrates range
from single-stranded DNA/ protein complexes to multicomponent toxins.
They are assisted by integral membrane coupling factors, the multimeric
type IV coupling proteins (T4CPs), which connect the macromolecular
complexes to be transferred with the secretory conduit.
Enterococcus faecalis and the other from CloDF13, a multi-resistance
plasmid from Enterobacter cloacae. Knock-out of the T4CP gene of pIP501
will be performed by a novel gene disruption method for E. faecalis. For
pIP501, the knock-out will be tested in conjugation assays with different E.
faecalis strains, for CloDF13 between different E. coli strains. To exclude
polar effects of the knock-out on downstream genes in the T4SS operon
complementation will be performed by cloning the respective wild type gene
in trans on a vector compatible with pIP501 and CloDF13, respectively.
Granada 2014
P05-13
Modulation of the plasma membrane localization
and activation of PKCalpha by fatty acids
treatment
Senena Corbalan Garcia, Teresa Coronado-Parra, Dolores Perez-
Sanchez, Ruben Lopez-Nicolas, Juan C Gomez-Fernandez
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de
Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES
Protein Kinase C (PKC) is a family of serine/threonine phosphotransferases
that participate in a wide variety of cellular processes that are crucial
in tumor progression. Among them, proliferation, migration, invasion
and survival of cancer cells. Many studies have demonstrated these
isoenzymes are involved in cancer due to changes in their expression
and phosphorylation levels. Unfortunately, no specific PKC modulators
to address the clinical needs have been found to date. In this work we
studied the effect of several fatty acids (OA, DHA and EPA) on cell
localization, migration and catalytic activation of PKCa. Both OA and
DHA increased the catalytic activity of the enzyme. The use of several
mutants that abolished the C2 or C1 domains function revealed that the
C2 domain was essential for activation, while the C1 domain played
a less relevant role. In cell experiments were performed in two breast
cancer cell lines: one from adenocarcinoma non-invasive (MCF-7) and
the other from a highly bone metastatic (MDA-MB-231). The three fatty
acids induced the translocation of PKCa from the cytosol to the plasma
membrane and increased its co-localization with actin filaments. In
addition, we demonstrated that OA and DHA reduced the cell migration
capacity and induced apoptosis in both cell lines, effects that increased
when PKCa was down-regulated by specific siRNA, suggesting that the
enzyme plays critical roles in the migration and survival processes in
breast cancer cells.
P05-14
Two photon fluorescence microscopy of
GUV discloses unprecedented liquid domain
segregation behavior in cholesterol-enriched lipid
bilayers
Pablo Carravilla, Félix M. Goñi, José Luis Nieva, Jose Requejo-
Isidro, Nerea Huarte
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES
Fluorescence microscopy imaging of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)
has been extensively used to investigate lateral segregation of liquid
microdomains. However, the general application of this approach is
hampered by artifactual light-induced domain formation. Here, we
show that this problem can be circumvented by performing two photon
fluorescence measurements of Laurdan-labeled GUVs, which also
provide quantitative information on the level of molecular order in
each domain by means of the Generalized Polarization function (GP).
To explore domain segregation in the absence of photooxidation, we
have determined Laurdan fluorescence and order degree in raft-standard
ternary mixtures of egg sphingomyelin (eSM)/ dioleoyl-sn-glycero-
3-phosphocholine (DOPC)/cholesterol (Chol). Our most relevant
observation is that lateral segregation into microscopic Lo-Ld domains
is never observed with eSM:Chol mole ratios lower than 1. Below this
ratio the membrane average order level depends mainly on the eSM
content and no co-existence is observed. In addition, by determining the
order levels under coexistence conditions we infer that the maximum
cholesterol content in Lo domains is attained with eSM:Chol ratios of
ca. 2:1. These observations point to eSM as the main determinant of
macroscopic lipid platform formation in these mixtures.
Pósters
P05-15 (R05-8)
Perifosine modulates autophagy in human tumor
cells
José M Jiménez-López1, Pablo Ríos-Marco1, Marisol Fernández-
Ortiz1, Miguel García-González2, Josefa L Segovia1, Carmen Marco1,
María Paz Carrasco Jiménez1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology I. Faculty of
Sciences. University of Granada, Granada, ES, 2Universitary School
“La Inmaculada Concepción”.University of Granada, Granada, ES
Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of
various cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines.
APLs have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic,
however their exact mechanisms of action on cell death and other
inhibitory pathways are unknown. In this work, we show that perifosine, as
representative APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3-
II in HepG2 and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An
increase in autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with
both autophagy stimulation and block in the late stages of autophagy. To
discriminate whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells
resulted from induction of autophagy or decreased autophagic flux, we
performed assays in the presence of chloroquine to block autophagy by
inhibiting lysosomal proteases and preventing autophagosome-lysosome
fusion. We observed that perifosine treatment produces an alteration in
autophagic flux in both cell lines. We detected moreover that blockade of
autophagy at the level of the autophagosome-lysosome fusion does not
modify apoptotic cell death induced by perifosine in both cell lines. We
conclude that modulation of autophagy process is emerging as new target
for cancer therapy.
This research was aided by the Junta de Andalucía (P11-CVI-7859).
P05-16 (R05-7)
Pancreatic cancer cell glycosylation regulates cell
adhesion and invasion through the modulation of
α2β1 integrin and E-cadherin function
Rosa Peracaula Miró1, Sònia Bassagañas1, Sandra Carvalho2, Ana
M. Dias2, Joan Figueras3, Marta Pérez-Garay1, M. Rosa Ortiz3, Celso
A. Reis2, Salomé S. Pinho2
1
Universidad de Girona, Girona, ES, 2Institute of Molecular
Pathology and Immunology of the University of Porto (IPATIMUP),
Porto, PT, 3Hospital Universitario Dr. Josep Trueta, Girona, ES
In our previous studies we have described that ST3Gal III transfected
pancreatic adenocarcinoma Capan-1 and MDAPanc-28 cells show
increased membrane expression levels of sialyl-Lewis x (SLex) along with
a concomitant decrease in α2,6-sialic acid compared to control cells. Here
we have addressed the role of this glycosylation pattern in the functional
properties of two glycoproteins involved in the processes of cancer cell
invasion and migration, α2β1 integrin, the main receptor for type 1 collagen,
and E-cadherin, responsible for cell-cell contacts and whose deregulation
determines cell invasive capabilities. Our results demonstrate that ST3Gal
III transfectants showed reduced cell-cell aggregation and increased invasive
capacities. ST3Gal III transfected Capan-1 cells exhibited higher SLex and
lower α2,6-sialic acid content on the glycans of their α2β1 integrin molecules.
As a consequence, higher phosphorylation of focal adhesion kinase tyrosine
397, which is recognized as one of the first steps of integrin-derived signaling
pathways, was observed in these cells upon adhesion to type 1 collagen. This
molecular mechanism underlies the increased migration through collagen
of these cells. In addition, the pancreatic adenocarcinoma cell lines as
well as human pancreatic tumor tissues showed colocalization of SLex and
E-cadherin, which was higher in the ST3Gal III transfectants. In conclusion,
changes in the sialylation pattern of α2β1 integrin and E-cadherin appear to
influence the functional role of these two glycoproteins supporting the role of
these glycans as an underlying mechanism regulating pancreatic cancer cell
adhesion and invasion.
59
Pósters
P05-17 (R05-3)
Translation of molecular geometry into membrane
fission
Anna Shnyrova1, Eva Rodríguez Hortelano1, Juha-Peka Mattila2,
Sandra L. Schmid2, Sergey A. Akimov3, Vadim A. Frolov4
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa,
ES, 2Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center,
Dallas, TX, US, 3A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry
and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow,
RU, 4Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco;
IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Leioa, ES
Membrane fission constitutes an essential part of the dynamic life of
cellular membranes. Proteins implicated in this process are designed
to promote high membrane curvature and localized rupture of the
membrane monolayers, both hallmarks to membrane fission. The
localized action of the fission proteins is almost without exceptions
based upon the shallow membrane insertion (membrane wedging)
resulting in disruption of the lipid monolayer continuity at protein
length scale. Such deformation produced by an individual protein,
however, is limited and do not spread far from the protein itself. Thus,
larger-scale coordination of many deformations is needed in order to
effectively remodel the lipid bilayer and induce its fission. We show
here how protein complexes implement seemingly universal and
topology independent strategy to coordinate their membrane-disrupting
action during the fission process. Briefly, creation of a protein ring-like
complex with membrane insertions leads to a local constriction of the
membrane and to a coordinated membrane wedging, that “decouple”
the membrane deformations on both sides of the ring. Consequently,
ring-like rupture of one monolayer of the constricted membrane creates
additional degree of freedom that critically helps the lipid bilayer to adapt
to the geometry imposed by the constricting ring. As a result, critical
membrane curvature stress can be translated into local destabilization
of lipid monolayer (far from the ring, not at the ring) leading to non-
leaky physiological fission. This “boundary” action might constitute a
general principle of translation of molecular geometry of proteins into
bulk membrane remodeling. Thus, the proposed mechanism can be
crucially important for membrane biogenesis in cells.
P05-18
Specific interaction with cardiolipin triggers
functional activation of dynamin-related protein 1
Itsasne Bustillo-Zabalbeitia1, Sylvie Montessuit2, Etienne Raemy2,
Gorka Basañez1, Jean-Claude Martinou*2, Oihana Terrones Urio*1
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de
Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2Department of
Cell Biology, University of Geneva, Sciences III, Ginebra, CH
Dynamin-Related Protein 1 (Drp1), a large GTPase of the dynamin
superfamily, is required for mitochondrial fission in healthy and apoptotic
cells. Drp1 activation is a complex process that involves translocation
from the cytosol to the mitochondrial outer membrane (MOM)
and assembly into rings/spirals at the MOM, leading to membrane
constriction/division. Similar to dynamins, Drp1 contains GTPase (G),
bundle signaling element (BSE) and stalk domains. However, instead
of the lipid–interacting Pleckstrin Homology (PH) domain present in
the dynamins, Drp1 contains the so-called B insert or variable domain
that has been suggested to play an important role in Drp1 regulation.
Different proteins have been implicated in Drp1 recruitment to the
MOM, although how MOM-localized Drp1 acquires its fully functional
status remains poorly understood. We previously found that Drp1 can
interact with pure lipid bilayers enriched in the mitochondrion-specific
phospholipid cardiolipin (CL). Building on our previous study, we now
explore the specificity and functional consequences of this interaction.
60
XXXVII Congreso SEBBM
We show that a four lysine module located within the B insert of Drp1
interacts preferentially with CL over other anionic lipids. This interaction
dramatically enhances Drp1 oligomerization and assembly-stimulated
GTP hydrolysis. Our results add significantly to a growing body of
evidence indicating that CL is an important regulator of many essential
mitochondrial functions.
*Dual senior autorship.
P05-19
Structure and lipid specificity support
adaptation of pestivirus p7 C-terminal helix to
permeabilizing secretory compartments
Eneko Largo1, Antonio Alcaraz2, Nerea Huarte1, Vicente M.
Aguilella2, Manuel V. Borca3, José L. Nieva1
1
Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU) and Biochemistry and Molecular
Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU),
Bilbao, ES, 2Laboratory of Molecular Biophysics, Department of
Physics, Universitat Jaume I, Castelló, ES, 3Plum Island Animal
Disease Center, Greenport, US
Classical swine fever virus (CSFV) protein p7 possesses two hydrophobic
domains intervened by a short polar loop, predicted to span the membrane
as a helix-turn- helix hairpin. Here, we use a combined lipid monolayer,
planar bilayer and vesicle analysis to characterize the insertion and
permeabilization of membranes by constituent CSFV p7 helices. Structural
data and the dependence on lipid composition of these processes support
that the C-terminal helix is a poreforming protein adapted to permeabilizing
membranes of the secretory compartments or mitochondria. Together with
the observed pH-dependence and inhibition pattern, our data suggest that
CSFV p7 relies on genus-specific structures-mechanisms to perform its
viroporin function.
P05-20 (R05-6)
La proteína L-plastina está implicada en el
reclutamiento de NKG2D a balsas lipídicas y en
la migración de células NK mediada por NKG2D
Esther Serrano Pertierra1, Eva Cernuda-Morollón1, Tomas Brdicka2,
Václav Horejsi2, Carlos López-Larrea3
1
Servicio Neurología, Hospital Universitario Central de Asturias,
Oviedo, ES, 2Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences
of the Czech Republic, Praga, CZ, 3Servicio de Inmunología,
Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, ES
Las balsas de membrana son microdominios de la membrana plasmática
que desempeñan múltiples funciones biológicas. La implicación de estas
estructuras en la biología de células T, principalmente en la transducción
de señales mediada por TCR, ha sido ampliamente estudiada. Sin
embargo, se conoce menos sobre el papel de las balsas de membrana
en la señalización por receptores de células NK. Hemos estudiado
la distribución del receptor activador NKG2D en las balsas lipídicas
mediante el aislamiento de DRM por gradiente de densidad de sacarosa o
mediante fraccionamiento por solubilidad selectiva a beta-octilglucósido
en la línea celular NKL. Hemos encontrado que el complejo NKG2D-
DAP10 y pVav se reclutan a estas balsas tras la activación del receptor. El
análisis proteómico cualitativo mostró que el citoesqueleto de actina está
implicado en este proceso. En particular, hemos visto que la L-plastina,
proteína que une filamentos de actina, juega un papel importante en el
reclutamiento de NKG2D a las balsas lipídicas. Además, la activación del
receptor inhibidor NKG2A afecta parcialmente el reclutamiento a estos
dominios. Por otra parte, también hemos demostrado que la L-plastina
participa en la inhibición mediada por NKG2D de la quimiotaxis de
células NK.
Granada 2014
P05-21 (R05-5)
Dimerization of the transmembrane domain
regulates the function of p75 neurotrophin
receptor
Irmina García-Carpio1, Kirill Nadezhdin2, Sergey Goncharuk2, Konstantin
Mineev2, Eva Fernandez1, Alexander Areseniev2, Marçal Vilar1
1
Neurodegeneration Unit. UFIEC-ISCIII, Majadahonda, Madrid, ES,
2
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the
Russian Academy of Sciences, Moscú, RU
p75 neurotrophin receptor (p75 NTR), is best known for its role in mediating
neuronal cell death during development or after injury but it also regulates
cell proliferation, axon guidance or survival. p75 forms disulphide-linked
dimers through the Cys257 in the transmembrane domain and that it is
essential for NGF mediated signaling. Here we demonstrate that p75 use two
different interfaces of dimerization; one promoted by Cys257 and the other
by a motif of the form AxxxG. Our functional and structural data reveals
the key role that plays the Cys257 in p75 dimer assembly, redistribution
and activation of the receptor. We propose the transmembrane domain of
p75 as a new target domain to inhibit receptor function.
P05-22 (R05-2)
The multiple faces of caveolin in the
endoplasmic reticulum: from fat storage
to the integrity of mitochondria
Albert Pol Sorolla
IDIBAPS (CELLEX), Barcelona, ES
La caveolina (CAV) es un componente esencial de las caveolas,
invaginaciones ricas en colesterol de la membrana plasmática de la mayoría
de nuestras células. Sin embargo, la función de las CAV no está restringida
a la superficie celular, las CAV se asocian dinámicamente con orgánulos
intracelulares como el retículo endoplasmático (RE), el aparato de Golgi,
o los endosomas. Este transporte intracelular de CAV regula la distribución
intracelular de lípidos, ya que las CAV unen colesterol y ácidos grasos con
gran afinidad. En este contexto hemos demostrado dos funciones de CAV1
en el RE: i) regula los niveles de colesterol en las membranas mitocondriales,
su fluidez y la eficiencia de la cadena respiratoria y ii) regula la acumulación
de lípidos neutros en la bicapa del RE para generar los cuerpos lipídicos
y proporcionar energía durante la regeneración del hígado. La ausencia de
CAV1 provoca un desajuste en la distribución intracelular de lípidos con
importantes consecuencias metabólicas y patológicas para células y animales.
P05-23
Alteration of protein and lipid moieties
in a dysfunctional lung surfactant from alveolar
proteinosis
Mercedes Echaide Torreguitar, Carolina Ballester Lopez, Jesus
Perez-Gil
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad
Complutense de Madrid, Madrid, ES
Pulmonary Alveolar Proteinosis (PAP) is a rare disease characterized by an
accumulation of pulmonary surfactant at the alveoli and terminal airways.
Several studies have shown that THIS pathology is associated with an excess
of surfactant lipids and altered proteins. However, it is not clear how each of
the surfactant components contribute the most to the dysfunctional behavior of
this surfactant. In the current work, surfactant from a patient with Pulmonary
Alveolar Proteinosis (P) has been analyzed and compared with respect to
composition and functional behavior of porcine native surfactant (NS).
Compositional analysis by Western Blot revealed the presence of surfactant
protein aggregated forms. Moreover, the protein to phospholipid ratio was
26 times higher in P than in functional NS. An abnormal lipid composition
was also detected by Thin Layer Chromatography and further analysis
Pósters
showed an excess of cholesterol, resulting in a cholesterol to phospholipid
ratio 6 times higher than in NS.
Functional analysis using the Captive Bubble Surfactometer (CBS) showed
the incapacity of PAP surfactant films to reduce to low enough values the
surface tension at the air-liquid interface. NS and P were subjected to a
LH20 chromatography to obtain the protein, phospholipid and cholesterol
fractions separately. Thus, different combinations of these fractions with
the corresponding fractions of NS were analyzed in the CBS. The P Protein
fraction reconstituted into NS lipids showed an inefficient adsorption and
dynamic behavior, meaning that PAP-associated SP-B and SP-C were
dysfunctional. On the other hand, the excess of cholesterol also showed
a contribution to this impaired behavior, as seen in samples containing the
fully active protein and phospholipid complements of NS but the altered
neutral lipid fraction of P. The exacerbated amount of cholesterol in P
surfactant likely alters the structure and mechanical properties of surfactant
layers rendering them dysfunctional.
P05-24
Molecular function of isolated Ca2+-dependent
gating rings
Roger Gimeno-Llobet, Teresa Giráldez Fernández
Departamento de Ciencias Biomedicas, Facultad de Medicina,
y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias (CIBICAN),
Universidad de La Laguna, Tenerife, La Laguna, ES
In some Ca2+- regulated ion channels and transporters, ion binding is sensed by
a large C-terminal intracellular region, where eight Regulator of Conductance
for K+(RCK) domains form a “gating ring”. In the large conductance Ca2+
and voltage regulated channel (BK), it has been proposed that Ca2+ binding
expands the gating ring, and the large movement of the gating ring would
physically pull and open the gate located at the pore domain. Calcium binding
to this region reduces the energy required to open the channel, but the exact
mechanism underlying this process is still uncertain. Using patch-clamp
recordings and simultaneous measurements of fluorescence energy transfer
between CFP and YFP variants of the green fluorescent protein, our group
has shown that Ca2+ binding produces large structural changes that are not
obligatorily coupled to the opening of the pore of the BK channel (Miranda et
al PNAS 2013 110:5217). These results are in contrast with structural studies
of isolated gating rings, where large rearrangements are not observed after
Ca2+ binding. It is possible that the apparent discrepancy is due to involvement
of other regions of the channel in the gating ring movement. We have now
characterized the molecular function of isolated gating rings, using fluorescent
fusion proteins expressed in mammalian cells.
P05-25 (R05-1)
TRPA1 channels are membrane sensors of
bacterial endotoxins
Victor Meseguer1, Yerandy Alpizar2, Sendoa Tajada3, Enoch Luis1,
Carlos Fernández-Peña1, Tatiana Kichko4, Peter Reeh4, María Teresa
Pérez-García3, José Ramón López López5, Thomas Voets2, Carlos
Belmonte1, Karel Talavera2, Félix Viana1
1
Instituto de Neurociencias de Alicante UMH-CSIC, San Juan
de Alicante, ES, 2KULeuven, Leuven, BE, 3Instituto de Biología
y Genética Molecular (IBGM), Universidad de Valladolid-CSIC,
Valladolid, ES, 4Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen-Nürnberg,
DE, 5Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM), Universidad
de Valladolid- CSIC, Valladolid, ES
TRPA1 is a member of the transient receptor potential (TRP) family of
cationic channels, expressed in nociceptive sensory terminals of primary
sensory neurons. TRPA1 shows polymodal activation by physical (e.g.
temperature and mechanical stretch) and chemical stimuli. Recently,
TRPA1 has emerged as a key chemosensor for many natural and industrial
chemical irritants. In addition, TRPA1 responds to reactive oxygen species
61
Pósters
and reactive aldehydes. Activation of TRPA1 produces pain, release of
neuropeptides and inflammation.
Gram(-) bacterial infections are generally accompanied by inflammation and
pain. These symptoms are generally attributed to sensitization of nociceptors
by inflammatory mediators released by immune cells (e.g. monocytes and
macrophages) through activation of the Toll-like-receptor 4 (TLR4) signaling
pathway by lipopolysaccharide (LPS), a toxic byproduct of bacterial lyses.
Unexpectedly, we found that LPS exerts fast, membrane delimited, excitatory
actions on TRPA1. Activation of TRPA1 by different forms of LPS correlates
with the structure of lipid A, the lipid component of the LPS moiety.
Moreover, we found that pain and acute pathophysiological vascular
reactions, including neurogenic inflammation (CGRP release) caused by
LPS are primarily dependent on TRPA1 channel activation in nociceptor
terminals. The identification of TRPA1 as molecular determinant of LPS
effects opens novel avenues for the treatment of symptoms caused by
Gram(-) bacterial infections and offers new insights into the pathogenesis
of pain and neurovascular responses during bacterial infections.
P05-26
Perifosine modulates autophagy in human tumor
cells
J.M. Jiménez-López1, P. Ríos-Marco1, M. Fernández-Ortiz1, M.
García-González2, J.L. Segovia1, C. Marco1, M.P. Carrasco1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Faculty of
Sciences, University of Granada, Granada, ES, 2Universitary School
“La Inmaculada Concepción”, University of Granada, Granada, ES
Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of various
cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines. APLs
have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic, however
their exact mechanisms of action on cell death and other inhibitory pathways
are unknown. In this work, we show that perifosine, as representative
APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3-II in HepG2
and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An increase in
autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with both autophagy
stimulation and block in the late stages of autophagy. To discriminate
whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells resulted from
induction of autophagy or decreased autophagic flux, we performed assays
in the presence of chloroquine to block autophagy by inhibiting lysosomal
proteases and preventing autophagosome-lysosome fusion. We observed
that perifosine treatment produces an alteration in autophagic flux in both
cell lines. We detected moreover that blockade of autophagy at the level of
the autophagosome-lysosome fusion does not modify apoptotic cell death
induced by perifosine in both cell lines. We conclude that modulation of
autophagy process is emerging as new target for cancer therapy.
This research was aided by the Junta de Andalucía (P11-CVI-7859).
P06. Bioquímica de la nutrición
P06r-1
Las semillas de tomate: una fuente oculta
de alérgenos
Laura Martín-Pedraza1, Miguel González2, Juan Carlos López-
Rodríguez1, Eva Batanero1, Rodrigo Barderas1, Miguel Blanca3,
Rosalía Rodríguez1, Mayte Villalba1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad
Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Laboratorio de Investigación,
IBIMA, Hospital Regional Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES,
3
UGC Alergia, IBIMA, Hospital Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES
62
XXXVII Congreso SEBBM
La alergia a alimentos es un problema de salud en los países desarrollados
que afecta a un 5% de la población. Provoca síntomas graves e inesperados
y es causa frecuente de anafilaxia. En adultos los alimentos vegetales
inducen el mayor número de reacciones de hipersensibilidad, y la mayoría
de sus alérgenos pertenecen a unas pocas familias de proteínas, entre las
que destacan las cupinas y las prolaminas.
Algunos de los problemas diagnósticos de estas alergias radican en la
presencia de alérgenos específicos en ciertas partes del fruto, como las
semillas. El poder diagnóstico de estas moléculas se ve diluido cuando se
utiliza el extracto completo, el cual es una mezcla compleja del fruto. Este
es el caso de las semillas de tomate, que son una fuente rica en proteínas de
reserva suponiendo un 80% del total.
Los objetivos del presente trabajo son detectar los alérgenos reconocidos
por las IgE de pacientes alérgicos a las semillas de tomate, con síntomas
graves como anafilaxia o angioedema, o leves como urticaria o síndrome de
alergia oral, e identificarlos mediante inmunodetecciones con anticuerpos
policlonales y con sueros de pacientes.
Los extractos se han cromatografiado en HPLC y los picos obtenidos se
han analizado en PAGE-SDS mediante tinción con Azul de Coomassie y
tras transferencia a membranas con sueros. La unión de IgE a una banda
de 10 kDa es mayoritaria en pacientes con síntomas graves de anafilaxia y
angioedema, mientras que bandas de mayor masa molecular (35-60 kDa)
son asociadas a síntomas leves.
El uso de extractos bien definidos de cada tejido y la identificación de los
alérgenos implicados permitirá determinar el patrón de sensibilización
de cada paciente con mayor precisión y evitar los falsos negativos que se
obtienen en las pruebas cutáneas.
P06r-2 (R06-4)
Cardiotrophin-1 up-regulates apelin secretion
and gene expression in 3T3-L1 adipocytes
Miguel López Yoldi1, Matilde Bustos2, María Asunción Romero
Lozano2, J Alfredo Martínez1, Jesús Prieto2, María Jesús Moreno
Aliaga1
1
Department of Nutrition, Food Science and Physiology, Centre
for Nutrition Research, Faculty of Pharmacy, University of Navarra
- CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn),
Instituto de Salud Carlos III, Pamplona, ES, 2Area of Hepatology
and Gene Therapy, Center for Applied Medical Research (CIMA),
University of Navarra, Pamplona, ES
Introduction: Cardiotrophin-1 (CT-1) is a member of the IL-6 family
of cytokines. A recent study of our group has revealed that CT-1 is a key
regulator of glucose and lipid metabolism. Apelin is an adipokine that
stimulates glucose utilization and insulin sensitivity in obese and insulin-
resistant mice. The aim of the present study was to analyze the potential
effect of CT-1 on apelin production in adipocytes.
Methods: Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were incubated with
different concentrations (1-40 ng/mL) of recombinant protein CT-1 (rCT-
1) or IL-6 (20 ng/mL) for 18 hours. Apelin mRNA expression levels were
determined by quantitative real-time PCR. The measurement of apelin
secretion to the medium was quantified by ELISA. The phosphorylation
levels of p-Akt (Ser-473) and p-ERK 1/2 (Thr 202/Tyr 204) as well as
total AKT and ERK protein levels were analyzed by Western blot. Specific
inhibitors were used to characterize if these pathways were involved in the
actions of CT-1 on apelin production.
Results: rCT-1 treatment (18 h) significantly increased apelin gene
expression and secretion in 3T3-L1 adipocytes in a concentration dependent
manner. In parallel, rCT-1 (20 ng/mL) induced the phosphorylation of
ERK and AKT in adipocytes. Pre-treatment with the PI3K inhibitor,
LY294002, completely blocked the stimulatory action of CT-1 on apelin
gene expression.
Conclusion: The present data demonstrate the ability of rCT-1 to stimulate
apelin synthesis and/or secretion in adipocytes and suggest that these
effects are probably mediated by PI3K/AKT pathway.
Granada 2014
P06-3 (R06-1)
Acción moduladora de marcadores
cardiovasculares y de obesidad de café verde
y yerba mate
Laura Bravo Clemente, Sara Martínez López, Raquel Mateos,
Beatriz Sarria
ICTAN-CSIC, Madrid, ES
El café es ampliamente consumido en todo el mundo, mientras que
la yerba mate es muy popular en países Sudamericanos, aunque su
consumo se está extendiendo. Ambas bebidas tienen un rico contenido en
compuestos fenólicos derivados de los ácidos hidroxicinámicos, así como
metilxantinas, siendo la cafeína la más abundante. El café verde presenta
una mayor concentración de estos compuestos bioactivos en comparación
con el clásico café tostado. En este estudio se quiso conocer los efectos
en marcadores cardiovasculares y de obesidad del consumo regular de un
producto de café mezcla de verde y tostado (35:65) y de yerba mate en una
población normocolesterolémica (n=25) y otra hipercolesterolémica (HC,
n=27). Se llevó a cabo un estudio cruzado, aleatorizado y controlado en
hombres y mujeres de entre 18-45 años, no fumadores, no vegetarianos,
con un IMC=18-25 kg/m2, que tomaron el café, mate o agua (control) tres
veces al día, durante 8 semanas, restringiéndose el consumo de ciertos
alimentos ricos en polifenoles. Al principio y final de cada intervención
se tomaron muestras de sangre y se controló la presión arterial (PA)
y frecuencia cardiaca (FC), se hizo un estudio antropométrico y los
participantes rellenaron un registro dietético de 72 horas y cuestionario de
actividad física. Se analizó el perfil lipídico y la proteína C reactiva (PCR)
mediante autoanalizadores, así como citoquinas pro- y anti-inflamatorias,
quimioquinas, moléculas de adhesión, adipoquinas y hormonas mediante
ensayos Multiplex. Los resultados se analizaron mediante un modelo
general de medidas repetidas y test de Bonferroni dentro de cada grupo
(SPSS, v. 19.0).
Ambas bebidas, redujeron FC y PA, especialmente en los sujetos HC, en
los que también se observó una disminución en los niveles de colesterol
total, VLDL-C y triglicéridos. Tras la intervención con café los voluntarios
disminuyeron su peso corporal, así como el porcentaje de grasa corporal
(por bioimpedancia); con el mate se observaron las mismas tendencias
aunque las diferencias no fueron significativas. Con ambas bebidas se
observó una ligera menor ingesta de proteína y, en el caso del mate, también
de grasas y energía. El consumo de café dio lugar a un descenso en los
niveles de grelina, leptina, inhibidor de la activación de plasminógeno-1
(PAI-1), resistina y PCR en ambos grupos de estudio.
P06-5 (R06-7)
Suplementación dietaria con aceite de rosa
mosqueta (Rosa rubiginosa) y prevención de la
esteatosis hepática inducida por una dieta alta
en grasa: participación de PPAR-alfa y ACOX
Gladys Tapia Opazo1, Sergio Rodriguez1, Gladys Tapia1, Pamela
Romanque Ulloa1, Amanda Despessailles Tapia1, Alejandra Espinosa
Escalona2, Camila Dossi Muñoz1
1
Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, CL,
2
Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Medicina, Universidad
de Chile, Santiago, CL
El elevado aporte dietario de ácidos grasos ω-6 en relación a los ácidos
grasos ω-3, genera alteraciones en la salud cardiovascular y hepática,
dentro de las patologías crónicas no transmisibles. Por otro lado, el
pescado, rico en ácidos grasos ω-3, es de bajo consumo en Chile, siendo
necesario buscar otras fuentes alternativas de estos ácidos grasos, como
lo son aceites con un alto contenido del ácido alfa linolénico, precursor
de los ácidos grasos ω-3, eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico
(DHA). Tanto EPA como DHA son activadores del factor de transcripción
PPAR-α, el cual regula la expresión del gen que codifica para la proteína
prolipolítica, ACOX. Este trabajo evaluó la prevención de la esteatosis
Pósters
hepática mediante suplementación con aceite de rosa mosqueta (RM)
rico en ácido alfa linolénico, que se biotransforma en EPA y DHA. Para
ello, ratones macho C57BL/6J (n=5-9 por grupo experimental) fueron
alimentados con una dieta: a) control (10% lípidos, 20% proteínas y 70%
de carbohidratos) y b) alta en grasa (60% lípidos, 10% proteínas y 30%
carbohidratos) con o sin suplementación dietaria diaria con aceite de
RM (Coesam, Chile). La dieta y la suplementación con aceite de RM
se mantuvieron por 12 semanas. Se determinó la esteatosis hepática
(histología) y los niveles de PPAR-α (RT-PCR) y de ACOX (RT-PCR).
Los resultados mostraron que los animales que fueron alimentados con
dieta alta en grasa y suplementados con aceite de RM: i) presentaron una
histología hepática normal y una disminución significativa en los niveles
de esteatosis hepática evaluada por el porcentaje de células con gotas
lipídicas, respecto al grupo que sólo recibió la dieta alta en grasa (ANOVA
unifactorial, seguida del Test de Newman Keuls); y ii) disminuyeron en
forma significativa el contenido de grasa abdominal, respecto a aquellos
que sólo recibieron la dieta alta en grasa. La prevención de la esteatosis
hepática se acompañó de un aumento en los niveles hepáticos del mRNA
de PPAR-α y ACOX. Se concluye que la administración dietaria de un
aceite rico en ácido alfa linolénico previene la esteatosis hepática lo
cual podría estar relacionado al aumento en los niveles de PPAR-α y de
ACOX.
FONDECYT 1140547.
P06-6
Efecto de la suplementación dietética con
proteínas de plasma bovino en la prevención
de alteraciones de la mucosa intestinal
en un modelo de colitis
Lluïsa Miró1, Anna Pérez-Bosque2, Mònica Maijó2, Javier Polo1,
Miquel Moretó2
1
APC Europe, Granollers, Barcelona, ES, 2Departament de
Fisiologia, Facultat de Farmàcia; Institut de Nutrició i Seguretat
Alimentària, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES
En estudios previos se ha demostrado que la suplementación dietética
con proteínas plasmáticas reduce la respuesta inflamatoria intestinal en
modelos de inflamación aguda. La mucosa intestinal contiene mucinas
y TFF3, con funciones de protección y reparación tisular. El objetivo de
este trabajo es analizar dichas variables en ratones KO que carecen del
gen mdr-1 y desarrollan colitis de forma espontánea, y evaluar el efecto
de la suplementación dietética con inmunoglobulinas de plasma bovino
(IPB). Los ratones KO y los correspondientes controles recibieron una
dieta control o bien una dieta suplementada con 2% IPB desde el día 21
(destete) hasta el día 56. Se realizó un estudio histológico para establecer
el índice histopatológico así como el recuento de las células caliciformes
de la mucosa del colon. También se determinó por RT-PCR la expresión
de mucinas MUC1 y MUC4 (transmembrana), MUC2 (secretora) y del
TFF3. Los ratones KO presentaron un mayor índice histopatológico que
los controles y la suplementación con IPB redujo en parte estos efectos.
En los animales KO se observó un aumento de la expresión de MUC4 (4
veces) y de MUC1 (6 veces, ambas P<0,05), menor expresión de MUC2
y TFF3, que se redujo en un 80% y un 50%, respectivamente (P<0,05)
y un menor número de células caliciformes. La suplementación con
IPB atenuó los cambios en la expresión de las mucinas transmembrana
y del TFF3 sin modificar la MUC2 y restauró la población de células
secretoras de moco. Los resultados indican que la suplementación con
IPB restablece la función protectora de la mucosa intestinal, modulando
la expresión de mucinas y reduciendo las alteraciones histológicas de la
colitis.
Financiado por el proyecto TRACE 2009 0317 (Ministerio de Economía y
Competitividad, España).
63
Pósters
P06r-7
Efecto del ácido maslínico, un triterpeno
pentacíclico natural, sobre lesiones
preneoplásicas inducidas en colon de rata
Glòria Lozano-Mena, Marta Sánchez-González, M. Emília Juan,
Joana M. Planas
Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i
Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES
El ácido maslínico es un triterpeno pentacíclico presente en distintos
vegetales habituales en la dieta mediterránea. Estudios previos han
demostrado su actividad antiproliferativa y proapoptótica en la línea
celular de cáncer de colon HT-29. Con el fin de confirmar su actividad
quimiopreventiva in vivo, se ha usado un modelo de cáncer de colon en
rata inducido por 1,2-dimetilhidrazina (DMH). El agente carcinógeno se
inyectó semanalmente por vía intraperitoneal (20 mg/kg), mientras que el
ácido maslínico se administró por vía oral a las dosis 5, 10 y 25 mg/kg
durante 49 días. El colon se dividió en los segmentos proximal, medial
y distal, que se fijaron con formalina antes de la observación de lesiones
preneoplásicas al microscopio óptico. La tinción de azul de metileno
permitió el recuento de focos de criptas aberrantes (FCA), mientras que
la tinción de diaminas y hierro/azul alciano se usó para el recuento de
focos con depleción de mucinas (FDM), indicativas de un mayor grado
de displasia. Además, se determinó la concentración de ácido maslínico en
contenido de colon para establecer una correlación con el efecto observado.
El ácido maslínico no redujo el número de FCA en colon total, que fue
de 158±20, 189±15, 184±17 y 160±18 en los grupos DMH i DMH-ácido
maslínico a las tres dosis, respectivamente. En todos los grupos se observó
la misma distribución de FCA, siendo mayor en los segmentos medial y
distal. Tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas
en el recuento de FDM, que fue de 28±5, 33±6, 34±10 y 35±12 en colon
total. En conclusión, el ácido maslínico a la tres dosis ensayadas no evita la
aparición de lesiones preneoplásicas inducidas por DMH en ratas.
Financiado por AGL2009-12866 del MEC y 2009-SGR-00471 de la
Generalitat de Catalunya.
P06-8
Preventive effect of low molecular-weight
proanthocyanidins on metabolic syndrome
parameters
Zara Pons, Susana Suárez-García, Aleix Ribas-Latre, Francisca
Isabel Bravo, Aïda Pascual-Serrano, Manuel Suarez, Cinta Bladé,
Gerard Aragonès, Lluis Arola, Anna Arola-Arnal, Begoña Muguerza
Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili,
Tarragona, ES
The importance of metabolic syndrome (MS) is rising due to its increasing
prevalence worldwide. For that reason, a great effort is being directed
to prevent the development of MS. In this regard, the use of functional
foods is highly recommended. A good animal model to study MS is the
cafeteria (CAF) fed rat, no only because it reproduces the MS but also
because it shares the pathogenesis of the human disease. On the other hand,
proanthocyanidins have been previously described to cause beneficial
health effects in most of the components of MS and in cardiovascular risk
factors.
In this study, male wistar rats were fed CAF or standard (ST) diet for 12
weeks. Additionally, CAF fed rats were treated with different doses of low
molecular weight grape seed proanthocyanidins extract (LM-GSPE) (25,
100 and 200 mg/Kg/day; n=10) or vehicle, and the ST rats were given
vehicle (n=10). Body weight, waist perimeter, blood pressure and food
intake were measured weekly. Plasmatic parameters were checked at 7th,
10th and 12th week of experiment.
The animals fed with CAF diet presented raised body weight, waist perimeter
and blood pressure compared to ST rats. LM-GSPE decreased blood pressure
64
XXXVII Congreso SEBBM
in a dose response manner. CAF treated rats had decreased body weight and
waist perimeter at the 7th and 8th week of experiment at doses of 100 and 200
mg/Kg/day. Differences in food and liquid intake were found for diet, but not
due to treatment. Plasma triglycerides and total cholesterol were elevated in
CAF rats compared to ST rats. A decrease in total cholesterol was found for
the highest doses of LM-GSPE in 7th and 10th weeks and a decrease in plasma
triglycerides with the lower doses at 12th week was observed.
Grape seed proanthocyanidins have a clear antihypertensive effect,
preventing the rise of blood pressure due to the CAF diet. Body weight
and waist perimeter were slightly modified by the treatments. In addition,
a clear effect on plasma cholesterol was described. Therefore, LM-GSPE
could be a promising candidate for functional foods due to the improvement
observed in most of MS components.
P06-9
Efectos de la suplementación prolongada con
ácidos grasos omega-3 en un modelo de sordera
progresiva
Raquel Martínez Vega1, Teresa Partearroyo2, Néstor Vallecillo3,
Gregorio Varela-Moreiras2, Isabel Varela-Nieto1, María A. Pajares1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”
(CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 761, CIBERER , Madrid, ES,
2
Departamento de Ciencias Farmacéuticas y de la Salud, Facultad
de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Boadilla del Monte,
Madrid, ES, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”
(CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 761, CIBERER , Madrid, ES
Los ácidos grasos poli-insaturados omega-3 (PUFAs) son nutrientes
muy conocidos por sus efectos beneficiosos en el desarrollo cognitivo
y su mantenimiento, regulando la inflamación, el estrés oxidativo y la
sensibilidad a insulina, entre otros parámetros asociados al envejecimiento
(1). Los niveles insuficientes de ácido docosahexaenóico (omega-3) se
han asociado con trastornos neurológicos, vasculares, y con la pérdida
auditiva asociada a la edad (ARHL) en el hombre (2). Se ha demostrado
la existencia de una relación directa entre ARHL y niveles plasmáticos
elevados de homocisteína (pHcy)(3). Por el contrario, la relación entre
ARHL y altos niveles plasmáticos de PUFAs resulta ser inversa (4). En el
presente estudio hemos utilizado ratones C57BL/6J y una suplementación
prolongada con omega-3 para evaluar su impacto en la capacidad auditiva,
los niveles de Hcy, el estrés oxidativo y la inflamación.
Ratones de dos meses de edad fueron alimentados con dieta control o
suplementada con omega-3 durante 10 meses. La capacidad auditiva de los
animales fue evaluada mensualmente mediante ABR y DPOAE, analizando
sus umbrales auditivos. Se tomaron muestras de sangre para determinar
concentraciones de pHcy y ácido fólico por HPLC. La morfología coclear
se evaluó mediante inmunohistoquímica y tinción con violeta de cresylo.
Se analizaron marcadores de inflamación y estrés oxidativo mediante
Western blotting y RT-qPCR.
El grupo control mostró umbrales auditivos significativamente elevados
en ABR (~25 dB SPL) y menores amplitudes DPOAE a frecuencias
medias-altas, cuando se comparó con el grupo que recibió omega-3. No se
observaron diferencias histológicas entre los grupos, pero sí se detectaron
niveles elevados de pHcy (p=0.13) y disminuidos de ácido fólico sérico
(p<0.05) en el grupo control comparado con el suplementado con omega-3.
Los resultados obtenidos sugieren que la suplementación prolongada con
omega-3 podría tener un efecto protector a largo plazo en el desarrollo de
ARHL.
Referencias
[1] Da Young Oh et al., Cell, 142(5):687-98, 2010.
[2] Bamini Gopinath et al., Am J Clin Nutr, 92(2):416-21, 2010.
[3] Bamini Gopinath et al., J Nutr, 140(8):1469-74, 2010.
[4] Carla Dullemeijer et al., J Nutr Health Aging, 14(5):347-51, 2010.
Agradecimientos: Beca JAE, BFU2009-08977, SAF2011-24391, FP7-
AFHELO, FP7-AFHELO, FP7-TARGEAR y Lactalis-Puleva.
Granada 2014
P06-10 (R06-5)
Estudio farmacocinético del ácido maslínico,
un componente bioactivo de Olea europea L.
Marta Sánchez-González1, Glòria Lozano-Mena1, Tatiana
Trebolento1, Helena Colom2, M. Emília Juan1, Joana M. Planas1
1
Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i
Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES,
2
Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica, Barcelona, ES
El ácido maslínico es un componente minoritario aislado de diferentes
plantas y principalmente de las hojas y los frutos del olivo. Se han
descrito sus efectos beneficiosos en modelos animales de cáncer,
diabetes y cardiopatía pero se desconoce su biodisponibilidad oral. Por
lo tanto, el objetivo del presente estudio es determinar los parámetros
farmacocinéticos del ácido maslínico en rata tras su administración oral.
Una dosis única de 50 mg/kg del compuesto fue administrada mediante
sonda intragástrica a ratas Sprague-Dawley. Se obtuvieron muestras de
sangre procedentes de la vena safena a 18 tiempos distintos durante 24
horas. El plasma se procesó siguiendo una doble extracción líquido-
líquido con acetato de etilo antes de ser analizado por HPLC-MS.
Mediante el software Winnonlin se realizó el análisis no compartimental
y compartimental de las concentraciones plasmáticas de ácido maslínico
vs tiempo, siendo el modelo bicompartimental el que mejor describió
la farmacocinética oral del compuesto. La Cmax del ácido maslínico
(4,82 μM) se alcanzó 49,90 min después de su administración. El AUC
fue de 913,58 min·μmol/L y el CL/F de 0,116 L/min/kg. Los Vc/F y
Vp/F fueron de 13,02 y 30,56 L/kg, respectivamente. Por otro lado, la
K01 presentó un valor de 0,034 1/min y la K10 de 0,0088 1/min. Los
resultados obtenidos sugieren una absorción relativamente rápida con
una buena distribución al compartimento periférico y una eliminación
sostenida. En conclusión, las concentraciones plasmáticas de ácido
maslínico tras su administración oral siguen una caída biexponencial
con una constante de retorno limitada y una eliminación lenta del
organismo.
Estudio financiado por los proyectos AGL2009-12866 del MCT y 2009-
SGR-00471 de la Generalitat de Catalunya.
P06-11 (R06-2)
Efectos beneficiosos de ingredientes bioactivos
sobre la hipertensión arterial
Begoña Muguerza, Cinta Bladé, Gerard Aragones, Manuel Suarez,
Lluís Arola, Anna Arola-Arnal
Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili,
Tarragona, ES
La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en el mundo
y la hipertensión arterial es uno de sus principales factores de riesgo. Varios
estudios han demostrado que el consumo de alimentos o ingredientes
ricos en flavanoles, como el cacao o extracto de pepita de uva, mejoran la
función endotelial y disminuyen la presión arterial.
Diferentes mecanismos podrían justificar las propiedades antihipertensivas
de los flavanoles. La vasodilatación ocasionada por estos compuestos se
ha relacionado con la reducción del estrés oxidativo, con la producción
de óxido nítrico (NO) y la inhibición de la enzima convertidora de la
angiotensina (ECA), clave para el control de la presión arterial.
El cacao y el extracto de pepita de uva son productos ricos en flavanoles
del tipo flavan-3-ol y proantocianidinas que han demostrado gran
actividad antioxidante. Sin embargo, la concentración real de flavonoides
que alcanzan los vasos sanguineos es tan baja que es poco probable
que estos compuestos actúen por un mecanismo antioxidante directo
y posiblemente otros mecanismos relacionados con interacciones
específicas con proteínas o lípidos, serán responsables de sus efectos sobre
la presión arterial. De hecho, el efecto antihipertensivo de los flavanoles
se atribuye fundamentalmente, a un aumento en la disponibilidad de NO.
Sin embargo, es posible que otros mecanismos de acción estén también
Pósters
implicados como la disminución de endothelina-1 o el aumento de
prostaciclina. Además, se conoce que estos compuestos también pueden
inhibir un gran número de enzimas, incluyendo la ECA, de promover
la expresión de múltiples genes reguladores de la presión arterial y de
afectar en diferentes niveles a las cascadas de señalización implicadas en
el control de la presión arterial.
P06-12 (R06-6)
Apigenin K has intestinal anti-inflammatory
effect in two experimental models of rat colitis
Raquel González Pérez1, Cristina Mascaraque Molina1, María
Dolores Suárez Ortega2, Antonio Zarzuelo Zurita1, Olga Martínez
Augustin2, Femín Sánchez de Medina López-Huertas1
1
Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, CIBERehd,
UGR, Granada, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular II, Facultad de Farmacia, CIBERehd, UGR, Granada, ES
Background and objectives: Flavonoids are polyphenolic compounds
which are widespread in nature and are consumed as part of the human
diet in significant amounts. Many flavonoids have been studied for their
intestinal antiinflammatory activity. The aim of this study was to test the
intestinal anti-inflammatory activity of apigenin K, a soluble form of
apigenin, in two models of rat colitis, the trinitrobenzene sulfonic acid
(TNBS) model and the dextran sulfate (DSS) model.
Methods: Apigenin K (3 mg/kg, p.o.) was administered as a pretreatment
to rats with TNBS and DSS colitis and colonic status was checked 7 and 9
days after colitis induction, respectively, by macroscopic and biochemical
examination.
Results: Apigenin K pretreatment resulted in amelioration of the
morphological signs and biochemical markers in the TNBS model. The
results demonstrate a reduction in inflamed area of 2.4 cm compared
with TNBS group, lower values of macroscopic damage (5.8±1.1 vs
8.6±1.4, p<0.05) and a slight decrease in the colonic weight/length
ratio. Myeloperoxidase and alkaline phosphatase colonic activities were
reduced by 34% (p<0,05) and 18%, respectively. Moreover, apigenin K
also ameliorated morphological signs and biochemical markers in the DSS
model, the comparable results. Thus macroscopic damage was significantly
reduced (0.5±0.5 vs 2.1±0.6, p<0.05) and the colonic weight/length ratio
was lowered by approximately 10%. Colonic myeloperoxidase and alkaline
phosphatase activities decreased 30% and 20%, respectively (p<0,05).
Apigenin K treatment additionally reduced the colonic expression of IL1β,
IL6, Foxp3, TLR2 and TGFβ compared with the TNBS group (p>0.05 for
the latter two).
Conclusions: Apigenin K has anti-inflammatory effects in two preclinical
models of inflammatory bowel disease.
This study was supported by grants of the Centre for Technological
Industrial Development (CDTI) (CENIT SENIFOOD).
P06-13 (R06-3)
Pectinas, regulación del peso corporal y salud
Ana María Rodríguez Guerrero, Francisco Javier García Carrizo,
Catalina Picó Segura, Andreu Palou Oliver
Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología
(Universitat de les Illes Balears) y CIBER Fisiopatología de la
Obesidad y Nutrición, Palma de Mallorca, ES
Recientemente, la composición de la microbiota intestinal ha emergido
como factor crucial en la prevención de la obesidad (y sus complicaciones),
a su vez fuertemente influenciada por la dieta. Numerosas investigaciones
destacan el efecto de los prebióticos como moduladores de la microbiota,
en un mejor funcionamiento metabólico y en la protección frente a la
obesidad. Un tipo particular de prebióticos, utilizados de forma tradicional
en alimentación, son las pectinas.
65
Pósters
Las pectinas son fibras hidrosolubles del tipo polisacáridos no-almidón
sobre las que se ha probado su papel en la mejora del control de la glucemia
y de los niveles de colesterol, aunque su posible papel en la protección
frente a la obesidad y en otros aspectos relacionados con la salud metabólica
está menos demostrado.
En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo de propensión
a la obesidad: descendencia de ratas sometidas a restricción calórica
moderada durante el embarazo, modelo más similar a la posible
situación en humanos respecto de otros modelos más restrictivos.
Hemos analizado el efecto protector de una suplementación moderada
con pectinas altamente esterificadas de manzana desde el destete hasta
la edad adulta bajo una dieta control o incluyendo un factor obesogénico
más (dieta alta en sacarosa). Hemos comprobado que la suplementación
con pectinas a largo plazo supone una protección significativa frente
al desarrollo de adiposidad corporal, acompañada de un mejor perfil
metabólico de parámetros circulantes y parámetros de expresión génica
en tejidos clave.
En definitiva, la suplementación de la dieta con pectinas se perfila como
una posible herramienta eficaz en la prevención de la obesidad y en el
mantenimiento de un perfil metabólico saludable.
P06-14
Dietary squalene increases high density
lipoprotein-cholesterol and paraoxonase 1
and decreases oxidative stress in mice
Clara Gabás-Rivera1, Cristina Barranquero2, Roberto Martínez-
Beamonte1, María Angeles Navarro-Ferrando1, Joaquín Carlos Surra-
Muñoz3, Jesús de la Osada García4
1
Departamento Bioquímica y Biología Molecular y Celular,
Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2CIBER de Fisiopatología
de la Obesidad y Nutrición, Instituto de Salud Carlos III, Zaragoza,
ES, 3Departamento de Producción Animal, Escuela Politécnica
Superior de Huesca, Huesca, ES, 4Departamento de Bioquímica y
Biología molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad
de Zaragoza, Zaragoza, ES
Background and Purpose: squalene, the main hydrocarbon in the
unsaponifiable fraction of virgin olive oil, is involved in cholesterol
synthesis and it has been reported to own antiatherosclerotic and
antiesteatosic effects. However, the squalene’’’’s role on lipid plasma
parameters and the influence of genotype on this effect need to be
addressed.
Experimental Approaches: three male mouse models (wild-type, Apoa1-
and Apoe- deficient) were fed chow semisynthetic diets enriched in
squalene to provide a dose of 1 g/kg during 11 weeks. After this period,
their plasma parameters and lipoprotein profiles were analyzed.
Key Results: squalene administration at a dose of 1 g/kg showed
decreased reactive oxygen species in lipoprotein fractions independently
of the animal background and caused an specific increase in high density
lipoprotein (HDL)-cholesterol levels, accompanied by an increase in
phosphatidylcholine and paraoxonase 1 and no changes in apolipoproteins
A1 and A4 in wild-type mice. In these mice, the cholesterol increase
was due to its esterified form and associated with an increased hepatic
expression of Lcat. These effects were not observed in absence of
apolipoprotein A1. The increases in HDL- paraoxonase 1 were translated
into decreased plasma malondialdehyde levels depending on the presence
of Apolipoprotein A1.
Conclusions and Implications: dietary squalene promotes changes in
HDL- cholesterol and paraoxonase 1 and decreases reactive oxygen species
in lipoproteins and plasma malondialdehyde levels, providing new benefits
of its intake that might contribute to explain the properties of virgin olive
oil, although the phenotype related to apolipoproteins A1 and E may be
particularly relevant.
66
XXXVII Congreso SEBBM
P06m-15
Marcadores diagnósticos y pronósticos
en la obesidad mórbida
JR Muñoz-Rodríguez1, E Salas1, E Segura1, M Sánchez1, G López1,
M Palma1, P Rozas1, L Sáenz1, A Agarrado1, C González-Martín2,
G Casas1, A León1, J Martín1, LF Alguacil2
1
Hospital General Universitario de Ciudad Real, Ciudad Real, ES,
2
Hospital General Universitario de Ciudad Real, Universidad CEU
San Pablo, Boadilla del Monte, Madrid, ES
El objetivo de este estudio es evaluar la posible utilidad diagnóstica de
diversos marcadores genéticos y bioquímicos en la obesidad mórbida, así
como su valor pronóstico y predictivo de la respuesta personalizada a la
cirugía bariátrica.
Para el estudio bioquímico se seleccionaron 31 pacientes con obesidad
mórbida (IMC>40 kg/m2) que fueron sometidos a cirugía bariátrica en el
HGUCR y a los que se realizó un seguimiento de 12 meses. Se reclutó
el mismo número de controles normopesos (IMC entre 18,5 y 24,9 kg/
m2) entre el personal del hospital procurando que las proporciones de edad
y sexo resultaran homogéneas. Para los estudios genéticos se aumentó el
número de pacientes a 74 y el de controles a 57.
Como marcadores genéticos se midieron polimorfismos de genes
relacionados con obesidad y trastornos de la conducta alimentaria (Bdnf,
Cart, Ucp2, Fto, Adra2B y Pparg). Como marcadores bioquímicos se
midieron neuropéptidos (BDNF y CART), hormonas (grelina, leptina,
adiponectina, insulina) y citoquinas proinflamatorias (IL-6 y TNFα).
El estudio genético mostró diferencias significativas entre controles y
pacientes en las frecuencias de los polimorfismos rs9939609 y rs9939973
del gen Fto y rs71824147 del gen Ucp2. Los niveles de IL-6 fueron
superiores en pacientes respecto a los controles. Se detectó un descenso en
BDNF un año después de la cirugía bariátrica en los pacientes intervenidos.
El perfil hormonal, claramente distinto entre ambos grupos de inicio, se
revirtió en los pacientes obesos intervenidos en lo que respecta a niveles de
adiponectina, leptina e insulina.
Los datos obtenidos, junto con otros estudios preclínicos y clínicos,
sugieren que el análisis de los polimorfismos de Ucp2 y Fto, la citoquina
IL-6, el perfil hormonal y el neuropéptido BDNF, pueden ser herramientas
valiosas bien para definir diferentes endofenotipos de obesidad, bien para
evaluar o predecir el resultado de los tratamientos contra la obesidad.
Financiado por el Instituto de Salud Carlos III (FIS PI10/00440). Los
autores agradecen a Dña Amelia González López su excelente asistencia
técnica.
P07. Bioquímica perinatal
P07-1 (R07-3)
Obesidad pregestacional. Consecuencias para
la descendencia y papel del estrés oxidativo
Martín Alcalá Díaz.Mor1, Sonia Clapés2, Victoria E: Bolado García1,
Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles1, Franciasco Dasí3, Guillermo
Saez Tormo4, María del Pilar Ramos Álvarez1, Marta Viana Arribas1
1
Facultad de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Madrid, ES,
2
ICBP Victoria de Girón, La Habana, CU, 3Fundación Investigación
Clínico de Valencia, Instituto de Investigación Sanitaria-INCLIVA,
Valencia, ES, 4Dpto. de Bioquímica y Biol. Molecular-CIBEROBN,
Facultad de Medicina - Servicio de Análisis Clínicos-CDB HGUV,
Universidad de Valencia, Valencia, ES
Llevamos a cabo un estudio en un modelo de rata gestante con obesidad
inducida por dieta, donde existen claras alteraciones metabólicas, entre
ellas una elevada resistencia a la insulina. Se observó un incremento en
el porcentaje de malformaciones congénitas en el grupo de ratas obesas,
Granada 2014
reducido tras la administración de vitamina E. Se observó un incremento
en el estrés oxidativo materno (mayores niveles de daño oxidativo, tanto
a proteínas (PAOP) como al ADN, no siendo así en lípidos). Las mayores
concentraciones de PAOP y de 8-oxo-7,8-dihidro-2 ́-desoxiguanosina, se
correlacionaron positivamente con el incremento en las malformaciones
congénitas. Además, los sistemas antioxidantes, tanto lipofílicos (vitamina
E en tejido adiposo visceral), como enzimáticos (CuZnSOD, MnSOD y
GPx hepáticos) se encontraron disminuidos, confirmando así la situación
de incrementado estrés oxidativo asociado a la obesidad. Además, la
subunidad catalítica de la glutamato cisteína ligasa, enzima responsable de
la síntesis del glutation, está incrementada en obesidad como consecuencia
de la demanda de dicho antioxidante.
P07-2 (R07-4)
Early nutrition reprograms the hepatic circadian
clock: Permanent deregulation of metabolism
Cristina Garcia-Beltran1, Sílvia Ribó1, Susana Kalko2, Antonio
Fernández3, Laura Martínez-Guinó1, Judith Cebrià1, Thais Pentinat1,
Débora Martínez1, Carles Lerín1, Mario Vallejo3, Rubén Díaz1, Josep
Jiménez Chillarón1
1 la probabilidad de que una mujer presente obesidad o sobrepeso al inicio de
Hospital Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, ES, 2Hospital
Clínic de Barcelona-IDIBAPS, Barcelona, ES, 3Instituto de
Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’ CSIC-UAM; Centro de
Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades
Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Madrid, ES
Excessive caloric intake during early stages of development increases the
risk of childhood obesity and predisposes individuals to develop late onset
of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes.
We have developed a mouse model of neonatal overfeeding (ON) by culling
the offspring to 4 pups per dam during lactation. Control females nursed
8 pups during lactation (C). ON mice developed obesity, hyperglycaemia,
insulin resistance and glucose intolerance with ageing. The liver was the
tissue that contributed most prominently to the development of insulin
resistance. In order to underpin molecular mechanisms of insulin resistance
we analysed global gene expression profiling (Affymetrix) in livers from
ON and C male mice. The Ontology with highest significance was the
Circadian Rhythm. We next validated (qPCR) the candidate genes (Npas2,
Per1, Per3, Cry1) in adult mice. Strikingly, changes in expression (Per1,
Cry2) were already present in livers from 15-day-old ON mice. This data
suggests that altered expression of hepatic clock genes is established early
in life and do not occur as a secondary event associated to the progressive
development of obesity and/or insulin resistance.
Circadian rhythms play a major role in orchestrating daily physiological
functions, and disrupting the expression of clock genes evokes metabolic
diseases. Thus, we tested whole-body metabolism by indirect calorimetry.
We found that VO2, VCO2, energy expenditure or activity absolute
values were similar between groups during both the light and dark cycles.
In contrast, in agreement with alterations in the circadian rhythmicity,
the diurnal decrease in respiratory exchange ratio (RER) cycling started
significantly earlier in ON mice. Likewise, upon fasting, V02, VCO2, and
energy expenditure remained higher in ON mice during the night cycle.
Overall, we show that early malnutrition permanently reprograms the
hepatic circadian clock. Such reprogramming induces a sustained feed-
back loop that may in turn influence the physiologic behaviour of mice
leading, secondarily, to overall metabolic deregulation.
P07-3 (R07-2)
Papel de p53 en la obesidad y su posible
implicación en la programación del metabolismo
Ruben Nogueiras Pozo
Universidad Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES
p53 es un gen supresor tumoral que desempeña múltiples funciones biológicas,
incluyendo la capacidad para modular el metabolismo a diferentes niveles,
Pósters
incluyendo acciones en la grasa, el hígado o el páncreas. En este sentido
p53 parece estar involucrado en la programación metabólica de los islotes
pancreáticos durante la maternidad. La función endógena de p53 parece estar
afectada por los diferentes estadíos nutricionales y los animales modificados
genéticamente en los que se altera la expresión de p53 presentan importantes
cambios metabólicos. Además también se ha observado que la expresión de
p53 en el sistema nervioso central regula la acción metabólica de algunas
hormonas que afectan a la ingesta. Futuros estudios serán necesarios para
corroborar si p53 podría ser utilizada como diana terapéutica.
P07-4 (R07-5)
La obesidad previa a la gestación induce
alteraciones metabólicas en la placenta
Mónica Diez-Hochleitner Ruiz1, Julio Sevillano Fernández1, Jimena
Pita Santibáñez1, María Haro García1, Marta Viana Arribas1, Gema
Medina Gómez2, M. Pilar Ramos Álvarez1
1
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad CEU San Pablo,
Madrid, ES, 2Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES
La prevalencia de la obesidad ha aumentado en los últimos años, por lo que
la gestación es cada vez mayor. Por estudios epidemiológicos sabemos que
la obesidad durante la gestación favorece un mayor riesgo de complicaciones
del recién nacido en edad adulta, aunque no se conocen en detalle los
mecanismos implicados. Por esta razón, quisimos estudiar si la obesidad
previa a la gestación altera la homeostasis glucídica y lipídica de la madre.
Un grupo de ratas wistar recibió una dieta moderada en grasa previamente a
la gestación (Moderate Fat Diet, MFD), y en paralelo otro grupo recibió la
dieta control (C). Tras 35 días con las dietas, la hembras MFD ya presentaban
sobrepeso, hiperlipemia, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina. En este
momento se cruzaron los animales y se estudiaron a día 20 de gestación. Las
madres con la dieta MFD tuvieron fetos más pequeños que las controles,
aunque no hubo diferencias en el peso de las placentas ni en su contenido
de lípidos. Asimismo, en las placentas del grupo MFD la expresión de Glut-
1 y Lipina-2 estaba aumentada mientras que la de la LPL se encontraba
disminuida frente a las C. El estudio metabolómico de las placentas reveló un
mayor contenido de metabolitos como carnitina, acetilcarnitina, cistationina
y serina (todos ellos relacionados con el metabolismo de los lípidos y la
glucosa) en las placentas del grupo de MFD respecto al C. Estos resultados
permiten concluir que la obesidad presente antes de la gestación, promueve
un mecanismo adaptativo que protege a la placenta frente a una posible
lipotoxicidad, pero a pesar de ello existen alteraciones relacionadas con un
aumento en la captación de glucosa y en el metabolismo de la cistationina
que podrían tener consecuencias en el desarrollo del feto.
Financiado con SAF2010-19603 y CAM-BMD2010-2423.
P07-5 (R07-1)
Programación metabólica en el periodo pre-
y post-natal de la predisposición a la obesidad
en el adulto
Catalina Picó, Andreu Palou
CIBER Fisiología de la Obesidad y Nutrición y Laboratorio de
Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología (Universidad de las
Islas Baleares), Palma de mallorca, ES
Alrededor del 25% de los casos de obesidad en la edad adulta tienen su
origen en las primeras etapas del desarrollo pre- y post-natal. Son períodos
críticos en los que la restricción materna de alimentos y la presencia o no de
determinados componentes de los mismos puede conducir a adaptaciones
permanentes de procesos metabólicos responsables de estos problemas y,
según los estudios en modelos animales, los efectos pueden ser diferentes
dependiendo del sexo, del periodo de exposición y su severidad. Y pueden
ser de signo opuesto dependiendo de si la restricción materna tienen lugar
67
Pósters
en la gestación (propensión a la obesidad) o en la lactancia (resistencia
a la obesidad). Entre los nutrientes que más influyen en la programación
metabólica del control del peso corporal, en 2005 identificamos a la leptina,
un componente normal de la leche materna y ausente en las fórmulas o
preparados para lactantes, que debiera ser considerado un nutriente esencial
durante el desarrollo perinatal, pues en esta etapa contribuye a la organización
de los sistemas de control metabólico-alimentario que operarán el resto de la
vida. Aquí resumiremos datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio que
revelan la capacidad de la leptina para corregir desajustes de la programación
metabólica del recién nacido debidos a la alimentación materna durante la
gestación y que, de no corregirse conducen a alteraciones metabólicas en la
base del síndrome metabólico y la obesidad.
P08. Bioquímica y biología molecular
de plantas
P08-1
Análisis de la expresión de la oxidasa alternativa
de girasol (Helianthus annuus L.) en relación
con el estrés biótico causado por Plasmopara
halstedii
Theo Guerra Dug1, Ana María Fernández Ocaña1, José Rafael
Pedrajas Cabrera2, Raquel Valderrama Rodríguez2, Juan Bautista
Barroso Albarracín2, María Victoria Gómez Rodríguez1
1
Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología.
Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2Departamento de Biología
Experimental. Universidad de Jaén, Jaén, ES
La oxidasa alternativa (AOX) es una proteína presente en plantas y otros
organismos que forma parte de la cadena mitocondrial de transporte de
electrones. AOX puede sustituir a la Citocromo c oxidasa como aceptor
final de electrones, con la ventaja de ser insensible al cianuro si bien su
actuación da lugar a un menor rendimiento en términos de ATP.
Puesto que se ha descrito que AOX desempeña un importante papel frente
al estrés oxidativo y nitrosativo derivado de condiciones adversas de tipo
biótico y abiótico, se ha realizado un estudio preliminar acerca del papel
que esta proteína pudiera tener en la interacción entre H. annuus y uno de
sus más importantes patógenos (P. halstedii), así como de la posibilidad de
que AOX pudiera formar parte de los mecanismos de defensa que el BTH,
un inductor de resistencia sistémica adquirida (SAR), pudiera activar.
Se han empleado dos líneas de girasol, una susceptible HA89 y otra
resistente RHA274 y tanto a nivel de expresión como de cantidad de
proteína.
Los resultados obtenidos han mostrado la existencia de diferencias en
la expresión de la AOX entre ambas líneas de girasol. Las plantas de la
línea susceptible tienen distinto nivel de expresión de AOX que las de
la línea resistente pero esa diferencia no parece estar relacionada con su
resistencia o susceptibilidad a P. halstedii. La infección da lugar en las
plantas susceptibles a un aumento de la cantidad de AOX, no debida a
una mayor transcripción de los genes que codifican las dos isoformas,
sino a una distinta regulación de la traducción y/o equilibrio en la síntesis/
degradación de la proteína.
De nuestros resultados se deduce que si bien el BTH actúa como protector
de la infección por P. halstedii, este efecto no está ligado a una activación
de la expresión de los genes que codifican para las dos isoformas de la
AOX ni tampoco al aumento de la cantidad de proteína.
Las semillas de girasol fueron amablemente cedidas por el equipo del
profesor Said Mouzeyar, Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand,
Francia.
Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO2012-
33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286).
68
XXXVII Congreso SEBBM
P08-2 (R08-1)
Reevaluating the involvement of plastidic
phosphoglucose isomerase in starch biosynthesis
in mesophyll cells
Ángela Sánchez López, Abdellatif Bahaji, Francisco José Muñoz,
Edurne Baroja-Fernández, Jun Li, Adriana Ricarte-Bermejo,
Goizeder Almagro, Manuel Montero, Javier Pozueta-Romero
Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra),
Nafarroa, ES
It is widely assumed that the whole starch biosynthetic process occurring
in leaf mesophyll cells resides exclusively in the chloroplast. According
to this view, transitory starch is considered the end-product of a metabolic
pathway involving plastidic phosphoglucomutase (pPGM), ADP-glucose
pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS) that is linked to the
Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase
(pPGI). In this work we isolated pgi1-3, a mutant totally lacking pPGI
activity as a consequence of aberrant splicing of intron 6 of the pPGI
encoding gene, PGI1. Starch content in pgi1-3 leaves was ca. 10-15%
of that of wild type (WT) leaves, which is similar to that of leaves of
pgi1-2, a T-DNA insertion pPGI null mutant. Unexpectedly, microscopy
analyses revealed the presence of few starch granules per chloroplast in the
mesophyll cells of pgi1-2 and pgi1-3 leaves. Both pgi1-2 and pgi1-3 leaves
accumulated WT levels of the starch precursor molecule, ADP-glucose,
and displayed reduced SS and high β-amylase activities. Moreover, the
two pgi1 mutants displayed a slow growth phenotype and possessed
reduced photosynthetic capacities when cultured under continuous light
photoperiod. Importantly, pgi1-2 and pgi1-3 leaves accumulated high
starch content when plants were cultured in the presence of elevated CO2
concentration. Furthermore, introduction into pgi1-2 and pgi1-3 of a sex1
null mutation impeding β-amylase-mediated starch breakdown reverted
the starch-deficient phenotype of pgi1 mesophyll cells. The overall data
(a) show that mesophyll cells of pPGI null mutants accumulate starch, (b)
provide strong evidence that the reduced starch content in pgi1 mesophyll
cells is largely the consequence of combined factors including reduced
photosynthetic capacity and pleiotropic changes in activities of enzymes
directly linked to starch metabolism, (c) support the occurrence of
important starch biosynthetic pathway(s) alternative to the classic Calvin-
Benson cycle-pPGI-pPGM-AGP-SS pathway, and (d) show that pPGI is an
important determinant of both photosynthetic capacity and growth.
P08-3
Análisis proteómico en plantas de Arabidopsis
thaliana deficientes en las tiorredoxinas f y m
plastidiales
Juan Fernández Trijeque, José Antonio Rojas González, Antonio
Jesús Serrato Recio, Mariam Sahrawy Barragan
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de
Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES
La regulación redox es probablemente el mecanismo más utilizado por las
plantas para controlar la activación de enzimas o la reducción de puentes
disulfuro de proteínas implicadas en diversos procesos metabólicos o de
desarrollo. Aunque existen distintas proteínas capaces de llevar a cabo
intercambios tiol/disulfuro, las tiorredoxinas (Trx) son las responsables de
muchos de las funciones que ocurren en plantas. Las Trx plastidiales de
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) son el grupo más numeroso de la familia
multigénica a la que pertenecen, en el cloroplasto se han descrito las Trx f, m,
x, y. Hasta hace unos años se conocía la activación específica de la fructosa-
1,6-bisfosfatasa cloroplastídica por la Trx f y de la malato deshidrogenasa
por la Trx m. Sin embargo el número de isoformas existentes para cada tipo,
sugiere una gran diversidad funcional lo que conlleva la dificultad de asignar
un papel fisiológico concreto a cada una de las Trxs.
Para contribuir a la identificación de funciones específicas a las Trx f y
m de Arabidopsis en este estudio hemos caracterizado las proteínas
Granada 2014
diferencialmente expresados en mutantes de Arabidopsis deficientes
(“knockout”) en las Trx f1, f2, m1, m2, m3 y m4, respectivamente.
Extractos de proteínas fueron preparados para comparar las proteínas en
plantas mutantes y silvestres usando la técnica de 2D-PAGE. Las proteínas
diferencialmente expresadas fueron identificadas mediante MS-MS/MS
(MALDITOF-TOF) en el Servicio de Proteómica (SCAI) de la Universidad
de Córdoba. Los análisis muestran un total de 37 y 71 proteínas inhibidas y
sobreexpresadas, respectivamente, en todos los mutantes. La clasificación
de las proteínas por categorías funcionales indica que varios procesos de
la planta están afectados, entre los cuales podemos destacar el transporte
electrónico, la fotosíntesis y el Ciclo de Calvin, el ensamblaje de proteínas,
y la síntesis de amino ácidos. Este estudio puede favorecer la asignación de
acciones a algunas de Trx f y m analizadas.
Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por el MICINN
(BIO2009-7297), MINECO (BIO2012-33292) y por la Junta de Andalucía
(P07-CVI-02795, BIO154).
P08-4 (R08-7)
Reconocimiento molecular en la interacción
de la NADPH-tiorredoxina-reductasa cloroplástica
(NTRC) con 2-Cys peroxirredoxina
José A. Navarro1, Pilar Bernal-Bayard1, Francisco J. Cejudo1, Adrián
Velázquez-Campoy2, Manuel Hervás1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, Sevilla,
ES, 2Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos
(BIFI), Zaragoza, ES
Las NADPH-tiorredoxina-reductasas (NTR) utilizan NADPH como fuente
de electrones para la reducción de tiorredoxinas (Trx), en lo que conforma
un sistema de regulación por oxidación-reducción de grupos disulfuro
que controla múltiples procesos celulares. Las NTR contienen una flavina
y un grupo disulfuro como cofactores, que operan como una cadena de
transferencia intramolecular de electrones desde el NADPH al grupo
disulfuro en el sitio activo. Además de las NTR estándar, las plantas poseen
una NTR plastídica, llamada NTRC, con un dominio Trx fusionado a su
extremo C-terminal. NTRC, entre otras funciones, actúa como un reductor
de las 2-Cys peroxirredoxinas (2-Cys Prx), que controlan los niveles
intracelulares de peróxido de hidrógeno, sin embargo, las características
de la interacción entre ambas proteínas no se conoce. Hemos estudiado
los procesos de reconocimiento molecular del sistema NTRC/2-Cys Prx
mediante calorimetría de titulación isoterma, utilizando tanto proteínas
nativas como los módulos NTR (NTRM) y Trx (TrxM) de NTRC, expresados
separadamente. Las interacciones de NTRC, TrxM y NTRM con la 2-Cys
Prx son similares en cuanto a afinidad, aunque diferentes en cuanto a la
contribución entalpía/entropía. Nuestros datos sugieren que ambos módulos,
NTRM y TrxM, contribuyen significativamente a la interacción de NTRC
con la 2-Cys Prx, en concordancia con el modelo de interacción que hemos
propuesto recientemente. Por el contrario, NTRC no interacciona con
una Trx cloroplastídica de tipo x, debido a que la presencia del módulo
Trx impide dicha interacción. Nuestros resultados ponen de manifiesto el
conjunto preciso y definido de interacciones que determinan la especificidad
del reconocimiento molecular en el sistema NTRC/2-Cys Prx de plantas.
P08-5 (R08-2)
Función y regulación de las estrigolactonas como
fitohormonas y moléculas señal en la rizosfera
Juan Antonio López Ráez, Rocío Torres Vera, Juan Manuel García
Ramírez, Javier Rivero Bravo, Estefanía Berrio Pozo, María José
Pozo Jiménez
Estación Experimental del Zaidín, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES
Las estrigolactonas (SL) son unas moléculas multifuncionales que
están involucradas en diferentes procesos en las plantas, donde actúan
Pósters
hormonas y como moléculas señal en la rizosfera. Como fitohormonas,
se ha propuesto que podrían jugar un papel como moduladores del
desarrollo coordinado de raíces y parte aérea en respuesta a condiciones
de estrés nutricional. De acuerdo con esta hipótesis, se ha demostrado
que las SL están involucradas en la regulación de la arquitectura vegetal,
formación de raíces adventicias, crecimiento secundario y desarrollo
reproductivo. Además, nuevas funciones se están descubriendo
continuamente. Como moléculas señal en la rizosfera, las SL favorecen
el establecimiento de la simbiosis con ciertos hongos beneficiosos del
suelo (simbiosis micorrícica arbuscular). Mediante el establecimiento
de este tipo de simbiosis, las plantas son capaces de sobrevivir bajo
diferentes condiciones de estrés. En la rizosfera, las SL también actúan
como estimulantes de la germinación de plantas parásitas de la familia
Orobancheaceae (malas hierbas), las cuales ocasionan grandes pérdidas
a nivel agronómico. Debido a este papel dual de las SL en la rizosfera,
se ha propuesto que las micorrizas también podrían ser utilizadas para el
desarrollo de nuevas estrategias de biocontrol frente a este tipo de malas
hierbas.
En nuestro grupo de investigación, estamos interesados en estudiar cómo
diferentes condiciones de estrés, tanto de tipo abiótico como biótico, afectan
a la producción y regulación de SL, así como analizar cómo esto afecta a
la formación de micorrizas y a la infección por plantas parásitas. Por otro
lado, también estamos interesados en descubrir nuevas funciones de las SL,
como por ejemplo su posible implicación en respuestas de defensa.
P08-6
HPLC-MS/MS analyses show that leaves of
the near-starchless aps1 and pgm mutants
accumulate wild type levels of ADPglucose:
further evidence for the occurrence of various
important ADPglucose biosynthetic pathway(s)
Miren Edurne Baroja Fernández1, Abdellatif Bahaji1, Ángela
María Sánchez López1, Francisco José Muñoz1, Jun Li1, Goizeder
Almagro1, Manuel Montero1, Adriana Ricarte Bermejo1, Pablo
Pujol2, Regina Galarza2, Kentaro Kaneko3, Kazusato Oikawa3, Kaede
Wada3, Toshiaki Mitsui3, Javier Pozueta Romero1
1
Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra),
Mutilva, Navarra, ES, 2Servicio de Apoyo a la Investigación,
Universidad Pública de Navarra, Pamplona, ES, 3Department of
Applied Biological Chemistry, Niigata University, Niigata, JP
In leaves, it is widely assumed that starch is the end-product of a
metabolic pathway exclusively taking place in the chloroplast that (a)
involves plastidic phosphoglucomutase (pPGM), ADPglucose (ADPG)
pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS), and (b) is linked to the
Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase
(pPGI). This view also implies that AGP is the sole enzyme producing the
starch precursor molecule, ADPG. However, mounting evidence has been
compiled pointing to the occurrence of important sources, other than the
pPGI-pPGM-AGP pathway, of ADPG. To further explore this possibility,
in this work two independent laboratories have carried out HPLC-MS/
MS analyses of ADPG content in leaves of the near-starchless pgm and
aps1 mutants impaired in pPGM and AGP, respectively, grown under
two different culture conditions. We also measured the ADPG content
in WT and aps1 leaves expressing in the plastid two different ADPG
cleaving enzymes, and in aps1leaves expressing in the plastid GlgC,
a bacterial AGP. Furthermore, we measured the ADPG content in ss3/
ss4/aps1 mutants impaired in starch granule initiation and chloroplastic
ADPG synthesis. We found that, irrespective of their starch contents,
pgm and aps1 leaves, WT and aps1 leaves expressing in the plastid
ADPG cleaving enzymes, and aps1 leaves expressing in the plastid GlgC
accumulate WT ADPG content (0.13-0.19 nmol ADPG/g fresh weight).
In clear contrast, ss3/ss4/aps1 leaves accumulated ca. 300 fold-more
ADPG than WT leaves. The overall data further provide strong evidence
that, in Arabidopsis leaves, (a) there are important ADPG biosynthetic
69
Pósters
pathways, other than the pPGI-pPGM-AGP pathway, (b) pPGM and AGP
are major determinants of starch accumulation, but not of intracellular
ADPG content, and (c) most of ADPG has an extraplastidial localization
in WT leaves.
P08-7 (R08-3)
Interplay between SWR1 and NuA4 chromatin
remodelling complexes in the control of flowering
time
Pedro Crevillén Lomas, Angeles Gómez-Zambrano, Alfonso Mouriz,
Manuel Piñeiro, José A. Jarillo
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA),
Pozuelo de Alarcón, ES
Histone acetylation by the NuA4/Tip60 complex and histone H2A.Z
deposition by the SWR1/SRCAP complex are functionally linked
chromatin modifications observed across eukaryotes, regulating multiple
biological processes such as gene expression, heterochromatin boundary
maintenance, and DNA repair. In our lab, we previously characterized a
series of Arabidopsis thaliana early flowering mutants defining a major
role for SWR1-C in the regulation of flowering time, a key developmental
process in the lifecycle of plants. We are currently focused on the YEATS
domain protein YAF9/GAS41, a shared subunit between SWR1 and NuA4
complexes. There are only two Arabidopsis YEATS domain proteins:
AtYAF9a and AtYAF9b. Atyaf9a KO allele displays an early flowering
phenotype, as previously characterized SWR1-C mutants. AtYAF9A binds
to regulatory regions of master flowering genes altering their histone
acetylation levels and H2A.Z dynamics. In addition to flowering time
alterations, Atyaf9ayaf9b double mutant shows strong developmental
phenotypic defects as well as misregulation of many genes. We have
also isolated different mutant alleles for other NuA4 subunits and have
generated double mutant combinations to uncover the possible existence of
functional redundancy between homologues. We will present our current
data and speculate about their role in regulating plant development.
P08-8
Nuevas cepas de fitoplancton transgénico con
componentes antimicrobianos para reforzar el
sistema inmune innato de especies acuículas
Marta Vila Spinola, Encarnación Díaz-Santos, Marta de la Vega
Naranjo, Javier Vigara, Rosa León Bañares
Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales,
Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales,
Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del
Mar-CEIMAR, Huelva, ES
El uso de antibióticos para prevenir enfermedades en muchas especies
acuícolas es una práctica de riesgo que puede provocar la aparición de
patógenos resistentes, además los antibióticos nos son efectivos frente
a virus. La vacunación frente a enfermedades usuales puede hacerse en
ejemplares de peces adultos, pero es imposible de aplicar a alevines o a
otras especies acuícolas que carecen de un sistema inmune adaptativo,
como los bivalvos. En estos casos es necesario desarrollar alternativas de
compuestos antimicrobianos que refuercen el sistema inmunitario de los
ejemplares cultivados y mejoren sus tasas de supervivencia. Los AMP son
pequeños péptidos catiónicos que pueden inactivar a un amplio espectro
de bacterias, hongos y parásitos patógenos, además de virus y que se
encuentran muy conservados a lo largo de la evolución, lo que hace pensar
que su papel dentro del sistema inmune innato debe de ser fundamental.
En este trabajo hemos aislado el gen que codifica un pequeño péptido
con características antimicrobianas (AMP) a partir de tejido de Mytilus
galloprovincialis (mejillón), lo hemos clonado en el vector de expresión
“Phycogen high-expression vector” para microalgas suministrado por
la empresa Phycogenetics SL y lo hemos insertado en el genoma de una
70
XXXVII Congreso SEBBM
microalga, desarrollando fitoplancton con alto contenido en péptidos
antimicrobianos (AMP). La expresión del gen MitC se ha comprobado
a nivel de mensajero y a nivel de síntesis de proteínas. El carácter
antimicrobiano del fitoplancton obtenido está en estudio.
P08-9
Induction of bioflocculation in microalgae
Encarnación Díaz Santos, Marta Vila Spínola, Marta De la Vega
Naranjo, Rocío Rengel, Alicia Azogil, Rosa León Bañares, Javier
Vigara Fernández
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. Química y
Ciencia de los Materiales, Facultad de Experimentales, Universidad
de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES
Harvesting of microalgae biomass is a critical step, which accounts for
more than 30% of the total price of microalgal production. Reducing
its cost is essential to make economically feasible the production of bulk
products from microalgae, such as biodiesel which despite the enthusiasm
generated, is far from being competitive. Autoaggregation of flocculent
microalgae in response to stressing conditions is poorly understood, but it
is a promising approach to induce the aggregation of microalgae into flocks
and make microalgal harvesting a straightforward and cheap procedure.
The effect of the flocculent yeast strainSaccharomyces bayanus var. uvarum
and the flocculent microalgae Tetraselmis suecica on two chlorophytes:
the model freshwater microalga Chlamydomonas reinhardtii and the novel
marine microalgaPicochlorum sp HM1, was investigated. Both flocculent
microorganisms had a positive effect on microalgal cell aggregation and
improved flocculation efficiencies, which were considerably increased with
addition of yeasts grown in anaerobic conditions. In order to gain more insights
in the origin of microorganism-induced microalgal flocculation, proteins
released into the culture medium by the flocculent yeastSaccharomyces
bayanus var. uvarum were isolated and its ability to induce flocculation
was tested. The most abundant of these proteins was identified as a protein
like-glucanase and its addition in microalgal cultures caused an important
improvement of the flocculation effectiveness. The study was completed
evaluating the effect of some plant lectins on the chosen chlorophytes.
P08-10
Promotion of Arabidopsis growth and flowering
by Alternaria alternata volatile emissions is
a photocontrolled process involving dramatic
changes in the plant hormonome
Jun Li1, Nuria De Diego2, Ángela María Sánchez-López1, Abdellatif
Bahaji1, Francisco José Muñoz1, Edurne Baroja-Fernández1, Karel
Dolezal2, Lukas Spichal2, Javier Pozueta-Romero1
1
Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra),
Mutilva, ES, 2Centre of the Region Haná for Biotechnological
and Agricultural Research, Department of Chemical Biology and
Genetics, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, CZ
Plants perceive biotic stimuli by recognizing different signaling substances
originating from the interacting microorganisms. Some of them are volatile
compounds. Volatile emissions from some rhizobacterial isolates promote
growth in Arabidopsis by facilitating nutrient uptake, photosynthesis and
defense responses, and by decreasing glucose sensing and ABA levels.
Analyses of Arabidopsis mutants affected in hormone signaling have
indicated possible involvement in the reaction to rhizobacterial volatiles. We
found that the production of volatilespromoting plant growth is not restricted
to some rhizobacteria, and that volatiles emitted by different microbial
species ranging from Gram-negative and Gram-positive bacteria to different
fungi (including plant pathogens and microbes normally not interacting with
plants) promote both growth and accumulation of exceptionally high levels of
starch in leaves of both mono- and di-cotyledonous plants. This phenomenon,
initially designated as MIVOISAP (for MIcrobial VOlatiles Induced Starch
Granada 2014
Accumulation Process), involves changes in the leaf transcriptome and
metabolome. To better understand MIVOISAP, we analyzed the effect of
volatiles emitted by Alternaria alternata on Arabidopsis development. We
found that itsvolatiles induce rapid growth, development of secondary roots
and initiation of the flowering. Using different mutants we also observed
that MIVOISAP down-regulated genes involved in light signaling and in the
main hormone synthesis and signaling. We also carried out high throughput
analyses of hormone content in root and leaves of plants exposed to A.
altertata volatile emissions. The overall data showed that MIVOISAP is a
photocontrolled process involving dramatic changes in the hormonome of
the both plant organs.
This research was partially supported by the grants [BIO2010-18239]
from the Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología and Fondo
Europeo de Desarrollo Regional (Spain) and by Iden Biotechnology. A-M.
S-L. acknowledges a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of
Science and Innovation as well as the Ministry of Education, Youth and
Sports, Czech Republic (Grant L01204 from the National Program of
Sustainability and Agricultural Research and project POST-UP, reg. No.
CZ.1.07/2.3.00/30.0004).
P08-11 (R08-5)
PpNAC1, posible candidato para articular la red
transcripcional implicada en la síntesis de pared
celular secundaria en pino
M. Belén Pascual, Blanca Craven-Bartle, Francisco M Cánovas,
Concepción Ávila
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de teatinos, Málaga, ES
El conocimiento de las redes de regulación transcripcional que controlan
procesos importantes en coníferas es muy limitado. Por ello, la identificación
y caracterización funcional de factores de transcripción (TF) es esencial para
comprender la regulación de genes implicados en procesos estrechamente
ligados a la productividad forestal. El transcriptoma de P. pinaster contiene
877 TF distribuidos en 30 familias. Este número es similar al descrito en
abeto blanco y menor al descrito en angiospermas (Canales y col. 2014).
Los factores de transcripción NAC constituyen una gran familia génica
específica de las plantas. Usando la información disponible en la base de
datos Sustainpine, hemos identificado 37 posibles genes NAC en pino.
Los análisis filogenéticos y la identificación de motivos conservados
con el programa MEME realizados en otras especies sugieren que genes
relacionados estructuralmente podrían ejercer funciones similares (Shen y
col. 2009). Según esto, hemos visto que PpNAC1 se agrupa en el mismo
clado que NST1, NST2 y SND1 de Arabidopsis, genes implicados en la
formación de pared celular secundaria. Por tanto, PpNAC1 es un candidato
interesante para estudiar la formación de madera en una especie forestal
como el pino donde dicho proceso es de gran importancia económica.
Ensayos de retraso en gel y estudios de expresión transitoria en protoplastos
de pino se han utilizado con el objetivo de elucidar el papel de PpNAC1 en la
red de regulación transcripcional que controla la formación de pared celular
secundaria, así como el control sobre los factores R2R3-Myb, esenciales en
el metabolismo de la fenilalanina y posterior síntesis de fenilpropanoides
(Craven-Bartle y col. 2013). Resultados preliminares apuntan a que PpNAC1
regula su propia expresión así como la expresión de factores Myb implicados
en el proceso. Todo esto nos permite especular sobre su posible función como
regulador río arriba de la biosíntesis de fenilalanina, el aminoácido precursor
de la lignina. La obtención de líneas embriogénicas de pino sobreexpresoras
de PpNAC1 y RNAi en curso, junto con su posterior caracterización, nos
proporcionará la información necesaria para demostrar la implicación de este
factor de transcripción en la síntesis de pared celular secundaria.
Bibliografía
Canales y col. 2014. De novo assembly of maritime pine transcriptome:
implications for forest breeding and biotechnology. Plant Biotechnology
Journal 12: 286-299.
Pósters
Craven-Bartle y col. 2013. A Myb transcription factor regulates genes of
the phenylalanine pathway in maritime pine. The Plant Journal 74: 755-
766.
Shen y col. 2009. A Bioinformatic analysis of NAC genes for plant cell
wall development in relation to lignocellulosic bioenergy production.
Bioenergy Res 2: 217-232.
P08-12
El herbicida auxínico ácido
2,4-diclorofenoxiacético induce alteraciones
del citoesqueleto de actina por carbonilación
y S-nitrosilación y afecta la dinámica de
peroxisomas y mitocondrias
Maria Rodríguez-Serrano1, Diana M Pazmiño1, Imogen Sparkes2,
Chris Hawes2, Maria C Romero-Puertas1, Luisa M Sandalio1
1
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular
de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada,
ES, 2School of Biological & Medical Sciences, Oxford Brookes
University, oxford, UK
El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es una auxina sintética utilizada
como herbicida. Altas concentraciones de 2,4-D inducen malformaciones
en hojas (epinastia) y tallosy muerte celular. En este trabajo se han
estudiado losmecanismos moleculares implicados en la toxicidad del 2,4-
D mediante el análisis de la producción de especies de oxígeno reactivo
(ROS), óxido nítrico (NO) en plantas de Arabidopsis y su efecto sobre la
estructura del citoesqueleto y la dinámica de peroxisomas y mitocondrias.
La aplicación foliar de 2,4-D (23 mM) producía epinastia en hojas y este
fenotipo podía prevenirse por pre-tratamiento con EDTA. El análisis de la
acumulación de ROS mediante microscopía confocal mostró un incremento
dependiente de 2,4-D del H2O2 y O2.- asociado a pequeños orgánulos,
posiblemente peroxisomas y mitocondrias, mientras que la acumulación
total de NO no se afectaba por el tratamiento. El análisis del citoesqueleto
de actina mediante el uso de una línea de Arabidopsis FABD2-GFP mostró
alteraciones el mismo dependientes del 2,4-D. El análisis de modificaciones
postraduccionales de proteínas por carbonilación y S-nitrosilación
demostró que la actina experimenta ambas modificaciones lo que afecta
a su polimerización, tal como sugiere la relación de F-actin/G-actin. Estos
efectos se reducían por el tratamiento con EDTA, que a su vez reducía
la oxidación de proteínas y en particular de la actina. El 2,4-D también
reducía la velocidad y desplazamiento de peroxisomas y mitocondrias,
como consecuencia de las alteraciones observadas en el citoesqueleto.
Para determinar la fuente de ROS implicada en este proceso, se analizó
el fenotipo de distintos mutantes de Arabidospsis, entre ellos, las líneas
deficientes en xantina deshidrogenasa y enacilCoA oxidasa que mostraron
una reducción considerable de la epinastia.Se ha analizado además la
regulación de la epinastia por ABA, jasmónico y etileno. Los resultados
obtenidos sugieren que la epinastia es el resultado de alteraciones del
citoesqueleto de actina dependientes de ROS y NO.
Trabajo financiado por ERDF-BIO2008-04067 y BIO2012-36742 del
MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337).
P08r-13
Modulación de la capacidad antioxidante del
ciclo ascorbato-glutatión por modificaciones
post-traduccionales mediadas por óxido nítrico
Juan Carlos Begara-Morales1, Beatriz Sánchez-Calvo1, Mounira
Chaki1, Raquel Valderrama1, Capilla Mata-Pérez1, Javier López-
Jaramillo2, María N. Padilla1, Alfonso Carreras1, Francisco Javier
Corpas3, Juan Bautista Barroso1
1
Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico,
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad
71
Pósters
de Jaén, Jaén, ES, 2Instituto de Biotecnología, Departamento de
Química Orgánica, Universidad de Granada, Granada, ES, 3Grupo
de Antioxidantes, Radicales Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología
y Agroalimentación, Departamento de Bioquímica, Biología
Molecular y Celular de Plantas - Estación Esperimental del Zaidín,
CSIC, Granada, ES
Las modificaciones post-traduccionales mediadas por óxido nítrico
(MPT-NO), tales como nitración y S-nitrosilación, pueden modular la
función de dianas proteicas [1]. Sin embargo, la información disponible
sobre su efecto en la actividad y estructura de proteínas involucradas en
sistemas antioxidantes es limitada. Por esta razón, se analizó el efecto
de estas MPT-NO sobre las principales enzimas del ciclo ascorbato-
glutatión, clave en la detoxificación y regulación de los niveles de
peróxido de hidrógeno en plantas [2]. En este estudio, se utilizaron
diferentes proteínas recombinantes de guisante: Ascorbato peroxidasa
citosólica (APX), monodeshidroascorbato reductasa peroxisomal
(MDAR) y glutatión reductasa (GR) citosólica y cloroplastídica. Los
resultados pusieron de manifiesto una regulación diferente de las enzimas
del ciclo. En el caso de la APX disminuyó su actividad por nitración y
aumentó por S-nitrosilación [3], mientras que las GR no se modificaron
y la MDAR fue inhibida por ambas modificaciones. Además, en la APX
se identificaron las dianas de estas MPT-NO y su implicación funcional.
Finalmente, utilizando plantas de guisante sometidas a estrés salino se
observó que la S-nitrosilación de APX ocurre in vivo y que aumenta
durante esta situación de estrés [3].
En conclusión, se evidenció que el ciclo ascorbato-glutatión presenta
regulación por NO, sugiriendo además una estrecha relación entre el
metabolismo de NO y ROS en plantas.
Referencias
[1] Corpas FJ et al. Plant Sci (2011), 181:604-611.
[2] Noctor and Foyer. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1998),
49:249-279.
[3] Begara-Morales JC et al. J Exp Bot (2014), 65:527-538.
Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos
BIO2012-33904 y 20134R0569) y Junta de Andalucía (grupos BIO286 y
BIO192).
P08-14
Caracterización funcional de la quinasa CPK1
peroxisomal en respuesta a estrés biótico y
abiótico en plantas de Arabidopsis
Katiuska Cárdenas, María Rodríguez-Serrano, Adela Olmedilla
Arnal, María C. Romero-Puertas, Luisa M. Sandalio
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de
Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Profesor Albareda
1, Granada, ES
La modificación postraduccional de proteínas por fosforilación es
uno de los mecanismos más comunes en la regulación de la actividad,
localización subcelular y degradación de proteínas. Estos procesos están
implicados en el reconocimiento de cambios en el entorno celular y en la
regulación de la respuesta celular frente a factores bióticos y abióticos.
Los peroxisomas son fuentes importantes de señales celulares como
especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (ROS, RNS) y hormonas,
y tienen un papel central en la regulación de procesos metabólicos
esenciales para la célula y en la respuesta celular al estrés. La presencia
de quinasas y fosfatasas en estos orgánulos ha sido recientemente
demostrada, si bien sus proteínas diana y su función no han sido
establecidas. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización
de la quinasa de Arabidopsis thalina CPK1 en respuesta a estrés por
metales (Cd y As), e infección por Pseudomonas syringae (Pst avrB).
Para ello, se ha utilizado un mutante de Arabidopsis deficiente en
esta proteína, cpk1. En este mutante se ha analizado el fenotipo de la
planta en respuesta a los estreses anteriormente mencionados, así como
72
XXXVII Congreso SEBBM
la ultraestructura de la hoja en respuesta al tratamiento con Cd. Para
establecer posibles dianas de la CPK1 se ha analizado la actividad de
proteínas peroxisomales que previamente se ha demostrado que pueden
fosforilarse, la glicolato oxidasa, catalasa y superóxido dismutasa.
También se ha analizado el papel de esta quinasa en la regulación de la
acumulación de H2O2 en respuesta al tratamiento con Cd. Los resultados
obtenidos sugieren que la CPK1 podría regular la producción de H2O2
procedente de la fotorrespiración en situaciones de estrés por Cd. En
estas condiciones, las hojas de plantas cpk1 experimentan cambios
importantes en la ultraestructura de la célula que afectan especialmente
a los peroxisomas. Por el contrario, la deficiencia de CPK1 no afecta
a la respuesta frente al As ni a la respuesta hipersensible frente a Pst
avrB.
Trabajo financiado por ERDF-BIO2008-04067y BIO2012-36742del
MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337).
P08-15
PpMyb23, un nuevo factor de transcripción Myb
R2R3 de coníferas relacionado con el desarrollo
de las acículas y el metabolismo
de los flavonoides
Jose M Granados, Marina Rueda-López, Mª Belén Pascual,
Concepción Ávila, Francisco M Cánovas, Rafael A. Cañas
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos,
Málaga, ES
En un trabajo previo de nuestro laboratorio hemos caracterizado el
metabolismo anual de las acículas de árboles adultos de Pinus pinaster
(Aiton) en condiciones naturales mediante el análisis de redes de co-
expresión de genes (WGCNA). Gracias a este análisis se pudo identificar
un nuevo factor de transcripción Myb R2R3 de coníferas, que ha sido
nombrado como PpMyb23, asociado al desarrollo de las acículas y al
metabolismo de los flavonoides. El análisis de su secuencia muestra que
no pertenece al Subgrupo 4 de factores Myb R2R3 que han sido propuestos
como los principales responsables de la regulación del metabolismo de
los flavonoides en coníferas (Bedon et al. 2010). La caracterización de su
expresión génica a lo largo del desarrollo plantular confirma que la acción
de PpMyb23 se encuentra ligada a las acículas, probablemente en respuesta
a las condiciones lumínicas. Como otros factores Myb R2R3 relacionados
con el metabolismo de los flavonoides su expresión se modifica por metil-
jasmonato (MeJA).
Bibliografía
Bedon F, Bomal C, Caron S, Levasseur C, Boyle B, Mansfield SD, Schmidt
A, Gershenzon J, Grima-Pettenati J, Séguin A, MacKay J. (2010) Subgroup
4 R2R3-MYBs in conifer trees: gene family expansion and contribution to
the isoprenoid- and flavonoid-oriented responses. J Exp Bot. 61(14): 3847-
3864.
P08-16
Respuesta antioxidante y fotosintética
de la fanerógama marina Posidonia oceanica al
estrés por deficiencia lumínica
Anna Maria Ortolà Garcia
Dpto. Producció Vegetal, Universitat Politècnica de València,
València, ES
La Posidonia oceanica (L.) Delile es una fanerógama marina endémica
del mar Mediteráneo, en donde forma extensas praderas cuya distribución
está estrechamente unida a la capacidad de penetración de la luz en el agua.
Su ecosistema está reconocido por el European Habitats Directive (92/43/
CEE) como hábitat de interés prioritario. Actualmente las praderas litorales
Granada 2014
están en regresión como consecuencia, entre otros factores, del incremento
de la sedimentación y turbidez del agua por vertidos urbanos e industriales,
que modifican las condiciones de iluminación de la columna de agua bajo
la cual se asienta la pradera, generando una situación de estrés en la planta
por la atenuación de la luz solar.
En este trabajo se estudia la influencia de la deficiencia de luz en plantas
de posidonia de praderas naturales situadas en la costa alicantina de Denia.
Se analiza la respuesta antioxidante y fotosintética de plantas localizadas
en praderas a 3 y a 9 metros de profundidad, de dos zonas con distinta
calidad de agua, una en las inmediaciones del emisario submarino de aguas
residuales de Denia y otra en un área alejada de su influencia.
Se cuantifica el contenido en pigmentos fotosintéticos, carbohidratos
solubles, sacarosa, almidón y la actividad del enzima sacarosa sintetasa
(SS) para analizar la respuesta fotosintética. Se determina la actividad de
los enzimas catalasa, superóxido dismutasa y ascorbato peróxidasa, y se
miden los niveles de malondialdehido (MDA), como indicadores del estrés
oxidativo.
Los resultados obtenidos apuntan a una disminución de los carbohidratos y
pigmentos fotosintéticos en la planta con el incremento de la profundidad
y turbidez, y un aumento de la actividad de los enzimas antioxidantes,
en respuesta al deterioro del funcionamiento fotosintético debido a la
limitación de la luz solar.
P08-17
Genes encoding beta-mannanases in
Brachypodium distachyon seeds have a role not
only in cell wall softening upon germination
sensu stricto but also during post-germinative
reserve mobilization
Virginia Gonzáles-Calle, Raquel Iglesias Fernández, Victoria Llanos-
Casado, Pilar Carbonero
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP) - Instituto
Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria –
Universidad Politécnica de Madrid, Pozuelo de Alarcón (Madrid), ES
Brachypodium distachyon seeds are characterized by presenting low
levels of starch and high levels of (1,3; 1,4) β-glucans in its endosperm
cells besides having thick mannan-rich cell walls. Upon germination
and subsequent reserve mobilization β-mannanase encoding genes are
selectively induced.
Endo-β-mannanases (EC 3.2.1.78) are hydrolytic enzymes that catalyze
the cleavage of β(1-4) bonds in the mannan polymer. In the genome of
Brachypodium, the endo-β-mannanase (MAN) family is represented by
six members. We have systematically explored the expression of the six
MAN genes in different organs (leaves, roots, spikes, developing seeds)
and we have found that in dry seeds BdMAN3 is the most highly expressed
gene, but its expression decreases upon germination in aleurone while
the other five are induced at 36 hours of imbibition. In the germinating
embryo the most important genes are BdMAN2 and BdMAN6. In situ
hybridization analysis shows that BdMAN2 and BdMAN6 transcripts
accumulate in the coleorhiza while BdMAN3 is mainly expressed in the
radicle tip.
Difference in sequence and expression of the MAN gene family in
Brachypodium distachyon and in other cereals, and their different putative
functions in comparison to those reported in Arabidopsis thaliana [1,2] that
are mainly involved in germination sensu stricto, are discussed.
References
[1] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Carbonero P, Matilla AJ
(2012) Softening-up mannan-rich cell walls. J. Exp. Botany 63: 3975-3988.
[2] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Barrero-Sicilia C,
Carbonero P, Matilla AJ (2011) Three endo-β-mannanase genes expressed
in the micropylar endosperm and in the radicle influence germination of
Arabidopsis thaliana seeds. Planta 233: 25-36
Pósters
P08r-18
Microbacterium sp. 3J1 reduces the expression
of enzymes involved in ethylene pathway in roots
of pepper plants under drought conditions
Cristina García-Fontana, Juan Ignacio Vílchez, Jesús González-
López, Maximino Manzanera
Instituto del Agua, Universidad de Granada, Granada, ES
Plant water deficit is one stress which has been extensively associated
with elevated release of ethylene. The impact of water stress on ethylene
synthesis is of interest because ethylene is responsible for senescence and
abscission induced by water deficits. Some microorganisms present in
the rhyzosphere protect plants from drought by interaction with the plant
host. The interaction of these microorganisms, that we term Drought Plant
Protecting Bacteria (DPPB), with the plant is translated in a reduction of
the ethylene produced by the plant. We have isolated a Microbacterium
sp. 3J1 strain that is desiccation tolerant soil bacterium and can interact
with plants as DPPB. The inoculation of pepper plants with this strain
reduced the ethylene produced by the plant and this in turn induced a
marked delay in senescence. Here we used proteomic to compare plants
inoculated with Microbacterium sp. 3J1 subjected to drying conditions
with non-inoculated plants. Presence of the microorganism is translated
in a reduction of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH). A
dramatic reduction of SAHH could be translated in accumulation of SAH
(S-Adenosylhomocysteine) and SAM (S-adnosylmethionine), a methyl
donor for choline production, which is used for glycinebetaine production,
a potent xeroprotectant produced in the chloroplast. SAHH also controls
biological methylation reactions by mediating the intracellular SAH/
SAM ratio. DNA and protein methylation and demethylation play
an important role in signal transduction. We do not discard additional
signal transduction effects on other pathways to increase desiccation
tolerance on the plant by the reduction in SAHH caused in presence of
Microbacterium sp. 3J1.
P08-19 (R08-4)
Differential analysis of root proteome obtained
in microbe-plant interaction as a tool for
identification of proteins involved in resistance
to drought events in pepper plants
Juan Ignacio Vílchez1, Cristina García Fontana2, Jesús González
López1, Maximino Manzanera Ruiz1
1
Universidad de Granada, Ogíjares, Granada, ES, 2Instituto del
Agua, Universidad de Granada, Granada, ES
A collection of bacterial strains isolated in our laboratory, have been
shown to reduce dehydration stress1. These strains have also been shown
to protect plants against abiotic stresses by colonizing the rhizosphere of
various plant species, and promoting plant growth by reducing ethylene
production via ACC-deaminase activity and by reducing the reduction
of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH) of the plant2. Apart from
ethynele accumulation, drought also causes damages by accumulation
of reactive oxygen species (ROS)3. Preliminary investigation on the
molecular basis of bacterial mediated drought stress alleviation was
performed by examining the mRNA levels of three important drought stress
responsive genes, DREB2A, CAT1, and DHN in inoculated plants by real-
time quantitative polymerase chain reaction (qPCR)4. Here we describe
the effect of Microbacterium sp. 3J1 over the plant under water stress at
the proteomic level using two-dimensional electrophoresis assisted by
PDQuest Basic 2D Gel Analysis software. Differentially expressed proteins
were identified by mass spectrometry Mass (MALDI TOF-TOF) let us
identify a reduction in proteins such as disulfoxide isomerase, nucleoside
diphosphate kinase, Glutathione S Transferase and Annexin, involved in
response to oxidative stress. Likewise, a decrease in proteins involved in
systemic resistance as chitinases and dehydrogenases was observed as well
as in several proteins involved in the pathway of ethylene on plants such as
73
Pósters
S adenosyl homocysteine hydrolase, response factor binding ethylene, beta
subunit of succinyl CoA and Caffeoil CoA.
P08-20
Identificación de genes de referencia para
estudios de RT-qPCR en Pinus pinaster (Aiton)
José M. Granados, Concepción Ávila, Francisco M. Cánovas, Rafael
A. Cañas
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos,
Málaga, ES
La técnica de RT-qPCR es uno de los procedimientos experimentales más
utilizados para el análisis de la expresión génica. El desarrollo experimental
requiere la normalización de los resultados obtenidos mediante comparación
con otros genes de referencia cuyos niveles de expresión sean uniformes en
las condiciones estudiadas. En los primeros estudios realizados mediante
esta técnica se usaron para la normalización genes implicados en el
mantenimiento de funciones celulares básicas (“housekeeping genes”).
Sin embargo, los niveles de expresión de dichos genes no son invariables
y se requiere una verificación experimental preliminar para determinar
qué genes resultan adecuados en cada organismo o tejido a estudiar. La
falta de metodologías de trabajo estandarizadas ha provocado errores
metodológicos y experimentales en la identificación de genes de referencia
y en la aplicación de esta técnica que cuestionan los resultados obtenidos.
Se han presentado diferentes propuestas para establecer una metodología
experimental adecuada, siendo en estos momentos la más aceptada MIQE
(“Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR
Experiments”).
El pino marítimo (Pinus pinaster Aiton) es una planta modelo de interés
forestal en la que se están realizando avances en biología molecular. En
el presente trabajo, hemos realizado la búsqueda de genes de referencia
adecuados para la normalización de los datos de RT-qPCR tanto en acícula
adulta de P. pinaster como en los primeros estadios de desarrollo plantular
siguiendo las recomendaciones del MIQE. Nuestro objetivo es la obtención
de resultados fiables y reproducibles en estudios de expresión génica en P.
pinaster.
P08r-21
Detección y formación endógena de ácidos grasos
nitrados en el aceite de oliva
Raquel Valderrama Rodríguez, Beatriz Sánchez-Calvo, Capilla Mata-
Pérez, María N. Padilla, Juan C. Begara-Morales, Juan B. Barroso
Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico,
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de
Jaén, Jaén, ES
El óxido nítrico (NO) y especies de nitrógeno reactivo derivadas (RNS)
reaccionan con ácidos grasos insaturados originando ácidos grasos
nitrados (NO2–FA). Estas moléculas se consideran novedosos mediadores
de señalización celular que abarcan un amplio conjunto de respuestas
celulares en sistemas animales, entre los que destacan una probada función
anti-inflamatoria y beneficios a nivel de salud cardiovascular [1]. El aceite
de oliva virgen extra (EVOO) es la fuente principal de los lípidos en la
dieta mediterránea, y promueve respuestas anti-inflamatorias y beneficios
clínicos a través de mecanismos pobremente definidos. El presente estudio
evaluó mediante LC-MS/MS, el contenido endógeno de NO2–FA, tanto en
aceituna como en EVOO procedentes de tres variedades de la provincia
de Jaén. Se observó la presencia de ácido nitro-linoleico conjugado (NO2-
CLA) en los tres aceites ensayados. El carácter electrofílico de estos
NO2–FA fue confirmado por la detección HPLC-MS/MS [2] de niveles
significativos de aductos de cisteína-proteína de ácido nitro-oleico (NO2-
OA-cisteína) en el fruto. Además, la nitración de EVOO por nitritos en
condiciones digestivas de acidez gástrica, reveló que el consumo humano
de los EVOO origina un incremento de NO2-CLA y NO2-OA. Estos
74
XXXVII Congreso SEBBM
resultados identifican por primera vez NO2–FA en plantas y sugieren que el
consumo en la dieta y la generación fisiológica de estos lípidos electrófilos
anti-inflamatorios contribuye a los beneficios fisiológicos de las dietas ricas
en ácidos grasos insaturados.
Bibliografía
[1] Freeman BA et al., J Biol Chem. (2008), 283(23):15515-9.
[2] Trostchansky A et al., Free Radic Biol Med. (2008), 44(11):1887-96.
Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO2012-
33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286).
P08r-22
Bio-hydrogen production in the green algae
Chlamydomonas: effect of H2 partial pressure,
acetate and oxygen
Jose Luis Jurado Oller, David González Ballester, Aurora Galván
Cejudo, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad
de Córdoba, Córdoba, ES
Under anaerobic conditions, some unicellular algae and bacteria produce a
hydrogenase enzyme able to produce hydrogen (H2) in a reversible reaction.
H2 production in algae is a clean source of H2 that can be potentially
cheaper than any other way to produce H2 and would also contribute to the
capturing of atmospheric CO2.
Unfortunately, bio-H2 production is a low efficiency process and two of the
main limitations are: 1) the high O2 sensitivity (hydrogenases are inhibited
by O2 at transcriptional and post-translational level). 2) H2 production is a
transient process that do not last more than a few days.
We have investigated different approaches to optimize the H2 production
in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. This alga is able
to perform three different pathways to produce H2. Two of them are linked
to photosynthesis (PSII-dependent and PSII-independent pathways) and
the main difference between these two pathways is the original source
of electrons. In the PSII-dependent pathway, the electrons come from
the photolysis of water at PSII level. Whereas in the PSII-independent
pathway, the electrons come from starch degradation. A third pathway
for H2 production is also possible through fermentative pathways that use
starch as electron donor.
As starting point of our project we screened 22,000 insertional mutants
for two different phenotypes: starch and photosynthetic mutants. Both
phenotypes can have theoretically an impact in the H2production process.
One photosynthetic deficient strain showed an improved H2 production
(PSII-linked) under low light conditions.
The effect of the H2 accumulation in the cultures headspace was also
investigated. We found that H2 partial pressure is an important factor that
can inhibit the production. By aerating the cultures we have improved H2
production by 10 times.
Finally, we studied the effect of acetate in the culture media. Cultures
that were supplemented with acetate can improve H2 production by 2
times. Moreover, continuous supplementation with acetate can result in a
sustained H2 production.
Altogether, our results show an optimization of the H2 production process
in Chlamydomonas by more than 60 times.
P08-23
Autentificación de aceite de oliva mediante qPCR
Sonia Ramos-Gómez, Natividad Ortega Santamaría, María D. Busto,
David Palacios, Manuel Pérez-Mateos
Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias,
Universidad de Burgos, Burgos, ES
El elevado valor nutricional del aceite de oliva puede verse reducido
mediante adulteración con otros aceites vegetales. Este tipo de práctica
Granada 2014
supone, además, importantes pérdidas económicas por lo que es necesario
certificar la autenticidad del aceite de oliva. La elevada sensibilidad y
fiabilidad de las técnicas basadas en ADN les han convertido en una
herramienta básica en el control de calidad y seguridad alimentaria. En
este contexto, el objetivo de este trabajo fue determinar la aplicabilidad de
métodos basados en ADN y PCR cuantitativa (qPCR) para la autentificación
de aceite de oliva.
Se analizaron mediante qPCR nueve sistemas de amplificación específicos
para olivo: tres previamente publicados (PIP5, G219/172H y C4-80), y
seis diseñados en este trabajo (ycf1, clpP, Pre, PetN, 1post y 2post). La
aplicabilidad de dichos sistemas se determinó mediante cuantificación de
ADN de olivo, amplificación específica de olivo frente a otras especies
oleaginosas, cuantificación de olivo en mezclas de ADN y amplificación de
ADN de aceites de oliva.
De los resultados obtenidos destacar que el sistema 2post no permitió
cuantificar ADN de olivo, los sistemas ycf1, clpP y PIP5 mostraron rangos de
cuantificación limitados, y C4-80 no presentó especificidad. Por el contrario,
el intervalo de cuantificación de G219/172H y PetN osciló entre 2,5 μg y
25 pg y entre 2,5 μg y 2,5 pg para Pre y 1post, mostrando especificidad
para olivo frente a colza, girasol, soja y maíz. La especificidad relativa de
G219/172H y 1post fue del 0,2% de ADN de olivo en ADN de sésamo, y del
0,1% para Pre y PetN. Además, estos sistemas permitieron la detección de
ADN extraído de aceites de oliva. No obstante, es necesario comprobar su
especificidad en otros aceites vegetales y en alimentos elaborados.
P08-24
Efecto sobre la fotosíntesis y la acumulación de
azúcares en frutos de fresa (Fragaria x ananassa)
de la reducción de los niveles de las isoformas
cFBP1 y cyFBP de FBPasa
Antonio Jesús Serrato Recio1, José Antonio Rojas González1, Juan
Antonio García Gago2, Fernando Pliego Alfaro2, José Ángel Mercado
Carmona2, Mariam Sahrawy Barragán1
1
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de
Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES,
2
Departamento de Biología Vegetal, IHSM-UMA-CSIC, Universidad
de Málaga, Málaga, ES
La fructosa-1,6-bifosfatasa (FBPasa) juega un papel clave en la fijación
del CO2 atmosférico durante la fotosíntesis y en procesos gluconeogénicos,
conociéndose tres isoformas, localizadas en el cloroplasto (cFBP1 y
cFBP2) y el citosol (cyFBP). cFBP1 forma parte de las enzimas del ciclo
de Calvin y contiene un lazo regulador que la hace dependiente del estado
redox del cloroplasto, siendo regulada por tiorredoxina f. Sin embargo,
al contrario que con cFBP1, no se ha descrito ninguna regulación redox
para cyFBP, la cual forma parte de la ruta de biosíntesis de sacarosa. A
la isoforma cFBP2 todavía no se le ha asignado una función fisiológica
definida, pudiendo participar en procesos relacionados con las otras dos
isoformas, las cuales muestran un mayor nivel de expresión que cFBP2.
La fresa (Fragaria x ananassa) es un cultivo estratégico para la agricultura
española, siendo una de sus cualidades organolépticas más valoradas,
por su contenido en sacarosa, el sabor dulce del fruto. Aunque en los
estadíos iniciales tiene cierta capacidad fotosintética, la mayor parte de los
azúcares acumulados en los frutos son transportados por el floema desde
las hojas. Para determinar el papel de las FBPasas en el contenido final
de sacarosa en fruto se realizaron construcciones antisentido para cFBP1
y sobre-expresoras para cyFBP con las que se transformaron plantas de
fresa, obteniéndose una serie de líneas que contenían el marcador de
selección. Estas líneas fueron analizadas mediante la técnica de western-
blot para determinar el nivel de expresión de las dos isoformas estudiadas.
Asimismo, se ha relacionado la capacidad fotosintética de estas líneas
con el contenido en FBPasas de las hojas. Para la caracterización de los
frutos de fresa se han analizado parámetros como el peso, la dureza o los
grados Brix (directamente relacionados con el contenido en azúcares,
principalmente la sacarosa).
Pósters
Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de
Ciencia e Innovación (BIO2009-7297) y por la Junta de Andalucía (P07-
CVI-02795).
P08-25
Respuesta antioxidante al estrés hídrico en
plantas de sorgo
Magaly Pérez Lara, Víctor Olalde Portugal, Silvia Edith Valdés
Rodríguez
CINVESTAV Irapuato, Irapuato, MX
El sorgo es una planta gramínea que es capaz de tolerar el estrés por
deficiencia de agua, por lo que diversos estudios se han enfocado en la
respuesta bioquímica el estrés hídrico. Nuestro grupo de trabajo realizó
un estudio de proteómica en hojas de sorgo, en respuesta al estrés hídrico,
haciendo uso de electroforesis en geles de 2D y la Espetrometría de masas.
Los resultados obtenidos indicaron que las proteínas que aumentan, en su
mayoría están relacionadas con la respuesta antioxidante. Con el fin de validar
los cambios observados en el estudio de proteómica, se planteó cuantificar
la actividad antioxidante en hojas de plantas de sorgo (Sorghum vulgare
var. BJ 83 Caloro) de 58 días después de la siembra, sometidas a estrés por
deficiencia de agua, el cual consistió en someter a las plantas a un estrés
gradual durante 7 días, llegando a suprimir el riego durante un día, mientras
que el control estuvo bajo riego adecuado. En extractos de hoja de plantas
control y sometidas a estrés hídrico, se evaluó la capacidad antioxidante y
la relación glutatión oxidado/reducido, además se cuantificó la actividad
de enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa y ascorbato
peroxidasa. Los resultados obtenidos indican que hubo un aumento de estas
actividades en las plantas que fueron sometidas a estrés hídrico, lo cual
sugiere que esta actividad podría estar contribuyendo a la tolerancia al estrés.
En este estudio se destaca la importancia de estas enzimas en la tolerancia al
estrés hídrico estableciendo parámetros para cuantificar el nivel de estrés en
plantas de sorgo, que podrían ser utilizados como referencia en otras especies
de plantas con importancia económica y social.
P08-26 (R08-6)
La interrupción de la función de las fructosa-
1,6-bisfosfatasas cloroplastídica y citosólica
induce cambios metabólicos que afecta todos los
procesos en plantas de Arabidopsis thaliana
José Antonio Rojas González1, Antonio Jesús Serrato Recio1, Ina
Thormählen2, Peter Geigenberger2, Mariam Sahrawy Barragán1
1
Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Estación
Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2Ludwig-Maximilians-
Universität München, Martinsried, DE
Se han caracterizado tres mutantes de Arabidopsis thaliana con pérdida
de función en las enzimas fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasas) citosólica
(cyfbp) y cloroplastídica 1 (cfbp1) y de ambas (cyfbp cfbp1). Debido al
papel clave que ejerce la enzima plastidial en el Ciclo de Calvin, las plantas
mutante cfbp1 presentan un tamaño más reducido en relación con el silvestre
afectando especialmente la tasa fotosintética, estructura de la hoja, raíz y
el desarrollo de la planta. Cuando se interrumpe la función de la isoforma
citosólica en la síntesis de la sacarosa provoca un acumulo de almidón en
los cloroplastos y contenido de sacarosa similar al silvestre. Interesante fue
comprobar que el doble mutante cyfbp cfbp1 puede heredar las características
de uno u otro parental, sin embargo el fenotipo es similar al del mutante cfbp1.
Los cambios fisiológicos inducidos por la pérdida de función de las FBPasas
en cada uno de los mutantes podrían indicar modificaciones en varios
procesos metabólicos importantes. Para estudiar el papel de ambas enzimas
en la síntesis y distribución de azúcares en plantas se ha suministrado, a
cada mutante, un aporte exógeno de azúcares (sacarosa, glucosa, fructosa,
manitol, glucosa 1P, glucosa 6P, fructosa 6P y fructosa-1,6-bisfosfato)
observando en algunos casos la recuperación del fenotipo silvestre. Se han
75
Pósters
determinado los contenidos en hexosas, sustrato, triosas fosfato y analizado
los metabolitos en los tres mutantes mediante GS MS. Los resultados
muestran que como respuesta a la falta de una o ambas FBPasas se produce
un acumulo de sustrato y de triosas P. La pérdida de la enzima cloroplastídica
cFBPasa1 provoca un significativo cambio en los niveles de los metabolitos
pertenecientes a distintas categorías, azúcares, azúcares alcohol, aminos
ácidos, ácidos orgánicos, antioxidantes, etc. Estos resultados sugieren que
en el mutante cyfbp la planta reorganiza su metabolismo carbonado, mientras
que en los mutantes cfbp1 y doble mutante, existe una respuesta general de la
planta para evitar la situación extrema a la cual está sometida por la falta de
aporte carbonado. BIO 2012-33292. Junta de Andalucía BIO 154.
P08-27
Arabidopsis mutants in the bHLH transcription
factors SPEECHLESS and MUTE reveal
transcriptional and functional features of
stomataless plants in photosynthesis and
secondary metabolites
Marisa Pérez Bueno1, Magdalena Triviño2, Alberto de Marcos2,
Carmen Fenoll2, Montaña Mena2, Matilde Barón1
1 P09-1
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas
- Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Departamento
de Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias Ambientales y
Bioquímica, Universidad de Castilla la Mancha, Toledo, ES
Stomata are microscopic valves formed by guard cell pairs in the epidermis of
terrestrial plants. As they regulate gas exchange with the atmosphere, stomata
are essential for CO2 uptake and H2O loss, thus controlling photosynthesis,
transpiration and leaf temperature. Plants dynamically regulate stomatal
opening in response to environmental conditions; work in Arabidopsis during
the last years has also established that stomata abundance is also regulated
during leaf development through genetic networks whose molecular
components have been partially unveiled. For instance, loss of function of the
bHLH transcription factors SPCH and MUTE produces stomataless plants
with very limited growth even in sucrose-supplemented medium.
Using ATH1 Affymetrix microarrays we made hybridizations with RNA
from wild-type Arabidopsis, spch-3 and mute-3 mutants and identified
ca.1.800 differentially expressed transcripts (p-value with false discovery
rate correction <0.05; ± 2 fold change) in three pairwise comparisons.
Their functional classification identified major expression changes in
key genes. The mutant transcriptomes predict a limited photosynthesis,
but also important changes in secondary metabolism, cuticle and cell
wall composition that might modify the permeability to gases of the
mutant epidermes. The impact of the observed transcriptional changes in
photosynthesis-related genes was examined in-situ by quenching analysis of
chlorophyll fluorescence. Kinetic analyses of the red fluorescence emitted
by chlorophyll estimate photosynthetic efficiency as well as mechanisms
of energy dissipation indicative of stress. Blue and green fluorescence was
used to estimate the accumulation of pigments and secondary metabolites
suggested by the transcriptomic analysis.
P08-28
Fluorescence and thermal imaging techniques
allow detection of white root rot on leaves of
avocado plants infected with Rosellinia necatrix
prior to the development of symptoms
Espen Granum1, María Luisa Pérez Bueno1, Claudia Calderón2, Cayo
Ramos3, Antonio de Vicente2, Francisco M. Cazorla2, Matilde Barón1
1
Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de
Investigaciones Científicas, Granada, ES, 2Instituto de
Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora,
Universidad de Málaga, Consejo Superior de Investigaciones
Científicas - Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias,
76
XXXVII Congreso SEBBM
Campus de Teatinos, Málaga, ES, 3Instituto de Hortofruticultura
Subtropical y Mediterránea La Mayora, Universidad de Málaga,
Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Área de Genética,
Facultad de Ciencias, Campus de Teatinos, Málaga, ES
One of the most important soilborne diseases affecting avocado (Persea
americana Mill.) crops is white root rot, caused by the fungus Rosellinia
necatrix. Moreover, this fungus is considered to be an emergent threat to
crop plants worldwide. Imaging techniques applied to remote sensing are
emerging as powerful tools to be used in crop protection. In this study
we investigated the potential applications of imaging techniques, including
chlorophyll fluorescence, blue-green fluorescence and thermography, in
early detection of white root rot on leaves of infected avocado plants. The
results show that changes in certain chlorophyll fluorescence parameters
provide early indications of fungal infection prior to the development of
visual symptoms in the aerial part of the plant.
P09. Biotecnología molecular
Isolation and Identification of a new archaea
strain in hypersaline waters
Marta de la Vega Naranjo1, Agustín García Barneto2, José Ariza
Carmona2, Rosa León Bañares1
1
Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales,
Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales,
Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del
Mar-CEIMAR, Huelva, ES, 2Dpto. Ingeniería Química, Física-
Química y Química Orgánica, Campus del Carmen, Facultad de
Ciencias Experiementales, Universidad de Huelva, Huelva, ES
An extremely halophilic archea was isolated from marine salt ponds at the
Southwest of Spain. Analysis of its 16S rRNA encoding gene showed that the
isolated microorganism was phylogenetically related to species of the genus
Halorubrum within the Halobacteriaceae family. Halorubrum cells were
harvested by centrifugation and carotenoids were extracted with methanol.
Carotenoids identification was performed by HPLC and confirmed by UPLC-
MS. Results revealed that this Halorubrum strain produces as predominant
carotenoid, bacterioruberin. This carotenoid is a dipolar C50 carotenoid with
4 hydroxyl substitutes. It shows the typical 3-finger UV-Vis spectra with
absorption around 467, 497 and 531 nm and a molecular weight of 713. Its
biosynthesis is described as the addition of an isoprenoid-C5 unit to each of
the extremes of lycopene-C40, followed by the introduction of the 4 hydroxil
groups. Bacterioruberin contains 13 pairs of conjugated double bonds, so it can
be an effective hydroxyl free-radical scavenger; it can protect the halobacteria
from fatal injury of oxidative damage under strong light, and resist oxidative
DNA damage resulting from UV irradiation. This carotenoid could be very
useful for practical applications and the extremely halophilic archeon could be
considered as a prokaryotic candidate for the production of carotenoids.
P09-2 (R09-7)
Herramientas para el control de la expresión
durante procesos de infección en patógenos y
simbiontes
Carlos Medina Morillas1, Beatriz Mesa Pereira1, Eva María Camacho
Fernandez1, Amando Flores Díaz1, Irene Jiménez Guerrero2,
Francisco Javier López Baena2, Eduardo Santero Santurino1
1
Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 2Universidad de Sevilla,
Sevilla, ES
El estudio de las interacciones entre microorganismos y sus hospedadores
presenta ciertas limitaciones que dificultan el seguimiento del proceso
Granada 2014
de infección en el interior de los organismos superiores. La naturaleza
del hospedador puede impedir la monitorización del microorganismo
durante la infección, por lo que se hace necesario el uso de sistemas de
microscopía adaptados a condiciones “in vivo”. Así mismo, el limitado
número de herramientas que permiten el control de la expresión de
genes involucrados en las interacciones bacteria-hospedador, restringe
la posibilidad de activar o desactivar dichos genes en el momento o
lugar deseados en el transcurso de la infección. En nuestro laboratorio
hemos contribuido al desarrollo de un sistema de expresión de
proteínas que responde a concentraciones permisivas de diferentes
inductores como el salicilato, ácido acetil salicílico o 3-metil benzoato.
Dicho sistema acopla dos reguladores transcripcionales que funcionan
en cascada, el primero de los cuales controla la expresión del segundo
que finalmente regula la expresión de genes heterólogos clonados
bajo el control de un promotor inducible. Estos elementos proceden
de distintas especies bacterianas, y han demostrado su eficiencia en
la producción de proteínas heterólogas en diferentes microorganismos
tanto patógenos de animales (Salmonella) como simbiontes de plantas
(Sinorhizobium). Una de las características interesantes del sistema es
que los inductores son capaces de difundir libremente entre los distintos
tejidos del hospedador sin presentar toxicidad a las concentraciones
ensayadas. Esta propiedad junto a una correcta monitorización del
proceso infectivo, permite disparar la expresión de genes de interés
en el momento deseado lo cual puede ser muy útil para comprender
cuando y donde actúan los genes implicados en las interacciones
tanto de bacterias patógenas como simbiontes con sus hospedadores
respectivos.
P09-3 (R09-1)
Herramientas biotecnológicas derivadas de virus
de plantas
José Antonio Darós Arnau
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC-
Universidad Politécnica de Valencia), Valencia, ES
Los virus que infectan plantas superiores son muy sencillos
genéticamente. Sin embargo, sus pequeños genomas contienen
información suficiente para completar complejos ciclos infecciosos
que, además de la replicación, movimiento y transmisión del virus,
incluyen la desactivación de las defensas de la planta. Estos pequeños
genomas codifican un número limitado de proteínas que suelen ser
multifuncionales y tener la capacidad de interaccionar, reclutar y
subvertir la actividad de multitud de factores del huésped para que
desarrollen diversos cometidos durante la infección. Los viroides
son un caso extremo dentro de los agentes infecciosos de las plantas,
puesto que son RNA capaces de replicarse y moverse por el huésped a
pesar de no codificar ninguna proteína propia. La sencillez estructural
y riqueza funcional de los virus y viroides de las plantas facilita el
desarrollo de herramientas biotecnológicas basadas en elementos de
su biología. En nuestras investigaciones recientes hemos desarrollado
un vector viral desarmado, basado en el potyvirus del grabado del
tabaco, de interés en ingeniería metabólica de plantas. El vector
permite coexpresar simultáneamente varias proteínas heterólogas en
cantidades equimolares y en la misma localización subcelular. Así, la
coexpresión de dos factores de transcripción de la ruta de biosíntesis
de las antocianinas conlleva a la acumulación de niveles notables de
estos compuestos antioxidantes en los tejidos de la planta invadidos por
el vector. También hemos desarrollado un sistema para la producción
de RNA recombinantes en Escherichia coli basado en la coexpresión
de un RNA derivado del viroide latente de la berenjena junto con una
proteína con la que éste interacciona durante la infección, la isoforma
cloroplástica de la tRNA ligasa de berenjena.
Pósters
P09-4 (R09-3)
Un insecticida natural interfiere con
comportamientos bacterianos clave en procesos
infectivos
Isabel Mª López-Lara1, Joaquina Nogales2, Ángel Pech-Canul1, Lydia
Mª Bernabéu-Roda2, Nieves Calatrava-Morales2, José Olivares2,
Laura Álvarez3, Otto Geiger1, Mª José Soto Misffut2
1
Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de
México-UNAM, Cuernavaca, MX, 2Estación Experimental del Zaidín,
CSIC, Granada, ES, 3Centro de Investigaciones Químicas, Universidad
Autónoma del Estado de Morelos-UAEM, Cuernavaca, MX
En Sinorhizobium meliloti, la pérdida de función del gen fadD que codifica
una acil-CoA ligasa específica de ácidos grasos de cadena larga, promueve
movilidad swarming e interfiere con la capacidad de establecer simbiosis
con alfalfa [1]. El análisis de extractos lipídicos de sobrenadantes de cultivo
del mutante fadD y su cepa parental desveló la presencia en el mutante de
dos compuestos que fueron identificados como 2-tridecanona (2-TDC) y
dodecanal, ausentes en los sobrenadantes de la cepa silvestre. La aplicación
de 2-TDC comercial en concentraciones micromolar induce movilidad en
superficie de cepas de S. meliloti, favoreciendo tanto swarming como un
desplazamiento independiente de flagelos. La 2-TDC se ha descrito como
un insecticida natural producido por variedades silvestres de tomate [2]
pero hasta ahora no se habían descrito sus efectos en bacterias. La 2-TDC
afecta comportamientos en superficie de diversas bacterias: promueve
swarming en los patovares tomato y syringae de Pseudomonas syringae,
inhibe formación de biofilm en S. meliloti y P. syringae y es capaz de
anular el swarming de Salmonella. Interesantemente, la aplicación de esta
metilcetona interfiere con el establecimiento de 2 interacciones planta-
bacteria: la formación de nódulos en la simbiosis S. meliloti–alfalfa,
y el desarrollo de peca bacteriana en tomate, resultados con potencial
biotecnológico.
Bibliografía
[1] Soto et al. 2002. Mol. Microbiol. 43:371-382.
[2] Williams et al. 1980. Science 207:888-889.
P09r-5 (R09-4)
Physical and functional standardization of
glycolytic modules for knocking-in novel
metabolic capacities in Gram-negative bacteria
Alberto Sánchez-Pascuala, Víctor de Lorenzo, Pablo I. Nikel
Systems Biology Program, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC,
Campus de Cantoblanco, Madrid, ES
One key tenet of Synthetic Biology is the physical and functional
modularization of the components of live systems for enabling their
reuse in a different biological context. Because of their extant metabolic
network, bacteria which are appealing for biotechnological processes (e.g.,
Pseudomonas putida KT2440) often show a non-optimal energetic yield
that limit their efficiency under operation conditions. In order to overcome
this state of affairs, we took the Escherichia coli’s Embden-Meyerhof-
Parnas pathway (one of the most efficient glycolytic pathways in terms of
energy balance) as the starting point for improving sugar utilization in P.
putida and other Gram-negative bacteria. To this end we engineered various
genetic/biochemical modules that are composable and interchangeable
by means of the format brought about by the Standard European Vector
Architecture (SEVA; Silva-Rocha et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41:
D666-D675). These designs considered [i] the distribution of a minimal
set of relevant glycolytic genes from E. coli into two different catalytic
blocks, [ii] the elimination of restriction enzyme targets in the genes, while
maintaining the amino acid sequence of the polypeptides encoded, and
[iii] the creation of independent enzymatic modules with corresponding
DNA sequences flanked by appropriate restriction sites for easing their
subsequent formatting with the SEVA rules. These genetic/biochemical
77
Pósters
devices allow for the re-factoring of central pathways for C consumption
in a variety of Gram-negative microorganisms, thereby increasing their
energy balance and thus developing new-to-Nature metabolic capabilities.
P09r-6 (R09-5)
Aptámeros de RNA para el estudio de la función
del dominio CRE del genoma del virus de la
hepatitis C
Alba Fernández Sanlés, Beatriz Berzal Herranz, Pablo Ríos Marco,
Alfredo Berzal Herranz, Cristina Romero López
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES
La consecución del ciclo infectivo del virus de la hepatitis C (HCV)
depende de varios dominios genómicos altamente conservados en
estructura y secuencia, entre los que se encuentra la región CRE (cis-
acting replicating element). Este elemento, esencial para la replicación
viral e implicado en la regulación de la traducción, se encuentra en el
extremo 3’ de la región codificante del genoma. Su estructura presenta
tres dominios con estructura tallo lazo, denominados 5BSL3.1, 5BSL3.2 y
5BSL3.3, de los cuales los dos primeros son esenciales para la replicación
y además el 5BSL3.2 es importante en la regulación de la traducción.
Este dominio ejerce su función reguladora mediante la interacción con la
proteína RNA polimerasa NS5B y con regiones distantes en el genoma
como la región 3’UTR o el elemento IRES (internal ribosome entry
site) localizado en la región 5’UTR. Dada su importancia funcional, se
presenta como una potencial diana terapéutica. Los mejores candidatos
para interferir con un elemento funcional estructural de RNA como el
CRE son los aptámeros de RNA. Los aptámeros son oligonucleótidos
que se unen específicamente a su diana dependiendo de su secuencia y
estructura, de manera similar a los anticuerpos. Se obtienen mediante un
proceso de selección in vitro conocido como SELEX. Hemos aislado una
batería de aptámeros tras nueve rondas de selección y el análisis de sus
secuencias ha permitido clasificarlos en cinco grupos definidos por un
motivo común. Observamos que los motivos de secuencia cuya diana es
5BSL3.2 están presentes en los aptámeros que inhiben en mayor medida
los niveles de RNA total (>80%) de un sistema replicativo subgenómino
de HCV. Además, dichas secuencias consenso se encuentran en los lazos
apicales de los aptámeros. Asimismo, los ensayos de unión de NS5B al
genoma viral en presencia de los aptámeros muestran que aquellos que se
unen al motivo 5BSL3.2 compiten por la unión de la polimerasa NS5B
al extremo 3’ del genoma. Los resultados obtenidos apoyan el potencial
del elemento CRE como diana terapéutica, así como el potencial de los
aptámeros de RNA como agentes antivirales.
P09-7
Nanoparticles as protein carriers
Juan Diego Unciti Broceta, Victoria Cano Cortés, María Paz Ruiz
Blas, Juan Jose Díaz-Mochón, Rosario M. Sanchez-Martin
Dpto. Química Orgánica y Farmacéutica, Universidad de Granada -
Centro de Genómica e Investigación Oncológica-GENyO, Granada, ES
The development of an efficient carrier system for delivery of functional
proteins into cells, although a challenging area of research, is a key
technology for the progress of research in the biological sciences and
medicine. Recent examples include conjugation of proteins to cell
penetrating peptides (CPP) such as those derived from HIV-1 TAT,
“profection” by cationic lipids and the use of several “nanodevices” such as
nanotubes or silica nanoparticles. Previously we have reported that amino-
functionalized, cross-linked polystyrene microspheres of highly defined
sizes (200 nm– 2 μm) are efficient cellular delivery devices that can enter a
broad range of cell types including adherent, suspension and primary cells.
These microspheres are inherently attractive as a carrier/delivery system
due to their lack of toxicity and highly controllable cellular loading.
78
XXXVII Congreso SEBBM
Herein we present our last advances in the development of nanotechnology-
based strategy for delivery of therapeutic proteins into cells. For this
purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry, and
basic molecular biology techniques has been optimized for the conjugation
of proteins to nanoparticles.
P09r-8
A SMART chemistry for liver injury diagnosis
Antonio Delgado González1, Mavys Tabraue Chávez2, Rosario María
Sánchez Martín2, Salvatore Pernagallo2, Juan José Díaz-Mochón2
1
DestiNA Genomics Ltd y GENYO - Centre for Genomics and
Oncological Research: Pfizer / University of Granada / Andalusian
Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and
Organic Chemistry, School of Pharmacy, University of Granada,
Granada, ES, 2DestiNA Genomics Ltd, Granada, ES
Molecular diagnostics is the process of identifying genetic variants
in biological samples. Testing for human diseases and illnesses, drug
performance and toxicities, pathogenic bacteria and viruses has created an
important, multi-billion and rapidly expanding global market. Molecular
diagnostics is increasingly being used in the cost challenged medical health
systems, animal health, food safety and pharmaceutical industries. The
limitation to its use in clinical diagnosis has been cost, testing errors, and
clinician conservatism.
DestiNA Tecnology is unique and distinguishable from ALL existing
enzymatic methods of nucleic acid analysis. It can be used to identify
any known target nucleic acid sequences, including insertion and deletion
mutations, as well as non-mutated nucleic acid sequences. DestiNA reagents
can successfully be used on the major diagnostic platforms - fluorescence
and colourimetric. This gives the technology a unique, powerful position
versus current detection methods.
In this study, DestiNA reagents are combined with two of the major
diagnostic platforms - fluorescence and colourimetric - for developing
novel tools for early detection and quantification of miRNA-122 involved
in human liver injury.
The integration of these platforms with DestiNA reagents promises to
transform and expand routine clinical diagnostic for liver injury with
benefits in terms of result consistency, time, cost, and ease of use.
P09r-9
Tumor-associated circulating microRNAs
detection by Chem-NAT
M.A. Luque-González1, M. Tabraue-Chávez2, R.M. Sánchez-Martín1,
S. Pernagallo2, J.J. Díaz-Mochón1
1
GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research:
Pfizer / University of Granada / Andalusian Regional Government
- PTS- Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry,
School of Pharmacy, University of Granada, Granada, ES, 2DestiNA
Genomica S.L, Granada, ES
Among the advanced emerging nucleic acid detection (NAT) technologies,
DestiNA Genomics has developed a unique chemistry approach for nucleic
acid testing (Chem-NAT). DestiNA core technology takes advantage of
dynamic chemistry for nucleic acid sequence specific recognition, using
aldehyde-modified natural nucleobases (so called SMART nucleobases),
and probes based on peptide nucleic acid (PNA) containing an “abasic”
position (DestiNA probes), which can be made complementary to any
target nucleic acid sequence [Bowler et al. in Angew. Chem. Int. Ed. 2010].
In this study the unique DestiNA reagents are combined with Matrix-
Assisted Laser Desorption Ionization – Time-of-Flight Mass Spectrometry
(MALDI-TOF MS) to rapidly identify tumor-associated circulating
microRNAs as biomarkers of cancer. This biological model represents
the first step in developing novel suite assays for medical diagnostic field.
Integration of DestiNA technology with MALDI-TOF MS brings a truly
Granada 2014
innovative step forward for rapidly detects circulating microRNAs with
benefits in terms of result consistency, time, cost, and ease of use.
With its potential PCR free approach, this tool promises to transform and
expand routine clinical diagnostic testing and screening for tumor-associated
circulating microRNAs in the emerging companion diagnostics market.
P09-10
Optimization of the E. coli biosynthesis of
lycopene through mathematical modelling
Nakens Núñez Martín1, Julia Gallego2, Manuel Cánovas2, Néstor
Torres1
1
Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular
y Genética. Facultad Biología, Universidad de La Laguna, San
Cristobal de La Laguna, ES, 2Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus
de Excelencia Internacional Regional “Campus Mare Nostrum”,
Universidad de Murcia,, Murcia, ES
Isoprenoids is an ubiquitous family of lipid compounds of industrial and
commercial interest due to its key roles in cell signaling, pigmentation and
defense among others. Currently the processes used to produce isoprenoids
are based in their extraction from natural sources (mainly plants), but these
processes show poor efficiency and sustainability. Thus their biosynthesis
by microorganisms has since, long time ago be proposed as a more efficient,
cheaper and sustainable alternative.
However the bioengineering of this process have been halted by several
factors. The first one is the complexity of the metabolic pathways involved
in the biosynthesis of this family of secondary metabolites. All isoprenoids
are built from a basic block, the Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP)
or its isomer, the Isopentenyl pyrophosphate (IPP). This five carbon
structure is synthetized via two independent pathways, the mevalonate
and non-mevalonate pathway. The latter one is of major interest from
a biotechnological perspective since, in addition to its occurrence in
chloroplasts and protozoa, it is also present in prokaryotic microorganisms.
The goal of this project is to address the metabolic engineering of an E. coli
strain in order to optimize the production of one member of the isoprenoid
family, the lycopene. For this purpose we will built up a mathematical model
of the non-mevalonate. The model will integrate the available information
of the pathway network and regulatory features. Once it will be evaluate
in terms of stability, robustness and reliably will be used to determine the
changes, either in individual or group of enzymes or transport processes
that should be modified in order to increase lycopene productivity while
cell viability is guaranteed.
Work funded by research grants from ACIISI, Ref No. ACIISI Project ProID
2010/39 and Project BIO2011-29233-C02-02 MINECO. IMBRAIN REF.
FP7-REGPOT-2012-CT2012-31637-IMBRAIN.
P09-11
Evaluación de la producción
de galactooligosacáridos en variantes de beta
galactosidasa de Kluyveromyces lactis
Agustín Rico Díaz, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel
Becerra Fernández
Universidade da Coruña, A Coruña, ES
La beta galactosidasa de Kluyveromyces lactis (Kl-β-gal) es una de las
enzimas más usadas en la industria de alimentación, especialmente en la
láctea. Aunque la enzima tiene muchas características interesantes como
son su alta capacidad hidrolítica o su seguridad (es producida por un
organismo generalmente reconocido como seguro), tiene la desventaja
de ser bastante lábil a temperaturas altas. Esta característica limita su uso
en aplicaciones industriales que necesitan llevarse a cabo a temperaturas
moderadamente elevadas.
Pósters
Uno de los usos más extendidos y novedosos de las beta-galactosidasas
es su utilización en la síntesis de galactooligosacaridos (GOS), derivados
lácteos con propiedades prebióticas que son usados en la elaboración
de ciertos alimentos funcionales. La enzima produce GOS mediante
transgalactosilación, la cual se ve favorecida por altas concentraciones de
lactosa. Teniendo en cuenta que la lactosa es bastante insoluble en agua, es
necesario llevar a cabo la reacción a temperaturas elevadas, por lo que el
uso de la Kl-β-gal se ve limitado.
En este trabajo se compara la capacidad de síntesis de GOS entre la
variante silvestre de la Kl-β-gal y una variante mutante de la misma
obtenida mediante mutagénesis dirigida, la cual posee una estabilidad
térmica mayor.
P09-12
Novel conjugation approaches for delivery
of nucleic acids mediated by nanoparticles
Victoria Cano-Cortés, Juan Diego Unciti-Broceta, María Paz Ruiz-
Blas, Juan José Díaz-Mochón
GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: Pfizer /
University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS-
Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, School of
Pharmacy, University of Granada, Granada, ES
The efficient introduction and delivery of bioactive materials into cells
(such as a drug, protein, nucleic acid, etc) to elicit, induce or control
specific biological functions is of fundamental importance throughout
many areas of biology and medicine. The ability to add a specific
plasmidic DNA into cells to modify cellular function or to deliver
RNA sequences into cells to silence a cellular function has significant
applications in Biomedicine. However, their celular access can often
be severely limited by properties such as solubility, charge or size.
Several techniques for the delivery of these therapeutic molecules are
in development such as cationic lipids, polymers and nanoparticles.
However, due to certain issues (such as poor uptake efficiencies, major
perturbations of cellular function or high cellular mortality) there is
still a need to improve transfection efficiency for specific cell lines
that are difficult to transfect. Herein we present our last advances in
the development of nanotechnology-based transfection agents. For this
purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry,
and basic molecular biology techniques has been optimized for the
conjugation of DNA to nanoparticles.
P09-13
Biodiesel conversion of non-edible vegetable
oils catalyzed by magnetic cross-linked enzyme
aggregates of Candida antarctica lipase B
Iraide Bejarano1, Jone I. Otsoa-Txintxetru1, Enrique A. Picó1,
Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1
1
Enzyme and Cell Technology Group, Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and
Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa,
ES,2Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and
Molecular Biology Department, University of the Basque Country
(UPV/EHU), Leioa, ES
In the past years, first generation biodiesel was obtained by
transesterification reaction with methanol of edible vegetable oil and
animal fats. Second-generation biodiesel can be also produced from
non-food crops such as non-edible vegetable oils. In this work magnetic
cross-linked enzyme aggregates (mCLEAs) of the lipase B from Candida
antarctica (CALB) were obtained by cross-linking covalently the
insolubilized lipase to magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized
with amine groups, using glutaraldehyde as cross-linking reagent. The
resulting novel robust biocatalyst, denoted as mCLEA-CALB, has been
79
Pósters
used to catalyze the conversion to biodiesel of different non-edible
vegetable oils.
For this purpose the trans/esterification reaction catalyzed by mCLEA-
CALB was assessed using different non-edible oils (waste-frying, unrefined
soya, Jatropha and Cameline oils) in the presence o methanol, ethanol,
2-propanol and 2-butanol as alkyl-donors. Different alcohol:triglyceride
molar ratios (1:1, 3:1, 6:1, 9:1 and 12:1) were assayed at 30ºC in 1 ml
reaction mixture stirred by a rotatory mixer.
Olive oil was used as control oil in all assays.Finally, the reaction mixture
was scaled up to 50 ml using control olive oil and methanol as substrates
in a magnetic reactor (Carousel 12 Plus, Radleys, UK). The biodiesel
conversion of oil to fatty acids methyl esters (FAMEs) was optimized using
different amounts of mCLEA-CALB and an alcohol:triglyceride molar ratio
of 6:1. The obtained FAMEs were analyzed by thin-layer chromatography
(TLC) in Silica Gel G-60 plates after staining with Coomassie Blue.
Then, digital images of plates were taken and analyzed using the “TLC
Analyzer” software (available at: http://www.sciencebuddies.org/science-
research-papers/tlc_analyzer.shtml). Results were exported and integrated
numerically in a spreadsheet to calculate the amount of FAMEs and
triglycerides.
Results obtained indicate that mCLEA-CALB appears as a promising novel
biocatalyst of interest to catalyze the production of second-generation
biodiesel from waste-frying oil and other non-edible vegetable oils.
Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), the Basque
Government (SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25).
P09-14
Inmovilización de la enzima β-galactosidasa de
Aspergillus oryzae en membranas de quitosano
Maria del Carmen Romero Cruz1, Paulina Urrutia2, Gonzalo Ruiz-
Philippi2, Carlos Vílchez Lobato1, Javier Vigara Fernández1, Lorena
Wilson Soto2
1 organic solvents.
Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias
Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES,
2
Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica,
Valparaiso, CL
La inmovilización de biocatalizadores persigue la mejora de las prestaciones
biotecnológicas de los mismos con idea de aumentar sus posibilidades de
aplicación en los distintos campos de la industria productiva. El presente
trabajo muestra un estudio de inmovilización de la β-galactosidasa (EC
3.2.1.23) del hongo Aspergillus oryzae utilizando membranas de quitosano
activadas con glutaraldehído, que permite la inmovilización covalente de la
enzima al soporte. En los estudios de optimización de la inmovilización, la
actividad enzimática se cuantificó utilizando orto-nitrofenil-β-galactosido
(ONPG) como sustrato. La activación de los grupos aminos del quitosano
(xNH2) con glutaraldehído (GT) se optimizó a una relación de 10GT:1NH2,
obteniéndose un rendimiento de la inmovilización próximo al 55 %, frente
al 20% obtenido con la relación 1GT:1NH2. Para la carga enzimática
utilizada se estableció un valor óptimo de 10 mg prot./g soporte, basada
en un compromiso entre la actividad expresada y el rendimiento de la
inmovilización. La membrana de quitosano activada se preparó a diferentes
grosores (2; 2,5 y 4 mm) incrementándose 3,5 veces el rendimiento de la
inmovilización para un grosor del 2 mm; el aumento del grosor provocó
un aumento aparente de la constante de Michaelis para el ONPG, como
consecuencia de restricciones difusionales. Independientemente del grosor
utilizado, la inmovilización mejoró la estabilidad térmica de la enzima
respecto al sistema libre. Como interés biotecnológico, la β-galactosidasa
inmovilizada en membranas de quitosano puede utilizarse para diseñar un
biosensor de lactosa, acoplando la membrana a un detector que permita
cuantificar la glucosa resultante de la hidrólisis enzimática.
Proyecto: ALGANAET (PIRSES-GA-2011-295165).
80
XXXVII Congreso SEBBM
P09r-15
Stability and reutilization of magnetic biocatalyst
(mCLEAs) for biodiesel production from
microalgae oil
Enrique Angulo Picó1, Carmen López2, Álvaro Cruz-Izquierdo1,
Teresa García-Bárcena1, Noelia Villarroel1, María J. Llama1, Juan L.
Serra1
1
Enzyme and Cell Technology Group, Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and
Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa,
ES,2Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and
Molecular Biology Department, University of the Basque Country
(UPV/EHU), Leioa, ES
Combinatorial approaches in enzyme immobilization are increasing in
the design of novel robust immobilized biocatalysts. Catalytic functions
may improve using cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) to obtain
more stable catalysts. Moreover, magnetic nanoparticles (MNPs) are an
attractive support for enzyme immobilization offering fast and simple
recovery of the immobilized catalyst with a magnet. The lipase B from
Candida antarctica (CALB) is one of the most used enzymes in organic
chemistry, based on its broad specificity and high selectivity. Its capability
to catalyze trans/esterification reactions makes it a very good alternative
for biodiesel production.
The aim of this work is to produce biodiesel by reactions of esterification
catalyzed by magnetic CLEAs of CALB (mCLEA-CALB), using either
free fatty acids (FFA) or oils from the microalga Scenedesmus sp, as well
as analyze the stability and possible reutilization of the biocatalyst for
the synthetic purposes. The progress of reactions was assessed by high
performance liquid chromatography (HPLC). Different experimental
conditions such as type of alcohol, alcohol:FFA molar ratio, type of
agitation, as well as different solvents were tested to find the best conditions
for obtaining biodiesel in terms of reaction rates and conversion values. In
addition, the stability of hydrolytic and biosynthetic activity of mCLEAs
was tested after incubating the immobilized enzyme for 48 h in different
Using mild conditions of temperature (30˚C) and magnetic stirring,
biodiesel conversion of oils up to 90% was obtained with methanol as
alkyl-donor and t-butanol as solvent. The reutilization of mCLEAs was
tested using two different types of stirring methods. After 50 consecutive
cycles, the complete initial activity was maintained using mechanical
stirring.
Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), Basque Government
(SAIOTEK S-PE12UN041), UPV/EHU (GIU11/25) and EU (Energreen
Project EFA217/11, POCTEFA).
P09r-16
Magnetic cross-linked enzyme aggregates
of Candida antarctica lipase B. Kinetic
characterization and its use to obtain bioproducts
Teresa García-Bárcena1, Ane Quesada1, Julen Díaz1, Enrique A.
Picó1, Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1
1
Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry
and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology,
University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES,2Enzyme
and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and
Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of
the Basque Country (UPV/EHU) - Ikerbasque, Basque foundation
for science; Biochemistry and Molecular Biology Department,
University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES
The use of robust magnetic biocatalysts is nowadays a rapidly emerging
area because the enzyme can be easily recovered from the reaction
mixture and reused in several catalytic cycles. In this work cross-linked
Granada 2014
enzyme aggregates (CLEAs) of the lipase B from Candida antarctica
(CALB) have been covalently bound to magnetic nanoparticles (MNPs)
of magnetite to obtain a novel robust biocatalyst denoted as mCLEA-
CALB.
In order to compare the behavior of this novel magnetically-separable
biocatalyst to that of the soluble enzyme, the main structural and
catalytic properties of mCLEA-CALB have been studied. For this
purpose the hydrolytic activity was assessed using the chromogenic
substrate p-nitrophenyl acetate (pNPA) whereas the synthetic activity
was evaluated by following the trans/esterification reaction to obtain
either biodiesel (from free fatty acids or triglycerides with methanol)
or biosurfactant (sucrose monopalmitate, SMP, from sucrose and vinyl
palmitate).
The effects of substrate concentration and temperature were studied in
the case of the hydrolytic activity. In the other hand, the kinetics of
mCLEA-CALB to obtain fatty acid methyl esters (FAMEs) was studied
using oleic, linoleic and linolenic acids at 30°C, and the values of
kinetic parameters Km and Vm were determined. Also the kinetics of
the transesterification reaction was followed using non-edible vegetable
oils (unrefined soybean and jatropha oils) as well as olive oil as a
control substrate. The effect of stirring on the hydrolytic and synthetic
activity was followed using both mechanical (gyratory) and ultrasound
(sonoreactor) agitation.
Finally, the synthetic activity of mCLEA-CALB to catalyze the synthesis
of SMP was studied. The reaction was carried out at 60ºC with magnetic
stirring using different amount of mCLEAs and substrates, in the presence
of different organic solvents (DMSO, t-butanol and 2-methyl-2-butanol).
These results indicate that mCLEAs of CALB can be envisaged as a
promising novel biocatalyst of interest to catalyze both hydrolytic and
transesterification reactions to obtain bioproducts.
Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), the Basque
Government (SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25).
P09-17
DNA binding and hybridyzation on functionarized
TiO2 surfaces
José Antonio Mas Gutiérrez1, José Vicente Pérez-Girón2,
Ruy Sanz González3, Miriam Jaafar Ruiz-Castellanos4, Jens Jensen5,
Oscar de Luis Jiménez6
1 complejos, como el galactomanano de algarrobo, pudiendo hidrolizar
Laboratorio de Genómica del Centro de Apoyo Tecnológico,
Universidad Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES,
2 combinación con la enzima ß-manosidasa. Estas ventajas permiten que la
Emerging Viruses Department, Heinrich Pette Institute, Hamburg,
DE, 3CNR-IMM-MATIS, Catania, IT, 4Departamento de Física de la
Materia Condensada, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma
de Madrid, Campus de Cantoblanco, Madrid, ES, 5Thin Film
Physics Division, Department of Physics, Chemistry and Biology,
Linköping University, Linköping, SE, 6Departamento de Ciencias
Básicas de la Salud, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad
Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES
Titanium dioxide (TiO2) is a versatile material with a wide range of
technological applications. The physical and chemical properties of TiO2
surfaces are influenced by morphology and crystallinity, among others.
Preparing well-ordered functional structures of TiO2, having highly active
surface areas, is of great interest due to their potential application for
biomaterials and biosensors.
One way of fabricating regular micro- and nano-patterns is by ion-beam
lithography (IBL), where a mask is used to harness an ion beam and define
the structures. Energetic ion-beams induce localized material modifications
in TiO2, which is susceptible to chemical etching. In this way a well-defined
pattern with interesting surface properties can be induced.
The applied lithography method generates a permanent and well defined
periodic structure of micrometre sized square holes having nanostructured
TiO2 surfaces, presenting different physical and chemical properties
compared to the surrounding rutile single crystal surface. On the patterned
Pósters
substrates is possible to bind oligonucleotide molecules at the surfaces of
the holes without the participation of intermediate molecules as binding
functional groups.
Here we describe the direct adsorption of DNA oligonucleotides after
surface activation by UV irradiation. Effective DNA-TiO2 surface binding
was demonstrated after several astringent washes. We demonstrate also that
fixed oligonucleotides are able to hybridize specifically to its corresponding
antisense non-fixed oligonucleotide. These preliminary results allow us to
propose TiO2 as an adequate substrate for nanobiosensor applications based
on nucleic acids sequence recognition.
P09-18
Producción y caracterización de la enzima
α-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae
María E. Álvarez Cao, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel
Becerra Fernández, María Isabel González Siso
Universidade da Coruña, A Coruña, ES
La α-galactosidasa de la levadura Saccharomyces cerevisiae (ScAGAL)
es una glucósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis enzimática de
residuos galactosa unidos por enlaces α-(1,6) de galacto-oligosacáridos
y galacto-mananos poliméricos. La ScAGAL presenta bajo coste de
producción, gran estabilidad a temperatura ambiente y amplio rango
de Tª y pH de trabajo que la identifican como una enzima robusta y de
especial importancia en numerosas aplicaciones biotecnológicas que
van desde la industria azucarera y la alimentación animal, pasando por
la farmacéutica, hasta la producción de etanol o biodiesel acoplado a la
degradación de diferentes materiales (melazas, derivados de legumbres).
En este trabajo, el gen MEL1 que codifica para la ScAGAL fue clonado
y expresado en la cepa S. cerevisiaeBJ3505 generando diferentes
construcciones con el fin de favorecer la purificación y producción de la
enzima. Además, la optimización de las condiciones de cultivo permitió
mejorar la productividad obteniendo un incremento de hasta 10 veces
más de enzima al aumentar la concentración de la fuente de carbono y la
aireación del medio de cultivo, y hasta 30 veces más si se alarga el tiempo
de cultivo hasta las 250 h. Por otro lado, la caracterización enzimática
de la ScAGAL utilizando diferentes sustratos y su estudio comparativo
con otras α-galactosidasas disponibles en el mercado, demuestra que la
enzima hidroliza eficientemente los sustratos naturales melibiosa, rafinosa
y estaquiosa pero no puede actuar directamente sobre galactomananos
los galactomano-oligosacáridos sintéticos, Gal1Man3 y Gal3,4Man5, en
ScAGAL sea un buen candidato para su aplicación en la eliminación de
oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO).
P09-19
Identification of an inhibitory antibody for
imaging active urokinase plasminogen activator
(uPA)
Natalia Sevillano1, Aaron M. LeBeau2, Daniel R. Hostetter3, Henry F.
VanBrocklin2, Charles S. Craik1
1
Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California
San Francisco, San Francisco, US, 2Center for Molecular and
Functional Imaging, Department of Radiology and Biomedical
Imaging, University of California San Francisco, San Francisco, US,
3
CytomX Therapeutics Inc, South San Francisco, US
Increased proteolytic activity is a common characteristic of highly
proliferative and invasive cancers. Proteases are involved in all stages
of cancer and represent functional biomarkers that can be targeted to
distinguish aggressive disease.
Over-expression of the plasminogen activation system (PAS) – which
consists of the serine protease urokinase plasminogen activator (uPA), the
81
Pósters
uPA receptor, uPAR, and uPA inhibitor, PAI-1, – has been documented in
a number of primary and metastatic cancers. The expression of the PAS
directly correlates with cancers that are phenotypically aggressive, result
in poor clinical prognosis, and quickly acquire drug resistance to first line
therapies. Active uPA is a functional biomarker of aggressive cancer that
can be selectively targeted for preclinical imaging using an antagonistic
molecular approach.
Using a fully human naïve Fab phage-display library we have identified
a human antibody (Fab U33) that selectively inhibits the active form
of uPA. This antibody targets and internalizes the active form of uPA
via a receptor mediated mechanism by mimicking the action of the
endogenous inhibitor of uPA, PAI-1. We have used U33 labeled with
fluorophores or radionuclides to non-invasively detect active uPA
in vivo in prostate cancer xenografts and in experimental metastasis
models.
P09-20 (R09-6)
Evolución dirigida de una peroxigenasa
inespecífica, un biocatalizador altamente
promiscuo y selectivo
Patricia Molina-Espeja1, Eva Garcia-Ruiz2, David Gonzalez-Perez1,
Miguel Alcalde1
1
Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis y
Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2Departamento de Ingeniería
Química y Biomolecular, Universidad de Illinois en Urbana-
Champaign, Urbana, Illinois, US
Hace diez años, se descubrió en el hongo basidiomiceto Agrocybe
aegerita una enzima capaz de catalizar actividades que engloban aquellas
de la cloroperoxidasa de Caldaryomices fumago (CPO) y las de las
monooxigenasas del citocromo P450 [1,2]. Con el nombre de peroxigenasa
inespecífica (unspecific peroxygenase, UPO, EC 1.11.2.1), esta versátil
enzima [3] ha demostrado suplir las carencias de las anteriores, con una
elevada eficiencia y selectividad. La UPO es una enzima extracelular e
independiente de cofactores como el NAD(P)H y otras enzimas auxiliares
(sólo necesita H2O2 para trabajar), al contrario que las P450, lo que reduce
el coste de su aplicación.
Hemos sometido a esta peroxigenasa hemo-tiolada (cisteína como
ligando axial) a evolución dirigida hacia expresión funcional en
Saccharomyces cerevisiae [4]. Tras cinco ciclos, se obtuvo la variante
PaDa-I, con unos niveles de secreción de ~8 mg/L. También ha sido
sobre-expresada en Pichia pastoris, obteniendo ~230 mg/L (material
sin publicar). En ambos casos, las propiedades y comportamiento son
equivalentes a los de la enzima homóloga. Así, disponemos de una
plataforma de fácil uso para continuar su mejora hacia aplicaciones de
interés biotecnológico. En nuestro caso, estamos sometiendo a PaDa-I a
evolución hacia mejora de su actividad hidroxilativa sobre naftaleno, en
detrimento de su actividad oxidativa (material sin publicar). Esta última
transforma el compuesto de interés, 1-naftol, en productos no deseados.
La actividad oxidativa en la UPO parece estar muy relacionada con
su estabilidad, pero los resultados obtenidos son esperanzadores, con
una nueva variante que reduce cinco veces la actividad oxidativa
(peroxidasa) manteniendo su capacidad de transferencia de oxígeno
(actividad peroxigenasa).
Bibliografía
[1] Ullrich R, Nüske J, Scheibner K, Spantzel J, Hofrichter M. Novel
haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes
aryl alcohols and aldehydes. Appl Environ Microb 2004; 70: 4575-81.
[3] Hofrichter M and Ullrich R. Oxidations catalyzed by fungal
peroxygenases. Curr Opin Chem Biol 2014; 19: 116-25.
82
XXXVII Congreso SEBBM
P09-21
Identifying recombinant antibodies to
conformational states of challenging protein
targets
Natalia Sevillano1, JungMin Kim1, Hai Ta1, Kiment Verba2, David
Agard2, John Gross1, Yifan Cheng2, Charles S. Craik1
1
Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California
San Francisco, San Francisco, US, 2Department of Biochemistry
and Biophysics, University of California San Francisco, San
Francisco, US
Monoclonal antibodies (mAbs) are ubiquitous in biomedical research
and medicine. Synthetic antibodies (recombinant antibodies, rAbs) can
be created in the laboratory, completely eliminating animals from the
antibody-production process. rAbs can be used in the same applications
as traditional mAbs such as western blotting, immunohistochemistry,
FACs and immuno-precipitation experiments. They have several
advantages over the traditional hybridoma-based antibodies, including
control over the state of the antigen that allows identification of
antibodies to conformational states of the antigen, rapid identification
of antibody binders allowing automation for high throughput production
and ability to develop antibodies to highly toxic or non-immunogenic
proteins.A fully human naïve Fab phage-display library with a diversity
of 4.1 x 1010 was constructed by the Craik laboratory using methods
previously described. We have optimized the protocols for phage display
panning for fast verification of binders and initial characterization of
the epitope by semi-quantitative and competitive ELISAs without the
purification of the Fabs. Using these optimized protocols, we have
successfully generated Fabs that are useful for structural analysis against
a wide range of protein targets including proteases, membrane proteins
and protein complexes.
P09-22
Solid lipid nanoparticle composition is a key
factor for the development of a suitable drug
delivery system
Lide Arana Urbieta, Félix María Goñi, Itziar Alkorta
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de
Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES
Development of novel drug delivery systems for the treatment of
complex diseases has become a big challenge for the last two decades.
Many drugs present low water solubility, poor absortion or rapid
elimination and suitable drug carriers are essential for the improvement
of drug bioavailability. Nanotechnology has abruptly broadened the field
of drug delivery systems and particularly, Solid Lipid Nanoparticles
(SLN) have emerged as some of the most promising nanocarriers for
controlled drug delivery. SLN have many advantages: they are able to
incorporate hydrophilic and lipophilic drugs, they present no biotoxicity
and their production can be easily scaled up. Due to their solid core,
drug release is controlled and their size facilitates drug diffusion through
some biological barriers. SLN composition must be carefully selected
depending on targeted tissue and incorporated drug. In this work we have
tested solid lipid nanoparticles (SLN) composed of long-chain fatty acids,
Epikuron 200 (largely soy bean lecithin), and bile salts. A total of five
different systems were prepared, and characterized by photon correlation
spectroscopy, transmission electron microscopy, differential scanning
calorimetry, and capacity to incorporate non-polar drugs. Our results
suggest that SLN composition is essential for particle size, polidispersity
and stability but not for drug incorporation efficiency.
Granada 2014
P09-23
Hydrolysis of mcl-polyhydroxyalkanoates
by immobilized depolymerase from
Streptosporangium roseum
Noelia Villarroel1, Alba Álvarez1, Teresa García-Bárcena1, Enrique A.
Picó1, Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1
1
Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry
and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology,
University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES,2Enzyme
and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and
Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University
of the Basque Country (UPV/EHU) - IKERBASQUE, Basque
Foundation for Science , Leioa, ES
Over the past years, the use of plastics in packaging and other products
has exacerbated the problem of disposal of solid waste. In response to
the problem and harmful effects of the plastic waste on the environment,
there is a considerable interest in the production of biodegradable plastics.
Polyhydroxyalkanoates (PHAs) provide a good fully degradable alternative
to petrochemical plastics. Among PHAs, the medium-chain length
ones (mcl-PHAs) are considered to be promising candidates for special
bioplastic applications due to properties such as elasticity, hydrophobicity,
low oxygen permeability, among others.
At the same time, PHAs have an added interest as source of R-3-
hydroxyalkanoic acids (R-HAs), the monomers that form the polymer,
which are scaffolds as chiral starting materials in fine chemical,
pharmaceutical and medical industries. Extracellular PHA depolymerases
are enzymes capable of degrading PHAs available in the environment after
the death or lysis of PHA-accumulating bacteria.
In our laboratory a hypothetical protein with a putative extracellular mcl-
PHA depolymerase activity from Streptosporangium roseum DSM43021
was cloned and expressed as a hexahistidine recombinant protein in cells
of E. coli BL21 (DE3) and then purified by IMAC.
Taking into account the advantages that the immobilization can offer with
respect to the soluble enzyme in aspects such as stability or reutilization
of biocatalyst, the aim of this work was to immobilize the recombinant
protein testing different supports in order to obtain an efficient and
robust biocatalyst to hydrolyze mcl-PHAs. For this purpose, hydrophobic
adsorption to porous polypropylene (Accurel MP-1000) and covalent
linkage to magnetic nanoparticles (MNPs) were used. The biochemical
properties of the resulting biocatalysts as well as their ability to catalyze
the production of monomers or dimers of R-HAs in the hydrolytic reaction
of PHAs were compared. Also, the biocatalysts were used for several
consecutive hydrolytic cycles to demonstrate their possible reutilization in
the hydrolytic reaction of mcl-PHA which could allow a cost reduction in
future bioprocesses.
Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), Basque Government
(SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25). NV was the
recipient of a predoctoral scholarship from the Basque Government.
P09-24
Screening mutant libraries of versatiles
peroxidase from Pleurotus eryngii to enhance
oxidative stability
David Gonzalez-Perez1, Eva Garcia-Ruiz2, Bernardo J. Gómez
Fernández1, Francisco Javier Ruiz-Dueñas3, Ángel T.Martinez3,
Miguel Alcalde1
1
Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES,
2
Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University
of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, US, 3Centro de
Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES
Versatile peroxidases (VP) are promiscuous biocatalyst with the
highest fragility to peroxides reported yet due to sophisticate molecular
Pósters
architecture that includes three catalytic sites and several oxidation
pathways. In this work, an evolved version of VP was subjected to a
range of hybrid and evolutionary strategies in Saccharomyces cerevisiae
to study the resistance to H2O2. After 5 generations of random-,
saturation- and domain- mutagenesis together with in vivo DNA
recombination approaches, several structural determinants behind the
oxidative destabilization of the enzyme were unmasked. To keep balance
between activity and stability,selected beneficial mutations were further
relocated in novel mutational environments by in vivo sequence blocks
exchange promoting epistatic interactions. The best variant of this
process accumulated 8 mutations that increased the half-life up to 30 min
in the presence of 3,000 equivalents of H2O2 and shifted 6ºC upwards
the kinetic thermostability. Whilst the main heme domain was not
significantly modified, mutations in the surroundings of the Mn2+ binding
pocket and the catalytic tryptophan decreased substrates affinities for
both catalytic sites exerting a beneficial effect to the protein stabilization.
Multiple structural alignment with other H2O2 tolerant peroxidases
addressed possible roles played by the new mutations in the overall
oxidative damage process of the heme-peroxidase superfamily.
P09r-25
Screening a glycosynthase library with an
enzyme-independent assay based on a
fluorescent sensor
Hugo Aragunde Pazos, Estela Castilla, Eduardo Andrés, Xevi
Biarnés, Antoni Planas
Laboratory of Biochemistry, Bioengineering Department, Institut
Quimic de Sarria, Universitat Ramon Llull, Barcelona, ES
Glycosynthases have become efficient tools for the enzymatic synthesis
of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They are
engineered retaining glycosidases in which the hydrolase activity is
abolished by mutation of the catalytic nucleophile but efficiently catalyze
transglycosylation when using activated glycosyl fluoride donors with
the opposite anomeric configuration to the substrate in the wild-type
enzyme. Enzyme-directed evolution approaches are applied to improve the
performance of current glycosynthases and engineer specificity for new
substrates. However, simple and general screening methods are required
since most of the reported assays are specific for each particular enzyme
[1]. Only one “universal” screening method has been proposed, a pH-based
assay that measures the hydrofluoric acid released as by-product of the
glycosynthase reaction, being detected by color change of a pH-indicator
[2]. However, it is not very reproducible and difficult to implement due to
sample matrix variations.
We have developed a new general screening assay independent of
enzyme specificity for the screening of glycosynthase libraries [3].
This assay is based on the use of a chemical sensor to transduce
fluoride concentration (by-product of all glycosynthase reactions using
fluoride activated donors) into a fluorescence signal. We report here
the application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus
licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase. Beyond the expected mutations at
the nucleophile, other variants have acquired glycosynthase activity.
Surprisingly, an aspartic acid for glutamic acid replacement renders
a highly active glycosynthase, but retaining low hydrolase activity.
It appears to be an intermediate state between glycosyl hydrolase and
glycosynthase [4].
References
[1] Roman K., Withers S.G. (2010) Carbohydr. Res. 345, 1272-1279.
[2] Ben-Davis A., Shoham G., Shoham Y. (2008) Chem. Biol. 15, 546-551.
[3] Andrés E., Aragunde H., Planas A. (2014) Biochem. J. 458, 355–363.
[4] Aragunde H., Castilla E., Biarnés X., Faijes M., Planas A. (2014)
Carbohydr. Res. 389, 85-92.
83
Pósters
P09-26
Identification of reciprocal adhesion genes in
pathogenic and nonpathogenic Pseudomonas
Jesús de la Torre Zúñiga1, Maria Antonia Molina Henares1, Estrella
Duque Martin de Oliva2, Miguel Alaminos Mingorance3, Manuel
Espinosa Urgel1, Amalia Roca4, Patricia Bernal Guzman1, Matilde
Fernandez1, Sophie de Bentzmann5, Juan Luis Ramos Martin2
1
Consejo Superior de Investigaciones Científicas-EEZ, Department
of Environmental Protection, Granada, ES, 2Abengoa Research,
Department of Biotechnology, Campus Palmas Altas, Sevilla, ES,
3
Universidad de Granada, Facultad de Medicina, Department of
Histology, Granada, ES, 4Bio-Iliberis R&D, Granada, ES, 5UPR
CNRS 9027, Marseille, FR
We used a combination of in silico and large-scale mutagenesis
approaches to expand our current knowledge of the genetic determinants
used by Pseudomonas putida KT2440 to attach to surfaces. We first
identified in silico orthologs that have been annotated in Pseudomonas
aeruginosa as potentially involved in attachment. In this search 67 paired-
related genes of P. putida KT2440 and P. aeruginosa were identified as
associated to adhesion. To test the potential role of the corresponding
gene products in adhesion, 37 knock-out mutants of KT2440, available
in the Pseudomonas Reference Culture Collection, were analyzed with
regard to their ability to form biofilms in polystyrene microtiter plates;
of these, 7 mutants were deficient in adhesion. Since mutants in all
potential adhesion genes were not available, we generated a genome-
wide collection of mutants made of 15 360 independent mini-Tn5
insertions and tested them for the formation of biofilm on polystyrene
microtiter plates. Eighteen clones that exhibited a reduction of at least
3-fold in biofilm biomass formation were considered candidate mutants
in adhesion determinants. DNA sequencing of the insertion site identified
5 other new genes involved in adhesion. Phenotypic characterization of
the mutants showed that 11 of the inactivated proteins were required
for attachment to biotic surfaces too. This combined approach allowed
us to identify new proteins with a role in P. putida adhesion, including
the global regulator RpoN and GacS, the lectin-like protein LecA, PstS,
and a protein of unknown function (PP1633). The remaining mutants
corresponded to functions known or predicted to participate in adhesion
based on previous evidence, such as the large adhesion proteins LapA,
LapF, and flagellar proteins. In silico analysis showed this set of genes
to be well conserved in all sequenced P. putida strains, and that at least
9 reciprocal genes involved in attachment are shared by P. putida and
P. aeruginosa.
P09r-27
Inhibición de la adsorción de proteínas a
superficies de sílice mediante el uso de
polielectrolitos de alta densidad de carga
Felipe Hornos Adán, Rocío Esquembre Tomé, Javier Gómez Pérez
Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel
Hernández), Elche, ES
La adsorción es un proceso complejo que puede afectar a la estabilidad
estructural de las proteínas dependiendo de factores tales como temperatura,
pH o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado
multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo
de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in
vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y
manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida por
la adsorción - desorción a superficies de vidrio o plástico y su potencial
inmunogenicidad.
Proponemos la utilización de polielectrolitos (PE) catiónicos de alta
densidad de carga como medio eficaz para inhibir la adsorción de proteínas
a superficies de sílice. En particular hemos estudiado la capacidad de
inhibición de polielectrolitos basados en grupos amonio y en grupos amina
de distinto peso molecular. Nuestros resultados indican que estos PE
84
XXXVII Congreso SEBBM
compiten de forma muy efectiva con la proteína por la superficie hidrofílica,
no habiéndose observado una dependencia significativa en su capacidad de
inhibición con el peso molecular. Incluso en condiciones de fuerza iónica
elevada, donde las interacciones electrostáticas se ven minimizadas, 1 mg
de PE es capaz de provocar la desorción de 0.5 mg de lisozima previamente
adsorbida sobre 10 mg de sílice contenidos en 1 mL.
Finalmente, la capacidad de prevenir la adsorción de proteínas a superficies
de sílice mediante el recubrimiento previo de estas superficies con una
monocapa de polielectrolito ha sido testada encontrándose que lavados
sucesivos de la superficie tienen un efecto prácticamente despreciable sobre
el nivel de recubrimiento de la superficie y, por tanto, sobre su protección
frente a la adsorción proteica.
P09-28
El receptor de productos avanzados de glicación
(RAGE) como una diana para la generación de
reactivos específicos de transfección de células
eucariotas
María Dolores Girón González1, Fernando Hernández Mateo2,
Francisco Javier López-Jaramillo2, Arturo Morales Portillo2, Alfonso
Salinas Castillo3, Francisco Santoyo González2, Rafael Salto
González1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de
Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departamento de
Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada,
Granada, ES, 3Departamento de Química Analítica, Facultad de
Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES
En las alteraciones a largo plazo de la diabetes y en la angiogénesis
asociada con la metástasis tumoral, el receptor de productos avanzados de
glicación (RAGE) tiene un papel esencial. Este receptor se sobre-expresa
en los tejidos diana asociados a estas patologías y tras unirse a sus ligandos
se internaliza. Esto hace que este receptor constituya una diana para el
desarrollo de reactivos específicos de transfección.
Así, derivados de polietilenimina (PEI 25 kDa) y PAMAM-G2 se
modificaron mediante la reacción de glicación no enzimática de Maillard
para generar nuevos agentes de transfección irreversiblemente glicados
capaces de unirse al RAGE. Estos reactivos así sintetizados mantienen la
capacidad de unir DNA y protegerlo de la degradación por endonucleasas.
Además, mientras que los reactivos glicados mostraron una baja
capacidad de transfección en células CHO-k1 que no expresan RAGE, los
compuestos glicados actuaron como eficientes reactivos de transfección
en una línea celular CHO-k1 que expresa de manera recombinante el
RAGE. La especificidad de estos reactivos quedo demostrada por el
hecho de que la pre-incubación con albúmina glicada, el ligando natural
del RAGE, o dansyl cadaverina, un inhibidor de la internalización del
RAGE, bloquean la transfección mediada por los reactivos glicados. Los
resultados obtenidos se han confirmado en las líneas celulares NRK y
RAW264.7 que expresan de manera natural el receptor. Asimismo, los
compuestos glicados retienen su eficiencia de transfección en presencia
de suero y son capaces de promover la transfección in vivo en un modelo
experimental en ratón. Por tanto, nuestros resultados muestran que
la reacción de Maillard es un procedimiento simple y directo para la
preparación de reactivos glicados de transfección específicos y que esta
técnica es aplicable a otros reactivos de transfección que presenten grupos
amino libres. En conclusión, las propiedades de estos compuestos son
muy interesantes para su uso in vivo: la glicación confiere selectividad con
un muy pequeño efecto sobre la toxicidad de los reactivos, mantienen su
actividad en presencia de suero y utiliza una vía única de internalización
mediada por receptores, con una alta eficiencia de transfección in vivoen
ratón.
Investigación subvencionada por el Proyecto CTQ2011-29299-C02
(MEC).
Granada 2014
P09-29
Adsorción de proteínas a superficies
hidrofóbicas: caracterización termodinámica y
estrategias de inhibición
Rocío Esquembre Tomé, Felipe Hornos Adán, Javier Gómez Pérez
Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel
Hernández), Elche, ES
La adsorción de proteínas a superficies hidrofóbicas es un proceso
complejo que puede afectar la estabilidad estructural de las proteínas y
su actividad biológica dependiendo de factores tales como temperatura,
pH o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado
multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo
de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in
vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y
manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida
por la adsorción - desorción a superficies de plástico y su potencial
inmunogenicidad.
Hemos caracterizado termodinámicamente la adsorción de la proteína
modelo lisozima a partículas coloidales de látex (de diámetro menor de
1 μm) e identificado sustancias que permiten la inhibición efectiva de
dicho proceso. Dada su naturaleza apolar y la presencia de cargas en su
superficie para asegurar su estabilidad coloidal (evitar su aglomeración),
la energía libre de adsorción contiene tanto un componente electrostático
como otro hidrofóbico. Nuestros resultados indican que la adsorción
proteica presenta cooperatividad negativa debido a la repulsión
electrostática entre moléculas individuales de proteína adsorbidas sobre
la superficie hidrofóbica. Como consecuencia, el nivel de recubrimiento
(y la afinidad aparente de la proteína por la superficie) es máximo a un
pH cercano a su punto isoeléctrico disminuyendo a medida que aumenta
la carga de la proteína. Mediante calorimetría isoterma de titulación
hemos podido caracterizar termodinámicamente las contribuciones
electrostáticas e hidrofóbicas del proceso de adsorción así como
cuantificar su inhibición mediante surfactantes y polímeros hidrofílicos
como el polivinilalcohol.
P09-30 (R09-2)
Visualizando ATP intracelular en células vivas
Vicente González Charro, Iván López Montero
Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES
La molécula de ATP (adenosín trifosfato) es la principal fuente de
energía necesaria para realizar trabajo biológico. La mayor parte de ATP
se genera mediante el proceso de respiración mitocondrial. Se sabe que
el ATP generado es transportado al citosol en contra de un gradiente de
concentración, mediante el potencial de membrana actuando como fuerza
motriz. Al mismo tiempo, el ADP se transporta activamente al interior
de las mitocondrias, manteniendo su concentración citosólica muy baja.
La relación de concentraciones de ATP:ADP en el citosol es del orden de
200:1. Sin embargo no se conoce la distribución de ATP en los diferentes
compartimentos intracelulares debido a que los métodos convencionales
para la detección y cuantificación de ATP, basados en análisis de extractos
celulares, sólo proporcionan niveles promediados de ATP. Por ello, la
detección selectiva de ATP intracelular en células únicas vivas se ha
convertido recientemente en un tema de investigación muy activo. El
diseño de sensores específicos de ATP permitirá entender cómo se regula
la concentración de ATP intracelular a nivel de célula única. En esta
contribución se expondrán las diferentes aproximaciones, tanto químicas
como biológicas, que se han realizado recientemente para monitorizar
y visualizar los niveles de ATP en células individuales y en tiempo real.
Además, se mostrarán resultados preliminares del uso de un sensor basado
en rodamina tanto en células NIH3T3 como en sistemas de membrana
artificiales.
Pósters
P09-31
Engineering biological approaches for antibiotic
detection. A new microbial biosensor based on
the Pseudomonas putida TtgR repressor
Manuel Espinosa-Urgel1, Luis Serrano2, Juan Luis Ramos1,
Ana María Fernández-Escamilla1
1
Department of Environmental Protection, Estación Experimental
del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2European Molecular Biology
Laboratory and Centre for Genomic Regulation Systems Biology
Research Unit, Barcelona, ES
Environmental contamination by toxic organic compounds and
antimicrobials is one of the causes for the recent surge of multidrug-resistant
pathogenic bacteria. Monitoring contamination is therefore the first step in
containment of antimicrobial resistance, and requires the development of
simple, sensitive and quantitative tools that detect a broad spectrum of toxic
compounds. The emerging approach for detecting toxic compounds is the
rational design of microbial biosensors. In this study, we have engineered
a new specific microbial biosensor based on the ttgR-regulated promoter
which controls expression of the TtgABC extrusion efflux pump, coupled
to a gfp reporter. The system was introduced in Pseudomonas putida DOT-
T1E, a strain characterized by its ability to survive in the presence of high
concentrations of diverse organic compounds. This whole-cell biosensor is
capable to detect a wide range of antibiotics, as well as organic compounds
such as toluene or flavonoids. Our tool opens the possibility to screen a
wide range of toxic compounds by altering the TtgR binding site to obtain
specific versions of this biosensor oriented to sense specific compounds.
P09-32
Análisis funcional de tres acil-CoA sintetasas
implicadas en la degradación de ácidos biliares
en Pseudomonas putida DOC21
Álvaro Barrientos Castañeda, Estefanía Merino García, Joaquín
Rodríguez Fernández, Esther Coto Alcaraz, Raquel Benavides
Serrano, José María Luengo Rodríguez, Elías Rodríguez Olivera
Dpto Biología Molecular, Universidad de León, León, ES
Pseudomonas putida DOC21 es una g-proteobacteria aislada del medio
ambiente por su capacidad para utilizar ácidos biliares y otros esteroides
como única fuente de carbono. En el genoma de esta bacteria se han
identificado cinco clusters de genes que codifican funciones implicadas con
el catabolismo de estos compuestos (genes std). Tres de estos genes codifican
posibles acil-CoA sintetasas implicadas en la degradación de ácidos biliares
(stdA1, stdA2 y stdA3). Se ha procedido a la mutación específica mediante
deleción de cada uno de estos genes obteniéndose las cepas ΔstdA1,
ΔstdA2 y ΔstdA3. Dos de las cepas mutantes obtenidas, ΔstdA1 y ΔstdA2,
resultaron incapaces de asimilar colato y otros ácidos biliares, no viéndose
afectado el metabolismo de testosterona y 4-androsten-3,17-diona. Por
el contrario, el tercer mutante, ΔstdA3, crecía con dificultad en cualquier
medio en el que la fuente de carbono fuera un compuesto esteroideo.
Cuando se cultivaron dichos mutantes en medios conteniendo colato
como fuente de intermediarios metabólicos y con succinato como fuente
de carbono para soportar el crecimiento bacteriano, el mutante ΔstdA1
acumulaba en los caldos de cultivo Δ1/4-3-cetocolato y Δ1,4-3-cetocolato,
el mutante ΔstdA2 acumulaba 7α,12α-dihidroxi-3-oxopregna-1,4-dien-
20-carboxilato (DHOPDC), y el mutante ΔstdA3 mostraba un bloqueo
metabólico a nivel del 3aα-H-4α(3’’’’propanoato)-7aβ-metilhexahidro-
1,5-indanodiona (HIP). Análisis bioquímicos posteriores demostraron que
StdA1 cataliza la tioesterificación de colato, 3-cetocolato, Δ1/4-3-cetocolato
y Δ1,4-3-cetocolato a sus respectivos derivados de CoA, la proteína StdA2
cataliza la transformación de DHOPDC a DHOPDC-CoA, mientras que la
enzima StdA3 lleva a cabo la tioesterificación del HIP y/o sus derivados
hidroxilados a sus tioésteres de coenzima A.
85
Pósters
P09-33
Comparative evaluation of the antitumor
activity of new platinum based drugs on human
adenocarcioma cell lines
Enric Milà1, Roldán Cortés1, Margarita Crespo2, Laia Davin2, Raquel
Martín2, Josefina Quirante3, Daniel Ruiz3, Ramon Messeguer4,
Carme Calvis4, Laura Baldomà5, Josefa Badia5, Marta Cascante1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of
Biology - IBUB, Universitat de Barcelona (UB), IDIBAPS, Unit
Associated with CSIC, Barcelona, ES, 2Departament de Química
Inorgànica and IBUB, Facultat de Química, UB, Barcelona, ES,
3
Laboratori de Química Orgànica, Facultat de Farmàcia, UB,
Barcelona, ES, 4Biomed Division LEITAT Technological Center, Parc
Científic de Barcelona, Barcelona, ES, 5Departament de Bioquímica i
Biologia Molecular, Facultat de Farmàcia, IBUB, UB, Barcelona, ES
It is estimated that 50-70% of cancer patients are treated with platinum (II)
drugs. Despite the therapeutic benefit of the approved platinum based drugs
(cisplatin, carboplatinand Oxaliplatin), their efficacy is still limited due to
side effects and resistances. Hence, great efforts have been undertaken to
develop novel metal-based drugs. Over the last three decades thousands
of Pt-containing compounds have been designed and tested, but just a few
of them have entered clinical use (carboplatin, oxaliplatin and nedaplatin)
or are in clinical trials. Despite the therapeutic benefit of the approved
platinum drug, the efficacy of the treatments is still limited due to side
effects and intrinsic and acquired resistances. It is believed that DNA isthe
main target of platinum drug and that cisplatin and its analogues form
an intrastrand d(GpG) adduct with platinum cross-linking N7 atoms of
neighbour guanine residues of DNA. It has been also shown that carrier
amine ligands of cisplatin analogues appear to modulate the antitumor
properties of this class of drugs. Cyclometalating N-donor ligands may
offer an alternative approach to give structures quite different from that
of cisplatin and analogs, with the possibility that those could interact in
a different way with DNA and consequently show a different spectrum
of activity and toxicity profile. We have been recently involved in the
synthesis of a novel class of seven-membered platinacycles, and the lack of
information on the biological activity of these compounds prompted us to
undertake the present study.
P10. Estructura y función de proteínas
P10-1
Effect of TIA-1 phosphorylation in dimerisation
and stress granule formation
Sofía Muñoz García-Mauriño1, Isabel Cruz-Gallardo1, Antonio
Díaz-Quintana1, Myriam Gorospe2, Jacqueline A. Wilce3, Irene Díaz-
Moreno1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla – CSIC, Sevilla, ES, 2Laboratory of Genetics,
National Institute on Aging-Intramural Research Program, NIH,
Baltimore, US, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,
Monash University, Victoria, AU
TIA-1 (T-cell restricted Intracellular Antigen-1) is an RNA-Binding Protein
(RBP) that functions as a translational repressor, sequestering target mRNA
into stress granules (SG) upon cellular stress [1]. It has been shown that the
deregulation of this system results in neurodegenerative diseases such as
Alzheimer [2].
TIA-1 is constituted by three RNA Recognition Motifs (RRMs) and
a Prion-Related Domain (PRD). Preliminary work using EMSA and
Analytical Ultracentrifugation (AU) revealed that TIA-1 RRM2 has a high
propensity to form dimers, while TIA-1 RRM23 or RRM3 alone behave as
a stable monomer, in agreement with recent NMR relaxation measurements
86
XXXVII Congreso SEBBM
[3]. There is little known about the sequence of events that leads to SG
formation but, in this work, we propose that the SG assembly by TIA-
1 involves the nucleating trigger of dimerisation via RRM2. In addition,
post-translational modifications of TIA-1 (such as phosphorylation that
occurs in cells under stress) can also lead to the SG formation.
Fas-Activated Serine/Threonine Kinase (FAST K) is known to interact with
and phosphorylate TIA-1 [4,5]. The substitution of three serines at TIA-1
RRMs by either aspartic acid — serving as a phosphoserine mimic — or
alanine — that can no longer be phosphorylated — helps to understand the
structural effects of TIA-1 phosphorylation, as well as the TIA-1 capability
of being phosphorylated by FAST K. In fact, we have explored how such
Ser-by-Asp phosphomimetic mutants of TIA-1 trigger the conformational
changes required for RRM dimerisation and TIA-1 protein self-association
by combining Light Scattering and AU measurements with Molecular
Dynamics simulations.
Our hypothesis presents a novel paradigm for the field of neurodegenerative
research suggesting that the SG nucleation can be initiated by TIA-1 RRM
domains, rather than by the PRD module as is widely accepted.
References
[1] Anderson P, Kedersha N. (2002) Visibly stressed: the role of eIF2, TIA-
1, and stress granules in protein translation Cell Stress Chaperones 7: 213-
221.
[2] Wolozin, B. (2012) Regulated protein aggregation: stress granules and
neurodegeneration Mol Neurodegener.7: 56.
[3] Wang I, Hennig J, Jagtap PK, Sonntag M, Valcárcel J, Sattler M. (2014)
Structure, dynamics and RNA binding of the multi-domain splicing factor
TIA-1 Nucleic Acids Res. 42: 5949-5966.
[4] Tian Q, Taupin J, Elledge S, Robertson M, Anderson P. (1995) Fas-
activated serine/threonine kinase (FAST) phosphorylates TIA-1 during
Fas-mediated apoptosis J. Exp. Med. 182: 865-874.
[5] Izquierdo, JM, Valcarcel J. (2007) Fas-activated serine/threonine kinase
(FAST K) synergizes with TIA-1/TIAR proteins to regulate Fas alternative
splicing. J. Biol. Chem. 282: 1539-1543.
P10-2
Nucleophosmin stabilization as a strategy
to prevent its mislocalization in leukemia
Sonia Bañuelos1, Igor Arregi1, María Sendino1, Marián Alonso-
Mariño1, José Antonio Rodríguez2, Jarl Underhaug3, Aurora
Martínez3, Maria Ángeles Urbaneja1
1
Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of
Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque
Country, Leioa, ES, 2Department of Genetics, Physical Anthropology
and Animal Physiology, University of the Basque Country, Leioa, ES,
3
Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, NO
Nucleophosmin (NPM) is a protein involved in ribosome biogenesis and
other functions affecting cell proliferation. NPM is oligomeric and built
of several domains: a compact, pentameric core, is connected through
long and flexible linkers to small, helical C-terminal domains. Albeit
continuously shuttling between nucleolus, nucleoplasm and cytoplasm,
NPM is mostly enriched in nucleoli, which probably depends on its binding
to G-rich sequences of nucleic acids. NPM deregulation has been related
to different types of cancer; in particular, NPM1 is the most frequently
mutated gene in acute myeloid leukemia (AML), and these mutations
cause the aberrant localization of the protein to the cytoplasm. It has
been shown that AML-related mutations confer NPM an additional NES
(nuclear export sequence), and impair folding of the C-terminal domain
(e.g., abolishing ability to bind nucleic acids and hence to the nucleolus),
all in all displacing the protein to the cytoplasm. Therefore, AML can be
regarded as a “misfolding disease”. The “pharmacological chaperones”
approach is an interesting strategy to restore the conformational stability
of misfolded proteins. Probing for changes in the thermal stability of
NPM C-terminal domain, we have performed a high throughput screening
of a natural compound library. 25 hits were found to increase the Tm of
Granada 2014
the domain by 6-21ºC. We have then tested the effect of some of these
compounds on the subcellular localization of AML-like mutants in HeLa
cells expressing fluorescent NPM constructs. One compound is able to
partially restore nucleolar localization whereas another one alleviates
the protein aggregation of misfolded mutants. We conclude that these
compounds might help to promote native localization and functionality of
mutant, oncogenic NPM.
P10-3
Recognition of nucleophosmin by the export
receptor Crm1: deciphering the basis of aberrant
traffic in leukemia
Igor Arregi Vado1, Marián Alonso-Mariño1, José Antonio Rodríguez2,
María Ángeles Urbaneja1, Sonia Bañuelos1
1
Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of
Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque
Country, Leioa, ES, 2Departamento de Genética, Antropología Física
y Fisiología Animal. Facultad de Ciencias, EHU/UPV, Leioa, ES
Nucleophosmin (NPM) is a nucleolar protein involved in several functions
impacting cell growth, such as the assembly and export of ribosomes from
the nucleolus to the cytoplasm. NPM is an oligomeric, multidomain protein,
built of a compact core, connected to C-terminal, globular domains through
long, flexible linkers. Although NPM is normally enriched in nucleoli, its
activities require continuous shuttling between nucleolus, nucleoplasm
and cytoplasm. This traffic relies on different localization signals in the
protein: NLS for import, Crm1-dependent NES for export, and C-terminal
domains for binding to nucleolar components. NPM deregulation has
been related to different types of cancer; in particular, NPM1 gene is
frequently mutated in acute myeloid leukemia (AML), correlating with an
aberrant, cytoplasmic localization of the protein. It has been shown that
AML-related mutations of NPM impair folding of the C-terminal domain,
hampering attachment to the nucleolus, and confer an additional NES,
both factors contributing to displacement of the protein to the cytoplasm.
The molecular determinants of wild type NPM recognition by the export
receptor Crm1 are not yet understood; on the other hand, the subcellular
localization of mutant NPM in AML remains to be explained in terms of
Crm1 binding properties. To better understand the determinants of NPM
cellular traffic, both in physiological and pathological conditions, we are
characterizing NPM recognition by Crm1, and the effect of AML mutations
on the interaction. We have observed that AML-related NPM mutants
bind indeed with stronger avidity to Crm1, explaining their unbalanced
transport in leukemia.
P10-4
Identifying protein-protein interaction inhibitors
for NUPR1, a key therapeutic target in
pancreatic cancer
María Arruebo1, Ángel Lanas2, José L. Neira3, Juan L. Iovanna4,
Adrián Velázquez-Campoy5, Olga Abián6
1
IIS Aragón / Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud-IACS,
Zaragoza, ES, 2IIS Aragón, Universidad de Zaragoza, Servicio
de Digestivo - Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de
Zaragoza, Zaragoza, ES, 3Instituto de Biología Molecular y Celular,
Universidad Miguel Hernández - Instituto de Biocomputación y
Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza,
Elche, ES, 4Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
(CRCM), INSERM U1068, Marsella, FR, 5BIFI - Universidad de
Zaragoza - Fundación ARAID, Diputación General de Aragón,
Zaragoza, ES, 6IIS Aragón/Instituto Aragonés de Ciencias de la
Salud (IACS) - BIFI - Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most common type of
pancreatic cancer, is one of the most aggressive human cancers and worse
Pósters
prognosis because of its remarkable capacity for invasion and metastasis.
PDAC exhibits an extremely low survival rate (<3-4% at 5 years), due to its
difficult diagnosis in early stages, and its high resistance to chemotherapy
and radiotherapy. Hence, there is an urgent need to develop new and
effective therapies against this disease.Protein NUPR1 (Nuclear Protein
1), also known as p8, is a nuclear protein overexpressed in several types
of human cancers (breast, thyroid, skin...), especially in PDAC, where
NUPR1 is essential for the development and progression of the tumor.
Several studies have shown that blocking NUPR1 expression in pancreatic
cancer cells prevents the formation of tumors, thus, confirming its key role
in PDAC.
NUPR1 protein is a small (82 aminoacid residues), basic and multifunctional
protein without stable secondary and tertiary structure, belonging to the
groupof intrinsically disorderedproteins (IDP’s). Its interaction with its
different partners promotes the mutual stabilization of their structures
in a particular conformation and the formation of fuzzy, but biologically
active complex. NUPR1 fuzzy complexes are involved in the regulation of
important cellular processes, such as transcription of genes, cellular cycle,
or apoptosis.
In our group, we have developed a new strategy for identifying compounds
capable of blocking NUPR1 intracellular interactions. The in vitro selected
compounds inhibited NUPR1 interactions with one of its cellular partners
and efficiently blocked NUPR1 function in cell-based studies.
Keywords: NUPR1, PDAC, IDPs, Thermal stability, Structural characterization
of proteins, HTS.
P10-5 (R10-1)
Dissecting I-DmoI endonuclease catalysis “live”
Rafael Molina Monterrubio1, Stefano Stella2, Pilar Redondo1, Hansel
Gomez3, Maria Jose Marcaida4, Modesto Orozco3, Jesus Prieto1,
Guillermo Montoya2
1
Structural Biology and Biocomputing Programme, Spanish National
Cancer Research Centre (CNIO), Macromolecular Crystallography
Group, Madrid, ES, 2Structural Biology Group, Novo Nordisk
Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and
Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, DK,
3
Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona,Joint
BSC-CRG-IRB Program in Computational Biology and Department
of Biochemistry and Molecular Biology, University of Barcelona,
Barcelona, ES, 4Department of Chemistry and Biochemistry,
University of Bern, Bern, CH
The enzymatic hydrolysis of a DNA phoshpodiester bond has been widely
studied; however, the chemical reaction has not been directly observed.
Here we watch the course of a double strand break generation by I-DmoI,
a homing endonuclease. The catalysis of this enzyme family is similar to
type II restriction enzymes, which are general tools in molecular biology
and boosted the recombinant DNA technology. By using a “dynamic”
crystallography approach we provide the first time-resolved view of a
two-metal ion cleavage mechanism, a central reaction to modify and edit
DNA. We developed a procedure to capture intermediates of the different
catalytic steps allowing us to analyse and watch the reaction by “freezing”
multiple stages. We observe the successive entrance of two metals involved
in the reaction, and finally the arrival of a third metal in a central position
of the active site. This metal plays a pivotal role triggering the consecutive
digestion of the targeted phosphodiester bonds in the non-coding and coding
strands. Finally, the central metal abandons its position after double strand
break generating a 4bp DNA overhang. We solved more than 150 crystal
structures to obtain key snapshots of different catalytic stages, showing the
orchestrated conformational changes in the amino acids, nucleotides and
metals during catalysis. Our work provides a “live” and visual proof of this
key biological mechanism.
87
Pósters
P10-6
The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated
factor p15PAF is an intrinsically disordered
protein with non-random structural preferences
at sites of interaction with other proteins
Alfredo De Biasio1, Alain Ibáñez de Opakua1, Tiago N. Cordeiro2,
Maider Villate1, Nekane Merino1, Nathalie Sibille2, Moreno Lelli3,
Tammo Diercks1, Pau Bernadó2, Francisco J Blanco4
1
CIC bioGUNE, Derio, ES, 2Centre de Biochimie Structurale,
Montpellier, FR, 3Institut de Sciences Analytiques, Villeurbanne,
FR, 4IKERBASQUE, Bilbao, ES
We present the first structural characterization of the p15PAF protein
showing that it is monomeric and intrinsically disordered in solution
but with non-random conformational preferences at sites of protein-
protein interactions. The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated
factor p15PAF is a 12 kDa nuclear protein that acts as a regulator of
DNA repair during DNA replication. The p15PAF gene is overexpressed
in several types of human cancer. The nearly complete NMR backbone
assignment of p15PAF allowed us to measure 86 N-HN residual dipolar
couplings (RDCs). Our RDC analysis reveals non-random conformational
preferences in distinct regions, including the PCNA-interacting protein
motif (PIP-box) and the KEN-box (recognized by the ubiquitin ligase that
targets p15PAF for degradation). In accordance with these findings, the
analysis of the 15N R2 relaxation rates shows a relatively reduced mobility
for the residues in these regions. The agreement between the experimental
small angle X-ray scattering curve of p15PAF and that computed from
a statistical coil ensemble corrected for the presence of local secondary
structural elements further validates our structural model for p15PAF. The
coincidence of these transiently structured regions with protein-protein
interaction and post-translational modification sites suggests a possible role
for these structures as molecular recognition elements for p15PAF.
P10-7 (R10-2)
Structural basis of regulation and oligomerization
of human cystathionine β-synthase, the central
enzyme of transsulfuration
June Ereño Orbea
CICBiogune, Derio, ES
Cystathionine β-synthase (CBS) controls the flux of sulfur from
methionine to cysteine, a precursor of glutathione, taurine, and H2S. CBS
condenses serine and homocysteine to cystathionine with the help of three
cofactors, heme, pyridoxal-5′-phosphate, and S-adenosyl-L-methionine.
Inherited deficiency of CBS activity causes homocystinuria, the most
frequent disorder of sulfur metabolism. We present the structure of the
human enzyme, discuss the unique arrangement of the CBS domains in
the C-terminal region, and propose how they interact with the catalytic
core of the complementary subunit to regulate access to the catalytic site.
This arrangement clearly contrasts with other proteins containing the CBS
domain including the recent Drosophila melanogaster CBS structure. The
absence of large conformational changes and the crystal structure of the
partially activated pathogenic D444N mutant suggest that the rotation of
CBS motifs and relaxation of loops delineating the entrance to the catalytic
site represent the most likely molecular mechanism of CBS activation
by S-adenosyl-L-methionine. Moreover, our data suggest how tetramers,
the native quaternary structure of the mammalian CBS enzymes, are
formed. Because of its central role in transsulfuration, redox status, and
H2S biogenesis, CBS represents a very attractive therapeutic target. The
availability of the structure will help us understand the pathogenicity of the
numerous missense mutations causing inherited homocystinuria and will
allow the rational design of compounds modulating CBS activity.
88
XXXVII Congreso SEBBM
P10-8 (R10-3)
Instruct: infraestructura europea para biología
estructural
Carlos Oscar Sorzano Sánchez1, José María Carazo2
1
Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, ES, 2Centro Nacional de
Biotecnología, CSIC, Madrid, ES
La biología estructural proporciona información muy valiosa sobre los
mecanismos biológicos implicados en el funcionamiento fisiológico y
patológico de las células. La obtención de información experimental
de alta calidad depende en gran medida del acceso a infraestructuras
de última generación para el análisis de estructuras biológicas desde
resolución celular a resolución atómica utilizando cristalografía de rayos
X, resonancia magnética nuclear, tomografía electrónica, así como otras
técnicas biofísicas y bioquímicas. Instruct es una infraestructura europea
cuyo objetivo es proporcionar acceso mediante un proceso de revisión
por pares a un amplio abanico de técnicas para el estudio estructural.
Instruct tiene un modelo de nodos con un nodo central. El nodo central
coordina actividades como decisiones estratégicas, acceso al portal web,
cursos, colaboraciones con la industria mientras que los nodos nacionales
coordinan el acceso de los usuarios de ese país. En esta charla se expondrán
los recursos disponibles a través de Instruct así como el proceso para
solicitarlos.
P10r-9
The interaction of TIA-1 with C-rich RNA
sequences is driven by its pH-dependent RRM3
domain
Isabel Cruz-Gallardo1, Jesús Angulo2, Myriam Gorospe3, B. Göran
Karlsson4, Jacqueline A. Wilce5, Miguel A. De la Rosa1, Irene Díaz-
Moreno1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2School of Pharmacy,
University of East Anglia - Norwich Research Park, Norwich,
UK,3Laboratory of Genetics, National Institute on Aging-Intramural
Research Program, NIH, Baltimore, US, 4Swedish NMR Centre,
University of Gothenburg, Gothenburg, SE, 5Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Victoria,
AU
T-cell intracellular antigen-1 (TIA-1) is a key RNA binding protein that
regulates critical events in cell physiology by the regulation of pre-mRNA
splicing and mRNA translation [1, 2]. It possesses three RNA recognition
motifs (RRM) along with a glutamine-rich domain, with the central
domains (RRM2 and RRM3) acting as RNA binding platforms. While
RRM2 domain is primarily responsible for the RNA interaction, the RRM3
contribution to the RNA binding, as well as its targets sequences, are still
unknown. Here we combine Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Surface
Plasmon Resonance (SPR) and pull-down assays to elucidate the sequence
specificity of TIA-1 RRM3 [3]. We demonstrate that RRM3 significantly
binds to those oligonucleotides enriched with cytosines. Notably, in
combination with RRM2 or in the context of the full length protein, the
RRM3 domain enhances the binding to C-rich sequences. In addition, the
binding of RRM3 to RNA is modified by pH conditions, having a significant
effect on the overall interaction of TIA-1 protein [4]. Our findings provide
a new insight into the role of RRM3 in regulating TIA-1 binding to C-rich
stretches, abundant at the 5’ TOPs (5’ Terminal Oligopyrimidine Tracts) of
translationally-repressed mRNAs under stress situations [5].
References
[1] Förch et al. (2000). Mol Cell, 6: 1089-1098.
[2] Mazan-Mamczarz et al. (2006). Mol Cell Biol, 26: 2716-2727.
[3] Cruz-Gallardo, I. et al. (2014) RNA Biol, 11.
[4] Cruz-Gallardo, I. et al. (2013). J Biol Chem, 288: 20896-20907.
[5] Damgaard and Lykke-Andersen. (2011) Genes Dev, 25: 2057-2068.
Granada 2014
Acknowledgements: Andalusian Government (P07-CVI-02896, P08-
CVI-3876, P11-CVI-7216 and BIO198); Bio-NMR Research Infrastructure
co-funded by EC (FP7/2007-2013, grant agreement 26186 and BIO-
NMR-00190); NMR services at the Centro de Investigación Tecnología e
Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS).
P10-10 (R10-6)
Structural basis for the recruitment and
activation of the Legionella phospholipase VipD
by the host GTPase Rab5
Maria Lucas1, Andrew H. Gaspar2, Chiara Pallara3, Ander
Vidaurrazaga1, Adriana L. Rojas1, Matthias P. Machner2, Aitor
Hierro1
1
CIC bioGUNE, Derio, ES, 2Cell Biology and Metabolism
Program, National Institute of Health, Bethesda, US, 3Barcelona
Supercomputing Center, Barcelona, ES
A challenge for microbial pathogens is to assure that their translocated effector
proteins modulate only the correct host cell compartment during infection. The
Legionella pneumophila effector protein VipD localizes to early endosomal
membranes and alters their lipid and protein composition, thereby protecting the
pathogen from endosomal fusion. This process requires the phospholipase A1
(PLA1) activity of VipD that is triggered specifically upon binding to the host
cell GTPase Rab5, a key regulator of endosomes. Here, we present the crystal
structure of VipD in complex with constitutively active Rab5 and reveal the
molecular mechanism underlying PLA1 activation. An active site-obstructing
loop that originates from the C-terminal domain of VipD is repositioned upon
Rab5 binding, thereby exposing the catalytic pocket within the N-terminal
PLA1 domain. Substitution of amino acid residues located within the VipD-
Rab5 interface prevented PLA1 activation and caused a failure of VipD
mutant proteins to target to Rab5-enriched endosomal structures within cells.
Experimental and computational analyses confirmed an extended VipD-
binding interface on Rab5 that explains why this L. pneumophila effector can
compete with cellular ligands for Rab5 binding. Together, our data explain how
the catalytic activity within microbial effectors can be precisely linked to their
subcellular localization.
P10r-11
Electrostatic effects in the folding of the
SH3 domain of the c-Src tyrosine kinase: pH-
dependence in 3D-domain swapping and amyloid
formation
Julio Luis Bacarizo Roa1, Ana Cámara Artigas1, Sergio Martínez
Rodríguez2, José Luis Neira Faleiro3, José Manuel Martín García1,
Montserrat Andújar Sánchez1, Emilia Ortíz Salmerón1
1
Universidad de Almería, Aguadulce, ES, 2Universidad de Granada,
Almería, ES, 3Universidad Miguel Hernández, Elche, ES
The SH3 domain of the c-Src tyrosine kinase (c-Src-SH3) aggregates to form
intertwined dimers and amyloid fibrils at mild acidic pHs. In this work, we show
that a single mutation of residue Gln128 of this SH3 domain has a significant
effect on: (i) its thermal stability; and (ii) its propensity to form amyloid fibrils;
the Gln128Glu mutant forms amyloid fibrils at neutral pH but not at mild acidic
pH, while Gln128Lys and Gln128Arg mutants do not form these aggregates
under any of the conditions assayed. We have also solved the crystallographic
structures of the wild-type (WT) and Gln128Glu, Gln128Lys and Gln128Arg
mutants from crystals obtained at different pHs. At pH 5.0, crystals belong to
the hexagonal space group P6522 and the asymmetric unit is formed by a chain
of the protomer of the c-Src-SH3 domain in an open conformation. At pH 7.0,
crystals belong to the orthorhombic space group P212121, with two molecules
at the asymmetric unit showing the characteristic fold of the SH3 domain.
Analysis of these crystallographic structures shows that the residue at position
128 is connected to Glu106 at the diverging β-turn through a cluster of water
molecules. Changes in this hydrogen-bond network leads to the displacement
Pósters
of the c-Src-SH3 distal loop, also resulting in conformational changes of
Leu100 that might be related to the binding of proline rich motifs. Our findings
show that electrostatic interactions and solvation of the residues close to the
folding nucleation site of the c-Src-SH3 domain might play an important role
during folding reaction and amyloid fibril formation.
Acknowledgements: This research was funded by the Spanish Ministry of
Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness and
FEDER (EU) [BIO2009-13261-C02-01/02 BIO2012-39922-C02-01/02,
CTQ2013-4493 and CSD2008-00005], Andalusian and Valentian
Regional Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and
P10-CVI-5915; Prometeo 2013/018]. Data collection was supported
by European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, France)
[BAG proposals MX-1406 and MX-1541] and ALBA (Barcelona, Spain)
[proposals 2012010072 and 2012100378]. This work has been performed
by members of the research groups BIO-328 Protein Structures of the
Andalusian Regional Government (Spain). We thank the staff at the ID14-4
beamline of the ESRF (Grenoble, France) and specially we would also like
to thank the beam line XALOC from the Spanish Synchrotron Radiation
Facility ALBA and Jordi Juanhuix, Jordi Benach and Fernando Gil for
their assistance in the measurement of the crystals.
P10r-12
Structural approaches on YIH1: a protein
involved in protein synthesis control under
stravation conditions
Sara Zamora Caballero1, Jerónimo Bravo Sicilia1, Bertrand
Séraphin2
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES,
2
IGBMC, Illkirch, FR
Protein synthesis is an essential and complex process that is susceptible to
different environmental situations. One of them might be the accumulation
of uncharged tRNAs due to starvation, leading to the activation of a cell
response that affects general protein synthesis. The proposed mechanism
requires GCN2 binding to GCN1, being this interaction mediated by the
GCN2 RWD domain. Once these two proteins have interacted, the complex
binds to the ribosome, what is essential for the detection of empty tRNAs;
since GCN1 is thought to facilitate the transfer of uncharged tRNAs from the
ribosome to the histidyl tRNA synthetase like domain of Gcn2. This signal
activates the kinase domain of GCN2, leading EIF2α phosphorylation, which
promotes the translation of some determinant transcription activators of
amino acid biosynthetic genes and also represses general protein synthesis.
YIH1 (yeast IMPACT homolog 1) also contains a RWD domain that
interacts with GCN1 through the same region as GCN2, thus competing
with GCN2 for GCN1 binding and down-regulating GCN2 activation.
Our aim is to elucidate the crystal structure of the YIH1-GCN1 complex.
Here we present the crystallization trials of this complex and also, the
C-terminal structure of a fungi YIH1 homolog. This C-terminal belongs
to the UPF 0029 group in Pfam with unknown functions described. It is
conserved in both procariotes and eucariotes. This domain is organized as
beta-alpha-beta-beta-alpha-beta, similar to a ferredoxin like domain.
P10r-13
Melanocortin receptor 1 (MC1R) variants
and human pigmentation phenotypes.
Characterization of a MC1R mutant from a family
with hypopigmentation of skin and hair
Julia Sirés-Campos, Marta Abrisqueta González, Celia Jiménez-
Cervantes, José Carlos García-Borrón Martínez, Conchi Olivares Sánchez
Universidad de Murcia, Murcia, ES
Melanocortin 1 receptor (MC1R) is a Gs protein-coupled receptor
(GPCR) expressed on the surface of melanocytes and crucial for the
89
Pósters
regulation of its proliferation and function. Upon binding melanocortins,
MC1R activates the cAMP pathway, ultimately leading to synthesis
of photoprotective eumelanins. Conversely, defective signaling is
associated with pheomelanogenesis. MC1R gene is highly polymorphic
and differences in signaling by MC1R variants result in diverse human
skin pigmentation and skin cancer susceptibility. The MC1R is seven-
pass integral transmembrane protein with the canonical GPCRs
structure. The C-terminal domain may play an important role in receptor
trafficking, functional coupling and regulation of signaling. We have
analyzed for function a new natural nonsense mutation resulting in the
premature truncation of the C-terminal tail. This p.Y298* mutation was
found in human family with hypopigmentation. Deletion of the complete
cytoplasmic C-terminus in the mutant protein reduced functional
coupling to the cAMP pathway to almost undetectable levels. The
residual activity was lower for p.Y298* than for most hypomorphic red
hair color-associated alleles. The electrophoretic pattern was similar
for the p.Y298* and wildtype proteins, indicative of comparable post-
translational processing and oligomerization. Significant expression of
the p.Y298* variant on the cell surface was detected by ELISA in non-
permeabilized heterologous cells and confirmed by confocal microscopy,
thus challenging the current view of the role of the MC1R C-terminus in
forward trafficking through the biosynthetic-secretory pathway. However,
the intracellular half-life of the p.Y298* mutant in transiently transfected
cells was shorter, compared with wildtype, suggesting sensitivity to
proteolytic digestion and a faster turnover.
P10r-14
Structural characterization of the β-propeller
domain of Erb1, an essential protein in
eukaryotic ribosome biogenesis
Marcin Wegrecki, Jerónimo Bravo
Instituto de Biomedicina de Valencia - CSIC, Valencia, ES
Erb1 (Bop1 in mammals) is a eukaryotic protein essential in ribosome
biogenesis. Altogether with Nop7 and Ytm1 it forms a stable complex
that participates in early steps of rRNA processing and is necessary for
the proper maturation of the 60S ribosomal subunit although its exact
implication in the process remains unknown. The amino terminal part of
Erb1 harbors a poorly characterized domain (BopNt) which is directly
responsible for its function and binding to Nop7, whereas the carboxy-
terminus of the protein contains a big β-propeller domain that is formed
by seven WD repeats. It has been postulated that this C-terminal region
is not directly involved in the main function of the protein during 60S
synthesis; nevertheless it is well conserved within the Erb1/Bop1 family
and provides an extensive surface for possible protein-protein and protein-
RNA interactions. In total, 22 pre-ribosomal factors contain a β-propeller
domain in their structure indicating that it is one of the most common folds
that maintain the complex network of interactions required for the 60S
assembly.
Here we present the crystal structure of the β-propeller domain of Erb1
from Saccharomyces cerevisiae at 1.6Å (residues 417-807) that was
obtained as a result of random proteolysis event during crystallization
trials of Erb1/Nop7 dimer. The structural information allowed us to
exactly define the boundaries of the domain and to describe its particular
features, being the presence of a long insertion within the second WD
repeat the most distinctive characteristic. This additional segment forms a
protrusion on the surface of the propeller and may play an important role
in peptide binding. We conclude that the proper folding of the insertion is
determined by the neighboring blades of the propeller. The analysis of the
electrostatic surface and conserved hot-spot residues allows us to predict
the patches that might be involved in protein-protein interactions. At last,
we show that the propeller binds to RNA through a defined surface that
can be saturated.
90
XXXVII Congreso SEBBM
P10-15
Estudio estructural de dUTPasas diméricas
virales
Elisa Maiques1, Jordi Donderis1, Ilty Mehmedov1, María Angeles
Tormo-Más2, María García2, José R. Penadés3, Alberto Marina1
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES,
2
Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA-IVIA), Segorbe,
ES, 3Institute of Infection, Immunity, and Inflammation, College
of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of Glasgow,
Glasgow, UK
Las dUTPasas (Dut) son enzimas presentes en todos los organismos,
responsables de mantener los niveles celulares de dUTP bajos, al hidrolizar
este nucleótido a dUMP y pirofosfato. Según su estado de oligomerización,
las Dut se clasifican en tres grupos, monoméricas, diméricas y triméricas.
Tanto las Dut monoméricas como las triméricas, a pesar de no tener una
elevada homología a nivel de secuencia, presentan un plegamiento similar
formado por hojas betas que generan un centro activo común. En cambio,
las Dut diméricas son proteínas cuya estructura secundaria está formada
por α-hélices, por tanto, con un plegamiento diferente al de las otras Dut.
Además, las propiedades bioquímicas de las enzimas pertenecientes a este
grupo también difieren de otras Dut, siendo capaces de hidrolizar tanto
dUTP como dUDP.
Aunque las Dut diméricas son un grupo menor dentro de la familia, son
las que presentan patógenos como Leishmania major, Trypanosoma cruzi
y Campylobacter jejuni. Diferentes bacteriófagos de Staphylococcus
aureus presentan este tipo de Dut diméricas, mientras que otros presentan
las más predominantes Dut triméricas. Las Dut triméricas han sido
ampliamente caracterizadas a nivel estructural, habiendo estructuras de
todos los reinos, desde virus hasta el hombre, incluyendo Dut de fagos
de S. aureus, donde nuestro grupo ha contribuido de forma importante.
Por el contrario, la caracterización estructural de Dut diméricas se reduce
a pocos ejemplos. En esta comunicación presentaremos trabajo reciente
del laboratorio que nos ha permitido resolver la estructura tridimensional
de 3 Dut diméricas de diferentes fagos S. aureus, ϕDI, ϕO11 y ϕ55,
en sus formas Apo y unidas a dUMPnPP. La comparación de estas
estructuras entre sí, y con los pocos ejemplos depositados en el PDB, nos
han permitido delimitar un módulo mínimo compuesto por 4 α-hélices
implicadas en el reconocimiento e hidrólisis del nucleótido. A este núcleo
básico se suman múltiples inserciones variables en secuencia y tamaño
cuya implicación en la catálisis y/o otras funciones será discutida en la
presentación.
P10-16
Structural and dynamic study of the response
regulator CheY3 from the R. sphaeroides
chemotaxis network
Lorena Varela, Christian Bell, Judith Armitage, Christina Redfield
Universidad de Oxford, Oxford, UK
The process by which bacteria bias their motility, enabling them to move
towards favourable chemical stimuli and away from unfavourable ones, is
known as chemotaxis.
The chemotaxis signalling network of E. coli. depends on
autophosphorylation of a histidine protein kinase (HPK) in response to a
signal from a sensor domain, with subsequent transfer of the phosphoryl
group to an aspartate on response regulator (RR) proteins that bind to the
flagellar motor and alter its rotation. CheY is a simple 14kDa single domain
RR that is conserved across motile species. It is formed by 5 alpha-helices
and 5 beta-strands surrounding a conserved phosphoryl accepting aspartate
residue, and once phosphorylated diffuses to the flagellar motor, binding to
its FliM component to cause switching of rotational direction and, hence, a
change from smooth-swimming to tumbling.
The photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides has multiple
chemosensory pathways formed by homologues of the E. coli chemosensory
Granada 2014
proteins. It has six homologues of the response regulator CheY and they all
have different effects on chemotaxis.
In this work we have used solution-state NMR methods to answer
important questions about the structure, dynamics and function of the
6 highly homologous CheYs from R. sphaeroides. We have performed
a detailed study on how conditions (Mg+2 and BeF3 concentrations,
pH) affect the structure and function of the CheY3 protein. Under
conditions where CheY3 is inactive (no BeF3 bound) and at low pH we
have detected one minor and one major protein conformation and upon
pH increase these populations are inverted and finally only one species
is present. We have observed that only at high pH is Mg+2required for
the protein to bind BeF3, a phosphorylation mimic, and the affinity for
Mg+2 is considerably higher than at low pH. We have evidence for the
presence of two binding sites for Mg+2, one with very high affinity and
one with lower affinity locatedclose to the BeF3 binding site. We have
also investigated backbone dynamics of the inactive and active forms
of CheY3 using heteronuclear NOE experiments and no significant
differences have been observed suggesting that the flexibility of both
conformations is similar. Finally, we have assigned the backbone
resonances of CheY3 in their inactive and active states using triple-
resonance NMR methods and information about secondary structure
has been obtained from the analysis of 1H, 13C and 15N chemical shifts
using TALOS as well as CD experiments.
P10-17
Biophysical characterization of the L-isoaspartyl
O-methyltransferase from Escherichia coli
Emilio José González Ramirez1, Sergio Martínez-Rodriguez2, Emilia
Ortiz-Salmerón1, Montserrat Andújar-Sánchez1, Ana Cámara-Artigas1
1
Departamento de Química y Física, Escuela Politécnica y Facultad
de Ciencias Experimentales, Universidad de Almería, Almería,
ES, 2Departamento de Química y Física, Universidad de Granada,
Granada, ES
The protein L-isoaspartyl O-methyltransferase (PIMT) is a highly
conserved enzyme found in a wide diversity of organisms, including
plants, insects, bacteria, and mammals. Its function is to recognize
L-Isoaspartyl residues in proteins and revert to L-aspartyl residues. This
action takes places by the transfer of a methyl group from S-adenosyl-L-
methionine (AdoMet) to the α-carboxyl of the L-isoaspartyl group, which
forms a succinimide, and subsequent hydrolysis converts a fraction of
these residues to aspartyls [1].There are several studies on E.coli PIMT
(EC-PIMT) functional features, but the knowledge about its biophysical
behavior is scarce. We have performed a biophysical characterization
of this enzyme by using spectroscopic techniques. Our results shows
that E.Coli PIMT is monomeric in all the range of pH assayed (2-12)
and protein concentration (1-10 mg·mL-1) at temperatures below 45oC.
We have also characterized the stability of the protein by means of
fluorescence emission. Our results show that the protein denaturizes at
urea concentrations higher than 2.5 M.
Acknowledgment: This research was funded by the Spanish Ministry of
Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness
and FEDER (EU) [BIO2012-39922-C02-01/02], Andalusian Regional
Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and P10-
CVI-5915]. This work has been performed by members of the research
groups BIO-328 Protein Structures of the Andalusian Regional
Government (Spain).
References
[1] Fang, P., Li, X., Wang, J., Xing, L., Gao, Y., Niu, L., Teng, M., (2010)
“Crystal Structure of the Protein L-Isoaspartyl Methyltransferase from
Escherichia coli”. Cell Biochem Biophys 58, 163–167.
Pósters
P10-18
Characterization of canine adipose derived
mesenchymal stem cell population: expression
of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9
Guillermo Mejías Martínez1, Leticia G. León2, Maria Luisa Fermín3,
Elena Merino1, Cristina Fragío3, Elisabeth Kremmer4, Concepción
Tejero Ortego1
1
Department of Biochemistry and Molecular Biology IV, Veterinary
Faculty (UCM), Madrid, ES, 2Center of Biomedical Investigations
from Canarias (CIBICAN) - Institute of Biomedical Technologies
(ITB) (ULL), La Laguna, ES, 3Department of Animal Medicine
and Surgery, Veterinary Faculty (UCM), Madrid, ES, 4Institut für
Immunologie, GSF-Forschungszentrum Umwelt und Gesundheit,
München, DE
Adult mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells able to
differentiate into adipogenic, condrogenic and osteogenic lineages.
Initially MSC source has been bone marrow, however currently adipose
tissue-derived stem cells (ADSCs) has been shown as an interesting
alternative source, making these cells particularly attractive for therapeutic
exploitation.The aim of this work was to develop an easy-to-use protocol
to isolate and characterize canine MSCs from adipose tissue. In addition,
considering the role of MMP-2 and MMP-9 in migration and facilitating
homing to the injured tissue, a study of its expression has been done.
Peritoneal fat was obtained from clinically healthy bitches at the time of
elective ovariohysterectomy, digested with collagenase I and then isolated
by centrifugation and filtration. cMSCs were cultured in IMDM medium at
7000 cell/cm2 with 10% dog serum at 38ºC, 5% CO2 and 90% air humidity.
In vitro growth is exponential until 25-30 days, and doubling time of all
samples studied remains constant throughout 1-4th passages. Dot plot of
stained cMSC after incubation with primary antibodies reveal that these
cells had positive results for CD90 and negative for CD34, CD45 and
MHC-II. Gelatin zymografy reveal the expression of MMP-2 and MMP-9.
In conclusion, we have isolated and characterized a canine adipose
tissue-derived mesenchymal stem cells population. As far as we know,
we provided the first evidence that canine mesenchymal derived adipose
cells constitutively express MMP-2 and MMP-9. Further investigations on
cMSC differentiation into specific tissues may lead to the development of
novel therapeutic strategies to target specific diseases.
P10r-19
Inhibition of Type IV secretion ATPase TrwD
by unsaturated fatty acids as a potential tool
to prevent wide spread dissemination of
antibiotic resistance genes
Yolanda García Cazorla1, Jorge Ripoll Rozada2, Cristina Machón3,
María Getino1, Fernando de la Cruz1, Elena Cabezón1, Ignacio
Arechaga1
1
Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, e
Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC),
CSIC-UC-IDICAN, Santander, ES, 2Instituto de Biología Molecular
e Celular (IBMC), Porto, PT, 3Instituto de Investigación Biomédica-
IRB, Barcelona, ES
Antibiotic resistance has become a major health issue [1]. Unfortunately,
the development of new antibiotics is being very slow and expensive
and we are running out of weapons to fight against the appearance
of multi-resistant bugs. Bacterial conjugation is the main mechanism
for the wide spread dissemination of antibiotic resistance genes and,
therefore, the search of specific inhibitors of conjugation (COINs)
could become a brand new strategy in this warfare. In the search of
potential COINs, previous studies have reported that unsaturated fatty
acids (uFAs) were able to inhibit conjugation [2]. Based on these
studies we have looked for the molecular targets of these compounds
and we have found that the Type IV secretion ATPase TrwD is inhibited
91
Pósters
by linoleic acid and 2-alkynoic fatty acids, such as the 2-hexadecynoic
acid. These two uFAs compounds were the most effective inhibitors in
R388 plasmid conjugation [3]. The inhibitory effect is specific for the
traffic ATPase TrwD, as the remaining ATPases of the Type IV secretion
system are unaffected by both uFAs and 2-AFAs. We have characterized
the inhibition mechanism and we have found that in both cases it is
a non-competitive inhibition, as the affinities for the substrate (ATP)
and product (ADP) are not altered in the presence of the fatty acids.
Altogether, these results could open new avenues in the development
of new strategies to prevent the dissemination of antibiotic resistance
genes.
References
[1] Sommer M.O. (2014). Microbiology: Barriers to the spread of
resistance. Nature. Doi: 10.1038.
[2] Fernandez-Lopez R. et al. (2005) Unsaturated fatty acids are inhibitors
of bacterialconjugation. Microbiology. 151, 3517–3526.
[3] Getino M. et al. (2014) 2-alkynoic fatty acids as chemically stable
conjugation inhibitors. (Submitted)
P10-20
A triple mutant of human, Mn(II)-dependent
ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase
(ADPRibase-Mn) displays cyclic ADP-ribose
(cADPR) phosphohydrolase as its major activity
Iralis López-Villamizar1, Alicia Cabezas1, José Canales1, Ascensión
Fernández1, Rosa María Pinto1, João Meireles Ribeiro1, Joaquim Rui
Rodrigues2, María Jesús Costas1, José Carlos Cameselle1
1 of the cytotoxic effect of HQ is discussed.
Grupo de Enzimología, Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de
Extremadura, Badajoz, ES, 2Escola Superior de Tecnologia e Gestão,
Instituto Politécnico de Leiria, Leiria, PT
ADPRibase-Mn (EC 3.6.1.53) belongs to the metallo-dependent
phosphatases superfamily, where it forms a family of its own (SCOP2
ID 4002589). Rat and human ADPRibase-Mn hydrolyze ADP-ribose
(A), CDP-choline (B) and 2´,3´-cAMP (C) with decreasing efficiencies
(kcat/KM). They also display a unique cADPR phosphohydrolase
activity much less efficient than the activities on the other substrates [1-
3]. Zebrafish ADPRibase-Mn has similar specificity but is inactive on
cADPR [3]. Mutagenesis of human ADPRibase-Mn showed that Phe37 is
a determinant of the preference for A, due to a hydrophobic interaction
with the nitrogenous base, not evident with B, C or cADPR in docking
simulations. The F37A mutant exhibited, versus the wild type, a 50-
fold decrease of efficiency on A, much less marked (only 3-5 fold) on
B, C and cADPR. The double mutant F37A+L196F showed stronger
decreases of efficiency on A, B and C, but not on cADPR. In contrast,
the C253A mutation had a weak stimulatory effect with A, Band C, much
stronger with cADPR. Finally, the triple mutant F37A+L196F+C253A
was preferentially active on cADPR. While the wild-type is 150-, 40- or
6-fold more efficient on A, B or C than on cADPR, the triple mutant
was 2.9-, 1.3- or 7.2-fold more efficient on cADPR than on A, B or C.
The change of specificity included, in absolute terms, a 7-fold increase
of the cADPR phosphohydrolase efficiency over the wild type. Further
mutagenesis could perhaps generate an even more specific cADPR
phosphohydrolase.
References
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Support: Gobierno de Extremadura and FEDER (GR10133).
92
XXXVII Congreso SEBBM
P10-21
Tyrosinase-catalyzed hydroxylation
of hydroquinone, a depigmenting agent,
to hydroxyhydroquinone: a kinetic study
María del Mar García Molina1, Jose Luis Munoz-Munoz2, Miguel
Angel Maria Solano2, Jose Berna1, Francisco Garcia-Canovas2
1
Universidad de Murcia, Albatera, ES, 2Universidad de Murcia -
Grupo GENZ, Murcia, ES
Hydroquinone (HQ) is used as a depigmenting agent. In this work we
demonstrate that tyrosinase hydroxylates HQ to 2-hydroxyhydroquinone
(HHQ). Oxy-tyrosinase hydroxylates HQ to HHQ forming the complex
met-tyrosinase-HHQ, which can evolve in two different ways, forming
deoxy-tyrosinase and p-hydroxy-o-quinone, which rapidly isomerizes
to 2-hydroxy-p-benzoquinone or on the other way generating met-
tyrosinase and HHQ. In the latter case, HHQ is rapidly oxidized by
oxygen to generate 2-hydroxy-p-benzoquinone, and therefore, it cannot
close the enzyme catalytic cycle for the lack of reductant (HHQ).
However, in the presence of hydrogen peroxide, met-tyrosinase (inactive
on hydroquinone) is transformed into oxy-tyrosinase, which is active on
HQ. Similarly, in the presence of ascorbic acid, HQ is transformed into
2-hydroxy-p-benzoquinone by the action of tyrosinase; however, in this
case, ascorbic acid reduces met-tyrosinase to deoxy-tyrosinase, which
after binding to oxygen, originates oxy-tyrosinase. This enzymatic form
is now capable of reacting with HQ to generate p-hydroxy-o-quinone,
which rapidly isomerizes to 2-hydroxy-p-benzoquinone. The formation of
HHQ during the action of tyrosinase on HQ is demonstrated by means
of high performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC-
MS) by using hydrogen peroxide and high ascorbic acid concentrations.
We propose a kinetic mechanism for the tyrosinase oxidation of HQ which
allows us the kinetic characterization of the process. A possible explanation
P10-22
Crystallographic structure of the first WW domain
of Human YAP2 isoform
Ana Camara-Artigas1, Julio Bacarizo1, Sergio Martínez-Rodríguez2
1
Department of Chemistry and Physics, University of Almería,
Agrifood Campus of International Excellence (ceiA3), Almería, ES,
2
Department of Physical Chemistry, Faculty of Sciences, University
of Granada, Granada, ES
The WW domain is a small modular domain (approximately 35-40 residues)
that takes its name from the presence of two highly conserved tryptophan
residues. These domains were first identified in the Yes tyrosine kinase
Associated Protein (YAP), and since their discovery they became focus of
attention as they have been related to several important human diseases such
as Cancer, the Liddle’s syndrome, Alzhehimer’s, Huntington’s and viral
diseases. Two major isoforms of YAP have been described in human tissues,
namely YAP1 and YAP2, containing one and two WW domains, respectively.
Up to date, most of the available WW domain structures have been
obtained in solution by NMR techniques, and very few structures of WW
domains have been solved by X-ray diffraction. These domains show an
intrinsic conformational flexibility which difficult the formation of crystal
contacts and, therefore, their crystallization. We have solved the first
crystallographic structure of the first WW domain of the h-YAP2 at 1.6 Å
resolution in its apo form. The high quality of the data allowed us to model
residues 165-208. The Ramachandran plot shows 100% of the residues in
the preferred regions.
The interactions that stabilize this minimal modular domain have been
analyzed, showing that besides Trp177, which together with Pro202
and Phe189 form an aromatic cluster in the hydrophobic core of the
protein, some salt-bridges might play a key role in their folding reaction.
Furthermore, this structure allows us to explore for the first time the
conformational changes that take place in this domain upon binding of
Proline Rich Motifs.
Granada 2014
P10r-23 (R10-5)
A common signalosome for programmed cell
death in humans and plants
Katiuska González-Arzola1, Jonathan Martínez-Fábregas1, Antonio
Díaz-Quintana1, Simon Janocha2, Rita Bernhardt2, Adrián
Velázquez-Campoy3, Irene Díaz-Moreno1, Miguel Ángel De la Rosa1
1
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Institut für Biochemie,
Universität des Saarlandes, Campus B2.2, Saarbrücken,
DE,3Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems
(BIFI), Joint-Unit IQFR-CSIC-BIFI, Department of Biochemistry and
Molecular and Cell Biology, University of Zaragoza, Zaragoza, ES
Programmed cell death (PCD) is a fundamental event for the development
of multicellular organisms. In mammalian cells, early events in PCD
involve the release of cytochrome c (Cc) from mitochondria to the
cytoplasm to act at the first stages of the apoptotic process, playing a key
role in assembling the apoptosome. In plants, PCD is part of a general
process named hypersensitive response, where Cc is also released into
the cytosol but its role in PCD remains veiled. Such highly conserved
cytoplasmic location of Cc upon apoptotic stimuli lead to think of a
common link for PCD in evolutionarily distant species, like humans and
plants.
To better understand the role of Cc in the onset of PCD in both humans
and plants, a proteomic approach based on affinity chromatography with
Cc as bait was used. Upon combining this approach and Bimolecular
Fluorescence Complementation (BIFC), a total of 8 human and 9 plant
new proteins interacting with Cc under PCD were found [1,2]. These new
PCD Cc-partners are involved in protein folding, translational regulation,
oxidative stress, DNA damage, energetic and mRNA metabolism.
Strikingly, some of the novel human Cc-targets are closely related to those
for plant Cc, indicating that the evolutionarily well-conserved cytosolic
Cc – appearing in organism from plant to mammals- interact with a wide
range of targets on PCD.
Modeling of the complexes between human and plant Cc with its
counterparts shows how the heme crevice of Cc takes part of the complex
interface in agreement with the vast majority of known redox adducts of
Cc. However, in contrast to the high turnover rate of the mitochondrial
Cc redox adducts, those occurring under PCD lead to the formation of
rather stable nucleo-cytoplasmic ensembles, as inferred from Surface
Plasmon Resonance (SPR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
measurements. On the basis of these findings, we suggest that human and
plant Cc interacts with pro-survival, anti-apoptotic proteins after its release
into the cytoplasm. Then, Cc may interfere with cell survival pathways and
unlock PCD in order to prevent the spatial and temporal co-existence of
antagonist signals.
References
[1] Martínez-Fábregas, J. et al. (2013). Mol. Cell. Proteomics, 12: 3666-
3676.
[2] Martínez-Fábregas, J. et al. (2014). Mol. Cell. Proteomics, doi:10.1074/
mcp.M113.034322.
P10-24
Assessing the performance of ancestral protein
reconstruction
Sergio Martínez-Rodríguez, Valeria Alejandra Risso, José Manuel
Sánchez-Ruiz
Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad
de Granada, Granada, ES
Ancestral sequence reconstruction is a protein engineering methodology
exploiting natural sequence diversity to obtain protein variants with
enhanced characteristics [1], and has also been suggested to allow
inferring features of the physical environment in which ancient
organisms evolved [2]. After successful evaluation of this approach
Pósters
for the design of resurrected Precambrian β-lactamases [3], we wanted
to further confirm the performance of this evolutionary phylogeny
method analyzing the properties of additional resurrected ancestral
β-lactamases standing in the evolutionary path among Firmicutes and
Actinobacteria phyla, encoding proteins dating back between ~1.4 and
~2.9 billion years (Gyr). This alternative evolutionary reconstruction also
produced β-lactamases with higher in vitro denaturation temperatures
(~25 °C) and higher substrate promiscuity than modern β-lactamases.
In vivo studies showed that the resurrected enzymes provided actual
Escherichia coli cells with higher resistance to different third-generation
antibiotics, providing us with plausible evolutionary scenarios for actual
microorganisms’ antibiotic resistance. Our results reinforce the virtues of
ancestral protein reconstruction as a biotechnological cornerstone for the
molecular design of engineered enzymes. Furthermore, our denaturation
experiments suggest a different evolutionary environment for ancestral
Gram-positive bacteria, in full agreement with the inferred colonization
of land environments by Actinobacteria/Firmicutes at some point at the
end of the Archean period [4].
References
[1] Cole MF, Gaucher EA. Utilizing natural diversity to evolve protein
function: applications towards thermostability. Curr Opin Chem Biol.
(2011) 15(3):399-406.
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palaeoenvironment of ancient bacteria on the basis of resurrected proteins.
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[3] Risso VA, Gavira JA, Mejia-Carmona DF, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz
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[4] Battistuzzi FU, Hedges SB. A major clade of prokaryotes with ancient
adaptations to life on land. Mol Biol Evol (2009) 26(2):335-343.
P10r-25
Caracterización físico-química y funcional
del citocromo c6-3 de la cianobacteria Nostoc sp.
PCC 7119
Alejandro Torrado Maya, Leonor Puerto-Galán, Manuel Hervás, Jose
A. Navarro, Fernando Publio Molina-Heredia
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de
Sevilla y CSIC, cicCartuja, Sevilla, ES
En cianobacterias, las cadenas de transporte de electrones fotosintética
y respiratoria están localizadas en el mismo compartimento celular
y comparten algunos componentes, como son la plastocianina (Pc)
o el citocromo (Cit) c6 y el complejo b6-f. Se ha propuesto que en
estos organismos el Cit c6 y la Pc podrían transportar los electrones
alternativamente desde el complejo b6-f al Fotosistema I (PSI) o a la Cit
c oxidasa. Además de Cit c6 y Pc, en cianobacterias se han encontrado
otros posibles transportadores solubles de electrones, localizados en el
lumen tilacoidal, cuya función aún no ha sido bien establecida, como
son el Cit c6-2 y el Cit cM. A partir de un análisis de secuencias génicas
en cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, hemos
encontrado otra proteína que podría intervenir en estos procesos: el
Cit c6-3. En estos organismos, la fijación de nitrógeno atmosférico
se produce en unas células especializadas denominadas heterocistos.
En estas células, debido a que la nitrogenasa se inhibe por O2, la tasa
respiratoria es muy alta, con el fin de crear un ambiente anoxigénico.
En este trabajo hemos abordado la caracterización físico-química y el
análisis funcional del Cit c6-3. Esta proteína no es capaz de interaccionar
eficientemente con el PSI, por lo que no parece actuar en fotosíntesis. En
cambio, sí reduce específicamente a determinadas oxidasas terminales
en los heterocistos, por lo que proponemos que podría tener un papel
relevante en respiración.
93
Pósters
P10-26
Structural and thermodynamic characterization
of the interaction between viral late domains and
their cellular targets
1 1 1
Pedro Buzón , Manuel Iglesias-Bexiga , Francisco Castillo , Andrés
Palencia1, Maria J. Macias2, Francisco Blanco3, Ana Camara-
Artigas4, Irene Luque1
1
Department of Physical Chemistry, University of Granada, Granada,
ES, 2Structural and Computational Biology Programme, Institute
for Research in Biomedicine, Barcelona, ES, 3Structural Biology
Unit, CIC bioGUNE, Parque tecnológico de Bizkaia, Deiro, ES,
4
Department of Physical Chemistry, Biochemistry and Inorganic
Chemistry, University of Almería, Almería, ES
Many viruses encode a late budding domain (L-domain) in their sequence.
These L-domains usually contain highly conserved motifs known to
mediate cellular protein-protein interactions, such as PPXY and PTAP.
These motifs are essential for the recruitment of the cellular machinery
sequestered by the virus for replication inside the infected cell. The budding
process, which is mediated by the ubiquitin-proteasome system, has been
proposed as a potential target to inhibit viral replication. We present here a
structural and thermodynamic characterization of the interactions between
a set of peptide ligands corresponding to L-domains sequences from
different viruses (including Ebola, HTLV-1, Rabies, Marburg and HIV-
1) and their cellular targets (the UEV domain of hTsg101 and the WW
domains of hNedd4) aimed at understanding the molecular determinants
of binding affinity and specificity in these systems. Our work reveals that
the establishment of networks of water-mediated hydrogen bonds at the
binding interface and the reorganization of the conformational distribution
in both protein and ligand upon complex formation are important features
determining the thermodynamic signature of these interactions, that need to
be taken into account for a full understanding of these systems. The work
presented suggests that combining a detailed structural and thermodynamic
analysis with screening and molecular biology techniques can provide very
valuable information for the design of specific and high affinitty inhibitors
as potential broad spectrum antivirals.
P10-27
Structural insights into the Ca+2 and PI(4,5)P2
binding modes of the C2 domains of rabphilin 3A
and synaptotagmin 1
María Dolores Pérez Sánchez1, Teresa Coronado-Parra2, Jaime
Guillén2, Juan C. Gómez-Fernández2, Nuria Verdaguer3, Senena
Corbalán-García1
1
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de
Murcia, Jumilla, ES, 2Dpto de Bioquímica y Biología Molecular
A, Universidad de Murcia, Murca, ES, 3Department of Structural
Biology, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC),
Barcelona, ES
Proteins containing C2 domains are the sensors for Ca+2 in myriad of
secretory pathways. Here, we have determined the structure of this
domain in complex with PI(4,5)P2 and IP3 at resolutions of 1.75 and 1.9
Å, respectively, unveiling that the polybasic cluster formed by strands β3-
β4 is involved in the interation with the phosphoinositides. A comparative
study demonstrates that the C2A domain is highly specific for PI(4,5)P2/
PI(3,4,5)P3, whereas the C2B domain cannot discrimiate among sny of the
diphosphorylated forms. Structural comparisons between C2A domains
of rabphilin 3A and synaptotagmin 1 indicated the presence of a key
glutamic residue in the polybasic cluster of synaptotagmin 1 that abolishes
the interaction with PI(4,5)P2. Together, these results provide a structural
explanation for the ability of different C2 domains to pull plasma and
vesicle membranes close together in a Ca+2-dependent manner and reveal
how this family of proteins can use subtle structural changes to modulate
their sensivity and specificity to various cellular signals.
94
XXXVII Congreso SEBBM
P10-28
Estudio estructural y funcional de la fosfatasa
MG207 de Mycoplasma genitalium
Patricia Casino Ferrando1, Ana M. Martínez Martínez Mariscal2,
Alberto Marina3, Jaume Piñol2, Ignacio Fita1
1
Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular
de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, 2Departamento de
Bioquímica i Biología Molecular, Institut de Biotecnología i
Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra-
Barcelona, ES, 3Departmento de genómica y proteómica, Instituto
de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES
Mycoplasma genitalium es una bacteria parasitaria con genoma mínimo
(~580Kb) implicada en infecciones urogenitales, del endometrio y
síndrome pélvico inflamatorio; carece de pared celular y por tanto no es
sensible a antibióticos que bloquean la síntesis de ésta como la penicilina
y los betalactámicos [1]. La movilidad de estas bacterias se realiza por
deslizamiento gracias a una membrana que sobresale del polo de la bacteria
llamada organela terminal y que está implicada en adherencia celular.
En Mycoplasma pneumoniae, se ha correlacionado la función quinasa/
fosfatasa con la movilidad, de forma que mutaciones en la serín/treonina
prkC (MPN248) y su fosfatasa prpC (MPN247) producen cambios en la
movilidad así como cambios en el patrón de fosforilación de proteínas
de la organela terminal, HMW1 y HMW2 [2]. Acorde al tamaño de su
genoma, M. genitalium contiene muy pocas proteínas señalizadoras y tan
sólo cuatro ORFs han sido anotadas como fosfatasas, la proteína fosfatasa
2C (MG_108), dos serine/treonín fostatasas (MG_207 y MG_246) y
la pirofosfatasa inorgánica (MG_351). Recientemente, se demostró in
vivo que la fosfatasa MG_207 estaba implicada en virulencia, ya que la
cepa knockout en MG_207 era menos virulenta, su adherencia a células
eucarióticas era menor y presentaba un patrón de proteínas fosforiladas
diferente a la silvestre [3]. Con el fin de caracterizar la fosfatasa MG207
hemos obtenido, por cristalografía, su estructura tridimensional que
muestra un plegamiento a/β característico de fosfodiesterasas, además el
estudio funcional demuestra que MG207 presenta tanto actividad fosfatasa
como fosfodiesterasa. En el centro activo se observó la presencia de dos
metales y un sulfato y hemos confirmado que las actividades fosfatasa y
fosfodiesterasa son modulables dependiendo de la presencia de cationes
divalentes, siendo los metales de transición Mn2+, Ni2+ y Fe2+ quienes
especialmente activan esta enzima.
Bibliografía
[1] Anagrius C, Loré B, Jensen JS. Treatment of Mycoplasma genitalium.
Observations from a Swedish STD clinic. PLoS One. 2013;8(4):e61481.
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with gliding motility in Mycoplasma pneumonia. J Bacteriol. 2013:1750-7.
[3] Martinez MA, Das K, Saikolappan S, Materon LA, Dhandayuthapani
S. A serine/threonine phosphatase encoded by MG_207 of Mycoplasma
genitalium is critical for its virulence. BMC Microbiol. 2013;13:44.
P10-29
Biogénesis de ribosomas, “the Backstage”
Gisela Pöll, Shuang Li, Uli Ohmayer, Thomas Hierlmeier, Philipp
Milkereit, Jorge Pérez-Fernández
Universität Regensburg, Biochemie-Zentrum Regensburg (BZR),
Lehrstuhl Biochemie III, Regensburg, DE
La biogénesis de ribosomas es un proceso celular que implica el
procesamiento y plegamiento de los RNA ribosómicos y la incorporación
de las proteínas ribosómicas. Dicho proceso es facilitado, en organismos
eucariotas, por la acción de más de 150 proteínas conocidas como factores
de ensamblaje. Algunos de estos factores, denominados Utp, son capaces
de formar subcomplejos proteicos (UTP), que participan como entidades
independientes en la biogénesis de la subunidad menor del ribosoma
(40S). Dos de estos subcomplejos, tUTP/UTP A y UTP B participan en
las primeras etapas del ensamblaje y procesamiento del RNA ribosómico.
Granada 2014
Actualmente, se conoce la composición proteica de tUTP/UTP A y UTP B
y su arquitectura ha sido analizada hasta ahora en base a las interacciones
binarias proteína-proteína. En este trabajo presentamos una caracterización
bioquímica detallada de la arquitectura de los subcomplejos tUTP/UTP
A y UTP B. Los resultados obtenidos indican la completa reconstitución
in vitro de tUTP y UTP B. Además, proporcionan evidencias bioquímicas
sobre la existencia de complejos binarios, ternarios o de grado superior,
en consonancia con las interacciones binarias previamente descritas.
Por último, los resultados sugieren que los diferentes complejos
proteicos obtenidos constituyen diferentes módulos de tUTP y UTP B y
proporcionan un nuevo punto de vista sobre intermediarios de ensamblaje
o desensamblaje de los subcomplejos UTP.
P10-30
N-terminal protein tails act as aggregation
protective entropic bristles: the SUMO case
Patrizia Marinelli, Ricardo Graña-Montes, David Reverter, Salvador
Ventura
Universitat Autónoma de Barcelona, Barcelona, ES
The formation of β-sheet enriched amyloid fibrils constitutes the hallmark
of many diseases but is also an intrinsic property of polypeptide chains in
general, because the formation of compact globular proteins comes at the
expense of an inherent sequential aggregation propensity. In this context,
identification of strategies that enable proteins to remain functional and
soluble in the cell has become a central issue in chemical biology. We show
here, using human SUMO proteins as a model system, that the recurrent
presence of disordered tails flanking globular domains might constitute yet
another of these protective strategies. These short, disordered, and highly
soluble protein segments would act as intramolecular entropic bristles,
reducing the overall protein intrinsic aggregation propensity and favoring
thus the attainment and maintenance of functional conformations.
P10-31
Directed evolution of acyltransferases
for triglyceride production in E. coli
Omar Santín, Gabriel Moncalián
IBBTEC, Universidad de Cantabria, Santander, ES
Wax ester synthase/diacylglicerol acyltransferase (WS/DGAT) is a family
of enzymes able to perform the esterification of diacylglycerol or fatty
alcohols and acyl-CoA to produce triglycerides (TAGs) or wax esters,
respectively. Both products can be easily transformed onto biodiesel.
Although the specificity determinants of substrate recognition are still
unknown and there is no crystal structure solved from any bacterial WS/
DGATs , we recently published a study where we used limited proteolysis
and directed mutagenesis approaches to identify key folding domains
and motifs critical for the catalysis. We have also recently patented
a diacylglycerol acyltransferase (tDGAT) (ES201200967) from the
thermophilic organism Thermomonospora curvata that is able to produce
TAGs and waxes in E. coli. We have used this system for TAG production
in E.coli, but we believe it can be significantly improved through directed
evolution of tDGAT. Thus, the main goal of our work is to enhance TAG
production in E. coli by directed evolution. Moreover, this work will
provide us some information about the amino acids residues involved
in substrate recognition. For this purpose we have developed a direct
evolution protocol where we constructed mutant libraries by mutagenic
PCR in order to obtain variants of the protein. Using Nile Red, a fluorescent
dye that binds to neutral lipids we can select different variants of tDGAT
through a high throughput selection system based on fluorimetry and flow
cytometry. Mutants carrying interesting phenotypes are further selected
and sequenced. This way we were able to detect mutations that lead to a
2-fold increase in the TAG production.
Pósters
P10-32
Structural insights into the human Sigma-1
Receptor Chaperone structure and interactions
Jose Luis Ortega Roldan, Felipe Ossa, Nader Amin, Jason Schnell
Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK
The Sigma-1 Receptor (S1R) is a ligand-regulated membrane
protein chaperone involved in the ER stress response. S1R activity is
implicated in diseases of the central nervous system including amnesia,
schizophrenia, depression, Alzheimer’s disease, and addiction. S1R has
been shown previously to regulate the Hsp70 BiP and the IP3R calcium
channel through a C-terminal domain. It also binds and is regulated by
a large number of small molecules such us psychostimulants (cocaine,
methamphetamine and DMT), antidepressants, antipsychotics and
steroids.
We have developed methods for bacterial expression and reconstitution
of the chaperone domain and a truncation construct lacking the first
transmembrane domain (TM) of human S1R into DPC:DPPC mixed
micelles that enable its study by solution NMR spectroscopy.
S1R is found to contain a first TM, two helices in the cytosolic loop,
followed by the second TM and a juxtaposed helix, a largely dynamic
region and a structured, helical C-terminal region that encompasses a
membrane associated domain containing four helices. The helical region
at residues ~198-206 is strongly amphipathic and proposed to anchor the
chaperone domain to micelles and membranes. Three of the helices in the
C- terminal region closely correspond to previously identified cholesterol
and drug recognition sites.
Moreover, we show experimentally using chemical shifts, spin relaxation
and H/D exchange that the second TM, whose position hasn’t been
predicted accurately, spans the residues 89 to 111 and includes the entire
Sterol Binding Domain Like 1 (SBD1), partially responsible for drug
binding.
In addition, we show that the chaperone domain interacts with full- length
BiP or the isolated nucleotide binding domain (NBD) of BiP, but not the
substrate binding domain, suggesting that the NBD is sufficient for S1R
interactions.
These results, that constitute the first structural information obtained for
this protein and its interactions, advance our understanding of S1R and are
likely to be useful in refining models of the S1R drug binding sites.
P10-33
Conformational distribution of the SH3-SH2
Tandem of the Abl kinase and its modulation
by intramolecular interactions
Carles Corbi-Verge1, Fabrizio Marinelli2, Ana Zafra Ruano1, Javier
Ruiz-Sanz1, Irene Luque-Fernández1, José D. Faraldo-Gómez2
1
Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, Granada, ES, 2Max Planck Institute of
Biophysics, Theoretical Molecular Biophysics Group , Frankfurt, DE
Tyrosine kinases are involved in a wide variety of key signaling processes
and are therefore tightly regulated by the cell. Indeed, numerous
pathologies, ranging from cancer to neurodegeneration, result from or
are associated with deficiencies in kinase regulation. Consequently, these
enzymes are a prominent target for novel pharmacological strategies
against human disease.
This study focuses on Abl, which is one of the most ubiquitously conserved
tyrosine kinases. Abl is present in all metazoa, where it plays an essential
role in processes as diverse as cytoskeleton reorganization, DNA repair,
and regulation of apoptosis. Accordingly, when constitutively active forms
of Abl are present in normal cells, these are transformed into cancer cells.
For example, in human white-blood cells, a chromosomal abnormality
leads to the fusion of the bcr and abl genes, which together encode for a
cytoplasm-targeted, deregulated form of Abl; Bcr-Abl interferes with the
cell cycle, resulting in uncontrolled cell proliferation, and is the principal
cause of chronic myeloid leukemia (CML).
95
Pósters
Regulation of Abl can be thought as a reversible equilibrium whereby the
SH3, SH2 and catalytic domains are either dissociated or self-assembled
in one or more configurations. External factors, such as competing
interactions involving one or both regulatory domains, will bias this
equilibrium in one or other direction. For Abl in particular, the significance
of this mechanism is underscored by the fact that mutations that impair
the correct assembly of the autoinhibited complex, either in the SH3-SH2
tandem or in the domain-domain linkers, confer CML cells with resistance
against inhibitory drugs designed to target the catalytic domain of the
Bcr-Abl oncogene. This outcome has prompted considerable interest in
the mechanisms of allosteric regulation of Abl and other tyrosine kinases,
and in the development of compounds designed to interfere with these
mechanisms.
In this study, we use molecular simulations, free-energy calculations and
differential scanning calorimetry to study the determining factors of a
necessary step in the assembly of the autoinhibited form of Abl, namely the
organization of the SH3 and SH2 domains into a conformation conducive
to its association with the SH2-kinase linker. Our results show that the
conformational dynamics of the Abl SH3-SH2 tandem are clearly distinct
from those of Src and related kinases. This finding enables us to reconcile
seemingly contradictory structural and biophysical data on the mechanism
of Abl regulation. Finally, we also examine the impact of activating
mutations within the SH3-SH2 unit, particularly in the short connector
between the domains.
P10r-34
ER targeting of COPI vesicles involves cargo
recognition by tethering factors
Ana María Pérez-Linero, Javier Manzano-López, Marcos Cámara-
Donoso, Manuel Muñiz
Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
Vesicular transport through the eukaryotic secretory pathway is essential
for cellular function. This process depends on cytosolic coat proteins that
form vesicles from a donor compartment and ensure their correct docking
and fusion with the acceptor compartment trough interaction with
tethering factors. Specifically, the Dsl1 tethering complex tethers Golgi-
derived COPI retrograde transport vesicles to the endoplasmic reticulum
(ER) membrane. In this study, we found that the Dsl1 complex interacts
physically with the p24 proteins, which are type I transmembrane
proteins assembled into heteromeric complexes. The p24 complex is an
abundant cargo passenger of COPI vesicles that facilitates COPI vesicle
budding by stabilizing the COPI coat onto the Golgi membrane. By using
genetic analysis we also show that the Dsl1 and p24 complexes interact
functionally. Indeed, the phenotypic characterization of double mutants
indicates that the Dsl1-p24 physical interaction is required for an efficient
COPI vesicle tethering to the ER. Therefore, our results strongly suggest
that a specialized cargo like the p24 complex could promote the Golgi-
to-ER retrograde transport by coupling both budding and tethering events
of COPI vesicles.
P10r-35
Study of the Caspase-9/PP2ACα interaction in the
apoptotic pathway as a potential target for cancer
therapy
Leticia Domínguez Berrocal1, Angelita Rebollo2, Jerónimo Bravo
Sicilia1
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES,
2
INSERM UMRS 945, Hôpital Pitié Salpêtrière, Université Pierre et
Marie Curie, París, FR
Apoptosis is the process of programmed cell death induced in damaged,
unnecessary or dangerous cells to signal macrophages to engulf and
degrade their corpses. This key mechanism is found to be altered in
96
XXXVII Congreso SEBBM
most types of cancer. The apoptotic machinery depends on a family
of proteases called caspases, whose activation irreversibly triggers cell
death.
Caspase-9 is an initiator caspase that generates the active forms of
Caspase-3 and Caspase-7 by limited proteolysis, and thereby transmits
the apoptotic signal to the execution phase. PP2A is a serine/threonine
phosphatase critical to physiological processes, including apoptosis,
inducing cell death either by dephosphorylating proteins or by its own
inhibition.
Cell penetrating peptides are molecules that can translocate into cells
without causing membrane damage. Based on the characterization of
the region responsible for the interaction, we developed cell penetrating
fusion peptides specifically designed to disrupt the Caspase-9/PP2ACα
binding. Using these peptides, we performed the biophysical and
biochemical characterization of the interaction, showing a direct
association between Caspase-9 and PP2ACα. We are also evaluating the
therapeutical potential of these peptides to induce Caspase-9 dependent
apoptosis.
P10-36
Mutational studies on ancestral proteins
Fadia Manssour1, Valeria A Risso1, Alvaro Inglés-Prieto1, Raquel
Godoy-Ruiz2, Jose A Gavira3, Beatriz Ibarra-Molero1, Jose M
Sanchez-Ruiz1
1
Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, Granada, ES, 2Department of Biochemistry
and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine,
Maryland, US, 3Laboratorio de Estudios Cristalográficos,
Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (Consejo Superior de
Investigaciones Científicas- Universidad de Granada), Armilla,
Granada, ES
We have carried out an extensive mutational analysis of two thioredoxins:
a laboratory resurrection of a protein of the last common bacterial ancestor
(LBCA thioredoxin), an organism estimated to have lived about 4 billion
years ago, and one of its modern descendant (E. coli thioredoxin). Both
proteins share the same overall 3D-structure but show only 55% sequence
identity[1-2].
A total of 25 variants involving exchanges between highly similar amino
acids (E/D, I/V)[3-4] were purified and their thermal stabilities were
investigated by Differential Scanning Calorimetry.
Surprisingly, our results indicate a significant correlation between the
mutation effects on the ancestral and modern backgrounds suggesting a
conservation of protein mutational energetics over billions of years.
References
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Jimenez R, Fernandez JM, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz JM, Gavira
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JM. Relation between protein stability, evolution and structure, as probed
by carboxylic acid mutations. J Mol Biol 336:313-318.
[4] Godoy-Ruiz R, Perez-Jimenez R, Ibarra-Molero B and Sanchez-Ruiz
JM. A stability pattern of protein hydrophobic mutations that reflects
evolutionary structural optimitzation. Biophys J 89:3320-3331.
Granada 2014
P10r-37
Structure and function study of the complex that
synthesizes S-adenosylmethionine
Ben Murray1, Svetlana Antonyuk2, Alberto Marina3, Sebastiaan Van
Liempd4, Shelly Lu5, Jose Mato4, Samar Hasnain2, Adriana Rojas3
1
Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology, Faculty
of Health and life sciences, University of Liverpool & Structural
biology unit, CIC bioGUNE, Parque Tecnoloico de Bizkaia , Derio,
ES, 2Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology,
Faculty of Health and life sciences, University of Liverpool,
Liverpool, UK, 3Structural Biology Unit, CIC bioGUNE, Parque
tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 4Metabolomics Unit, CIC
bioGUNE, Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 5Division of
Gastroenterology and Liver Diseases, USC Research center for Liver
Disease, USC-UCLA Research center for ALPD and Cirrhosis, Keck
Scool of medicine, Los Angeles, US
S-Adenosylmethionine (SAMe) is the principal methyl donor of the cell and
is synthesized via an ATP-driven process by methionine adenosyltransferase
(MAT) enzymes. It is tightly linked with cell proliferation in liver and
colon cancer. In humans, there are three genes, mat1A, mat2A and mat2B,
which encode MAT enzymes. mat2A and mat2B transcribe MATα2 and
MATβ enzyme subunits, respectively, with catalytic and regulatory roles.
The MATα2β complex is expressed in nearly all tissues and is thought to
be essential in providing the necessary SAMe flux for methylation of DNA
and various proteins including histones. In human hepatocellular carcinoma
mat2A and mat2B genes are upregulated, highlighting the importance of
the MATα2β complex in liver disease. The individual subunits have been
structurally characterized but the nature of the complex has remained elusive
despite its existence having been postulated for more than 20 years and the
observation that MATβ is often colocalized with MATα2. Though SAMe can
be produced by MAT(α2)4 alone, our work shows that the Vmax of the MATα2β
complex is three- to fourfold higher depending on the variants of MATβ that
participate in complex formation. Using X-ray crystallography and solution
X-ray scattering, the first structures are provided of this 258 kDa functional
complex both in crystals and solution with an unexpected stoichiometry of
4α2 and 2βV2 subunits. It is demonstrated that the N-terminal regulates the
activity of the complex and it is shown that complex formation takes place
surprisingly via the C-terminal of MATβV2 that buries itself in a tunnel
created at the interface of the MAT(α2)2. The structural data suggest a unique
mechanism of regulation and provide a gateway for structure-based drug
design in anticancer therapies.
P10-38
The misfolding behaviour of PSD95-PDZ3 is
modified by extra-domain structures and post-
translational modifications
Javier Murciano Calles1, Marta Marin-Argany2, Eva S. Cobos1,
Sandra Villegas2, Jose C. Martinez1
1
Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departament de Bioquimica
i Biologia Molecular, Facultat de Biociencies, Universitat Autonoma
de Barcelona, Barcelona, ES
Post-translational modifications located out from the binding pocket of the
third PDZ domain of PSD95 (PDZ3) regulate binding affinity and specificity
through an intra-domain electrostatic network. Such residues involve some
charged residues in the b2–b3 loop (were a succinimide modification occurs)
and the a3 helix (an extra-structural element that links the PDZ3 domain with
the following SH3 domain in PSD95, and contains the phosphorylation target
Tyr397). We have shown that these structural elements and their related post-
translational modifications also influence the folding/misfolding pathway of
PDZ3, by using site-directed mutagenesis combined with calorimetry and
spectroscopy. We have found that, although all the assayed mutations generate
proteins more prone to aggregation than the wild-type PDZ3, those directly
affecting the a3 helix increase the population of the DSC-detected intermediate
Pósters
state and the misfolding kinetics, by organizing the supramacromolecular
structures at the expense of the two b-sheets present in the PDZ3 fold.
However, those mutations affecting the b2–b3 loop, included into the prone-
to-aggregation region composed by a single b-sheet comprising b2 to b4
chains, stabilize the trimeric intermediate previously shown in the wild-type
PDZ3 and slow-down aggregation. These results strongly suggest that the a3
helix protects to some extent the PDZ3 domain core from misfolding. This
might well constitute the first example where an extra-element, intended to
link the PDZ3 domain to the following SH3 in PSD95 and in other members
of the MAGUK family, not only regulates the binding abilities of this domain
but it also protects PDZ3 from misfolding and aggregation.
P10-39
A functional amyloid assembly controls plasmid
DNA replication in bacteria
María Moreno del Álamo1, Fátima Gasset-Rosa1, Susana Moreno-
Díaz de la Espina1, Elena Fernández-Tresguerres1, Rudi Lurz2,
Rafael Giraldo1
1
Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES, 2Max Plant
Institute for Molecular Genetics, Berlin, DE
DNA replication is tightly regulated to constrain the genetic material within
strict spatiotemporal boundaries and copy numbers. In some plasmids
from Gram-negative bacteria, two circular DNA molecules associate
(‘handcuff’) their replication origins (ori) through a nucleoprotein assembly
with an oligomer of a plasmid-encoded replication protein (Rep) at its
core. Handcuffing thus hampers new replication rounds and determines
plasmid incompatibility [1]. The WH1 domain in the RepA protein of the
Pseudomonas pPS10 plasmid, besides its contributions to transcriptional
repression of repA gene and to plasmid DNA replication initiation by the
full length protein [2], assembles into amyloid fibers upon binding to DNA
in vitro [3] and causes an amyloid proteinopathy when overexpressed in
Escherichia coli [4,5]. We have developed a monoclonal antibody (B3h7)
specific for an amyloid oligomeric conformation of RepA-WH1 which has
revealed here that the handcuffed RepA assemblies are amyloid by nature.
RepA amyloids are found both in handcuffed complexes reconstructed
in vitro and inside the nucleoid of bacterial cells, where plasmids with
low copy numbers are known to cluster for partition and DNA-promoted
RepA-WH1 amyloidogenesis actually occurs. A stable amyloid core would
thus provide the basis for the previously reported requirement of molecular
chaperones in dismantling handcuffs to allow for further replication
rounds. RepA is a versatile DNA binding manifold, whose abilities, beyond
transcriptional auto-repression and plasmid replication initiation, now also
include the assembly of a replication inhibitory functional amyloid.
References
[1] Giraldo R and Fernández-Tresguerres ME (2004). Plasmid 52(2): 69-83.
[2] Gasset-Rosa F, et al. (2008). Mol Microbiol 68(3): 560-572.
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[4] Fernández-Tresguerres ME, et al. (2010). Mol Microbiol 77: 1456-69.
[5] Gasset-Rosa F, et al. (2014). Mol Microbiol 91(6):1070-1087
P10-40
Characterization of specific amino acid changes
in rhodopsin as putative positively selected sites
in visual pigment evolution
Miguel Antonio Fernández Sampedro, Sundaramoorthy Srinivasan,
Eva Ramon Portés, Pere Garriga Solé
Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de
Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya,
Terrassa (Barcelona), ES
Rhodopsin has highly conserved motifs throughout vertebrate species,
but there are differences at variable sites in residues shared among
97
Pósters
lower mammals (monotreme) and the therian mammals. The shared
residues among monotreme and, reptile and amphibian rhodopsins,
include amino acids at positions 7, 8, 13, 225, 346 and 348, which
are not shared with therian. Moreover, a Bayes empirical approach
predicts several positively selected sites in the therian branch: Phe37,
Gln225 and Ile290 at the transmembrane helices of the receptor; Phe-
13 at the N terminus; and Ser343, Ser344 and Ala346 at the C terminus
of the protein. Here, we have expressed, purified and functionally
characterized three of these rhodopsin changes: F13M, Q225R and
A346S. We find that Q225R and A346S mutants have a wild type-like
behaviour upon photobleaching/acidification and Western blot analysis
and metarhodopsin II decay rates but show different hydroxylamine
reactivity. Both Q225R and A346S mutants show increased reactivity
to hydroxylamine, reflecting lower conformational stability as observed
for echidna (most basal mammals) rhodopsins. We observe a lower Gt
activation rate for Q225R which can be explained because the mutation
is located close to the third intracellular loop important for Gt binding.
A346S shows increased Gt activation rate that could be related to the
evolutionary loss of an extra phosphorylation place at the C terminal
tail of rhodopsin. In contrast, the extracellular F13M mutant could not
bind retinal and showed a clearly different electrophoretic pattern. We
could restore chromophore binding, for F13M, by adding a cysteine
pair (N2C/D282C) that forms a stabilizing disulfide bond. This result
reveals the importance of the N-terminal domain of rhodopsin in visual
pigment evolution.
P10-41
Different retinal binding modes to visual
pigments suggest mechanism for Fine- Tuning
GPCR-ligand interactions
Sundaramoorthy Srinivasan, Miguel Fernandez, Eva Ramon, Pere
Garriga
Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de
Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya,
Terrassa, ES
Cone opsins are G-protein coupled receptors localized in cone
photoreceptor cells of the retina. These receptors are activated by light
and mediate the complex process of color vision. These visual pigments
are heptahelical transmembrane proteins, bound to a light sensitive
chromophore, 11 - cis -retinal (11CR) through a protonated Schiff
base (SB) linkage at K312. Red and green opsin pigments show 95%
sequence identity and they share a similarly biophysical and biochemical
properties, yet the possible structural differences between each other
are unclear. In order that to study human red and green cone pigments
were expressed in COS-1 cells, regenerated with 11CR and purified
using immunochromatography. Were analyzed the purified pigments
using UV-vis and fluorescence spectroscopies in the dark state and after
photoactivation. Ligand binding was measured by using the analog
9-cis-retinal (9CR) in addition to 11CR. The results of the regeneration
experiments with the photoactivated receptors show that green cone
opsin can not form a pigment in the visible region of the spectrum
when regenerated with 11CR but it can band with a visible form 9CR.
The acidification of the sample regenerated 11CR showed increased
absorption at 440nm suggesting the formation of unprotonated SB linkage
activated between 11CR and green opsin. In contrast, activated red cone
opsin exhibits the formation with protonated SB both retinals. These
that results suggest the difference in aminoacid sequence between green
and red opsins not only contributes to their spectral sensitivity but also
modulates ligand binding after photoactivation. Identified the molecular
interactions these details contributing differences in ligand binding can
be a model for fine-tuning of ligand- receptor of other members of the
GPCR superfamily.
98
XXXVII Congreso SEBBM
P10-42
Binding of activators to the kinase unit of AMPK:
theoretical study of the activation mechanism
Gleiciane Leal Moraes1, Carolina Estarellas1, Ana Castro2, Axel
Bidon-Chanal1, F. Javier Luque1
1
Departamento de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia,
Universidad de Barcelona, Santa Coloma de Gramanet, ES,
2
Instituto de Química Médica, CSIC, Madrid, ES
Mammalian AMP-activated protein kinase (AMPK) is a serine/threonine
protein kinase that acts as a key sensor of cellular energy status. Its primary
function it to “sense” changes in the intracellular level of ATP and to couple
the changes in ATP to phosphorylation of downstream substrates, leading
to an increase in the rate of pathways producing ATP and/or a decrease
in the rate of ATP-consuming processes. Its function in the homeostasis
of cellular energy confers AMPK a major role in numerous metabolic
disorders, such as type 2 diabetes, obesity and cancer. This explains the
progressive interest in AMPK as a therapeutic target.
AMPK is a heterotrimer composed of three different subunits: alpha, beta
and gamma. The alpha subunit carries the catalytic function and contains a
kinase domain at the N-terminus of the protein followed by an autoinhibitory
domain and a C-terminal domain required for interaction with the beta
subunit. The AMPK activity is regulated by several mechanisms, including
a number of indirect activators of AMPK (such as metformin, rosiglitazone
and resveratrol), an direct activators, such as compound A-769662 . Some
of these activators show a clear specificity for a particular AMPK subunit,
which opens they way to design and discover new compounds that could
activate AMPK in some tissues but not in others, minimizing in this way the
putative negative effects of the activation of AMPK at whole body level.
Up to now, the mechanism exerted by direct activators remained unknown.
Very recently, two X-ray structures showing the binding of direct AMPK
activators have been reported. This study reports the results of molecular
dynamics simulates carried out to gain insight into the mechanism of
AMPK activation by A-769662.
P10r-43
Macromolecular crowding modulates the
interaction of DnaK with its functional partners
Garbiñe Celaya, Ianire Martin, Alejandra Aguado, Yovana Cabrera,
Fernando Moro, Arturo Muga
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco,
Leioa, ES
Hsp70 proteins are central components of the cellular network of
molecular chaperones and they assist a broad range of physiological
processes, such as folding and assembly of newly synthesized proteins or
refolding of misfolded and aggregated proteins. DnaK (Hsp70) of E. coli is
an allosteric chaperone that has a nucleotide binding domain (NBD), that
binds and hydrolyzes ATP, a substrate binding domain (SBD) and a linker
that connects both domains. DnaK, together with the cochaperone DnaJ
(Hsp40) and the nucleotide exchange factor GrpE, forms the chaperone
system that is able to avoid aggregation of partially unfolded protein
conformations and to remodel and reactivate some protein aggregates by
itself or cooperating with other chaperone systems, such as ClpB (Hsp100).
DnaJ and GrpE regulate the functional cycle of DnaK, which is based
on a complex allosterical interdomain communication that promotes
transition between two main DnaK conformations that differ in substrate
affinity; when DnaK binds ATP, the linker promotes the tethering of both
domains and it acquires an open conformation with lower affinity. Binding
of substrates and DnaJ induces ATP hydrolysis and DnaK acquires a
conformation recognizable by GrpE, where the two domains separate and
behave independently. In this ADP-bound state, the SBD adopts a closed
conformation that tightly binds substrates.
The sequential association reactions that occur during the functional cycle
of the chaperone system have been characterized under dilute experimental
Granada 2014
conditions, despite the fact that in the intracellular medium the equilibrium
and transition rates between different protein conformations are most likely
affected by volume exclusion arising from macromolecular crowding. We
have studied the effect of crowding on the conformational properties,
ATPase and chaperone activities of the DnaK system.
Our data show that crowding regulates in a temperature dependent manner
the affinity of DnaK for DnaJ, but not for GrpE. The most relevant DnaJ
domain regulating this interaction is the disordered G/F rich region that can
be recognized by DnaK as a pseudosubstrate at low temperatures. Excluded
volume conditions also allow ClpB to compete with GrpE for binding to
the same DnaK region. This competition directs DnaK to reactivate stable
protein aggregates, interacting with ClpB, or to remodel substrate proteins,
interacting with GrpE. Therefore, crowding modulates the interaction of
DnaK with specific protein partners.
P10-44
Aminooxi análogos de histidina: una
posible estrategia para modular la histidina
descarboxilasa humana
Francisca María Sánchez Jiménez1, Rosario Castro Oropeza1,
Almudena Pino Ángeles1, Maximilian A. Khomutov2, José Luis
Urdiales Ruiz1, Alexander Khomutov2
1
Dept. Biología Molecular y Bioquímica. Universidad de Málaga-
Unidad 741 CIBERER, Campus Andalucía Tech, Málaga, ES,
2
Instituto de Biología Molecular Engelhardt, Moscú, RU
La histamina (Hia) es una amina biógena implicada en procesos
fisiológicos esenciales (respuesta inmune, neurotransmisión, entre otros).
El desequilibrio de su metabolismo juega un destacado papel en muchas
patologías. El control de los efectos adversos de Hia se ejerce únicamente
modulando sus receptores (H1R-H4R). En células humanas, Hia se
sintetiza por descarboxilación de la L-His, en la reacción dependiente de
piridoxal 5-fosfato (PLP) que cataliza la histidina descarboxilasa (HDC,
EC 4.1.1.22). La baja tasa de expresión y la inestabilidad de HDC han
dificultado su caracterización estructural y funcional, y por tanto el
desarrollo de estrategias basadas en su inhibición. Nuestra experiencia
derivada de estudios in silico (modelado y dinámica molecular) y
experimentales con HDC, nos permitió abordar la búsqueda de nuevas
posibilidades. Mediante tecnología de “barrido virtual” dedujimos que
un inhibidor competitivo efectivo debería ser aquel capaz de enlazarse
eficientemente con el PLP formando una estructura similar al intermediario
PLP-substrato. Debería también conservar el grupo imidazol para reforzar
la afinidad por el sitio catalítico. Ambas características podían conseguirse
utilizando el compuesto 4(5)-aminooximetilimidazol (O-IMHA). Esta
hipótesis se ha contrastado experimentalmente sobre extractos de HDC
humana purificada. Hemos comprobado que O-IMHA es capaz de formar
una PLP-oxima en el centro catalítico de la enzima humana. Los resultados
indican que O-IMHA puede constituir una cabeza de síntesis prometedora
de inhibidores de HDC. Aprovechando el conocimiento actual sobre la
estructura de la enzima proponemos las configuraciones más probables del
aducto en el sitio catalítico y podremos desarrollar nuevos derivados con
potencial traslacional.
SAF2011-26518 y CVI-06585. CIBERER (ISCIII).
P10r-45
Golgi assembly depends on vesicle tethering
mediated by cooperation of ER cargo receptors
Javier Manzano-López, Ana María Pérez-Linero, Laura Ojeda-
Márquez, Marcos Cámara-Donoso, Manuel Muñiz
Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
Endoplasmic reticulum (ER) cargo receptors are major transmembrane
constituents of the early secretory pathway that continuously cycle between
Pósters
the ER and Golgi apparatus. They function individually to mediate selective
incorporation of specific cargo proteins into ER-derived vesicles by linking
the cargo with the COPII coat. Here, we show that cargo receptors also
interact with each other to form a High-Molecular-Weight complex at the
level of the ER exit sites. We also found that this complex is required for de
novo assembly of the cis-Golgi compartment by promoting COPII vesicle
tethering. Our results suggest that, in addition to their individual function
in selective ER export, cargo receptors cooperate to maintain the structural
and functional homeostasis of the early secretory pathway by forming a
multi-protein platform that stabilizes the COPII coat onto the vesicle
membrane and thereby ensures correct functioning of tethering factors.
P10-46
Unraveling GPCR-Zinc interactions and its role
in depression
Mercè Tena Campos, Xiaoyun Dong, Diana Rivera Rodríguez, Eva
Ramon Portes, Pere Garriga Solé
Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de
Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya,
Terrassa, ES
Zinc supplementation has been widely reported to improve treatment against
major depressive disorder. It is also well known that G-protein-coupled
receptor (GPCRs) are involved in this disorder, among these 5-HT1A, GalR1
and GPR39, all three potentially connected to zinc modulation. Our work
has been focused on the study and characterization of these receptors and
its relationships with zinc both in vitro and in cell culture. To this aim, we
have designed a strategy to purify the receptors in a conformationally active
state. We have used receptors tagged with the monoclonal 1D4 antibody
epitope, and employed ligand assisted purification. We have purified all
three receptors properly folded, active and in a monomeric state as shown
by native gel electrophoresis.
In the case of GPR39, it is still under debate whether zinc is the orthosteric
ligand or not, but it is clear that there is an interaction between the receptor
and the metal ion. According to our results, the receptor appears to be
purified bound to zinc, even when cell culture and purification media
are not supplemented with the cation, meaning that there is a specific
interaction between zinc and GPR39 under physiological conditions. This
interaction is confirmed by Trp fluorescence increase upon EDTA addition
to a GPR39 purified sample.
5-HT1A, GalR1 have been described to heterodimerize triggering a non-
physiological state that would underly depression. Using FRET we have
demonstrated that zinc is able to disrupt this interaction. Both purified
receptors are analyzed by surface plasmon resonance in order to determine
the kinetics of this interaction. Further investigations should be carried out
to fully uncover the relationships between these receptors, zinc and major
depressive disorder.
P10-47
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,
endonucleasa IV y uracil DNA glicosilasa forman
parte de un complejo proteico implicado en
mantener la integridad del genoma en E. coli
Maria Alexandra Cañas Pacheco, Laura Aguilera Gil, Elaine Ferreira
Melo, Carina S. Alvarez, Rosa Giménez Claudio, Josefa Badía
Palacin, Laura Baldomà Llavinés
Departamento de Bioquimica i Bilogia Molecular, Facultat de
Farmàcia, Universitat de Barcelona. Institut de Biomedicina de la
UB (IBUB), Barcelona, ES
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es una proteína
multifuncional. A parte de su función en la glicolisis presenta otras
actividades. Estudios previos realizados por nuestro grupo con mutantes
gapA y células silenciadas con RNA antisentido sugerían la implicación
99
Pósters
funcional de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli.
Las células deficientes en GAPDH presentan menor supervivencia que
las células control frente al tratamiento con agentes genotóxicos, así
como un mayor número de centros apurínicos/apirimidínicos (centros
AP) espontáneos en su genoma. En este estudio se han realizado ensayos
pull down seguidos de Western blot con varias proteínas de los sistemas
de reparación del DNA. Los resultados muestran interacción de GAPDH
con: (i) SSB (single strand DNA binding protein), proteína esencial en los
procesos de reparación por recombinación homóloga y respuesta SOS (ii)
endonucleasa Endo IV, implicada en la reparación de centros AP y (iii)
uracil DNA glicosilasa (UDG) que genera un centro AP al eliminar el
uracilo presente en el DNA. El estudio de estas interacciones en mutantes
deficientes en estas proteínas indica que GAPDH, EndoIV y UDG forman
parte de un complejo de reparación de DNA en E. coli. La morfología
filamentosa observada en cepas silenciadas o deficientes en GAPDH a las 3
horas de recuperación después de un tratamiento con bleomicina o agentes
alquilantes es compatible con la inhibición de la división celular por
acúmulo de lesiones no reparadas en el genoma y confirma la implicación
de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli.
P10-48
Docosahexaenoic acid effect on the conformational
stability of the rhodopsin mutants G90V and N55K
associated with retinitis pigmentosa
Xiaoyun Dong, Eva Ramon Portes, Pere Garriga Sole
Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de
Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya,
Terrassa, ES
Rhodopsin is a prototypical seven-transmembrane helix receptor belonging
to the G-protein coupled receptor (GPCR) superfamily. It functions as a
visual photoreceptor and serves as the photosensitive pigment for scotopic
vision under dim light conditions. As a GPCR, its structural and functional
features are modulated by lipids. Docosahexaenoic acid (DHA) provides a
physiologically relevant milieu for stabilizing rhodopsin but the Influence
of DHA on rhodopsin mutants conformational properties have not been
previously explored. We have studied the structural features of two
thermosensitive mutants, G90V and N55K, which are associated with the
retinal degenerative disease retinitis pigmentosa and show thermal unstability
when solubilized in the classical neutral detergent dodecyl maltoside (DM).
We have used 1,2-didocosa-hexaenoyl--sn-glycero-3-phosphocholine
(DDHA-PC) liposomes for reconstituting the purified rhodopsin mutants.
G90V mutant reconstituted in DDHA-PC liposomes showed a 4-fold thermal
stability increase than in DM. In turn, N55K mutant showed a slight increase
on its thermal stability under the same conditions. The active conformation
metarhodopsin II decayed faster, as measured by retinal release fluorescence
spectroscopic measurements, for both mutants in DDHA-PC liposomes
compared with DM. DDHA-PC liposomes also preserved G90V and N55K
opsin conformations allowing more efficient binding of exogenously added
11-cis-retinal ligand. DDHA-PC liposomes provide an environment can
preserve the conformation of the pathogenic mutations by providing higher
thermal stability when compared with the DM-purified receptors. These
effects highlight the potential stabilizing role of DHA on the structural
features of rhodopsin mutants associated with retinal disease.
P10-49
N-terminal acetylation of α-Synuclein decreaces
the population of partially folded oligomers and
reduces amyloid aggregation
David Ruzafa Ruiz1, Yuriko Hernández G.2, Giovanni Bisello2,
Bertrand Morel3, Francisco Conejero-Lara4
1
Universidad de Granada, Granada, ES, 2Dipartimento di Science
del Farmaco, Università degli Studi di Padova, Padova, IT,
100
XXXVII Congreso SEBBM
3
Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada,
ES, 4Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, Granada, ES
Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder with a high
impact in our society. This is one of several diseases related to the
oligomerization and aggregation of α-Synuclein (αSyn). The interaction
of αSyn with surfactants, lipids and membranes appears to play a key
role in its physiological function. The αSyn found in cells presents a post-
transcriptional modification consisting of the acetylation of its N-terminus,
which appears to affect its behavior and therefore also its function.
Sodium dodecyl sulfate (SDS) has been widely used as a simple model
for membrane environment and has been reported to accelerate amyloid
fibrillation of αSyn in vitro. In this study, we compared N-acetylated and
unacetylated αSyn in their mode of interaction with SDS and related their
different properties with their amyloidogenic propensity. We found that
in the presence of sub-CMC concentrations of SDS αSyn forms SDS-
associated partially folded oligomers. These oligomers appear to constitute
optimal species for spontaneous and efficient formation of amyloid nuclei,
which further drive rapid, lag-free amyloid fibrillation. N-acetylation
reduces the extent of αSyn oligomerization favoring its interaction with
micelles, thereby reducing the rate of formation of amyloid nuclei.
P10-51
El dominio β-hairpin, implicación en el proceso
señalizador de dUTPasas triméricas
Jorge Donderis Martínez1, Elisa Maiques1, Ilty Mehemedov1, María
Ángeles Tormo Más2, María García Caballer2, José Penadés3, Alberto
Marina1
1
Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC, Valencia, ES,
2
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, CITA-IVIA,
Segorbe, ES, 3Institute of Infection, Immunity, and Inflammation,
College of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of
Glasgow, Glasgow, UK
Las dUTPasas (DUT) son enzimas presentes en todos los organismos que
hidrolizan el dUTP a dUMP y pirofosfato inorgánico. Diversos trabajos
han descrito la actividad señalizadora de las DUT independientemente
de su actividad catalítica, como es el caso de la DUT monomérica del
Epstein-Barr virus, capaz de inducir la expresión de citoquinas pro-
inflamatorias, o la DUT trimérica de la rata que une a PPARα y regula la
expresión génica mediada por el complejo PPARα-RXR; o, recientemente
nuestro grupo demostró que en Staphylococcus aureus las DUT triméricas
de bacteriófagos podían inducir la transferencia horizontal de islas de
patogenicidad (SaPI) en estas bacterias [1,2].
La movilidad de las SaPI depende de la unión de la DUT a la proteína
Stl que reprime la isla. Dicha unión está vinculada a una conformación
catalíticamente activa de la DUT además de la presencia de un dominio
extra de entre 20-30 residuos muy variable en secuencia y longitud entre
las diferentes DUT fágicas.
Para comprender mejor la capacidad señalizadora de estas proteínas, en
este trabajo hemos resuelto la estructura tridimensional de 3 DUT con
capacidad inductora de las SaPI de diferentes fagos. Sorprendentemente,
comparando estas estructuras, junto con la DUT del fago 80α, previamente
resuelta por nuestro grupo, observamos que dentro de este dominio extra
no conservado a nivel de secuencia, existe una región central de 9 residuos
que ocupa una disposición espacial idéntica en todas ellas así como la
misma conformación, un β-hairpin, pese a la diversidad de la secuencia.
Nuestros estudios mutacionales muestran que este motivo estructural juega
un papel clave en el reconocimiento de la proteína Stl y por lo tanto en la
actividad señalizadora de estas DUT.
Bibliografía
[1] Penadés et al., 2013. dUTPases, the unexplored family of signalling
molecules. Curr. Opin. Microbiol. 16, 163–170.
[2] Tormo-Más et al., 2013. Phage dUTPases Control Transfer of Virulence
Genes by a Proto-Oncogenic G Protein-like Mechanism. Mol. Cell 49, 947-958.
Granada 2014
P10-52
Investigando la función de CutA en bacterias:
estudios estructurales y funcionales
Lorena Tremino-Agulló1, Javier Espinosa2, Carles Palanca1, Asunción
Contreras2, Vicente Rubio1
1
Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER-
ISCIII, Valencia, ES, 2División de Genética, Universidad de
Alicante, Alicante, ES
Nuestro laboratorio ha aclarado sobre base estructural la función de la
proteína PII, señalizador homotrimérico de 112 residuos, muy conservado
y ampliamente distribuido, que interacciona con enzimas, canales y
reguladores de expresión génica. Ahora intentamos lo mismo con la
proteína CutA, de secuencia aparentemente no homóloga a PII, también
homotrimérica, de 112 residuos, muy conservada y ampliamente distribuida.
Su nombre se debe a que su gen se identificó en una región de dos genes
de E.coli cuya deleción sensibilizaba a cobre, sin evidencia sólida de su
implicación en protección a metales. Suponiéndole una función señalizadora
análoga a la de PII, realizamos un estudio de doble híbrido en levadura con
una librería del genoma y de candidatos prometedores de la cianobacteria
Synechococcus elongatus, el mismo organismo y estrategia que llevaron a
identificar las dianas de PII. Los resultados con CutA, presentados aquí, han
sido poco informativos. También presentaremos la estructura cristalina de
CutA de S. elongatus a 2 Å de resolución, esencialmente idéntica a la de PII
excepto por faltar los largos lazos flexibles T, sin que hayamos tenido éxito
en generar estructura de complejos con metales de esta proteína. Finalmente,
presentaremos experimentos en que reconsideramos desde el inicio la
funcionalidad de CutA, utilizando un mutante nulo de E. coli, exclusivo de
CutA, en el que investigamos la sensibilidad a metales y otras características
fenotípicas. Confiamos en que estos experimentos proporcionen información
funcional sólida sobre el papel de CutA y sobre las razones de su amplia
distribución y alta conservación.
Financiado por ayudas Prometeo 2009/051 (Generalitat Valenciana) y
BFU2011-30407 (MINECO). L. Tremino becaria FPI del MINECO.
P10-53 (R10-4)
Crystal structures of human carbamoyl phosphate
synthetase 1 (CPS1) shed light on domains
functions, substrate tunnels and allosteric
activation, and allow rationalization of inborn
CPS1 deficiency
Sergio de Cima Martín1, Luis Mariano Polo1, Carmen Díez-
Fernandez1, Javier Cervera1, Ignacio Fita2, Vicente Rubio1
1
Instituto de Biomedicina de Valencia of the CSIC, and Group
739 of the Centro de Investigación Biomédica en Red sobre
Enfermedades Raras-CIBERER del Instituto de Salud Carlos III,
Valencia, ES, 2Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC),
Barcelona, ES
CPS1 is a large six-domain protein that constitutes the first step of the urea
cycle: the synthesis of carbamoyl phosphate from bicarbonate, ammonia
and two ATP molecules. A paramount feature of this enzyme is its absolute
requirement for N-acetyl-L-glutamate (NAG), an allosteric activator without
which it is inactive. The report of CPS1 regulation by lysine deacylation
by NAD-dependent sirtuin 5 connected the urea cycle with the age-control
machinery (Nakagawa et al. Cell 2009; 137:560). CPS1 deficiency (CPS1D)
is an inborn disorder that cause severe neonatal hyperammonemia leading
to mental retardation or even to death. More than 300 mutations have been
reported in CPS1D patients, of which the majority are missense mutations
showing little recurrence and having unproven disease-causing potential. The
structure of the E. coli homologous CPS has been known for >15 years, but
differences with CPS1 (40% identity; use of glutamine instead of ammonia;
insensitivity to NAG) rendered essential to obtain the structure of CPS1 for
proper understanding of its functioning, and for evaluating disease causation
Pósters
by CPS1D mutations. Using a baculovirus/insect cell system we have finally
succeeded in producing recombinant human CPS1 in large amount and pure
form, allowing us to experimentally examine the effects of reported mutations
and ascertain its disease-causing potential (Díez-Fernández et al. Human Mut
2013; 34:1149). In addition we have determined the structure of CPS1, in
both apo and ligand-bound (NAG and ADP/Pi) forms. The liganded structure
revealed how NAG binds in a pocket of the C-terminal domain and has
identified elements stabilized by ADP binding and conformational changes that
lead to define the carbamate tunnel, which in the apo form is heavily branched
and open to the environment. Our structures decipher the CPS1 inability to use
glutamine and reveal a potential channel for ammonia intake. Furthermore,
they help rationalize the disease-causing role of most clinical CPS1 mutations.
Supported by Fundación Alicia Koplowitz and Valencian (Prometeo
2009/051) and Spanish (BFU2011-30407; FPU to CD-F) governments.
P10-54
Unveiling the mechanism of transcriptional
auto-regulation of parD system
Srdja Drakulic, Ana María Hernández-Arriaga, Carlos Fernández-
Tornero, Ramón Díaz Orejas
Centro de Investigaciones Biológicas (CIB/CSIC), Madrid, ES
Survival of extrachromosomal genetic material in bacterial population
involves the activity of toxin-antitoxin systems (TA). In particular, the
maintenance of R1 plasmid requires the employment of three stability
systems: parA, parB and parD. The focus of our work is on the parD system,
a type II toxin-antitoxin system, consisting of stable protein toxin Kid, a
ribonuclease which activity leads to cell growth arrest, and of proteolyses
prone Kis antitoxin, which through protein-protein interactions abolishes
the toxic effect of Kid. Interestingly, parD operon exhibits a transcriptional
auto-regulation. Depending on their relative molar ratio and the presence
of promoter DNA, Kis and Kid form differentially sized complexes, with
variable capacity of parD operon transcriptional regulation.Our preliminary
results indicate that KisKid complexes coexist with RNAP at the promoter,
raising questions of how KisKid system and RNAP interact, and how
would this lead to parD operon´s transcription decrease. In order to provide
the answers to previously raised questions, we have combined structural,
in a first place negative-staining EM, with biochemical/functional analysis
of the RNAP core-enzyme (subunits composition: α, β, β´, γ, ω), RNAP
core in complex with the sigma70 factor (RNAP holoenzyme), KisKid
repressor with its promoter DNA (PO), and RNAP holoenzyme:KisKid:PO
complex. The 3DEM structure of the repressor-DNA complex indicates
that two KisKid-heterooctamers, bound respectively at the operator sites
I and II, establish protein-protein interactions to form a supercomplex in
which the RNAP binding site seems to be exposed through the extensive
DNA bending. Our current work is dedicated to the determination of the
structural and biochemical properties of the RNAP holoenzyme-KisKid-
DNA complex, with the goal of deciphering the transcriptional regulation
mechanism of the KisKid repressor complex on the parD system.
P10-55
The why of linkers in structural biology: the case
of Galectin-4
Mónica Álvarez Pérez1, Eliza Buzamet1, Rubén M. Buey2, Sabine
Vértesy3, J. Fernando Díaz2, Sabine André3, Hans-Joachim Gabius3,
Margarita Menéndez1, Dolores Solís1
1
Instituto de Química Física Rocasolano, CSIC and Centro de
Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias-
CIBERES, Madrid, ES, 2Centro de Investigaciones Biológicas,
CSIC, Madrid, ES, 3Institut für Physiologische Chemie,Tierärztliche
Fakultät, LMU München, Munich, DE
Cell surface glycans are versatile biochemical signals decoded and translated
into responses by endogenous lectins [1]. Among them, the members of the
101
Pósters
galectin family with ability to crosslink glycans of cellular glycoconjugates
fulfil special tasks, e.g. in growth control and glycoprotein routing as
galectin-4 (Gal-4) does [2, 3]. To address the issue on the functional
significance of the 42-amino-acid linker connecting the two lectin domains,
we engineered variants and performed structural analysis in solution.
Analytical ultracentrifugation and gel filtration revealed an impact of linker
truncation on quaternary structure, further studied by additional variants.
This type of structural analysis was flanked by precipitation analysis with a
pan-galectin counterreceptor, i.e. the glycoprotein asialofetuin. The obtained
results disclose new information on linker presence and encourage respective
analysis using this strategy on homodimeric Gal-1, engineered to have the
Gal-4 linker, and the chimera-type Gal-3.
References
[1] Gabius et al. (2011) From lectin structure to functional glycomics:
principles of the sugar code. TIBS 36, 298-316.
[2] Ledeen et al. (2012) Beyond glycoproteins as galectin counterreceptors:
tumor-effector T cell growth control via ganglioside GM1. Ann N Y Acad
Sci 1253, 206-221.
[3] Velasco et al. (2013) Neuronal galectin-4 is required for axon growth
and for the organization of axonal membrane L1 delivery and clustering. J
Neurochem 125, 49-62.
P10-56
Tubulin dimer dissociation by chaperones TBCE
and TBCB is a mechanically driven process
Gerardo Carranza1, Marina Serna2, Jaime Martín-Benito3, Jose María
Valpuesta3, Juan Carlos Zabala1
1
Universidad de Cantabria, Santander, ES, 2Imperial College,
London, UK, 3Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC),
Madrid, ES
A group of molecular chaperones termed tubulin cofactors (TBCs)
participate in tubulin proteostasis inside the cell playing an important role
in the spatial and temporal regulation of the microtubule cytoskeleton.
While tubulin heterodimer formation is well characterized, its dissociation
pathway is not well understood.
In the study reported here we showed the structural determination by electron
microscopy and image processing of the complex between human TBCE,
TBCB and α-tubulin (αEB), which is formed upon dissociation of the αβ-
tubulin heterodimer by both chaperones, as well as its interpretation through
the molecular fitting of the atomic structures of the protein domains.
Docking of the atomic structures of the different domains of the three
proteins, including the UBL domain of TBCE, solved in this study by X-ray
crystallography, has allowed us to construct an atomic model of the αEB
complex with important functional consequences regarding the molecular
mechanism of the tubulin dimer dissociation by both tubulin cofactors. This
process, which is not energy-dependent, takes place through the distortion of
the α/β-tubulin interface caused by a steric clash between the TBCE CAP-
Gly and LRR domains and β-tubulin. Finally, the protruding arrangement of
both UBL domains in the αEB complex suggests a direct interaction of this
complex with the proteasome, mediating α-tubulin degradation.
P10-57
Insights into the human carboxypeptidase D
structure deduced from single-particle electron
microscopy
Javier Garcia Pardo1, Sebastian Tanco1, Pablo Gallego1, Daniela
Lufrano2, David Reverter1, José L. Carrascosa3, Julia Lorenzo1,
Francesc X. Avilès1
1
Institut de Biotecnologia i Biomedicina and Departament de
Bioquimica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de
Barcelona, Bellaterra, ES, 2Laboratorio de Investigación de
Proteínas Vegetales, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad
102
XXXVII Congreso SEBBM
Nacional de La Plata, La Plata, AR, 3Department of Macromolecular
Structure, Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de
Investigaciones Cienfícas-CSIC, Madrid, ES
Carboxypeptidase D (CPD) is a 180 kDa membrane-bound
metallocarboxypeptidase that contains three carboxypeptidase (CP)
domains. The biological function of this enzyme is not well known
but it is thought to participate in the maturation of hormones and other
bioactive peptides in the trans-Golgi network and functions as a docking
receptor for duck hepatitis B virus. Only the first and second domains
have detectable carboxypeptidase activity whereas the third domain seems
to be implicated in the virus recognition. Previous reports described the
three-dimensional structures of the first and second CP domains solved
by X-ray crystallography. Nonetheless, nothing is known about the three
dimensional structure of the full-length enzyme and the implications for
its biological function.
To study the structure of full-length human CPD we cloned, recombinantly
expressed and purified a soluble form of this enzyme, lacking the
transmembrane domain. For this purpose we used a mammalian cell-based
expression system that allows us to purify milligrams of soluble and active
human CPD.
The oligomeric state of the enzyme was determined by molecular exclusion
chromatography and dynamic light scattering (DLS), showing that the
protein self-associates to a homotrimeric complex with a molecular weight
of approximately 450 kDa. The CPD trimeric complex was stable up to 1
M salt concentrations, suggesting that complex association is driven by
hydrophobic interactions.
By single particle EM reconstructions we confirmed the trimeric native
state of this soluble human CPD enzyme. In the trimer each CPD monomer
has almost triangular appearance with dimensions of approximately 80 x
80 Å. The oligomeric structure has a 3-fold rotational symmetry with a
high structural flexibility.
Finally, using the interactions observed in the tridimensional structure of
duck CPD dII previously solved, we propose a three-dimensional structure
model of human CPD to explain the obtained single particle EM 2D
reconstructions.
P10-58
La asociación de las GTPasas pequeñas RagA
y Rab3 al motor de dineína tiene lugar a través
de su unión a DYNLT
Javier Merino Gracia1, Ruth A. Valero2, Mª Flor García-Mayoral3,
Marta Bruix3, Ignacio Rodríguez-Crespo2
1
Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de
Madrid, Madrid, ES, 3Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC,
Madrid, ES
Las cadenas ligeras de dineína, DYNLT, DYNLL y DYNLRB, son pequeñas
proteínas diméricas que forman parte del motor de dineína, una estructura
macromolecular de ~1.2 MDa encargada del transporte retrógrado por
los microtúbulos. Estas tres cadenas se asocian al extremo N-terminal de
la cadena intermedia de dineína, DYNC1I. Aunque DYNLT y DYNLL no
son homólogas entre sí, adoptan un plegamiento casi idéntico, con láminas
beta antiparalelas como superficies de unión del dímero, flanqueada por dos
alfa hélices en cada monómero. Para DYNLL se ha descrito su asociación
a numerosas proteínas celulares y virales que poseen una de las dos
secuencias consenso de unión: KSTQT y –KDTGIQVDR, las cuales adoptan
una disposición de cadena beta que se inserta de forma antiparalela en el
homodímero previamente formado. Sin embargo, DYNLL posee un único
sitio de unión para polipéptidos, implicando que si se asocia a la cadena
intermedia de dineína no puede unirse simultáneamente a una proteína diana.
Nuestro trabajo muestra que DYNLT, al contrario que DYNLL, funciona
como una proteína de acoplamiento de proteínas diana al motor de dineína,
presentando dos sitios de unión. RagA y Rab3D son dos pequeñas GTPasas
que se asocian con DYNLT. Por medio de dobles híbridos de levaduras y
Granada 2014
mutagénesis dirigida de las GTPasas, hemos identificado el sitio de unión
de DYNLT, y los requerimientos de la secuencia para la interacción. Con
técnicas de NMR hemos localizado los aminoácidos de DYNLT implicados
en la unión a la cadena intermedia de dineína y los implicados en su unión
a las GTPasas pequeñas. En experimentos de inmunoprecipitación hemos
confirmado que DYNLT funciona como proteína puente capaz de asociar
RagA y Rab3D a microtúbulos. Así, establecemos un modelo que describe
un nuevo mecanismo de asociación de proteínas al motor de dineína, para su
transporte por los microtúbulos.
P10-59
La pérdida funcional de VAMP2 en células
plasmáticas humanas provoca una disminución
de la secreción de inmunoglobulinas
Laura Gómez Jaramillo, Raquel Romero García, Ana B. Ramos
Amaya, Gema Jiménez Gómez, José A. Brieva, Antonio Campos Caro
Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES
Objetivo: Las células plasmáticas (CP) son células secretoras por
excelencia que presentan una maquinaria exocítica muy desarrollada,
donde se engloban las proteínas SNARE. Estas participan en todo proceso
de fusión de membrana que tenga lugar en la célula, gracias a la formación
de un complejo constituido por tres miembros, uno de cada una de las
tres familias descritas de estas proteínas; SNAP25, Syntaxinas y VAMP.
Resultados previos implican a SNAP-23 y STX4 en la secreción de Igs. El
objeto de este estudio es definir qué miembro de la familia VAMP completa
el complejo que lleva a cabo la secreción de Ig en CPs humanas.
Metodología: Usamos la línea celular U266. Caracterizamos la
expresión y distribución de VAMP2 mediante ensayos de western blot
e inmunofluorescencia, respectivamente. Como estudios de pérdida de
función realizamos tres estrategias; 1) Silenciamos su expresión con ARNi,
2) Sobreexpresamos la cadena ligera de la toxina tetánica, neurotoxina
que degrada VAMP2 y VAMP3 pero no afecta a la integridad de los
demás miembros de la familia y 3) Expresamos varias construcciones
de VAMP2 que consisten en distintas deleciones del fragmento
transmembrana de la proteína con el fin de que compitan con la forma
normal endógena provocando la formación de complejos no funcionales.
En los sobrenadantes resultantes de todos estos ensayos hemos medido la
secreción de IgE mediante ELISA.
Resultados: La disminución de los niveles de VAMP2 o su pérdida de
función en las células provoca una disminución en la secreción de Igs. El
mismo efecto observamos cuando introducimos en la célula la proteína
VAMP2 delecionada en el fragmento trasmembrana que se distribuye
deslocalizada por todo el citoplasma. Además observamos que las vesículas
que transportan la IgE en células U266 colocalizan parcialmente con VAMP2.
Conclusión: VAMP2 es un claro candidato a ser el tercer SNARE que,
junto con SNAP23 y STX4, forman el complejo que lleva a cabo la
secreción de Igs en CP. Si bien, la disminución es parcial, indicando que
existen otras proteínas SNARE o reguladoras implicadas en dicho proceso.
P10-60
Synthesis of polymeric dyes through oxidative
cross-coupling by directed laccase evolution
Ana Isabel Vicente Martín1, Susana Camarero Fernández2, Miguel
Alcalde Galeote1
1
Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2Centro
de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES
Fungal laccases (EC1.10.3.2) are blue-multicopper containing enzymes
capable of oxidizing phenols, polyphenols, aromatic amines and many
other compounds with the concomitant reduction of molecular oxygen
to water. The versatility of these enzymes can be expanded by the use of
redox mediators (from natural or synthetic origin) thereby finding plenty of
applications ranging from bioremediation to novel green processes. Besides,
Pósters
fungal laccases are capable to promote complex hetero-polymerizations of
great significance for the synthesis of dyes [1].
The present work describes a laboratory evolution protocol to engineer
efficient fungal laccases for the synthesis of polymeric dyes. The departure
point for this study was the laccase IG-88 mutant from of Myceliophthora
thermophila, which was previously evolved through 21 rounds of
directed evolution for secretion in yeast, organic co-solvent tolerance and
alkalophilicity [2-4]. With the help of a HTS-assay based on the oxidative
cross-coupling (heterocoupling N-C) of 2,5-diaminobenzenesulfonic acid
(2,5-DABSA) and policatechol, laccase mutant libraries were screened and
new variants with improved turnover rates under operational conditions
(alkaline pH, high temperature) were identified.
P11. Genómica y proteómica
P11-1 (R11-1)
Where proteomics is the approach in basic and
translational plant research, but how?
Jesus V. Jorrin Novo
Agroforestry and Plant Biochemistry and Proteomics; Dpt. of
Biochemistry and Molecular Biology, Córdoba, ES
Biological investigation and knowledge at the molecular level, whether
the experimental systems are plants or other living organisms, models or
orphans, is based and the result of data generated by the use of different and
complementary methodological approaches. Historically we moved from the
classical and in vitrotechniques (e.g. protein chemistry/biochemistry) to the
in vivo and the most recent holistic, –omics, ones (e.g. proteomics), that with
mathematical and bioinformatics tools build the so-called Systems biology.
Nowadays, biological research should not be just the result of data
accumulation and blind acceptance of the huge amount of data generated
by the potent –omics equipment’s and algorithms, as the result of that could
be, in the best of the cases, merely descriptive and speculative.
As indicated in the title of this presentation, and based on my own research
experience and the current literature, it is pretended to discuss how is or
could be the contribution of proteomics to the knowledge in these living
organisms. Why, when, and how to use proteomics should be the questions
to be answered. Finally, the challenges, power and limitations of the
approach will be evaluated.
P11-2 (R11-2)
La proteína quinasa DYRK1A regula transcripción
vía su reclutamiento a promotores
Susana de la Luna
ICREA y Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES
DYRK1A es una proteína quinasa que participa en procesos celulares
relacionados con proliferación, diferenciación y supervivencia. La actividad
biológica de esta quinasa es extremadamente dependiente de la dosis génica
ya que su sobreexpresión se ha asociado a alteraciones del neurodesarrollo
asociadas al síndrome de Down, mientras que mutaciones en uno de los
alelos del gen codificante son responsables de un nuevo síndrome asociado
al locus MRD7 (Mental Retardation Autosomal Dominant 7).
DYRK1A está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de células de
mamífero, si bien la mayoría de sus actividades nucleares pueden ser explicadas
por fosforilaciones que ocurren en el citosol. Estas observaciones han planteado
dudas sobre si esta quinasa posee funciones específicamente nucleares.
Mediante una aproximación proteómica no sesgada, hemos identificado
que la fracción nuclear de DYRK1A interacciona con componentes de la
maquinaria basal de transcripción. El análisis a nivel genómico de la presencia
de DYRK1A en cromatina, mediante experimentos de ChIP-Seq, ha revelado
que la quinasa es reclutada a regiones proximales de promotores dependientes
103
Pósters
de la RNA polimerasa II caracterizados por la presencia de una secuencia
palindrómica muy conservada, y enriquecidos en categorías funcionales
relacionadas con traducción y procesamiento de RNA. La presencia de
DYRK1A en genes dependientes de la RNA polimerasa III también ha sido
detectada. Nuestros datos indican que la expresión de un grupo de genes diana,
dentro de estas categorías, depende de la actividad quinasa de DYRK1A.
Además, la reducción en los niveles de DYRK1A provoca una reducción en el
tamaño de las células. Los resultados permiten proponer un modelo por el que
DYRK1A podría regular directamente la expresión de genes diana mediante la
fosforilación, en regiones reguladoras promotoras, de diferentes componentes
de la maquinaria basal de la transcripción, contribuyendo a la coregulación de
programas de expresión implicados en la homeostasis celular.
P11-3
Caracterización de la expresión de haptoglobina
en cáncer colorrectal
Óscar Mariño Crespo1, Elisa Cuevas Álvarez2, Emilio Gil Martín1,
Almudena Fernández Briera1
1
Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad
de Vigo, Vigo, ES, 2Servicio de Anatomía Patológica, Complejo
Hospitalario Universitario de Ourense, Ourense, ES
La haptoglobina (Hp) es una proteína de fase aguda conocida por unir
hemoglobina durante la hemólisis, evitando así la pérdida de hierro y el daño
renal. En un estudio reciente detectamos esta proteína en especímenes de
pacientes con cáncer colorrectal (CCR) como potencial portadora de CDw75,
un epitopo glucídico relacionado con la progresión de esta neoplasia.
Para proseguir con este trabajo nos hemos propuesto certificar la expresión
de la Hp en CCR mediante un estudio inmunohistoquímico utilizando
especímenes de tejido sano y tumoral (12 y 55, respectivamente). Además,
hemos pretendido caracterizar su expresión y relación con el CDw75
mediante western blot de fracciones enriquecidas en proteínas citosólicas
o de membrana procedentes de especímenes de tejido sano y tumoral de
algunos de los pacientes empleados en el estudio histológico.
Ninguno de los especímenes de tejido sano analizados por inmunohistoquímica
presentó expresión de Hp, mientras que en el tejido tumoral únicamente
se detectó en 9 de los 55 ensayados (16 %). Cuando estaba presente, la
Hp apareció de forma tenue, focal y restringida a las células del epitelio
glandular. Además, hemos comprobado que la expresión de esta proteína se
asocia significativamente con la edad del paciente, el estadio de Dukes y la
presencia de metástasis.
Mediante western blot hemos acreditado la presencia preferencial de la Hp
en la fracción citosólica y comprobado que su patrón de bandas coincide en
masa con el del epitopo CDw75. Por otro lado, no parece haber diferencias
de expresión de la Hp entre el tejido sano y el tumoral.
Estudio financiado mediante el Contrato-Programa CN 2011/024, Xunta
de Galicia.
P11-4
Nueva función del GEF C3G como regulador
del secretoma plaquetario: implicación en la
patología trombótica
Víctor Martín Granado1, Sara Gutiérrez Herrero1, Sara Alonso
Alvarez2, Sara Ortiz Rivero1, José Ramón González Porras2, Neibla
Priego Bendeck3, Almudena Porras Gallo3, Carmen Guerrero Arroyo1
1
Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL,
Salamanca, ES, 2Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL,
Salamanca, ES, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES
C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap1,
una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Específicamente,
la isoforma Rap1b participa en aspecto críticos de la función plaquetaria a
104
XXXVII Congreso SEBBM
través de la activación de la integrina αIIbβ3. Además, se sabe que C3G
juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como
in vivo, a través de la activación de Rap1b. En base a todo esto, nuestra
hipótesis es que C3G puede influir en la secreción durante la activación
plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones
transgénicos para C3G (tgC3G) y C3GΔCat (un mutante con deleción del
dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor
del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la
cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que
las plaquetas tgC3G secretaron mayor cantidad que los controles, mientras
que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad.
El perfil de secreción proteica de las plaquetas tgC3G también fue diferente
al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de
proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas
diferencialmente secretadas por las plaquetas tgC3G se encontraban
apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fibrinógeno, αhemoglobina y
trombospondina-1, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el
desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán
profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria
y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fisio-patológicos,
especialmente en el contexto de patologías trombóticas.
P11-5
Efecto del clima en las comunidades bacterianas
asociadas al suelo rizosférico en el Parque
Nacional de Sierra Nevada
Javier Pascual1, Silvia Blanco1, Juan Luis Ramos2, Pieter van
Dillewijn1
1
Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES
Teniendo en cuenta que los microorganismos presentes en el suelo, y
especialmente en el suelo asociado a las raíces de las plantas, la rizosfera,
ejercen un papel clave en la dinámica y el funcionamiento de los
ecosistemas, es necesario conocer cómo las comunidades bacterianas se
ven influenciadas por los cambios climáticos que se producen en el medio
ambiente. Uno de los lugares que puede ser utilizado como modelo para
evaluar el efecto del clima es el Parque Nacional de Sierra Nevada, debido
a la clara estratificación termoclimática que existe en el macizo montañoso.
El objetivo del presente trabajo ha consistido en el análisis de la diversidad
taxonómica y funcional de las comunidades bacterianas asociadas a la
rizosfera del tomillo salsero (Thymus zygis L.) y al suelo suelto, presente
en diferentes pisos termoclimáticos de dos regiones de Sierra Nevada,
Capileira y Puerto de la Ragua.
Para llevar a cabo el estudio se ha analizado el ADN metagenómico de las
comunidades bacterianas presentes en las diferentes muestras de suelo: (i)
la diversidad taxonómica se ha analizado mediante pirosecuenciación de
amplicones del gen ARNr 16S, mientras que (ii) la diversidad funcional se
ha estudiado utilizando GeoChips.
Los resultados obtenidos hasta la fecha muestran que el clima ejerce un papel
clave en la estructura y funcionalidad de las comunidades bacterianas del
suelo. Este trabajo forma parte de un estudio más amplio donde se analizará
a su vez la dinámica de las comunidades bacterianas a escala temporal.
P11r-6
Análisis transcriptómico mediante RNA-seq de
genes de respuesta a ácido linolénico implicados
en situaciones de estrés abiótico en Arabidopsis
Capilla Mata Pérez1, Beatriz Sánchez-Calvo1, Juan Carlos Begara-
Morales1, María N Padilla-Serrano1, Raquel Valderrama1, Francisco
Luque2, Ana Fernández-Ocaña1, Francisco J Corpas3, Juan B Barroso1
1
Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico,
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad
Granada 2014
de Jaén, Jaén, ES, 2Departamento de Biología Experimental,
Universidad de Jaén, Jaén, ES, 3Grupo de Antioxidantes, Radicales
Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología y Agroalimentación,
Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de
Plantas, Estación Esperimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES
El ácido linolénico (LnA) es un ácido graso poliinsaturado esencial de
la serie omega-3, precursor de la fitohormona Ácido Jasmónico (JA),
implicada en diversas situaciones de estrés abiótico que cursan con
la sobreproducción de especies de oxígeno reactivo (ROS) [1,2]. Con
el objetivo de tener un conocimiento más amplio acerca de los genes
implicados en la respuesta a LnA, se realizó un análisis transcriptómico en
cultivos celulares de A. thaliana, mediante la tecnología de secuenciación
a gran escala Illumina-mRNA-Seq. Se analizó el comportamiento
de genes que responden a la señalización por LnA implicados en la
generación de un fenómeno de estrés oxidativo durante situaciones de
estrés abiótico, identificándose un total de 3275 genes que respondían
a LnA. La mayoría estaban relacionados con la ruta biosintética del
JA, como la Lipoxigenasa (LOX) o Aleno Óxido Ciclasa (AOC) [3].
Sin embargo, una parte importante de ellos estaba relacionada con el
mecanismo de respuesta frente a diversas situaciones de estrés abiótico,
como la galactinol sintasa 1 (GOLS1), diferentes enzimas detoxificadoras
de grupos carbonilo y diferentes deshidrogenasas. En definitiva, el
análisis funcional mediante tecnología RNA-seq permite ampliar nuestro
conocimiento sobre la conexión de ROS y la ruta de señalización del JA,
evidenciando que una parte significativa de estos genes codifica proteínas
relacionadas con la respuesta de la planta a diferentes situaciones de
estrés y estímulos abióticos.
Bibliografía
[1] Suza WP et al. (2010) Plant Physiol Biochem 48:337-50.
[2] Hu X et al. (2009) Plant Signal Behav 4:696-7.
[3] Wasternack C, Hause B (2013) Ann Bot.
Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos
BIO2012-33904, AGR-6374, AGR-6038, 20134R0569) y Junta de
Andalucía (grupos BIO286 y BIO192).
P11-7 (R11-4)
MicroRNAs in tumor development
Pedro Medina Vico
Universidad de Granada, Granada, ES
MiRNAs are a class of small RNA molecules that regulate gene expression
at the posttranscriptional level. Initially discovered in Caenorhabditis
elegans, they were considered an oddity of nematodes until it was
realized that some of them were phylogenetically conserved in a wide
variety of animals including humans. Today, miRNAs are increasingly
seen as important regulators of gene expression, ushering in a renewed
appreciation of the regulative capabilities of ncRNA. At the cellular level,
miRNAs are significant in the establishment and maintenance of cell
identity. Aberrant levels of miRNAs often result in loss of differentiation,
a hallmark of cancer. Not surprisingly, therefore, dysfunctions of the
miRNA pathway affect many cellular processes that are routinely altered
in cancer, such as differentiation, proliferation, apoptosis, metastasis, and
senescence.
Although the miRNA era started only a few years ago, it has brought
great promise for diagnosis, prognosis, and therapy of cancer. The quick
development of powerful techniques such as miRNA microarrays, short-
RNA deep sequencing, specific quantitative polymerase chain reaction
(PCR) of miRNAs, and antisense technologies is expected to have a
significant impact on clinical oncology in the next decade.
Pósters
P11-8
Búsqueda de termoenzimas hidrolíticas en una
metagenoteca de aguas termales
Juan José Escuder Rodríguez, Kamila Knapik, María Isabel
González Siso, Manuel Becerra Fernández
Universidad de A Coruña, A Coruña, ES
La metagenómica funcional, es decir, el estudio del genoma colectivo de una
comunidad microbiana presente en una muestra ambiental, es una poderosa
herramienta para explotar la gran diversidad de microorganismos no
cultivables en la búsqueda de nuevas enzimas con aplicación industrial. La
técnica se basa en la extracción del material genético presente en la muestra
ambiental y su clonación en un hospedador heterólogo para la obtención
de una biblioteca metagenómica (metagenoteca) en la que identificar
actividades enzimáticas de interés añadiendo los sustratos adecuados al
medio de cultivo. Esta metodología, en comparación con la metagenómica
basada en secuencia, permite encontrar nuevos productos génicos que
no presentan homología significativa con las secuencias conocidas y
depositadas en las bases de datos. Determinados procesos industriales se
llevan a cabo en condiciones adversas para la mayoría de microorganismos,
tales como elevadas temperaturas, pH extremo, alta salinidad o alta
concentración de solventes. En este sentido, es común la búsqueda de
enzimas procedentes de comunidades microbianas de ambientes extremos,
en los que se dan condiciones similares. En este trabajo se ha construido
una metagenoteca a partir de una muestra de aguas termales para la
búsqueda de enzimas hidrolíticas estables a elevadas temperaturas. Debido
a que los fenómenos de transcripción, traducción, plegamiento y secreción
del producto génico pueden ser incorrectos al emplear como hospedador la
bacteria mesófila Escherichia coli, se ha empleado un vector lanzadera que
permite la transferencia de la metagenoteca a la bacteria termófila Thermus
thermophilus para incrementar los productos génicos detectables.
P11m-9
Identificación de biomarcadores y nuevas
proteínas relacionadas con la enfermedad
aterosclerótica en pacientes con diabetes
mellitus tipo 2
Beatriz García-Fontana1, Sonia Morales-Santana2, Victoria
Longobardo3, Antonia García-Martín1, Rebeca Reyes-García1, Pedro
Rozas-Moreno4, José Antonio García-Salcedo5, Manuel Muñoz-
Torres1
1
Unidad de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de
Endocrinología, Instituto de Investigaciones Biomédicas de
Granada, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2Unidad
de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de Endocrinología,
Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital
Universitario San Cecilio - Servicio de Proteómica, Fundación
para la Investigación Biosanitaria de Andalucía Oriental -Alejandro
Otero- (FIBAO) , Granada, ES, 3Servicio de Proteómica, Instituto
de Parasitología y Biomedicina “López Neyra” (CSIC), Granada,
ES, 4Servicio de Endocrinología, Hospital General de Ciudad Real,
Ciudad Real, ES, 5Unidad de Enfermedades Infecciosas, Instituto
de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario
San Cecilio, Granada, ES
La prevalencia de diabetes mellitus está aumentando rápidamente
alcanzando proporciones epidémicas. Esta enfermedad se asocia a
numerosas complicaciones, siendo la enfermedad aterosclerótica (EA) una
de las más relevantes debido a su morbimortalidad. Por ello, la identificación
precoz de pacientes diabéticos con alto riesgo de padecer EA es relevante
para reducir el impacto de esta enfermedad y sus complicaciones. El
objetivo de este estudio fue comparar el proteoma sérico de pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 (DM2) con o sin EA con el de sujetos sanos para
identificar biomarcadores o proteínas esenciales que intervengan en la
patogénesis de la DM2 y la EA.
105
Pósters
Se realizó un estudio proteómico incluyendo 18 hombres divididos en tres
grupos: i) 6 pacientes con DM2 y EA, ii) 6 pacientes con DM2 sin EA; iii)
6 controles sanos. Se realizó una depleción proteica de las 14 proteínas
mayoritarias para mejorar la sensibilidad de detección en suero. Los perfiles
proteicos fueron separados mediante 2D-DIGE y las imágenes obtenidas
fueron analizadas mediante el software específico DeCyder 7.0. Las
proteínas expresadas diferencialmente se identificaron por espectrometría
de masas-masas (MALDI TOF-TOF) o cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Nuestros resultados muestran una sobreexpresión de la proteína de unión
a retinol plasmático (RBP) y de la glutation peroxidasa 3 (GPx -3) y una
disminución de los niveles séricos de Transtirretina (TTR) en pacientes con
DM2 y EA en comparación con pacientes diabéticos sin EA y controles
sanos.
El análisis proteómico revela cambios en proteínas relacionadas con
procesos inflamatorios en pacientes con DM2 y EA sugiriendo que el
proceso inflamatorio juega un papel muy importante en el desarrollo de
complicaciones vasculares en la DM2. Estas proteínas podrían actuar como
biomarcadores o dianas terapéuticas de la enfermedad aterosclerótica en
pacientes con DM2 mejorando la supervivencia de estos pacientes.
P11r-10 (R11-5)
Fucosylation increase in α-1 acid glycoprotein
(AGP) in pancreatic cancer
Meritxell Balmaña1, Estela Giménez2, Ángel Puerta3, Esther Llop1,
Carme de Bolós4, Sílvia Barrabés1, Mercedes de Frutos3, Rosa
Peracaula1
1
Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology,
University of Girona, Girona, ES, 2Department of Analytical
Chemistry, University of Barcelona, Barcelona, ES, 3Institute of
Organic Chemistry (CSIC), Madrid, ES, 4Institute Hospital del Mar
of Medical Investigations (IMIM), Barcelona, ES
Pancreatic cancer (PDAC) is the fourth leading cause of cancer death
[1]. Its low survival rate (around 5% in 5 years) is due to the intrinsic
aggressiveness of this tumour and also to a late diagnosis. The only
biomarker available for PDAC is CA19-9, but it is currently only used to
monitor the pathology because of its false positive results.
Previously, our group performed N-glycan analysis of major serum acute
phase proteins, including α-1 acid glycoprotein (AGP), in pancreatic
cancer, chronic pancreatitis and healthy control sera and concluded that
increase in core fucosylation in AGP could be cancer associated [2].
In this study, AGP from serum samples from a larger cohort (N=31) was
purified using an anti-AGP immunoaffinity column. Different ELISAs
using specific fucose recognizing lectins and antibodies against fucosylated
epitopes were performed to determine differences in AGP glycoepitopes
between the groups. In addition, relative quantitation of AGP glycosylation
variants by stable isotope labelling of AGP released N-glycans was
carried out using [12C]/[13C] aniline and ZIC-HILIC-ESI-TOF-MS [3].
Furthermore, AGP isoforms were analysed by capillary electrophoresis
(CE-UV) [4]. An increase in fucosylation levels using Aleuria aurantia
lectin was found in PDAC patients compared to chronic pancreatitis and
healthy controls and this increase was more marked in the advanced
PDACs. The sialofucosylated antigen (sialyl-Lewis x) also tended to be
increased in the AGP of the PDAC group. Complementarily, MS results
showed an increase in the levels of certain fucosylated glycan structures
between chronic pancreatitis and PDAC. Moreover, significantly different
profiles by CE-UV, which separates AGP isoforms, were obtained between
AGP from controls and PDACs. Altogether these results suggest that AGP
fucosylation levels could be useful as a PDAC marker.
References:
[1] Siegel R, et al. CA Cancer J Clin 2014.
[2] Sarrats A, et al. Proteomics Clin Appl 2010.
[3] Gimenez E, et al. Anal Bioanal Chem 2013.
[4] Puerta A, et al. Methods Mol Biol 2013.
106
XXXVII Congreso SEBBM
P11-11
Identificación de proteínas celulares de unión
al elemento CRE del genoma del virus de la
hepatitis C
Pablo Ríos Marco, Cristina Romero López, Alba Fernández Sanlés,
Alfredo Berzal-Herranz
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Armilla, ES
El genoma del virus de la hepatitis C (HCV) es un RNA monocatenario
de polaridad positiva con una longitud aproximada de 9,6 Kb. Existen
diversos dominios estructurales en su genoma que destacan por su
capacidad para regular procesos esenciales para el virus tales como su
traducción y replicación. Dos de estos dominios son el lugar de entrada
interna del ribosoma (IRES) o la región 3´X-tail, situados en las regiones
no traducibles 5´UTR y 3´UTR respectivamente. Otro dominio de gran
interés en el genoma del virus es el denominado cis-replicating element
(CRE), presente en el extremo 3´ de la región codificante del virus. CRE
tiene capacidad de interactuar con IRES o 3´X-tail y así regular cambios
necesarios entre las etapas de traducción y replicación del ciclo infectivo del
virus. En este trabajo hemos tratado de identificar proteínas celulares que
muestren asociación con el elemento CRE y puedan afectar a su interacción
con otros dominios del genoma viral. Así, experimentos de incubación del
fragmento CRE con lisados celulares en condiciones de competición con
IRES, con el propio CRE o con un RNA no relacionado, fueron utilizados
para demostrar la especificidad de unión de CRE a proteínas celulares. Las
proteínas obtenidas tras los ensayos de pull-down se analizaron mediante
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) 1D y cromatografía líquida
acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Estas técnicas nos han
permitido identificar un conjunto de proteínas que interactúan con la región
CRE del HCV entre las que destacan miembros de la familia hnRNP,
tubulinas, helicasas y factores relacionados con la traducción. Asimismo,
ensayos de unión de CRE a subunidades ribosomales demuestran que CRE
se une específicamente a la subunidad 40S. Todos estos resultados son de
gran importancia para investigar la relación de CRE con diferentes factores
celulares y otros dominios del virus y así poder comprender cómo dichas
interacciones afectan a procesos biológicos del virus.
P11-12
Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens
Pdp11 en el proteoma hepático del lenguado
senegalés (Solea senegalensis) cultivado a
diferentes densidades de biomasa
Juan Jurado1, Tránsito García-García1, Miguel Ángel Moríñigo2,
María José Prieto-Álamo1
1
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba,
Córdoba, ES, 2Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES
La introducción de nuevas especies es uno de los desafíos pendientes para
desarrollar una acuicultura productiva, viable y sostenible. En este sentido,
el lenguado senegalés (Solea senegalensis) es una especie con alto potencial
en la acuicultura marina española. Sin embargo, la escasez de herramientas
veterinarias constituye una seria limitación para la implantación del cultivo
intensivo del lenguado, muy susceptible a patologías infecciosas por
Photobacterium, Vibrio y Tenacibaculum, sobre todo cuando se cultiva a
densidades elevadas de biomasa. Los probióticos (PB) constituyen una opción
interesante ya que en los peces aumentan tanto la eficiencia de la alimentación
como la resistencia a las enfermedades y a otras situaciones de estrés.
Con el objeto de investigar las bases moleculares de este efecto beneficioso
a nivel de expresión de proteínas, en este trabajo hemos estudiado el
efecto del PB Shewanella putrefaciens Pdp11 en el proteoma hepático
del lenguado senegalés cultivado a dos densidades diferentes: (i)
densidad normal (DN: 7 Kg/m2), y (ii) densidad alta (DA: 30 Kg/m2).
Este estudio se llevó a cabo mediante la separación de proteínas por
electroforesis bidimensional en geles desnaturalizantes de poliacrilamida
Granada 2014
(2-DE) utilizando tiras de amplio rango de pH (3-11NL). Las proteínas
diferencialmente expresadas se identificaron mediante el uso combinado
de huella peptídica y espectrometría de masas en tandem (PMF + MS/MS).
El tratamiento de los peces con el PB provocó cambios en la expresión de
6 proteínas a DN y de 2 a DA de cultivo. Por otra parte, el estrés generado
por el cultivo de los peces a DA en ausencia de PB, afectó a la expresión de
11 proteínas, produciendo mayoritariamente incrementos de expresión. Por el
contrario, en presencia de PB, la DA provocó principalmente disminuciones
de expresión. Entre las proteínas afectadas, hay proteínas implicadas en el
metabolismo de glúcidos (PGAM1, GAPDH y F16P1), en el metabolismo de
aminoácidos y proteínas (LAP, PHGDH, FAAA, y SPYA), en la detoxificación
de xenobióticos (GSTR y GSTT) o en el transporte de hierro (TF).
Financiación: AGL2011-30381-CO3-03.
P11-13
Nueva función del GEF C3G como regulador
del secretoma plaquetario: implicación en la
patología trombótica
Victor Martin Granado1, Sara Gutiérrez Herrero1, Sara Alonso
Alvarez2, Sara Ortiz Rivero1, José Ramón González Porras2, Neibla
Priego Bendeck3, Almudena Porras Gallo3, Carmen Guerrero Arroyo1
1
Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL,
Salamanca, ES, 2Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL,
Salamanca, ES, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES
C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap1,
una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Específicamente,
la isoforma Rap1b participa en aspectos críticos de la función plaquetaria
a través de la activación de la integrina αIIbβ3. Además, se sabe que C3G
juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como
in vivo, a través de la activación de Rap1b. En base a todo esto, nuestra
hipótesis es que C3G puede influir en la secreción durante la activación
plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones
transgénicos para C3G (tgC3G) y C3GΔCat (un mutante con deleción del
dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor
del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la
cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que
las plaquetas tgC3G secretaron mayor cantidad que los controles, mientras
que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad.
El perfil de secreción proteica de las plaquetas tgC3G también fue diferente
al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de
proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas
diferencialmente secretadas por las plaquetas tgC3G se encontraban
apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fibrinógeno, αhemoglobina y
trombospondina-1, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el
desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán
profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria
y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fisio-patológicos,
especialmente en el contexto de patologías trombóticas.
P11-14
Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens
Pdp11 sobre la expresión transcripcional del
lenguado senegalés (Solea senegalensis) en
respuesta a factores de estrés fisiopatológico
María-José Prieto-Álamo1, Laura Maldonado-Escudero1, Silvana T
Tapia-Paniagua2, Miguel Ángel Moríñigo2, Juan Jurado1
1
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba,
Cordoba, ES, 2Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES
El cultivo del lenguado senegalés (Solea senegalensis), un organismo no
modelo de interés para la acuicultura española, se ve dificultado por su
Pósters
susceptibilidad a diversas patologías y situaciones de estrés, sobre todo
cuando se cultiva a altas densidades de biomasa, condiciones necesarias
para la rentabilidad de las explotaciones. Actualmente, la acuicultura
europea carece de herramientas veterinarias suficientes lo que supone una
limitación para el desarrollo de este sector. Los probióticos son una opción
interesante ya que parecen aumentar la eficiencia de la alimentación, la
tolerancia a situaciones de estrés, y la resistencia a enfermedades. El
análisis de los patrones de expresión transcripcional aporta una valiosa
información sobre el funcionamiento coordinado de los genes en respuesta
a distintas variables. Hemos analizado, mediante qRT-PCR en tiempo real,
los perfiles hepáticos de expresión transcripcional de S. senegalensis, en
respuesta a estrés por sobrepoblación y a una infección por bacterias del
genero Vibrio. En ambos casos se ha investigado el efecto del probiótico
Shewanella putrefaciens Pdp11. Se han cuantificado 28 transcritos que
codifican proteínas implicadas en la respuesta inmune, respuesta a estrés,
metabolismo central y crecimiento, y proteasas relacionadas con varios
procesos biológicos. Los resultados muestran que los lenguados cultivados
a alta densidad presentan niveles disminuidos de varios transcritos de
la respuesta inmune, lo que explicaría su mayor susceptibilidad a sufrir
infecciones. Por el contrario la infección indujo la expresión de la mayoría
de los genes relacionados con la respuesta inmune. En las condiciones
analizadas, el probiótico no tuvo un efecto apreciable sobre los cambios de
expresión debidos a la sobrepoblación, pero produjo una mayor resistencia
a la infección en estos lenguados, lo que se relaciona con la recuperación de
niveles normales de los transcritos de la respuesta inmune. Los resultados
respaldan el efecto beneficioso de S. putrefaciens Pdp11 como tratamiento
profiláctico en situaciones de susceptibilidad a patógenos durante el cultivo
del lenguado.
Financiación: AGL2011-30381-CO3-03.
P11-15
iTRAQ analysis of hepatic proteins in free-living
Mus spretus mice to assess the contamination
status of areas surrounding Doñana National Park
Nieves Abril Díaz, Eduardo Chicano-Galvez, Carmen Michán Doña,
Carmen Pueyo de la Cuesta, Juan López-Barea
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba,
Córdoba, ES
Doñana National Park (DNP), a Biosphere Reserve located at SW
Spain, includes some of the most environmentally valuable ecosystems
in Europe. Nevertheless, DNP is threatened by pesticides, metals and
contaminants carried out by local streams and Guadalquivir River. A
follow-up study started by combining conventional biomarkers and 2-DE
proteomic approaches that resolved near 3,000 protein spots. Based on
these pioneering studies, we have combined several “omics” approaches
for the identification of molecular biomarkers of pollution exposure,
using the aboriginal species Mus spretus as bioindicator. This mouse is
phyllogenetically related to Mus musculus, thus facilitating the use of its
gene/protein sequence databases for massive identification of proteins and
transcripts with altered expression. Here we report the results of a second
generation proteomic study in free-living M. spretus from neighboring
areas of Doñana National Park (DNP) with different pollution levels.
Liver proteins from mice captured at the “Matochal” rice fields (MAT),
the “Rocina” stream (ROC), two sites of the “Partido” streams (PAR,
AJO) and the reference site “Lucio del Palacio” (LP), were labeled
with iTRAQ-8plex tags to quantify differentially expressed proteins. A
previous isoelectric focusing step was included to improve separation of
the highly complex peptide mixture. Mass spectrometry was carried out in
a LTQ Orbitrap system for protein dentification and iTRAQ reporter ion
quantitation using the Mus musculus database as reference. Of the near
100,000 peptides sequenced, 1032 proteins were identified and quantified
by iTRAQ reporter ions, leading to the identification of 118 proteins that
were significantly altered (> 2.5 fold variation) in at least two problem areas
(PAR, AJO, ROC or MAT) compared to the reference (LP). The results
107
Pósters
of iTRAQ analysis were confirmed by Western blotting. The identified
proteins provide insight about the different defense strategies in free-living
mice affected by pollutants in DNP and its surrounding areas (CTM2012-
38720-C03-02, CVI-3829, CTM2009-12858-CO2-02, BIO1675).
P11r-16
Análisis de la expresión de la proteína
CD26/DPPIV en diferentes líneas celulares
de cáncer colorrectal
Marta Rodríguez Quiroga1, Lorena Vázquez-Iglesias1, Leticia Barcia
Castro1, Andrea Díaz Díaz1, Oscar J Cordero2, Fco.Javier Rodriguez
Berrocal1, María Páez de la Cadena1
1 nuevas interacciones entre proteínas. En este trabajo se han empleado
Dpto.Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo,
Vigo, ES, 2Dpto.Bioquimica y Biología Molecular, Ed. CIBUS,
Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela,
ES
La proteína CD26 (dipeptidil peptidasa IV, DPPIV; EC 3.4.14.5) es una
glicoproteína transmebrana exopeptidasa, localizada en la superficie
celular de linfocitos, células endoteliales y epiteliales. Sus funciones,
dependientes e independientes de la actividad enzimática parecen estar
relacionadas con la regulación de respuestas inflamatorias e inmunológicas,
la transducción de señales y la apoptosis, sugiriendo su implicación en
la progresión tumoral. También se encuentra en forma soluble en varios
fluidos biológicos y hemos propuesto su utilidad como biomarcador en
cáncer colorrectal (CCR). Se ha descrito como supresor tumoral tanto en
cáncer de páncreas como en melanoma y hay indicios de que cumple esta
función en CCR.
Numerosos estudios muestran que las células tumorales reactivan lo que
se conoce como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT). En su intento
por liberarse de su confinamiento habitual, las células sufren una serie de
cambios que conllevan a una mayor capacidad migratoria, invasividad y
una elevada resistencia a apoptosis. Las células que están sufriendo esta
transición se pueden identificar generalmente por la presencia o ausencia
de determinadas moléculas que las dotan de una estructura más flexible,
capacidad de viajar, y por una forma diferente a la de la célula epitelial.
En este trabajo nos propusimos analizar la expresión de la proteína CD26
y de dos proteínas implicadas en la EMT: E-cadherina y vimentina en 8
líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal de diferentes estadios:
SW1116, SW480, SW620, DLD-1, COLO205, T84, HT-29 y Caco-2
mediante técnicas de western blot y citometría de flujo.
Los resultados muestran que las líneas SW480 y SW620 presentan
un fenotipo mesenquimal ya que tienen niveles elevados de la proteína
vimentina mientras que los niveles de E-cadherina son significativamente
menores a los de las otras líneas celulares analizadas que muestran un
fenotipo de tipo epitelial. Los resultados obtenidos tanto por citometría
como por western blot indican que la proteína CD26 se expresa casi
exclusivamente en células de fenotipo epitelial.
Financiación: AECC (GCB13131592CAST), INBIOMED (CN2012/273),
REGICC (CN2012/217).
P11m-17
Estudio del interactoma de Ixr1 en Saccharomyces
cerevisiae
Aida Inés Barreiro Alonso, Ángel Vizoso Vázquez, Mónica Lamas
Maceiras, María Esperanza Cerdán Villanueva
Universidad de A Coruña, A Coruña, ES
Ixr1 es una proteína HMG de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Dicha
proteína se identificó por su unión a DNA platinado. El cisplatino es una
droga antitumoral empleada principalmente para el tratamiento de tumores
sólidos como los presentes en el cáncer de ovario, testículo o cuello [1].
Ixr1 es, además, un factor transcripcional implicado en la adaptación
108
XXXVII Congreso SEBBM
a condiciones de normoxia e hipoxia. Así, se ha visto que reprime la
expresión aerobia de genes como COX5B [2], TIR1 [3] y HEM13 [4]
así mismo también se ha observado que en el caso de HEM13 activa su
expresión en condiciones de anaerobiosis. Por otra parte Ixr1 participa en
la respuesta a estrés oxidativo, ya que se ha determinado que su ausencia
incrementa la sensibilidad a la presencia de peróxidos [5]. Estructuralmente
Ixr1 se caracteriza por la presencia de dos dominios HMG dispuestos en
tándem, y varias regiones de poliglutaminas. Diversos estudios han puesto
de manifiesto que Ixr1 interacciona con DNA platinado a través de sus
dominios HMG [1].
Para poder profundizar en el conocimiento de las diferentes funciones en las
que está implicado Ixr1 es necesaria la búsqueda de nuevas interacciones
de esta proteína. El sistema TAP (Tandem Affinity Purification) y el sistema
de doble híbrido son dos técnicas de gran utilidad a la hora de identificar
estos dos métodos para encontrar posibles interacciones de Ixr1 con
otras proteínas en Saccharomyces cerevisiae. Para ello se ha optimizado
el método TAP empleando diferentes etiquetas/epítopos y mejorando las
condiciones de purificación.
Bibliografía
[1] M.M . McA’Nulty et al., Mutat. Res. (1996), 75-86.
[2] J.R Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:7345-9.
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[5] R. Castro-Prego et al., Biochem. J. (2010), 425(1):235-43.
P11r-18
Niveles de proteína y actividad enzimática
de MMP-9 en cáncer de pulmón no microcítico
Leticia Barcia Castro1, Sonia Blanco Prieto1, Lorena Vázquez
Iglesias1, F.J. Rodriguez-Berrocal1, M. Isabel Botana Rial2, M. Paez
de la Cadena1
1
Dpto. Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de
Vigo, Vigo, ES, 2Servicio de Neumología, Complexo Hospitalario
Universitario de Vigo, Vigo, ES
Las enzimas Metaloproteasas de Matriz Extracelular (MMP) juegan un
papel esencial en la progresión del tumor en distintos tipos de cáncer. En
particular la MMP9 o gelatinasa B degrada componentes de la matriz como
el colágeno tipo IV por lo que se la relaciona con procesos de invasión
y metástasis. Aunque la función reside en su actividad enzimática, la
mayoría de los estudios sobre su valor como marcador tumoral se realizan
cuantificando los niveles de proteína.
El objetivo de nuestro estudio es determinar en el suero de pacientes con
cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), los niveles de proteína y de
actividad enzimática de MMP-9 mediante técnicas de ELISA y ensayos
de zimografía. En las zimografías se cuantificó la actividad atendiendo a
sus diferentes isoformas: proMMP9 (92 kDa), el conjunto de la proMMP9
(92 kDa) y la pro-MMP9-NGAL (130 kDa) y finalmente, la MMP9 total
(proMMP9, proMMP9-NGAL y Homodímero proMMP9).
Los resultados muestran que los niveles de MMP-9 (tanto de proteína como
de actividad) se incrementan en las muestras de pacientes con CPNM en
comparación con el grupo control. La media de los niveles de proteína en el
grupo control es de 209,04±148,6 (ng/mL) frente a 392,29±241,61 (ng/mL)
en CPNM. En el caso de la actividad, considerando el conjunto constituido
por la proMMP9 y proMMP9-NGAL, los valores para el grupo control
son de 16,57±11,38 (u.a.) frente a 25,39±13,9 (u.a.) de las muestras con
CPNM. El estudio de correlación entre los niveles de MMP-9 obtenidos
mediante zimografía y los obtenidos por ELISA muestran correlaciones
diferentes dependiendo de la banda de actividad considerada siendo el
conjunto proMMP9 y proMMP9-NGAL el que presenta mejor correlación
con los niveles séricos.
Financiación: Agrupamento Inbiomed 2012/73, Proyecto PS09-00405,
Instituto de Salud Carlos III y fondos FEDER.
Granada 2014
P11-19
Análisis mediante pirosecuenciación del grado
de metilación del gen SEPT9 en suero para el
diagnóstico de cáncer colorrectal
Loretta De Chiara, Olalla Otero-Estévez, María Páez de la Cadena,
Francisco Javier Rodríguez Berrocal, Vicenta Soledad Martínez Zorzano
Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Facultad de
Biología, Universidad de Vigo, Vigo, ES
Recientemente, tras analizar cualitativamente el estado de hipermetilación
del gen SEPT9, éste ha sido propuesto como marcador diagnóstico
para cáncer colorrectal (CCR). El objetivo de este trabajo es cuantificar
mediante pirosecuenciación el porcentaje de metilación de SEPT9 en
suero de individuos sometidos a colonoscopia. Adicionalmente se evaluó
su valor diagnóstico para detectar casos de CCR y de neoplasia avanzada
(adenomas avanzados o CCR).
Por pirosecuenciación se estudiaron 7 sitios CpG incluidos en la región
promotora del gen, en muestras de suero de: 21 individuos sin hallazgos, 15
con patologías benignas, 19 con adenomas no avanzados, 7 con adenomas
avanzados y 22 casos de CCR. Para evaluar la capacidad diagnóstica se
construyeron curvas ROC y se calcularon las áreas bajo la curva (AUC)
para cada sitio CpG y sus combinaciones realizadas mediante regresión
logística binaria. Fijando la especificidad al 90%, se estimó la sensibilidad
del marcador en cada supuesto.
Para el diagnóstico de CCR, los valores de AUC obtenidos para cada uno
de los sitios CpG estudiados estuvieron comprendidos entre 0,51-0,60,
con valores de sensibilidad de 4,5-18,2%. La mayor sensibilidad (36,4%)
se alcanzó combinando las posiciones 1 a 6 (AUC: 0,74). En cuanto a la
detección de neoplasia avanzada, el AUC resultó entre 0,50-0,59 para los
7 sitios analizados, con sensibilidades de 10,3-24,1%. La combinación
óptima (posiciones 1 a 4 y 7) mostró un AUC de 0,70 (sensibilidad 41,4%).
En resumen, a pesar de la baja sensibilidad que presenta la metilación de
SEPT9 para la detección tanto de CCR como de neoplasia avanzada, el
análisis por pirosecuenciación permitió identificar los sitios CpG que más
contribuyen, lo que permitirá optimizar su capacidad diagnóstica.
Financiación: Fundación Científica de la Asociación Española contra
el Cáncer (GCB13131592CAST) y Fondo de Investigación Sanitaria del
Instituto de Salud Carlos III - FEDER (PI12/00117).
P11-20
Análisis proteómico para el estudio de los
mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de
las RNA polimerasas eucarióticas
Ana Isabel Garrido-Godino, Verónica Martínez-Fernández, Abel
Cuevas-Bermúdez, Francisco Navarro Gómez
Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES
Las RNA polimerasas son complejos multiproteicos encargados de la
transcripción. A pesar de que existe una amplia información de cómo
estos complejos funcionan e interactúan en el núcleo celular de eucariotas,
poco se sabe sobre los mecanismos de su ensamblaje citoplasmático y
su posterior entrada al núcleo, así como de los procesos de reciclado y
desensamblaje nucleares. Nuestra investigación ha permitido ahondar en
estos procesos y describir nuevos mecanismos y proteínas implicados
en los mismos. Mediante técnicas de análisis proteómicos, combinadas
contécnicas genéticas, bioquímicas y de biología molecular hemos
determinado la existencia de dos nuevas proteínas, Bud27 y Rtr1 que
median estos procesos y que tienen un efecto directo en el ensamblaje de las
RNA polimerasas eucarióticas y en el proceso transcripcional. Continuar
con este tipo de abordaje, ayudará a clarificar y profundizar en estos
mecanismos que tienen un interés crucial para entender la transcripción,
no solo desde el punto de vista funcional en el núcleo, sino desde un punto
de vista dinámico que implica, además, los procesos de ensamblaje y
desensamblaje de la maquinaria de transcripción.
Pósters
P11-21
Análisis proteómico de vesículas de membrana
externa aisladas de cultivos de la cepa probiótica
Escherichia coli 1917 en medio DMEM
Lorena Toloza Maturana, Laura Aguilera Gil, María José Fábrega
Fernández, Rosa Giménez Claudio, Laura Baldomà Llavinés, Josefa
Badía
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de
Farmàcia, Universitat de Barcelona, Institut de Biomedicina de la
UB (IBUB), Barcelona, ES
Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico utilizado en el
tratamiento de patologías intestinales. EcN favorece el equilibrio de
la microbiota y mejora la homeostasis intestinal. Sin embargo, existe
poca información sobre cómo las moléculas efectoras liberadas por este
probiótico acceden a las células del huésped. Las bacterias gram-negativas
producen vesículas de membrana externa (OMV). Estas estructuras
desempeñan un rol importante en la interacción bacteria-huésped. Por
ello, las OMV generadas por microbiota comensal y probióticos gram-
negativos se vislumbran como agentes importantes en la señalización
a nivel intestinal. Los estudios proteómicos pueden aportar información
relevante en este contexto.
Aquí se presenta el proteoma de las OMV aisladas de cultivos de la cepa EcN
en DMEM, medio habitual para el cultivo de líneas de epitelio intestinal.
Las proteínas de las OMV fueron separadas en geles de poliacrilamida-SDS,
extraídas del gel y analizadas por espectrometría de masas. Las proteínas
identificadas fueron clasificadas en grupos funcionales según las bases
UniProt y GenProtecEc y los resultados comparados con los obtenidos
del proteoma de las OMV aisladas de cultivos en LB, recientemente
publicado por nuestro grupo de investigación. Se identificaron un total
de 148 proteínas, 114 eran comunes al proteoma de las OMV en LB. La
distribución en grupos funcionales fue similar en ambos proteomas. En
cuanto a su localización subcelular las OMV en DMEM presentan una
mayor proporción de proteínas de membrana interna y de citoplasma. Así,
el medio de cultivo determina la composición de las OMV. En conjunto
los resultados demuestran que las OMV de probióticos contienen proteínas
capaces de interaccionar con células del huésped y modular su función.
* Estos autores han contribuido por igual.
P11-22
c-Myc como predictor de respuesta a la
radioquimioterapia en el cáncer de recto
Marta Cuadros Celorrio1, Raquel Conde Muiño2, Pablo Palma2,
Victoria Sánchez3, Sofía Boyero4
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e
Inmunología, Universidad de Granada - Centro Pfizer-Universidad
de Granada-Junta de Andalucía de Genómica e Investigación
Oncológica (GENYO), Granada, ES, 2Sección de Cirugía Colorrectal,
Servicio de Cirugía General, HUVN Granada, Granada, ES, 3Centro
Pfizer - Universidad de Granada - Junta de Andalucía de Genómica
e Investigación Oncológica (GENYO), Granada, ES, 4Universidad de
Granada, Granada, ES
Introducción: El tratamiento actual del cancer de recto localmente
avanzado (CRLA) incluye regímenes de radioquimoterapia (RQPT)
antes de la exéresis quirúrgica. Hasta la fecha, no existe ningún marcador
que pueda predecir la respuesta a esa RQPT, sin poderse detectar el alto
índice de pacientes que no se benefician de esta actuación, no exenta de
morbilidad y de un alto coste económico.El objetivo de este estudio es
evaluar la expresión de c-Myc como posible marcador de respuesta a la
RQTP en pacientes afectos con CRLA.
Material y métodos: Para determinar si la sobreexpresión del ARNm
de c-Myc se correlacionaba con una amplificación del ADN se realizó
hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Además, se realizó la
inmunohistoquímica de c-Myc. Se analizaron mediante curvas ROC la
109
Pósters
sensibilidad y especificidad de la sobreexpresión de c-Myc para predecir
la respuesta al tratamiento.
Resultados: Identificamos mediante microarrays 257 genes cuya expresión
era distinta y significativa entre respondedores y no respondedores a la
RQTP. En la red de interconexión más importante destacaban 24 genes
relacionados directa o indirectamente con c-Myc. Ninguno de los tumores
amplificó c-Myc. El 100% de las muestras presentaron un elevado número
de células tumorales positivas (>90%), independientemente de su respuesta
al tratamiento.El análisis de curvas ROC indica que la sobreexpresión de
c-Myc tiene una especificidad del 93.8% y una sensibilidad del 70% para
determinar la respuesta al tratamiento.
Conclusiones: La sobreexpresión de c-Myc a nivel de ARNm muestra
una buena correlación con la respuesta a la QRTP en pacientes afectos de
CRLA.
P11-23 (R11-6)
Differentiation of mouse embryonic stem cells
towards pancreatic beta-cell surrogates through
regulation of Pdx1 by nitric oxide
Carmen Salguero Aranda1, Rafael Tapia Limonchi1, Gladys Cahuana
Macedo2, Ana Belén Hitos Prados1, Irene Díaz Contreras1, Karim
Hmadcha1, Mario Fernández Fraga3, Franz Martín Bermudo1, Bernat
Soria Escoms1, Juan R. Tejedo Huamán1, Francisco Bedoya Bergua1
1
Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa-
CABIMER, Sevilla, ES, 2Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES,
3
Hospital Universitario Central de Asturias, Asturias, ES
Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1) is a transcription factor
that regulates the pancreatic development and the differentiation and
functionality of beta cells. Our group has shown that exposure of mouse
embryonic stem (mES) cells to high concentrations of NO donors such
as diethylenetriamine nitric oxide adduct (DETA-NO) increases the
expression of Pdx1. In that study we report that the increase of Pdx1
expression after NO treatment is associated with the release of Polycomb
Repressive Complex 2 (PRC2) and the histone acetyltransferase P300
from its promoter. Moreover, it is observed some changes in bivalent
marks of histone H3k27me3 and H3K4me3, site specific changes of DNA
methylation, and no changes in H3 acetylation of Pdx1 promoter. The
knowledge of the regulation of the gene Pdx1 has allowed us develop a
protocol to differentiate mES cells towards insulin producing cells. The
protocol consists of adding to the culture medium 0.5 mM DETA-NO
for 19 hours, 100 μM valproic acid for 6 days, 50 μM P300 inhibitor for
20 hours and a final step of suspension culture to form aggregates for 3
days. This simple and cost effective differentiation protocol allows the
generation of cells stably expressing markers of beta-cells such as Pdx1,
Nkx6.1, GcK, Kir6.2, Glut-2 and insulin.
Subvencionado por Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría
de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-
900000) y Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011).
P11-24 (R11-3)
Estrategias ómicas aplicadas al estudio de la
patología renal y vascular
Irene Zubiri, Marta Martín-Lorenzo, Laura González-Calero, María
Posada-Ayala, Aroa S. Maroto, Fernando Vivanco, Gloria Álvarez-
Llamas
Departamento de Inmunología, IIS-Fundación Jiménez Díaz, UAM,
Madrid, ES
La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema emergente en todo
el mundo. En España, en pacientes seguidos en atención primaria con
enfermedades tan frecuentes como hipertensión arterial (HTA) o diabetes
mellitus (DM), la prevalencia de ERC puede alcanzar el 35-40%. En
110
XXXVII Congreso SEBBM
particular, la nefropatía diabética (ND) es la principal causa (44,3%) de ERC
terminal en el mundo. Estos pacientes presentan un riesgo cardiovascular
(CV) añadido y se estima que el 40% de la población española con
enfermedad renal oculta (no diagnosticada) fallecerá principalmente
de problemas cardiovasculares. Si bien es conocida la existencia de un
síndrome cardio-renal, o desorden por el cual la disfunción del corazón
o riñón afecta al otro órgano, no se comprenden del todo los procesos que
operan específicamente en este contexto.
En este trabajo, perseguimos un doble objetivo: a) la identificación de
nuevos marcadores de ERC, ND y riesgo CV, y b) la aplicación de nuevas
tecnologías como la Espectrometría de Masas de Imagen (MSI) al estudio
de la aterosclerosis como patología de base en el síndrome cardio-renal.
En un abordaje multidisciplinar empleando RMN, DIGE y SRM-LC-MS/
MS en modelos animales tempranos de ND y aterosclerosis y en muestras
humanas, hemos analizado el proteoma y el metaboloma de tejido renal,
tejido arterial, orina y exosomas aislados de orina. En paralelo, hemos
desarrollado y aplicado con éxito un protocolo MSI de análisis de arterias
que permite identificar, in situ, mapas moleculares específicamente
asociados a regiones arteriales concretas (zona de placa, capa íntima o capa
media) y su implicación en el desarrollo de la lesión aterosclerótica.
P11-25
Aislamiento de una nueva hidrolasa a partir de
un manantial geotermal mediante metagenómica
funcional
Mª Eugenia de Castro1, Esther Rodriguez-Belmonte2, Maria Isabel
González-Siso2
1
Universidad de A Coruña, A Coruña, ES, 2Área de Bioquímica y
Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de A Coruña,
A Coruña, ES
Las beta-galactosidasas (EC 3.2.1.23) constituyen una gran familia
de proteínas con capacidad para catalizar la hidrólisis de enlaces β-D
(1,4)-galactosídicos y participar en reacciones de transgalactosilación.
Por ello, son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria como
intermediarias para la producción de leche sin lactosa, la revalorización
de los sueros o la obtención de galacto-oligosacáridos, constituyentes
fundamentales de los prebióticos, entre otros. En los últimos años, la
posibilidad de obtener beta-galactosidasas termoestables y el creciente
mercado de alimentos funcionales han incrementado su interés industrial.
La metagenómica funcional permite analizar el genoma colectivo de una
comunidad microbiana expresándolo de manera heteróloga y constituye un
campo emergente de la biotecnología que ha permitido la caracterización
de enzimas procedentes de microorganismos de ambientes difíciles de
aislar por sus condiciones extremófilas.
En el presente estudio se recoge la purificación y caracterización
enzimática de una hidrolasa obtenida mediante búsqueda funcional en una
metagenoteca de aguas termales procedentes del manantial del Riocaldo
(Lobios, Ourense), no descrita hasta el momento y que presenta actividad
hidrolasa estable a 65ºC.
P11-26
Recombinant glycoproteins gp125 and gp350 for
immunodiagnostic of EBV
Iván Iglesias Baena, Encarnación Campos Gutierrez, Fernando
Morcillo de Amuedo, Julian López-Viota, José Rojas, Ainel Alemán
Vircell SL, Granada, ES
Serodiagnosis of Epstein-Barr virus (EBV) gain relevance for
its relationship with nasopharyngeal carcinoma and other EBV-
associated diseases. Viral capsid glycoproteins gp125 and gp350 has
been described as good antigens for early infections, which proteins
combined with EBNA and p18 could improve the sensitivity. The yeast
and mammalian overexpression of recombinant proteins is an important
Granada 2014
tool to obtain post-translational modifications, which can be essential
in its antigenicity, and higher yield than the native form obtained from
virus culture.
We have purified the tagged gp125 from Baculovirus and Pichia
pastoris system, and the N-terminal gp350 and C-terminal gp350 from
Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris system. The improvement of
the expression conditions in a bioreactor were carried out with the control
of parameters in order to reduce degradation and to obtain higher biomass.
After yeast cell disruption and clarification, the purification strategy were
carried out by affinity chromatography in FPLC system and analyzed using
the specific monoclonal antibodies.
Both enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and magnetic
nanoparticules (MNP) have been used to get an antigen characterization of
the different fussion proteins, developing a new method of diagnostic with
high sensitivity and specificity. The gp125 obtained from Pichia pastoris
showed similar activity than the commercial native antigen, and contribute
to distinguish between possitive and negative serum samples for IgM. We
have observed the crucial role of the expression in eukaryotic system of
early antigens from the capsid of EBV in order to conserve the relevance
glycosilations into the conformational epitopes.
P11-27
P1 recombinant antigen for the Mycoplasma
pneumoniae diagnosis
Anabel López Ramos1, Ana Leticia Jiménez Escobar2, Ivan Iglesias
Baena1, Encarnación Campos Gutierrez1, Fernando Morcillo1, Julian
López Viota1, Jose Rojas1
1
Vircell SL, Granada, ES, 2Universidad de Granada, Granada, ES
Mycoplasma pneumoniae is a human pathogen that causes atypical
bacterial pneumonia with high prevalence in children and young adults.
Other pathogens produce pneumonia with a nonspecific clinical, so to
develop an immunological method with high sensitivity and specificity. A
kit for the diagnostic of M. pneumoniae by ELISA has been developed by
Vircell S.L. for detection of the infection in the early state (IgM).
The adhesin P1 has been described as a good antigen for serological test
for its immunogenicity. This membrane protein has been obtained from
the bacterial extract, but in order to improve the relation yield-cost, we
have designed the cloning and overexpression of P1 in eukaryotic and
prokaryotic system.
The C-terminal fragment of P1 has been cloned into expression vector for
Baculovirus and Escherichia coli, obtaining a tagged proteins that were
purified by affinity chromatography in FPLC system and analyzed using
specific monoclonal antibodies. We have developed the expression and
purification process to obtain the purified protein.
The obtained recombinant P1, conserve the crucial epitopes for the
discrimination between positive and negative serum samples. Indeed,
we have develop a new platform for mycoplasma diagnosis, using
nanoparticles labelled to the antigen.
P11-28
Efecto de la aeroplisinina-1 sobre proteínas
involucradas en el proceso angiogénico e
inflamatorio
Javier A. García-Vilas, Ana R. Quesada, Miguel Ángel Medina Torres
Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología
Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA-
Biomedical Research Institute of Málaga - Unidad 741, CIBER de
Enfermedades Raras-CIBERER, Málaga, ES
La aeroplisinina-1 metabolito secundario sintetizado por esponjas como
mecanismo de defensa, ha sido caracterizada por nuestro grupo como
un potente agente antiangiogénico por modular proteínas involucradas
estrechamente en este proceso, tanto en células endoteliales de cultivos
Pósters
primarios como en células endoteliales inmortalizadas. Estudios
posteriores que hemos realizado con la aeroplisinina-1, han dilucidado que
este compuesto también presenta capacidad antiinflamatoria al disminuir
los niveles de proteínas a las que se les atribuyen importantes actividades
inflamatorias por mediar algunos estadios como puede ser la atracción de
células inflamatorias, proteasas para facilitar la trasvasación de las células
desde el torrente sanguíneo hasta el foco inflamatorio, además de disminuir
los niveles de COX-2 responsable de sintetizar moléculas de carácter
inflamatorio.
Tanto el proceso angiogénico como el proceso inflamatorio, no sólo
se encuentran regulados por las proteínas a las que se les asocian
directamente, sino que está descrito que en ambos procesos ejerce
un importante papel las proteínas responsables del metabolismo
redox. Mediante aproximación proteómica hemos comprobado que
el tratamiento con aeroplisinina-1 modifica los niveles de proteínas
relacionadas con el metabolismo redox, sugiriendo que el efecto
antiinflamatorio y antiangiogénico de la aeroplisinina-1 demostrado
en estudios anteriores, se debe al efecto multidiana sobre diversos
“módulos del metabolismo” permitiendo engrosar las evidencias de
este compuesto como un potente agente modulador de los procesos
asociados a los tumores.
Supported by grant P12-CTS-1507 (Andalusian Government and FEDER)
and funds from group BIO-267 (Andalusian Government). The “CIBER de
Enfermedades Raras” is an initiative from the ISCIII.
P11-29
Actividad proteosomal en pacientes mexicanos
con cáncer de próstata
José Francisco Montiel-Sosa1, Victoria Edwina Campos Garcia2,
Sandra Díaz-Barriga Arceo1, Jorge Ramirez Salcedo3, Sergio Ureta4,
Patricia Ramírez Noguera1
1
PhD. en Bioquímica, Departamento de Bioquímica y Farmacología
Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlán
Izcalli, MX, 2B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento
de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional
Autónoma de México, Cuautitlan Izcalli, MX, 3PhD. en Ciencias
Biomedicas. Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional
Autónoma de México, México, MX, 4M.D.Médico Urólogo, Hospital
Español, Distrito Federal, MX
Dentro de las señales celulares involucradas en proceso de cáncer de
próstata CaP, el sistema ubiquitina proteosoma y proteínas similares
a ubiquitina (SUMO) juegan un papel muy importante. Con objeto de
conocer el estado de ubiquitinación proteíca y sumoilación in vitro en
biopsias de pacientes con cáncer de próstata se estimó, la capacidad de
formación in vitro de aductos-Ub y aductos-SENP específicos utilizando
las proteínas de fusión recombinantes HA-Ub-Vinilsulfona y HA-SUMO
-1 y HA-SUMO 2/3-vinilsulfona (VS). Las sondas HA-Ub-VS y HA-
SUMO-1-VS y -2/3-VS producto de la generación de unaproteína de
fusión Tag-HA, reaccionaron covalentemente con los sitios nucleofílicos
activos de las enzimas DUB y SENP respectivamente. Estas enzimas están
presentes en el tejido prostático y dependiendo de su estado y actividad,
se pudieron unir covalentemente con el grupo VS de cada sonda. Los
resultados al momento muestran que la actividad similar a quimotripsina
estimada por medio de ensayos fluorogénicos y utilizando sustratos
específicos acoplados a coumarina está aumentada significativamente
un 10 % respecto al control negativo analizado. Estas deducciones son
importantes desde el punto de vista funcional del sistema ubiquitina
proteosoma en la células. Este sistema multienzimático, es capaz de
reconocer sustratos proteícos intracelulares necesarios en la modulación
de señales enfocadas en el control de la función y degradación de
proteínas señalizadoras en diversos procesos de transformación celular
y cáncer. El aumento en la actividad proteolítica similar a quimotripsina
sugiere una activación significativa en los pacientes de cáncer analizados
quizá con este fin.
111
Pósters
P11-30
Distinct serum proteome profiles associated
with collagen-induced arthritis, and complete
Freund’s adjuvant-induced inflammation in
CD38–/– mice
Antonio Rosal-Vela1, Sonia García-Rodríguez1, Jorge Postigo2,
Marcos Iglesias2, Jesús Merino2, Ramón Merino3, Mercedes
Zubiaur1, Jaime Sancho1
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Armilla (Granada), ES, 2Departmento de Biología
Molecular, Instituto de Formación e Investigación Marqués de
Valdecilla, Universidad de Cantabria, Santander, ES, 3Instituto de
Biomedicina y Biotecnología de Cantabria/CSIC-Universidad de
Cantabria-SODERCAN, Santander, ES
Collagen-type-II-induced arthritis (CIA) is milder in CD38-/- than in WT
mice. Their serum samples were treated with ProteoMiner-beads to equalize
protein concentrations resulting in a significant enrichment in proteins from
extracellular vesicles (blood microparticles, exosomes). ProteoMiner-
equalized samples were subjected to 2D-DiGE and MS-MALDI-TOF/TOF
analyses to identify proteins that were differentially expressed in CD38-/-
versus WT mice either with arthritis (Col.II+/CIA+), with no arthritis (Col.
II+/CIA-), or with inflammation (CFA-treated). Altered proteins included
those involved in acute phase response (SAA1), inflammation (B2MG,
HABP2, Hemoglobin), complement activation (Ficolins, C4-B fragments,
C1qb, C3-b-chain), polyclonal B-cell activation (Ig-kappa-light-chain) and
lipid metabolism (APOE, APOAI, APOAII, APOAIV, APOJ/Clusterin). Of
the proteins that changed in abundance, Hemoglobin and APOE could be
indicative of the milder pathological process found in CIA+CD38-/- mice,
whereas another set of proteins such as HABP2, Ig-kappa-light-chain,
SAA1, Ficolin-1, and Ficolin-2 were clearly associated to the stronger
response of WT mice to either collagen immunization or CFA-treatment.
Multivariate analyses revealed that the differential protein abundance
of 28 distinct protein spots was able to discriminate between CIA+ and
CIA- mice, independently of their genetic background. This approach is
suitable for the identification of arthritis, or inflammation serum proteome
signatures in mice with distinct genetic backgrounds.
P12. Metabolismo del nitrógeno
P12-1 (R12-3)
Análisis mutacional de la interacción GS-IFs en
cianobacterias
Rocío Robles Rengel, Lorena Saelices Gómez, Francisco Javier
Florencio Bellido, María Isabel Muro Pastor
Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja,
Universidad de Sevilla-CSIC, Sevilla, ES
La glutamina sintetasa de tipo I (GS) de Synechocystis sp. PCC 6803se
regula a nivel transcripcional y postraduccional en función del balance
carbono/nitrógeno celular. La regulación postraduccional se lleva a cabo
mediante la interacción reversible proteína-proteína con dos factores
inactivantes, IF7 e IF17 [1]. En el caso de Anabaena sp. PCC 7120,
existe un único factor inactivante denominado IF7A, homólogo a IF7
de Synechocystis. La GS de Synechocystis es inactivada por IF7, IF17 e
IF7A, mientras que la GS de Anabaena sólo es inactivada por su propio
factor, IF7A. Basándonos en esta observación, hemos construído cuatro
proteínas quiméricas entre la GS de Synechocystis y la de Anabaena.
El estudiocomparado de estas proteínas nos ha permitido localizar una
región carboxilo terminal de 56 residuos de aminoácidos responsable de
la interacción GS/IFs. Por otra parte conocemos la naturaleza electrostática
de dicha interacción y se han identificado tres residuos de arginina de los
factores inactivantes, claves para la funcionalidad de estas proteínas [2].
112
XXXVII Congreso SEBBM
Hemos abordado un exhaustivo estudio mutacional de la región de 56
aminoácidos C-terminal de la GS de Synechocystis tanto in vitro (mediante
ensayos de retardo en gel e inactivación con proteínas purificadas) como
in vivo (expresando en Synechocystis las versiones mutantes de la GS).
Hemos identificado tres residuos (glutamato 419, asparragina 456 y
arginina 459 de la GS de Synechocystis) fundamentales para la interacción
GS/IFs y la inactivación de la enzima. Analizando los resultados a la luz
de la estructura de la GS de Synechocystis (PDB ID 3NG0), obtenida
recientemente, observamos que estos tres residuos se localizan próximos y
expuestos al solvente, constituyendo un núcleo para la interacción GS/IFs
responsable de la inactivación de la enzima.
Bibliografía
[1] García-Domínguez M, Reyes JC, Florencio FJ (1999) Prot Natl Acad
Sci USA 96, 7161-7166.
[2] Saelices L, Galmozzi CV, Florencio FJ, Muro-Pastor MI. Mol Microbiol.
2011 Nov; 82 (4):964-75.
P12-2 (R12-1)
Análisis global de la degradación de residuos
cianurados industriales por Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT5344
Conrado Moreno Vivián1, Víctor M. Luque-Almagro1, Isabel Manso1,
Isabel Ibáñez1, Lara P. Sáez1, M. Paz Escribano1, Purificación
Cabello2, Francisco Castillo1, M. Dolores Roldán1
1
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba,
Córdoba, ES, 2Dpto. Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal,
Universidad de Córdoba, Córdoba, ES
Diversas actividades industriales, como la minería y el electropulido del
oro y otros metales preciosos en la joyería, generan residuos que contienen
una elevada concentración de cianuro, un compuesto muy tóxico para la
mayoría de los seres vivos. Así, la industria joyera de Córdoba genera
anualmente varias toneladas de un residuo alcalino que contiene hasta 1,5
M de cianuro y diversos metales, como cobre, hierro y zinc, el cual debe
ser tratado mediante procedimientos físico-químicos. La bacteria alcalófila
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 puede utilizar cianuro,
cianato, diferentes nitrilos y complejos cianuro-metálicos como única
fuente de nitrógeno, por lo que es un buen candidato para la biodegradación
de los residuos cianurados industriales. Para optimizar la degradación del
residuo de la joyería en biorreactores, se ha estudiado el efecto del pH, la
aireación, la fuente de carbono y la cantidad de inóculo inicial, entre otros
parámetros, y se ha comprobado que esta estirpe puede consumir hasta 12
mM de cianuro total cuando crece a pH 9, lo que evita la volatilización
del cianuro como HCN. La secuenciación completa del genoma de esta
estirpe (1,2) ha permitido realizar estudios proteómicos y genómicos que
revelan que el cianuro provoca en esta bacteria una respuesta global de
adaptación a esta fuente de nitrógeno tóxica. La inducción de una oxidasa
alternativa asociada a una malato:quinona oxidorreductasa permite, no
sólo la respiración insensible al cianuro, sino también la formación de
oxalacetato, que reacciona con el cianuro formando una cianhidrina. La
nitrilasa NitC inducible por cianuro utiliza esta cianhidrina para formar
amonio, que es asimilado por la ruta GS/GOGAT (3,4). El cianuro también
induce sistemas de captación de hierro, ya que la biodisponibilidad del
hierro disminuye por la formación de complejos estables con el cianuro.
Además, el residuo cianurado induce una respuesta de estrés oxidativo
y de defensa frente a metales. Finalmente, se han obtenido mutantes en
los genes implicados en la biosíntesis de polihidroxialcanoatos de cadena
corta y media identificados en el genoma, lo que ha permitido comprobar
que, según la estirpe empleada (silvestre o mutantes), es posible producir
material bioplástico de diferente naturaleza durante el crecimiento con
el residuo cianurado, lo que confiere un valor añadido al proceso de
biorremediación de este residuo industrial tóxico.
Bibliografía
[1] Luque-Almagro et al. Environ. Microbiol. 15: 253-270 (2013).
Granada 2014
[2] Wibberg et al. J. Biotechnol. 175: 67-68 (2014).
[3] Luque-Almagro et al. Microbiology 157:739-746 (2011).
[4] Estepa et al. Environ. Microbiol. Rep. 4: 326-334 (2012).
Financiado por MICINN (BIO2011-30026-C02-01) y Junta de Andalucía
(Proyecto Excelencia CVI-7560).
P12-3
Proteolytic control of the Bradyrhizobium
japonicum transcription factor FixK2
Juan J. Cabrera1, Noemí Fernández1, Mariette Bonnet2, Monika
Stegmann2, Zeljka Maglica3, Eilika Weber-Ban3, Hauke Hennecke2,
Eulogio J. Bedmar1, Socorro Mesa1
1
Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems,
Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Institute
of Microbiology, ETH Zurich, Zürich, CH, 3Institute of Molecular
Biology and Biophysics, ETH Zurich, Zürich, CH
FixK2 is a key regulator that controls a large number of genes required for
the anoxic and microoxic, endosymbiotic and nitrogen-fixing life styles of
the α-proteobacterium Bradyrhizobium japonicum [1]. FixK2is an unusual
member of the CRP/FNR family of bacterial transcription factors, because
it is active in vitro without an additional effector molecule and is regulated
posttranslationally by the oxidation of its singular cysteine residue [2].
In addition to its oxidation-mediated control, FixK2 is also regulated by
proteolysis. Despite the induction of fixK2 gene expression at low-oxygen
concentrations, the steady-state levels of the FixK2 protein remains constant
regardless of the growth conditions [2]. Further, the B. japonicum ClpAP1
proteolytic system degrades FixK2 in vitro [3]. Remarkably, the recently
solved FixK2structure in complex with DNA revealed that the C-terminus
of FixK2 is surface-exposed, and therefore a target for proteolysis [4].
We also observed that a truncated variant is always co-purified together
with N-terminally His6-tagged FixK2 proteins. Mass spectrometric analysis
revealed that this form a C-terminally cleaved derivative (between V220
and L221), which lacks the last twelve amino acids. Likewise, this shorter
FixK2 species is also present in cells of B. japonicum. In this work, we
have constructed a series of protein variants with modifications within
the C-terminus of FixK2. Our results showed that the C-terminal stretch
of twelve amino acids, and particularly L221, play a crucial role in FixK2
proteolysis, protein folding, DNA binding and in vitro activity. In order to
find out the function of the carboxy-terminal part of FixK2in vivo, we are
currently testing different proteins derivatives with regard to their ability to
complement a fixK2 mutant strain.
Bibliografía
[1] Mesa et al. (2008) J. Bacteriol. 190:6568-79.
[2] Mesa et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:21860-5.
[3] Bonnet et al. (2013) FEBS Lett. 587:88-93
[4] Bonnet et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:14238-46.
This work was supported by the ERDF-co-financed grant AGL2011-23383
from MINECO.
P12-4
Caracterización de la asparraginasa de pino:
implicaciones en el desarrollo del sistema vascular
Sonia H. E. Van Kerckhoven, Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre,
Concepción Avila, Francisco M. Cánovas, Francisco R. Cantón
Universidad de Málaga, Dpto Biol. Molecular y Bioquímica, Málaga, ES
La asparragina es un metabolito clave en plantas para el transporte y reserva
temporal de nitrógeno. La principal vía de movilización del nitrógeno
contenido en el grupo amido de la asparragina implica a la enzima
asparraginasa (ASPG, EC 3.5.1.1), especialmente en tejidos que demandan
altas cantidades de este elemento, tales como semillas en desarrollo y hojas
Pósters
jóvenes. Durante el desarrollo y crecimiento del tronco de los árboles, éstos
afrontan un consumo masivo de carbono y nitrógeno para proveer la síntesis
de celulosa y lignina. Estudios previos han demostrado que la expresión
del gen de asparraginasa en el pino está asociada al intensivo desarrollo del
sistema vascular que se produce en el tallo de las plántulas una vez que ésta
ha agotado las reservas de la semilla, y que su expresión está confinada a
las células de la región del cambium [1]. La observación de que este gen
se expresa también en células de xilema secundario en diferenciación de
árbol adulto sugiere que la ASPG podría jugar un papel importante en el
desarrollo vascular y ser de gran relevancia en la producción de biomasa.
Aunque conocemos, en líneas generales, la implicación de la asparraginasa
en el transporte y movilización de nitrógeno, desconocemos los mecanismos
moleculares que controlan espacial y temporalmente su actividad. En
nuestro grupo seguimos diferentes aproximaciones para dilucidar el control
transcripcional y post-transcripcional de esta enzima y su implicación en el
desarrollo del sistema vascular. Nuestros objetivos específicos son determinar
las características del procesado y activación de la asparraginasa de pino y
los factores que regulan la expresión génica asociada al desarrollo vascular.
Bibliografía
[1] Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre, Francisco M. Cánovas,
Francisco R. Cantón. (2007). Planta, 225:1205-1219.
Este trabajo ha sido financiado con ayudas del Ministerio de Economía y
Competitividad (BIO2012-33797, AGL9-12139C0202) y una ayuda F.P.U.
del Ministerio de Educación a SVK (AP2010-5434).
P12-5 (R12-9)
Control de RegR sobre la expresión de los genes
nor de Bradyrhizobium japonicum: micro-oxia
versus anoxia
Ana Salas Huertas, María Jesús Torres Porras, María Jesús Delgado
Igeño, Eulogio J. Bedmar Gómez
Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos -
Estación Experimental del Zaidín, CSIC, AP 419, Granada, ES
Bradyrhizobium japonicum es una bacteria del suelo que establece una
asociación simbiótica con plantas de soja y es capaz de desnitrificar tanto
en vida libre como en simbiosis. Los genes napEDABC, nirK,norCBQD y
nosRZDYFLX, que codifican las enzimas nitrato-, nitrito-, óxido nítrico-
y óxido nitroso-reductasa, respectivamente, son necesarios para llevar
a cabo dicho proceso. En B. japonicum, se han descrito dos cascadas
reguladoras, FixLJ-FixK2 y RegSR-NifA, de respuesta a oxígeno. Estudios
recientes de nuestro grupo de investigación han demostrado que la proteína
reguladora RegR es necesaria para la máxima inducción de los genes nor
en condiciones de cultivo anaeróbicas con nitrato y que este control es
independiente de RegS [1]. En este trabajo, se ha investigado si el control
que ejerce RegR sobre los genes nor ocurre también en micro-oxia o si
es exclusivo de condiciones anóxicas. Para ello, se han cultivado la cepa
parental USDA110spc4 y las mutantes en los genes regS y regR, en medio
mínimo con succinato como fuente de carbono, con nitrato como aceptor
final de electrones y en condiciones micro-óxicas (2% de oxígeno en la
atmósfera gaseosa). Tras el cultivo de las células, se han realizado estudios
de expresión de los genes nor mediante la determinación de la actividad
β-galactosidasa de una fusión transcripcional norC-lacZ y estudios de
detección de la proteína NorC mediante tinción del grupo hemo c.Los
resultados obtenidos han confirmado que la proteína reguladora RegR
está implicada en la inducción de los genes nor en respuesta a anoxia y
nitrato. Sin embargo, en condiciones de micro-oxia los niveles de actividad
β-galactosidasa de la fusión norC-lacZ, así como la expresión de la proteína
NorC en la cepa mutante regR, fueron superiores a los detectados en la
cepa parental. Esto sugiere que, a diferencia de lo observado en anoxia,
la proteína RegR podría tener un papel represor sobre la expresión de los
genes nor en condiciones micro-óxicas.
113
Pósters
Bibliografía
[1] Torres et al., 2014. PLOS one, en prensa.
Este trabajo se ha subvencionado con fondos cofinanciados por FEDER del
proyecto AGL2010-18607 del Ministerio de Economía y Competitividad.
P12-6 (R12-8)
El gen nosZ como marcador molecular de la
desnitrificación en ecosistemas naturales
David Correa-Galeote, German Tortosa, Eulogio J. Bedmar
Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos -
Estación Experimental del Zaidín - Agencia CSIC, Granada, ES
La relación entre el contenido en nitratos, la emisión de N2O y las distintas
comunidades desnitrificantes en diferentes muestras medioambientales aún no
ha sido establecida. En este estudio se determinó la abundancia relativa genes
de la desnitrificación narG, napA, nirK, nirS y nosZ con el fin de correlacionar
los distintos genes tanto entre sí, como con el substrato inicial y el producto
final de la reacción de la desnitrificación y a su vez, tratar de establecer un gen
de la desnitrificación como marcador molecular de dicho proceso.
Para ello se seleccionaron dos sitios de muestreo dentro del Parque Nacional
de Doñana uno con escaso contenido en nitratos (Laguna del Acebrón, S1)
y otro con elevado contenido en nitratos (Arroyo de la Cañada, S2). La
recogida de sedimentos se realizó en los meses de abril y octubre de los
años 2008, 2009 y 2010. El aislamiento, purificación y amplificación de los
genes 16S rRNA así como de los genes de la desnitrificación se realizó de
la manera habitualmente realizada en el laboratorio.
De acuerdo con el test de Spearman, la abundancia relativa de los genes de
la desnitrificación no presentó correlación ni con el contenido en nitratos
ni con la emisión de N2O en S1. Por el contrario, para S2 existe correlación
significativamente positiva entre el contenido en nitratos y cada uno de los
genes de la desnitrificación, si bien el gen nosZ fue el gen que presentó
una mayor correlación. La emisión de N2O y la abundancia relativa
de los genes de la desnitrificación en S2 fue negativa, encontrándose la
mayor correlación negativa para el gen nosZ. Por otra parte, tanto en S1
como en S2, todos los genes de la desnitrificación se correlacionaron
estadísticamente entre sí, observándose la mayor correlación entre el gen
nosZ y el resto de genes analizados.
Por tanto, se propone el gen nosZ como un posible marcador molecular
de las comunidades desnitrificantes en muestras medioambientales
contaminadas con nitratos.
P12-7 (R12-7)
Identificación de una nucleasa en ejes
embrionarios de judía regulada por nitrato
Rocío Lambert Rodríguez, Juan Miguel Cabello Díaz, Cristina
Caballo Linares, Francisco Antonio Quiles Luque, Pedro Piedras
Montilla
Universidad de Córdoba, Córdoba, ES
Las actividades nucleasas de plantas están implicadas en la degradación
de ácidos nucleicos asociada a procesos de muerte celular programada y a
los de restricción, reparación y recombinación del ADN. Sin embargo, el
conocimiento sobre la función de las nucleasas de plantas es muy limitado.
En ejes en desarrollo de judía se ha detectado una actividad nucleasa
mayoritaria que utiliza ARN y ADNmc como sustratos, cuyos valores de
actividad incrementaron tras la emergencia radicular coincidiendo con
el incremento de actividad nucleotidasa (Cabello-Díaz et al, 2012) y la
acumulación de ureidos (Quiles et al, 2009), lo que podría sugerir una
implicación en la movilización de reservas. Esta enzima se ha purificado
y el gen que la codifica (PVN1) se ha identificado mediante MALDI TOF/
TOF. Las características de la enzima purificada así como la secuencia
del gen indican que pertenece a la familia S1/P1 de nucleasas. Utilizando
la base de datos del genoma de judía (www.phytozome.com), se han
identificado 5 miembros de esta familia, cuya expresión se ha analizado
114
XXXVII Congreso SEBBM
durante la germinación y desarrollo postgerminativo temprano de judía. El
gen PVN1, que corresponde con la proteína purificada, fue el que mostró
mayor valor de expresión en ejes en desarrollo. La inclusión de nitrato en
el medio de imbibición redujo la expresión del gen, lo que sugiere una
relación con el estado nutricional de plántulas de judía.
Bibliografía
Cabello-Díaz JM, Quiles FA, Lambert R, Pineda M y Piedras P (2012).
Plant Physiol. Biochem., 53, 54-60.
Quiles FA, Raso MJ, Pineda M y Piedras P (2009). Physiol. Plant., 135,
19-28.
Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2012-
34230) y el Plan Andaluz de Investigación (BIO-115).
P12-8 (R12-10)
NRT1 y el transporte de compuestos
nitrogenados en Chlamydomonas
Victoria Calatrava, José Higuera, Zaira González, Emilio Fernández
Reyes, Aurora Galván Cejudo
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba,
Córdoba, ES
El nitrato es una señal positiva que activa la ruta de asimilación de nitrato/
nitrito. Para la activación de la ruta son necesarios dos factores, 1) la
entrada de nitrato al interior de la célula, y 2) la presencia de un NIT2
funcional. NIT2 es un factor de transcripción del tipo RWP-RK y es el
principal gen regulador de la ruta que necesita además de una proteína
dedo de zinc (NZF1) para la óptima funcionalidad de NIT2, en respuesta
a nitrato. Los mutantes nit2 ni sienten el nitrato ni crecen en medios con
nitrato [1, 2].
NRT2 y NRT1 son transportadores de nitrato que pertenecen a familias de
proteínas no relacionadas. A la familia NRT2 pertenecen transportadores
de nitrato/nitrito de alta afinidad y algunos de ellos esenciales para el
crecimiento con nitrato como única fuente de nitrógeno. A la familia
NRT1 pertenecen transportadores de nitrato, aminoácidos, oligopéptidos.
Recientemente esta familia se ha denominado NPF (NRT1/PTR Family).
En el presente trabajo se ha estudiado el papel de NRT1 de Chlamydomonas
(NPF7) en la señalización por nitrato y el efecto sobre la utilización de
fuentes de nitrógeno orgánica, urea, aminoácidos, péptidos.
Bibliografía
[1] Camargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, González-Ballester
D, Lefebvre PA, Fernández E, Galván A (2007) Nitrate signaling by the
regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell 19: 3491-3503.
[2] Higuera JJ, Fernandez E, Galvan A (2014) Chlamydomonas NZF1,
a tandem-repeated zinc finger factor involved in nitrate signalling by
controlling the regulatory gene NIT2. Plant Cell Environ. doi: 10.1111/
pce.12305.
Financiado por JA-P08-CVI-042157 y MINECO-BFU2011-29338 (EU
FEDER Programa).
P12-9 (R12-2)
25 años de estudios sobre metabolismo
de nitrógeno y carbono en haloarqueas
María José Bonete, Mónica Camacho, Carmen Pire, Rosa María
Martínez-Espinosa, Julia Esclapez, Vanesa Bautista, Anna Vegara,
Susana Díaz, Francisco Pérez-Pomares, Basilio Zafrilla, Laia Pedro-
Roig, Gloria Bravo-Barrales, Francisco I. Llorca
División de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de
Alicante, Alicante, ES
Los estudios sobre microorganismos extremófilos han aumentado
exponencialmente en los últimos años. Estos organismos se han adaptado
Granada 2014
a vivir en medios inhóspitos caracterizados por temperaturas, presiones,
valores de pH y fuerza iónica extremos. Investigaciones recientes
muestran que sus maquinarias celulares son únicas, ofreciendo una fuente
valiosa de nuevos biocatalizadores y compuestos de alto valor añadido
en el mercado.
Nuestro grupo de investigación ha centrado sus esfuerzos en el
estudio y caracterización del metabolismo del carbono y del nitrógeno
de haloarqueas. Como es bien sabido, el N es uno de los elementos
básicos de los seres vivos, y la disponibilidad de una fuente adecuada
del mismo a menudo limita la productividad primaria en algunos
ambientes naturales y en la agricultura. En relación a ello, cabe resaltar
que las publicaciones sobre la regulación a nivel transcripcional y
post-transcripcional de la asimilación del nitrato/amonio son escasas
en el Dominio Archaea. Este hecho ha motivado que recientemente
nuestro objetivo se centre en comprender los mecanismos que subyacen
en la regulación de este metabolismo y sus diferencias con los otros
Dominios.
Hasta el momento se ha aislado, caracterizado y expresado enzimas como
glutamato, isocitrato y glucosa deshidrogenasas, glutamina sintetasa,
ciclodextrin glucanotransferasa, nitrato y nitrito reductasas y proteínas
reguladoras como GlnK (PII). Estos estudios se han complementado
con otros de carácter fisiológico para conocer con detalle cómo estas
haloarqueas se adaptan a condiciones cambiantes del medio o a medios
extremos en los que además existen compuestos tóxicos. En este sentido,
la vía de desnitrificación se presenta como una de las más destacadas para
explorar posibles usos de las haloarqueas en biorremediación de aguas
y suelos salinos. Para comprender mejor esta ruta metabólica se han
purificado y caracterizado enzimas implicadas en ella y se han realizado
análisis informáticos para identificar los genes involucrados en esta ruta en
haloarqueas desnitrificantes.
P12r-10
Estudio funcional de promotores de genes
de la asimilación de nitrógeno en Haloferax
mediterranei
Rebeca González Guerrero, Anna Vegara Luque, Gabriel Felipe
Rodríguez Lozano, Julia María Esclapez Espliego, Carmen Lucía
Pire Galiana, María José Bonete Pérez
Grupo Biotecnología de Extremófilos, Universidad de Alicante, San
Vicente del Raspeig, ES
Haloferax mediterranei es una arquea halófila extrema capaz de adaptar
su metabolismo en función de la fuente de nitrógeno disponible. Puede
crecer en presencia de amonio, nitrato, nitrito o aminoácidos como única
fuente de nitrógeno. Se han llevado a cabo análisis mediante microarrays
y por qPCR que indican cuáles son los genes cuya transcripción se ve
afectada en función de la disponibilidad y de la fuente de nitrógeno.
Entre estos genes se encuentran los que codifican la glutamina sintetasa
(glnA), glutamato sintasa (gltS) y NAD-glutamato deshidrogenasa
(gdh-1). Se han clonado los promotores de estos genes fusionados con
el gen de la β-galactosidasa de Haloferax lucentensis (bgaH) como gen
reportero en el vector pVA-513 con el que se ha transformado Haloferax
mediterranei, midiéndose la actividad β-galactosidasa de las células
transformadas en medios con diferentes fuentes de nitrógeno. Además
se han realizado mutantes en el promotor del gen gltS que permiten la
identificación de sitios clave en la regulación de la actividad de este
promotor.
Por último con el objetivo de identificar los posibles reguladores
transcripcionales que se unan al promotor del gen gltS, se han realizado
ensayos de cromatografía de afinidad DNA-proteína, mediante la unión
del promotor biotinilado a una matriz magnética con estreptavidina, e
incubando con extractos de Haloferax mediterranei obtenidos en diferentes
condiciones de cultivo.
Pósters
P12-11
Transcriptómica de la deficiencia en glutamina
sintetasa plastídica en la leguminosa modelo
Lotus japonicus
Marco Betti, Carmen M. Pérez-Delgado, Margarita García-Calderón,
Antonio J. Márquez
Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad
de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
En las plantas existen diferentes isoformas de glutamina sintetasa
(GS) cuya función fisiológica precisa está aún por esclarecer. En este
trabajo se muestra un resumen de todos los estudios de transcriptómica
llevados a cabo hasta la fecha con los mutantes Ljgln2-2 deficientes en
GS plastídica (GS2) de L. japonicus, que fueron previamente aislados
en nuestro laboratorio, y que constituyen los primeros mutantes de su
clase que han sido identificados y caracterizados en plantas leguminosas.
Dichos estudios han puesto de manifiesto la importancia de la GS2 en
distintos procesos tales como la respuesta a sequía [1] y la reasimilación de
amonio fotorrespiratorio [2], estableciendo las múltiples interconexiones
tanto de la GS2, como de la sequía y la fotorrespiración, con distintos
procesos metabólicos de la célula. El hecho de que muchos de los cambios
observados sean comunes para los distintos procesos examinados sugiere
que la GS2 media en la respuesta a diferentes situaciones de estrés como
el producido por la sequía ó por la existencia de un ciclo fotorrespiratorio
incompleto en las plantas. Otros estudios más recientes utilizando redes de
coexpresión han identificado posibles factores de transcripción que pueden
tener papeles clave en la respuesta de las plantas [3].
Bibliografía
[1] Díaz P, Betti M, Sánchez DH, Udvardi MK, Monza J, Márquez AJ
(2010) New Phytol. 188, 1001-1013.
[2] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi M,
Kopka J, Márquez AJ, Betti M (2013) Plant Physiol. 162, 1834-1848.
[3] Pérez-Delgado CM (2014) Tesis Doctoral, Universidad de Sevilla.
Agradecemos la financiación del proyecto P10-CVI-6368 y BIO-163 de
la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, y
Plan Propio Universidad Sevilla.
P12-12 (R12-11)
THB1, una hemoglobina truncada regulada por
nitrógeno, modula los niveles de óxido nítrico
(NO) y la actividad NR en Chlamydomonas
Francisco Javier Ocaña Calahorro, Emanuel Sanz Luque, Aurora
Galván Cejudo, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad
de Córdoba, Córdoba, ES
La gran familia de hemoglobinas está presente en todos los organismos
vivos. Durante mucho tiempo, se ha relacionado a estas proteínas con el
transporte y almacenamiento de oxígeno. Sin embargo, su participación
en diferentes procesos fisiológicos y una emergente variedad de funciones,
le confieren una gran importancia, aunque la mayoría de ellas son todavía
poco conocidas. En los últimos años, se ha relacionado a las hemoglobinas
con la degradación del NO, que está implicado en multitud de procesos de
señalización celular, de esta manera se evitarían posibles efectos tóxicos
del NO debido a su acumulación. En el alga verde Chlamydomonas
reinhardtii, encontramos la mayor familia de hemoglobinas truncadas
descritas hasta la fecha (THB1 -12). En este trabajo, se describe cómo
dos de ellas (THB1 y THB2) están reguladas por la fuente de nitrógeno
y el factor de transcripción NIT2, que controla gran parte de los genes
implicados en la asimilación de nitrato en el alga (transportadores y
reductasas específicas). También se muestra cómo THB1 se sobreexpresa
en presencia de NO y cómo es capaz de convertir in vitro el NO en nitrato.
Además, se caracteriza cómo la nitrato reductasa está implicada de manera
115
Pósters
muy eficiente en la reducción de la THB1 necesaria para su actividad, y
cómo su represión produce un aumento de la actividad NR. Por lo tanto,
sugerimos en este trabajo, que esta hemoglobina controla los niveles de NO
e inhibe la actividad NR simultáneamente.
P12-13 (R12-6)
Estudio mediante técnicas “ómicas” del papel
señalizador de la glutamina sintetasa plastídica
en el metabolismo de la leguminosa modelo
Lotus japonicus
Margarita García-Calderón, Jesús Giráldez, Carmen M. Pérez-
Delgado, Marco Betti, Antonio J. Márquez
Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad
de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
El mutante fotorrespiratorio Ljgln2-2 de la leguminosa modelo Lotus
japonicus es deficiente en la enzima glutamina sintetasa plastídica
(GS2), siendo incapaz de reasimilar el amonio fotorrespiratorio cuando
se cultiva en condiciones de aire (fotorrespiración activa) [1]. Cuando
el mutante se cultiva bajo una atmósfera de alto CO2, la planta no realiza
la fotorrespiración, suprimiendo el efecto de la deficiencia en GS2 en
este proceso. Para analizar si la GS2 pudiera estar implicada en otros
aspectos del metabolismo de la planta además de en la fotorrespiración,
se utilizaron técnicas “ómicas” en el estudio de plantas silvestres y
mutantes bajo condiciones de alto CO2. En plantas en simbiosis con
Mesorhizobium loti, genes correspondientes al metabolismo del
almidón y sacarosa y metabolismo de aminoácidos mostraron menor
expresión en plantas mutantes respecto a WT. Los resultados sugieren
que en plantas noduladas, la deficiencia en GS2 conlleva alteraciones
en la expresión de genes del metabolismo del C y N, sugiriendo un
papel de la GS2 en la señalización del balance C/N en plantas de L.
japonicus. Estudios de co-expresión han permitido establecer la
relación de la GS2 con el metabolismo del C, compatible con otros
resultados anteriormente obtenidos sobre la deficiencia en nodulación
de mutantes Ljgln2-2 [2].
Bibliografía
[1] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi MK,
Kopka J, Márquez AJ, Betti M. 2013. Plant Physiol. 162, 1834-48.
[2] García-Calderón M, Chiurazzi M, Espuny MR, Márquez AJ. 2012.
MPMI 25, 211-9.
Agradecemos la financiación de la Consejería de Economía, Innovación y
Ciencia de la Junta de Andalucía (proyecto P10-CVI-6368 y BIO-163) y
Plan Propio Universidad de Sevilla.
P12-14 (R12-4)
Biosíntesis de fenilalanina en coníferas:
caracterización de la familia arogenato
dehidratasa de Pinus pinaster
Jorge El-Azaz Ciudad, Fernando de la Torre, Concepción Ávila,
Francisco M. Cánovas
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de
Málaga, Málaga, ES
En las plantas, la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos tirosina (Tyr)
y fenilalanina (Phe) tiene lugar en los cloroplastos a través de la ruta del
prefenato, que tiene su origen en la ruta del siquimato. En la ruta del prefenato,
la biosíntesis de Phe tiene lugar mediante dos reacciones consecutivas:
la primera de ellas consiste en la conversión de prefenato en arogenato a
través de una reacción de transaminación (actividad prefenato-arogenato
aminotransferasa, PAT) y posteriormente la transformación del arogenato en
Phe (actividad arogenato dehidratasa, ADT). Muy recientemente, dos nuevas
publicaciones han aportado evidencias respecto a la existencia de una vía
116
XXXVII Congreso SEBBM
alternativa de biosíntesis de Phe, que no dependería de arogenato (Yoo et
al., 2013; de la Torre et al., 2014). En esta ruta alternativa el prefenato sería
transformado en fenilpiruvato a través de la enzima prefenato dehidratasa
(PDT). El fenilpiruvato producido en esta reacción sería posteriormente
convertido en Phe a través de una transaminasa de aminoácidos aromáticos.
Una particularidad de especial interés es el hecho de que las actividades ADT
y PDT se encuentran en las mismas proteínas en Arabidopsis thaliana (Cho
et al., 2007).
En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha estado trabajando
en la ruta del prefenato, centrados principalmente en la enzima PAT de
Pinus pinaster, y más recientemente en la caracterización de familia de
las ADT en esta misma especie. La presente comunicación desarrolla el
trabajo de caracterización que estamos realizando en la familia de genes
ADT/PDT de P. pinaster, integrada por al menos 9 genes candidatos
presentes en el transcriptoma de esta especie (Canales et al., 2013).
Estos genes candidatos presentan patrones de expresión característicos
y dependientes del órgano y el estadio de desarrollo de la planta. De
estos 9 genes, 3 de ellos forman un grupo filogenético característico
de gimnospermas. Los objetivos de nuestro trabajo se encuentran
actualmente enfocados en la caracterización funcional de este grupo de 3
genes ADT/PDT característicos de coníferas.
Bibliografía
Canales J, et al. (2013). Plant Biotechnol J. 12(3):286-99.
Cho MH, et al. (2007)J Biol Chem. 282(42):30827-35.
De la Torre F, El-Azaz J, Ávila C and Cánovas FM. (2014). Plant Physiol.
164(1):92-104.
Yoo H, et al. (2013). Nat Commun. 4:2833.
P12-15 (R12-5)
Efectos de elevados niveles de CO2 y nitrato
durante el desarrollo de las hojas primarias
de girasol
Francisco José Canales Castilla, Purificación De la Haba, Elisabeth
Barrientos, Lourdes de la Mata, Eloísa Agüera
Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Facultad
de Ciencias, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES
Se ha estudiado el efecto de elevados niveles de CO2 y nitrato sobre el
desarrollo de las hojas primarias de girasol. Las plantas se cultivaron 42
días con CO2 ambiental (400 mL L-1) y 10 mM de nitrato (C10), CO2
ambiental y 25 mM de nitrato (C25) y elevado CO2 (800 mL L-1) y 25 mM
de nitrato (T), en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad
relativa, recolectándose el primer par de hojas a los 16, 22, 32 y 42 días.
Los resultados indican que algunos procesos metabólicos son sensibles a
la alta concentración de CO2 y nitrato durante la ontogenia de las hojas
primarias de girasol. Así, las plantas cultivadas con elevada concentración
de CO2 mostraron un mayor crecimiento que las plantas cultivadas con CO2
ambiental, como refleja la determinación del peso seco (PS) de la planta
completa, PS y área foliar así como la determinación de la masa foliar
específica (SLM). La elevada concentración de CO2 y nitrato (T) aumentó
significativamente la fijación fotosintética de CO2 en las hojas en relación
con la concentración de CO2 ambiental (C10 y C25), principalmente en
hojas de jóvenes. El contenido en pigmentos fotosintéticos disminuyó
con el desarrollo de la hoja en todos los tratamientos, especialmente con
elevados CO2 y nitrato (T), produciéndose la mayor disminución entre
los 28 y 42 días. Estos resultados sugieren que el elevado CO2 acelera
la degradación de pigmentos fotosintéticos y posiblemente también la
senescencia de la hoja. En los tres tratamientos, se genera un importante
estrés oxidativo durante la senescencia de hojas primarias de girasol,
como se revela por la acumulación de H2O2, siendo esta acumulación más
elevada en plantas crecidas con elevado CO2, y elevado nitrato. En hojas
senescentes el incremento en los niveles de H2O2 ocurrió en paralelo con
una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes (catalasa
y ascorbato peroxidasa). Nuestro resultados indican que una elevada
exposición a CO2 puede provocar estrés oxidativo debido a la disminución
Granada 2014
en la actividad de enzimas antioxidantes posiblemente como consecuencia
de un incremento de la carbonilación de proteínas (Qui et al. 2008.
Photosynth Res 97: 155-66).
Agradecimientos: Investigación financiada por la Junta de Andalucía
Grupo de Investigación BIO-0159).
P12-16
Regulación de enzimas esenciales en el
metabolismo de H. mediterranei en función
de la fuente de nitrógeno
Anna Vegara, Catalina Ruíz, Mónica Camacho, Julia Esclapez,
Vanesa Bautista, María José Bonete
División de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de
Alicante, Alicante, ES
Haloferax mediterranei es una arquea halófila extrema que puede utilizar
diferentes fuentes de nitrógeno inorgánicas u orgánicas para su crecimiento.
Este microorganismo posee dos genes (glnK1 y glnK2) que codifican
proteínas de transducción de señales altamente conservadas, ambas
pertenecientes a la superfamilia de las PII. Estas proteínas reguladoras
actúan en la célula para que pueda adaptarse a las diferentes condiciones
del medio; perciben señales del balance entre carbono y nitrógeno,
modificando la actividad de las principales enzimas implicadas en los
ciclos de dichos elementos. Con la generación de mutantes knockout en
H. mediterranei deficientes en los genes glnK1 y glnK2, mediante estudios
fisiológicos y ensayos enzimáticos, se ha estudiado cómo afecta la ausencia
de estas proteínas reguladoras a la actividad de enzimas clave como son
glutamina sintetasa, isocitrato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa.
Los resultados sugieren que la actividad isocitrato deshidrogenasa regula la
ruta de asimilación de amonio, ya que un aumento de su actividad produce
una disminución de la de glutamato deshidrogenasa. Además, las dos
proteínas PII ejercen la misma función de activación sobre la actividad de
glutamina sintetasa.
P12-17
Efecto del cianuro sobre la expresión génica
de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
Gracia Becerra, María Isabel Igeño, María Isabel Carmona, María
Isabel Guijo, Faustino Merchán, Rafael Blasco Plá
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética,
Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres, ES
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria que se
aisló por su capacidad de utilizar cianuro como fuente de nitrógeno. El
análisis trascriptómico (RNA-seq) de la respuesta global a cianuro de la
cepa CECT 5344 en medio mínimo ha puesto de manifiesto que la mayoría
de los genes regulados positivamente por cianuro están relacionados con
procesos que ya han sido previamente descritos en el mismo contexto,
pero utilizando otras aproximaciones experimentales. Así, la presencia de
cianuro induce la expresión de operones implicados en el metabolismo
del nitrógeno (cianato, aminoácidos y nitrilos), en la respuesta al estrés
oxidativo y en la respiración insensible a cianuro (oxidasas terminales).
El cianuro induce también la expresión de un nuevo grupo de genes
probablemente involucrados en la degradación de compuestos aromáticos.
Los genes regulados negativamente codifican proteínas pertenecientes a
tres categorías: proteínas ribosómicas, transportadores (fosfato y sulfato)
y proteínas implicadas en el metabolismo energético (ciclo de Krebs y
fosforilación oxidativa). Estos resultados se han validado por q-PCR. El
papel de los nuevos genes implicados en el metabolismo del cianuro, y no
descritos hasta la fecha, se analizará mediante mutagénesis dirigida.
La mayoría de los genes cuya expresión varía en respuesta a cianuro en
medio mínimo también lo hace, y en el mismo sentido, en medio LB. Sin
embargo, existen genes cuya expresión varía dependiendo de que el medio
Pósters
sea mínimo o rico. Entre ellos destacan algunas de las oxidasas terminales y
otros genes que podrían proporcionar pistas acerca de la ruta de asimilación
del cianuro.
Los autores agradecen la financiación de este trabajo por parte del
Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO2011-30026-C02-01), del
Gobierno de Extremadura (GR10165) y FEDER 2007-2013. D. Macías
agradece la beca concedida por el Programa de captación y formación de
recursos humanos de excelencia en investigación, desarrollo e innovación
2010 de la UEX cofinanciado a su vez por la Junta de Extremadura. Los
autores agradecen la ayuda técnica de G. Gutiérrez.
P12-18
Papel de Trk1 y de la fuente de nitrógeno en
la regulación del transportador de K+ Hak1 en
levaduras
Norberto Escudero*1, María C. Álvarez2, José Ramos2, José M.
Siverio*1
1
Departamento de Bioquímica, Universidad de La Laguna,
La Laguna, ES, 2Departamento de Microbiología, Universidad de
Córdoba, Córdoba, ES
La levadura Hansenula polymorpha presenta dos transportadores de K+;
Hak1, de alta afinidad y regulado por los niveles de K+; y Trk1, de baja
afinidad y constitutivo. HAK1 es inducido a bajas concentraciones de K+.
La fuente de nitrógeno también afecta los niveles de Hak1. La presencia de
concentraciones elevadas de K+ desencadena la endocitosis y degradación
vacuolar de la permeasa. La deleción del gen TRK1 desregula HAK1. En
una cepa Δtrk1, los niveles tanto del gen (HAK1) como de la permeasa
(Hak1) son más altos que en la cepa silvestre. Los mutantes Δtrk1 son
hipersensibles a Li+ y Na+; y los elevados niveles de Hak1 son regulados
a la baja sólo en concentraciones superiores a 50 mM K+. Nuestros
resultados sugieren que Trk1 podría actuar como un sensor de K+ en la
levadura por mecanismos que desconocemos. La sobreexpresión de TRK1
podría aportar pistas a este respecto. Para ello hemos creado una cepa en la
que TRK1 se expresa bajo el promotor del gen de la nitrato reductasa YNR1.
Resultados muy preliminares indican que los niveles de Hak1 son bajos en
medios con bajo K+.
P13. Neurobiología molecular
P13-1 (R13-3)
APC/C-Cdh1 coordinates neurogenesis
and cortical size during development
María Delgado Esteban1, Irene García-Higuera2, Sergio Moreno2,
Ángeles Almeida1
1
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL,
Hospital Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL -
Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad
de Salamanca, IBSAL , Salamanca, ES, 2Instituto de Biología
Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca,
IBSAL, Salamanca, ES
The morphology of the adult brain is the result of a delicate balance
between neural progenitor proliferation and the initiation of neurogenesis
in the embryonic period. Here we assessed whether the anaphase-
promoting complex/cyclosome (APC/C) cofactor, Cdh1— which regulates
mitosis exit and G1-phase length in dividing cells—regulates neurogenesis
in vivo. We use an embryo-restricted Cdh1 knockout mouse model and
show that functional APC/C-Cdh1 ubiquitin ligase activity is required for
both terminal differentiation of cortical neurons in vitro and neurogenesis
in vivo. Further, genetic ablation of Cdh1 impairs the ability of APC/C to
117
Pósters
promote neurogenesis by delaying the exit of the progenitor cells from the
cell cycle. This causes replicative stress and p53-mediated apoptotic death
resulting in decreased number of cortical neurons and cortex size. These
results demonstrate that APC/C-Cdh1 coordinates cortical neurogenesis
and size, thus posing Cdh1 in the molecular pathogenesis of congenital
neurodevelopmental disorders, such as microcephaly.
This work was funded by FEDER (European regional development fund)
and Instituto de Salud Carlos III (PI12/00685; RD06/0026/1008 and
RD12/0014/0007).
P13r-2
Mitochondrial supercomplexes assembly explains
differences in reactive oxygen species production
between neurons and astrocytes
Irene López Fabuel, Juan Pedro Bolaños
Instituto de Biología Funcional y Genómica, Salamanca, ES
Understanding the physiological roles of reactive oxygen species (ROS) in
the brain requires dissecting out the contribution of each of the four different
neural cell types to ROS formation. Here, the abilities of mitochondria
isolated from rodent neurons and astrocytes, the most abundant brain cell
types, to spontaneously form ROS were characterized. We found that ROS
production is about one order of magnitude higher in astrocytes than in
neurons. This observation is intriguing in view of the widely held notion
that astrocytes, which express high levels of antioxidants, are efficient ROS
detoxifiers. We also found that the main source of ROS in both cell types
is the mitochondrial electron transport chain, but the difference is ROS
production cannot be accounted by the relative abundance of total complex
I, a major superoxide anion source within mitochondria. Furthermore, the
high ROS production by astrocytes is conserved amongst several rodents,
including Wistar rat and C57BL6 mice. In view that the mitochondrial
supercomplex assembly factor, SCAFI, is not functional in C57BL6 mice,
we conclude that the high ROS production in astrocytes is not due to a
putative differential expression of this assembly protein. Interestingly, we
found that in astrocytes a large proportion of complex I protein occurs free,
whereas in neurons most complex I is part of supercomplexes. We conclude
that this differential complex I assembly into supercomplexes explains the
high mitochondrial ROS production by astrocytes. These results suggest
cell-specific physiological roles for mitochondrial ROS in the brain.
P13r-3
Understanding ApoD neuroprotective function:
modulation of glial ApoD subcellular traffic upon
metabolic and oxidative stress
Raquel Pascua-Maestro1, María Dolores Ganfornina2, Diego
Sánchez2
1
Estudiante de doctorado, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y
Fisiología / IBGM – Universidad de Valladolid / CSIC, Valladolid, ES,
2
Profesor titular, Valladolid, ES
Apolipoprotein D (ApoD) is expressed in the nervous system, increases
with aging and neurodegeneration, and is induced in response to
serum deprivation or oxidative stress. To understand how ApoD traffic
through different subcellular compartments affects glial cells protecting
mechanisms, we analyze the time course of ApoD subcellular traffic upon
exposure to low-serum and paraquat stimuli in a human astroglioma cell
line.
During treatment, the spatial pattern of ApoD reorganizes from large
intracellular perinuclear organelles to a dotted surface pattern, indicative of
engagement in intracellular vesicles followed by a second phase of action
on the membrane. A small fraction of ApoD locates in the endoplasmic
reticulum and Golgi apparatus. Both signals are independent of the
118
XXXVII Congreso SEBBM
experimental conditions. We also detect ApoD in the extracellular medium,
indicating secretion to the extracellular space.
Culture growth and metabolic or oxidative stress alters caveolae and
endosome distribution. The intracellular localization of ApoD indicates
that secretion is followed by interaction with the plasma membrane,
caveolin-dependent endocytosis, and location in endosomes. No ApoD is
immunodetected in mitochondria. Interestingly, an important fraction of
ApoD is located in lysosomes. Large LAMP2-ApoD-positive organelles
indicate ApoD presence in autophagolysosomes which is confirmed
by co-localization with LC-3. ApoD presence inside lysosomes and
autophagolysosomes is stable over time, suggesting an active role in
autophagy.
Previous hypotheses on ApoD neuroprotective roles in glial cells must be
refined: control of plasma membrane and of the lysosome/autophagosome
function must be key elements in the function of this lipid-binding protein.
Support: MICINN (BFU2011-23978), JCyL (VA180A11-2).
P13-4 (R13-1)
Molecular mechanisms underlying Parkinson´s
disease: LRRK2 takes centerstage
Sabine Hilfiker
CSIC, Granada, ES
Mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are the
most common cause of familial Parkinson´s disease (PD), and risk
factor variants increase the risk for sporadic PD. However, despite the
importance of LRRK2 for the pathogenesis of both familial and sporadic
versions of the disease, its biological function, and the mechanism(s)
by which pathogenic mutations cause neurodegeneration in PD remain
largely unknown. LRRK2 is a large multi-domain containing protein
with various protein-interaction domains, a GTPase and a protein kinase
domain. Altered catalytic activity correlates with neurotoxicity, indicating
that targeting those activities may provide clues as to novel therapeutic
strategies for LRRK2-linked PD. However, the cellular readout(s) of such
altered catalytic activities remain largely unclear. Recent cell biological
studies have started to highlight possible early cellular events which
are altered in the presence of pathogenic LRRK2. These events include
alterations in endocytosis, autophagy, retromer-mediated trafficking
from late endosomes to the Golgi, and Golgi integrity. How mutant
LRRK2 may induce such divergent effects on intracellular membrane
trafficking pathways remains unclear, and may involve a large variety of
distinct molecular mechanisms. Alternatively, since membrane trafficking
pathways are highly interconnected and interdependent, a small number of
LRRK2-mediated cellular alterations may give rise to the wide spectrum
of vesicular trafficking alterations. I will present our data on the role of
pathogenic LRRK2 in regulating Rab protein activities which can account
for the majority of the observed cellular alterations.
P13r-5
The human Tp53 Arg72Pro polymorphism
modulates neuronal vulnerability to amyloid-beta
neurotoxicity
Rebeca Lapresa Ruiz de Gauna, María Delgado Esteban, Ángeles
Almeida Parra
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital
Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL - Instituto
de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de
Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES
Alzheimer´s disease (AD) is the most common form of dementia in the
elderly. AD is a neurodegenerative disorder of the Central Nervous System
characterized by an altered amyloid-beta (Ab) metabolism, leading to
deposition of Ab peptides into neuritic plaques, tau hyperphosphorylation,
Granada 2014
which forms neurofibrillary tangles, neuroinflammation and the
degeneration of synapses and neurons in the hippocampus and cortex,
regions implicated in learning and memory.
It has been described that p53 plays an essential role in this neurodegeneration
process [1]. The p53 protein naturally occurs in humans in two variants
with single nucleotide polymorphism (SNP) resulting in Arg or Pro at
residue 72. This SNP occurs in the proline-rich domain of this protein,
which regulates its apoptotic activity [2]. Recently, we have demonstrated
that the Arg72-p53 genotype increases neuronal susceptibility to ischemia-
induced apoptosis [3].
The objective of this study was to determine the role of p53 Arg72Pro
polymorphism on the susceptibility of neurons to Ab-induced
neurodegeneration and its potential role as a genetic biomarker for AD risk.
We used cortical neurons in primary culture from wild-type (wt) mice and
both knockout p53 mice (KOp53) and Knock-in human p53, expressing
either p53Pro or p53Arg. Neurons were then incubated in culture medium
containing either 10 μM Ab(25-35), the active fragment of Ab, or 10 μM
Ab(35-25), the inactive form, for 24 hours. We analysed protein expression
levels by Western Blot and mitochondrial function and apoptosis by flow
cytometry.
We first found that Ab promoted p53 stabilisation in cortical neurons.
Moreover, genetic depletion of p53 prevented Ab-induced mitochondrial
depolarization and neurodegeneration, suggesting that p53 might play an
important role in AD. Furthermore, we observed that the polymorphic
variant p53Arg increased the susceptibility of neurons to mitochondrial
depolarization and the subsequent apoptosis caused by Ab, in comparison
to the p53Pro one. Thus, p53 Arg72Pro polymorphism modulates the
susceptibility of neurons to Ab neurotoxicity and could determine the
extent of brain damage in AD. These results pose Tp53 Arg72Pro SNP as a
good biomarker candidate for AD risk.
This work was funded by FEDER, ISCIII (PI12/0685, RD12/0014/0007)
and Junta de Castilla y León. R. Lapresa was funded by MECD (Ministerio
de Educación, Cultura y Deporte, becas FPU).
Bibliografía
[1] Lanni C, Racchi M, Memo M, Govoni S and Uberti D (2012) Free
Radic Biol Med 52:1727-1733.
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[3] Gomez-Sanchez JC, Delgado-Esteban M, Rodriguez-Hernandez I,
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R, Castillo J and Almeida A (2011) J Exp Med 208:429-437.
P13-6
Cdh1 is essential for neurite outgrowth and
synaptic plasticity in the adult brain in vivo
Verónica Bobo Jiménez, María Delgado Esteban, Juan Pedro
Bolaños Hernández, Ángeles Almeida Parra
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL -
Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, Centro Superior
de Investigaciones Científicas-CSIC/Universidad de Salamanca-
USAL, Salamanca, ES
The E3 ubiquitin ligase APC/C (Anaphase Promoting Complex/Ciclosome)
is a multi subunit complex that regulates progression from metaphase to
anaphase, exit from mitosis and G1 maintenance in proliferating cells.
To be active, APC/C requires the binding of either one of two activators:
Cdc20 or Cdh1. Neurons are postmitotic cells that undergo an active
downregulation of cell cycle-related proteins to survive. However,
neurons retain the ability to activate the cell cycle machinery in response
to pathological circumstances, including both acute injury and chronic
neurodegenerative disorders. Recently, we described that Cdh1 is the main
activator of APC/C in cultured cortical neurons. Moreover, APC/C-Cdh1
is essential for neuronal survival in vitro, as it prevents the activation of
the cell cycle machinery and the subsequent neuronal apoptosis. Here we
Pósters
assessed whether Cdh1 regulates neuronal survival in vivo by generating
mice lacking Cdh1 from excitatory neurons of the adult forebrain.
These animals were viable but exhibited a severe impairment in neurite
outgrowth and arborisation, leading to synapse loss and neurodegeneration
in the adult cerebral cortex and hippocampal CA1 region. Moreover,
Cdh1 loss induced basal anxiety and spatial learning and memory deficits.
Our results demonstrate that Cdh1 is essential for neurite outgrowth and
synaptic plasticity in the adult brain and supports the role of APC/C-Cdh1
in neuronal integrity and survival.
Funded: Instituto de Salud Carlos III (PI12/0685 and RD12/0014/0007),
Junta de Castilla y León (GRS244/A/08 and GREX206), Ministerio de
Ciencia e Innovación (SAF2010-20008) and Fundación Miguel Casado
San José.
P13r-7
Papel regulador de Wrap53 en la isquemia
cerebral
Irene Sánchez Morán, Cristina Rodríguez, Ángeles Almeida
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital
Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL, Salmanca -
Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad
de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES
Durante la isquemia cerebral se interrumpe el aporte de glucosa y oxígeno
a la región cerebral afectada, lo que desencadena una compleja cascada de
señalización celular, denominada “cascada isquémica”, que culmina en la
muerte neuronal. Se ha descrito que la proteína supresora de tumores p53
está implicada en la muerte neuronal isquémica [1]. En los últimos años se
han identificado RNAs
reguladores que desempeñan un importante papel en el control de la
expresión de genes eucariotas [2]. Wrap53 es un cis-NAT (Natural
Antisense Transcript) que se localiza en el cromosoma 17p13 y solapa
con la región 5’UTR de p53. Se ha descrito que los transcritos de Wrap53
controlan la expresión de p53 al interferir con la región solapante [3]. Es
más, se han identificado varios SNP (single nucleotide polymorphisms) en
Wrap53, específicos de humanos, que afectan a la capacidad de regulación
de los niveles de p53.
En el presente trabajo nos propusimos estudiar la posible función de
Wrap53 en la regulación de la expresión de p53 en neuronas, tras el insulto
isquémico. Además, hemos analizado la asociación entre SNP de Wrap53
(rs2287498 y rs2287497) y el estado funcional de pacientes de ictus
isquémico. La expresión de Wrap53 y p53 se analizó mediante RT q-PCR
en neuronas corticales y células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y)
diferenciadas sometidas a 90 minutos isquemia experimental (deprivación
de oxígeno y glucosa). Los estudios clínicos se realizaron en una cohorte
de pacientes de ictus isquémico procedente del Hospital Universitario de
Salamanca. El estado funcional de los pacientes se evaluó a los 3 meses del
ictus, mediante la escala de Rankin modificada.
Nuestros resultados mostraron que los niveles de Wrap53 y p53 no
variaron significativamente durante la isquemia. Sin embargo, observamos
un incremento significativo en los niveles de Wrap53 a las 24 horas tras
el insulto isquémico. El análisis genómico reveló que el SNP rs2287498
modula el estado funcional de pacientes de ictus, de manera que pacientes
que portan el alelo T presentan peor pronóstico funcional a los 3 meses del
infarto cerebral.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que Wrap53, NAT de p53,
podría estar modulando la susceptibilidad de las neuronas a la isquemia. Es
más, el estado funcional de pacientes de ictus isquémico está condicionado
por el SNP rs2287498 de Wrap53, de manera que hemos identificado un
nuevo biomarcador genético de pronóstico en ictus.
El trabajo ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III
(PI12/0685;RD12/0014/0007), la Junta de Castilla y León y el FSE (ISM).
119
Pósters
Bibliografía
[1] Hong LZ, et al. (2010) Neurosci Bull 26:232-240.
[2] Watanabe T, et al. (2008) Nature 453:539-543.
[3] Mahmoudi et al. (2009) Molcel 33, 462-471.
P13-8
La expresión génica de receptores de adenosina
y metabotrópicos de glutamato en cultivos
primarios de neuronas se modula por glutamato y
un derivado hidrosoluble de C60 fulereno
Davide Giust1, Tatiana Da Ros2, Mairena Martín3, José Luis
Albasanz3
1
Institute of Inflammation and Repair, University of Manchester,
Manchester, UK, 2Dipartimento di Scienze Chimiche e
Farmaceutiche, Università degli Studi di Trieste, Trieste,
IT,3Departamento de Química Inorgánica, Orgánica y Bioquímica,
Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas / Facultad de
Medicina de Ciudad Real, Centro Regional de Investigaciones
Biomédicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real, ES
A concentraciones fisiológicas el glutamato, como principal neurotransmisor
excitador, participa en procesos de aprendizaje y memoria a través de receptores
ionotrópicos y metabotrópicos. Sin embargo, a elevadas concentraciones actúa
como una neurotoxina, principalmente a través de receptores ionotrópicos,
produciendo degeneración y muerte celular propia de muchas enfermedades
neurodegenerativas. Los niveles de glutamato se regulan, entre otros, por la
acción del nucleósido adenosina sobre sus receptores, inhibiendo su liberación,
a través de receptores A1, o estimulando la misma, a través de receptores
A2A. En el presente trabajo se estudió el efecto del L-Glutamato (L-Glu) en
la arquitectura celular y en la expresión de los receptores de adenosina y
metabotrópicos de glutamato; así como el posible papel neuroprotector del
t3ss, un derivado hidrosoluble del C60 fulereno. El estudio se llevó a cabo
usando cultivos primarios de neuronas que fueron tratadas con L-Glu y t3ss. Se
determinó la viabilidad celular por el método de MTT, se valoró la expresión
de las proteínas MAP-2 y NEFH por inmunohistoquímica y se cuantificaron
los genes que codifican los mGluR y AdoR por PCR cuantitativa en tiempo
real. Los resultados mostraron que el L-Glu causaba muerte neuronal que
revertía en presencia de t3ss. Este derivado hidrosoluble de fulereno modulaba
los receptores mGlu y Ado en las mismas condiciones en las que revertía el
efecto tóxico del L-Glu. Por tanto, los resultados sugieren que el fulereno
protege las neuronas de la excitotoxicidad en un proceso que parece estar
asociado a la modulación de la expresión génica de los receptores de adenosina
y metabotrópicos de glutamato.
P13-9 (R13-4)
Effect of alpha-synuclein pathological mutations
and post-translational modifications on stability
and survival on neurons in situ
Ignacio Iñigo1, Iker Zuriguel2, Laura Larrea3, María Esther Luquin3,
Rafael Aldabe3, Montserrat Arrasate3
1
Center for Applied Medical Research-CIMA, Graduate Program
on Neuroscience and Cognition, School of Medicine, University of
Navarra, Pamplona, ES, 2School of Sciences, University of Navarra,
Pamplona, ES, 3Center for Applied Medical Research-CIMA,
University of Navarra, Pamplona, ES
Alpha-synuclein (a-syn) is a presynaptic protein with a key role on
neurodegenerative disorders like Parkinson´s disease (PD) and dementia
with Lewy Bodies (DLB). Although 90% of PD cases are sporadic,
mutations on the gene encoding a-syn (SNCA) cause autosomal
dominant PD. Indeed, duplications and triplications of SNCA gene cause
parkinsonism with prominent dementia linking a-syn levels with neuronal
death. Yet, the mechanisms that regulate a-syn steady-state levels on
sporadic and familial PD cases with point mutations on the SNCA coding
120
XXXVII Congreso SEBBM
region remain unclear. It has been hypothesized that point mutations and/
or post-translational modifications on a-syn alter the stability of the protein
leading to an increase of its steady-state levels and eventually to neuronal
death. We have set up a microscope-based methodology to longitudinally
track individual neurons and determine the risk of neuronal death induced
by wild-type (wt) and mutant versions of a-syn. Furthermore, to determine
the stability of wt and mutant versions of a-syn in living neurons we
have applied a novel optical pulse-chase methodology based on the
photoswitchable protein Dendra2 and longitudinal analysis to measure
its half-life on neurons in situ. Among the pathological a-syn mutations,
the E46K mutation increases significantly the risk of neuronal death on
primary cortical neurons. Post-translational modifications modulate a-syn
dependent neuronal death risk. We are currently analyzing whether these
effects are associated with a change on the stability of the protein.
Supported by: FP7-Marie Curie IRG (Project ID:224849), MINECO
(BFU2012-39737), Ramón y Cajal Program MICINN (RYC2008-0325)
and UTE project CIMA.
P13-10
Análisis de la expresión de SERCA2 en cerebros
humanos afectados por la enfermedad de
Alzheimer
M. Rosario Sepúlveda1, Julio Navascués1, Ana M. Mata2
1
Depto. Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de
Granada, Granada, ES, 2Depto. Bioquímica y Biología Molecular
y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura,
Badajoz, ES
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que
se caracteriza por una pérdida progresiva de memoria y una decadencia
cognitiva. Esta neurodegeneración está asociada a la presencia de placas
seniles de péptido β-amiloide y ovillos neurofibrilares de tau, así como a
una alteración en la homeostasis del Ca2+ intracelular. Entre los mecanismos
reguladores del Ca2+ neuronal se encuentra la Ca2+-ATPasa de retículo
sarco(endo)plásmico (SERCA), que transporta Ca2+ del citoplasma al interior
del retículo a expensas de la hidrólisis de ATP. En este trabajo se ha analizado
la expresión de SERCA2 mediante inmunohistoquímica en secciones de
cerebros humanos sanos y afectados por la enfermedad de Alzheimer. Los
resultados mostraron localización de esta proteína en el soma de neuronas
en ambas muestras, y una elevada expresión en otro tipo celular no neural
principalmente en los cerebros afectados. Se realizaron ensayos con
marcadores específicos de astrocitos y microglía, células que cada vez son
consideradas más relevantes en la patogénesis de la enfermedad. Nuestros
resultados sugieren una relación entre la sobreexpresión de SERCA y la
participación de la glía en la enfermedad de Alzheimer.
Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2011-
23313), Junta de Extremadura y FEDER (A.M.M); BFU2010-19981
(J.N.); CEI BioTic Granada mP_BS_35 (M.R.S.).
P13-11
CSP-alpha is essential to maintain
the quiescence of radial-glia like stem cells
in postnatal neurogenesis
Jose Luis Nieto-Gonzalez, Leonardo Gómez-Sánchez, Fabiola
Mavillard, Pedro Linares-Clemente, Jose Antonio Martinez-Lopez,
Ricardo Pardal, Rafael Fernandez Chacon
Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) HUVR/CSIC/Universidad
de Sevilla, Dpto. de Fisiología Médica y Biofísica and CIBERNED,
Sevilla, ES
Cysteine String Protein-α (CSP-α) is a synaptic co-chaperone that prevents
activity-dependent degeneration of nerve terminals. Mutations in the
Granada 2014
human CSP-α gene cause neuronal ceroid lipofuscinosis characterized by
progressive dementia and seizures. Synapses formed onto granule cells
by parvalbumin (PV)-expressing basket cells progressively degenerate in
CSP-α KO mice. Using electrophysiology in acute hippocampal slices,
we have found that the properties of GABA release from basket cells are
dysfunctional in CSP-α KO mice. In addition, at the dentate gyrus of CSP-α
KO mice, the number of calretinin-expressing neurons is significantly
increased. We have systematically used BrdU injections and specific
markers to uncover a severe deregulation of adult neurogenesis. We have
observed that the pool of radial-glia like stem cells becomes progressively
depleted due to hyper-proliferation, likely caused by a loss of stem cell
quiescence. Surprisingly, part of these alterations occurs before basket cell
synaptic dysfunction is established, suggesting that proliferation increase
is partly due to a cell autonomous mechanism. Indeed, in the absence
of CSP-α, although the number of neurospheres formed is much higher
during the first passages, this number progressively becomes much lower
than in controls. Our data are compatible with two types of alterations
in adult neurogenesis: circuit-independent and circuit (PV neurons)-
dependent mechanisms. Remarkably, our study uncovers an unanticipated
requirement of CSP-α to maintain the quiescence of radial-glia like cells in
postnatal neurogenesis.
P13-12
POMGnT1, a protein involved in muscle-eye-
brain disease, is located in the Golgi complex
in the mouse retina and 661W photoreceptors
Mary Luz Uribe1, Carmen Haro1, María Paz Ventero1, Laura
Campello1, Jesús Cruces2, José Martín Nieto1
1
Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Facultad
de Ciencias, Universidad de Alicante, Alicante, ES, 2Departamento
de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma
de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC,
IdiPAZ, Madrid, ES
The POMGNT1 gene, encoding protein O-linked mannose β1,2-N-
acetylglucosaminyltransferase 1, is associated with muscle-eye-brain
disease (MEB) and other dystroglycanopathies. Its lack of function or
expression causes hypoglycosylation of alpha-dystroglycan (α-DG) in
muscle and CNS (including brain and retina), where it catalyzes the
transfer of N-acetyl-glucosamine to O-mannosylated α-DG. MEB patients
ocular symptoms include retinal dysplasia and detachment, glaucoma
and abnormal electroretinogram. In this context, α-DG O-glycosylation
is known to be relevant for the establishment of functional synapses
between photoreceptors and their postsynaptic, bipolar cells in the retina.
Nonetheless, the POMGnT1 expression pattern in the normal mammalian
retina remains to be addressed.
In this work we have demonstrated by means of RT-PCR and
immunoblotting analyses that the POMGNT1 gene is expressed at the
mRNA and protein levels in all mammalian species studied, from rodents
to humans. Immunohistochemical studies have shown that it concentrates
in the myoid portion of mouse photoreceptor inner segments, where it
colocalizes with GM130, a Golgi complex protein marker. Its presence
in the Golgi has also been revealed in 661W cells, a mouse cone
photoreceptor immortalized cell line. However, and in contrast to retinal
tissue, POMGnT1 additionally accumulates in the nucleus in 661W
photoreceptors, where it colocalizes with POMT1 and POMT2, two
proteins known to form a heterodimer active in the O-linked addition
of mannose to (unglycosylated) α-DG. These results are suggestive that
POMGnT1 not only participates in the O-glycosylation of α-DG in the
Golgi complex, but also of other yet-to-be-identified proteins in the
nucleus of mouse photoreceptors.
Funding: Instituto de Salud Carlos III grant PI12/0157.
Pósters
P13-13
Alterations in age-dependent spatial segregation
of secretory vesicles upon treatments associated
with Parkinson´s disease
Mar Martínez Salvador, Elena Fernández, Sabine Hilfiker
Instituto de biomedicina López Neyra, CSIC, Armilla, ES
Neurons and neuroendocrine cells are packed with secretory vesicles,
only a few of which seem to be releasable upon appropriate stimuli.
Previous studies have shown that vesicles display functional and spatial
segregation according to age, whereby newly synthesized vesicles seem
to be preferentially released. Here, using various fluorescent cargo
proteins which change colour with time fused to either neuropeptides
or select neurotransmitter transporters, we evaluated effects of toxins
associated with Parkinson´s disease on secretory vesicle age and
distribution in dopaminergic cells in culture. We found alterations in the
percentage of old versus newly synthesized vesicles largely consistent
with previously observed toxin-induced effects on secretion and/or axonal
transport. Various reagents which modulate either proteasome function
or macroautophagy indicate that preferentially older secretory vesicles
are subject to degradation by autophagy (crinophagy). Similarly, older
vesicles seem to be preferentially excluded from neurites, indicating the
existence of a cellular mechanism able to distinguish vesicles according to
their age for their intracellular transport as well as degradation. Additional
studies underway are attempting to address whether proteins associated
with familial Parkinson´s disease also cause alterations in vesicle age with
implications for dopaminergic transmission.
P13-14
Increased intracellular iron load is associated
with lysosomal alterations and modulated by TPC
and TRPML2 channel regulation
Belén Fernández, Sabine Hilfiker
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Granada, ES
Iron dyshomeostasis has been shown associated with various
neurodegenerative diseases including Parkinson´s disease (PD), but the
underlying cellular mechanisms leading to eventual cellular demise remain
unclear. Here, we show increased iron content in postmortem samples from
PD patients as compared to age-matched controls. Artificially increasing
iron content in cultured dopaminergic neuronal as well as non-neuronal cells
causes increased apoptosis in a time- and dose-dependent manner, which
is most pronounced in dopaminergic cells. Under non-toxic conditions,
increasing iron content is associated with a pronounced proliferation of late
endosomal/lysosomal compartments, where iron seems to be preferentially
stored. Furthermore, increased intracellular iron load is associated
with increased oxidative stress and autophagy induction. Interestingly,
application of NAADP, an agonist of lysosomal TPC and TRPML
channels, potentiates cell death associated with increased cellular iron
content, whilst its antagonist Ned-19 inhibits the effects. Overexpression
of TPC1 and TPC2 potentiates cell death induced upon intracellular iron
increase, whilst the dominant-negative channel mutants are without effect.
NAADP triggers a large increase in cytosolic iron in TPC2-expressing
cells, indicating that iron is released from lysosomal stores in an NAADP-
mediated manner. Similar effects are observed with TRPML2, indicating
that both channels regulate iron release from lysosomal compartments.
Together, our data indicate that increased cellular iron load is associated
with an increase in lysosomal proliferation which may be a consequence
of enhanced iron storage in this organelle, and that iron release from acidic
stores involves TPC2 and TRPML2 channels in a manner regulatable by
NAADP and Ned-19. These data indicate that modulating lysosomal iron
storage and release capacities may be a beneficial therapeutic strategy for a
variety of disorders associated with iron dyshomeostasis.
121
Pósters
P13-15
El déficit en C-RAF incrementa la
neuroinflamación y la apoptosis en el receptor
auditivo tras exposición a estrés por ruido
Rocío de Iriarte Rodríguez1, Marta Magariños Sánchez2, Isabel
Varela-Nieto1, Ulf R. Rapp3
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, CSIC-
UAM - CIBERER, Unit 761, Instituto de Salud Carlos III , Madrid,
ES, 2Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”,
CSIC-UAM - CIBERER, Unit 761, Instituto de Salud Carlos III
- Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid ,
Madrid, ES, 3Department of Molecular Biology, Max-Planck-Institute
of Biochemistry, Madrid, ES
Las proteínas RAF son serina treonina quinasas pertenecientes a la
ruta RAS-RAF-MERK-ERK. Son esenciales para la proliferación,
supervivencia y diferenciación celular durante el desarrollo, y en la
homeostasis de los tejidos adultos. El déficit a homocigosis de CRAF es
una enfermedad rara sindrómica que cursa sordera neurosensorial en el
hombre (ORPHA648), observándose el mismo fenotipo en el ratón nulo
C-Raf-/-. En contraste, los animales heterocigotos C-Raf+/- no muestran
alteraciones funcionales ni anatómicas.
Nuestro objetivo ha sido estudiar sí el déficit parcial de C-Raf predispone
al daño auditivo. Para ello se ha utilizado como agente estresor el ruido y
ratones C-Raf +/+ y C-Raf +/- y se ha realizado el estudio comparado de
la neurofisiología (potenciales auditivos del tronco cerebral), la morfología
y citoarquitectura (histología, inmunofluorescencia, TUNEL) y niveles de
marcadores de tipo celular, proliferación, supervivencia e inflamación (RT-
qPCR y Western blotting).
Los ratones de ambos genotipos presentaron un incremento de 50 dB SPL en
el umbral auditivo inmediatamente tras la exposición al ruido. Los ratones
C-Raf +/+ recuperaron parcialmente la función auditiva 35 días después,
por el contrario, los ratones C-Raf+/- presentaron una pérdida auditiva
irreversible. Así mismo, mostraron un mayor daño celular y un aumento del
90% en el número de células apoptóticas. Las cócleas de los ratones C-Raf
+/- presentaron mayores niveles basales de activación de JNK que las de
C-Raf +/+. Ambos genotipos expuestos a ruido incrementaron la actividad
de ERK y de proteínas implicadas en la respuesta inflamatoria (p-JNK) en
la cóclea, así como en marcadores de apoptosis (PARP-1 fragmentado).
En resumen, nuestros resultados indican que el receptor auditivo mantiene
su función aun cuando los niveles de C-RAF estén disminuidos, pero que
se reduce su capacidad de recuperación tras la exposición a estrés.
Agradecimientos: RdI tiene un contrato asociado al proyecto SAF2011-
24391. El trabajo ha sido financiado con la ayuda de este proyecto y con
el FP7-AFHELO.
P13r-16
Specificity of cell-penetrating peptides based on
connexin43 and c-Src in glioma stem cells
Myriam Jaraíz Rodríguez, Marta Domínguez-Prieto, José M. Medina,
Arantxa Tabernero
Instituto de Neurociencias de Castilla y León-INCYL, Salamanca, ES
Glioma stem cells (GSCs) are thought to be responsible for tumor
initiation, relapse, and therapeutic resistance in gliomas, the most common
brain tumors. Connexin43 (Cx43), the main gap junction channel-
forming protein in astrocytes, is down-regulated in GSCs. Interestingly,
restoring Cx43 reverses GSC phenotype and consequently reduces their
tumorigenicity. Our previous work shows that the interaction of Cx43 with
c-Src is responsible for this antitumorigenic effect.
Aims: On this basis, we have designed several cell-penetrating peptides
(CPPs) containing different regions of Cx43 involved in c-Src interaction
and we have investigated their role on GSC proliferation and migration.
Methods: Human G166 GSCs, C6 rat glioma cells, neurons and astrocytes
cultures were treated with CPPs. Cell growth was analyzed by MTT.
122
XXXVII Congreso SEBBM
Migration was studied using wound-healing assays, Time-Lapse live-cell
Imaging and Immunocytochemistry.
Results: Our results show that CPPs are internalized and reduced the rate
of cell growth. Interestingly, the effects of CPPs are stronger in GSCs
compared to other type of cells. TAT sequence did not significantly change
the rate of growth.
Although several studies show that Cx43 increases cell migration, our
results indicate that the region of Cx43 that interacts with c-Src does not
exert this effect. In fact, the CPPs used in this study reduced the rate of
GSC migration and locomotion.
Conclusions: Our results indicate that c-Src plays an essential role in the
effects of Cx43 in GSCs proliferation and migration and suggest these
CPPs as promising therapies .
P13-17
Effect of Parkinson´s disease-associated LRRK2
mutations and kinase inhibition on microtubule
interactions
Marian Blanca Ramírez1, Elena Fdez2, Sabine Hilfiker2
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES, 2Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-
Neyra”, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la
Salud, Granada, ES
Mutations in LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) are associated
with both sporadic and familial Parkinson´s disease (PD). LRRK2 is
a large protein containing both GTPase and kinase activities. Various
studies indicate that LRRK2 interacts with microtubules and modulates
cytoskeletal functions by regulating microtubule dynamics. We find that
PD-related mutations in the GTPase domain, but not the kinase domain,
cause templating of LRRK2 onto stable, acetylated microtubules. A
similar templating is observed when inhibiting the kinase activity of
LRRK2 by various distinct, specific kinase inhibitors. Such interaction
can be partially disrupted by nocodazole, and fully disrupted upon cold-
induced microtubule depolymerization. Microtubule regrowth assays
indicate that LRRK2 filaments form with a delay after microtubules
are reformed. Modulating the acetylation status of microtubules causes
alterations in filament formation consistent with the idea that pathogenic
LRRK2 interacts preferentially with stable microtubules. An artificial
mutation in LRRK2 which enhances GTP hydrolysis decreases filament
formation, whilst a mutation which abolishes an autophosphorylation
site in LRRK2 is without effect. Together, the data indicate that LRRK2
filament formation is dependent on its GTPase activity, modulated by
kinase inhibition, and occurs by preferential association with stable
microtubules. Further studies are under way to determine the impact
of such interactions on modulating posttranslational microtubule
modifications.
P13r-18
Targeted modulation of the glial inflammatory
response in Retinitis Pigmentosa attenuates
photoreceptor cell death
María Platón Corchado1, Catalina Hernández-Sánchez1, Alberto M.
Hernández-Pinto1, Miguel Marchena1, Noemí Álvarez-Lindo1, Ana
I. Arroba1, Sean Jmaeff2, Pablo F. Barcelona2, H. Uri Saragovi2,
Enrique J. de la Rosa1
1
Centro de Investigaciones Biológicas-CIB-CSIC, Madrid, ES,
2
McGill University, Lady Davis Institute-Jewish General Hospital,
Montreal, CA
Purpose: Retinitis Pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of genetic
retinal dystrophies. In most forms of RP, photoreceptor cell death is
associated with disease progression. Reactive Müller cell gliosis and
microglial activation are also found, often prior to photoreceptor death.
Granada 2014
Here, we studied inflammatory pathways, arising from Müller cell and
microglia that regulate neuronal cell death.
Methods: We analyzed the expression of pro-inflammatory cytokines and
of markers of reactive Müller cell gliosis and microglial activation by qRT-
PCR and immunohistochemistry in retinas from wild type and RP mouse
models. Growth factors and pharmacological agents were tested in retinal
explants ex vivo and by intravitreal injection in vivo.
The agents were selected to modulate the glial inflammatory response.
The treatments included clodronate-liposomes (to cause depletion of
microglia), IGF-I (to polarize microglia response), and antagonists of the
p75NTR receptor (a receptor present in Müller and glial cells and whose
activity stimulates TNFα production).
Results: A marked increase in GFAP and TNFα transcription preceded
photoreceptor cell death in RP retinas. Reduced photoreceptor cell death,
better preservation of the outer nuclear layer, and decreased gliosis were
observed upon treatment.
Conclusions: Our results suggest the possible existence in the RP retinas
of a pro-inflammatory loop mediated by the activation of p75NTR in
Müller glial cells, which causes TNFα production. Modulation of the
p75NTR inflammatory response is a possible target to attenuate RP
progression.
P13-19
LRRK2 delays degradative receptor trafficking
by impeding late endosomal budding through
decreasing Rab7 activity
Pilar Rivero-Ríos1, Patricia Gómez-Suaga1, Elena Fdez1, Marian
Blanca Ramírez1, Isidro Ferrer2, Ana Aiastui3, Adolfo López de
Munain3, Sabine Hilfiker1
1
Institute of Parasitology and Biomedicine “López-Neyra”, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas-CSIC, Granada, ES,
2
Institute of Neuropathology, IDIBELL-University Hospital Bellvitge,
University of Barcelona, Hospitalet de Llobregat, ES, 3Neuroscience
Area, Biodonostia Institute, San Sebastián, ES
Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene cause late-
onset autosomal dominant Parkinson´s disease (PD), and sequence
variations at the LRRK2 locus are associated with increased risk
for sporadic PD. LRRK2 contains both GTPase and kinase domains
flanked by protein interaction motifs, and mutations associated with
familial PD have been described for both catalytic domains. LRRK2
has been implicated in diverse cellular processes, and recent evidence
pinpoints to an important role for LRRK2 in modulating a variety of
intracellular membrane trafficking pathways. However, the underlying
mechanisms are poorly understood. Here, by studying the classical,
well-understood, degradative trafficking pathway of the epidermal
growth factor receptor (EGFR), we show that LRRK2 regulates
endocytic membrane trafficking in a Rab7-dependent manner. Mutant
LRRK2 expression causes a slight delay in early-to-late endosomal
trafficking, and a pronounced delay in trafficking out of late endosomes,
which become aberrantly elongated into tubules. This is accompanied
by a delay in EGFR degradation. The LRRK2-mediated deficits in
EGFR trafficking and degradation can be reverted upon coexpression of
active Rab7 and of a series of proteins involved in bridging the EGFR
to Rab7 on late endosomes. Moreover, expression of TBC1D15, the
Rab7 GAP, mimicks the effects of mutant LRRK2 on EGFR trafficking.
Effector pull-down assays indicate that pathogenic LRRK2 decreases
Rab7 activity both in cells overexpressing LRRK2, as well as in
fibroblasts from pathogenic mutant LRRK2 PD patients as compared
to healthy controls. Together, these findings provide novel insights into
a previously unknown regulation of Rab7 activity by mutant LRRK2
which impairs membrane trafficking at very late stages of the endocytic
pathway. Current studies are underway to determine whether LRRK2-
mediated changes in intraluminal endolysosomal calcium may account
for altered Rab7 activity.
Pósters
P13-20
Pathogenic mutations in LRRK2 cause
alterations in cell cycle progression
and premature centrosome splitting
Jesús Madero Pérez1, Elena Fdez1, Patricia Gómez-Suaga1, Angus
C. Nairn2, Ana Aiastui3, Adolfo López de Munaín3, Sabine Hilfiker1
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”-CSIC,
Armilla, ES, 2Dept. of Psychiatry, Yale University School of
Medicine, New Haven, US, 3Neuroscience Area, Biodonostia
Institute, San Sebastián, ES
Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the most common
cause of familial and sporadic Parkinson´s disease (PD). The effects
of pathogenic mutations in LRRK2 have generally been studied in
differentiated, non-dividing neuronal cells. However, recent studies indicate
that pathogenic LRRK2 may play a role in dividing cells as well, as indicated
by alterations in adult neurogenesis or the increased cancer risk in LRRK2
PD patients. Here, we report that three pathogenic LRRK2 mutants cause
alterations in cell cycle progression, nuclear shape alterations and premature
centrosome splitting. Premature centrosome splitting is associated with
partial displacement of the intercentrosomal linker protein rootletin, and can
be partially or fully rescued when expressing rootletin, dominant-negative
Nek2a or active PP1a, indicating a LRRK2-mediated deregulation of the
balance of the Nek2a/PP1 pathway controlling centrosome cohesion via
intercentrosomal linkers. Alterations in centrosome cohesion and nuclear
shape changes are reverted upon pharmacological LRRK2 kinase inhibition.
Centrosomal and nuclear shape alterations are also observed in human
dermal fibroblasts from G2019S LRRK2 mutant PD patients compared to
healthy controls. Together, our data indicate a mechanism for pathogenic
LRRK2 function in dividing cells.
P13-21 (R13-5)
Chronic hypoxia aggravates Alzheimer’s disease
pathology by causing microglial dysfunction
Rosana March-Diaz1, Antonio Heras-Garvín1, Adrian Viehweger1,
Sebastian Jimenez1, Alberto Serrano-Pozo1, Victoria Navarro1,
Almudena Gerpe2, Marisa Vizuete1, Antonia Gutierrez3, José López-
Barneo1, Edurne Berra2, Javier Vitorica1, Alberto Pascual Bravo1
1
Instituto de Biomedicina de Sevilla-IBiS, Hospital Universitario
Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2Centro
de Investigación Cooperativa en Biociencias, CIC bioGUNE - Parque
Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 3Dept. Biología Celular, Genética
y Fisiología - Facultad de Ciencias. Instituto de Investigación
Biomédica de Málaga-IBIMA - Universidad de Málaga, Sevilla, ES
Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder
and the most common form of dementia. In many cases AD patients present
concomitant vascular pathology. Low oxygen levels are also frequently
found in the brain of AD patients. The most accepted hypothesis to explain
the correlation between hypoxia and AD is the deposition of amyloid ß
(Aß) occurring in the microvasculature (amyloid angiopathy) and the
affectation by the disease of the locus coeruleus, a brain region involved
in the control of brain blood flow. However, few data has been collected to
understand the relation between hypoxia and AD progression.
We show here the accumulation of the hypoxic marker HIF1α (Hypoxia-
inducible-factor 1α), the major transcription factor for the adaptation to
hypoxic conditions, in the brain of AD patients by western blot. We have
also characterized the consequences of chronic exposition to hypoxia in the
progression of the disease using a widely accepted AD mice model.
AD mice were exposed to physiologic hypoxia (8.5% oxygen, 21 days) at
initial and advances stages of the pathology. Brains from hypoxic animals
showed no differences in the Aß content and number of plaques, but they
showed a clear reduction in the total number of microglial cells that was
even more evident around the Aß plaques. In vitro analyses suggest that
hypoxia slows down proliferation and chemotaxis towards polymeric Aß
in both cell line and primary microglial cultures.
123
Pósters
Interestingly, the brain cortex from the hypoxic animals showed a high
increase in the number of dystrophic neurites surrounding the microglia-
free Aß plaques. We observed also a decrease in the mRNA levels of
two markers of interneurons, Somatostatin and Neuropeptide-Y, in the
hippocampus of hypoxic mice. These data suggest that hypoxia accelerates
the progression of AD pathology.
The pathway underlying microglial affectation by hypoxia has an enormous
potential in neurodegenerative disorders where microglia function is
correlated with the progression of the disease.
P13-22
GPCR homo- and heteroreceptor complexes
in the brain
Dasiel Oscar Borroto Escuela1, Manuel Narváez2, Michael Di
Palma1, Wilber Romero-Fernández1, Ismel Brito3, Michael Bader4,
Malgorzata Filip5, Luigi F. Agnati1, Pierre Trifilieff6, Jonathan
Javitch7, Kjell Fuxe1
1
Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, Stockholm,
SE, 2Department of Physiology, School of Medicine, University of
Malaga, Málaga, ES, 3IIIA-CSIC, Artificial Intelligence Research
Institute, Spanish National Research Council, Barcelona, ES, 4Max-
Delbrück-Center for Molecular Medicine, Berlín, DE, 5Laboratory
of Drug Addiction Pharmacology and Department of Pharmacology,
Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences, Kraków,
PL, 6University Bordeaux 2 INRA, Bordeaux, FR, 7Department of
Neuroscience, Columbia University, New York, US
G protein–coupled receptors (GPCRs) play critical roles in cellular processes
and signaling and have been shown to form homo and heteroreceptor
complexes with diverge biochemical and/or pharmacological activities.
However, despite extensive experimental results supporting the formation
of GPCR homo and heteroreceptor complexes in heterologous systems, the
existence of such receptor-receptor complexes in their native environment
remains largely unknown, mostly because of the lack of appropriate
methodology. For instance, until recently years the methods that have
been developed to study receptor-receptor interactions require that genetic
constructs be expressed in the cells to enable detection of the receptor
interactions, thus excluding the use of tissue samples. In order to demonstrate
in native tissue the existence of GPCR homo and heteroreceptor complexes,
especially in a manner that can be generally applicable to different receptor
pairs, a well-characterized in situ proximity ligation assay (in situ PLA) has
been adapted to confirm the existence of GPCR homo- and heteroreceptor
complexes in brain slices ex vivo. We also describe the in situ PLA procedure
as a high selectivity and sensitivity assay to image GPCR homo- and
heteroreceptor complexes in brain sections by confocal microscopy and how
the assay is performed. We point out as well the method advantages and
disadvantages and compare it to other available techniques.
P13-23 (R13-6)
The neuronal-specific serum and glucocorticoid-
regulated kinase 1.1 protects against seizure-
induced neuronal death
Natalia Armas-Capote1, Adoración Martínez-Palacián2, Diego Álvarez
de la Rosa1, Teresa Giráldez3
1
Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina y Centro
de Investigaciones Biomédicas de Canarias-CIBICAN, Universidad
de La Laguna, La Laguna, ES, 2Dep. of Biochemistry and Molecular
Biology II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and
Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos-
IdISSC, Madrid, ES,3Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad
de Medicina y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias-
CIBICAN, Universidad de La Laguna, La Laguna, ES
The M-current formed by tetramerization of Kv7.2 and Kv7.3 subunits is
a neuronal voltage gated K+ conductance that controls resting membrane
124
XXXVII Congreso SEBBM
potential and cellular excitability. Our group has previously shown that
the neuronal isoform of the serum and glucocorticoid-regulated kinase
(SGK1.1), with distinct subcellular localization and modulation, up-
regulates the Kv7.2/3 current in neurons. Moreover, transgenic mice
(Tg.sgk) expressing a constitutively active form of SGK1.1 (S515D)
were resistent to seizures induced by kainic acid, unveiling a novel role
for SGK1.1 as a physiological regulator of the M-current and neuronal
excitability (Miranda et al, J Neurosci 2013 33:2684). The ubiquous
isoform of this kinase, SGK1, has been involved in protection from
apoptosis (Mikosz et al JBC 2001 276:20) and neurogenesis (Anacker
et al PNAS 2013 110:8708). Both mechanisms have been associated to
seizure-induced neuronal death. Therefore, to explore whether SGK1.1
also protects against seizure cell death, we compared the levels of neuronal
death in Tg.sgk vs wild-type mice, using the Fluoro-Jade staining approach
in different brain regions in mice with comparable seizure development.
Our results show a significant decrease in neuronal death in transgenic
mice after kainate treatment, even under status epilepticus. Experiments are
underway in our laboratory to test signalling pathways involved in SGK1.1
protective role. This result is clinically relevant, since both seizure-induced
cognitive impairments and epileptic seizure severity are influenced by the
extent of damage caused by seizures.
P13-24
Dopamine D1 and D2 receptor immunoreactivities
in the arcuate median eminence complex
Wilber Romero Fernández1, Dasiel Borroto-Escuela2, Víctor Vargas-
Barroso3, Manuel Narváez Narváez4, Michael Di Palma5, Luigi F
Agnati6, Jorge Larriva Sahd3, Kjell Fuxe2
1
Faculty of Health Sciences, Technical University of Ambato,
Ambato, EC, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institute,
Stockholm, SE, 3Institute of Neurobiology, National Autonomous
University of Mexico, Campus Juriquilla, Querétaro, MX,
4
Department of Physiology, School of Medicine, University of
Málaga, Málaga, ES, 5Department of Earth, Life and Environmental
Sciences, Section of Physiology, Carlo Bo University of Urbino,
Urbino, IT, 6IRCCS Lido Venice, Venice, IT
Dopamine D1 and D2 receptor (D1DR and D2DR) immunohistochemistry
was used to determine the distribution of the D1DR and D2DR
immunoreactivities (IR) in the rat arcuate-median eminence complex.
Punctate D1DR and D2DR immunoreactivities were enriched in the
lateral palisade zone, while the densities were low to modest in the medial
palisade zone. D1DR but not D2DR IR nerve cell bodies were found
in the ventromedial part of the arcuate nucleus and in the lateral part of
the internal layer of the median eminence. A large number of tyrosine
hydrolase (TH) IR nerve cell bodies in dorsomedial part showed punctate
D1DR IR but only a few presented D2DR IR which were mainly found
in a substantial number of TH cell bodies of the ventral periventricular
hypothalamic nucleus. This immunohistochemical work could explain the
role of D1DR and D2DR in this region.
P13-25 (R13-2)
Super-resolution imaging of cargo transport
Melike Lakadamyali
ICFO, Instituto de Ciencias Fotónicas, Castelldefels, Barcelona, ES
Intracellular transport is essential for maintaining cell function and
morphology. Transport is carried out by molecular motors that convert the
energy of ATP hydrolysis to mechanical motion. Several single molecule
in vitro studies produced a wealth of information on the biophysical
properties and function of these motors. However, the cellular environment
imposes further challenges on motors. Multiple, opposing polarity motors
must coordinate or compete to overcome road-blocks in the crowded
cellular environment to effectively deliver their cargo in the right place at
the right time. We are combining super-resolution microscopy with single
Granada 2014
particle tracking to understand how motors tackle these challenges. Our
studies have shown that, even the dense microtubule network can present
obstacles to motor-mediated cargo transport, but motors are well-adapted
to circumvent these obstacles.
P13-26
Ultrastructural localization of the core-machinery
for vesicle secretion
Israel Salcedo González, Heidi de Wit, Jan van Weering
Department of Functional Genomics, Center for Neurogenomics and
Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, Amsterdam, NL
Neurons communicate with each other through synapses. The secretion
of neurotransmitters is highly regulated by voltage-sensitive channels that
allow Ca2+ influx in the cell triggering the fusion of the vesicles, where the
neurotransmitters are stored, with the active zone in the cell membrane. All
this process is controlled by a set of proteins, including SNARE proteins.
The SNARE proteins are a large family of proteins connected to the cell’s
membrane system, some, to the vesicles (v-SNAREs) and some others
to the cell membrane (t-SNAREs), while other proteins help this core to
operate correctly. Four proteins are essential for neurotransmitter release:
Syntaxin, Munc18, SNAP25 and Synaptotagmin. This process starts with
the assembly of Syntaxin and SNAP25 in the membrane, helped by Munc18.
After, Synaptotagmin and Synaptobrevin bind to them and form the SNARE
complex, docking the vesicles close to the membrane. When the SNARE
complex is zippered, Complexin inhibits fusion until Synaptotagmin detects
Ca2+ influx, promoting membranes fusion and neurotransmitter release.
It is known that, after fusion, the SNARE complex is dissolved by the
enzyme NSF, but somehow the proteins should be prevented to bind again.
Also, the axon button constitutes a very independent system as it is far
away from the cell soma, making necessary to recycle the vesicles to gain
functionality again.
The aim of this research is to clarify the redistribution and recycling of the
proteins involved in neurotransmitter release after vesicle fusion. To address
this question, in our lab we use primary cultures of mouse chromaffin cells
as a suitable model for neuron vesicle cycle. The cells are stimulated with a
highly concentrated K+ solution to trigger vesicle secretion. They are fixed at
several times after stimulation. To visualize the proteins, immunofluorescent
stainings are used for confocal microscopy, analyzing the redistribution of
the proteins through the cell with the program Image J. To follow the exact
organelle where the proteins are while recycling, electron-microscopy is
used, labeling the proteins with immunogold particles. The data obtained
from these techniques will allow insight for the first time into the cycle of the
proteins responsible of vesicle fusion.
P14. Parasitología molecular
P14-1 (R14-2)
Functional microengineered model of the human
splenon-on-a-chip
1 2
Aleix Elizalde-Torent , Luís Rigat-Brugarolas , María Bernabéu , 1 internalization into non phagocytic cells
Mariana De Niz1, Lorena Martín-Jaular1, Carmen Fernández-
Becerra1, Antoni Homs-Corbera2, Josep Samitier2, Hernando A. Del
Portillo1
1
CRESIB-Barcelona Center for International Health Research,
Barcelona, ES, 2Nanobioengineering group, Institute for
Bioengineering of Catalonia-IBEC, Barcelona, ES
We have developed a newfangled microfluidic device that mimics the
hydrodynamic behavior and filtering functions of the splenon, the minimal
functional unit of the red pulp of the spleen able to maintain its filtering
functions. Unlike any other previous microfluidic devices, the human splenon-
Pósters
on-a-chip incorporates for the first time two compartments with different flow
velocities (according to the physiological flow division) and two physical
barriers representing the reticular mesh and the interendothelial slits (IES)
where cells first slow down increasing the hematocrit and then traverse the
IES in a unidirectional matter. To validate the use of this platform, several
experiments were carried out with different types of red blood cells (RBCs). As
a proof of concept, we described that old RBCs showed less deformability than
freshly drawn RBCs when traversing the microconstrictions. Posterior analysis
allowed studying the passage and deformability of infected RBCs through the
IES using peripheral blood of BALB/c mice experimentally infected with
the P. yoelii 17X-GFP strain. Results showed that infected reticulocytes are
significantly more deformable than non-infected reticulocytes, in agreement
with the higher deformability of reticulocytes parasitized by P. vivax, a human
malarial parasite with reticulocyte tropism. These results suggest that the device
is able to reproduce physiological conditions and to distinguish different types
of RBCs by means of deformation/mechanical properties. Presently, we are
determining if there is hemolysis during the pass of blood through the device,
if there is pitting in the absence of macrophages and the rheological properties
of malarial infected RBCs.
P14-2
Cambios inducidos por choque térmico en el
transcriptoma de Leishmania major
Alberto Rastrojo, Begoña Aguado, José M. Requena
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM, Madrid, ES
Los parásitos del género Leishmania, causantes de un grupo de patologías
conocidas como leishmaniasis, son transmitidos a humanos y otros mamíferos
a través de insectos hematófagos. Durante la transmisión, entre otros cambios,
el parásito debe enfrentarse a un aumento significativo en la temperatura
ambiente, siendo considerado un factor disparador del proceso de diferenciación.
Para comprender mejor la relación entre el aumento de temperatura y la
diferenciación en Leishmania, en este estudio, hemos analizado mediante
RNASeq los cambios en el transcriptoma de la forma promastigote (propia
del insecto vector) asociados a la temperatura de crecimiento propia de sus
huéspedes (26 o 37ºC). La cuantificación de los niveles de expresión relativa
de los 11.523 transcritos anotados para L. major y su análisis con diferentes
programas (Cuffdiff, DESeq y DESeq2), han puesto de manifiesto importantes
cambios en el transcriptoma inducidos por choque térmico. Considerando los
resultados comunes a los 3 programas, observamos la expresión diferencial de
111 transcritos, de los que 92 mostraron una acumulación y 19 disminuyeron
sus niveles. Los transcritos codificantes de amastinas y otras proteínas
específicas del estadio amastigote (forma del parásito en el huésped mamífero)
aumentaron su expresión, así como transcritos codificantes de quinasas, ciclinas
y proteínas de unión a RNA. También observamos la acumulación durante
el choque térmico de 12 transcritos correspondientes a RNA estructurales
(snoRNA y rRNA). Además, hemos observado que el choque térmico tiene
efectos importantes sobre mecanismos clave de la regulación de la expresión
génica en Leishmania como son el trans-splicing, la poliadenilación y la
terminación transcripcional.
P14-3
Adenylate cyclase toxin promotes bacterial
Asier Etxaniz Iriondo1, César Martín1, Kepa B. Uribe1, Aitor
Etxebarria1, David González Bullón1, Jon Arluzea2, Felix M. Goñi1,
Juan Aréchaga2, Helena Ostolaza1
1
Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco,
Bilbao, ES, 2Departamento de Biología Celular, Facultad de
Medicina, Universidad del País Vasco, Bilbao, ES
Bordetella pertussis causes whooping cough, a respiratory infectious disease
that is the fifth largest cause of vaccine-preventable death in infants. Though
historically considered an extracellular pathogen, this bacterium has been
125
Pósters
detected both in vitro and in vivo inside phagocytic and non-phagocytic cells.
However the precise mechanism used by B. pertussis for cell entry, or the
putative bacterial factors involved remain largely unknown. Here we find that
adenylate cyclase toxin (ACT), one of the important toxins of B. pertussis, is
sufficient to promote bacterial internalization into nonphagocytic cells. After
exhaustive characterization of the entry route we show that uptake of “toxin-
coated bacteria” proceeds via a clathrin-independent, caveolaedependent
entry pathway, allowing the internalized bacteria to survive within the cells.
Intracellular bacteria were found inside non-acidic phagosomes enriched
in sphingomyelin and cholesterol, or “free” in the cytosol of the invaded
cells, suggesting that the ACT-induced bacterial uptake does not follow the
classical phagolysosomal pathway. Activation of Tyr kinases and toxin-
induced Ca2+-influx are essential for the entry process. We hypothesize that
B. pertussismight use ACT to activate the endocytic machinery of non-
phagocytic cells and gain entry into these cells, which represents a possible
mechanism by which it might evade the host immune system.
P14r-4
Molecular epidemiology and analysis of the
risk of infection by Anisakis spp. (Nematoda:
Anisakidae) in sardines (Sardina pilchardus) from
Iberian waters
Dolores Molina Fernández, David Malagón, Gema Merino Espinosa,
Rocío Benítez, F. Javier Adroher, Joaquina Martín Sánchez
Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad
de Granada, Granada, ES
Sardine (Sardina pilchardus) is a fish commonly consumed and appreciated
in Mediterranean countries. A molecular epidemiological survey with 190
sardines from 5 fishing areas of Mediterranean (Málaga, southern Spain)
and Atlantic Spanish coasts (southern: Cádiz and Isla Cristina; northern: A
Coruña and Ondarroa) were carried out to analyse the presence of Anisakis
spp. larvae. All found larvae in fish were in third larval stage. The higher
prevalence of these larvae was observed in fish from A Coruña (28.3%),
followed from Ondarroa (5%) and Cádiz (2.5%). No Anisakis larvae were
found in fish from Málaga and Isla Cristina. Three Anisakis genotypes were
identified by polymerase chain reaction followed by restriction fragment
length polymorphism of the ribosomal fragment ITS1-5.8S-ITS2: A. simplex
sensu stricto, A. pegreffii and a hybrid genotype between these two species. A.
pegreffii was the more prevalent species in A Coruña (71.0 % of larvae). Only
three Anisakis larvae (9.1% collected larvae) were located in the musculature
of sardines: two of them were identified as A. pegreffii, and the remaining
one was a hybrid genotype. Sardine infection was associated with fishing
area and fish length/weight. Risk factor multivariate analysis shows that the
risk of infection increases 1.6 times per cm in the length of the sardines in the
same fishing area. Also, in equal length, sardines from A Coruña have a risk
of parasitization 11.5 times higher than those from other fishing areas. In any
case, the low number of larvae found in the muscle supposes a low human
anisakiasis risk. This risk is less, however, if people eat smaller sardines and/
or sardines from fishing areas with low prevalence of Anisakis infection,
which reduces significantly the presence of Anisakis in this fish.
P14-5
Caracterización multigénica de los vectores
transmisores de fascioliasis humana y animal en
Chile, basada en la utilidad de marcadores del
ADN ribosomal y mitocondrial
Verónica H Agramunt, Maria Dolores Bargues, Santiago Mas-Coma
Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad
de Valencia, Burjassot, Valencia / Departamento de Ciencias
Biomédicas, Universidad CEU-Cardenal Herrera, Castellón, ES
Las implicaciones de los lymnaeidos en la transmisión de la fascioliasis,
su epidemiología y control, insta a desarrollar nuevas herramientas para
126
XXXVII Congreso SEBBM
facilitar la clasificación de muestras, caracterización genética de las
poblaciones naturales y cepas de laboratorio, y para dilucidar la sistemática
y taxonomía de la família Lymnaeidae. Los marcadores de ADN ribosomal
(ADNr) y de ADN mitocondrial (ADNmt) han demostrado ser útiles en esta
tarea en los invertebrados en general. Su aplicación también ha demostrado
ser útil en caracoles lymnaeidos a niveles específicos, genéricos y de
taxones supragenéricos. Los espaciadores transcritos internos del ADNr,
ITS-2 e ITS-1, son las secuencias más útiles para clasificar especies de
lymnaeidos. Un fragmento del gen de la subunidad I de la citocromo c
oxidasa (cox1) del ADNmt también resultó útil, aunque los marcadores
del ADNmt deben ser empleados con precaución. Cada uno de los tres
marcadores de ADN se amplificaron mediante PCR independientemente
para cada especímen de lymnaeido, y cada producto de PCR se secuenció
para una caracterización de haplotipos. Los datos de las secuencias de
nucleótidos de los ITS-2 e ITS-1 del ADNr nuclear y de cox1 del ADNmt
de depositaron en el GenBank. Los resultados obtenidos cambian el
escenario de los lymnaeidos conocido hasta ahora en Chile. Se demostró
la presencia de Galba truncatula en Chile, especie que ha sido siempre
confundida con Lymnaea viator. Esta última podría ser la principal
responsable de la infección animal, mientras que G. truncatula lo sería
de la mayoría de casos humanos. Especímenes de Pectinidens diaphana
mostraron una gran variabilidad intraespecífica en su ADN, con un nuevo
haplotipo en ITS-1 y tres nuevos en cox1. Lymnaea patagonica demostró
ser un sinónimo de P. diaphana. Las escasas diferencias nucleotídicas a
nivel de ITS-2 e ITS-1 mantienen a L. patagonica como una subespecie
de P. diaphana. Tampoco Lymnaea lebruni presentó diferencias suficientes
para considerarlo un taxón distinto respecto a P. diaphana y L. patagonica.
Todo ello proporciona una nueva línea de base para llevar a cabo futuros
estudios apropiados sobre la transmisión, epidemiología y control de la
Fascioliasis humana y animal en Chile.
Financiación: SAF2010-20805, Ministerio de Economía y Competitividad;
RD06/0021/0017, Red de Investigación Cooperativa en Enfermedades
Tropicales-RICET, RETICS-FEDER, Ministerio de Sanidad, Madrid; y
PROMETEO 2012/042, Programa I+D de Grupos de Investigación de
Excelencia, Generalitat Valenciana, Valencia.
P14-6 (R14-1)
Carbohydrate-binding agents act as potent
trypanocidals that elicit modifications in VSG
glycosylation
Víctor M. Castillo-Acosta1, Antonio E. Vidal1, Luis Miguel Ruiz-
Pérez1, Els J.M. Van Damme2, Yasuhiro Igarashi3, Jan Balzarini4,
Dolores González-Pacanowska1
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”,
CSIC, Armilla (Granada), ES, 2Laboratory of Biochemistry and
Glycobiology, Department of Molecular Biotechnology, Ghent
University, Ghent, BE, 3Biotechnology Research Center, Toyama
Prefectural University, Toyama, JP, 4Rega Institute for Medical
Research, Leuven, BE
The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the etiologic agent of
African trypanosomiasis. The chemotherapy relies on a few drugs
which have adverse side-effects. The cell surface of bloodstream forms
dwelling in the mammalian host is covered by a densely packed coat
of glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoproteins. The major
component is the variant surface glycoprotein (VSG) which is glycosylated
by both paucimannose and oligomannose N-glycans for building up the
protective barrier against the immune system. Surface glycans are poorly
accessible and killing mediated by peptide lectin-VSG complexes is
hindered by active endocytosis. In contrast to previous belief, here we
show that high affinity carbohydrate binding agents (CBAs) bind to
surface glycoproteins and abrogate growth of T. brucei bloodstream
forms. Specifically, binding of the mannose-specific Hippeastrum hybrid
agglutinin (HHA) triggered intense perturbations in endocytosis and
further parasite lysis. Prolonged exposure to HHA induced parasites
Granada 2014
resistance based on their diminished capacity to bind the lectin. These
parasites exhibited a loss of triantennary oligomannose at the expense of
paucimannose structures in surface glycoproteins as a result of genetic
rearrangements that abolished expression of the oligosaccharyltransferase
TbSTT3B gene together with the appearance of novel chimeric enzymes.
In addition, we have evaluated the trypanocidal activity of a series of
prokaryote non-peptidic CBAs that rendered parasitological cure in acute
models of African trypanosomiasis. Thus specific glycosylation patterns
are important for CBA cytotoxicity and parasite fitness in vivo and agents
binding efficiently to surface glycoproteins emerge as a new strategy for
therapy for African trypanosomiasis.
P14-7
Función, estructura y regulación de la expresión
de la tirosina aminotransferasa de Leishmania
infantum
Miguel Ángel Moreno Izquierdo1, Ana Alonso Ayala1, Pedro José
Alcolea Alcolea1, Peter John Myler2, Antonio Jiménez3, Vicente
Larraga Rodríguez1
1
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES,
2
Seattle Biomedical Research Institute, Seattle, Washington, US,
3
Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES
Leishmania infantum es el agente responsable de la leishmaniasis visceral
en la cuenca mediterránea. En su ciclo biológico se alternan dos estadíos:
promastigote (extracelular en el insecto vector, donde desarrolla un proceso
por el que adquiere mayor infectividad conocido como metaciclogénesis)
y amastigote (intracelular en el macrófago del hospedador mamífero). La
falta de nutrientes esenciales hace que el parásito utilice rutas alternativas
para obtener energía, como la degradación de aminoácidos aromáticos
mediante transaminación, relacionada con la patogenia y la infectividad por
la toxicidad para el hospedador de los productos finales de degradación. En
L. infantum esta transaminación la lleva a cabo la tirosina aminotransferasa
(LiTAT). LiTAT es una proteína citoplásmática, que se expresa en
amastigotes y en promastigotes logarítmicos y metacíclicos en cultivo
axénico. Por otro lado se sobreexpresa en cepas resistentes a óxido nítrico
de L. chagasi. Dicha sobreexpresión podría explicarse por su interacción
con la malato descarboxilasa, responsable de la síntesis de piruvato a partir
de malato produciendo NADPH, requerido en la protección frente a estrés
oxidativo. LiTAT, en ausencia de hierro, sufre una degradación mediada por
proteasoma, la cual puede ser eludida por la deleción del dominio N-terminal.
Por ello, LiTAT es un buen candidato para un diseño racional de inhibidores
y su estructura unida al cofactor fue resuelta por cristalografía de rayos X
a una resolución de 2.3 Å (PDB: 4ix8). Mediante acoplamiento molecular
in silico, los residuos responsables de la diferente especificidad de sustrato
entre LiTAT y el ortólogo en mamíferos fueron identificados, permitiendo
generar un grupo farmacóforo para la identificación de nuevos inhibidores
frente a la leishmaniasis.
P14r-8
Identificación por cribado de una librería de
sobreexpresión de genes implicados en el
mecanismo de resistencia al suero humano de
Trypanosoma brucei gambiense
Jean-Mathieu Bart1, Carlos Cordon-Obras2, Fabian Lorenzo3, Basilio
Valladares3, Agustin Benito1, Miguel Navarro2
1
Centro Nacional de Medicina Tropical Instituto de Salud Carlos
III, Armilla, ES, 2Instituto de Parasitología y Biomedicina “López -
Neyra”, CSIC, Armilla, ES, 3Instituto Universitario de Enfermedades
Tropicales y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES
Trypanosoma es un protozoo que vive en el torrente sanguino de los
mamíferos. Desarrolló a lo largo de la evolución una serie de mecanismos para
eludir las respuestas inmunes específicas e innatas de sus huéspedes. De las
Pósters
tres subespecies de Trypanosoma brucei, dos son infectivas para el humano,
T. b. rhodesiense y T. b. gambiense, mientras T. b. brucei es sensible al acción
del suero humano (SH). Se ha descrito la Apolipoproteina L1 (ApoL1) como
el componente del suero humano responsable de la lisis de los tripanosomas,
formando poros al nivel del lisosoma del parasito. En T. b. rhodesiense, la
expresión de un único gen, el SRA (Serum Resistante Associated gene) es
suficiente para conferir resistencia al SH, impidiendo la acción de ApoL1. En
T. b. gambiense, el parasito responsable de 95% de los casos de enfermedad de
sueño, el mecanismo de resistencia no está todavía bien entendido.
El objetivo de nuestro trabajo era descubrir genes implicados en el
mecanismo desarrollado por T. b. gambiense para resistir al SH. Nuestra
estrategia consistió en complementar la cepa sensible al SH de T. b. brucei
por una librería de expresión construida a partir del ADN genómico de T.
b. gambiense. La selección de los clones se hizo por adición de 1% de SH.
Dos genes han sido identificados: HRF-1 y HRF-2 (Human Resistant
Factor), cuya sobreexpresión permite a T. b. brucei proliferar en presencia
de 10% de SH. HRF-1 se expresa en el nucléolo de la célula, y su papel
regulador esta estudiado vía secuenciación masiva de ARN. HRF-2 es una
proteína glicosilada perteneciendo a la familia de la lectinas. El análisis
de su localización subcelular por inmunofluorescencia nos permitió
colocalizar HRF-2 con proteínas implicadas en exocytosis. El KO de
ambos genes HRF-1 y 2 en T. b. gambiense está en proceso y nos permitirá
evaluar si su falta de expresión impide al parasito de resistir el SH.
A pesar de la ausencia de la proteína TgsGP publicada recientemente como
implicada en el mecanismo de resistencia al SH de T. b. gambiense, hemos
caracterizados dos genes HRF-1 y HRF-2 cuya sobreexpresión confiere
resistencia parcial.
P14-9
ABCI3, un nuevo transportador mitocondrial de
Leishmania major implicado en la susceptibilidad
a antimoniales
Talia Arcari, José Ignacio Manzano, Santiago Castanys, Francisco
Gamarro
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Granada, ES
Los parásitos del genero Leishmania son responsables de un grupo
de enfermedades devastadoras con diversas manifestaciones clínicas.
La ausencia de vacunas y la frecuente resistencia a los fármacos, hace
necesario identificar nuevas dianas terapéuticas. Los transportadores
ABC (ATP-binding cassette) son una familia de proteínas implicadas en
la resistencia a fármacos en diversos organismos. En el presente trabajo
describimos la caracterización funcional del transportador ABCI3 de
Leishmania major, que pertenece a un grupo de transportadores únicos
de tripanosomátidos. Utilizando parásitos que sobreexpresan ABCI3
fusionada a GFP (GFP-ABCI3) y ensayos de permeabilización con
digitonina, hemos determinado que ABCI3 se localiza en la membrana
externa de la mitocondria del parásito. Hemos obtenido parásitos con un
alelo delecionado para ABCI3 (LmABCI3+/-), y hemos realizado ensayos
de viabilidad celular en presencia de fármacos leishmanicidas. Los
promastigotes LmABCI3+/- son cinco veces más resistentes a Sb(III) y
As(III); al exponer los parásitos a concentraciones subletales de Sb(III),
estos acumulan menos Sb(III), presentan unos niveles de ATP mayores, una
menor despolarización de la membrana mitocondrial, y menores niveles de
ROS que los parásitos control. Además, los parásitos que sobreexpresan
una versión mutada inactiva del transportador (LmABCI3K1088M) son
también más resistentes a Sb(III). Actualmente estamos realizando ensayos
de complementación de LmABCI3+/- con una copia episomal del gen y
posteriormente trataremos de obtener parásitos mutantes nulos.
Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan
Nacional de I+D+i Proyectos SAF2012-34267 (F.G.), SAF2011-28102
(S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia
CTS-7282).
127
Pósters
P14r-10
Identificación y caracterización de nuevos fármacos
de reposición activos frente a Trypanosoma brucei
Marta Martínez-García1, Luis Carvalho1, Rubén Cebrián Castillo2,
Jenny Campos-Salinas1, Ignacio Pérez-Victoria3, J. Ignacio Manzano
González1, Santiago Castanys1, Francisco Gamarro1, Vanessa Yardley4,
Elena González1, Mercedes Maqueda Abreu2, José Mª Pérez-Victoria1
1
IPBLN-CSIC, Granada, ES, 2Universidad de Granada, Granada, ES,
3
Fundación MEDINA, Granada, ES, 4LSHTM, Londres, UK
El protozoo parásito Trypanosoma brucei es responsable de la enfermedad del
sueño, una de las enfermedades consideradas como “olvidadas” por la OMS
que cuenta con un peor control farmacológico. Los pocos medicamentos
disponibles son muy tóxicos y difíciles de administrar, por lo que se
necesitan nuevos fármacos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica
sin producir neurotoxicidad, a ser posible de administración oral y de un
precio asumible por los pacientes. La reposición de fármacos (utilización
de medicamentos en uso para tratar otras enfermedades) es una estrategia
interesante para identificar este tipo de compuestos, ya que permite reducir el
tiempo transcurrido desde la identificación del compuesto hasta su entrada en
fase clínica de estudio. En este trabajo describiremos la actividad tripanocida
y el mecanismo de acción de varios de estos prometedores compuestos frente
a T. brucei. Un ejemplo lo constituye la tafenoquina (TFQ), un fármaco oral
en fase clínica avanzada (IIb/III) para tratar y prevenir la malaria y que
ha demostrado ser eficaz in vivo frente a Leishmania, aunque no frente a
Trypanosoma cruzi. Mostramos que la TFQ es activa a concentraciones
submicromolares frente a distintas subespecies de T. brucei, incluyendo
T. b. rhodesiense. La TFQ provoca una despolarización mitocondrial en el
parásito, aumento de Ca2+ intracelular y producción de especies reactivas del
oxígeno, que acaban produciendo alteraciones celulares a nivel del bolsillo
flagelar, el núcleo y la mitocondria. También mostraremos el efecto de otros
fármacos de reposición muy activos frente a T. brucei (IC50%= 3 nM) cuyo
mecanismo de acción estamos caracterizando.
Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215
(JMPV),SAF2012-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO1786(JMPV) y
Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV).
P14r-11
Analysis of the Trypanosomatid serine/threonine
protein kinase “Jean3”, a novel potential
therapeutic target
Andrés Vacas-Oleas1, Celia Fernández-Rubio1, Carmen Sanmartin2,
Socorro Espuelas3, Paul Nguewa1
1
Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento
de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona,
ES, 2Instituto de Salud Tropical/Departamento de Química Orgánica
y Farmacéutica, University of Navarra, Pamplona, ES, 3Instituto
de Salud Tropical/Department of Pharmacy and Pharmaceutical
Technology, School of Pharmacy, University of Navarra, Pamplona, ES
Leishmaniasis, Sleeping sickness and Chagas disease are neglected diseases
caused by intra-cellular parasites that belong to the Trypanosomatidae
family. These pathologies affect several million people around the world.
The transmission of the parasites between invertebrate vectors and
mammalian hosts, involves morphological and physiological changes
needed to acquire virulence and to adapt to the environment. This
mechanism of differentiation is called metacyclogenesis. We identified
a number of genes apparently involved during this process. One of our
objectives is the validation of these genes as therapeutic targets.
After screening the Leishmania and Trypanosoma genomes, we found
plausible candidates involved in the parasites differentiation and adaptation
phenomena. We mainly focus on protein kinases as promising druggable
molecules described against different pathologies. After identifying
“Jean3” as a therapeutic target candidate in several trypanosomatids, the
analysis of its structure and the prediction of its function were assessed by
128
XXXVII Congreso SEBBM
several bioinformatic tools in T. cruzi and L. major. We also demonstrated
that Jean3 is differentially expressed during the stages of growth and
proliferation. In addition, the infective forms of these parasites exhibit high
gene expression levels of this protein kinase.
We are now performing several experiments in order to study the
localization of Jean3 and its implication in different processes such as
treatment resistance, cell cycle and viability, cell death and apoptosis, and
parasites virulence phenomena.
P14r-12
Identificación funcional de posibles secuencias
promotoras de la polimerasa de ARN tipo II en
tripanosomas africanos
Carlos Cordon-Obras1, Andreu Saura1, Diana López Farfán1, Fabián
Lorenzo2, Nick Dickens3, Basilio Valladares2, Miguel Navarro1
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES, 2Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales
y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES,3The
Wellcome Trust Centre for Molecular Parasitology, Glasgow, UK
Los tripanosomátidos son protozoos flagelados pertenecientes al orden
Kinetoplastida, organismos ancestrales que se separaron muy pronto del
resto de la rama eucariota. Su particular evolución hace que presenten una
combinación de rasgos procariotas y eucariotas única, fundamentalmente a
nivel de transcripción y organización genómica. Con la salvedad del Spliced
Leader (SL), un ARN que se añade al 5’ de todos los ARN mensajeros, no
se ha identificado ningún otro promotor de ARN polimerasa de tipo II (pol
II), e incluso éste, es bastante particular, puesto que inhibidores específicos
de pol II y pol III no reducen su actividad en la medida esperada. La
transcripción, mediada en la mayoría de los marcos abiertos de lectura
por la pol II, está organizada en policistrones, y se ha sugerido que los
sitios donde cambia el sentido de la transcripción (SSR), son secuencias de
iniciación de la transcripción. Sin embargo, no se ha identificado ninguna
secuencia específica que pueda ser considerada como promotor.
Para realizar este trabajo primero se generó un antisuero purificado por
afinidad frente a la subunidad mayor de la pol II, lo que nos permitió analizar
su expresión por Western blot, y su localización en el núcleo del Kinetoplastida
modelo (Trypanosoma brucei) mediante inmunofluorescencia. Empleando este
antisuero para inmunoprecipitación de cromatina y posterior secuenciación
masiva identificamos posibles promotores de la pol II. Esta técnica reveló más
de 200 picos significativos de acumulación de la pol II, la mayoría de ellos
asociados con los SSR divergentes del genoma de T. brucei. La alta resolución
de esta técnica nos permitió acotar con gran precisión regiones candidatas para
actuar como promotores. El potencial de estas regiones como promotores se
está evaluando mediante el análisis de actividad de un gen reportero insertado
de forma estable en el genoma. Resultados preliminares muestran que algunas
de estas regiones permiten la transcripción del gen reportero, al contrario de lo
que ocurre con la misma construcción en ausencia de promotor. Estos datos, de
confirmarse, supondrían la modificación del paradigma que dicta la ausencia
de promotores de ARN pol II en los Kinetoplastida.
P14-13
Caracterización de un nuevo transportador
ABC esencial en Trypanosoma brucei, agente
etiológico de la enfermedad del sueño
Lina Orrego, Viviana Sánchez-Martíns, Marta Martínez-García, María
Cabello-Donaire, Sophie Malagerie-Cazenave, Jenny Campos-
Salinas, Antonio Estevez, Santiago Castanys, Francisco Gamarro,
José M. Pérez-Victoria
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”-CSIC, Granada, ES
La enfermedad del sueño es una enfermedad tropical causada por el
protozoo parásito Trypanosoma brucei. La transmite la mosca TseTse,
que inyecta las formas procíclicas del parásito al hospedador mamífero,
Granada 2014
donde se transforman en formas sanguíneas que causan la enfermedad,
mortal en ausencia de tratamiento. Como los medicamentos tripanocidas
no son adecuados debido a su toxicidad y a la aparición de resistencias,
es prioritario encontrar nuevas dianas terapéuticas para el desarrollo de
fármacos. En este trabajo presentamos la caracterización de TbABCG6,
un nuevo transportador ABC de T. brucei. La proteína ortóloga en el
parásito Leishmania, se encuentra localizada en membrana plasmática
y confiere resistencia a medicamentos leishmanicidas. En primer
lugar, ensayos de northern y western blot indicaron que TbABCG6 se
expresa mayoritariamente en las formas sanguíneas del parásito, estadío
sobre el que se realizó el resto de la caracterización. Los ensayos de
inmunofluorescencia usando anticuerpos generados frente a esta proteína
mostraron que se localiza en vesículas cercanas al bolsillo flagelar del
parásito, donde se encuentra concentrada la maquinaria endocítica y
exocítica. La sobreexpresión de TbABCG6 no confirió resistencia a
fármacos tripanocidas. Por el contrario, incrementó la sensibilidad a
suramina, un fármaco que entra por endocitosis mediada por receptor,
aunque esta mayor sensibilidad no se debe a diferencias en la acumulación
de suramina. Por otra parte, la interferencia parcial de la expresión
de TbABCG6 mediante RNAi causó una dramática disminución del
crecimiento del parásito asociada con una anormal morfología celular
(ensanchamiento del bolsillo flagelar y presencia de múltiples flagelos).
La importancia de dicha proteína en la viabilidad del parásito sugiere
un papel esencial de TbABCG6 en T. brucei que estamos tratando de
elucidar.
Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215
(JMPV), SAF2012-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO1786 (JMPV) y
Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV).
P14r-14
El transportador ABCG2 de Leishmania está
implicado en la resistencia a antimoniales
Ana Perea, José Ignacio Manzano, Kirsten Verachtert, Santiago
Castanys, Francisco Gamarro
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Granada, ES
La quimioterapia es actualmente la única herramienta de lucha disponible
frente a la leishmaniasis, aunque el reducido arsenal de fármacos
disponibles y el incremento del fallo terapéutico limitan el control de esta
enfermedad parasitaria. La familia de transportadores ABC (ATP-binding
cassette) en Leishmania incluye 42 genes distribuidos en 8 subfamilias (A-
H), llevando a cabo funciones biológicas relevantes. Se han caracterizado
varios miembros de la subfamilia ABCG, los cuales son half-transporters,
implicados en la resistencia a fármacos, translocación de fosfolípidos a la
membrana plasmática e infectividad. Nuestro grupo ha descrito que líneas
dominantes negativas para el transportador ABCG2, presentan una menor
infectividad en modelo murino. Hemos comprobado que la sobreexpresión
de ABCG2 confiere una resistencia significativa a Sb(III) así como al ión
metálico As(III), debido a una reducción en su acumulación por incremento
de su eflujo. Igualmente, hemos observado que formas amastigotas
de Leishmania que sobreexpresan el transportador ABCG2, son más
resistentes a antimonio que la línea salvaje. Asimismo, comprobamos que
la resistencia a metales revierte tras la reducción de los niveles de tioles
mediante el pretratamiento con butionina-sulfoximida. Los estudios de
localización subcelular en parásitos que sobreexpresan ABCG2-GFP,
sugieren que el transportador se localiza en vesículas intracelulares del
parásito.
Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan
Nacional de I+D+i Proyectos SAF2012-34267 (F.G.), SAF2011-28102
(S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia
CTS-7282).
Pósters
P14m-15
Desarrollo y validación de un sistema HTS
en un modelo experimental de LV para
el descubrimiento de nuevos fármacos
leishmanicidas
Estefanía Calvo Álvarez, José Miguel Escudero Martínez, Rosa
Reguera Torres, Rafael Balaña Fouce, Estefanía Calvo Álvarez
Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de
León, León, ES
El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar la leishmaniosis visceral
(LV), la forma más severa de los distintos tipos de leishmaniosis, es cada vez
más urgente y necesario, debido a la ineficacia de los tratamientos actuales,
su toxicidad y a la aparición de resistencias. El desarrollo de sistemas de
alto rendimiento o HTS (High-Throughput Screening), permitiría testar
miles de compuestos de manera rápida, efectiva y reproducible. Debido a
la influencia crítica de la respuesta inmune del hospedador en el tratamiento
de la infección, el sistema empleado incluye la totalidad de las poblaciones
celulares involucradas en la interacción parásito-hospedador y la forma
intracelular del parásito. Nuestro grupo ha validado un sistema HTS en
placas de 384 pocillos, mediante el empleo de un modelo ex vivo de bazos
infectados con una cepa de L. infantum que sobreexpresa de forma estable la
proteína infrarroja iRFP. La regulación de la expresión génica en Leishmania
involucra las zonas 3’ no traducidas (3’UTR), las cuales contienen señales
necesarias para el procesamiento adecuado de los ARNm. La máxima
expresión de la proteína iRFP en la fase de amastigote fue analizada mediante
el clonaje de distintas regiones 3’UTR de genes regulados diferencialmente
en la fase intracelular del ciclo (A2, AMASTIN), y del gen HSP70II de L.
infantum expresado de forma constitutiva, corriente abajo del reportero
infrarrojo. La caracterización de la fluorescencia emitida fue realizada en
promastigotes, amastigotes aislados de infecciones in vitro en la línea humana
THP-1, y amastigotes purificados de bazos de ratones BALB/c infectados.
Las infecciones experimentales en ratones BALB/c para la obtención de los
cultivos ex vivo se llevaron a cabo con la cepa iRFP-3’HSP70+ L. infantum.
La validación del sistema se realizó mediante el testado de una colección
de 320 compuestos en placas de 384 pocillos, obteniendo valores Z>0.5.
La capacidad para identificar compuestos mediante sistemas HTS es vital
para el descubrimiento de nuevos fármacos que puedan ser empleados en un
futuro en la terapia contra la leishmaniosis.
Agradecimientos: trabajo financiado por los proyectos AGL2010 16078/
GAN y CYTED 214RT0482, del Ministerio de Economía y Competitividad
(MINECO).
P14-16
Fosforilación de la histona H2AX en Leishmania
major como respuesta al daño producido en el
ADN por los derivados camptotecínicos
Raquel Álvarez-Velilla, Rafael Balaña-Fouce, Rosa M Reguera-
Torres, Yolanda Pérez-Pertejo
Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de
León, León, ES
La camptotecina y sus derivados estabilizan el complejo de escisión que se
genera entre la Topoisomerasa IB (TopIB) y la molécula de ADN durante el
proceso de replicación. Esta estabilización a menudo implica la formación
de roturas de la doble cadena debido a la colisión entre este complejo y
la horquilla de replicación, lo que puede desencadenar tanto en un arresto
del ciclo celular como en la muerte de la célula. Como consecuencia del
daño producido se activan los procesos de reparación del ADN a través
de modificaciones o variantes de las histonas. Uno de los marcadores mas
tempranos del daño en el material genético en eucarioras es la ϒH2AX, una
variante de la histona H2A con un serina fosforilada. En tripanosomatidos,
esta fosforilación se produce en la treonina 130 situada en el extremo
C terminal de la histona. Por lo tanto, este marcador nos es útil para una
129
Pósters
correcta evaluación del daño sufrido en el ADN provocado por la acción
de los inhibidores camptotecínicos. Diseñamos un péptido para la posterior
inmunización de un conejo y así obtener anticuerpos específicos frente a
la histona fosforilada. Estudiamos el daño producido por la camptotecina
y tres de sus derivados: gimatecan, topotecan y el metabolito activo del
irinotecan, denominado SN38, en promastigotes de Leishmania major.
Estos compuestos fueron evaluados a una concentración fija y distintos
tiempos, observándose en todos los casos una señal positiva para la histona
fosoforilada que va aumentando hasta un máximo de 2 horas. Además se
observa un arresto de ciclo celular en distintas fases como consecuencia de la
rotura de doble cadena durante las primeras horas de exposición a la droga.
Financiación: PI12/00104 del Instituto de Salud Carlos III y CYTED
214RT0482 del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO).
P14-17
Respuesta inmune de dendrímeros carbosilanos en
ganglio de ratón infectado con Leishmania major
Ana Tejería-Bengoechea, José Miguel Escudero-Martínez, Yolanda
Pérez-Pertejo, Rafael Balaña Fouce, Rosa Mª Reguera
Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de
León, León, ES
Se ha estudiado la respuesta inmune ex vivo de 10 nanopartículas
dendriméricas derivadas de carbosilano con diferente carga, sobre
gangliocitos murinos infectados con Leishmania major, el agente responsable
de la leishmaniosis cutánea en el Viejo Mundo. Ratones BALB/c infectados
en la almohadilla plantar con promastigotes metacíclicos de L. major
modificados genéticamente con el gen que codifica la proteína fluorescente
mCherry, se sacrificaron la 16º semana postinfección y se reseccionó el
ganglio poplíteo que drenaba la lesión infectada. Los explantes de ganglio
infectados se cultivaron en presencia de una concentración de cada
dendrímero toxicológicamente no comprometida. Tras 72h de cultivo, se
recogieron los sobrenadantes para valorar las citoquinas: IL-4, IL-12, TNFα
e INFγ. El dendrímero BDEF 031 y los cinco derivados de éste, mostraron
una disminución significativa de la IL-4 y un aumento tanto en la señal de
TNFα como en la del INFγ, ambas correspondientes a una respuesta Th1,
cabe destacar, que ninguno de los dendrímeros mostró cambios en IL-12 con
respecto al control. Los otros 4 dendrímeros, de generaciones superiores a los
anteriores, fueron capaces de disminuir la respuesta Th2 mediada por la IL-
4, pero no fue significativa, mientras que en el caso de la respuesta Th1, no
se encontraron señales de un aumento del TNFα y del INFγ. Para completar
estos resultados de la respuesta inmune se realizó la cuantificación de las
actividades iNOS y arginasa de las células hospedadoras, obteniendo unos
niveles altos de NO en el sobrenadante de los cultivo y una baja actividad
arginasa atribuible a un ratio Th1/Th2 elevado.
Trabajo financiado por los proyectos PI12/00104 del Instituto de
Salud Carlos III y CYTED 214RT0482, del Ministerio de Economía y
Competitividad (MINECO).
P14-18 (R14-4)
Amino alcohols as an appealing and versatile
scaffold for Leishmania chemotherapy.
Unraveling their mechanism of action
M. Ángeles Abengozar Infantes1, Raquel García-Hernández2, Pilar
Fernández de Palencia1, Luis Antonio Bustos3, Ricardo Escarcena3,
Santiago Castanys2, Esther Del Olmo3, Francisco Gamarro2, Arturo
San Feliciano3, Luis Rivas1
1
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Unidad
Metabolómica, Interacciones y Bioanálisis (UMIB), Madrid, ES,
2
Instituto de Parasitología y Biomedicina ‘López-Neyra’, CSIC,
Armilla, ES, 3Facultad de Farmacia, Departamento de Química
Farmacéutica (USAL), Salamanca, ES
130
XXXVII Congreso SEBBM
The quest for new leads against the human infections caused by the
protozoans of the genus Leishmania, known collectively as leishmaniasis,
is urgently demanding, as chemotherapy, based on a paucity of drugs,
is threatened by rising resistance. Aminoalcohols are a versatile
pharmacological scaffold successfully assayed for anti-inflammatory,
antitumoral, antibiotic and antiparasitic activities.
In this work, a set of 15 alkyl-substituted aminoalcohols were assayed
for leishmanicidal activity. All were active at micromolar range, being
compound 5 the best candidate on intracellular L. donovani parasites (IC50=
0.7μM, and selectivity index = 71.4).
The most active compounds induced depletion of intracellular levels
of ATP; however, they displayed a non-homogenous mechanism lethal
pattern, depending on subtle structural differences, as assessed by
biochemical and microscopical techniques. Two polarized modes of
action were unveiled; whereas for compound 5 is based on mitochondrial
dysfunction, with inhibition of complex II of the respiratory chain,
compound 8 behaved as a membrane-active agent inducing an irreversible
loss of internal homeostasis with entrance of vital dyes. Aside from these
two extreme prototypes, others, as compound 9, fell in an intermediate,
gray area, between them with alteration of membrane traffic with
intracellular vesiculation and accumulation of material at the flagellar
pocket.
Altogether aminoalcohols resulted as appealing new candidates for
Leishmania chemotherapy.
Supported by grants VI PN de I+D+I 2008-2011 ISCIII -Subdirección
General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa RICET
(RD12/0018/0007, RD12/0018/0017, RD12/0018/0002), PI12-02706 (LR),
SAF2012-34267 (F.G.), Proyecto de Excelencia CTS-7282 (F.G.) and JCyL
221U13.
P14-19
Clonaje y expresión de la enzima E1, activadora
de ubiquitina, en Leishmania infantum
Jaime Larraga, Pedro José Alcolea, Ana Alonso, Vicente Larraga
Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES
La leishmaniosis es una enfermedad producida por protozoos del género
Leishmania que afecta a dos millones de personas en el mundo. Es
una zoonosis transmitida a través de la picadura de dípteros del género
Phlebotomus. Las principales formas clínicas son cutánea, visceral y
mucocutánea. En Europa el agente causante de la enfermedad visceral es
L. infantum.
La enzima activadora de ubiquitina (E1) cataliza el primer paso en la
reacción de ubiquitinación que marca las proteínas para su degradación
vía proteasoma. Al inicio de la cascada de la ubiquitinación, la enzima
E1 une ATP-Mg2+ y la ubiquitina. En el siguiente paso, una cisteína
catalítica del enzima E1, ataca el complejo ubiquitina-AMP formado a
través de una sustitución acílica, creando simultáneamente una unión
tioéster, liberándose AMP. Finalmente el complejo E1-ubiquitina
transfiere la ubiquitina a la enzima catalítica E2 a través de una reacción
de transesterificación.
Se ha realizado el clonaje del gen activador de la ubiquitina E1
(LinJ.07.0010) en el vector pQE-30 y se llevó a cabo la expresión en la
cepa M15 de E. coli. Las condiciones óptimas de expresión resultaron ser
2h a 30 ºC, siendo parcialmente soluble. Se purificó usando cromatografía
de afinidad y se está procediendo a su caracterización.
Mediante el uso de los programas ClustalW y BlastP se ha realizado el
alineamiento, siendo el grado de homología obtenido aproximadamente
del 90% con L. major y L. braziliensis, reduciéndose este valor al 41%
en el caso de Trypanosoma cruzi, siendo todavía menor en el caso de
los mamíferos. Se ha llevado a cabo el modelado de la proteína con el
programa PyMol.
Granada 2014
P14-20
Efecto de la sobreexpresión de las proteínas
fosfatasas 1 (PP1) en Leishmania infantum
María Degayón, Ana Alonso, Pedro J. Alcolea, Miguel Angel Moreno,
Vicente Larraga
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES
La leishmaniasis visceral es una enfermedad zoonótica causada por
el protozoo Leishmania infantum en la Cuenca Mediterránea, donde
los perros son el reservorio principal. La transmisión se produce
por la picadura del vector Phlebotomus perniciosus. A lo largo del
ciclo biológico digenético, el parásito se desarrolla desde su forma
extracelular y móvil en el hospedador invertebrado, promastigote;
a su estado intracelular y no móvil, en el hospedador mamífero,
amastigote. Las PP1 desempeñan un papel esencial en la regulación
de una gran variedad de procesos en los organismos eucariotas. Sin
embargo, las rutas de señalización celular que desencadenan estos
cambios morfogénicos en L. infantum apenas han sido caracterizadas,
lo que promueve este estudio. El alineamiento comparativo de las
PP1 codificadas por el cromosoma 34 en L. infantum revela un
núcleo catalítico altamente conservado que difiere únicamente en el
extremo N-terminal. Los perfiles de expresión génica analizados por
qRT-PCR a lo largo del ciclo biológico muestran que diversas PP1 se
encuentran sobreexpresadas en promastigotes infectivos diferenciados
en el flebótomo respecto a promastigotes de cultivo axénico. La
sobreexpresión de las PP1 LinJ.15.0240 y LinJ.34.0840 en trasfectantes
estables de L. infantum mediante la integración del plásmido pIR-mcs,
altera la cinética de crecimiento en promastigotes de cultivo axénico.
Asimismo, los estudios por Western blot reflejan un drástico descenso
en la sobreexpresión de las mencionadas PP1 tras 48 h de incubación.
Estas observaciones sugieren que las PP1 podrían desempeñar una
función esencial en los procesos de diferenciación celular.
P14-21
Reticulocyte-prone malaria parasites
predominantly invade CD71hi immature cells:
implications for the development of an in vitro
culture for Plasmodium vivax
Lorena Martín Jaular1, Aleix Elizalde-Torrent1, Richard Thomson-
Luque1, Mireia Ferrer1, Jose Carlos Segovia2, Esperanza Herreros-
Aviles3, Carmen Fernandez-Becerra1, Hernando A del Portillo4
1
CRESIB (Barcelona Center for International Health Research),
Barcelona, ES, 2CIEMAT, madrid, ES, 3Tres Cantos Medicines
Development Campus, GlaxoSmithKline, madrid, ES, 4ICREA -
CRESIB (Barcelona Center for International Health Research),
barcelona, ES
The lack of an in vitro culture for malaria parasites with a unique
tropism for reticulocytes, such as Plasmodium vivax or the P. yoelii
17X strain hinders research in these organisms. In order to advance
in the characterization of infected cells during P.yoelii 17X-Balb/c
experimental infections we have assessed CD71 expression in erythroid
cells (TER119+) as a correlate of maturation. Parasites were found
mainly in immature cells from blood after day 5 post infection (p.i.).
Immature reticulocytes (CD71hi) were present in low levels at the
beginning of the infeccion but its number increases as the infection
progresses. The increase of CD71hi cells in blood concurred with
changes in erythropoietic organs. CD71hi cells appeared in spleen at
day 10p.i and increased in bone marrow from day 15 p.i. being the
cells mainly infected. Interestingly, mean fluorescence intensity (MFI)
of CD71 in infected cells was higher in both, bone marrow and spleen
than in the blood at day 15 p.i. This fact strongly suggests that the
parasite would begin the infection in erythropoietic organs; thereafter,
immature cells would be released to blood. The parasite preference
for immature cells that are rare in normal blood could have important
Pósters
implications for the development of an in vitro culture. As a proof of
concept, we attempted in vitro culture of P.yoelli adding RBCs from
mice with a pyruvate kinase deficiency (PKD). PKD mice presented
high percentages of CD71hi cells in blood comparing with normal
animals. In these conditions, we were able to see merozoite reinvasion
and viable parasites after 120 h of culture.
P14r-22
Tráfico de hemo en Leishmania, un protozoo
parásito auxótrofo para este metabolito esencial
María Cabello Donaire1, Alfonso Calvo2, Francisco J. Gálvez3, Noemí
Vergara-Segura1, Alba Rodríguez-Martínez1, Lina Orrego1, Marta
Martínez-García1, Sophie Malagarie-Cazenave1, M. Carmen Ruiz-
Cantero1, Antonio M. Estévez1, José Mª Pérez-Victoria1
1
Institute of Parasitology and Biomedicine “López-Neyra”, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas-CSIC, Armilla, ES, 2Centro
de Investigación Médica Aplicada-CIMA/Departamento de Histología
y Patología, Universidad de Navarra, Pamplona, ES, 3Estación
Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES
La leishmaniasis es una devastadora enfermedad tropical causada por el
protozoo parásito Leishmania. Su control se basa en la quimioterapia,
pero los fármacos leishmanicidas en uso clínico no son adecuados,
por lo que es prioritario encontrar nuevos tratamientos. Una estrategia
atractiva para la identificación de nuevas dianas farmacológicas consiste
en aprovechar diferencias bioquímicas entre el parásito y el hospedador
humano. El metabolismo del grupo hemo, un metabolito esencial en
todos los organismos aeróbicos, constituye una de estas diferencias,
ya que como el resto de tripanosomátidos patógenos, Leishmania es
auxótrofo para esta porfirina y debe rescatarlo de la persona infectada.
En este trabajo caracterizamos el tráfico de porfirinas a través de la
membrana plasmática de L. major. Mostramos que la entrada de
porfirinas es dependiente de proteína y que se afecta por variaciones
de pH y temperatura así como por la presencia iones y de inhibidores
de la producción de energía. A su vez, existe un eflujo de porfirinas que
también caracterizamos. Por otra parte mostramos la caracterización
de una nueva familia de transportadores de membrana pertenecientes
a la superfamilia MFS. Algunos miembros están implicados en tráfico
de porfirinas en el parásito y otros confieren resistencia a fármacos
leishmanicidas. Finalmente, estamos analizando la implicación de
transportadores ABCB en el tráfico de porfirinas en la mitocondria, el
destino principal del hemo.
Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215
(JMPV), Junta de Andalucía BIO1786 (JMPV) y Fondos FEDER de la UE
(JMPV).
P14-23
Identification of a novel chromatin factor (CPF)
associated with VSG expression in African
Trypanosomes
Andreu Saura, Diana López Farfán, Isabel Vidal-Cobo, Miguel
Navarro
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Granada, ES
Antigenic variation in Trypanosoma brucei involves a sophisticated
mechanism to elude the host immune response by changes in the
expression of different Variant Surface Glycoprotein (VSG). The VSG
is expressed in a mono-allelic manner out of 1000 VSG genes, from one
telomeric site known as VSG-expression site (VSG-ES). The mono-
allelic expressed VSG gene is recruited in a single extra-nucleolar
nuclear body (ESB) that seems to be controlled at several levels. In
131
Pósters
this study, we have identified a novel chromatin factor that function
by enabling and disabling the accessibility of transcriptional factors.
We first developed a monoclonal antibody (11C10E4 mAb) against the
recombinant protein and designed a trypanosome cell line that express
an HA-tagged version of CPF. Western blot analysis using the mAb
11C10E4 showed a single band corresponding to the endogenous CPF
(105 KDa), also detected by epitope-tagging. Subcellular localization
of CPF by Immunofluorescence microscopy using the mAb localized
the protein in the nucleus, as expected. Functional analysis by RNA
interference confirmed first the depletion of CPF by Western blot
analysis. To deepen the phenotype we carried out a reverse transcriptase
quantitative PCR (RT-qPCR), after CPF depletion which showed a
decreased expression of VSG221 mRNA, as well as a slightly increase
of Procyclin mRNA, the surface protein expressed in the Procyclic
insect stage. However, no changes in the ribosomal RNA level were
detected although is also transcribed by the same RNA polymerase.
Next, we investigate the occupancy of CPF along the VSG-ES locus
by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiments using the mAb
anti-CPF. ChIP-qPCR data analysis demonstrated that CPF is present
in VSG221 coding region and the pseudo-VSG, genes located within
the active VSG-ES. Future aims are directed to delineate the specific
function of CPF in VSG-ES expression.
P14-24 (R14-5)
Caracterización funcional de las condensinas
en la variación antigénica de Trypanosoma brucei
Domingo I. Rojas-Barros1, Jean-Mathieu Bart2, Diana López-Farfán1,
Miguel Navarro1
1
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC,
Granada, ES, 2Instituto de Salud “Carlos III”, Madrid, ES
Los tripanosomas africanos eluden la respuesta inmunológica del
hospedador expresando consecutivamente distintos tipos de la
Glicoproteína Variable de Superficie (VSG) lo que permite al parásito
una infección persistente. Trypanosoma brucei dispone de un complejo
sistema genético dedicado a proporcionar todo un repertorio de miles de
genes que codifican diferentes VSG. Sin embargo, para una variación
antigénica eficaz, el parásito debe expresar en la membrana un solo tipo
de VSG en un momento dado, lo que requiere la expresión monoalélica
de la familia multigénica de VSG. Recientemente hemos descrito que
el complejo Cohesina es importante para la regulación de la VSG, ya
que la interferencia de RNA de las cohesinas conduce a la separación
prematura de las cromátidas hermanas del VSG-ES y a un incremento
en la frecuencia de aparición de nuevas variantes antigénicas (Landeira
et al., JCB. 2009).
Las condensinas, junto con las cohesinas, son complejos cuya función
es esencial para mantener la topología de los cromosomas a lo largo del
ciclo celular. Recientemente se ha sido descrito que las condensinas están
involucradas en la regulación de la expresión génica (Hirano et al. G&D,
2012). Para estudiar la función de las condensinas en T. brucei hemos
caracterizado funcionalmente las subunidades TbSMC4 y TbCND2 del
complejo. Para ello, hemos generado un anticuerpo monoclonal y un
antisuero de conejo frente a TbSMC4. Análisis por imunoflorescencia nos
ha permitido determinar la localización nuclear de TbSMC4. Experimentos
de interferencia de RNA (RNAi) de TbSMC4 muestran un incremento
significativo del porcentaje de células en fase G2, demostrando la función
esencial de las condensinas en el control del ciclo celular en este protozoo
parásito. Además, RNAi de TbSMC4 y TbCND2 provocó un incremento
en la frecuencia de variación antigénica, detectándose la expresión de
otras VSG. Estos resultados sugieren que el complejo Condensina juega
un papel importante en el establecimiento y/o mantenimiento del estado
transcripcional del VSG-ES.
132
XXXVII Congreso SEBBM
P14-25
Identificación de polimorfismo F200Y del
gen de β-tubulina en una población de
Haemonchus contortus aislada en la Facultad
de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM,
Estado de México
Rosa Isabel Higuera Piedrahita1, Jorge Alfredo Cuéllar Ordaz1, Maria
Eugenia López Arellano2, F. Alba Hurtado1, Gabriel Ramírez Vargas2,
César Cuenca Verde1
1
Maestría en Ciencias de la Producción y Salud Animal. Facultad de
Estudios Superiores Cuautitlán. UNAM, Cuautitlán, MX, 2Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.
Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología
Veterinaria, Jiutepec, MX
Haemonchus contortus es uno de los parásitos gastrointestinales
con mayor impacto en los sistemas productivos mexicanos. La
genotipificación del polimorfismo F200Y del gen de β-tubulina permite
monitorear la resistencia en fincas y puede ayudar a correlacionar con
factores de riesgo y prácticas de manejo en campo. El aislamiento
de la cepa de Haemonchus contortus en la FES Cuautitlán muestra
susceptibilidad del 80- 90% a bencimidazoles en ensayos in vitro
(Moreno y col., 2013), sin embargo se requiere confirmar como cepa
susceptible por métodos moleculares. El objetivo de éste estudio fue
determinar el polimorfismo F200Y del gen de β-tubulina de esta cepa
provenientes de ovinos. El estudio se realizó en la Unidad de Helmintos
del CENID-PAVET, INIFAP, Jiutepec, Morelos. Se realizó la extracción
y digestión de DNA de larvas infectantes (L3) a 56 ºC por 12 horas, se
realizó la cuantificacion DNA en un nanodrop, obteniéndose 2,8 ug/
uL, con una correlación de 260/280 de 2,04. Paso seguido, se realizó la
técnica de Alelo Específico - PCR (AS-PCR) para la identificación del
polimorfismos, se utilizaron 10uL de Gotaq® que contiene 1X de buffer,
0.25uM de primer, 0,2 mM de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 y 1 U de Taq
polimerasa en 22uL y 40 ciclos de amplificación. En la primera reacción
se utilizó 1uL de PN1: (5’-GGCAAATATGTCCCACGTGC-3’) y 1uL
de PN2 (5’-GAAGCGCGATACGCTTGAGC- 3’) y 8uL de DNA de
larvas tres. El segundo PCR se realizó utilizando 8uL de DNA del primer
PCR, se utilizó 1uL de PH1 (5’-GGAACGATGGACTCCTTTCG-3’);
1uL de PH2 (5’- GATCAGCATTCAGCTGTCCA-3’) y 1ul de PH3
(5’- CTGGTAGAGAACACCGATGAAACATA-3’) para resistencia
y 1ul de PH4 (5’-ATACAGAGCTTCGTTGTCAATACGA-3’) para
susceptibilidad (Méo y col., 2012). Los resultados muestran que la cepa
de Haemonchus contortus de la FES Cuautitlán presentó un patrón de
bandas de 250 (fragmento resistente) y 550 (fragmento susceptible), lo
cual indica que es una cepa heterocigota, resultados que contrastan con
lo notificado por Moreno y col. (2013) e Higuera y col. (2014) donde
había sido susceptible en estudios in vitro e in vivo. Éstos resultados
nos indican que la presión que se realiza el aislamiento para mantenerla
debe ser mínima manteniendo individuos susceptibles en su mayoría,
además de que las pruebas moleculares son mucho más sensibles para
realizar el diagnóstico de resistencia a bencimidazoles.
P14-26
Estudio de nuevos compuestos con actividad
leishmanicida, inhibidores de la expresión de
genes implicados en la resistencia y virulencia
Celia Fernández-Rubio1, Daphne Campbell1, Elena Ibañez2, Esther
Moreno3, Andrés Vacas-Oleas1, Juana Schwartz3, Juan Antonio
Palop4, Alfonso Calvo5, Socorro Espuelas3, Carmen Sanmartin4,
Paul Nguewa1
1
Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento
de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona,
ES, 2Centro de Investigación Médica Aplicada-CIMA, Universidad
de Navarra, Pamplona, ES, 3Instituto de Salud Tropical/Department
Granada 2014
of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy,
University of Navarra, Pamplona, ES,4Instituto de Salud Tropical/
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, University of
Navarra, Pamplona, ES, 5Centro de Investigación Médica Aplicada-
CIMA/Departamento de Histología y Patología, Universidad de
Navarra, Pamplona, ES
La OMS clasifica a la leishmaniasis como una de las enfermedades
tropicales desatendidas y de interés mundial. Entre las prioridades
actuales en el abordaje de estas patologías, está la búsqueda de nuevos
tratamientos. A partir de un banco de compuestos, cuatro fueron
seleccionados según los criterios empíricos de un buen fármaco. Dos
de ellos (2b y 4b) presentaron en ensayos de dosis-respuesta frente a
promastigotes de L. major bajas IC50s (< 3 μM) y altos índices de
selectividad debido a su escasa toxicidad en macrófagos. Se midió el
potencial terapéutico de los dos posibles antiparasitarios, observándose
una reducción de la carga parasitaria cercana al 80% en macrófagos
murinos infectados a concentraciones subletales de ambos. El
fármaco leishmanicida de referencia, la paromomicina, presentó una
disminución menor, cercana al 60%. Además, 2b y 4b inducen por sí
mismos la liberación en los macrófagos de óxido nítrico cuya actividad
leishmanicida ha sido ampliamente descrita. El estudio de la actividad
de estos compuestos demostró alteración del ciclo celular con arresto
en la fase G1, siendo muy significativo en el caso del compuesto 2b.
Se analizó la expresión de genes relacionados con la proliferación
(PCNA), resistencia a fármacos (ABC-transporter y α-tubulina) y
virulencia (QDPR). Se observa una disminución de los niveles de
PCNA, α-tubulina y QDPR tras el tratamiento con ambos compuestos.
Sin embargo, no varía la expresión de ABC-transporter, que se ha
descrito como una de las principales familias de proteínas implicadas
en la multiresistencia a fármacos. Por los resultados mencionados,
consideramos estos compuestos con actividad leishmanicida como
buenos candidatos para futuros estudios en un modelo animal de
leishmaniasis cutánea.
P14-27 (R14-3)
Papel de la proteína de unión a RNA RBP33
en el silenciamiento de la expresión génica en
Trypanosoma brucei
Sandra Fernández Moya1, Mark Carrington2, Antonio M. Estévez3
1
LMU-München, Departamento de Anatomía III-Biología Celular,
Múnich, DE, 2University of Cambridge Department of Biochemistry ,
Cambridge, UK, 3Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-
Neyra”, IPBLN-CSIC, Armilla, ES
En esta comunicación presentamos la caracterización inicial de la
proteína de unión RNA RBP33 de Trypanosoma brucei. RBP33 es
una proteína nuclear y esencial para la viabilidad del parásito. Hemos
identificado el conjunto de los RNA asociados a RBP33 mediante
inmunoprecipitación de los complejos RNA-proteína y posterior
secuenciación masiva (RNAseq). La mayoría de los transcritos unidos
a RBP33 están descritos como no codificantes, siendo un tercio de éstos
producidos por genes localizados al final de las unidades de transcripción
policistrónicas o localizados en orientación antisentido dentro de una
unidad transcripcional. La depleción mediante RNAi de RBP33 conduce
a un aumento en los niveles de RNA provenientes de regiones que
están normalmente silenciadas, tales como zonas de cambio de hebra,
retrotransposones o secuencias repetidas, siendo este fenómeno más
acusado en la forma sanguínea del parásito. Este trabajo supone el primer
ejemplo de una proteína de unión a RNA implicada en la regulación del
silenciamiento génico en tripanosomas.
Pósters
P15. Radicales libres y estrés oxidativo
P15-1
Cambios en la homeostasis del hierro (Fe) y
expresión de óxido nítrico sintasa inducible
(iNOS) en el preacondicionamiento (P) hepático
con hierro frente a isquemia reperfusión (IR)
Virginia Fernandez, Angela Novoa Arce, Arlette Román Salinas,
Romina Vargas Villagrán, Luis A. Videla Cabrera, Pamela Cornejo
Zamorano
Universidad de Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de
Farmacología, Santiago, CL
La isquemia-reperfusión (IR) asociada a cirugías hepáticas bajo oclusión
vascular, desencadena inflamación en el hígado, asociado a la activación
temprana de las células de Küpffer que liberan especies reactivas del
oxígeno, gatillando un estrés oxidativo drástico. El uso del protocolo de
protección contra la IR consistente en 6 dosis de 50 mg/kg de Fe en días
alternos (P con Fe; PFe), genera una ventana de estrés oxidativo transiente
que recupera la actividad del NF-κB, factor de transcripción redox sensible.
Considerando que NF-κB regula la expresión de la iNOS, y los efectos
hepatoprotectores de esta enzima, en este estudio se evaluó la expresión
(RT-PCR) y actividad (niveles de nitritos y nitratos séricos) de iNOS
en ratas sometidas al protocolo de PFe o dosis equivalentes de salino
(controles), seguido de 1 h de isquemia y 20 h de reperfusión o cirugía
sham (laparatomía sin isquemia). Además, se evaluó la expresión de
proteínas que regulan la homeostasis del Fe, hepcidina (qPCR) que
degrada a la ferroportina (exportador celular de Fe), ferroportina y ferritina
(almacenador celular de Fe) (RT-PCR) en hígado de rata.
En relación a controles-sham, la IR per se incrementó la expresión de iNOS,
efecto exacerbado 5,2 veces por el PFe, el cual aumentó 1,3 veces (p<0,05)
los niveles de nitritos/nitratos séricos. En estas condiciones, el PFe frente a
la IR indujo la expresión de hepcidina (7 veces) y la de ferritina (2 veces),
sin cambios en la expresión de ferroportina.
Se concluye que el PFe se asocia a la inducción de iNOS, enzima de
acción antioxidante ya que •NO neutraliza radicales superóxido. La
inducción de hepcidina limita los niveles de ferroportina, favoreciendo el
almacenamiento del Fe en la ferritina, evitando sus efectos deletéreos.
Financiado por FONDECYT 1110006
P15-2
Protein kinase CK2 as a potential therapeutic
target in glioblastoma: preliminary preclinical
studies with apigenin based inhibition
Laura Ferrer-Font1, Estefania Alcaraz1, Maria Plana1, Ana Paula
Candiota2, Emilio Itarte1, Carles Arús1
1
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat
Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2Centro de
Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y
Nanomedicina (CIBER-BBN), Cerdanyola del Vallès, ES
Glioblastoma (GBM) is the most aggressive human glial tumour, with
a median survival of 14-15 months. Temozolamide (TMZ) is a standard
chemotherapeutic for GBM treatment. Cancer stem cells (CSC) mediate
chemoresistence, indicating their persistence in these tumours after
treatment. Protein kinase CK2 contributes to tumour development,
proliferation, and suppression of apoptosis in cancer, and it is overexpressed
in human GBM. Targeting CK2 in GBM treatment could benefit patients.
We have studied the CK2 expression level, using Western Blot analysis,
normalized to constitutive tubuline content in preclinical GBM. Orthotopic
GBM growing in C57Bl/6 mice (n=3) were generated by injecting 105
GL621 cells. Tumour volumes were assessed by T2W MRI during 15
days and mice sacrificed (final volume 77.3+10.9mm3). Both contralateral
133
Pósters
non-affected brain parenchyma and wild type mice brains (n=3) were
investigated. We also evaluated the effect of TMZ and apigenin (API),
a CK2 inhibitor, in cultured GL261 cells. For this, incubation of GL261
cells in 6-well plates with 20, 40 and 100μM drug was performed and cell
viability was assessed by the Trypan Blue method. The expression level
of CK2 catalytic subunit (CK2α) was found higher in tumour (4-fold)
and in contralateral brain parenchyma (2-fold) than in wild type tissue
(p <0.05). In contrast, no significant changes were detected in CK2
regulatory subunit (CK2β) expression, suggesting a predominance of free
CK2α in tumours. In in vitro experiments, API decreased cell viability
with respect to control as compared to TMZ (28.8+5% and 64.3+1,5%,
respectively) at equal drug concentration (100μM). Our data suggest
that CK2 targeted inhibitors could offer an alternative treatment for
chemoresistance to TMZ in preclinical GBM studies.
Supported by: SAF 2011-23870, SGR191-2014.
P15-3 (R15-4)
Activación por hipoxia del nicho neurogénico
del cuerpo carotídeo
Aida Platero-Luengo1, Susana González-Granero2, Blanca Díaz-
Castro1, José Ignacio Piruat1, José Manuel García-Verdugo2, Ricardo
Pardal1, José López-Barneo1
1 Gonzalez2, Angeles Almeida1, Juan P. Bolaños1
Instituto de Biomedicina de Sevilla, Universidad de Sevilla,
Sevilla, ES, 2Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología
Evolutiva, Universidad de Valencia, Valencia, ES
El mecanismo por el cual los estímulos ambientales y la demanda
fisiológica son capaces de modular los nichos neurogénicos en los
organismos adultos es una cuestión clave para entender la función de los
procesos de formación de nuevas neuronas en la etapa postembrionaria.
Nuestros estudios con células madre neurales del cuerpo carotideo, un
órgano quimiosensor responsable de la respuesta ventilatoria arterial, han
revelado cómo el estímulo hipóxico es capaz de activar la proliferación del
nicho neurogénico del cuerpo carotídeo a través del establecimiento de una
estructura tipo sinapsis entre la célula glómica neuronal madura y la célula
progenitora de donde proviene. De este modo, se establecen mecanismos
de control donde los elementos maduros pueden influir sobre los elementos
indiferenciados para conseguir un equilibrio en el desarrollo de la función
del órgano. El modelo establecido para el cuerpo carotídeo demuestra
cómo los distintos elementos de un nicho neurogénico se coordinan para
permitir al tejido adaptarse a situaciones fisiológicas cambiantes.
P15-4 (R15-3)
Cyclin B1: mediator of mitochondrial dysfunction
in excitotoxicity
Carolina Maestre1, Miguel Veas-Pérez de Tudela2, Juan P. Bolaños2,
Ángeles Almeida2
1
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES,
2
Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca, Hospital
Universitario de Salamanca - Instituto de Biología Funcional y
Genómica, Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca, ES
Anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), an E3 ubiquitin ligase
that destabilizes cell cycle proteins, is activated by Cdh1 in post-mitotic
neurons, where it regulates axonal growth, synaptic plasticity and survival.
The APC/C-Cdh1 substrate, cyclin B1, has been found to accumulate in
degenerating brain areas in Alzheimer´s disease and stroke. Recently, we
have reported that stimulation of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR)
that occurs in neurodegenerative diseases promoted the phosphorylation of
Cdh1 by the Cdk5/p25 complex, a condition necessary and sufficient for its
translocation to the cytosol and APC/C-Cdh1 inactivation. This led to the
stabilization of cyclin B1 in cortical neurons and cell death. These results
highlight the importance of elucidating the role of cyclin B1 in neurons
under excitotoxic conditions relevant to neurological disease.
134
XXXVII Congreso SEBBM
Cortical neurons in primary culture were stimulated with glutamate (100 μM)
and mitochondrial function and generation of radical oxygen species were
measured by flow cytometry. Here we described that glutamate promoted
oxidative stress and mitochondrial membrane potential depolarization by
a mechanism involving cyclin B1 accumulation. Moreover, expression
of either cyclin B1 or hEmi1, a well-known APC/C inhibitor, induced
oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegeneration.
Our results suggest that NMDAR stimulation increased Cdk5 kinase
activity leading to Cdh1 phosphorylation, APC/C inactivation and cyclin
B1 stabilization. As a consecuence, cyclin B1 promoted oxidative stress,
mitochondrial dysfunction and neuronal apoptotic death. These results
reveal Cdh1 as a novel Cdk5 substrate that mediates cyclin B1 neuronal
accumulation in excitotoxicity.
Funded by ISCIII (PS09/0366, RD06/0026/1008) MICINN (SAF2010-
20008), and Junta de Castilla y León.
P15r-5
NMDA receptor activity in astrocytes sustains
neuronal survival through a p35/Cdk5-Nrf2
pathway
Daniel Jimenez Blasco1, Patricia Santofimia-Castaño2, Antonio
1
Institute of Functional Biology and Genomics (IBFG), University
of Salamanca-CSIC, Salamanca, ES, 2Department of Physiology,
Faculty of Veterinary, University of Extremadura, Caceres, ES
Glutamatergic neurotransmission unavoidably enhances reactive oxygen
species (ROS) that in excess can trigger oxidative damage eventually leading
to neurodegeneration. Neurons are equipped with discrete antioxidant
defense that is insufficient to fully provide self-protection under certain
stressing conditions. Their neighbor astrocytes complement the antioxidant
defense and survival of neurons by releasing glutathione precursors,
which neurons take up for de novo glutathione biosynthesis. However, the
molecular mechanism by which neurons communicate astrocytes the need
for glutathione precursors to support survival during neurotransmission
is unknown. Here, we show that N-methyl-D-aspartate (NMDA), a
glutamate-receptor subtype agonist, at a dose sustaining neurotransmission
activates NMDA receptors in astrocytes triggering a signaling cascade
involving protein kinase Cd-dependent p35/cyclin-dependent kinase-5
(Cdk5) activation. Active p35/Cdk5 poly-phosphorylates nuclear factor-
erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), which translocate to the nucleus to
promote the expression of antioxidant genes. Furthermore, by releasing
glutathione precursors, NMDA receptor-mediated Nrf2 activation in
astrocytes sustains the antioxidant defense and survival of closely spaced
neurons. Thus, during neurotransmission, glutamate-receptor activation
in astrocytes decisively contributes to boost the antioxidant defense and
survival of neurons.
P15-6 (R15-2)
Micro RNAs involved in redox responses:
some examples related to organ fibrosis
Santiago Lamas Peláez
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas - Centro de Biologia
Molecular Severo Ochoa, Madrid, ES
Recent evidences point to the existence of a set of microRNAs that
participate actively in redox homeostasis and hormesis, and the term
“redoximirs” has been coined to define them. Reciprocally, proteins
involved in the basic machinery of microRNA processing can be
influenced by the cellular redox state. MicroRNAs may regulate central
pathways of the antioxidant response such as that of Nrf2 or directly
regulate the generation of reactive oxygen species by targeting mRNAs
that code for proteins directly involved in this process such as NOXs
Granada 2014
or components of mitochondrial complexes. We have focused on two
different potential targets: a) miRNAs regulating the levels of the
most relevant endogenous antioxidant, glutathione (GSH) b) miRNAs
targeting ROS generating proteins involved in fibrogenesis. We
identified mir-433 as a redoximir capable of targeting both the catalytic
and modulatory subunits of Glutathione-cysteine ligase (GCL) and of
reducing GSH levels. In addition we could demonstrate the participation
of mir-433 in fibrotic processes by using models of fibrosis in the liver
(bile duct ligation) and kidney (unilateral ureteral obstruction). We have
also identified a novel microRNA that participates in the regulation of
fibrogenesis by targeting both NOX-4 and the TGF-b pathway in cellular
and animal models of fibrosis as well as in patients with idiopathic
pulmonary fibrosis. We believe redoximirs constitute an important
potential pathway to understand the involvement of redox responses in
pathophysiological processes leading to organ fibrosis.
P15-7
Influencia del estrés oxidativo en la vía
de activación de la proteína quinasa activada
por AMP (AMPK) hepática en ratas tratadas
con hormona tiroidea (T3)
Pamela Cornejo Zamorano1, Romina Vargas Villagran2, Virginia
Fernández Arancibia2, Luis A. Videla Cabrera2
1
Universidad Diego Portales, Facultad de Salud y Odontología,
Escuela de Tecnología Médica, Ñuñoa, CL, 2Universidad de
Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de Farmacología,
Independencia, Santiago, CL
La administración de T3 conduce a estrés oxidativo (EOx) hepático,
mediado por el efecto calorigénico de la hormona. AMPK es un
sensor del estado energético celular, regulada por alosterismo (AMP)
y por fosforilación reversible de la subunidad catalítica α por distintas
proteínas quinasas tales como TAK1, CaMKKβ y LKB1. El objetivo de
este estudio es determinar el efecto del EOx en la expresión de AMPK
en hígado de rata por la administración de T3 y determinar su correlación
con la expresión de TAK1 y CaMKKβ. Para esto los animales fueron
pretratados 0,5 horas antes de la administración con T3 (0,1 mg/Kg de
peso) con el antioxidante N-acetilcisteina (NAC) 0,5 g/Kg. Se midieron
los niveles de mRNA con qPCR, niveles proteicos mediante Western
Blot y 8-isoprostanos hepáticos y plasmáticos como parámetro de EOx
con un kit comercial. La administración de T3 produjo un incremento
estadísticamente significativo en los niveles de mRNA de AMPK en
comparación con los controles (p<0,05), efecto suprimido parcialmente
con el pretratamiento con NAC. Por otra parte, se observó aumento de
6,4 veces y 291 veces en los niveles de mRNA de CaMKKβ y TAK1
respectivamente luego del tratamiento con la hormona en comparación
con los controles, efecto abolido por la administración de NAC. Se
determinó el efecto sobre la relación TAK1 fosforilada/TAK1 no
fosforilada, observándose un incremento estadísticamente significativo
después de tratamiento con T3 comparado con los valores controles
(190%), efecto parcialmente suprimido en los animales que fueron
pretratados con NAC (p<0,05). Los niveles de CaMKKβ aumentaron
65% en relación a los controles, efecto anulado con el pretratamiento
con NAC. Los niveles de 8-isoprostanos plasmáticos y hepáticos de
ratas tratadas con T3 aumentaron en relación a controles, efecto abolido
en los animales pretratados con NAC. Se concluye que el incremento
en la expresión de AMPK hepática inducida por T3 está mediado por un
mecanismo redox al cual podría contribuir el aumento en la expresión y/o
activación de TAK1 y CaMKKβ.
Financiado por FONDECYT 1120034.
Pósters
P15r-8
Análisis de las micorredoxinas de
Corynebacterium glutamicum y su papel
en el control del estrés oxidativo
Almudena F. Villadangos, Jose A. Gil, Luis M. Mateos
Área de microbiología, departamento de biología molecular,
facultad de ciencias biológicas y ambientales, Universidad de León,
León, ES
Las células sufren oxidaciones moleculares indeseables derivadas del propio
metabolismo aerobio y de agentes exógenos tóxicos. Los mecanismos de
respuesta celular combaten esas oxidaciones manteniendo un ambiente
reductor en el citoplasma mediante el uso de sistemas de “buffer” Redox.
Un sistema Redox exclusivo de actinomicetos, el cual depende de redoxinas
específicas (micorredoxinas; Mrx) y de compuestos de bajo peso molecular
(micotiol; MSH), conforma el par Redox Mrx/MSH.
Representantes del grupo de actinomicetos están ampliamente distribuidos
en la naturaleza y presentan gran interés desde el punto de vista industrial
(p.e. Streptomyces es el principal productor de antibióticos) y médico.
Con respecto a este último aspecto, el par Mrx/MSH podría ejercer
un papel relevante en los procesos de supervivencia de los miembros
de actinomicetos patógenos más representativos (Mycobacterium
tuberculosis, Rhodococcus equi o Corynebacterium diphtheriae) frente al
desafío con agentes oxidantes del hospedador.
El conocimiento detallado de las micorredoxinas a nivel molecular
y funcional en representantes de actinomicetos facilitaría la tarea
indicada. Nuestro grupo de trabajo ha identificado varias micorredoxinas
en Corynebacterium glutamicum, M. tuberculosis y R. equi, siendo
denominadas Mrx1 y Mrx3. Las micorredoxinas son proteinas pequeñas
con un centro activo conservado “CxxC” y próximo al extremo N-terminal;
estas Mrx son específicas de MSH y no se acoplan con otros compuestos
de bajo peso molecular (glutation o bacilitiol) de otros sistemas Redox. En
C. glutamicum se han obtenido mutantes “knockout” simples y dobles para
los genes mrx1 y mrx3, siendo estos mutantes sometidos a análisis de estrés
oxidativoin vivo por presencia de metales pesados (cadmio, manganeso
o arsenico) o agentes qúimicos como peróxido de hidrógeno y diamida.
Los resultados indican que Mrx1 y Mrx3 tienen un papel importante en
el restablecimiento de la viabilidad celular después de ser somentidos a
estrés oxidativo. La proteina Mrx1 de C. glutamicum [1] y M. tuberculosis
[1,2] ha sido recientemente caracterizada in vitro. Los ensayos in vitro
realizados con Mrx1 para determinar la cascada multienzimática mostraron
que la enzima es reducida mediante MSH [1,2]. La proteína Mrx3 de C.
glutamicum presenta igualmente el motivo típico “CxxC” del centro activo,
así como una cisteína adicional “atípica” (C65), aunque hasta el momento se
desconoce su cascada enzimática in vitro.
Bibliografía
[1] E. Ordóñez, K. Van Belle, G. Roos, S. De Galan, M. et al. J Biol Chem
2009; 284:15107-15116.
[2] K. Van Laer, L. Buts, N. Foloppe, D. Vertommen, et al. Mol Microbiol.
P15-9
DHA diet supplementation modulates the
activation of neutrophils in post-exercise
conditions
Miquel Martorell, Xavier Capó, Antoni Sureda, Joan Miquel Batle,
Isabel Llompart, Josep A Tur, Antoni Pons
Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress,
IUNICS, University of the Balearic Islands - CIBER: CB12/03/30038
Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, CIBERobn, Instituto de
Salud Carlos III-ISCIII, Palma de Mallorca, ES
Background and objectives: Docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n3)
increases phagocytic and fungical activity of neutrophils. We aimed to
135
Pósters
study the effects of training and DHA diet supplementation on the reactive
oxygen and nitrogen species production by neutrophil in football players.
Methods: Subjects were randomly included into two groups: placebo and
experimental groups. The placebo group took one liter five times a week
of a placebo drink and the experimental group consumed the experimental
drink enriched with DHA. Blood samples, used to purify neutrophils and
serum, were collected at the beginning in basal conditions and after 8 weeks
of training and diet intervention in basal and in post-exercise conditions.
ROS production by neutrophils after the activation with zymosan and with
phorbol myristate acetate (PMA) were determined by chemiluminescence
techniques. Nitrate levels were determined both in serum and in neutrophil
using a nitric oxide analyzer (NOA) 280i (Sievers).
Results: Neutrophils counts were not influenced by the training season or
the DHA diet supplementation, but the acute exercise realized at 8 weeks
significantly increased neutrophil counts. No effects were observed in the
chemiluminescence produced by neutrophils after their activation with
zymosan or PMA in the basal condition, however, the exercise significantly
increased neutrophil ROS production in response to immune stimulus
without effects of DHA diet supplementation. Moreover, the exercise
significantly decreased the time at which the maximal ROS production was
attained, and this decrease was higher in the experimental group. Exercise
significantly decreased nitrate levels in neutrophil but their increased in
serum, in both placebo and experimental groups, but this effect was higher
in the experimental group.
Conclusion: The consumption of an enriched DHA beverage for eight
weeks accelerates the postexercise neutrophil production of ROS after
stimulation with zymosan and increases the neutrophil secretion of nitrate
in post-exercise conditions.
Keywords: Docosahexaenoic acid; DHA; neutrophil; exercise; zymosan;
PMA; nitrate.
Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research
and Health Sciences, Projects 11/01791, Red Predimed-RETIC
RD06/0045/1004, and CIBERobn CB12/03/30038.
P15r-10 (R15-5)
The effects of NQO1 deletion in Nrf2/Akt
pathways and growth deregulation of mouse
embryonic fibroblasts
Julia Ariza Gómez1, Laura Jódar Montilla1, Evi Mercken2, Michel
Bernier2, Rafael de Cabo Moreno2, José Manuel Villalba Montoro1
1
Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, University
of Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario,
CeiA3, Córdoba, ES, 2Experimental Gerontology Section,
Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging,
National Institutes of Health, Baltimore, US
NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) is a 31kDa ubiquitously
expressed flavoenzyme that plays an important role in antioxidant defense,
being one of the best characterized detoxifying enzymes whose expression is
regulated by Nrf2. NQO1 catalyzes the reduction of several quinone substrates
using both NADH and NADPH. Besides its role as antioxidant, NQO1 has
been involved in the regulation of cell growth and development. Although
cells from many solid tumors contain increased levels of NQO1, low levels of
NQO1 are also associated with tumor development and carcinogenesis. Our
results show that the lack of NQO1 results in higher proliferation rates and
extended lifespan of immortalized MEFs, which is consistent with a role for
decreased NQO1 expression in tumor development. We have also observed
increased nuclear translocation of Nrf2 in NQO1KO MEFs, as well as in liver
of NQO1KO mice when compared to their Wt counterparts. An enhancement
of Nrf2-mediated antioxidant response might constitute a hormetic response
to the lack of NQO1 which, together with the activation of the Akt pathway
and higher levels of the glucose transporter GLUT1, could result in increased
growth and lifespan of NQO1KO cells. In fact, teratomas are generated when
NQO1KO cells are subcutaneously injected into immunodeficient mice.
However, NQO1KO MEFs also exhibited higher levels of apoptosis when
136
XXXVII Congreso SEBBM
compared to their Wt counterparts. This could be driven by the presence
of dysfunctional mitochondria in NQO1KO cells, which causes outer
mitochondrial membrane permeabilization and the release of apoptotic factors
that trigger the apoptosis process. Deregulation of mitogenic pathways could
surpass this increase of apoptotic signaling resulting in the overall stimulation
of growth rate and extended long-term survival of MEFs lacking NQO1.
P15-11
Hyperbaric oxygen therapy in the management
of chronic wound induces an antioxidant response
and modulates plasma VEGF and endothelin-1
Antoni Sureda1, Juan M. Batle1, Xavier Capó1, Miquel Martorell1,
Silvia Tejada2, Josep A. Tur1, Antoni Pons1
1
Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress,
IUNICS, University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca,
Spain and CIBER: CB12/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad
y la Nutrición, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de
Mallorca, ES, 2Experimental Laboratory, Research Unit, Son Llàtzer
Hospital, IUNICS and University of the Balearic Islands , Palma de
Mallorca, ES
Hyperbaric oxygen (HBO) treatment is the medical use of oxygen at higher
than 1 atmosphere of pressure. The aim of the study was to evaluate the
effects of HBO clinical treatment on the antioxidant response and the levels
of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endothelin-1 in patients
with chronic wounds. Ten patients with a chronic wounded situation (diabetic
wounds, osteomyelitis, enteritis radica and osteoarthritis) were volunteered
to participate in the study. The average time wounds without healing before
starting the HBO treatment were 20.5 ± 10.1 months. The patients performed
20 HBO sessions and blood samples were taken before and 2 hours after
the sessions 1, 5 and 20. No significant differences were reported in the
hematological parameters. Serum CK activity was progressively decreasing
with the sessions performed. No significant differences were reported in any
enzymatic activity of erythrocytes after HBO treatments. Plasma catalase
activity responded to the HBO therapy with a significant increase after the
first and fifth sessions. Plasma MPO activity was significantly reduced after
all analysed sessions. VEGF levels significantly increased after the sessions
respect to the pre-session values. Endothelin-1 levels were progressively
decreasing during the HBO therapy, with significant differences at the
session 20. No significant differences were evidenced in plasma nitrite
levels. The levels of MDA adducts in plasma were significantly lower
at the last analysed session. In conclusion, HBO therapy increases the
plasma antioxidant defenses and regulates angiogenesis and vascular tone
by increasing VEGF and decreasing endothelin-1, which may be important
factors in promoting enhanced wound healing.
Keywords: Antioxidants, Chronic wound, Hyperbaric chamber, Oxidative
damage, VEGF.
Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research and
Health Sciences, Projects 11/01791, Red Predimed-RETIC RD06/0045/1004,
and CIBERobn CB12/03/30038.
P15-12
Assessment of environmental pollution applying
oxidative stress biomarkers in the mussel Mytilus
galloprovincialis
Silvia Tejada1, Antoni Sureda2, Ainhoa Zuazu3, Miguela Méndez2,
Antonino Natalotto4, Salvatore Fasulo4, Salud Deudero3
1
University of the Balearic Islands / Experimental Laboratory, Research
Unit, Son Llàtzer Hospital, IUNICS, Palma de Mallorca, ES, 2Research
Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS,
University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, Spain and
CIBER: CB12/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición,
Granada 2014
Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de Mallorca, ES, 3Spanish
Institute of Oceanography, Palma de Mallorca, BI, ES, 4Dep. of Animal
Biology and Marine Ecology, University of Messina, IT
In polluted environments, and especially in coastal waters, living organisms
are most often exposed to complex mixtures of chemical contaminants.
Mussels are desirable as bioindicators since they are likely to reflect
changes in the environment pollution status. Transplanting mussels from a
reference site to different locations allows biomonitoring the alterations due
to environmental pollutants. The aim of the present study was to analyse the
biochemical response of the mussels (Mytilus galloprovincialis) exposed to
petrol refinery. Mussels purchased from a mussel farm in Messina (Italy)
were transplanted for two months in a control clean site (Brucoli) and a
polluted site (Priolo refinery). A third group was maintained in the same
conditions in the farm for two months. Gills from each specimen (n=8 for
each station) were dissected and used for biochemical analysis. Mussels
from the three studied areas presented the same length and width. Mussels
from the polluted site presented higher levels of malondialdehyde respect
to the clean site. The activities of catalase and glutathione-S transferase
(GST) were significantly higher in the polluted site, whereas the activity
of acetylcholinesterase was significantly lower respect non-polluted sites.
A significant increase in the gene expression of metallothionein (MT)-10,
MT-20 and cytochrome P450 were reported in the polluted site respect
to the other areas, whereas the increase in catalase and GST was not
statistically significant. In conclusion, pollutants induce oxidative stress
and increase the antioxidant and detoxifying system in mussels. The use
of biomarkers in gills of the mussel M. galloprovincialis is a good tool to
categorize differences between polluted and non-polluted areas.
Keywords: Antioxidants, Biomarkers, Oxidative damage, Pollution.
Acknowledgments: National Parks Program 024/2010 and CIBERobn
CB12/03/30038.
P15-13
Drug screening in Drosophila models of FRDA
and PD
Pablo Calap Quintana1, Francisco José Sanz López1, Lucía Benito
Jardón1, Verónica Muñoz Soriano2, Sandra López Domènech2, María
Dolores Moltó Ruiz3, Nuria Paricio Ortiz2, María José Martínez
Sebastián1
1
Departamento de Genética, Universidad de Valencia, Burjassot,
ES, 2Departamento de Genética, Universidad de Valencia - ERI
de Biotecnología y Biomedicina, Burjassot, ES,3Departamento
de Genética, Universidad de Valencia - Red de Salud Mental,
CIBERSAM - Fundación Investigación Clínico de Valencia, INCLIVA,
Burjassot, ES
Friedreich ataxia (FRDA) is the most common inherited ataxia in
the western population and is caused by a reduction in the level of the
mitochondrial protein frataxin. Parkinson’s disease (PD) is the second
most common neurodegenerative disease in the world and is caused
by the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra
pars compacta and the decrease of the striatal dopamine levels. In both
neurodegenerative diseases oxidative stress and mitochondrial alterations
seem to have an important role in the pathogenesis of both diseases.
Many groups are trying to identify possible therapeutic molecules that may
alleviate the symptoms of both disorders. For FRDA, the drug candidates
under more intense study are antioxidants, iron chelators and compounds
that increase the synthesis of frataxin. Current therapy for PD, based on a
dopamine replacement strategy, provides effective control in the first stages
of the disease, but fails in retard, stop or reverse the neurodegeneration.
We have developed a model of FRDA in D. melanogaster that employs an
iRNA expressed in the whole organism by means of the GAL4-UAS system
with the purpose of reducing the expression of the Drosophila fh gene
(which codifies Drosophila frataxin). Mutations in DJ-1 are associated to
autosomal recessive forms of PD. As a D. melanogaster model of PD, we
Pósters
have used a Drosophila line carrying loss of function mutations in DJ-1ß
(ortholog of DJ-1).
The individuals of both disease models show a decrease of their motor
performance. Using this phenotype, we started a screening of molecules
that could recover the motor ability of these flies. So far, we have
identified some possible candidates that belong to different functional
categories. Among these compounds, there are antioxidants, chelators
of different metals and metabolism modulators. Interestingly, some of
the compounds are able to improve motor performance in flies of both
disease models, while others seem to have a specific effect over either
FRDA flies or PD flies.
P15-14
La genisteína afecta a la eficacia de los
tratamientos contra el cáncer de mama
modulando la producción de especies radicales
de oxígeno
Daniel Gabriel Pons Miro, Daniel Palou Gramón, Adamo Valle
Gómez, Jordi Oliver Oliver, Pilar Roca
Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat
de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición
(CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
Algunos tratamientos del cáncer de mama tienen como efecto la generación
de especies radicales de oxígeno (ROS), lo que favorece la muerte celular.
La genisteína (GEN), un fitoestrógeno presente en la soja, podría modular la
producción de ROS gracias a su interacción con los dos tipos de receptores
estrogénicos (ER), ERα y ERβ, siendo más afín por ERβ.
Nuestro objetivo fue determinar los efectos de la GEN sobre la eficacia del
cisplatino (CDDP), el paclitaxel (PTX) y el tamoxifeno (TAM) en líneas
celulares de cáncer de mama con diferente ratio ER α/ERβ. Se estudiaron
las líneas MCF-7 (elevada ratio ERα/ERβ) y T47D (baja ratio ERα/ERβ)
tratadas con 1μM GEN, 10μM CDDP, 10nM PTX y 10μM TAM, así como
la combinación de los citotóxicos con la GEN, durante 48h. Se determinó
la viabilidad celular (Cristal Violeta), la producción de ROS (Amplex Red)
y la autofagia (monodansilcadaverina, indicador de apoptosis).
En MCF-7 la GEN promovió una mayor viabilidad celular y una
disminución de la autofagia provocada por los tratamientos excepto con
CDDP, sin cambios significativos en la producción de ROS. En T47D la
GEN provocó una disminución en la producción de ROS en los tratamientos
de CDDP y TAM con la GEN respecto a los tratamientos solos, sin cambios
significativos en la viabilidad celular ni en la autofagia.
Los resultados parecen indicar que el tratamiento con GEN en células con
una ratio ERα/ERβ alta podría favorecer la proliferación celular e inhibir
la apoptosis debido a su actividad estrogénica. En cambio, en células con
una ratio ERα/ERβ baja la presencia de GEN favorecería una reducción de
la producción de ROS, pudiendo disminuir la eficacia de los tratamientos
anticancerígenos.
Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea
“Una manera de hacer Europa”.
P15-15
Efecto del silenciamiento o inhibición de la
UCP2 sobre el estrés oxidativo en la línea de
cáncer de mama MCF-7
Mercedes Nadal-Serrano, Daniel G. Pons, Adamo Valle, Pilar Roca,
Jordi Oliver Oliver
Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat
de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición
(CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
El estrés oxidativo juega un papel dual en el desarrollo del cáncer; por
una parte una elevada producción de radicales libres de oxígeno (ROS)
137
Pósters
promueve la muerte celular, pero a niveles menores los ROS pueden
actuar como segundos mensajeros promoviendo la proliferación celular.
La mitocondria es la principal fuente de producción de ROS en la célula,
por lo que la UCP2 juega un papel importante en el control del estrés
oxidativo, desacoplando la cadena respiratoria y evitando de esta manera
la producción de ROS.
El objetivo que nos propusimos fue determinar el efecto del silenciamiento
con siRNA o la inhibición con genipin de la UCP2 sobre la proliferación y
el estrés oxidativo en la línea de cáncer de mama MCF-7. Concretamente
se ha determinado la proliferación (cristal violeta), la producción de ROS
(Amplex Red) y el daño oxidativo en lípidos y proteínas (4-HNE y grupos
carbonilo, respectivamente).
Mediante siRNA se consiguió una importante disminución de los
niveles de ARN mensajero de la UCP2, que se acompañó de una caída
de los niveles de proteína. El silenciamiento y la inhibición de la UCP2
provocaron una disminución de la viabilidad de las células cancerosas, en
el caso del genipin dependiente de la dosis. Además se observó un aumento
importante en la producción de ROS, que se acompañó de un aumento de
los daños oxidativos, tanto en lípidos como proteínas.
De los resultados obtenidos se puede desprender que la inhibición de
la UCP2 podría utilizarse como una nueva estrategia en el tratamiento
coadyuvante del cáncer.
Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea
“Una manera de hacer Europa”.
P15r-16 (R15-6)
Calorie restriction abolishes age-related changes
of coenzyme Q levels in liver and skeletal muscle
from mice fed a polyunsaturated fatty acids-
enriched diet
Lucía Fernández del Río1, Guillermo López-Lluch2, Plácido Navas2,
Jon J. Ramsey3, María Isabel Burón1, José Manuel Villalba1
1
Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología,
Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional
Agroalimentario, ceiA3, Córdoba, ES, 2Centro Andaluz de Biologia
del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide-CSIC, CIBERER,
Instituto de Salud Carlos III, Sevilla, ES, 3VM Molecular
Biosciences. UCDavis, Davis (California), US
Coenzyme Q (Q) is a lipid-soluble electron carrier and a powerful
antioxidant. Dietary n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA) increase
hepatic Q levels with aging. To investigate if these effects were altered
by calorie restriction (CR) we established two groups of mice fed lifelong
diets containing soybean oil (high in n-6 PUFA) as the main fat source,
either ad libitum or under CR. We also studied two additional CR groups
fed diets containing lard (high in saturated and n-9 monounsaturated
fatty acids) or fish oil (high in n-3 PUFA). Liver and skeletal muscle
samples were taken after 6 or 18 months of dietary intervention starting
at an age of 3 months. Hepatic Q9 and Q10 levels increased and Q9/Q10
ratio decreased with age in the control but not in the CR group. When
comparing the three CR diets it was found that Q9 and Q10 levels were
maximal in CR-fish, and Q9/Q10 ratio was the lowest in CR-soy and CR-
fish. In skeletal muscle, levels of coenzyme Q9 did not change either by
CR or age but Q10 levels increased significantly with age in the control
although not in CR group. Q9 levels were higher in CR-soy compared
with CR-lard, whereas CR-fish displayed the lowest Q9/Q10 ratio. We
demonstrate that: i) CR abolishes age-induced changes of Q levels in
liver and skeletal muscle from mice fed PUFA-enriched diets, and ii)
liver and skeletal muscle tissues adapt to a PUFA-enriched CR diet by
increasing Q levels and decreasing Q9/Q10 ratio.
138
XXXVII Congreso SEBBM
P15r-17
Effects of exogenous lipid source on mitochondrial
physiology and mTOR pathway in an in vitro model
Elena Gutiérrez Casado1, Lucía Fernandez del Río1, José Antonio
González Reyes1, María Isabel Burón Romero1, Chary López
Pedrera2, José Manuel Villalba Montoro1
1
Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología,
Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional
Agroalimentario, ceiA3, Córdoba, ES, 2Instituto Maimónides de
Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Universidad de
Córdoba, Córdoba, ES
Over the last few decades many scientific research groups have focused
their interest on the knowledge of those processes that are involved
in aging, as well as on their possible manipulation in order to stop or
retard it. Nowadays, the unsaturation degree of membrane phospholipids
(Membrane Theory of Aging) (Hulbert, 2003) and the endogenous
generation of reactive oxygen species (ROS) (Mitochondrial/Free Radicals
Theory of Aging) (Harman, 1956) are two of the most widely accepted
factors that affect aging.
Unsaturation degree of cellular membranes is inversely proportional to
longevity, although unsaturated fatty acids are also crucial to maintain the
fluidity of the lipid membranes. Fatty acid content of the diet can modify the
composition of membrane phospholipids (Ochoa-Herrera et al., 2001), and
can also affect the function of the electron transport chain (ETC) located
in the inner mitochondrial membrane (Aoun et al., 2012). The ETC is not
only the most important cellular energetic machinery for ATP generation,
but also one of the main sources of ROS in cells. ROS can interact with
lipids and proteins altering the permeability of cellular membranes and the
functional conformation of proteins.
The Ser/Thr-kinase mTOR is a crucial kinase in sensing the availability of
nutrients and growth factors in cells, and promoting the activation/inhibition
of different molecules involved in processes such as autophagy. Optimal
nutrient sensing through the mTOR pathway is impaired with aging. On
the other hand, inhibition of mTOR pathway by dietary manipulations as
calorie restriction increases lifespan (López-Otín et al., 2013).
The aim of our work was to determine how the mitochondrial physiology,
cellular oxidative damage, and the mTOR signaling pathway could be
modified by the supplementation with exogenous lipids using an in
vitro model. A mouse hepatocarcinoma cell line (Hepa 1.6) was grown
in culture medium containing either low (1g/l) or high glucose (4,5g/l),
and supplemented or not with two different lipid emulsions (at 7μg/ml):
Lipofundin, based on ω-6 fatty acids (thus mimicking a diet enriched
in soybean oil) or Lipoplus which also contains ω-3 fatty acids (thus
mimicking a diet containing fish oil). After 48 hours of treatment with the
corresponding emulsion, different parameters related with mitochondrial
function (including mitochondrial potential and activities of ETC
complexes) and oxidative stress (including superoxide and peroxide levels
and oxidative damage), as well as the activation state of components of
the mTOR pathway were assessed. Our results indicate that exogenous fat,
targets mitochondrial physiology, oxidative stress and mTOR pathway in a
manner that is dependent on fatty acid composition.
P15-18 (R15-1)
Papel de p38alfa y del estrés oxidativo en el
control de la citoquinesis
Ana M. Tormos1, Raquel Taléns-Visconti2, María Jorques1, Salvador
Pérez-Garrido1, Ana Bonora-Centellés1, Ángel R Nebreda3, Juan Sastre1
1
Departamento de Fisiología, Facultad de Farmacia, Universidad
de Valencia, Burjasot, ES, 2Departamento de Farmacia y Tecnología
Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia,
Burjasot, ES, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats
(ICREA), Barcelona, ES
La citoquinesis es la última etapa de la mitosis e implica una reorganización
del citoesqueleto de actina. Un fallo de la citoquinesis es uno de los
Granada 2014
principales mecanismos de formación de células poliploides en mamíferos,
que pueden resultar genéticamente inestables. Nuestros resultados indican
que la citoquinesis está regulada por la MAP quinasa p38alfa sensible al
estado redox y puede verse afectada por el estrés oxidativo. La activación
de MNK-1 es dependiente de p38alfa y MK2 y se requiere para la escisión
del puente intercelular. Los ratones viejos con deficiencia específica de
p38alfa en hígado tienen disminuida la fosforilación de MNK-1. La vía
de la pequeña GTPasa Rho – a través de fosfo-PRK-2, fosfocofilina,
y p27- también está deteriorada en los ratones knock-out cuando son
viejos. Asimismo, la ausencia de p38alfa condujo a una disminución de la
fosforilación de HSP27, que se requiere para la polimerización de la actina.
Por ello, se observa un grave deterioro de los filamentos de F-actina en el
hígado de ratones viejos con deficiencia de p38alfa. No obstante, no se
produce estrés oxidativo en estos animales. En consecuencia, la deficiencia
de p38alfa a largo plazo afecta el ensamblaje de la actina, sin producir
estrés oxidativo, dando lugar a un fallo de la citoquinesis y binucleación
de los hepatocitos con el envejecimiento. Por otro lado, el aislamiento de
hepatocitos produce marcada depleción de glutatión, incremento en la
generación de especies reactivas del oxígeno y activación de la entrada
en ciclo celular con bloqueo de la citoquinesis y binucleación. La adición
de N-acetil cisteína previno la depleción de glutatión y frenó la entrada
en el ciclo celular, evitando el fallo de la citoquinesis y la formación de
hepatocitos binucleados durante el aislamiento. En consecuencia, nuestros
resultados muestran que los hepatocitos entran en fase S pero no completan
la division celular cuando existe deficiencia de p38alfa o durante su
aislamiento, dando lugar en ambos casos a un fallo de la citoquinesis y
binucleación.
P15r-19
N-based ligands with intracellular oxidative
activity as potential anti-tumor agents
Marta González-Bártulos1, Olaf Cussó1, Miquel Costas1, Xavi Ribas1,
Anna Massaguer2
1
Bioinorganic and Supramolecular Chemistry group (QBIS),
Department of Chemistry, University of Girona, Girona, ES,
2
Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology,
University of Girona, Girona, ES
Tumor cells have persistently higher levels of Reactive Oxygen Species
(ROS) than normal cells which is a consequence of their abnormal
metabolism together with genetic alterations [1,2]. The constitutive
oxidative stress of cancer cells provides a specific target for the design
of novel redox-based anticancer therapies, as cancer cells are very
vulnerable to pro-oxidant agents such as transition metal based-complexes
[3]. When accumulated inside the cells, metals such as iron, manganese
or copper, undergo cycling redox reactions that generate high levels of
ROS, generating additional ROS, which likely increase the oxidative stress
above the cytotoxic threshold, leading to a cell death [4]. Therefore, we
evaluated the antitumoral properties of five polyamine Fe-Complexes
and their corresponding uncomplexed ligands. Only the ligands displayed
antiproliferative activity against breast adenocarcinoma MCF-7 and
pancreas adenocarcinoma CAPAN-1 cancer cell lines. The most active
compounds were selected to further analyze their cytotoxicity against
a broad panel of tumor and non-malignant cell lines and their ability to
inhibit the clonogenicity of cancer cells. In addition, the ability of the
compounds to generate ROS inside the cells and the influence of the
intracellular iron in their cytotoxicity was evaluated. Our results reveal that
three ligands display an interesting anticancer activity, with higher IC50
values in non-malignant cells than in tumor cells and exhibit inhibitory
effect on the clonogenicity of tumor cells. Moreover, the ligands are not
hemolytic against human red blood cells. We determine that the ligands are
inducers of oxidative stress and that ROS induction is associated to their
strong capactity to bind intracellular iron and generate the highly oxidant
iron coordination complexes inside the cells, inducing the cell death. These
results indicate that these ligands may be a potential pro-oxidant anticancer
agents.
Pósters
References
[1] Cairns RA et al. Nat Rev Cancer 2011.
[2] Luo J et al. Cell 2009.
[3] Montero AJ et al. Drugs 2011.
[4] Dixon S et al. Natu Chem Bio 2014.
P15-20
Presence of antioxidant enzymes and
peroxisomes in olive fruits (Olea europaea L.)
Eduardo López-Huertas, Luis A del Río
Group of Antioxidants, Free Radicals and Nitric Oxide in
Biotechnology, Food and Agriculture - Estación Experimental del
Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Granada, ES
The occurrence in olive (Olea europaea L.) fruit tissue of peroxisomes and
different antioxidant enzymes is reported for the first time. Ultrastructural
analysis showed that olive cells were characterized by the presence of large
vacuoles and lipid drops. Plastids, mitochondria and peroxisomes were
placed near the cell wall, showing some type of association with it. Olive
fruit peroxisomes were purified by sucrose density-gradient centrifugation,
and catalase, glutathione reductase and ascorbate peroxidase were found in
peroxisomes. In olive fruit tissue the presence of a battery of antioxidant
enzymes was demonstrated, including catalase, four superoxide dismutase
(SOD) isozymes (mainly an Fe-SOD plus 2 Cu,Zn-SOD, and a Mn-SOD),
all the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle, reduced and oxidized
glutathione, ascorbate, and four NADPH-recycling dehydrogenases. The
knowledge of the full composition of antioxidants (enzymatic and non-
enzymatic) in olive fruits is crucial to be able to understand the processes
regulating the antioxidant composition of olive oil.
Supported by the ERDF-cofinanced grant AGL2011-24428 from the
Ministry of Economy and Competitiveness, Spain.
P15-21
NADPH oxidasas como dianas terapéuticas
en la leucemia mieloide crónica
Beatriz Sánchez-Sánchez1, Sara Gutiérrez-Herrero2, Guillermo
López Ruano1, Rodrigo Prieto Bermejo1, Marta Romo-González1,
Marcial Llanillo1, Atanasio Pandiella2, Carmen Guerrero2, Jesús F.
San Miguel3, Fermín Sánchez-Guijo3, Consuelo del Cañizo3, Angel
Hernandez Hernandez1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de
Salamanca - Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-
IBSAL, Salamanca, ES, 2CIC-Centro de Investigación del Cáncer,
CSIC, Salamanca, ES, 3Instituto de Investigación Biomédica
de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca,
Salamanca, ES
Las células cancerosas muestran una excesiva producción de especies
reactivas del oxígeno (ROS), lo que parece estar relacionado con el inicio y
la progresión del cáncer. Las NADPH oxidasas son uno de los principales
sistemas productores de ROS en la célula. La leucemia mieloide crónica
(LMC) está provocada por la expresión de la quinasa BCR-ABL, cuya
actividad conduce a un aumento de la producción de ROS, en parte a través
de NADPH oxidasas. La terapia de la LMC basada en el uso de inhibidores
de BCR-ABL es muy efectiva, sin embargo la existencia o aparición de
resistencias a este tratamiento es aún un serio problema.
En este estudio se evalúa la familia de las NADPH oxidasas como dianas
terapéuticas en la LMC. Se ha analizado el efecto de diferentes inhibidores
de NADPH oxidasas, ya sea solos o en combinación con inhibidores de
BCR-ABL, en células de LMC y en dos modelos animales diferentes. Una
de las conclusiones a las que llega el estudio es que la inhibición de las
NADPH oxidasas deteriora drásticamente la proliferación y viabilidad de
las células de LMC e inhibe el crecimiento de tumores in vivo. Además, la
139
Pósters
combinación de inhibidores de las NADPH oxidasas con inhibidores de
BCR-ABL era altamente sinérgica. Los investigadores sugieren que esta
estrategia podría utilizarse no solo en LMC sino también en otros tipos de
tumores.
Por tanto, este estudio demuestra que las NADPH oxidasas son una
interesante diana terapéutica para la LMC, que podría usarse como
alternativa al uso de inhibidores de BCR-ABL, o para potenciar el efecto
de dichos inhibidores. Será interesante en el futuro profundizar en la
posibilidad de trasladar estos resultados a la práctica clínica.
P15-22
Role of the NADPH oxidase NOX4 in liver
tumorigenesis
Eva Crosas-Molist1, Esther Bertran1, Joan Fernando1, Isabel
Fabregat2
1
Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, LHospitalet de
Llobregat, ES, 2Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL -
Departament de Ciències Fisiològiques II, University of Barcelona,
Barcelona, ES
NOX4 has been implicated in a variety of physiological processes, including
cellular senescence, apoptosis, survival, migration, endoplasmatic reticulum
stress and differentiation. We have previously described that in liver cells,
NOX4 upregulation is necessary for TGF-beta-induced suppressor effects,
in particular, for cell death (Carmona-Cuenca et al., J Hepatol. 49:965,
2008). NOX4 is also required for TGF-beta-induced stellate cell activation
during liver fibrosis (Sancho et al. PLoS One, 7(9):e45285, 2012) and
pre-clinical assays have suggested NOX4 inhibitors as useful tools to
ameliorate this process (Jiang et al., Free Radic Biol Med., 53:289, 2012).
However, the potential consequences of sustained treatment of liver cells
with NOX4 inhibitors are unknown yet.
Here we show that stable knockdown of NOX4 expression in liver tumour
cells increase their proliferative capacity. In vivo analysis in mice revealed
that NOX4 expression is down regulated during diethyl-nitrosamine (DEN)-
induced hepatocarcinogenesis. Furthermore, xenograft experiments in athymic
mice indicated that NOX4 silencing confers advantage to human hepatocellular
carcinoma (HCC) cells to form earlier and bigger tumours in vivo. Furthermore,
silencing NOX4 in HCC cells induces a decrease in cell-to-cell and cell-to-
matrix adhesion and an increase in cell migration. NOX4 knockdown resulted
in decreased expression of E-cadherin and ZO-1, components of adherent and
tight junctions respectively, lower adhesion capacity and a decrease in focal
adhesions. Moreover, a change in the integrin pattern in the plasma membrane
was observed when NOX4 was silenced. All together, these results point to
a role for NOX4 in maintaining epithelial structures, increasing cell-to-cell
and cell-to-matrix adhesions, and preventing cell migration. In summary,
NOX4 may play a relevant tumor suppressor role during early stages of liver
tumorigenesis. In support of this idea, immunochemical analyses of NOX4
expression in human liver tumor cell lines and tissues revealed decreased
NOX4 protein levels in liver tumorigenesis.
P15-23
Amitriptyline, used alone or in combination
therapy, modifies expression of several
antioxidants in breast cancer cell lines
Eduardo Díaz-Parrado, Jéssica Núñez-Vasco, Matilde Illanes,
Ana Fernández-Rodríguez, Ana María Moreno-Fernández, Manuel
De Miguel
Dpto. Citología e Histología Normal y Patológica, Facultad de
Medicina, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
Introduction: Oxidative therapy is a promising anticancer strategy based
on the production of high levels of ROS and/or the depletion of antioxidants
of tumor cells. We have already demonstrated that Amitriptyline (Amit), a
tricyclic antidepressant, induces an increase of ROS production, leading to
140
XXXVII Congreso SEBBM
apoptosis through the caspase-dependent pathway. In this work, in order
to continue studying the potential antitumor activity of amitriptyline, we
have analyzed the effects of amitriptyline on the expression of several
antioxidants in human breast cancer cell lines, and in combination with the
chemotherapeutic camptothecin (CPT).
Materials and Method: MCF-10A (non-tumoral line cell) and MCF-7
and MDA-MB-231 cells (breast cancer cell lines with different hormonal
characteristics) were treated 24h with Amit (20μM), 10μM CPT and a
combination of both. Expression of several antioxidants (MnSOD, catalase,
GSR, HO-1) was analyzed by RT-qPCR.
Results: MCF-10A: Antioxidant expression was decreased in the different
treatment conditions, except for HO-1 that was significantly increased.
MCF-7: With Amit, an increase of GSR and a decrease of HO-1 were
observed. With the combination therapy, expression of the four antioxidants
was decreased.
MDA-MB-231: With Amit, all antioxidants showed a decreased expression
except for HO-1, which was higher than in control. With the combination
therapy, similar results to MCF-7 were obtained, with the exception of the
expression of HO-1, which showed a significant increase.
Conclusions: In general, Amit induces a reduction in the antioxidant
system, especially dramatic for catalase in the combination therapy.
However, HO-1 showed a significant increase in the non-tumoral cells and
in the combination therapy of MDA-MB-231 tumor cells. HO-1 could be
an important antioxidant against oxidative stress in breast cells since two of
the cell lines tested reacted increasing notably its expression after oxidative
treatment. After inducing oxidative stress, cells increase the expression of
some antioxidants, different ones depending on cell type.
P15-24
Caracterización de la enzima ascorbato
peroxidasa en extractos crudos de Dunaliella
salina
Antonio León Vaz, Rocio Rengel Domínguez, Maria del Carmen
Romero Cruz, Javier Vigara Fernández
Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias
Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES
Las especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el peróxido de
hidrógeno, el radical superóxido, el radical hidroxilo y el oxígeno singlete,
son continuamente producidas en plantas y microalgas en distintas rutas
metabólicas y con distinta localización subcelular. La producción de estas
especies se incrementa en situaciones de estrés ambiental, excediendo
la capacidad detoxificadora del organismo y causando daños oxidativos
a proteínas, ADN, lípidos y otras macromoléculas. Para evitar estos
daños oxidativos los distintos organismos han desarrollado eficientes
sistemas enzimáticos. La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.1.1.11) es una
hemoproteína que juega un importante papel en la eliminación de H2O2
(la forma más estable entre las distintas ROS) utilizando ascorbato como
donador de electrones. En este trabajo se presenta la caracterización del
ensayo de actividad de la enzima de la APX en extractos crudos de la
microalga eucariótica halófila Dunaliella salina. La actividad se muestra
dependiente de sus sustratos (ascorbato y agua oxigenada) y se estabiliza
con la presencia de EDTA en el medio de reacción, el ensayo también
requiere un medio tamponado, siendo su pH óptimo 6,0, en tampón
MES 100 mM. Se ha determinado una temperatura óptima de 34 ºC y
una energía de activación de 13,31 kJ/mol para el ensayo de actividad.
La APX de Dunaliella salina muestra una cinética de Michaelis-Menten
para el peróxido de hidrógeno, mostrando un valor de Km de 47,52 μM
y una Vmáx de 449,33 U/ml; presentando una cinética sigmoidal para el
ascorbato, con valores de S0,5 de 3,05 μM y un factor de Hill de n=1,06.
La actividad APX de Dunaliella salina se inhibe drásticamente por azida
y cinuro, inhibidores característicos de hemoproteínas, mostrándose una
inhibición parcial por Mn+2 y por DTT. Por otro lado, la carencia de fuente
nitrogenada o la presencia de metales pesados (Cd+2) en el medio de cultivo
de Dunaliella salina, generó estrés oxidativo en la microalga, provocando
el aumento de los niveles de actividad de la ascorbato peroxidasa.
Granada 2014
P16. Regulación de la expresión génica
y dinámica del genoma
P16-1 (R16-4)
Temporal and spatial regulation of the Yen1
Holliday junction resolvase prevents genome
instability
Miguel González Blanco1, Joao Matos2, Stephen C. West1
1
Clare Hall Laboratories, London Research Institute, Cancer
Research UK, Potters Bar, UK, 2Institute of Biochemistry,
Department of Biology, ETH Zürich, Otto-Stern-Weg 3, Zürich, CH
The careful orchestration of cellular events such as DNA replication,
repair, and segregation is essential for equal distribution of the duplicated
genome into two daughter cells. To ensure that persistent recombination
intermediates are resolved prior to cell division, the Yen1 Holliday junction
resolvase is activated at anaphase. Here, we show that the master cell-cycle
regulators, cyclin-dependent kinase (Cdk) and Cdc14 phosphatase, control
the actions of Yen1. During S phase, Cdk-mediated phosphorylation of
Yen1 promotes its nuclear exclusion and inhibits catalytic activity by
reducing the efficiency of DNA binding. Later in the cell cycle, at anaphase,
Cdc14 drives Yen1 dephosphorylation, leading to its nuclear relocalization
and enzymatic activation. Using a constitutively activated form of Yen1,
we show that uncontrolled Yen1 activity is detrimental to the cell: spatial
and temporal restriction of Yen1 protects against genotoxic stress and, by
avoiding competition with the noncrossover-promoting repair pathways,
prevents loss of heterozygosity.
P16-2 (R16-3)
Protein neddylation controls the timing of DNA
end resection and DNA double strand break
break repair
Pablo Huertas1, Sonia Jimeno1, María Jesús Fernández Ávila2,
Cristina Cepeda García2, Daniel Gómez Cabello2, Andrés Cruz García1
1
CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2CABIMER, Sevilla, ES
DNA double strand breaks are the most cytotoxic lesions that can occur
on the DNA. They can be repaired by different mechanisms and optimal
survival requires a tight control between them. Here we show that
protein deneddylation as a major controller of repair pathway choice.
Neddylation inhibition changes the normal repair profile towards an
increase on homologous recombination. Indeed, after DNA damage fast
and local RNF111-mediated neddylation acts as an inhibitor of BRCA1
and CtIP-mediated DNA end resection, a key process in repair pathway
choice. A secondary wave of deneddylation by the COP9-signalosome
allows resection to take place at later times. By controlling DNA resection,
protein neddylation not only affect the choice between NHEJ and
homologous recombination, but also controls the balance between different
recombination subpathways. Thus, protein neddylation act as a molecular
clock, controlling the timing of DNA end resection and repair events.
P16-3 (R16-2)
Role of chromatin dynamics on hormone-
dependent gene regulation in breast cancer cells
Guillermo Pablo Vicent Martínez
Centre de Regulació Genòmica (CRG), Barcelona, ES
A close chromatin conformation prevents gene expression in eukaryotic
cells. Genes activated by external cues have to overcome this repressive
state by locally changing chromatin structure to a more open state.
Although much is known about hormonal gene activation, how basal
repression of regulated genes is targeted to the correct sites throughout
Pósters
the genome is not well understood. Here we report that in breast
cancer cells the unliganded progesterone receptor binds genomic sites
and targets a repressive complex containing HP1g, LSD1, HDAC1/2,
CoREST, JARID1B and the RNA SRA (Steroid Receptor Activator) to
20% of hormone-inducible genes, keeping these genes silenced prior to
hormone treatment. The complex is anchored via binding of HP1g to
H3K9me3. SRA interacts with PR, HP1g and LSD1, and its depletion
compromises the loading of the repressive complex to target chromatin
promoting aberrant gene de-repression. Upon hormonal treatment the
HP1g-LSD1 complex is displaced from these constitutively poorly
expressed genes as a result of rapid phosphorylation of histone H3 at
serine 10 mediated by MSK1, which is recruited to the target sites by
the activated PR. On the other hand, the HP1g-LSD1 complex is also
recruited to the hormone-repressed genes BCAS1 and KRT23 promoting
a close chromatin conformation. These results highlight the importance
of the HP1g-LSD1 complex as a key factor involved in hormonal gene
regulation of breast cancer cells.
P16-4
La cromatina-quinasa VRK1 regula la histona
H2AX y la formación de los focos de reparación
de ADN inducidos por radiación ionizante
Marcella Salzano, Marta Sanz-García, Diana M. Monsalve, David S.
Moura, Pedro A. Lazo
Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca,
(CSIC). Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL,
Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES
El daño local al ADN altera la estructura de la cromatina y el detectar y
el responder a esta alteración es probablemente el inicio de la Respuesta
al Daño del ADN (RDA). En este contexto, las cromatina quinasas son
unos buenos candidatos por participar en la detección de la alteración
local de la cromatina por daño al ADN y en sus respuestas celulares.
VRK1 es una Ser-Thr quinasa nucleosomal identificada en el nuestro
laboratorio como un nuevo sensor de la RDA. Está descrito que VRK1
regula muchos procesos celulares como por ejemplo el ciclo celular,
condensación de la cromatina y protección de las células al daño génico
por regulación positiva de p53. Nuestros resultados demuestran que su
depleción por “knock-down” causa una pérdida global de la acetilación
de las histonas independientemente de ATM. También hemos demostrado
que VRK1 interacciona directamente con H2AX fosforilándola en
Ser139 inmediatamente tras el daño al ADN inducido por radiación
ionizante. El efecto sobre la fosforilación de H2AX y la formación de los
focos es prevenido por el knock-out de VRK1 y rescatado por la quinasa
activa, pero no con la inactiva, demostrando que es necesaria la actividad
de VRK1 para la respuesta al daño del ADN. Además, el pretratamiento
con los inhibidores de ATM demostró una cooperación de ATM y VRK1
sobre la formación de los focos de reparación. Concluimos que VRK1 es
un nuevo componente de la cromatina, que reacciona a sus alteraciones
y que participa a la respuesta muy temprana al daño génico, funcionando
ella sola o en colaboración de ATM.
P16r-5
Papel de SF3B en la reparación de los cortes
de doble cadena en el DNA
Mª Rosario Prados Carvajal1, Cristina Cepeda García1, Pablo
Huertas2
1
CABIMER, Sevilla, ES, 2CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
De los muchos tipos de daños que puede sufrir el DNA, los cortes de
doble cadena (DSB) son de los más citotóxicos, ya que causan mutaciones,
reordenamientos cromosómicos e inestabilidad genómica. Así, las células
han desarrollado diferentes mecanismos para la detección, señalización y
reparación de estas roturas. La reparación de dicho daño puede realizarse
141
Pósters
por recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR) o
por unión de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining;
NHEJ). La decisión entre ambos mecanismos de reparación depende de
la activación o no del proceso denominado resección de los extremos de
DNA. Dicho mecanismo es, por tanto, un proceso muy regulado y crítico
en la supervivencia de las células.
Una de las proteínas más importantes implicada en la resección del DNA es
la proteína CtIP, que controla si el proceso de resección ha de activarse o no.
Esta decisión depende de la integración de múltiples señales celulares por
parte de CtIP, garantizando así que las DSB sean señalizadas y reparadas
de la mejor manera posible. Para ello, CtIP sufre múltiples modificaciones
postraduccionales e interacciona con diversas proteínas.
Como parte de un estudio para entender como se regula la resección
a nivel celular, hemos aislado nuevas proteínas que interaccionan
físicamente con CtIP. Entre ellas, hemos encontrado diversas subunidades
del complejo SF3B. Como la depleción de varios componentes de dicho
complejo disminuyen la eficiencia de la recombinación homóloga, estamos
estudiando su papel en resección con más detalles. Aquí, presentamos
evidencias de que la depleción de distintas subunidades de SF3B reduce
la resección de cortes de doble cadena inducidos en el DNA de manera
artificial. Como se ha descrito que la subunidad SF3B2 del complejo es un
sustrato de ATM, la quinasa principal del checkpoint de daño en el DNA,
estamos analizando el papel de esas fosoforilaciones en la función del
complejo SF3B en resección.
P16r-6
Regulación del método de reparación de roturas
de doble cadena en el DNA por HDAC1, HDAC2
y PARP3
Cintia Checa Rodríguez, Pablo Huertas Sánchez, Daniel Gómez
Cabello
Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa
(CABIMER), Sevilla, ES
Los cortes de doble cadena (DSB) son el tipo de daño más citotóxico
que puede sufrir el DNA, pudiendo causar mutaciones e inestabilidad
genómica. Existen dos mecanismos para reparar estos cortes, la unión
de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining; NHEJ) y la
recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR). No se conoce
bien el mecanismo por el que los DSB son reparados por una u otra vía.
Sin embargo, se considera que el procesamiento de los extremos del corte,
o resección, es un paso clave en esta decisión conduciendo a la reparación
por HR e impidiendo la vía de NHEJ. La detección y señalización del daño
(checkpoint) influye también en el método de reparación.
El daño en el DNA conduce a una cascada de eventos coordinada, conocida
como respuesta al daño en el DNA (DNA Damage Response, DDR)
donde el reclutamiento de proteínas a la lesión está regulado en parte por
modificaciones postraduccionales incluyendo la fosforilación y la poli
(ADP-ribosilación). Recientemente, se ha demostrado que la poli (ADP-
ribosa) polimerasa PARP3 es activada específicamente por los DSB in vitro
y se ha propuesto que pueda tener un papel en HR.
Por otra parte, la estructura de la cromatina influye en el reconocimiento,
señalización y reparación de daños en el DNA. Las modificaciones de
histonas pueden alterar sus propiedades e influir en la respuesta al daño.
Se ha visto que las deacetilasas de histonas humanas HDAC1 e HDAC2
responden al daño del DNA y promueven la señalización y reparación de
los DSB. Ambas proteínas parecen implicadas tanto en NHEJ como en HR.
En este trabajo hemos analizado el efecto de la depleción de HDAC1,
HDAC2 y PARP3 sobre el balance entre NHEJ y HR. Para entender su
función, hemos estudiado su posible papel en el proceso de resección y
checkpoint.
142
XXXVII Congreso SEBBM
P16m-7
Identification of novel SND1 target genes
involved in glycerolipid metabolism in human
hepatoma cells under inflammatory conditions
Enara Arretxe, Sandra Armengol, Sarai Mula, Leire Enzunza,
Yolanda Chico, Begoña Ochoa, María José Martínez
Universidad del País Vasco, Leioa, ES
SND1 (Staphylococcal nuclease and Tudor domain-containing 1) is a
transcriptional corregulator involved in adipogenesis, stress response and
cancer progression. Current evidence indicates that SND1 upregulation
is a hallmark of several types of cancers. In particular in human
hepatocarcinoma, SND1 overexpression is correlated with malignancy
and a crosstalk between SND1, miRNA221, NF-κB and inflammation
signaling pathways may be envisaged. Work in our lab demonstrated
that SND1 gene activity in human hepatoblastoma cells is upregulated
by a transcriptional network involving NF-κB, Sp1 and NF-Y binding
in response to the inflammatory cytokine TNFa. Very recently, we have
performed the first genome-wide search for endogenous SND1 binding
sites by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip assays on HepG2
human hepatoma cells under basal and TNFα-induced inflammatory
conditions. Here we validated by ChIP-qPCR the binding of SND1 to the
promoter of four target genes, CHPT1, LPGAT1, LPIN1 and PTDSS1,
involved in regulation of glycerophospholipid metabolism. When SND1
protein was augmented in the nucleus by TNFα treatment, the transcript
expression of CHPT1, LPGAT1 and LPIN1 was increased whereas that of
PTDSS1 was decreased. These results were compatible with the increment
in the cellular phosphatidylcholine content detected in the TNFα treated
cells. SiRNA-mediated SND1 silencing abolished the TNFα-induced
changes on the mRNA level of the target genes as well as the increment in
cellular PC content. However, under non-inflammatory conditions, SND1
silencing did not affect the expression of LPIN1 and PTDSS1 but reduced
the expression of CHPT1 and LPGAT1. Our findings indicate that SND1
binding is essential for the TNFα action on the expression of these SND1
target genes involved in regulating cellular phosphatidylcholine content.
Supported by Gobierno Vasco (IT336/19, AE-2011-1-34, Saiotek calls) and
UPV/EHU (UFI11/20).
P16r-8 (R16-5)
VRK1 y AurKB interaccionan en mitosis
regulando la fosforilación específica de la histona
3 y la correcta progresión del ciclo celular
David da Silva Moura, Marta Vázquez-Cedeira, Pedro A. Lazo
Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, CSIC,
Universidad de Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica
de Salamanca (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca,
Salamanca, ES
El ciclo celular es un proceso altamente regulado en el que participan
diversas proteínas quinasa, como la Aurora B y la VRK1. Estas dos
quinasas controlan varios procesos para una correcta progresión del ciclo
celular, entre los cuales se destaca la condensación de la cromatina. Durante
la mitosis, las dos serina-treonina quinasas contribuyen significativamente
en la condensación de la cromatina en varios mecanismos, entre los que
se destaca la fosforilación de las histonas, más precisamente de la histona
3. VRK1 fosforila específicamente la treonina 3 (T3) de la histona 3 y la
Aurora B fosforila específicamente la histona 3 en la serina 10 (S10).
En este trabajo, hemos demostrado que VRK1 interacciona con Aurora B
y que esta interacción se produce durante la mitosis, concretamente en las
fases más tardías. Además, analizamos el efecto de la interacción VRK1-
Aurora B en la capacidad de fosforilar a la histona 3. Así, confirmamos
que cantidades crecientes de Aurora B, afectaban a la fosforilación de la
histona 3, en el residuo T3, por VRK1 y que este efecto era independiente
de la actividad quinasa de la Aurora B. De la misma manera, cantidades
Granada 2014
crecientes de VRK1, activa o inactiva, afectaban a la fosforilación de la
histona 3, en el residuo S10, por la Aurora B. El mismo efecto sobre la
histona 3 fue verificado en ensayos quinasa con (32P[ATP]). Posteriormente,
hemos analizado durante el ciclo celular los niveles de fosforilación de
la histona 3, en los dos residuos T3 y S10, y hemos demostrado que la
disminución de la fosforilación de la histona 3 en los dos residuos coincide
con la interacción VRK1-Aurora B.
Con estos resultados concluimos que la interacción VRK1-Aurora B afecta
negativamente la fosforilación de la histona 3 por las dos quinasas, y que
este puede ser un mecanismo regulatorio para una correcta salida de la
mitosis.
P16-9
GtrS and GltR form a two-component system:
The central role of 2-ketogluconate in the
expression of exotoxin A and glucose catabolic
enzymes in Pseudomonas aeruginosa
Abdelali Daddaoua1, Carlos Molina-Santiago2, Jesús de la Torre2,
Tino Krell2, Juan-Luis Ramos3
1 actividad transcripcional y la mitosis celular. Los ensayos con inhibidores
Estación Experimental de Zaidín, CSIC, Otura, Granada, ES, 2EEZ -
CSIC, Granada, ES, 3ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES
In the human pathogen Pseudomonas aeruginosa the GltR regulator is
required for glucose transport whereas GtrS is a sensor kinase that plays a
key role in mediating bacteria-host interaction and pathogen dissemination
in the host. We show that GtrS and GltR form a two-component system and
this novel TCS was found to regulate the expression from the promoters
Pedd/gap-1, PoprB and Pglk, which control the expression of genes involved in
glucose metabolism and transport. In addition, the GtrS/GltR pair regulates
the expression of toxA that encodes exotoxin A, the primary virulence factor.
Microcalorimetry-based ligand screening of the recombinant GtrS ligand
binding domain revealed specific binding of 2-ketogluconate (2-KG) (KD=
5 μM) and 6-phosphogluconate (KD= 98 μM). These effectors accelerate
GtrS autophosphorylation, with concomitant transphosphorylation of
GltR leading to a 3-fold increase in transcription. Surprisingly, in vivo a
similar increase in expression from the above promoters was observed
for the mutant deficient in GltR regardless of the presence of effectors.
Using footprinting assays, the GltR operator site was found to contain the
consensus sequence 5´-tgGTTTTTc-3´. We propose that 2-ketogluconate is
a key metabolite in the stringent transcriptional control of genes involved
in virulence and glucose metabolism. Surprisingly, we found that the GltR
response regulator is a repressor that is released from its target operators of
the toxA and glucose metabolism genes upon phosphorylation. This system
corresponds to another mode that guarantees a concerted regulation of
carbohydrate metabolism and exotoxin A expression.
P16-10
La inhibición de la actividad Aurora quinasa
B mediada por VHC regula la respuesta
antiinflamatoria en las fases iniciales
de la infección
Irene Francisco Recuero1, Antonio Madejón2, Julie Sheldon3, Celia
Perales3, Ana Isabel Gil2, Jordi Muntané4, Esteban Domingo3, Javier
García-Samaniego Rey2, Aurora Sánchez Pacheco1
1
Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES,
2
Departamento de Digestivo, Ciberhed. Hospital Carlos III, Madrid,
ES, 3Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Madrid, ES, 4Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) - Hospital
UniversitarioVirgen Del Rocio de Sevilla, Sevilla, ES
Introducción: Los cambios epigenéticos, entre los que se encuentran las
modificaciones covalentes de histonas, son cruciales en la inducción de
inestabilidad genética asociada a enfermedades en humanos, incluyendo
el desarrollo de fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo,
Pósters
se desconoce el papel que este tipo de modificaciones pueda tener en la
evolución de la enfermedad hepática producida por el virus de la hepatitis
C (VHC).
Objetivos: Estudiar las modificaciones covalentes de histonas inducidas
por la infección por VHC y determinar los mecanismos moleculares
implicados.
Métodos: Para determinar el papel del VHC en la inducción de cambios
epigenéticos se utilizó un sistema de infección in vitro de VHC (VHCcc)
sobre la línea celular Huh7.5. Alternativamente la región codificante de
la proteína del core viral (genotipos 1a, 1b y 2a) se clonó en un vector
de expresión eucariota con el que se realizaron ensayos de transfección
transitoria sobre la línea celular Huh7.5 y en cultivos primarios de
hepatocitos humanos. Las modificaciones de histonas se analizaron por
Western Blot, utilizando anticuerpos específicos. Para determinar las
actividades enzimáticas implicadas se ensayó el efecto de inhibidores
específicos como el ZM443979 y ensayos de siRNA. La expresión de
genes implicados en el control de la actividad inflamatoria, como NF-κB y
COX-2, se determinó por RT-PCR cuantitativa.
Resultados: Hemos demostrado que el HCV a través de la proteína
core inhibe la fosforilación del residuode Serina 10 de la histona H3
(H3Ser10ph), un marcador epigenético asociado a la regulación de la
de actividades enzimáticas implicadas en la fosforilación de histonas
demostraron que el efecto sobre la H3Ser10 inducida por la proteína del
core viral se inhibía en presencia de ZM443979, un inhibidor de la actividad
Aurora quinasa B (AKB). Mediante ensayos de coinmunoprecipitación
observamos una interacción directa entre la proteína del core viral y la
AKB. La interacción con la proteína del core indujo una inhibición de
la actividad quinasa de la AKB. Asociado a la inhibición de la actividad
AKB se observó una inhibición de transcripción de NF-κB y COX-2, genes
implicados en el control de la respuesta inflamatoria. La sobreexpresión de
AKB revirtió este efecto y disminuyó la infectividad extracelular del virus,
de manera opuesta la inhibición de la actividad de Aurora B aumentó la
infectividad viral.
Conclusiones: La proteína del core del VHC interacciona con AKB
inhibiendo su actividad quinasa y disminuyendo los niveles de fosforilación
de la H3Ser10ph así como la expresión de NF-κB y COX-2, dos genes
implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Este mecanismo
podría ser una nueva estrategia del VHC para asegurar su infectividad y
persistencia en la célula huésped.
P16-11
Vitamin D has wide regulatory effects on histone
modifying enzymes in human colon cancer cells
Antonio Barbáchano Becerril, Fábio Pereira, Asunción Fernández-
Barral, Gemma Ferrer-Mayorga, Alberto Muñoz, María Jesús Larriba
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM,
Madrid, ES
Vitamin D3 is obtained from the diet or mainly synthesized in the skin and
is converted into the active metabolite 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3
(1,25(OH)2D3). Epidemiological data suggest a protective role of vitamin D
against several neoplasias, particularly colorectal cancer. 1,25(OH)2D3 is a
major regulator of gene expression. Histones are subject to posttranslational
modifications including methylation, acetylation and others. Misregulation
of histone modifications alters gene expression and cell phenotype, which
may contribute to cancer initiation, progression and/or metastasis. We
found that 1,25(OH)2D3has a wide regulatory action on the expression
of genes coding for histone demethylases of the Jumonji C domain and
lysine-specific demethylase families (Pereira et al., 2011; 2012). Notably,
1,25(OH)2D3induces the expression of the histone demethylase JMJD3/
KDM6B that specifically demethylates the lysine 27 of histone H3
(H3K27) and has tumour suppressor activity. We found that the induction
of JMJD3 is necessary for the adequate gene regulatory, antiproliferative,
and prodifferentiation actions of 1,25(OH)2D3 in human colon cancer cells.
Conversely, 1,25(OH)2D3 inhibits the expression of several Polycomb
143
Pósters
group proteins that participate in the Polycomb repressive complexes
(PRC) 1 and 2, which are responsible for H3K27 methylation and promote
tumorigenesis. The inhibition of PRC2 activity by DZNep potentiates the
gene regulatory action of 1,25(OH)2D3 and also its effects on colon cancer
cell proliferation and differentiation. Thus, 1,25(OH)2D3 exerts an ample
regulatory effect on the expression of histone modifying enzymes involved
in epigenetic regulation that, in turn, mediate 1,25(OH)2D3 actions on gene
expression and cell phenotype in colon cancer.
P16-12
New strategies in relationship between lncRNAs
and the SWI/SNF complex
Antonio Herrera Merchán, Carmen Callejas Lechuga, Purificación
Fernández Espinosa, Pedro Pablo Medina Vico
Universidad de Granada, Granada, ES
Long non-coding RNAs (lncRNAs) are a new class of non-coding gene
regulators. But unlike their smaller counterparts, microRNAs, relatively
less is known about the roles and functions of lncRNAs. Current evidence
suggests that lncRNAs may play important roles in a wide range of
biological processes in human cancers.
Many of the LncRNAs have been functionally associated with chromatin-
remodeling complexes.
SWI/SNF is chromatin-remodeling complex, which alters the interactions
between DNA and histones and modifies the availability of the DNA for
transcription. The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced
the important and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF
complex in cancer. However, although SWI/SNF complex play a key role in
gene expression, the regulation of this complex itself is poorly understood.
We hypothesize that LncRNAs could be also functionally related SWI/SNF
playing a role in its function in carcinogenesis. Supporting this hypothesis,
recently, an LncRNA was found functionally associated with the SWI/SNF
complex, in prostate cancer.
We are gathering preliminary results using new technologies of sequencing
and immunoprecipitation of RNA (RNA-IP) to identify new LncRNAs
associated with SWI/SNF in different tumor cell lines for subsequently
develop functional assays to infer its biological role in tumor development.
P16r-13
Unravelling the molecular mechanism activating
ECF sigma factor in Pseudomonas aeruginosa
1 1
Joaquín R. Otero-Asman , Cristina Civantos , Karlijn Bastiaansen , 2 chromatin-associated transcriptional regulator
Marian Llamas1
1
Dept. of Environmental Protection, Estación Experimental del
Zaidín-CSIC, Granada, ES, 2Department of Molecular Microbiology
Vrije Universiteit Amsterdam Faculty of Earth and Life Sciences,
Amsterdam, NL
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that lives in a
wide range of environments. There are many interactions between the
environment and the bacterium that permit this niche variability. Many of
these interactions are possible because of the action of a regulatory system
known as cell surface signaling (CSS). CSS systems recognize signals
from the environment and transmit them into the cytosol, affecting gene
expression.The system is constituted by an outer membrane receptor, a
cytoplasmic membrane located anti-sigma factor and an extracytoplasmic
function (ECF) sigma factor in the cytosol. In absence of the inducing
signal, the anti-sigma factor binds to and keeps inactive the sigma factor.
The regulatory cascade starts with the recognition of the signal by the
receptor, which promotes the proteolytic degradation of the anti-sigma
factor and the activation of the ECF sigma factor. The ECF sigma factor
can then interact with the RNA polymerase and induce expression of target
genes. Most P. aeruginosa CSS systems have a role in the regulation of iron
uptake, which is an important process for the pathogen during infection.
However, this bacterium has a CSS system, called PUMA3 or Vre, that
144
XXXVII Congreso SEBBM
directly regulates the expression of virulence functions in response
to a host signal. In this work we aimed at understanding the molecular
mechanism that leads to the activation of P. aeruginosa ECF sigma factors.
We have identified two proteases, Prc and RseP, involved in the processing
of several anti-sigma factors in response to their cognate inducing signal.
Moreover, we have also observed that some anti-sigma factors are already
processed in an N- and a C-domain prior to the perception of the signal.
The biological significance of this observation is discussed.
P16-14
Genetic analysis of the role of the Mlp1 export
factor in genetic stability
Francisco García Benítez, Hélène Gaillard, Andrés Aguilera López
CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
Transcription of a DNA sequence increases its recombination frequency, a
phenomenon referred to as transcription-associated recombination (TAR).
During transcription, negative supercoils are accumulated behind the
advancing RNA polymerase, facilitating the unwinding of the DNA helix.
This transient DNA opening favours the annealing of the nascent mRNA to
the transcribed strand (TS) forming a DNA:RNA hybrid (R-loop). R-loops
can be formed naturally as intermediates in specific cellular processes, such
as mitochondrial DNA replication or immunoglobulin class switching and
have been suggested to play a role in transcription termination. A number of
observations in E. coli, yeast and humans indicate that the non-transcribed
strand (NTS) is more susceptible to damage than the TS. The formation of
R-loops, in which the NTS remains single stranded, renders the NTS more
vulnerable to DNA damage and contributes to TAR.
We are interested in understanding the different mechanisms associated with
the optimal biogenesis of mRNA and the control of R-loops formation. We
have found mlpD in a screening for deletions of non essential nuclear genes
that show hyper recombination when we overexpress a human deaminase
that preferentially targets ssDNA in Saccharomyces cerevisiae. The MLP1
gene encodes a nuclear pore basket protein that has an important role in
unspliced mRNA retention, SUMO regulation and telomere organization.
We investigate the role of Mlp1, its paralog Mlp2 and their human homolog
TPR in preventing genomic instability. Current results of Mlp1 will be
presented and discussed.
P16-15
Novel roles for the protein kinase DYRK1A as a
Chiara Di Vona1, Daniela Bezdan1, Abul B.M.M.K. Islam2, Nuria
Lopez-Bigas2, Stephan Ossowski1, Susana de la Luna1
1
Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES,
2
Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat
Pompeu Fabra, Barcelona, ES
Our perception of how kinases regulate gene expression has recently
been expanded to consider not only their influence on transcription
factors and co-regulators but also that on histones, chromatin remodelers
or components of the basal transcription machinery, all of which may be
directly modified by kinases at specific genomic loci. DYRK1A (dual-
specificity tyrosine-regulated kinase) belongs to a highly conserved family
of kinases represented in all eukaryotes and it is known to fulfil key roles
during brain development. While DYRK1A is present both in the nucleus
and cytoplasm of mammalian cells, very little is known about the nuclear
activities of DYRK1A. We show here that nuclear DYRK1A is an active
kinase that participates in high molecular weight complexes, interacting
with several components of the basal transcriptional machinery, including
RNA polymerase II. We mapped the genome-wide profile of DYRK1A
interactions with chromatin and found that the kinase is recruited to RNA
polymerase II-dependent promoters, where it activates transcription in a
kinase dependent manner. DYRK1A binds chromatin regions displaying a
highly conserved palindromic sequence that lies close to the transcription
Granada 2014
start site of target genes, a sequence that is apparently necessary for
DYRK1A-mediated transcriptional activation. Growth-dependent
expression of a subset of DYRK1A target genes depends on DYRK1A
protein levels and/or activity, and indeed, downregulation of DYRK1A
diminishes cell growth. Thus, we propose a novel role for DYRK1A as a
chromatin-associated transcriptional regulator and as part of the machinery
controlling cell growth.
P16-16
SMARCA4 expression regulation by miRNAs
in lung carcinogenesis
IF Coira1, EE. Rufino-Palomares1, P. Peinado1, C. Metheetrairut2, L.
Boyero1, OA Romero3, J Carretero4, E. Farez-Vidal5, M. Cuadros5, FJ
Reyes-Zurita5, JA Lupiáñez5, M Sánchez-Cespedes3, FJ Slack2, PP
Medina1
1
University of Granada, Department of Biochemistry and Molecular
Biology. Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO),
Granada, ES, 2Yale University, New Haven, US,3IDIBELL,
Barcelona, ES, 4University of Valencia, Department of Physiology,
Valencia, ES, 5University of Granada. Department of Biochemistry
and Molecular Biology, Granada, ES
SWI/SNF complex is chromatin-remodeling complex able to alter the
interactions between DNA and histones and modify the availability
of the DNA information to the cell machinery, using the energy of the
ATP hydrolysis. Last deep-sequencing efforts on tumoral genomes have
underlined the important and ubiquitous role of the SWI/SNF complex
and cancer. It has been known that the expression of SMARCA4, the
helicase/ATPase catalytic subunit of the SWI/SNF complex, is frequently
lost in NSCLC cell lines, mainly by mutations. In primary tumours, the
loss of expression of SMARCA4 is also frequent, however it lost cannot
be explained by mutations nor other gene silencing mechanisms such us
promoter hyper-methylation. So, the regulation of SMARCA4 is partially
unknown. In this assay, we study if the microRNAs contributes to the
loss of expression of SMARCA4 in lung tumors. For this purpose we
have determined experimentally the 3’UTR, and analysed functionally
the microRNA binding sites previously predicted by bioinformatics tools.
Results obtained indicated that the loss of expression of SMARCA4
observed in primary lung tumors can be due to microRNA activity.
P16-17 (R16-1)
RNAPII dephosphorylation is facilitated
by the Rpb4/7 heterodimer
Olga Calvo
Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/Universidad de
Salamanca, Salamanca, ES
The eukaryotic RNAPII enzyme, whose activity is essential for
transcription of protein-coding genes, is a complex of 12 subunits, Rpb1
to Rpb12. The Rpb4 and Rpb7 subunits bind to each other forming a
complex in archaebacteria and in eukaryotic cells, and display some unique
features that distinguish them from the remaining subunits. In the case of
S. cerevisiae, the Rpb4/7 heterodimer can dissociate from the rest of the
holoenzyme, and has been shown to be involved in several gene expression
processes. Thus, they are important for transcription initiation, elongation
and, in particular, Rpb4 contributes to contranscriptional recruitment
of 3’-end processing factors. Moreover, recent evidences suggest that
they are also involved in DNA repair, mRNA export and decay, as well
as in translation. Here, I present additional data showing that the Rpb4/7
heterodimer is important to maintain proper RNAPII phosphorylation levels
in S. cerevisiae, regulating several kinases and phosphatases. In fact, in the
absence of a functional Rpb4/7 heterodimer, RNAPII phosphorylation is
dramatically enhanced all along the transcription cycle due to altered CTD
phosphatases recruitment.
Pósters
P16-18
Roturas de ADN y topoisomerasas: el peligro de
jugar con cuchillos
Felipe Cortes Ledesma
CABIMER, Sevilla, ES
Las topoisomerasas de ADN son enzimas nucleares muy conservadas en la
evolución que pueden considerarse un arma de doble filo. Por un lado, su
acción es necesaria para regular los cambios topológicos inherentes a todos
los procesos fundamentales que implican a la molécula de ADN, incluyendo
tanto la transcripción, replicación y reparación como la condensación y
segregación cromosómica. Sin embargo, su ciclo catalítico emplea un
mecanismo de rotura transitoria y religación que, si se ve interrumpido, puede
dar lugar a roturas de ADN persistentes, con las evidentes consecuencias
que éstas pueden tener para la supervivencia celular y la integridad del
genoma. Además, esta peculiaridad del mecanismo de acción de las
topoisomerasas es la base de la eficacia antitumoral de los llamados “venenos
de topoisomerasas”, un grupo químicamente heterogéneo de compuestos
que inhiben específicamente el paso de religación catalizado por la enzima,
induciendo así la formación de roturas de ADN que, por su alto índice de
proliferación, afectan preferentemente a las células tumorales. Además de
esta interesante relación con la terapia del cáncer, se ha demostrado que una
deficiente reparación de roturas generadas por topoisomerasas puede ser la
base de diversas patologías neurológicas humanas. Por lo tanto, comprender
en su totalidad los mecanismos y la regulación que rigen la reparación de
las roturas de ADN inducidas por topoisomerasas adquiere una importancia
fundamental para la salud, con posibles implicaciones en el desarrollo de
futuras herramientas, tanto de diagnóstico y pronóstico como terapéuticas.
P16-19
Pitx2 differently controls the expression of host
genes and gene-embedded microRNAs in cardiac
and skeletal muscle cells
Francisco Hernandez-Torres, Amelia E Aranega, Diego Franco Jaime
Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén,
Jaén, ES
The Pitx2 gene is a member of the Bicoid-like homeobox family that
plays an importantrole in embryonic left-right signalling and subsequently
during cardiac and skeletal muscle organogenesis. Pitx2 misregulation
has been as well associated with skeletal and cardiac muscle diseases.
Although three Pitx2 isoforms are expressed in mice, Pitx2a, Pitx2b
and Pitx2c, only Pitx2c plays a determinant role in left–right signalling
and organogenesis. Over the last years we have gained insights into the
transcriptional regulatory mechanisms driven by Pitx2 in both cardiac
and skeletal muscle. Interestingly, besides playing a role in regulating a
large number of protein-coding genes, microRNAs are also regulated by
Pitx2. Whereas the functional role of distinct microRNAs in cardiac and
skeletal muscle development and homeostasis is progressively emerging,
their transcriptional control and the genetic networks in which they are
involved remains largely unexplored. Among 34 differentially regulated
microRNAs by Pitx2 in either skeletal or cardiac muscle cells, 10 (~30%)
display putative Pitx2 binding sites in the -3000 bp proximal promoter
sequence, among with other muscle-enriched transcription factor binding
sites. Curiously, only two of these microRNAs were intergenic, supporting
thus their own transcriptional regulatory mechanisms, while the majority
of them were embedded into distinct host genes. Since transcriptional
regulation of gene-embedded microRNAs seemed to be modulated in
accordance with transcriptional regulation of the host gene,we evaluated
the host gene/microRNA expression levels in Pitx2 gain-of-function
experiments using Sol8 skeletal muscle and HL-1 atrial cardiomyocytes,
respectively. Surprisingly, our data demonstrate that most of these
microRNAs are independently regulated from its host gene, and moreover
such transcriptional regulation is cell-type specific. We our now working
to establish the mechanisms by with Pitx2 can exert this microRNAs
transcriptional regulation.
145
Pósters
P16-20
Adult exposure to Bisphenol A decrease
the expression of 5alpha-reductase type I
in the prefrontal cortex of female rat. A novel
mechanism underlying Bisphenol A-associated
psychopathologies?
Esperanza Ortega Sánchez1, Beatriz Castro Bohorquez2, Pilar
Sánchez Medina2, Jesús M. Torres de Pinedo2
1
Universidad de Granada, Granada, ES, 2Dpto. de Bioquímica,
Biología Molecular 3 e Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad de Granada, Granada, ES
Most people in developed countries are exposed almost continuously to
Bisphenol A (BPA), an endocrine-disrupting chemical presents in food
packaging and dental sealants. BPA is able to interfere with cognitive
functions and behavior, but the mechanisms underlying these effects remain
unknown. Allopregnanolone (AlloP) is a neuroactive steroid involved in
modulating behavioral functions, stress, and neuroendocrine axes and its
deregulation is implicated in the development of several psychopathologies.
In these processes a key role is held by 5α-reductase (5α-R), the rate-limiting
enzyme of AlloP synthesis. Given 5α-R type 1 is the isozyme mainly
implicated in the biosynthesis of AlloP, we examined the effects of BPA on
5α-R1 expression in the prefrontal cortex (PFC) of female rats. We focused
on PFC since it is an important area for cognitive control and complex
behaviors. Adult female Wistar rats were subcutaneously injected during
4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental Protection
Agency (EPA) reference dose. Rats were euthanized at 30 min after the
final administration. Quantitative RT-PCR and Western blot analysis were
performed to quantify mRNA and protein levels of 5α-R1 respectively. Under
the conditions assayed, BPA decreased the expression of 5α-R1. This finding
is very interesting because reduced brain levels of 5α-R1 and, consequently
AlloP, may contribute to increased the vulnerability for mental and emotional
pathology in females. Thus, mood changes during the menstrual cycle,
postpartum, major depression and epilepsy are pathologies associated with
low AlloP levels. We present here a possible novel mechanism underlying
BPA-associated psychopathologies but also raises questions about the safety
of adult exposure to BPA.
P16r-21
Análisis de la expresión de GFP con diferentes
3´-UTR en un mutante nup84 del NPC
Bárbara María Varela-Rodríguez, Tania Alvarez-Felgar, Ana María
Rodríguez-Torres, Maria Angeles Freire Picos
Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias,
Universidad de la Coruña, A Coruña, ES
Uno de los aspectos clave de regulación de la expresión génica es
el procesamiento del extremo 3´de los RNA transcritos por la RNA
polimerasa II. En las regiones 3´-UTR (3´-Untranslated) de los mensajeros
se encuentran señales que determinan, entre otras, su estabilidad y en
general todos los procesos post-transcripcionales.
Menos conocido es el proceso que determina el emplazamiento de un
mRNA en el citosol por su paso a través del Complejo del Poro Nuclear
(NPC). Datos de nuestro grupo [1] indican que la mutación del factor
Nup84 (que forma parte del “complejo Y” del NPC) de la levadura
Saccharomyces cerevisiae afecta a la abundancia de transcritos detectables
en los genes con poliadenilación alternativa. Esto nos llevó a buscar un
sistema para identificar el producto final de la expresión, la proteína.
Para ello expresamos GFP con variantes de regiones 3´-UTR de genes de
levaduras: por un lado la 3´-UTR del gen CYC1 y por otro las variantes de
la UTR de un gen con poliadenilación alternativa, KlCYC1, expresado en S.
cerevisiae [2]. El análisis de la expresión de GFP se llevó a cabo tanto por
microscopía de fluorescencia como por fluorimetría y por western blot. Los
resultados de fluorimetría permitieron apreciar diferencias importantesen la
expresión de GFP en el mutante nup84 expresando la UTR de KlCYC1. Los
146
XXXVII Congreso SEBBM
datos obtenidos resultaron ser más claros al analizarlos por esta técnica que
por western. En la cepa salvaje, se obtienen niveles altos de GFP expresado
con la 3´-UTR de CYC1 y bajos con la de KlCYC1. Hemos comprobado
por tanto, que se puede modular la expresión de GFP con estas UTR, y que
el efecto del mutante nup84 varía en función de la 3´-UTR contigua a la
región codificadora.
Bibliografía
[1] T. Alvarez-Felgar, B.M Varela-Rodríguez y MA Freire-Picos.
Variaciones en la expresión de genes con procesamiento alternativo en
mutantes del poro nuclear. XXXVI Congreso de la SEBBM 2013.
[2] B.M. Varela-Rodríguez. Expresión de formas recombinantes de GFP
en levaduras: efecto de la cepa y componentes del poro nuclear. Tesis de
licenciatura. Facultad de ciencias, UDC 2013.
P16-22
DbdR, nuevo miembro de la familia de
LysR, regulador transcripcional de la ruta de
degradación anaerobia de 3,5-dihidroxibenzoato
en Thauera aromatica AR-1
Molina-Fuentes, A., Pacheco, D., Marín, P., Díaz-Romero, A.,
Marqués, S.
Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del
Zaidín, CSIC, Granada, ES
T. aromatica AR-1 es una bacteria desnitrificante capaz de crecer en 3,5
dihidroxibenzoato (3,5-DHB) como única fuente de carbono y energía
mediante una ruta oxidativa independiente de oxígeno utilizando nitrato
como aceptor final de electrones [1]. La agrupación génica que codifica para
las enzimas de la ruta y proteínas transportadoras consta de 20 genes en una
región cromosómica de 29 Kb [2]. Un análisis de RT-PCR ha permitido definir
una organización transcripcional en cinco operones, cuatro de los cuales son
inducibles por sustrato. A ambos extremos de la agrupación se encuentran
sendos reguladores de la familia de LysR. Mediante mutagénesis dirigida
hemos determinado que el único gen regulador esencial de la ruta es dbdR.
Un análisis de expresión en un fondo mutante dbdR revela que los operones
principales de la ruta son dependiente de este regulador. Mediante extensión
a partir de cebador hemos definido los promotores de estos operones, que
muestran una notable conservación en estructura, y en los que se predicen los
posibles sitios de unión para reguladores de la familia de LysR. Estos sitios
de unión se están confirmando mediante ensayos de retardo en gel (EMSA)
y de footprinting con DNAsa utilizando proteína DbdR sopreexpresada y
purificada. El gen regulador forma un operón con qorA, una de las enzimas
responsable del segundo paso de la ruta. Este operón presenta niveles basales
de expresión, inducibles en presencia de sustrato. Su actividad está regulada
negativamente por la presencia de DbdR en ausencia del sustrato. Se han
construido fusiones de cuatro promotores de la ruta (Porf18, Porf20, Pdctp y Pdbdr)
al gen reportero lacZ para analizar su actividad en un huésped heterólogo
en presencia y ausencia del regulador. Los resultados confirman el papel del
regulador en la expresión de estos promotores, aunque la actividad basal y la
fuerza de los distintos promotores varían. Esto siguiere distintos mecanismos
de activación para los distintos promotores. Estas construcciones se han
utilizado para analizar la expresión en T. aromatica AR-1. Los resultados
confirman que DbdR regula la expresión desde al menos Porf18, Porf20 y Pdctp.
Por otra parte se confirma la represión catabólica inicialmente descrita como
la represión de la utilización de 3,5-DHB en presencia de benzoato(3):
observamos que la presencia simultánea de succinato y 3,5-DHB produce
una cinética típica de crecimiento diáuxico, donde el 3,5-DHB sólo se
utiliza una vez consumido el succinato. Esta represión se ejerce a nivel de
la expresión desde al menos los promotores Porf18 y Porf20. Finalmente, el
análisis de la expresión de los promotores regulados en fondos mutantes para
los distintos pasos de la ruta nos ha permitido determinar que la molécula
efectora es el sustrato 3,5-DHB y no un producto de su metabolismo. Este
extremo se analizará bioquímicamente mediante microcalorimetría isoterma
de titulación (ITC) con la proteína reguladora purificada.
Granada 2014
Bibliografía
[1] Gallus, C., and Schink, B. (1998) Arch Microbiol. 169, 333-338.
[2] Molina-Fuentes, A. (2012) Tesis doctoral.
[3] Philipp B & Schink B. (2000) Arch Microbiol. 173, 91.
Proyecto financiado por fondos FEDER, proyecto del MICINN BIO2011-
23615.
P16r-23
Electrophoretic mobility of catenated, knotted
and supercoiled DNA molecules
1 1
Jorge Cebrián , Alicia Castán , Maridian J. Kadomatsu-Hermosa , 2 Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), Granada,
Víctor Martínez2, Cristina Parra2, María José Fernández-Nestosa2,
Christian Schaerer2, Pablo Hernández1, Jorge B. Schvartzman1,
Dora B. Krimer1
1
Department of Cellular and Molecular Biology. Centro de
Investigaciones Biológicas (CSIC), Madrid, ES, 2Scientific and Applied
Computing Laboratory. Polytechnic School. National University
of Asunción. P.O. Box 2111 SL. San Lorenzo, Asunción, PY
Two-Dimensional (2D) agarose gel electrophoresis is the method of
choice to separate the stereoisomers for any given circular DNA molecule.
Supercoiled, catenated and knotted families are clearly identified as they
exhibit different electrophoretic mobility. Here we used classical genetics,
treatments with Norfloxacine and 2D agarose gel electrophoresis run at
different conditions (voltage and agarose concentration) to analyze the
mobility of four families of stereoisomers of the same mass: monomeric
CatAs (where both duplexes are nicked), monomeric CatBs (where
one duplex is nicked and the other is covalently closed), covalently
closed dimers and knotted dimers. The results obtained indicate that the
contribution of catenane, knot and supercoil nodes to electrophoretic
mobility varies significantly depending on the electrophoretic conditions
employed. Whereas increasing voltage has little effect on the catenanes´
mobility, it changes significantly the mobility of supercoiled and knotted
dimers. This observation was confirmed for CatBs. Moreover, for partially
replicated molecules displaying two regions: one already replicated and
the other not, the electrophoretic mobility is determined by the size of the
region and the distribution of supercoiled and pre-catenane nodes.
P16-24
Mecanismos de regulación de la cromatina:
posicionamiento mononucleosomal en el gen Egr1
Angela L. Riffo-Campos, Josefa Castillo, M. Isabel Rodrigo, Gerardo
López-Rodas, Luis Franco
Laboratorio de Epigenética y cromatina. Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Valencia e
INCLIVA, Valencia, ES
La cromatina es una estructura compleja formada por DNA, RNA y
proteínas, que permite el empaquetamiento ordenado del genoma en las
células eucarióticas. Representa un nivel adicional de regulación de todos
los procesos metabólicos del DNA, como la replicación, reparación,
recombinación y transcripción. El gen Egr1 (Early growth response 1)
pertenece al tipo denominados genes inmediato tempranos (IEGs), dado
que se activa rápidamente en respuesta a señales mitogenicas que activan
la proliferación celular fundamentalmente mediante la vía de señalización
de las MAP Quinasas.
En la presente investigación se estudia el posicionamiento nucleosomal
del gen Egr1 en los modelos biológicos in vivo (hepatectomía parcial en
ratón) e in vitro (línea celular MLP29 de precursoras de hepatocitos de
ratón). El posicionamiento se determina mediante ensayos de digestión con
la enzima MNasa y posterior análisis por PCR en tiempo real utilizando
amplicones solapantes que cubren la región del promotor y el inicio de
la transcripción del gen. Los resultados demuestran que la posición de
los nucleosomas se mantiene en ambos modelos antes de la activación
Pósters
del gen. Tras la activación del gen existe un desplazamiento de N-2 y
una desestructuración parcial o total en los nucleosomas N-1 y N+1,
dejando accesible los elementos en cis del gen. También se estudia el
posicionamiento de Egr1 en condiciones de silenciamiento para investigar
la implicación de la proteína EGR1 en el desplazamiento del nucleosoma
N-2. Los resultados reiteran la importancia del estudio de los mecanismos
de regulación de la cromatina a nivel mononucleosomal.
P16-25
BCL7A’s role in haematological malignancies
Carlos Baliñas Gavira1, Pedro P. Medina2
1
ES, 2University of Granada, Departement of Biochemistry and
Molecular Biology I. Centre for Genomics and Oncological Research
(GENYO), Granada, ES
Gene expression regulation increases the functional versatility and
adaptability of the cell by allowing it to express certain proteins when
needed. It is, therefore, one of the most important and complex processes
of biology. Changes in the gene expression patterns are key in cancer cell
transformation, through an increase in expression of genes that promote
carcinogenesis (oncogenes) and/or a decrease in expression of genes that
prevent it (tumour suppressor genes).
SWI/SNF chromatin-remodeling complex alters the interactions between
DNA and histones and modifies the availability of the DNA for transcription.
The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced the important
and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF complex in cancer.
However, although SWI/SNF complex play a key role in gene expression,
the regulation of this complex itself is poorly understood.
BCL7A was recently identified as a new member of the human SWI/SNF
complex. Recently, some reports found BCL7A expression inactivated
in hematological malignancies. After screening for BCL7A genetic
alterations over a battery of hematological cell lines, we found two cell
lines homozygously mutated for BCL7A. We are currently using these
cell lines to analyze tumor phenotype changes after BCL7A expression
restoration. Upon the completion of this task, we will go through functional
analysis to determine BCL7A role in tumorigenesis.
P16-26
El tirosol regula el patrón global de expresión de
ARN mensajeros implicados en la reproducción,
desarrollo y crecimiento de Caenorhabditis elegans
Ana Cañuelo Navarro1, Francisco J. Esteban Ruiz2, Juan Peragón
Sánchez1
1
Área de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de
Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2Área
de Biología Celular, Departamento de Biología Experimental,
Universidad de Jaén, Jaén, ES
El tirosol (Tir, 2-(-4-hidroxifenil)etanol) es uno de los compuestos
fenólicos presentes en el fruto y hoja de olivo beneficiosos para la salud. La
incorporación de 250 μM de Tir en el medio de cultivo de Caenorhabditis
elegans incrementa la longevidad, la termotolerancia y la resistencia
al estrés oxidativo. En estudios previos hemos identificado, mediante
el análisis de los cambios inducidos en el proteoma de esta especie, las
proteínas dianas celulares sobre las que termina influyendo. En este trabajo
hemos determinado los cambios que se producen en el patrón global de
expresión de ARN mensajeros mediante un análisis de microarrays de
ARN utilizando la metodología Affymetrix.
Utilizando C.elegans GeneChipR Genome Array se han medido los
cambios que se producen en la expresión génica de 22625 transcritos. En
respuesta a 250 μM de Tir se producen cambios en los niveles de ARNm de
208 genes; en 206 el nivel de expresión estaba aumentado y en 2 de ellos
disminuido. Un posterior análisis de enriquecimiento funcional puso de
manifiesto que estos genes están implicados en procesos biológicos tales
147
Pósters
como la reproducción, el metabolismo lipídico, el desarrollo embrionario
y larvario, la morfogénesis y la regulación de la velocidad de crecimiento,
transcripción, transporte, así como en otras funciones. Destaca la inducción
de 19 genes que codifican para la Proteína Mayor del Esperma (msp).
Estos resultados permiten relacionar el incremento en la longevidad con la
reproducción, desarrollo y crecimiento en C. elegans mediado por tirosol.
Este trabajo ha sido financiado por el Plan de Apoyo a la Investigación,
Desarrollo Tecnológico e Innovación de la Universidad de Jaén
(R1/13/2010/02).
P16-27 (R16-6)
Mip6p, a putative mRNA binding protein
Manuel Martín Expósito, Susana Rodríguez Navarro
Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES
Las proteínas de unión a ARN (RBP) juegan un papel clave en el control
post-transcripcional de diferentes ARN, que, junto a la regulación
transcripcional, es una de las vías para regular los niveles de expresión
de genes durante el desarrollo. El control postranscripcional puede ocurrir
a diferentes niveles en el metabolismo de ARN, incluyendo splicing,
poliadenilación, estabilidad, localización y transporte del ARN mensajero
del núcleo al citoplasma.
La proteína Mip6 (MEX67-interacting protein 6) es una proteína con
dominios de unión a ARN, que interacciona físicamente con las proteínas
Mex67 y Sus 1. Mip6p posee tres dominios de unión a ARN en su extremo
N-terminal.
A través de distintas aproximaciones se ha tratado de identificar las dianas
(RNA unidos) a estos RBP o identificar RBP que se unen a secuencias
regulatorias conocidas. En general, los análisis genéticos indican que los
RBP deben regular numerosos RNA ya que la pérdida de un RBP presenta
mayores efectos que cepas desreguladas de ARNm conocidos.
En nuestro laboratorio estamos realizando la caracterización funcional
de Mip6. Hemos identificado que la localización de Mip6 varía en base a
cambios de temperatura. Por otro lado, el dominio C-terminal es necesario
para la interacción con Mex67 además de ser imprescindible para el paso
de Mip6 entre el núcleo y el citoplasma. Además, el mutante mip6 presenta
resistencia a estrés severo por temperatura.
Por último, estamos estudiando cuáles son los ARN diana de Mip6 bajo
condiciones de estrés como choque térmico. Se presentarán los últimos
resultados más relevantes obtenidos en la caracterización de Mip6.
P16r-28
RNAi-mediated silencing of plekstrin in murine
erytrholeukemia cell differentiation
Vanessa Fernández Calleja1, Pablo Hernández2, Jorge B.
Schvartzman2, Dora B. Krimer2
1
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES,
2
Department of Cellular and Molecular Biology, Centro de
Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES
Murine erythroleukemias are experimental models that have been
successful to comprehend tumour leukemogenesis mechanisms and
normal erythropoiesis development. Friend murine erythroleukemia
cells (MEL) derived from transformed erythroblasts immortalized by the
Friend complex virus were used in our lab to study the cell differentiation
blockade that characterize these cell lines. We established resistant cell
lines (MEL-R) that unlike their parental line, are refractive to inducers
of differentiation (Fernández et al., Leukemia Research (2008) 32,
121; SpringerPlus (2013) 2, 392). Recent results using next generation
sequencing recognized 487 genes that increased their expression
greater than two fold between MEL undifferentiated and MEL-R cells.
Among these genes we identified pleckstrin (plek), a protein implicated
in signaling and cytoskeletal function. Cytoskeletal proteins undergo
reorganization during terminal erythropoiesis and are involved in erythroid
148
XXXVII Congreso SEBBM
cell enucleation. After validation of the pleck results by real-time PCR and
Western, we generated shRNAs encoded by mammalian vectors that were
used to transfect MEL cells and down-regulate plek in transient or stable
transfectants. We analyzed also the effect of plek in early and late stages
of cell differentiation.
P16-29
Accurate chromatin structure is required for
proper Top2 and condensin activities during
chromosome decatenation and centromere
biorientation
Marina Murillo-Pineda1, Marta Clemente-Ruiz1, Fernando Monje
Casas2, Félix Prado Velasco1
1
CABIMER-CSIC, Sevilla, ES, 2CABIMER-USE, Sevilla, ES
The structural organization of chromosomes is essential for their correct
function and dynamics during the cell cycle. The assembly of DNA into
chromatin provides the substrate for topoisomerases and condensin, which
introduce the different levels of superhelical torsion required for DNA
metabolism. In particular, Top2 and condensin are directly involved in
both the resolution of precatenanes that form during replication and the
formation of the intramolecular loop that detect tension at the centromeric
chromatin during chromosome biorientation. Here we show that histone
depletion activates the spindle assembly checkpoint (SAC) and impairs
sister chromatid decatenation, leading to chromosome missegregation and
lethality in the absence of the SAC. We demonstrate that histone depletion
impairs chromosome biorientation and activates the Aurora-dependent
pathway, which detects tension problems at the kinetochore. Interestingly,
SAC activation is suppressed by the absence of Top2 and Smc2, an
essential component of condensin. Indeed, smc2-8 suppresses catenanes
accumulation, mitotic arrest and growth defects induced by histone
depletion at semi-permissive temperature. Therefore, our results reveal the
importance of chromatin structure for the function of Top2 and condensin
during precatenanes resolution and centromere biorientation, two essential
processes for chromosome segregation.
P16-30
Cambio de accesibilidad de la subunidad
ribosomal 40S al IRES del virus de la hepatitis C
tras la unión del miR-122
Ascensión Ariza-Mateos, Jordi Gómez
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC
- CIBER de enfermedades hepáticas y digestivas (CIBERehd),
Armilla, Granada, ES
El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de RNA de cadena sencilla
y polaridad positiva perteneciente a la familia Flaviviridae. El genoma
comprende una región 5’ no traducible que funciona como un sitio de
entrada interna del ribosoma (IRES), incluyendo el codón de inicio de la
traducción AUG, esencial para la síntesis de proteínas independiente de la
estructura 5’-cap.
Se ha demostrado que la enzima RNasa P, que procesa los precursores de
los tRNA del hospedador, puede cortar in vitro el genoma del RNA de
HCV en el IRES cerca del triplete iniciador AUG, indicando la presencia
de una estructura tipo-tRNA en el IRES. Otros grupos y nosotros hemos
demostrado previamente que el IRES de HCV reside en la región genómica
1-570 en una conformación cerrada que es capaz de cambiar a una
conformación abierta por la unión de moléculas del microRNA-122 en su
flanco 5’.
En este estudio hemos probado cuantitativamente la capacidad del miR-
122 para interaccionar con el RNA-HCV tanto en la forma cerrada como
en la abierta, determinando dos nuevos sitios de unión en tandem para el
miR-122 en el flanco 3’ del IRES.
Granada 2014
Los efectos de unión del miR-122 en el flanco 3’ del IRES fueron
determinados mediante RNasa específicas de simple y doble cadena (RNasa
A, T1 y V1) y agentes químicos (DMS). Sin embargo, la accesibilidad a
la estructura tipo-tRNA por las RNasa que reconocen específicamente
este regiones tipo-tRNA (RNasas P y Z) fue afectada, al igual que la
accesibilidad por la RNasa H, indicando que la unión del miR-122 en el
flanco 3’ del IRES provoca un cambio conformacional local en torno al
codón de inicio de traducción, que podría afectar directamente a la unión
de las subunidades ribosomales. Mediante ensayo de unión de la subunidad
ribosomal 40S en presencia de miR-122, se pudo concluir que el miR-122
se une al RNA-HCV en ambos flancos del IRES-HCV y que esto podría
ser un proceso sincrónico que induce un cambio conformacional global de
la estructura del IRES afectando directamente a la unión de la subunidad
ribosomal 40S.
P16-31
The inhibitory state of the T-cell receptor alpha
enhancer in T lymphocytes is not reverted upon
T cell helper differentiation of CD4+ lymphocytes
Úrsula Angulo Urrecho, Beatriz del Blanco, Jennifer López Ros,
Cristina Hernández-Munain
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC,
(IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud,
Armilla, ES
The T-cell receptor α (Tcra) enhancer (Eα) is essential for Tcra locus
germline transcription and primary Vα-to-Jα recombination during
thymocyte development. We found that Eα is inhibited late during
thymocyte differentiation and in peripheral T cells, indicating that it is not
required to drive transcription of rearranged Tcra genes. Eα inactivation in
peripheral T lymphocytes resulted in the lost of the enhancer-dependent
chromatin modifications and in the disruption of functional long-range
enhancer-promoter interactions as a consequence of the downregulation of
E2A and GATA-3 in mature T cells. Since GATA-3 is essential for T helper
(Th) 2 differentiation and has a role in regulatory T cell (Treg) maintenance
and function, we hypothesized that Eα function might be re-activated
during CD4+ cell differentiation. We have differentiated T cells in vitro to
different Th subsets: Th1, Th2, Th17 and Treg to evaluate whether there is a
direct correlation between Eα activity and Gata3 and Tcfe2a transcription.
Our results indicate that the high induction of GATA-3 transcription
observed during Th2 differentiation is not sufficient to activate Eα activity
in peripheral CD4+ T cells and that other factors are clearly required for
enhancer function in these cells. Further experiments are currently being
performed to extend these analyses during CD8+ T lymphocyte activation.
P16-32
Regulación epigenética del promotor PRDM1β en
mieloma múltiple
Raquel Romero García, Laura Gómez Jaramillo, Francisco Mora
López, Antonio Campos Caro
Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES
Objetivo: El gen PRDM1 codifica para un factor de transcripción clave
en el proceso de diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas (CP).
Existen dos isoformas de PRDM1, denominadas PRDM1α y PRDM1β,
que se originan a partir de dos promotores diferentes. La proteína PRDM1α
actúa como represor de la transcripción mientras que se desconoce la
función de la isoforma truncada PRDM1β aunque se ha observado que, en
las líneas celulares de mieloma estudiadas, su expresión está aumentada
con respecto a la de la proteína normal. Por ello, hemos estudiado si el
estado de metilación de su promotor está relacionado con la expresión en
mielomas.
Metodología: Se han utilizado líneas celulares de mieloma que expresan
la isoforma PRDM1β (U266, NCI-H929) y otras líneas de linfocitos que
Pósters
no la expresan (Daudi, Raji) así como poblaciones celulares de linfocitos
B y de CP normales y patológicas derivadas de pacientes con mieloma.
Se modificó el DNA genómico con bisulfito y se analizó el grado de
metilación de las diferentes CpG por secuenciación. También se trataron
las células con 5-Aza-2-deoxycytidine, un inhibidor de la metilación del
DNA, para analizar, mediante PCR a tiempo real, si había cambios en los
niveles de transcripción de PRDM1β.
Resultados: Hemos analizado hasta 12 posiciones CpG presentes en el
promotor de PRDM1β. Lo más destacado es que la línea celular U266
prácticamente no presenta metilación en ninguna de las CpG, solo en las
posiciones CpG 7 y 8 en menos del 25% de los clones analizados. Sin
embargo en líneas celulares como Daudi y Raji, así como en linfocitos B y
CP normales, se observa un patrón diferente donde las posiciones 4, 5, 6, 9 y
12 están preferentemente metiladas. Para evaluar si la expresión de PRDM1β
tiene relación directa con el estado de metilación del promotor, el tratamiento
con 5-Aza-2-deoxycytidine mostró un aumento en los niveles de transcritos
de PRDM1β en cultivos de células Namalwa pero no con U266.
Conclusión: Estos datos indican que la metilación de las CpG en el
promotor es, al menos, uno de los mecanismos por el cual se regula la
expresión de PRDM1β.
P17. Regulación metabólica
P17-1
Profiling of promoter occupancy by SND1
coactivator in human hepatoma cells via
ChIP-chip analysis
Enara Arretxe, Begoña Ochoa, Sandra Armengol, Sarai Mula,
Yolanda Chico, María José Martínez
Department of Physiology, University of the Basque Country Medical
School, UPV/EHU, Leioa, ES
Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1 (SND1), also
known as p100 coactivator or Tudor-SN, is an evolutionarily conserved
multifunctional protein implicated in a variety of cellular processes,
including adipogenesis, stress response, gene transcription, RNA
metabolism and cancer progression. Originally identified as a transcriptional
coactivator of EBNA-2, we now know that SND1 can modify the
expression of several genes by interacting with transcription factors
STAT5, STAT6, c-Myb and PPARγ. However, the relevance of SND1 as
a transcriptional coactivator remains unresolved and no comprehensive
picture of potential SND1 target genes has yet been reported. Interestingly,
we found overexpression of SND1 in human hepatoma cells exposed to
TNFα through NF-κB binding to gene promoter, supporting a role for
SND1 in inflammation signalling pathways. To gain insight into the role of
SND1 in gene transcription regulation, we performed genome-wide search
for endogenous SND1 binding sites by Chromatin Immunoprecipitation
(ChIP)-chip analysis on HepG2 human hepatoma cells left untreated and
upon TNFα stimulation. We found a set of 645 target genes in basal cells
and 822 in cytokine-treated cells, of which 281 genes were exclusively
bound in the treated group. Transcription factor binding site analysis of
target genes at CEAS server revealed enrichment of motifs for established
partners and novel transcription factors involved in stress response (i.e.
HSF and ATF), viral infection (i.e. STAT1 and STAT3), cell proliferation
(i.e. MEIS1/AHOXA9, E2F, E2F1 and PAX) and metabolic regulation
(i.e. p300 and CREB). Gene Ontology classification of SND1 target genes
by DAVID showed enriched ontologies such as regulation of information
molecules, metabolism, organ morphogenesis and central nervous system
development. Major differences of TNFα-treated vs untreated human
hepatoma cells were a few ontologies involving phospholipid metabolism,
heat shock protein binding and the TGF-β signaling pathway.
Supported by Basque Government grants IT-336/10 and S-PE13UN139.
149
Pósters
P17r-2
La sensibilidad del metabolismo de poliaminas a
la privación de glucosa es mayor en células
de neuroblastoma con amplificación de n-myc
Mª Victoria Ruiz Pérez, José Luis Urdiales, Francisca Sánchez
Jiménez, Miguel Ángel Medina
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de
Málaga, Málaga, ES
El oncogén n-myc es capaz de potenciar la síntesis de poliaminas, moléculas
esenciales para la proliferación celular cuyos niveles están elevados en muchos
tumores. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente
en niños, muestra amplificación de n-myc en el 25% de los casos, y dicha
amplificación está asociada a mala prognosis y escaso éxito del tratamiento.
En este trabajo, hemos evaluado la relevancia de la amplificación de n-myc
sobre varias características metabólicas de células de neuroblastoma humano,
y hemos analizado los efectos de la inhibición de la glucólisis sobre el
metabolismo de poliaminas en dichas células. Los resultados de este trabajo
muestran una relación previamente desconocida entre la glucólisis y los
niveles de poliaminas: la inhibición de la glucólisis desencadena eventos de
señalización que llevan a una disminución de los niveles proteicos de N-Myc
y a un descenso de la expresión de la enzima ornitina descarboxilasa y de los
niveles de poliaminas, todo ello acompañado por un bloqueo del ciclo celular.
Esta relación entre la privación de glucosa y la deficiencia de la síntesis de
poliaminas, y su aparente relación con la amplificación de n-myc, podría ser
explotada para el desarrollo de nuevas terapias antitumorales contra tumores
que presenten amplificado este oncogén.
P17m-3 (R17-5)
Modulación del metabolismo de los cuerpos
lipídicos hepáticos de ratón en la endotoxemia
Lino Arisqueta Herranz, Hiart Navarro-Imaz, Yuri Rueda Estévez,
Olatz Fresnedo Aranguren
Departamento de Fisiología, UPV/EHU, Leioa, ES
Durante la respuesta de fase aguda frente a patógenos se producen
cambios específicos en el metabolismo de los lípidos que conducen a la
denominada lipemia de la sepsis. Esta adaptación se considera parte de
la respuesta inmune innata ya que favorece la eliminación del torrente
sanguíneo de endotoxinas como el lipopolisacárido (LPS). La lipemia se
origina, entre otros, como consecuencia de adaptaciones hepáticas que
afectan al ensamblaje de VLDL, un proceso complejo en el que intervienen
los cuerpos lipídicos (CL). Este estudio se propuso con el fin de analizar
en qué medida el metabolismo de los CL hepáticos está implicado en la
respuesta inmune innata. Para ello se administró LPS a ratones salvajes y
ratones deficientes en leptina (ob/ob), cepa que presenta esteatosis hepática
(acumulación de CL) y mayor sensibilidad a la endotoxemia. Uno de los
efectos más destacables del tratamiento con LPS es una menor acumulación
de CL hepáticos. El segundo es la reducción en el contenido de colesterol
esterificado (CE) de estos CL. La cuantificación de la actividad de
enzimas implicados en el metabolismo de lípidos neutros así como de la
expresión de proteínas relacionadas condujo a proponer dos mecanismos
para explicar estas adaptaciones: uno dependiente de la modulación de
actividades enzimáticas y otro dependiente de la movilización de lípidos.
Estudios con cultivos primarios de hepatocitos confirman que las citoquinas
sobresecretadas tras el tratamiento con LPS participan en la regulación
diferencial de las actividades triglicérido hidrolasa y diglicérido hidrolasa
hepáticas, lo que probablemente conduce a una canalización de sustratos
hacia la biogénesis de VLDL. Este mecanismo conduciría a la menor
acumulación de CL en el hígado. Por otro lado, el menor contenido de CE
de los CL se debe probablemente a una mayor secreción de colesterol al
sinusoide mediada por sobreactivación del receptor nuclear LXR. En los
ratones ob/ob estos mecanismos se encuentran atenuados, lo que podría
condicionar una respuesta innata deficiente.
Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20).
150
XXXVII Congreso SEBBM
P17m-4
¿Es la resistencia a la insulina dependiente
de la remodelación del tejido adiposo?
Martín Alcalá Díaz-Mor1, Julio Sevillano Fernández1, Jimena Pita
Santibañez1, Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles2, María del Pilar
Ramos Álvarez1, Marta Viana Arribas1
1
Departamento de Química y Bioquímica, Facultad de Farmacia,
Universidad San Pablo CEU, Madrid, ES, 2Departamento de
Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad San
Pablo CEU, Madrid, ES
Introducción: La capacidad de expansión del tejido adiposo ante la
acumulación de grasa en la obesidad es clave en el desarrollo de patologías
asociadas. Sin embargo, se desconoce la cronología en la aparición de los
cambios estructurales del tejido adiposo, así como la implicación de cada
uno en la pérdida de funcionalidad.
Objetivos: Determinar el papel de la remodelación de la matriz extracelular
y la infiltración de macrófagos en el estroma vascular sobre la resistencia
a la insulina (RI) en el tejido adiposo visceral (TAV) de ratones obesos.
Métodos: Ratones CBL57/6J de 3 semanas de edad fueron divididos
en 2 grupos: un control (C), alimentado con dieta estándar y un grupo
alimentado con dieta rica en grasa (O), durante 14 y 28 semanas. Se
analizaron parámetros metabólicos, proteínas de la cascada de señalización
de la insulina en TAV y se analizó su estructura por inmunohistoquímica.
Resultados: Se observó RI en el grupo O desde la semana 14. A pesar de
que ya existía una infiltración de macrófagos inducida por HIF-1α, todavía
no se vieron cambios ni en el acúmulo de colágeno ni en la señalización de
la insulina en el TAV. Sin embargo, en la semana 28, la RI en los animales O
se caracterizó por la disminución en el receptor de insulina y el aumento en la
fosforilación de p38 en el TAV. A nivel estructural, además de la infiltración de
macrófagos, se observó un marcado acúmulo de colágeno total, tipo I y tipo III.
Conclusiones: Durante el desarrollo de obesidad, la llegada de macrófagos
parece ser uno de los primeros cambios en el TAV, aunque no es
suficiente para bloquear allí la señalización de la insulina. Esta pérdida
de funcionalidad del tejido se ve aumentada por los cambios estructurales
posteriores, principalmente mediados por el acúmulo de colágeno.
P17-5
The lack of GlnB and YejB compensates
the detrimental effect of spoT deletion in E. coli
cells expressing wild type relA
Manuel Montero1, Goizeder Almagro1, Alejandro Viale1, Angel Sevilla2,
Manuel Cánovas2, Cristina Bernal2, Ana Belén Lozano2, Francisco
José Muñoz1, Edurne Baroja-Fernández1, Javier Pozueta-Romero1
1
Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra),
Mutilva, Navarra, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus de
Excelencia Internacional Regional “Campus Mare Nostrum”,
Universidad de Murcia, Murcia, ES
In Escherichia coli, intracellular ppGpp content in response to nutritional
deficiency is controlled by the balanced action of RelA (synthetase I) and
the dual-function (synthetase/hydrolase) SpoT. Generally ascribed to the
detrimental effects of high (p)ppGpp levels, the co-existence of spoT null
(DspoT) with relA proficient alleles has been considered synthetically lethal.
However, in a recent work we have reported the construction of DspoT mutants
in a relA+background accumulating nearly wild type (WT) ppGpp levels when
cells were cultured on a rich complex medium. Sequencing of the genomes
from various selected DspoT clones identified in all of them suppressor
mutations located in relA. In two of them, additional inactivating mutations
were found in glnB and yejB, two genes that have not been characterized as
genetically linked to relA. To know whether mutations resulting in the total
abolishment of the glnB and yejB genes could compensate the detrimental
effects of spoT deletions in E. coli in this work we obtained multiple independent
DspoTDglnB and DspoTDyejB clones. Importantly, these clones expressed
WT RelA, displayed a nearly WT growth phenotype, and accumulated nearly
Granada 2014
WT ppGpp and glycogen contents when cultured in a rich complex medium.
None of these mutants, however, could grow on glucose minimal medium. The
overall data (a) show that different mutations other than in relA can be selected
in E. coli cells compensating the detrimental effects of spoT deletion, and (b)
point to the occurrence in E. coli of mechanism(s), other than SpoT-mediated
ppGpp hydrolytic breakdown, that prevent ppGpp over-accumulation. To our
knowledge this is the first report describing the production of spoT null mutants
of E. coli expressing WT RelA.
P17-6 (R17-6)
The development of insulin resistance can be
regulated by the levels of G-protein coupled
Receptor kinase 2 in myeloid cells
Rocío Vila-Bedmar1, Elisa Lucas1, Marta Cruces-Sande1, Hanneke
Willemen2, Annemieke Kavelaars3, Cobi Heijnen3, Cristina Murga1,
Federico Mayor Jr.1
1
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC),
Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación
Sanitaria La princesa, Madrid, ES, 2Laboratory of Neuroimmunology
and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical
Center Utrecht, Utrecht, NL, 3Department of Symptom Research,
Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson
Cancer Center, Houston, Texas, US
Introduction: G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) is a kinase
classically involved in the modulation of the signalling mediated by
many G protein-coupled receptors (GPCR), but it has also been recently
described to contribute to the development of insulin resistance (IR) and
fat mass accretion in vivo. Accordingly, our previously published studies
have described that lowering GRK2 levels can confer protection against
the development of IR in different mice models of this condition, and also
that this kinase plays an important role in the regulation of obesity and
energy expenditure. In this regard, obesity, which is currently considered
as a chronic low-level inflammatory disease, is a risk factor for the
development of IR. Particularly, macrophages that infiltrate adipose tissue
during obesity have been recognized to have a key contribution to this
metabolic disorder. In this work, we evaluate the potential effect of changes
in the levels of GRK2 specifically in macrophages to the insulin resistant
and obese phenotype observed after a high fat diet (HFD) in mice.
Materials and Methods: The specific contribution of GRK2 in
macrophages/myeloid cells in the context of IR and obesity has been
assessed in a mice model with a specific partial deletion of GRK2 in
myeloid cells, including microglia/macrophages/granulocytes (LysM-
GRK2+/-). These mice were fed a HFD and insulin and glucose tolerance
as well as insulin signalling in different tissues were explored.
Results: Our study showed that LysM-GRK2+/- mice are partially protected
against diet induced obesity (DIO), with no differences in food intake, and
display lower fasting plasma glucose levels after high fat feeding. Moreover,
HFD-fed LysM-GRK2+/- mice show improved glucose tolerance and a more
potent activation of insulin signals in different insulin target tissues, and are
protected against the development of non alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
Conclusion: Our data establish that changes in GRK2 levels specifically in
myeloid cells can regulate the development of diet-induced IR.
P17r-7 (R17-8)
Hacking the master transcriptional program of
prostate cancer metabolism
Lorea Valcárcel1, Veronica Torrano1, Ana Rosa Cortazar1, Sonia
Fernández Ruiz1, Patricia Zuñiga García1, Mar Lorente2, Alfredo Caro
Maldonado1, Natalia Martín Martín1, Amaia Zabala1, Pere Puigserver3,
Brett Carver4, Paolo Pinton5, Guillermo Velasco2, Ana Maria Aransay6,
Arkaitz Carracedo7
1
CIC bioGUNE, Derio, ES, 2Biochemistry and Molecular Biology
Department, School of Biology, Complutense University, Madrid,
Pósters
ES, 3Department of Cancer Biology, Dana-Farber Cancer Institute,
Harvard Medical School, Boston, MA, US, 4Surgery, Memorial
Sloan-Kettering Cancer Center, New York, US, 5Department of
Morphology, Surgery and Experimental Medicine Section of General
Pathology, University of Ferrara, Ferrara, IT, 6CIC bioGUNE, Centro
de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas
y Digestivas (Ciberehd), Derio, ES, 7CIC bioGUNE, Ikerbasque,
Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology
Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Derio, ES
Prostate cancer (PCa) is the third most common tumor found and the
third leading cause of cancer death in men in Europe. The main driver of
PCa is the PI3K pathway, which regulates cell proliferation, survival and
importantly, metabolism. The availability of a mouse model that is faithful
to the human disease is an invaluable tool for the study of this type of
cancer. While much is known about the signaling requirements of PCa, the
metabolic needs of this tumor remain vastly obscure.
We have previously demonstrated that in order to meet their energetic
demands, cancer cells reprogram their metabolism through alterations in
the transcriptional landscape.
We have approached the study of cancer metabolism starting from a
systematic analysis of transcriptional regulators that potentially contribute
to the metabolic switch. To define these factors, we have applied meta-
analysis constrains that ensure the selection of relevant candidates,
approach that has been shown to be valid to identify novel metabolic cues.
We have focused on metabolic transcriptional regulators that i) are altered
in a significant proportion of publicly available databases, and ii) that show
association with disease-free survival and metastatic disease.
This approach allowed us to unveil the tumor suppressive potential of
the transcriptional co-activator PGC1A. Comparative analysis of PGC1A
expression in melanoma, where it has been shown to be up-regulated, has
led us to define the appropriate expression level for gene re-expression in
prostate cancer. PGC1A re-expression leads to a tumor-suppressive reverse
Warburg effect in vitro and in vivo, reflected as an increase in mitochondrial
oxidative metabolism and decrease in lactate production as a consequence
of the transcriptional regulation. Our data suggest that PGC1A is at the
top of prostate cancer metabolic reprogramming and that this event is of
importance for the development of metabolic therapeutic strategies.
P17-8
La osteopontina provoca cambios en el
metabolismo lipídico y biliar en hígado de ratón
Maitane Núñez, Beatriz Gómez-Santos, Olatz Fresnedo, Patricia
Aspichueta
University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES
La osteopontina (OPN) participa en numerosos procesos fisiológicos y
patológicos. Diferentes estudios han relacionado el aumento de OPN con
la aparición de hepatocarcinoma pero se desconoce si este aumento juega
algún papel importante en el metabolismo hepático y en la reprogramación
metabólica, característica de este tipo de enfermedades. El objetivo
principal de este trabajo fue estudiar si el aumento de OPN provoca cambios
en el metabolismo lipídico y biliar en ratón. Para ello, se administró OPN
recombinante (rOPN) vía intravenosa en dos días alternos. Se determinaron
parámetros corporales, niveles de lípidos y expresión de genes relevantes.
Los resultados muestran que la administración de rOPN provoca un
aumento de la masa hepática sin cambios de la corporal. Estos cambios están
asociados a una remodelación lipídica, con un aumento en el contenido en
colesterol libre (CL) y sin modificaciones en el colesterol esterificado (CE),
diglicérido (DG) y triglicérido (TG). Paralelamente ocurre un descenso
en la expresión de genes implicados en la síntesis de CE, el transporte
de CL y en el metabolismo de lipoproteínas. La administración de rOPN
induce cambios en el metabolismo de glicerofosfolípidos, aumentando el
contenido hepático de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE) y
disminuyendo la expresión de genes relacionados con las vías de síntesis
de PC. Estas modificaciónes del metabolismo de CL y PC pueden estar
directamente relacionadas con un descenso en la expresión de genes
151
Pósters
implicados en el transporte de sales biliares y en la regulación de la
síntesis de ácidos biliares. En conclusión, la exposición a OPN produce
una remodelación del metabolismo lipídico y biliar en el hígado de ratón.
Subvencionado por GV (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20).
P17-9
Adaptation of T lymphocyte effector function to
metabolic stress
Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López-Rodríguez, José Aramburu
Beltrán
Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat
Pompeu Fabra, Barcelona, ES
In the last years it has been reported that nutrients and metabolism play
essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T lymphocytes
exhibit specific metabolic features depending on their activation and
polarization stage, being this crucial for their role in adaptive immune
responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and polarization
towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it is both a main
fuel for ATP production and a source of building blocks for macromolecule
biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial variations in glucose
concentration at inflammation sites and tumors, which raises the question of
how glucose fluctuations affect their capacity to maintain ATP and appropriate
responses to cytokines. We have explored the response of T lymphocytes to
glucose deprivation during cytokine-driven polarization. Our results show
that T lymphocytes can resist substantial glucose restriction and maintain
ATP levels by arresting their proliferation. Results indicate that expression
of different cytokines is differentially sensitive to glucose deprivation, and
we are currently analyzing the contribution of various energy-regulatory
pathways to cytokine expression. Our results suggest that local nutrient
conditions during T lymphocyte activation can have a significant impact in
their function over polarizing pressure from cytokines.
Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF2012-36535
to CL-R; SAF2011-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730,
122530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR601,
2014 SGR1153). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-2013-
062670.
P17m-10
Alterations of cellular metabolism of podocytes in
a lipotoxic context
Adriana Izquierdo Lahuerta1, Cristina Martínez-García1, T-K Yeo2, Yurena
Vivas1, Patricia Corrales1, Sheldon Chen2, Gema Medina-Gómez1
1
Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES, 2Division of Nephrology/
Hypertension, Northwestern University, Chicago, US
In last decades there has been a rapid change in life style that has
led to an alarming increase in the prevalence of obesity and obesity-
associated complications. Obese patients are at increased risk of
developing hypertension, heart disease, insulin resistance, dyslipidemia,
type 2 diabetes and renal disease. The excess of calories are stored as
triglycerides in adipose tissue, and also accumulate ectopically in other
organs, including kidney, which contributes to the damage through a toxic
process named lipotoxicity. Recently, evidences suggest that renal lipidic
accumulation leads to glomerular damage and more specifically, whether
this accumulation produces podocyte dysfunction. The aim of this study
was to analyze the mechanisms underlying the process of lipotoxicity in
podocytes, key cells in glomerular filtration barrier maintenance. We have
used conditional immortalized cultured mouse podocytes treated with
different doses (100, 500 and 750 μM) of palmitic acid (PA) and oleic acid
(OA), for 24h. PA treatment produced an intracellular accumulation of lipid
droplets and abnormal glucose and lipid metabolism. Such accumulation
led to an inflammation associated to an increased phosphorylation at Ser
152
XXXVII Congreso SEBBM
307 of the IRS-1. Also, a lack of response to Akt phosphorylation via
mTOR in the presence of insulin was observed. Furthermore, this fatty
acid produced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress as well as
rearrangements of the actin cytoskeleton. These effects were not observed
with treatment OA. It suggests that saturated fatty acids promote insulin
resistance and disturb the podocyte metabolism, playing an important role
in the renal dysfunction in the context of lipotoxicity.
Acknowledgements: Fundación de la SEEN, MINECO (BFU2012- 33594),
CAM (S2010/BMD-2423) y Ayudas a la Movilidad 2012 URJC.
P17r-11
Mitochondrial ATP governs neuronal response to
NMDA, and is maintained by calcium activation
of ATP-Mg/Pi carrier, SCaMC-3
Carlos Rueda, Javier Traba, Ignacio Amigo, Irene Llorente-Folch,
Beatriz Pardo, Araceli del Arco, Jorgina Satrustegui
Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular
Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-CSIC-
UAM, Universidad Autónoma de Madrid - Centro de Investigación
Biomédica en Red de Enfermedades Raras–CIBERER - Instituto de
Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz-IIS-FJD, Madrid, ES
Glutamate excitotoxicity is caused by sustained activation of neuronal
NMDA receptors causing elevations in cytosolic Ca2+ and Na+, activation
of PARP-1, fall in cytosolic NAD+ and ATP, and delayed Ca2+deregulation
(DCD) followed by neuronal death. Mitochondria undergo early changes in
membrane potential during excitotoxicity but their relation with these events
is still controversial. SCaMC-3/Slc25a23 is a mitochondrial ATP-Mg/Pi
carrier which transports ATP or ADP in a strictly Ca2+-dependent way and
is a candidate to play a role in the initial mitochondrial response to NMDA.
We have studied the early responses to NMDA in cortical neurons including
a rapid increase in oxygen consumption rate (OCR) which was found to be
due to Ca2+-dependent upregulation of respiration. NMDA exposure resulted
in a rapid fall in mitochondrial ATP ([ATP]mit) in SCaMC-3 KO neurons, but
not in control neurons, in which Ca2+-dependent adenine nucleotide uptake
through the carrier maintained [ATP]mit. The fall in [ATP]mit in the KO neurons
was associated with a blunted increase in respiration and a further decrease
in cytosolic ATP levels, indicating that maintenance of [ATP]mit was required
to upregulate OXPHOS upon NMDA exposure. The rapid fall in [ATP]
mit
and blunted respiratory response were prevented by PARP-1 inhibitors,
indicating a rapid NMDA-induced PARP-1 activation as cause. A second
consequence of the lack of SCaMC-3 was an early appearance of DCD. This
was associated with reduced Ca2+ retention capacity (CRC) and increased Ca2+-
dependent swelling in mitochondria from SCaMC-3 KO mice incubated with
physiological millimolar concentrations of ADP or Mg-ATP, suggesting that
failure to maintain matrix AdN is responsible for both the impaired CRC in
mitochondria and earlier neuronal DCD. SCaMC-3 KO neurons were more
vulnerable to glutamate excitotoxicity in vitro and SCaMC-3 KO mice were
more susceptible to kainate-induced seizures, showing that SCaMC-3 is an
early player in excitotoxic cascade both in vitro and in vivo.
P17r-12
G protein-coupled receptor kinase 2 regulates:
The development of non-alcoholic fatty liver disease
M Cruces Sande1, R Vila Bedmar1, E Lucas1, HL Willemen2,
CJ Heijnen3, A Kavelaars3, Á González-Rodríguez4, ÁM Valverde4,
F Mayor Jr1, C Murga1
1
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC,
Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación
Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2Laboratory of Neuroimmunology
and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical
Center Utrecht, Utrecht, NL, 3Department of Symptom Research,
Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson
Granada 2014
Cancer Center, Houston, Texas, US, 4Centro de Investigación
Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas
Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Barcelona - Instituto de
Investigaciones Biomédicas `Alberto Sols´ CSIC-UAM, Madrid, ES
Background: Insulin resistance (IR) and obesity are major health problems
and important risk factors for the development of non-alcoholic fatty liver
disease (NAFLD), a disease spectrum that includes hepatic steatosis,
non-alcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis, and cirrhosis. G protein-
coupled receptor kinase 2 (GRK2), first identified as a G protein-coupled
receptor regulator, has been recently described to play a relevant role in
IR and obesity in vivo. GRK2 hemizygous (GRK2+/-) mice are protected
against high fat diet (HFD)-induced systemic and hepatic insulin resistance
and obesity. However, the effect of GRK2 in the development of HFD-
induced NAFLD has not been studied.
Materials and methods: Given the lack of a potent and specific GRK2
inhibitor, we used a global tamoxifen (Tx)-inducible murine model
in which GRK2 levels are decreased once HFD-induced IR has been
established. Also, a long term chronic state of IR and obesity was triggered
by feeding wild type (WT) and GRK2+/- mice a 32 week-long HFD. To
discriminate the effects of the differential body weight gain, we fed mice
with a methionine-choline deficient diet (MCD), which induces NAFLD
independently of fat mass accretion.
Results: Systemic insulin sensitivity was preserved after decreasing GRK2
levels in the middle of a high fat feeding using tamoxifen, and accordingly
enhanced insulin signaling was observed in the liver of HFD-fed Tx-induced
GRK2-/- mice. Moreover, hepatic steatosis, a hallmark of NAFLD, was
decreased in these mice. Also, different signs of inflammation present in WT
mice were absent in Tx-induced GRK2-/- animals. Nevertheless, after a long
term HFD we found no differences in steatosis between WT and GRK2+/-
mice, despite the decrease in body weight gain and liver weight. Finally, we
found an increase in GRK2 protein levels in the liver of mice fed a MCD,
a well established model of NASH, similar to what is detected during HFD
feeding in WT animals, and we are further characterizing this model.
Conclusion: Taken together, these results suggest a role for GRK2 in the
establishment and development of NAFLD.
P17r-13
Obesity related cardiac hypertrophy is modulated
by G protein-coupled receptor kinase 2
Elisa Lucas1, María Jurado_Pueyo1, Rocío Vila-Bedmar1, Juan J.
Lazcano2, Javier Gómez-Ambrosi3, Gema Frühbeck3, Javier Díez4,
Cristina Murga1, Federico Mayor Jr.1
1
Departamento de Biología Molecular y Centro de Biología Molecular
Severo Ochoa (UAM-CSIC) - Instituto de Investigación Sanitaria
La Princesa, Madrid, ES, 2Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares (CNIC), Madrid, ES, 3Metabolic Research
Laboratory, Universidad de Navarra, CIBERobn, Pamplona, ES,
4
Division of Cardiovascular Sciences, Centre for Applied Medical
Research (CIMA) and Department of Cardiology and Cardiovascular
Surgery, University Clinic, University of Navarra, Pamplona, ES
The heart is a constitutive energy-demanding organ. Although
mitochondrial lipid oxidation is the principal energy source in the healthy
heart, the maintenance of glucose utilization is necessary for normal
cardiac function. Nevertheless, alterations in cardiac energy metabolism
downstream neurohormonal stimulation play a crucial role in the
pathogenesis of heart failure (HF). One biomarker molecule upregulated
in human and several animal models of HF is G protein-coupled receptor
kinase 2 (GRK2), a kinase originally discovered to regulate G protein-
coupled receptor desensitization. Previous studies have described the
potential role of GRK2 as a direct modulator of insulin signaling in
several tissues in addition to its classical role in cardiac βAR signaling
regulation which can also have an indirect effect on insulin signaling.
Since we have observed that GRK2 levels are increased in the hearts
of high fat diet (HFD)-fed animals and also in ob/ob mice, we aimed
to explore the effect of lowering GRK2 levels during HFD feeding in
Pósters
order to study whether GRK2 could be a good target to ameliorate the
detrimental consequences of HFD in the heart. Given the lack of selective
GRK2 pharmacological inhibitors, we have used GRK2 hemizygous
mice (GRK2+/-) as a model to assess the effects of a sustained systemic
inhibition of GRK2 on cardiac tissue. We find that, after 12 weeks of
HFD, insulin-dependent cardiac responses are impaired in young
wild type (WT) while preserved in GRK2+/- mice. Besides, adult 10
month-old WT mice fed a HFD for 32 weeks presented cardiomyocyte
hypertrophy and pathological cardiomegaly, while in HFD-fed GRK2+/-
animals heart size was indistinguishable from that of chow-fed mice.
In addition, we detected that cardiac tissue of GRK2+/- adult mice fed
with standard diet shows enhanced cardiac insulin sensitivity compared
with aged-matched WT hearts, and displays features of non-pathological
mild cardiac hypertrophy. These results highlight the importance of
maintaining GRK2 levels under a certain physiological level to preserve
insulin-mediated cardioprotection.
P17-14
Increased expression of carnitine
palmitoyltransferase 1A in rat ventromedial
hypothalamus produces hyperphagia, overweight
and alters the hyphothalamic lipidomic profile
Joan Francesc Mir1, Paula Mera1, Gemma Fabrias2, Fina Casas2, Sofia
Costa2, Minéia Weber1, Raquel Fucho1, María Calderón-Domínguez1,
Harald Petri3, Núria Casals4, Laura Herrero1, Dolors Serra1
1
Department of Biochemistry, Facultat de Farmàcia, Universitat de
Barcelona, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona
(IBUB) and CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición
(CIBEROBN), Instituto Carlos III, Barcelona, ES, 2Department
of Biomedicinal Chemistry, Institute of Advanced Chemistry of
Catalonia (IQAC)/CSIC, Barcelona, ES, 3UniQure, Amsterdam, NL,
4
Universitat Internacional de Catalunya, Sant Cugat del Vallés, ES
Lipid metabolism in hypothalamic neurons is a key pathway in food intake
modulation and glucose homeostasis. Carnitine palmitoyltransferase
(CPT) 1A is the rate-limiting enzyme in mitochondrial fatty acid oxidation
and it has recently been proposed as a crucial mediator of fasting and
ghrelin orexigenic signaling. However, the relationship between changes in
CPT1A activity and the intracellular downstream effectors that contribute
to appetite modulation in hypothalamus is not fully understood.
The aim of our study is to analyze the peripheral and central effect of
an increased CPT1A expression in the ventromedial nucleus of the
hypothalamus (VMH).
We used adeno-associated virus (AAV) to express a permanently active
form of CPT1A (malonyl-CoA-insensitive CPT1A, here CPT1AM) in rat
VMH. We have observed that permanent activation of CPT1A in VMH led
to hyperphagia, overweight, hyperglycemia and the development of insulin
resistance. These effects seem to be triggered by changes in the expression
of neurotransmitter transporters and hypothalamic changes in structural
and bioactive complex lipids such as ceramides and phospholipids.These
data highlight the role of ventromedial CPT1A in the modulation of food
intake and consequently glucose homeostasis.
P17-15
Modulación de la composición lipídica
de cuerpos lipídicos en hígado de ratón. Efecto
de una dieta rica en grasa
Hiart Navarro Imaz, Ibone Labiano Ciriza, Yuri Rueda Estévez, Lino
Arisqueta Herranz, Olatz Fresnedo Aranguren
Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal
Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES
Los cuerpos lipídicos (CL) citoplasmáticos son estructuras especializadas
en el almacenaje y movilización de lípidos que se acumulan en una
153
Pósters
amplia diversidad de situaciones fisiológicas y patológicas. La dieta y los
condicionantes metabólicos afectan a los niveles hepáticos de CL. Se han
realizado diversos estudios proteómicos con la finalidad de establecer en
qué modo se regula la composición de este orgánulo pero se desconocen
las adaptaciones cuantitativas en el lipidoma. En este estudio describimos
cómo afecta una dieta rica en grasa a la composición de los CL hepáticos
en ratones salvajes y deficientes en leptina (ob/ob), que presentan esteatosis
hepática por hiperfagia. Es destacable la similitud en la composición lipídica
(triglicéridos, diglicéridos, colesterol libre y esterificado, fosfatidilcolina
y fosfatidiletanolamina) entre las dos cepas analizadas alimentadas con
una dieta control. La característica más remarcable de los CL aislados
de hígado de animales tratados con dieta rica en grasa es la disminución
en el contenido de colesterol esterificado (CE). Esta disminución es
muy marcada en los ratones ob/ob y va acompañada de modificaciones
relevantes en los parámetros bioquímicos plasmáticos e índice hepático. El
conjunto de resultados indica que la mejora de la función hepática de los
ratones obesos alimentados con la dieta rica en grasa podría estar vinculada
a una mejora en la gestión del colesterol acumulado en los CL hepáticos.
El incremento en el transporte reverso de colesterol podría jugar un papel
central en esta adaptación.
Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20).
P17m-16 (R17-7)
Alteraciones en la vía tumoral Wnt/β-catenina
en linfocitos circulantes inducidas por
metabolitos relacionados con la diabetes
Valle Montalvo-Romeral1, María Gutiérrez-Salmerón1, Ana Chocarro-
Calvo2, José Manuel García-Martínez1, Antonio De La Vieja3,
Custodia García-Jiménez1
1
Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2Ludwig Institute for
Cancer Research - University of Oxford, Oxford, UK, 3Instituto de
Salud Carlos III, Majadahonda (Madrid), ES
Introducción: La población diabética presenta un riesgo incrementado de
desarrollar ciertos cánceres tejido-específicos. Los cánceres asociados a
diabetes suelen presentar alteraciones en la vía Wnt/β-catenina. Nuestro
grupo ha demostrado que la acumulación nuclear de β-catenina, efector de la
señalización tumoral por Wnt, sólo se produce en presencia de alta glucosa
(hiperglucemia). Hipotetizamos que otros metabolitos característicos
de la diabetes pueden inducir alteraciones en proteínas relacionadas con
la vía Wnt/β-catenina cooperando con la alta glucosa para favorecer la
aparición del fenotipo tumoral. Los linfocitos circulantes expresan los
componentes de la vía Wnt y en pacientes diabéticos están expuestos a
dichos metabolitos, por tanto planteamos la posibilidad de encontrar en
ellos, marcadores tempranos de riesgo de cáncer asociado a diabetes.
Objetivo: Identificar alteraciones moleculares en la vía Wnt/β-catenina en
linfocitos circulantes humanos producidas por el ambiente metabólico de
la diabetes.
Metodología: Se usan linfocitos humanos procedentes de voluntarios
sanos y la línea tumoral inmortalizada de linfocitos Jurkat. Se compara la
respuesta de los linfocitos sanos y los tumorales a estímulos metabólicos
característicos de la diabetes. Los resultados se analizan por western-blot,
qPCR y citometría.
Resultados: Se observan cambios en los componentes de la señalización
tumoral Wnt/ β-catenina a nivel de expresión génica (p300), niveles
proteícos (β-catenina) y funcionalidad (exhibición de receptor LRP6)
en linfocitos humanos sanos que difieren de la respuesta observada en
linfocitos tumorales (Jurkat).
Conclusiones: Es posible detectar cambios a distintos niveles de la vía
Wnt/β-catenina en linfocitos humanos expuestos al ambiente metabólico
de la diabetes. Nuestros resultados sugieren la posibilidad de usar linfocitos
circulantes de pacientes diabéticos para la detección precoz de marcadores
predictivos de tumores asociados a diabetes.
154
XXXVII Congreso SEBBM
P17-17
Activación de blancos metabólicos río abajo
de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK)
hepática por la hormona tiroídea (T3)
Luis Videla Cabrera1, Romina Vargas Villagrán1, Pamela Cornejo
Zamorano2, Virginia Fernández Arancibia1
1
Facultad de Medicina Universidad de Chile, Santiago, CL, 2Faculad
de Medicina Universidad Diego Portales, Santiago, CL
La administración de T3 activa a la AMPK hepática como respuesta
adaptativa frente a condiciones de alta demanda energética. El hígado
de ratas macho Sprague-Dawley tratadas con 0,1 mg T3/kg presentó un
aumento (P<0,05) en los niveles de pAMPK (ELISA) y de sus blancos
acetil-CoA carboxilasa (pACC) y proteína de unión al elemento de
respuesta a AMP-cíclico (pCREB) (Western blot), con mayor expresión
de los ARNm de ACC, CREB y del receptor activado por proliferadores
peroxisomales-γ coactivador-1α (PGC-1α)(qPCR). Conjuntamente,
T3 aumentó (P<0,05) la expresión proteica y de ARNm de la carnitina
palmitoil transferasa-1α (CPT-1α), acil-CoA oxidasa 1 (ACOX1) y acil-
CoA tioesterasa 2 (ACOT2) hepáticas, con mayores niveles séricos de
β-hidroxibutirato. Se concluye que la fosforilación de AMPK hepática por
T3 se asocia a la mayor activación de sus blancos directos ACC, CREB y
PGC-1α conduciendo a un incremento en la capacidad de oxidación de
ácidos grasos, asociado al aumento en las enzimas relacionadas CPT-1α,
ACOX1 y ACOT2, y evidenciado por la respuesta cetogénica consecuente.
La activación de la AMPK constituiría un mecanismo de señalización
clave para la regulación de la dinámica energética hepática en apoyo de
los mecanismos de preacondicionamiento, protección y/o reparación
otorgados por T3.
Financiado por FONDECYT 1120034.
P17r-18
Mathematical modelling of the amyloidogenic
pathway during Alzheimer’s disease in the
context of the lipid membrane
Guido Rosales Santos1, Mario Díaz2, Néstor V. Torres1
1
Grupo de Biología de Sistemas y Modelización Matemática.
Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y
Genética. Universidad de La Laguna, La Laguna, ES, 2Laboratorio
de Fisiología y Biofísica de Membranas, Departamento de Biología
Animal y Edafología y Geología, La Laguna, ES
Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia. There is
over 30 million people affected worldwide, and this number is increasing
every year. There is not therapy for AD. It is caused by the neuronal death
produced mainly by the toxic effect of amyloid-β peptides accumulation,
after the precursor protein (APP) is cleaved by a specific beta secretase
(BACE). APP and BACE proteins are located in the cellular membrane
of neurons. Specifically, both APP and BACE reside within detergent
resistant domains called lipid rafts. It is known that alterations in the lipid
composition of lipid rafts play an important role in the disease, being this
issue a very important aspect for finding a cure to AD.
Systemic approach to the study of AD let us to quantify the importance
of each component of the causal pathway to produce amyloid-β and its
relationship with the lipid composition of the membrane. The objective
of this work is to use mathematical modeling to understand the role of the
membrane composition on AD and try to find an effective therapy for this
disease.
This work was funded by research Grants from Spanish MINECO
(BIO2011-29233-C02-02 and SAF2010-22114-C02-0) and from Agencia
Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información (Ref.
Project PIL2070901 and PIL2071001). GS is recipient of a fellowship from
Fundación Cajacanarias para posgraduados.
Granada 2014
P17r-19 (R17-1)
Adaptation of T lymphocyte effector function
to metabolic stress
Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López Rodríguez, José Aramburu
Beltrán
Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud,
Universidad Pompeu Fabra, Barcelona, ES
In the last years it has been reported that nutrients and metabolism
play essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T
lymphocytes exhibit specific metabolic features depending on their
activation and polarization stage, being this crucial for their role in adaptive
immune responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and
polarization towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it
is both a main fuel for ATP production and a source of building blocks
for macromolecule biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial
variations in glucose concentration at inflammation sites and tumors, which
raises the question of how glucose fluctuations affect their capacity to
maintain ATP and appropriate responses to cytokines. We have explored the
response of T lymphocytes to glucose deprivation during cytokine-driven
polarization. Our results show that T lymphocytes can resist substantial
glucose restriction and maintain ATP levels by arresting their proliferation.
Results indicate that expression of different cytokines is differentially
sensitive to glucose deprivation, and we are currently analyzing the
contribution of various energy-regulatory pathways to cytokine expression.
Our results suggest that local nutrient conditions during T lymphocyte
activation can have a significant impact in their function over polarizing
pressure from cytokines.
Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF2012-36535
to CL-R; SAF2011-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730,
122530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR601,
2014 SGR1153). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-2013-
062670.
P17-20
Implicación de FAT/CD36 en la modulación
del metabolismo lipídico hepático
Larraitz Fernández-Ares, Daniela Mestre, Juan Luis García-
Rodríguez, Igor Aurrekoetxea, Xabier Buqué, Patricia Aspichueta
Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Bilbao, ES
CD36 es una glicoproteína que en la enfermedad del hígado graso no
alcohólica se sobreexpresa en la membrana plasmática del hepatocito
donde juega un papel clave en la entrada de AG, siendo su destino
metabólico desconocido. El objetivo fue investigar la implicación de
CD36 en la modulación del metabolismo lipídico hepático e investigar
el mecanismo.
Se infectaron hepatocitos de ratón C57/6J con adenovirus sentido para
CD36 y LacZ. Se analizó la incorporación de sustratos radiactivos en
los principales lípidos hepáticos, y en los metabolitos solubles ácidos
secretados. Se investigó la expresión de proteínas implicadas en estrés
de retículo endoplásmico, actividad mTORC1 y se analizó su relación
con el proceso de autofagia en presencia de inhibidores de la función
lisosomal.
La sobreexpresión de CD36 aumentó la incorporación de oleato en
triglicéridos y en los metabolitos solubles ácidos secretados y de acetato
en fosfolípidos. Además, provocó el incremento en p-S6 y la inhibición del
flujo de autofagia, compatible con el incremento en la actividad mTORC1.
La inhibición de la función lisosomal disminuyó los niveles de p-S6 y
revirtió la secreción de solubles ácidos y la esterificación lipídica.
Como conclusión, la sobreexpresión de CD36 en el hepatocito induce una
remodelación metabólica ligada a la activación de mTORC1. El incremento
en la síntesis de novo de fosfolípidos y esterificación de triglicéridos sugiere
una mayor actividad de fosfolipasas lo que podría inducir mTORC1.
Pósters
P17-21
Regulation of hypoxia response by NO
in pluripotent stem cells
Estefanía Caballano Infantes1, Ana B. Hitos2, Irene Díaz2, Gladys M.
Cahuana2, Abdelkrim Hmadcha3, Fran Martín4, Bernat Soria5, Juan
R. Tejedo4, Francisco J. Bedoya4
1
Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa
(CABIMER) y Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 2CABIMER,
Universidad Pablo de Olavide, y Centro de Investigación Biomédica
en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas
(CIBERDEM), Sevilla, ES, 3CABIMER, Fundación Progreso y
Salud, y Red de Terapia Celular (Tercel), Sevilla, ES,4CABIMER,
Universidad Pablo de Olavide; Red de Terapia Celular (Tercel), y
CIBERDEM, Sevilla, ES, 5CABIMER, Fundación Progreso y Salud;
Red de Terapia Celular (Tercel), y CIBERDEM, Sevilla, ES
The expansion of pluripotent cells (ESCs and iPSCs) under conditions that
maintain their pluripotency is necessary to implement a cell therapy program.
Previously, we have described that low nitric oxide donor diethylenetriamine/
nitric oxide adduct (DETA-NO) added to the culture medium, promote the
expansion of these cell types. The mechanisms involved in this response
are not yet known. We present evidences that when ESC and iPSCs are
grown under normoxia in presence of Nitric Oxide (NO) triggers a similar
response to hypoxia, thus maintaining the pluripotency. We have studied
the stability of protein HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor) in presence of
low NO. Because of the close relationship between hypoxia, metabolism,
mitochondrial function and pluripotency we have analyzed by qRT-PCR
the expression of genes involved in glucose metabolism and the glycolytic
pathway such as: HK2, LDHA and PDK1; besides other gene targets of
HIF. We further analyzed the expression of genes involved in mitochondrial
biogenesis such as PGC1α, TFAM and NRF1 and we have observed that
low NO maintains the same expression that in hypoxia. The study of the
mitochondrial membrane potential using MitoTracker dye, showed a
slight decrease in the membrane potential in cells with NO in normoxia ,
this indicated that NO might decrease the mitochondrial function. We will
analyze other metabolic parameters, to determinate if this molecule regulates
mitochondrial function and mimics Hypoxia Response. The knowledge of
the role of NO in the Response to Hypoxia and the mechanisms that help
to maintain self renewal in pluripotent cells grown under normoxia, can
help to the design of culture media where NO could be optimal for stem cell
expansion in the performance of future cell therapies.
Subvencionado por:
- Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de
Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-900000)
- Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011)
P17-22
Papel de los factores de transcripción E2F1
y E2F2 en la esteatosis hepática
Daniela Mestre Congregado1, Igor Aurrekoetxea1, Larraitz
Fernández-Ares1, Xabier Buqué1, Ainhoa Iglesias2, Ana Zubiaga2,
Patricia Aspichueta1
1
Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina y Odontología,
Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES, 2Departamento de
Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, Facultad de Ciencia
y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES
La enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA) se desarrolla en
un 80% de pacientes obesos, lo que se considera un factor de riesgo para el
desarrollo de carcinoma hepatocelular (CHC). En el desarrollo de EHGNA
y de CHC se producen importantes adaptaciones metabólicas. E2F1,
regulador del metabolismo oxidativo y cuya ausencia confiere resistencia
a obesidad, es junto con otros factores de transcripción E2F importante
regulador del ciclo celular. El objetivo fue definir el papel de los factores de
transcripción E2F1 y E2F2 en la instauración de hepatoesteatosis.
155
Pósters
Se utilizaron ratones macho de 3 meses E2F1-/-, E2F2-/- y sus controles.
Se indujo esteatosis administrando una dieta rica en grasa (HFD) durante
10 semanas. Se analizó la secreción hepática de triglicéridos (TG), el
contenido hepático en TG y su modulación en condiciones pro-esteatóticas
como la inhibición de la secreción de VLDL y el ayuno de 24 horas.
La HFD indujo esteatosis en ratones control. En ratones E2F2-/- el contenido
hepático en TG era el 40% del de los ratones control y permaneció invariable
tras la administración de la HFD. Sin embargo, el almacén de TG inducido
por el ayuno de 24 horas era superior en los ratones E2F2-/- que en los E2F1-
/-
y sus controles. En animales E2F1-/-, la HFD provocó el incremento de TG,
aunque no llegó a los valores de sus controles, lo que es atribuible al aumento
en la secreción de TG como lo demuestra su inhibición farmacológica.
En conclusión, los factores de transcripción E2F1 y E2F2 están implicados
en la instauración de la hepatoesteatosis por HFD. E2F1 ejerce un efecto
sobre la secreción hepática de TG y E2F2 podría estar implicado en los
procesos de síntesis de novo de lípidos.
Gobierno Vasco IT-336-10.
P17-23
Papel de la osteopontina en la modulación del
metabolismo hepático durante el envejecimiento
Beatriz Gómez-Santos, Maitane Núñez-García, Olatz Fresnedo,
Patricia Aspichueta
Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal
Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES
El envejecimiento está caracterizado por una pérdida progresiva de
la integridad fisiológica. La osteopontina (OPN) es una glicoproteína
multifuncional que muestra expresión incrementada en patologías derivadas
del síndrome metabólico y en varios tipos de cáncer, siendo la prevalencia de
estas patologías mayor con la edad. Nuestro objetivo fue determinar si OPN
modula el metabolismo lipídico hepático durante el envejecimiento y definir el
mecanismo implicado. Se emplearon ratones deficientes en OPN (OPN-KO) y
sus controles, de 3 y 10 meses de edad. Se estudió el contenido lipídico hepático
y actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de triglicéridos y
colesterol. Se analizaron parámetros séricos y rutas de señalización ligadas
a procesos de síntesis y oxidación de lípidos. Los resultados mostraron que
en animales control los niveles séricos de OPN aumentaban con la edad. La
deficiencia en OPN durante el envejecimiento resultó en un aumento del
índice hepático, del contenido hepático en colesterol esterificado y triglicérido
así como en glicerofosfolípidos. Los cambios en las actividades enzimáticas
analizadas no parecían ser causantes del incremento lipídico observado en
los ratones OPN-KO de mayor edad, en los que la actividad mTORC1 estaba
disminuida. Se observó mayor expresión proteica de la acetil-CoA carboxilasa
y menor porcentaje de su forma fosforilada compatible con su mayor actividad.
Como conclusión, OPN modula el metabolismo lipídico hepático durante el
envejecimiento. Su falta resulta en el incremento del almacén lipídico, debido,
al menos en parte, al incremento de la síntesis de novo.
Subvencionado por GV (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20).
P17-24
Dimorfismo sexual en el efecto de la rosiglitazona
sobre la lipotoxicidad del músculo cardíaco
asociada a una dieta hiperlipídica
Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá-Thorbrügge, Bel M. Galmés-
Pascual, Francisco J. García-Palmer, Isabel Lladó, Ana M. Proenza,
Magdalena Gianotti
Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental
i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears.
IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica
en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn,
CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
156
XXXVII Congreso SEBBM
La ingesta de dietas hiperlipídicas (HL) provoca una hiperlipidemia que
conlleva una mayor captación de ácidos grasos por parte del músculo
cardíaco. La situación de lipotoxicidad que se genera se acompaña de
resistencia a la insulina, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y
disminución de la utilización de glucosa, que puede conducir a una pérdida
de la capacidad contráctil y, por ende, a un fallo cardíaco. La rosiglitazona
(Rsg) es una tiazolidinediona que aumenta la sensibilidad a la insulina y
disminuye la lipotoxicidad periférica, a través de la mejora de la función
mitocondrial. En estudios previos hemos demostrado la existencia de un
dimorfismo sexual en la función y biogénesis mitocondriales, lo cual nos
lleva a plantearnos si existen diferencias entre sexos en el efecto de la Rsg
sobre la lipotoxicidad cardíaca asociada a la administración de una dieta
HL durante 15 semanas en ratas. La Rsg (100mg/kg dieta) se administró a
la mitad de los animales durante las dos últimas semanas del tratamiento.
En respuesta a la Rsg, las hembras responden de manera más acusada
a la disminución de triglicéridos en el miocardio provocada por la HL,
lo que se acompaña de una mayor activación de la vía de señalización a
la insulina y el consiguiente incremento en la utilización de la glucosa.
Paralelamente, las ratas hembra tratadas con Rsg muestran un mayor
metabolismo mitocondrial y un menor estrés oxidativo en el miocardio.
En conclusión, la Rsg promueve una mayor movilización lipídica en el
músculo cardíaco de las hembras, mejorando del fenotipo lipotóxico típico
que es característico de la cardiomiopatía diabética.
Financiado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB
(PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una
manera de hacer Europa”.
P17r-25 (R17-3)
Protein Kinase A-dependent phosphorylation
of the ATPase Inhibitory Factor 1 (IF1)
determines the metabolic status of the cell
Javier García-Bermúdez1, María Sánchez-Aragó2, José M. Cuezva2
1
Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2Centro de Biología
Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES
Mitochondria play key roles in cellular metabolism and bioenergetics
and are the master regulators in the execution of cell-death mediating
intracellular signaling by calcium and reactive oxygen species (ROS).
During the last years, the interest in mitochondria has experienced
a boost because of its involvement in a growing number of human
diseases displaying very different phenotypes. In mitochondria, the H+-
ATP synthase is the rotatory engine of the inner membrane that utilizes
the proton gradient generated by respiration for the synthesis of most
cellular ATP in normal aerobic differentiated cells. The expression level
of the nuclear encoded inhibitor peptide called ATPase Inhibitory Factor
1 (IF1) regulates the synthase activity of the H+-ATP synthase, being a
central player in controlling the flux of ATP being produced by oxidative
phosphorylation (OXPHOS). IF1 is a very short half-life protein that
is highly overexpressed in most prevalent human carcinomas. The
overexpression of IF1 in cancer promotes an increase in the flux of aerobic
glycolysis and a ROS-mediated signal that results in retrograde signaling to
the nucleus to activate programs of cell survival. However, the mechanisms
that regulate the expression and activity of IF1 remain elusive. Herein,
we demonstrate in human cancer cell lines that IF1 is regulated by post-
translational mechanisms. We show that the phosphorylation of IF1 on a
serine residue by cyclic AMP-dependent protein kinase A (PKA) prevents
its binding to the H+-ATPsynthase complex. Moreover, de-phosphorylated
IF1 is strongly bound to the complex and exerts an enhanced inhibition on
its enzymatic activity.
Supported by SAF2013-41945-R.
Granada 2014
P17-26
Dimorfismo sexual en la respuesta de la
paraoxonasa a la suplementación de una dieta
hiperlipídica con rosiglitazona
Bel M. Galmés-Pascual, Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert-
Roig, Magdalena Gianotti, Ana M. Proenza, Francisco J. García-
Palmer, Isabel Lladó
Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental
i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears.
IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica
en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn,
CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
La ingesta de dietas hipercalóricas induce inflamación y estrés oxidativo
y aumenta el riesgo cardiovascular. Estudios previos han puesto de
manifiesto que las ratas hembra presentan un menor daño oxidativo tisular
como resultado de una mayor capacidad antioxidante y funcionalidad
mitocondrial. El enzima paraoxonasa 1 (PON1) es el principal responsable
de la función antiaterogénica de las HDL, viéndose alterada su actividad
por la dieta. La rosiglitazona (Rsg), un fármaco que mejora el perfil de
sensibilidad insulínica, estimula la función mitocondrial y reduce el estado
de inflamación.
El objetivo fue determinar las diferencias entre sexos en la respuesta a
la Rsg de marcadores de estrés oxidativo y, en particular, de la actividad
y los niveles séricos de la PON1. Para ello se utilizaron ratas macho y
hembra Wistar de 22 semanas, alimentadas durante 16 semanas con una
dieta hiperlipídica (22,5% de materia grasa). Durante las últimas dos
semanas de tratamiento, la mitad de los animales recibieron la misma dieta
suplementada con Rsg (100mg/kg dieta).
La Rsg mejoró el perfil de sensibilidad a la insulina, aumentó la capacidad
antioxidante total y disminuyó la peroxidación lipídica sérica de manera
más acusada en las ratas macho que en las hembras. La suplementación
de la dieta hiperlipídica con Rsg aumentó la expresión hepática de PON1
en las ratas macho, mientras que en las hembras produjo un aumento de la
actividad del enzima. Estos resultados ponen de manifiesto un dimorfismo
sexual en los efectos de la Rsg a nivel de protección antioxidante que
podrían condicionar el riesgo cardiovascular en función del sexo.
Estudio financiado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB
(PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una
manera de hacer Europa”.
P17-27 (R17-4)
Dimorfismo sexual en la función y biogénesis
mitocondrial del tejido adiposo retroperitoneal en
respuesta a la suplementación con rosiglitazona
en ratas alimentadas con dieta hiperlipídica
Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert-Roig, Bel M.
Galmés-Pascual, Magdalena Gianotti, Francisco J. García-Palmer,
Isabel Lladó, Ana M. Proenza
Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia
Fonamental i Ciències de la Salut, IUNICS, Universitat de les
Illes Balears. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación
Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición
(CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma
de Mallorca, ES
La población mitocondrial del tejido adiposo blanco retroperitoneal (TABr)
de ratas hembra es menos diferenciada y más abundante que la de los
machos. Este dimorfismo sexual se atenúa en respuesta a la alimentación
con una dieta hiperlipídica (HL).
El objetivo de este estudio fue determinar si la rosiglitazona (Rsg), un
fármaco agonista del PPARγ que mejora la capacidad oxidativa y aumenta
el contenido mitocondrial en los adipocitos, ejerce efectos dependientes
del sexo en el TABr.
Pósters
Se utilizaron ratas Wistar de ambos sexos alimentadas durante 16 semanas
con dieta HL que, a dos semanas del sacrificio y para la mitad de los
animales, se suplementó con Rsg (100mg/kg dieta). En muestras de TABr
se determinaron parámetros marcadores de función, biogénesis, dinámica
y capacidad oxidativa mitocondriales, así como mecanismos antioxidantes.
La suplementación con Rsg provocó un aumento de la masa y la dinámica
mitocondriales en ambos sexos, aunque mucho más acentuado en los
machos. Sin embargo, la capacidad oxidativa únicamente se incrementó
en las hembras. La respuesta antioxidante, en cambio, se estimuló en igual
medida en ambos sexos.
En conclusión, el TABr parece responder de manera diferencial según
el sexo a los efectos inductores de la biogénesis de la Rsg, aumentando
la proliferación mitocondrial en las ratas macho y la diferenciación
mitocondrial en las hembras. Esta respuesta heterogénea podría deberse
a la acción de las hormonas sexuales, de acuerdo con resultados previos
obtenidos in vitro que muestran un efecto opuesto del estradiol y de la
testosterona sobre la biogénesis mitocondrial.
Estudio financiado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB
(PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una
manera de hacer Europa”.
P17-28
La suplementación de una dieta hipercalórica
con rosiglitazona mejora la sensibilidad hepática
a la insulina en las ratas macho pero no en las
hembras
Bel M. Galmés-Pascual, Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá-
Thorbrügge, Ana M. Proenza, Magdalena Gianotti, Isabel Lladó,
Francisco J. García-Palmer
Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental
i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears,
IdISPa - Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de
la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de
Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES
La ingesta de dietas hipercalóricas conduce a resistencia a la insulina y a
acumulación de grasa en el hígado. La rosiglitazona (Rsg) es un agonista de
PPARγ que mejora la sensibilidad a la insulina de forma directa en el tejido
adiposo blanco y, gracias a la secreción de adiponectina por los adipocitos,
en el músculo y en el hígado.
El objetivo fue determinar el efecto de la suplementación con Rsg
de una dieta hipercalórica sobre la sensibilidad hepática a la insulina y
a la adiponectina en ratas macho y hembra. Se utilizaron ratas Wistar
alimentadas durante 16 semanas con una dieta hiperlipídica rica en
sacarosa (HLS, 22,5% materia grasa). Durante las dos últimas semanas
de tratamiento, la mitad de los animales se alimentaron con la misma
dieta HLS suplementada con Rsg (100mg/kg). Se recogieron el suero, los
depósitos grasos y el hígado. En el hígado se determinó la actividad de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y se analizó la vía de señalización de la
insulina mediante la activación de Akt, y la de la adiponectina a través de
AdipoR2 y la activación de AMPk. En el suero se determinaron los niveles
de adiponectina.
En comparación con las ratas hembra, la adiposidad y los niveles de
triacilglicéridos hepáticos fueron más elevados en los machos HLS y
disminuyeron de forma más acusada por efecto de la Rsg. Además, en
las ratas macho, la Rsg mejoró la tolerancia a la glucosa aumentando
los niveles séricos de adiponectina y los hepáticos de AdipoR2 e
incrementando la activación de Akt. La disminución de la actividad
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa indica una menor producción hepática
de glucosa. Por el contrario, en las ratas hembra los efectos de la dieta HLS
y de la suplementación con Rsg fueron más moderados.
En conclusión, la mayor acumulación ectópica de grasa en el hígado de
los machos por la alimentación con la dieta HLS altera su sensibilidad a
157
Pósters
la insulina de forma más acusada que en las hembras, alteraciones que se
revierten, al menos en parte, por la Rsg.
Estudio financiado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB
(PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una
manera de hacer Europa”.
P17-29 (R17-2)
Mitochondrial glutamate transporter (Aralar):
influence over myelin formation and dopamine
metabolism
Beatriz Pardo1, Irene Llorente-Folch1, Sara Laine-Menéndez1,
Carlos B. Rueda1, Paloma González-Sánchez1, Inés Juaristi1, Paula
Martínez-Valero1, Araceli del Arco2, Jorgina Satrústegui1
1
Dept. de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo
Ochoa UAM-CSIC, CIBER de Enfermedades Raras, Universidad
Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2Área de Bioquímica, Centro
Regional de Investigación Biomédica (CRIB), Facultad de Ciencias
Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla - La Mancha,
Toledo, ES
The mitochondrial transporter of aspartate-glutamate Aralar/AGC1 is a
regulatory component of the malate-aspartate shuttle, mainly expressed
in neurons. Aralar-deficiency in mouse and human causes a shutdown
of brain shuttle activity and global cerebral hypomyelination (OMIM
ID # 612949) associated with a drastic drop in brain aspartate and
N-acetylaspartate (NAA) levels. Aralar-knockout (Aralar-KO) mice
show deficits in motor coordination, ataxia, hyperactivity, anxiety-like
behaviour and hyperreactivity (a phenotype very similar to what is
observed in the human patients). In Aralar-KO mice, the striatum is the
brain region most affected in terms of size, amino acid and monoamine
content. We find a fall in DA and in vesicular monoamine transporter-2
(VMAT2) levels which causes an increase both in non-vesicular dopamine
and dopamine turnover (DOPAC/dopamine ratio) through MAO activity.
Our results suggest that Aralar-deficiency results in a failure to produce
mitochondrial NADH and to an increase of ROS in the cytosol causing
a fall in VMAT2 and GSH/GSSH ratio in striatum. Aralar-hemizygous
(Aralar-HT) mice, with half-a-dose of Aralar and decreased NAA, have
also a heightened DOPAC/DA ratio with oxidative stress via MAO and
increased sensitivity to amphetamine; as well as a delayed postnatal
myelination.
NAA is one of the most concentrated metabolites in human and mice brain,
but the physiological functions served by NAA remain controversial.
NAA is proposed to be involved in providing acetyl CoA needed for
oligodendrocyte maturation and postnatal myelin synthesis, neuronal
osmoregulation and energy metabolism. These data make further the point
about the putative relevance of NAA in higher brain functions and control
of behavior.The correlation between reduced NAA, hypomyelination
and DA dysfuntion is relevant because its involvement in neurological
and psychiatric human diseases and needs to be further investigated and
discussed.
P17-30
Detección temprana del daño oxidativo
en pacientes hipercolesterolémicos: efectos
del tratamiento con estatinas
Lidia López López, Sandra Tavárez Alonso, Ana Martín Vega, Eulalia
Alonso Iglesias
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de
Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES
Numerosas evidencias clínicas y experimentales indican que las
alteraciones en el balance oxidativo están implicadas en la instauración
y progresión de las patologías de RCV como la hipercolesterolemia, y
158
XXXVII Congreso SEBBM
que parte de los efectos pleiotrópicos de las estatinas en esta patología
se relacionan con sus beneficios sobre el estrés oxidativo. Entre los
marcadores más recientemente introducidos de peroxidación lipídica
se encuentran los 8-isoprostanos, compuestos estables resultantes de
la oxidación del ácido araquidónico por radicales libres. Evaluando
los niveles de 8-isoprostanos (ELISA) en plasma y orina de individuos
control, hipercolesterolémicos e hipercolesterolémicos tratados
con estatinas en este trabajo demostramos, tanto que los niveles de
8-isoprostanos pueden ser un marcador temprano de oxidación en
humanos hipercolesterolémicos, como que el tratamiento con estatinas
se asocia a prevención del daño oxidativo. Los niveles de 8-isoprostanos
se elevan significativamente en plasma del grupo hipercolesterolémico
(52,08±4,01 vs 39,06±3,17 pg/mL; p=0,016), normalizándose
prácticamente por el tratamiento con estatinas (52,08±4,01 vs
41,34±2,5 pg/mL; p=0,04). Los resultados en orina corroboran estas
observaciones, sin alcanzar las diferencias significación estadística.
De las estatinas evaluadas, la atorvastatina es la que muestra un mejor
perfil en la normalización de los niveles de 8-isoprostanos, así como en
la reducción del colesterol total. De la comparación de estos resultados
con los de otros indicadores de daño oxidativo a lípidos y proteínas,
proponemos considerar a los 8-isoprostanos como el indicador más
temprano de daño oxidativo en la detección y posterior evaluación del
tratamiento con estatinas.
Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063.
P17-31
Integrando el papel de la resistina en un modelo
de riesgo cardiovascular: estudio en ratones ob/ob
Ana Martín Vega1, Sandra Tavárez Alonso1, Lidia López López1, Pilar
Codoñer Franch2, Eulalia Alonso Iglesias1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de
Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES, 2Departamento de
Pediatría , Facultad de Medicina, Universidad de Valencia; Servicio
de Pediatría, HU Dr Peset, Valencia, ES
La obesidad es uno de los factores principales de RCV. De origen
multifactorial, la acumulación excesiva de grasa en el tejido adiposo
promueve la liberación por este órgano endocrino de moléculas
inflamatorias y adipoquinas implicadas, por diferentes vías, en las
alteraciones metabólicas de la obesidad y en su asociación con el RCV.
Para evaluar el papel de la adipoquina resistina en este contexto, hemos
cuantificado sus niveles circulantes (Multiplex) y su relación con el estado
metabólico (perfil lipídico y resistencia insulínica), el daño oxidativo
(8-isoprostanos), la inflamación (IL-6) y el metabolismo de la arginina
(óxido nítrico (NO) y poliaminas) en ratones ob/ob, un modelo genético
de RCV. Los resultados sobre los niveles de resistina en este modelo de
obesidad son contradictorios. Según nuestros resultados, los niveles de
resistina en ratones ob/ob son significativamente más altos que en los
controles lean (3269±297 vs 1352±74 pg/mL; p<0,0001), y se correlacionan
positivamente con aumentos significativos del índice HOMA (p=0,002),
colesterol (p=0,018), TGs (p=0,015), IL-6 (p<0,0001), 8-isoprostanos
(p=0,003), espermina (p=0,005) y peso de los paquetes grasos (p<0,0001).
Los niveles de resistina también se correlacionan, aunque de forma
inversa, con el descenso en la producción de NO (p=0,003) y el cociente
espermidina/espermina (p<0,0001). Estos resultados apoyan el papel de la
resistina en la RI en este modelo de obesidad, así como los mecanismos
propuestos para su actuación que incluirían activación de la respuesta
inflamatoria, del estrés oxidativo y descenso en la producción de NO. Los
posibles efectos de la resistina sobre el metabolismo de las poliaminas
merecen ser analizados.
Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063.
Granada 2014
P18. Señalización celular
P18-1 (R18-3)
Glutaminolisis y mTOR: interacción entre el
metabolismo y la señalización celular en cáncer
Raúl V. Durán
Group of Metabolism and Cell Signaling, Institut Européen de
Chimie et Biologie VINCO Unit, U916 INSERM, Bordeaux, FR
Tradicionalmente se ha contemplado la transformación metabólica de
las células cancerígenas como un fenómeno secundario encaminado a
abastecer a la célula de la energía necesaria para permitir una rápida
proliferación. Sin embargo, en los últimos años esta visión ha cambiado
con el descubrimiento de que los genes que codifican para determinados
enzimas metabólicos pueden ser considerados como oncogenes o genes
supresores de tumor. De esta manera, la transformación metabólica puede
localizarse en el origen del cáncer. Esta conclusión lleva a la pregunta
de cómo consiguen los cambios metabólicos celulares alterar las rutas
de señalización para permitir el crecimiento descontrolado de la célula
tumoral. En este sentido, nuestra investigación se centra en el estudio de
los mecanismos por los que los nutrientes, en especial los aminoácidos,
activan la vía de señalización mTOR (mammalian target of rapamycin), un
regulador principal del crecimiento celular. Nuestros resultados muestran
que la glutamina, un aminoácido crucial para la bioenergética de las células
cancerígenas, activa la ruta mTORC1 (mTOR complex 1) por medio de
su propia degradación a través de la glutaminolisis. La glutaminolisis es
la doble desaminación de la glutamina para producir α-cetoglutarato. El
α-cetoglutarato intracelular activa a la familia de proteínas PHD (prolyl
hydroxylases), necesarias para la activación de mTORC1. Por lo tanto,
la ruta glutamina/PHD/mTORC1 constituye una cascada de señalización
principal en la respuesta celular a la disponibilidad de nutrientes. Tanto
la glutaminolisis como la ruta mTORC1 aparecen activados en una gran
variedad de tumores. De esta manera, nuestros resultados suponen un claro
ejemplo de cómo el metabolismo alterado de la célula tumoral afecta a
procesos de señalización celular, fundamentales para el crecimiento rápido
del tumor. La existencia de una relación mecanística entre glutaminolisis
y mTORC1 abre las puertas a futuras investigaciones para determinar si
ambos procesos tienen un efecto sinergístico como dianas terapéuticas
contra el cáncer.
P18r-2
Non-invasive spatio-temporal activation of
engineered receptor tyrosine kinases with light
Álvaro Inglés Prieto1, Eva Reichhart1, Karin Schelch2, Robert
Riedler1, Michael Grusch2, Harald Janovjak1
1
Institute of Science and Technology Austria, Viena, AT, 2Institute of
Cancer Research, Department of Medicine I, Comprehensive Cancer
Center Vienna, Medical University of Vienna, Viena, AT
Receptor tyrosine kinases (RTKs) are a large family of cell surface
receptors that sense growth factors and hormones and regulate a variety
of cell behaviours in health and disease. Contactless activation of RTKs
with spatial and temporal precision is currently not feasible. Here, we
generated RTKs that are insensitive to endogenous ligands but can be
selectively activated by low intensity blue light. We screened light-
oxygen-voltage (LOV)-sensing domains for their ability to activate
RTKs by light-activated dimerization. Incorporation of LOV domains
found in aureochrome photoreceptors of stramenopiles resulted in robust
activation of the fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1), epidermal
growth factor receptor (EGFR) and RET receptor. In human cancer and
endothelial cells, light induced cellular signalling with spatial and temporal
precision. Furthermore, light faithfully mimicked complex mitogenic
and morphogenic cell behaviour induced by growth factors. RTKs under
optical control (Opto-RTKs) provide a powerful optogenetic approach to
actuate cellular signals and manipulate cell behaviour.
Pósters
P18-3
Critical role of p38MAPK in the alternative
activation of macrophages
Sonsoles Hortelano Blanco, Lidia Jimenez, Sandra Herranz, Alfonso
Luque
Unidad de Terapias Farmacológicas. Instituto de Investigación
de Enfermedades Raras (IIER), Instituto de Salud Carlos III,
Majadahonda, ES
Alternative activation of macrophages plays an important role in a range
of physiological and pathological processes, including inflammation,
wound repair and tissue remodeling as well as parasite clearance and tumor
progression. This alternative phenotype, also known as M2 macrophages, is
induced by type 2 cytokines such as IL-4. The binding of IL-4 to its receptor
leads to activation of two major signaling pathways: STAT-6 and PI3K.
However, recent studies have described that p38MAPK might play a role in
IL-4-dependent signaling in some types of cells. Since IL-4 is one of the most
relevant cytokines involved in the alternative activation of macrophages,
we investigated whether p38MAPK plays a role in the polarization of
macrophages. Our results reveal that IL-4 induces phosphorylation of
p38MAPK in peritoneal macrophages, in addition to STAT-6 and PI3K
activation. Furthermore, p38MAPK inactivation, by gene silencing or
pharmacological inhibition, suppressed IL-4-induced typical M2 markers,
indicating the involvement of p38MAPK in the signaling of IL-4 leading
to M2-macrophage polarization. Moreover, p38MAPK inhibition blocked
phosphorylation of STAT-6 and Akt, suggesting that p38MAPK is upstream
of these signaling pathways. Taken together, our results establish a new role
for p38MAPK during IL-4-induced alternative activation of macrophages.
P18r-4
Insights into novel DDR functions of GRK2 and
repercussions on cell cycle arrest
Adolfo Javier Molejón García, Verónica Rivas Guerrero, Federico
Mayor Menéndez, Petronila Penela Márquez
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM),
Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación
Sanitaria La princesa, Madrid, ES
DNA Damage Response (DDR) is a complicated and conserved signalling
mechanism utilised by cells to repair errors in DNA in order to avoid genomic
lesions that may arise from non-pathological origins (DNA replication,
oxidative metabolism) or genotoxic insults (radiation, genotoxins). As such,
DDR mechanisms exist as an anti-tumourigenic generated from a variety
of genomic lesions from point mutations to chromosomal aberrations.
Furthermore, defects in DDR signalling are associated to a variety of
tumourigenic predispositions such as loss of p53, BRCA or ATM. In order to
efficiently orchestrate a DDR response, cells require sensors (MRN, 53BP1),
signal transducers (ATM/ATR, Chk1/Chk2, p53) and ultimately effectors
(p21, Puma, Noxa). Depending on the type of signal in a genomically intact
cell, the outcome will be either DNA repair and re-entry into cell cycle, or cell
cycle arrest via senescence or apoptosis. GRK2, a GPCR Receptor Kinase, has
emerging functions outside of its traditional role of phosphorylating GPCR
receptors for desensitisation and subsequent internalisation for degradation
or receptor recycling. We have recently uncovered that GRK2 is degraded
by default during G2/M transition, which allows cell cycle progression.
However, upon G2-checkpoint activation GRK2 is stabilized and cell cycle
is arrested. In this cellular context, GRK2 helps cells to cope with damage
by attenuating the p53 response and the expression of pro-apoptotic factors.
We have unveiled evidence of GRK2 further modulating the DDR cascade
upstream of p53 in response to acute and chronic genotoxic insults. As such,
we suggest a complex intertwinement of GRK2 with ATM wherein GRK2
could be a target of ATM based on structural features and in vitro and in situ
phosphorylation assays, while downstream functionality of ATM would be
attenuated by GRK2 in a kinase dependent manner. Furthermore, we note an
inverse correlation between GRK2 protein levels and degree of senescence
in cellular models and physiological settings. In this light, we propose GRK2
159
Pósters
as a potential therapeutic target owing to novel modulatory functions as well
as putative substrate in DDR response.
P18-5
Función de β2-quimerina como supresor de
tumores en cáncer de mama Her2+
Victoria Casado Medrano1, María José Caloca Roldán2
1
Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2CSIC
(IBGM), Valladolid, ES
Las quimerinas son una familia de proteínas GAP (GTPase activating
proteins) que esta formada por cuatro miembros: α1-, α2-, β1-, y β2-
quimerinas. Estas proteínas tienen una estructura característica con un
dominio C1 que une DAG y ésteres de forbol, un dominio GAP que inactiva
selectivamente a la GTPasa Rac, y un dominio SH2 N-terminal, solo
presente en las isoformas α2- y β2 de las quimerinas. Estas características
hacen únicas a las quimerinas dentro de las Rho-GAP y las situa como
reguladores clave que conectan la señalización por DAG con la activación
de Rac. La hiperactivación de GTPasas de la familia Rho, incluida Rac,
es común en cáncer, por lo que a las proteínas inactivadoras de estas
GTPasas se las atribuye un posible papel como supresores de tumores. Para
comprobar este papel de β2-quimerina en cáncer de mama, hemos generado
un modelo de ratón en el que hemos eliminado la expresión de esta proteína
en ratones MMTV-ErbB2/Neu, que desarrollan cáncer de mama por la
sobreexpresión del protooncogén ErB2/Her2/Neu en el epitelio mamario.
Hemos evaluado el efecto de la deficiencia de β2-quimerina sobre el tiempo
de latencia, la multiplicidad tumoral, la velocidad de crecimiento de los
tumores, el número de lesiones preneoplásicas y la metástasis pulmonar.
Nuestros resultados demuestran que la eliminación de β2-quimerina
reduce significativamente la latencia en la aparición de tumores de mama
y aumenta el número de lesiones preneoplásicas. Sin embargo, no hemos
observado diferencias estadísticamente significativas en la multiplicidad o
el crecimiento de los tumores en ausencia de β2-quimerina. Para estudiar
los mecanismos moleculares regulados por β2-quimerina implicados en
la transformación maligna hemos estudiado los niveles de Rac activado
y las principales vías de señalización reguladas por el receptor ErbB/Neu
(activación de Akt y ERK). En conjunto nuestros resultados indican que β2-
quimerina regula los pasos iniciales del desarrollo de los tumores de mama
mediados por activación del receptor ErbB2 a través de un mecanismo que
implica la activación de la GTPasa Rac.
P18-6 (R18-4)
ERK5 binds and regulates the androgen receptor
in prostate cancer cells: molecular and functional
characterization
Tatiana Erazo Andrade, Pau Muñoz Guardiola, José Ramón
Bayascas, Néstor Gómez, José Miguel Lizcano
Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de
Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina,
Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona), ES
Prostate cancer is the second commonest cause of cancer related death in
men in the western world. Usually, prostate cancer is initially androgen-
dependent so patients are usually treated with androgen deprivation
therapy. However, after remission the tumor frequently progresses into
a state of castration resistance, and available treatment options are only
palliative in most cases.
The MAP kinase ERK5 is activated in response to a wide range of growth
factors and cellular stresses and controls cell proliferation and progression
through the cell cycle, and the ERK5 pathway is associated with poor
prognosis of prostate cancer.
Here we show that ERK5 interacts with the AR protein in the cytosol
of resting cells, and that activation of AR with androgens induces the
translocation of both proteins to the nucleus, where they continue to interact
160
XXXVII Congreso SEBBM
with each other. Conversely, specific activation of ERK5 by the upstream
kinase MEK5 also induces the nuclear translocation of both ERK5 and
AR. We also provide evidences showing a functional link between these
proteins. Over-expression of active ERK5 enhances the ligand-dependent
trancriptional activity of AR (PSA promoter activity, a specific clinical
biomarker for prostate cancer), whereas silencing ERK5 inhibits the AR
transcriptional activation in response to androgens. Finally, we tested in
prostate cancer cells the compound XMD8-92, a newly sinthetized ERK5
speficic inhibitor. XMD8-92 inhibits cell proliferation and induces cell
death in both LnCaP (functional AR) and C4-2 (castrate resistant) cells,
whereas inhibition of the ERK1/2 pathway using MEK1 inhibitors had not
significative effect. In conclusion, we propose ERK5 inhibiton as a new
treatment fort androgen-dependent and castrate-resistant prostate cancers.
P18r-7
ABTL0812, a novel dual mTORC1/2
and dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitor
with a novel mechanism of action
Ingrid Tatiana Erazo Andrade1, José Alfon2, Mariana Gomez-
Ferreria2, María Salazar3, Mar Lorente3, Marc Cortal2, Guillermo
Velasco3, Carles Domenech2, José Miguel Lízcano1
1
Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de
Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina,
Universitat Autònoma de Barcelona , Bellaterra, ES, 2Ability
Pharmaceuticals SL, Edifici Eureka, Campus de la UAB Universitat
Autònoma de Barcelona , Bellaterra, ES, 3Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad
Complutense de Madrid , Madrid, ES
ABTL0812 is a novel multitarget drug with high efficacy by oral route in
mice models of cancer. In vivo ABTL0812 induces the regression of tumor
volume in xenograft models derived from human lung (A549) and human
pancreatic cancer cells (MiaPaca-2), and very recently started a Phase
I First in Human Clinical Trial in patients with advanced solid tumors.
We have shown that ABTL0812 induces the inhibition of two clinically
validated targets: mTORC1 (mTOR complex-1) and dihydrofolate
reductase (DHFR). Despite of this, ABTL0812 does not bind any of these
proteins, thus its precise mechanism of action remains to be described.
Here we show that ABTL0812 blocks the proliferation of lung and pancreatic
cancer cell lines. ABTL0812 induces autophagic cell death, but no apoptosis,
and inhibition of fusion of autophagosomes with lysosomes prevents its
citotoxicity. We also show that ABTL0812 induces the expression of TRB3
(tribbles homologue 3), a known Akt protein inhibitor in both A549 and
MiaPaca-2 human cancer cells. Overexpressed TRB3 interacts with Akt and
prevents Akt phosphorylation (Ser473) by mTORC2. This, in turn, results in
low levels of phosphorylated TSC2 and inhibition of mTORC1 (ribosomal
S6 phosphorylation). Finally, ABTL0812-induced mTORC1 inhibition
would render the loss of expression of the Cyclin D1, of E2F1 transcription
factor (controlled by Cyclin D1) and DHFR (controlled by E2F1).
Since TRB3 is down-regulated in some tumor types, the induction of TRB3
expression by ABTL0812 might account for the anti-tumoral action of
this compound. We proposed TRB3 expression levels as a biomarker to
monitor the antitumor efficacy of ABTL0812 in humans.
P18r-8
Role of the APC/C complex mediated degradation
of GRK2 in mitosis
Clara Reglero, Verónica Rivas, Federico Mayor Jr., Petronila Penela
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM),
Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación
Sanitaria La Princesa, Cantoblanco, ES
Proteasome-dependent degradation of key kinases represents a major
regulatory mechanism in the control of cell cycle. We have recently
Granada 2014
reported that timely degradation of GRK2, a serine/threonine G protein-
coupled receptor kinase, is part of an intrinsic pathway that ensures cell
cycle progression. Besides being a key player in the desensitization of
manifold GPCR receptors, GRK2 emerge as a signaling node due to its
ability to regulate a variety of signaling proteins and cellular functions.
We have previously found that GRK2 protein levels progressively decay
during G2/M as a result of the sequential cooperation of the E3 ligases
Mdm2 and APC/C. Thus, during G2 the functional interaction of Pin1 with
the CDK2/cyclinA-dependent phosphorylated GRK2 triggers its Mdm2-
mediated ubiquitination. At mitosis onset, GRK2 decay is promoted by the
APC/C-Cdc20 complex that recognizes a D-Box in GRK2, in a spindle
checkpoint-independent manner.
It is expected that this tightly regulated degradation of GRK2 will have
significant physiological consequences in mitosis. In this regard, recent
data of our group have unveiled the functional interaction of GRK2 with
regulatory factors involved in cytokinesis. Thus, we have demonstrated
that GRK2 is a key modulator of microtubule dynamics through the
phosphorylation of the tubulin deacetylase HDAC6. In addition, we have
found that GRK2 influences the extent of PI3K activation by a direct
interaction with the regulatory subunit p85, which also acts as a scaffold to
regulate the Rho-family GTPase Cdc42 and Septins at the cleavage furrow.
Our data reveal the presence of GRK2 in the midbody, a structure wherein
HDAC6 and p85 are also found. Dynamic changes in the levels and
functionality of GRK2 might help to timely activate HDAC6 or/and PI3K
in order to orchestrate microtubule dynamics and to recruit/activate factors
involved in organizing the contractile ring and setting the symmetry of the
division plane. Our results suggest that defective or sustained degradation
of GRK2 during mitosis could impair cytokinesis and contribute to
polyploidy and chromosomal instability.
P18-9
PAR-3 participates in Thy-1-induced astrocyte
migration without affecting polarization
Areli Cárdenas, Milene Kong, Alvaro Alvarez, Alejandra Valdivia,
Andrew F.G. Quest, Lisette Leyton
Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Independencia, CL
PAR-3 is an important adaptor protein that participates in polarization
of many cell types by forming a complex with PAR-6/aPKC; however,
PAR-3 is not part of this complex during astrocyte polarization. We have
shown that the neuronal protein Thy-1 induces astrocyte polarization and
migration; however, the signaling mechanisms involved and the role of
PAR-3 in these processes have not been completely elucidated. Here,
we evaluated whether PAR-3 participates in adhesion, polarization and
migration of astrocytes induced by Thy-1. To this end, DITNC1 astrocytes
were transfected with PAR-3-specific siRNA or siRNA control. Then, cells
were seeded and treated with Thy-1-Fc or control TRAIL-R2-Fc. Cell
polarity and focal adhesions were assessed by immunofluorescence staining
of cells with anti-giantin and anti-vinculin, respectively, and analyzed by
confocal microscopy. Cell migration was assessed in wound-healing assays
and the cell-free area was calculated after 24h of Thy-1 stimulation.
The polarization of DITNC1 cells upon Thy-1 stimulation was not affected
by silencing of PAR-3, whereas these cells exhibited longer focal adhesions
than control cells either non-stimulated or stimulated with the negative
control protein (TRAIL-R2-Fc). Accordingly, astrocytes lacking PAR-3
migrated less than the control cells in the presence of Thy-1.
Our results implicate PAR-3 in Thy-1-induced astrocyte migration, but not
polarization. Together, these observations suggest a novel role for PAR-3 in
cell signaling pathways activated by Thy-1 in astrocyte migration.
Acknowledgements: FONDECYT 3140471 (AC), FONDECYT 1110149
(LL), 1130250 (AFGQ); Iniciativas Científicas Milenio BNI P09-015-F
(LL); Anillo ACT1111 (AFGQ).
Pósters
P18-10
The neurosteroid-regulated σ1 receptor engages
NMDA receptor negative control for opioid
analgesia
Pilar Sanchez Blazquez1, Maria Rodriguez-Muñoz1, Manuel Merlos2,
Jose Miguel Vela2, Javier Garzón1
1
Instituto Cajal, CSIC, Madrid, ES, 2Drug Discovery & Preclinical
Development, Esteve. Scientific Park of Barcelona, Barcelona, ES
The antagonists of the sigma 1 receptor (σ1R) are of therapeutic interest
because these drugs reduce neuropathic pain and enhance mu-opioid
receptor (MOR)-mediated analgesia. However, the precise molecular events
implicated in the positive effects of these antagonists remain unknown.
The present study has identified the σ1R within the protein assembly,
supporting MOR-glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor
cross-regulation, in which this receptor couples the negative influence of
NMDARs to restrain opioid signalling in response to MOR activation. The
σ1R is a neurosteroid-regulated receptor that associates with NMDAR NR1
subunits to maintain NMDAR signalling within physiological limits. The
exogenous σ1R ligands likely mimic this physiological regulation through
the use of agonists and antagonists to respectively enhance and reduce the
ability of morphine-activated MORs to recruit NMDAR activity. Thus, the
absence of σ1Rs or σ1R antagonists disconnects both systems, enhancing
morphine analgesia and diminishing the development of tolerance. At
the molecular level, σ1R antagonists through the removal of σ1Rs from
their binding to NR1 subunits promote the entrance of negative regulators
of NMDARs, likely Ca2+-CaM, which impair the negative feedback on
opioid analgesia and reduce the impact of glutamate in neuropathic pain.
Therefore, the negative effects of σ1R antagonists on NMDAR function
alleviate neuropathic pain and also reduce the requirements of opioid
receptor occupancy as a suitable adjuvant of opioid analgesia. (Supported
by MSC, Plan Nacional Drogas 11-014 and MINECO, SAF 2012-034991).
P18-11
Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog
regulates the expression of bone morphogenetic
proteins to maintain germline stem cells
in Drosophila
Patricia Rojas Ríos1, Isabel Guerrero2, Acaimo González Reyes3
1
Institute of Human Genetics (IGH) mRNA Regulation and
Development , Montpellier, FR, 2Centro de Biologia Molecular
Severo Ochoa, CSIC/Universidad Autonoma de Madrid, Madrid,
ES,3Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad
Pablo de Olavide, Sevilla, ES
Stem cells are characterised by their undifferentiated state, their potential
for self-renewal and their capacity to produce one or multiple types of
differentiated cells. These properties sustain homeostasis and repair of adult
tissues and open a high expectative about the use of these cells in regenerative
medicine. Adult stem cells are found in specialised microenvironments
or niches that control their proliferation, self-renewal and differentiation
of the progeny. The niches are composed of different support cells and
signals like morphogens. The Drosophila ovary is an excellent system to
study the molecular mechanisms that operate in stem cell niches because
this organ contains a well-defined niche, the Germline Stem Cell (GSC)
niche. Our data demonstrate that Hedgehog (Hh) signalling pathway is
essential in the niche of the GSCs for their maintenance. The expression of
Hh is regulated by Engrailed in a type of support cells of the GSC niche,
the Cap Cells (CpCs). Hh is secreted from the CpCs and received by the
Escort Cells, another type of niche cell, where the Hh pathway induces
the expression of two essential GSC factors, Dpp and Gbb. Interestingly,
Hh protein decorates short projections emanating from CpCs that remind
to the filopodia described in different tissues of Drosophila larvae called
cytonemes. When the Hh signalling is impaired within the niche, wildtype
CpCs project longer Hh-coated cytonemes suggesting that the niche senses
161
Pósters
and responds to changes in Hh signalling. In addition, we have found that
the perturbation of the formation and/or dynamic of cytonemes in the niche
compromised the GSC self-renewal demonstrating that cytonemes are
essential for the maintenance of stem cells.
P18r-12
Papel de TCFL5 en el desarrollo tumoral
Javier Galán Martínez, Inés Sánchez Gómez, Konstantinos
Stamatakis, Núria Gironès Pujol, Manuel Fresno Escudero
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid,
ES
Las células madre tumorales, también denominadas Cancer Stem Cells
(CSC) son parte de la población heterogénea del tumor siendo las
responsables del mantenimiento de este, de la recurrencia y de la metástasis.
Comprender el papel que desempeñan este tipo de células durante el
desarrollo tumoral se ha convertido recientemente en un importante campo
de estudio para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Una vía
para la obtención de estas CSC es la formación de esferoides multicelulares
tumorales (MCTS), un modelo de cáncer in vitro generado a partir de la
agregación de células en suspensión. Estudios recientes muestran niveles
elevados del factor de transcripción TCFL5 después de la formación
de MCTS por la línea celular de cáncer de colon HT-29. El gen TCFL5
codifica para al menos cuatro isoformas de las cuales, de solo dos, se tienen
referencias a nivel experimental, denominadas TCFL5 y CHA. TCFL5
presenta la secuencia canónica compuesta por 6 exones mientras que CHA
carece del primer exón. Para determinar el papel de estas isoformas en la
formación de MCTS y de CSC in vitro se sobreexpresaron las isoformas
TCFL5 y CHA en diferentes líneas de cáncer de colon y se estudió el
fenotipo tumoral de estas células así como la expresión de marcadores
típicos de CSC. Además, se generaron tumores xenoinjertados a partir de
estas células para determinar el crecimiento tumoral in vivo. Los resultados
obtenidos muestran que, in vitro, las líneas celulares que sobreexpresan
CHA presentan un fenotipo más tumoral y mayor expresión de marcadores
de CSC que las líneas sobreexpresantes de TCFL5 que presentan el fenotipo
opuesto. In vivo, sin embargo, las líneas que sobreexpresan CHA crecieron
más lentamente que las TCFL5.
P18r-13
Regulation of TtgGHI efflux pump by indole
increases antibiotic resistance of Pseudomonas
putida DOT-T1E
Carlos Molina Santiago1, Abdelali Daddaoua1, Juan Luis Ramos2
1
Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Estación
Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2ABENGOA RESEARCH,
Sevilla, ES
In Gram-negative bacteria, multidrug efflux pumps are responsible for
the extrusion of chemicals. Some of these efflux pumps are induced by
endogenously produced effectors, while abiotic or biotic signals induce the
expression of other efflux pumps. In Pseudomonas putida, the TtgABC
efflux pump is the main antibiotic extrusion system and it is modulated
by TtgR regulator. The plasmid-encoded TtgGHI efflux pump in P. putida
DOT-T1E, regulated by TtgV regulator, plays a secondary role in antibiotic
resistance in the parental strain; however, its role is critical in isogenic
backgrounds deficient in TtgABC. TtgV recognizes indole as effector
which is not produced by Pseudomonas species, therefore, the indole-
dependent antibiotic resistance seems to be part of an antibiotic resistance
programme at the community level.
Transcriptomic analyses revealed that the indole specific response involves
the expression of the TtgGHI pump but also a set of genes involved in
iron homeostasis, as well as genes for amino acid catabolism. In a
ttgABC-deficient P. putida, background ampicillin and other bactericidal
compounds lead to cell death. Co-culture assays of E. coli and P. putida
ΔttgABC allowed growth of P. putida mutant in the presence of ampicillin
162
XXXVII Congreso SEBBM
due to the induction of the indole-dependent efflux pump demonstrating that
indole acts as an interspecies signalling molecule in antibiotic resistance.
P18r-14
Crosstalk between HGF and BMP9 signaling
pathways in hepatic progenitor oval cells
Annalisa Addante1, María García-Álvaro1, Nerea Deleyto1, Margarita
Fernández1, César Roncero1, Isabel Fabregat2, Blanca Herrera1,
Aránzazu Sánchez1
1
Instituto de Investigación Sanitaria, Hospital Clínico San Carlos
(IdISSC). Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad
de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid,
ES,2Laboratori d’Oncologia Molecular, Universitat de Barcelona,
Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge, L’Hospitalet de
Llobregat, Madrid, ES
Oval cells constitute a bi-potential progenitor cell population from adult
liver. Under chronic liver disease (CLD), they become activated and start
to proliferate and differentiate into cholangiocytes and/or hepatocytes to
compensate for the cellular loss and maintain liver homeostasis. It is well
recognized the critical role of the TGF-b in CLD, but the role of other
members of the TGF-b superfamily, the BMPs, is only partly understood.
We focused our attention in BMP9, since previous results from our group
and others indicated that BMP9 has a pro-tumorigenic action in HCC cells.
To study BMP9 role in hepatic progenitor cells, we used an in vitro model
of oval cell lines harbouring a genetically inactivated met tyrosine kinase
(Met-/- cells) and its control (Metflx/flx cells) that also allow us to explore a
possible signaling interaction between HGF and BMP9.
Our data show that BMP9 induces canonical and non-canonical signaling
pathways in both Metflx/flx and Met-/- oval cells, although Met appears to
increase BMP9-induced Smad1/5/8 activation. Interestingly, BMP9
decreases oval cell number, effect that is amplified in absence of Met. To
elucidate the underlying mechanisms; we investigated a potential effect of
BMP9 on apoptotic oval cell death. Our results show that BMP9 elicits a
moderate but significant increase in apoptosis, which is more pronounced
in Met-/- cells. Furthermore, HGF is able to prevent BMP9 effects in oval
cells.
All these data suggest that BMP9 is a suppressor (pro-apoptotic) factor
in oval cells and they also evidence a novel functional crosstalk between
Met/HGF and BMP9 signaling pathways in oval cell survival, with a
mechanism that will be discussed.
P18r-15
The Calcineurin splicing isoform CnAβ1
is implicated in early embryonic stem cell
differentiation and reduces pathological cardiac
hypertrophy
Jesús María Gómez-Salinero, María Villalba-Orero, Marina
Mercedes-Olañeta, Paula Ortiz-Sanchez, Enrique Lara-Pezzi
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC),
Madrid, ES
Embryonic stem cells (ESCs) have the ability to proliferate indefinitely
in culture, and to differentiate into all embryonic lineages. Although
the transcriptional program that coordinates pluripotency has been
progressively unveiled during the past few years, the signalling pathways
that regulate early differentiation events are not completely understood.
We have recently described that CnAβ1, an alternative splicing variant of
the phosphatase calcineurin, enhances muscle regeneration and improves
cardiac function after myocardial infarction. CnAβ1 lacks the autoinhibitory
domain typical of calcineurin, and instead has a unique C-terminal domain
with no similarity to any known protein. Unlike other calcineurin isoforms,
CnAβ1 has no impact on NFAT-regulated genes and instead activates the
Akt pathway. Interestingly, we have currently determined that CnAβ1 is
Granada 2014
specifically located at the Golgy contrary to other calcineurin isoforms, and
that this localization is mediated by its unique C-terminal domain. CnAβ1
is strongly expressed in stem and progenitor cells, although its role in these
cells is unknown. We found that CnAβ1 downregulation had no effect on
ESC pluripotency. However, CnAβ1 depletion in mESCs during the first
48 hours of differentiation specifically affected differentiation towards
the cardiac mesoderm lineage promoting hematopoietic differentiation.
In contrast, CnAβ1 overexpression promoted differentiation towards
the cardiac mesoderm lineage. Our results suggest that CnAβ1 regulates
mESC differentiation through the control of the Akt/GSK3 signalling
pathway. Interestingly, CnAβ1 knockout mice show increased cardiac
hypertrophy in response to trans-aortic banding, whereas transgenic
mice overexpressing CnAβ1 have decreased hypertrophy and improved
cardiac function. Together, these results suggest that CnAβ1 is implicated
in early mESCs differentiation, and that it reduces pathological cardiac
hypertrophy.
P18-16
A proteomics strategy reveals novel roles for
the protein kinase DYRK1A within the nucleus
Julia Roewenstrunk1, Chiara Di Vona1, Eva Borras2, Eduard Sabido2,
Susana de la Luna1
1
Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES, 2Proteomics
Unit, Centro de Regulación Genómica-CRG y Universitat Pompeu
Fabra-UPF, Barcelona, ES
The protein kinase DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase)
is an evolutionary conserved kinase highly sensitive to gene dosage
alterations. Reduced levels of DYRK1A in individuals due to gene
truncation or microdeletions cause microcephaly, intrauterine growth
retardation and developmental delay. On the other hand, DYRK1A
overexpression is associated to some neuropathological traits in Down
syndrome. Evidence obtained in different model systems indicates that
DYRK1A regulates brain growth across evolution, by playing a role in
neuron survival and differentiation. These activities have been associated to
DYRK1A-mediated phosphorylation of mostly cytosolic targets. However,
DYRK1A is also localized in the nucleus, but information on functional
roles for nuclear DYRK1A is still pretty scarce. To search for the identity
of physiological targets of nuclear DYRK1A, we have implemented a
quantitative interaction proteomic approach based on DYRK1A affinity
purification from nuclear extracts followed by label-free quantification
mass spectrometry. By using statistical values, we have generated a ranked-
list of putative interactors that includes already known DYRK1A partners
as the scaffold DCAF7 or members of the 14-3-3 family of proteins. To
gain insight into the biological role of nuclear DYRK1A, we have looked
for the enrichment of gene ontology (GO) terms for the proteins found
in the screen. A significant enrichment in GO terms associated with RNA
splicing, transcription and DNA repair was found. We have validated
the interaction of DYRK1A with several of its putative targets by direct
and reverse co-immunoprecipitation experiments. Moreover, we have
generated experimental evidence indicating that some of the DYRK1A
putative interactors are novel DYRK1A substrates. In summary, we have
defined a nuclear DYRK1A interactome that will be a powerful tool for
the characterization of the functional participation of DYRK1A in specific
nuclear processes.
P18-17 (R18-2)
Regulation of satellite cell functions in aging
Eusebio Perdiguero Santamaría
Universidad Pompeu Fabra (UPF), Barcelona, ES
Among the principal properties that distinguish adult mammalian stem
cells from their more differentiated progeny is the capacity of stem cells
to remain in a quiescent state for prolonged periods of time. However, the
molecular pathways for the maintenance of stem-cell quiescence remain
Pósters
largely unknown. Recent studies reported that, in skeletal muscle of old
mice, the muscle fiber expresses grow factors, driving satellite cells to
break quiescence by undergoing proliferation, and this would explain the
previously accepted skeletal muscle regenerative decline with aging. A
deep analysis of muscle stem cell aging has provided us with a novel vision
on why aged muscle stem cells lose their homeostatic quiescent state.
In very old, geriatric mice, satellite cells do not undergo a proliferative
pathway; instead, they switch to a pre-senescence stage. This switch
has dramatic consequences, since it converts the satellite cell reversible
G0 arrest into an irreversible G0 arrest that abrogates cell activation
upon muscle injury, thus precluding efficient regeneration and stem cell
self-renewal in aged mice. We have established that satellite cells from
sarcopenic geriatric, unlike those from non-sarcopenic old mice, enter
into a “point of no-return”, and lose their reversible quiescence state in
homeostatic conditions. We have also found this loss of quiescence in
satellite cells of progeric mice with accelerated aging and in samples from
aged humans.
Mechanistically, we have found that geriatric and progeric satellite cells
express senescence markers like p16INK4a. Indeed, p16INK4a, which is
never expressed in adult or old muscle stem cells in homeostatic conditions,
becomes de-repressed in geriatric and progeric satellite cells, correlating
with loss of reversible quiescence. Genetic silencing of p16INK4a in
geriatric and progeric satellite cells reverses G0 irreversible senescence into
a G0 reversible quiescence, thus allowing stem cell activation and muscle
regeneration in aged mice. Our results further show that in conditions of
muscle injury, in which satellite cells need to proliferate extensively to form
new myofibers, geriatric satellite cells are unable to proliferate and undergo
instead an accelerated entry into a deep senescence state (geroconversion).
We propose that satellite cell geroconversion arises from two opposed
forces: the proliferative pressure of the damaged muscle local environment
and the persistent cell cycle arrest induced by a p16INK4a -regulated Rb/
EF2 anti-proliferative axis on aged satellite cells.
P18r-18
Function of C3G as a regulator of cell migration/
invasion and tumour growth
Celia Sequera1, Neibla Priego1, María Arrechederra1, Ana Vázquez1,
Sara Ortiz-Rivero2, Aránzazu Sánchez1, Carmen Guerrero2,
Almudena Porras1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de
Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES, 2Centro de Investigación del
Cáncer IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES
C3G is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rap1 and R-Ras,
but it also acts through mechanisms not dependent on its GEF activity. It
is essential for embryonic development due to its role in integrin-mediated
adhesion and migration. In addition, C3G inhibits migration of highly
invasive breast carcinoma cells, although the mechanisms involved remain
unknown. The function of C3G in human cancer is controversial acting as
either a tumour suppressor or mediator.
p38 MAPKs regulate different cellular functions, including migration.
p38a MAPK is the most abundant isoform and essential for embryonic
development. p38a plays also a dual role in cancer depending on the tumour
type and stage and it can promote migration and invasion of tumour cells.
We have previously described that C3G through inhibition of p38a MAPK
regulates cell death. We have now analyzed if C3G also regulates migration
and invasion through mechanisms dependent on p38a in non-tumour and
tumour cells. By knocking-down/out C3G and/or p38a, we have found that
C3G inhibits migration and invasion through a mechanism that involves
down-regulation of p38a activity. This was confirmed by using a selective
p38a/b inhibitor. In addition, we have demonstrated that Rap-1 activation is
not required for these C3G actions. MMPs might be important mediators of
C3G/p38 effects on invasion. We are further characterizing the mechanisms
used by C3G and/or p38a to regulate these processes.
We have also found that both C3G and p38a promote tumour growth of
HCT116 cells, as determined by in vitro and in vivo assays.
163
Pósters
P18-19
DUSP10 is a cyclooxygenase 2 activity induced
gene and it regulates colon cancer cell stress
responses
Marta Jiménez Martínez, Konstantinos Stamatakis, Alba Jiménez-
Segovia, Beatriz Barrocal, Manuel Fresno
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES
Colorectal cancer is one of the deadliest types of cancer, due to its high
metastatic capacity and chemoresistance acquisition. Cyclooxygenase 2
(COX-2) elevated expression has been shown to play an important role in
colorectal tumour development and its inhibition can help prevent cancer
death.
We performed gene expression microarray analysis to identify genes
up- or down-regulated by COX-2 overexpression. We identified genes
with altered expression in these conditions, one of them being the Dual
Specificity Phosphatase 10 (DUSP10), specific for JNK and p38 MAPKs.
DUSP10 resulted to be up-regulated by COX-2 activity as well as by PGE2
treatment in a concentration depended manner.
We generated cell lines stably expressing DUSP10 or silencing DUSP10
by infecting with lentivirus the colorectal adenocarcinoma HT29-LucD6
cells. We found that DUSP10 are implicated in cell proliferation and stress
resistance to serum deprivation, osmotic and genotoxic agents and to
confluence arrest. DUSP10 could be regulating the HT29 cell response at
these conditions through the p38 pathway.
These results suggest that DUSP10 expression can confer a growth and
survival advantage in tumor environment to colorectal cancer cells.
P18-20
Identification of PMEPA1 as a cyclooxygenase
2 induced gene and its potential implication in
cancer progression
Alba Jiménez Segovia, Konstantinos Stamatakis, Marta Jiménez,
Beatriz Barrocal, Manuel Fresno
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES
Cyclooxygenase 2 (COX-2) elevated expression has been associated
with tumour development especially in colorectal cancer, and it is known
that its inhibition can prevent cancer. In order to study the mechanisms
that mediate the pro-tumorigenic effects of COX-2 we generated cell
lines stably overexpressing this gene and performed gene expression
microarray analysis to identify genes regulated by this overexpression.
One of the up-regulated genes in the COX-2 overexpressing cells is
PMEPA1, identified as an androgen-induced gene, highly expressed in
several cancers. The encoded product is a transforming growth factor-β
(TGF-β)-induced transmembrane protein overexpressed in breast,
prostate and colorectal cancer. In order to study PMEPA1 effects, we both
overexpressed and silenced, PMEPA1 in human colon adenocarcinoma
(HT29) and human ovarian carcinoma (Skov3) cells, generating stable
cell lines. We studied in vivo and in vitro cell characteristics, noting
significant differences between empty vector (EV) and PMEPA1
overexpressing cells. We observed differences in cell morphology, caused
by a different distribution of the actin cytoskeleton. Those morphological
differences are related to a PMEPA1- induced process of Epithelial
Mesenchymal Transition.
Mouse xenograft experiments, with subcutaneous and intraperitoneal
injection of the mentioned cells in nude mice, showed a differential effect
of PMEPA1 overexpression in the two cell types, HT29 and Skov3,
leading to a final growth delay of HT-29 xenografts, while PMEPA1
overexpressing Skov3 cells had a high initial survival and proliferative
advantage compared with EV cells.
These findings suggest that PMEPA1 may have an important role in cancer
progression.
164
XXXVII Congreso SEBBM
P18r-21 (R18-6)
P2X7 receptor stimulation in neurons mediates
different pathway activation in the presence or
absence of calcium
Bakarne Urzelai1, Francisco Llavero1, José Luis Zugaza2
1
Universidad del País Vasco (UPV/EHU)/Centro Vasco de
Neurociencias Achucarro, Leioa, ES, 2Ikerbasque/Centro Vasco de
Neurociencias Achucarro/Universidad del País Vasco (UPV/EHU),
Leioa, ES
P2X7 belongs to the family of ionotropic ATP-gated receptors, which
function as ion channels mediating calcium influx. P2X7 is one of the
predominant purinergic P2X receptor subtype expressed in neural cells.
It is involved in a variety of processes such as ATP-mediated cell death,
regulation of receptor trafficking, and inflammation. It is largely known
that P2X7 receptor stimulation leads to regulation of the mitogen-activated
protein kinases (MAPK) extracellular regulated kinases (ERK1/ERK2),
c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38. The canonical pathway for the
activation of these MAPKs is mediated by Ras.
Here, we show that P2X7 receptor stimulation triggers not only the MAPK
activation but also the Ras GTPase activation. Besides, we demonstrate that
in the presence of calcium this Ras/MAPK pathway regulation is mediated
by the Ras guanine exchange factor (GEF) RasGRF1. For its activation,
this GEF requires a calcium input from the extracellular medium, which
will intracellularly bind to calmodulin. In this configuration, Ca+2-loaded
calmodulin binds to the RasGRF1 IQ motif and activates it. Surprisingly,
P2X7 also activates Ras in a Ca+2-independent manner. In addition, this
alternative Ras activation leads to the activation of the small GTPase Rap1
and more importantly, triggers neural cell death. Our findings demonstrate
that P2X7 stimulation in neurons activates two different signaling pathways
depending on the presence or absence of extracellular Ca+2, leading to cell
survival versus cell death.
P18-22 (R18-1)
Tetraspanin-enriched microdomains. Translating
signals from the plasma membrane to Rac
GTPase and exosomes
María Yáñez-Mó
Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES
Tetraspanin-enriched microdomains (TEM) have unique biophysical
properties suited for the regulation of cell motility and intercellular adhesion.
In this study we demonstrate that TEM play a role in the compartmentalization
of Rac GTPase at the plasma membrane and into exosomes, providing a
molecular mechanism for the regulation of cell motility by tetraspanins.
We characterized the intracellular TEM interactome by high-throughput
mass-spectrometry, and found a specific interaction of tetraspanin CD81
with the GTPase Rac. This interaction was confirmed biochemically and
microscopy cross-correlation analysisthat demonstrated in situ integration of
both molecules into the same molecular complex. Pull-down experiments
revealed that CD81-Rac interaction was direct and independent of Rac
activation status. Knockdown of CD81 resulted in enhanced protrusion rate,
altered focal adhesion formation and decreased cell migration, correlating
with increased active Rac. Re-expression of wild typeCD81, but not
its truncated form lacking the C-terminal cytoplasmic domain, rescued
these effects. The phenotype of CD81 knockdown cells was mimicked
by treatment with a soluble peptide with the C-terminal sequence of the
tetraspanin. TEM-driven compartmentalization was also relevant for protein
sorting into exosomes. Quantitative proteomics showed that TEM ligands
account for a great proportion of the exosome proteome and that a selective
repertoire of CD81-associated molecules, including Rac, is not correctly
routed to exosomes in cells from CD81-deficient animals. Therefore TEM-
dependent compartmentalization is revealed as a new regulatory mechanism
of Rac activity. Moreover, our data provide firm evidence that insertion into
TEMs is critical for protein inclusion into the exosome structure.
Granada 2014
P18r-23
GRK2 modulates cell proliferation and invasive
migration of the highly metastatic MDA-MB-231
breast cancer cells
Laura Nogués1, Philippe Chavrier2, Federico Mayor Jr.1, Petronila
Penela3
1
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid,
ES, 2Membrane and cytoskeleton dynamics department, Institut
Curie, Paris, FR, 3Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa,
Madrid, ES
Breast cancer progression and outcome are conditioned by the acquisition
of two key abilities by tumour cells: the growth and survival capability that
trigger resistance to therapy and the invasion into host tissues resulting
in metastatic dissemination. Although both processes are usually studied
separately, the underlying mechanisms seem to be governed by the same
signalling nodes, including growth factor and chemokine receptors, p53
mutations and components of the Ras/ MAPKs/ PI3K axis. In addition, other
cancer-associated factors can cooperate with these oncogenic-signalling
routes to strength tumoural properties. In this sense, the serine/threonine
kinase GRK2 is emerging as a key signalling node tightly connected to
these cascades, given its participation in relevant biological processes such
as cell cycle, proliferation or migration. Moreover, our recent findings
show a novel interaction of GRK2 with the histone deacetylase HDAC6,
which has also been associated with malignant transformation and invasive
motility in breast cancer. All these evidences strongly suggest a relevant
contribution of GRK2 in breast cancer tumorigenesis. We report herein that
GRK2 subcellular distribution is altered in transformed breast cancer cells.
Moreover, GRK2 modulates in vitro and in vivo proliferation of the triple
negative MDA-MB-231 cells, in a HDAC6- phosphorylation dependent
manner, and protects from SAHA (an HDAC6 inhibitor)-induced cell
death. Furthermore, GRK2 also potentiates MDA-MB-231 cell migration
towards different oncogenic stimuli, whereas GRK2 down-regulation
results in suppression of both cell migration and invasion in 2D and 3D
models. Finally, GRK2 is required for two-dimensional matrix proteolysis,
suggesting a relevant role of GRK2 in the formation of protrusive structures
termed invadopodia. Overall, these results point GRK2 as a possible
contributor towards cell malignancy and as a potential drug target.
P18r-24
K-Ras modula la respuesta fibrótica inducida
por TGF-β1 mediante mecanismos independientes
de la vía de Smad
Cristina Cuesta Apausa1, José Manuel Muñoz Féliz1, Nuria Perretta
Tejedor1, Carlos Martínez Salgado2, Isabel Fuentes Calvo1
1
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto
“Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de
Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto
de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca, ES,
2
Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina
Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y
Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Estudios
de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL, Unidad de
Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES
La fibrosis es uno de los estadios finales de muchas enfermedades crónicas.
Se caracteriza por la presencia de miofibroblastos y por una deposición
excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC). El factor de
crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) es una citoquina muy importante
en la regulación de los procesos fibróticos. Señaliza a través de las proteínas
Smad2 y Smad3 gracias a la activación de su receptor tipo I. Además puede
activar otras vías de señalización, como la vía de Ras. Hay 3 isoformas de
las proteínas Ras: H-, N- y K-Ras.
Nuestro objetivo es determinar si K-Ras regula la expresión de proteínas de
MEC inducida por TGF-β1 y a través de que ruta de señalización intracelular.
Pósters
Para ello hemos generado una línea de fibroblastos embrionarios knock-out
de K-Ras (KO). La expresión proteica se ha analizado por western blot.
Las expresiones basales de fosfo-Smad2 y fosfo-Smad3 son similares en
fibroblastos KO de K-Ras y WT; sin embargo la expresión de fosfo-Erk1/2
es menor en fibroblastos K-Ras-/-, mientras que la expresión de fosfo-Akt
es mayor en estas células. TGF-β1 aumenta la expresión de Ras-GTP y la
fosforilación de Erk1/2 sólo en fibroblastos WT, e induce una fosforilación
similar de Smad2 y Smad3 en fibroblastos WT y K-Ras-/-. Además, TGF-β1
estimula la expresión de fibronectina, colágeno tipo I y colágeno total sólo
en fibroblastos WT. En ausencia de K-Ras la inhibición de la vía de Erk1/2
no reduce la expresión de fibronectina y colágeno tipo I. Sin embargo, la
inhibición de la vía PI3K/Akt disminuye la síntesis de colágeno tipo I y de
fibronectina en fibroblastos WT y KO.
Estos datos sugieren que la isoforma K-Ras regula negativamente la
expresión basal de proteínas de MEC (a través de la vía de PI3K/Akt),
regula positivamente la activación de la vía de Erk1/2, y es necesaria para
la activación de Erk1/2 en respuesta a TGF-β1, pero no para la activación
de la Smad2 y 3. Además, K-Ras es necesaria para el incremento en la
expresión de proteínas de la MEC inducido por TGF-β1, fundamentalmente
a través de la vía de Erk1/2.
P18-25
Chemotaxis of Pseudomonas to gamma-
aminobutyrate (GABA)
Jose Antonio Reyes Darias*1, Vanina García*1, Miriam Rico
Jiménez1, Andrés Corral Lugo1, Olivier Lesouhaitier2, Dalia Juárez
Hernández3, Yiling Yang4, Shuangyu Bi4, Marc Feuilloley2, Jesús
Muñoz Rojas3, Victor Sourjik4, Tino Krell1
1
Department of Environmental Protection, Estación Experimental del
Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada,
ES, 2Laboratory of Microbiology Signals and Microenvironnement
LMSM, EA 4312, Normandie Université, Université Rouen, Evreux,
FR, 3Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiológicas-Instituto de Ciencias,
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, MX, 4Max
Planck Institute for Terrestrial Microbiology & LOEWE Research
Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), Marburg, DE
Bacteria are able to migrate toward a more suitable environment by
detecting chemical and physical stimuli, in a process called chemotaxis.
Environmental stimuli are sensed by chemoreceptors, so called methyl–
accepting chemotaxis proteins (Mcp), which is typically composed of
a periplasmic ligand-binding domain (LBD) and a cytosolic signalling
domain. Chemotaxis occurs primarily to growth substrates but was also
reported for neurotransmitters, plant signals or quorum sensing signals and
the physiological relevance of taxis to these compounds is poorly understood.
Gamma-aminobutyrate (GABA) is ubiquitously present in nature and
has many functions like being a neurotransmitter, plant signal or growth
substrate. We show by microcalorimetric analysis that the recombinant LBDs
of the chemoreceptors PctC in the pathogenic Pseudomonas aeruginosa and
McpG in the saprophytic P. putida KT2440 bind GABA. Receptor chimeras
comprising the LBD of either PctC or McpG with the Tar signaling domain
were constructed and the signal output determined using fluorescence
resonance energy transfer (FRET). The resulting EC50 values for GABA
were with 3.6 ± 0.3 nM (PctC-Tar) and 5.7 ± 2 nM (McpG-Tar) extremely
low, indicating that both receptors are highly sensitive for GABA. The EC50
of PctC-Tar for GABA was 3100-fold inferior to the value for L-Pro, the
strongest responding protein amino acid. Experiments with Caenorhabditis
elegans showed that pctC mutation did not alter bacterial virulence. However,
mcpG mutation caused a reduction in tomato root colonization following
chemotaxis. The C. elegans data and the presence of a GABA receptor in a
saprophytic indicate that GABA taxis may not be related to virulence. The
environmental omnipresence of GABA and its multi-functionality suggests
that other bacteria may also show GABA taxis.
* Authors contributed equally to this work.
165
Pósters
P18-26
Characterization of a new human oncogene
Bárbara de la Peña, Cristian Suárez, Angustias Page, Josefa P.
Alameda, Llanos Casanova, Ángel Ramírez, Manuel Navarro
CIEMAT, Madrid, ES
Most human tumors have mutations in genes of the Ras small GTPase
protein family. Ras proteins work as binary molecular switches that
control intracellular signaling networks. Inappropriate activation of
ras causes aberrant signal transduction, proliferation and malignant
transformation. Oncogenic mutations in Ras prevent GTP hydrolysis,
locking Ras in a permanently active state. The main Ras isoforms are
H-Ras, N-Ras and K-Ras, mutations of which are found in several types
of human tumors. In spite of this, the human Ras family consists on
some 36 different genes, many of which have been scarcely studied.
One of these relatively unkonwn genes is ERas (Embryonic Ras), which
is a constitutively active Ras protein. ERas is located in chr X, and is
expressed only in embryonic stem cells, being undetectable in adult
tissues.
In the course of a high-throughput genetic screening to identify novel genes
mutated in human cancer, we detected insertional mutations leading to the
activation of ERas in a number of tumors. In this work, we describe the
cloning and introduction of ERas in several non-malignant human cell
lines. Forced expression of a HA-tagged ERas results in drastic changes in
cell shape, mobility and invasivity, as well as in the activation of specific
downstream pathways. Our results suggest that inappropriate expression of
ERas could have a role in human cancer.
P18-27 (R18-5)
Identificación de Hit1 como un nuevo regulador
de la salida de mitosis en Saccharomyces
cerevisiae
Ana Isabel de los Santos Velázquez, Fernando Monje Casas
Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa
(CABIMER), Utrera, ES
En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la salida de
mitosis se produce gracias a la liberación de Cdc14 desde el nucleolo hasta
el citoplasma, donde esta fosfatasa revierte los eventos de fosforilación
determinados por las ciclinas mitóticas, lo cual conduce finalmente a la
inactivación de las mismas. La liberación de Cdc14 se produce gracias
a dos cascadas de señalización: la ruta FEAR (Cdc-Fourteen Early
Anaphase Release) y la ruta MEN (Mitotic Exit Network). Aunque no
es esencial, FEAR juega un papel importante en la correcta segregación
del ADNr y los telómeros, la dinámica del huso mitótico, y la activación
de MEN. Así, la identificación de nuevos componentes de esta ruta es
importante para entender mejor el proceso de salida de mitosis. En nuestro
grupo de investigación, hemos identificado la proteína Hit1, de función
desconocida hasta el momento, como un posible nuevo componente de
la ruta FEAR, y estamos analizando el papel específico que esta proteína
juega en la correcta regulación de la liberación de Cdc14 y la salida de
mitosis.
P18r-28
Regulación de la desacetilasa de histonas SIRT6
en relación con el fenotipo tumoral
María Gutiérrez-Salmerón1, Valle Montalvo-Romeral1, Ana Chocarro-
Calvo2, José Manuel García-Martínez1, Antonio De la Vieja3,
Custodia García-Jiménez1
1
Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Rey Juan Carlos,
Alcorcón, ES, 2Ludwig Institute for Cancer Research, University of
Oxford, Oxford, UK, 3Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, ES
Introducción: La hiperglucemia favorece el desarrollo tumoral con
efectos directos sobre las células tumorales y efectos sistémicos. Nuestro
166
XXXVII Congreso SEBBM
grupo ha demostrado que mientras la señalización tumoral por Wnt
conduce al acúmulo citosólico del efector de la vía: la β-catenina, su
retención nuclear y activación transcripcional (responsable del aumento
de proliferación y otras características tumorales) requiere la existencia
de niveles elevados de glucosa. Esta acumulación nuclear dependiente de
hiperglucemia está mediada parcialmente por inhibición de la actividad
desacetilasa de las sirtuinas y, aunque hay evidencia de la implicación de
SIRT1, se desconoce si hay otras sirtuinas implicadas y cuáles son los
mecanismos subyacentes.
Recientemente se ha demostrado que el silenciamiento de SIRT6
altera el metabolismo de la glucosa y conduce a una disminución de la
glucemia y, por consiguiente, de la insulinemia. A diferencia de otras
sirtuinas los niveles de SIRT6 fluctúan de unos tipos celulares a otros y
esta sirtuina además de la actividad desacetilasa posee actividad ADP-
ribosilasa.
Los importantes efectos de SIRT6 sobre el metabolismo de la glucosa nos
han conducido a plantear el Objetivo: identificar estímulos que alteran los
niveles y actividad de SIRT6 y su relación con el fenotipo tumoral.
Metodología: células tumorales intestinales humanas y murinas
estimuladas con: glucosa, Wnt-3A o LiCl. Se evalúan cambios en niveles
o modificaciones por Western Blot e inmunofluorescencia; en expresión
génica por qPCR y en actividad desacetilasa por luminiscencia. Mediante
citometría determinamos su influencia en proliferación celular. Análisis
estadístico por ANOVA y post-test Bonferroni.
Resultados: Las proteínas Wnt-3A y LiCl reducen significativamente los
niveles de SIRT6 afectando a la actividad desacetilasa. Las alteraciones
de los niveles de SIRT6 correlacionan con alteraciones de la proliferación
celular.
Conclusiones: Algunos estímulos como Wnt o LiCl pueden facilitar la
aparición o progresión tumoral a través de la depleción ejercida sobre SIRT
6.
P18r-29
Interleukin 2 requieres p56Lck/PLCy/nPKCs
(PKCθ)/αPIX pathway to induce Rac 1-PYGM
activation in T cells
Francisco Llavero Bernal1, Bakarne Urzelai López de Aberásturi1,
José Luis Zugaza Gurruchaga2
1
Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES, 2Ikerbasque/
Centro Vasco de Neurociencias Achucarro/Universidad del País
Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES
Small GTPases of the Rho family have been implicated in important
cellular processes such as cell migration and adhesion, protein secretion,
and/or gene transcription. However, little is known about the role that
Rho GTPases play in IL-2-mediated responses in Kit 225 T cells. Our
group has shown that IL-2 induces Rac 1 activation, which interacts
with PYGM and modifies its activity to trigger T cell proliferation.
We have investigated the mechanisms by which PYGM is activated
through Rac 1 in T cells. Our results suggest that IL-2 stimulates
α-PIX/Rac 1/PYGM pathway activation through the novel Protein
kinase C theta type (PKCθ). Furthermore, by constructing αPIXS225A y
αPIXS488A mutants we show that these residues are essential for PYGM
activation. Moreover, it has been published that β subunit of the IL-2-
receptor activates p56Lck which in turns activates the phosphoinositide
phospholipase C-gamma (PLCγ). Here, we have observed that p56Lck
and PLCγ are implicated in the IL-2 signaling cascade that leads to
Rac1/PYGM pathway activation.
These data reveal a novel signaling pathway in which IL-2 transduces
signals through the Lymphocyte cell-specific protein-tyrosine kinase
(p56Lck)/Phosphoinositide phospholipase C-gamma (PLC)/novel Protein
kinase C theta type (PKCθ)/Rho guanine nucleotide exchange factor αPIX
/Rac 1 axis to activate PYGM.
Granada 2014
P18r-30
Novel functional complexes between Galphaq
and PB1 domain-containing proteins
Sofía Cabezudo Violero1, Guzmán Sánchez Fernández2, Catalina
Ribas Núñez2, Federico Mayor Menéndez2
1
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO), Instituto
de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2Max-Planck-
Institute for Heart and Lung Research, Centro de Biologia Molecular
“Severo Ochoa” (CSIC-UAM) and Instituto de Investigación
Sanitaria La Princesa, Madrid, ES
Introduction: G proteins play an essential role in the initiation of G-protein
coupled receptor (GPCR) signalling. Particularly, the Gαq/11 family has
been classically shown to associate and activate PLCβ. However, additional
effectors are responsible for other Gαq functions. We have reported that
GPCR activation promotes a direct interaction between Gαq and PKCƷ.
This association involves the basic PB1-type II domain of PKCƷ and a
novel acidic region in Gαq different from the classical effector-binding
region. This interaction leads to the stimulation of the ERK5 pathway
and to the development of cardiac hypertrophy, independently of the
canonical effector PLCβ. In this work, we have described that another PB1
containing protein, such as p62, belong to this Gαq/PKCƷ complex and
explored additional downstream pathways for this new Gαq interactome.
Methods: Biochemical characterization of the Gαq/p62 complex
was performed by mutagenesis and co-immunoprecipitation analysis.
Functionality of the Gαq/PKCƷ complex was determined performing
XCELLigence, propidium iodide incorporation and annexinV assays.
Results: We demonstrate that Gαq and p62 can be found in the same
functional protein complex. This association is enhanced upon Gαq
activation by GPCR. Furthermore, GRK2, a negative regulator of Gαq
signalling, abrogates this complex. This association involves the PB1
domain of p62 and the acidic region of Gαq, described to be essential for
PKCƷ binding. Interestingly, this association is preserved in PKCƷ deficient
cells, suggesting a direct interaction. Additionally, we show that the Gαq/
PKCƷ/ERK5 complex links Gαq to an apoptotic cell death pathway which
is autophagy-dependent.
Conclusion: Overall, our study provides concluding evidence showing
that PKCƷ acts as a functional effector of Gαq through the engagement of
a novel binding region in the alpha subunit leading to ERK5 activation and
apoptotic cell death in a mechanism dependent on autophagy where p62
could play an interesting role as part of this complex. These results could
help to uncover the identification of new potential pharmacological targets
for the treatment of cardiovascular diseases.
P18-31
IRF2-Binding Protein Like: implication of
the Ser526 phosphorylation on its cellular
localization, transcriptional activity and its novel
role as growth suppressor
Jon Vallejo1, Aintzane Apraiz2, Dorkaitz Basarte3, Asier Fullaondo1,
Ana M. Zubiaga1
1
Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal,
Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/
EHU, Leioa, ES, 2Departamento de Biología Celular e Histología,
Facultad de Medicina y Odontología, Universidad del País Vasco
UPV/EHU, Leioa, ES, 3Dpt Genética, Antropología Física y Fisiología
Animal, Fac. de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco
UPV/EHU, Leioa, ES
Ras proteins are important molecular switches that control intracellular
signaling networks, and their deregulation is one of the key events leading
to cellular transformation. On-going work in the laboratory has identified
IRF2BPL, an interferon regulatory factor family member, as a new
downstream effector of H-Ras. IRF2BPL encodes a transcription factor
that is thought to play a role in transcriptional regulation of hormones
Pósters
such as GNRH1 and PENK. It shows both target dependent transcriptional
activator and repressor activities and it has been described to form a
complex together with IRF2BP1 and IRF2BP2. However, the mechanisms
that underlie the regulation and functional activity of IRF2BPL are largely
unknown. The aim of this study is to characterize the regulation and
function of this protein.
We present evidence that IRF2BPL is predominantly nuclear and shows a
strong transcriptional repressor activity in serum-starved cells. Activation
of signaling pathways by the addition of serum leads to translocation of the
protein to the cytoplasm. IRF2BPL contains a nuclear localization sequence
(NLS) that is highly conserved in the interferon regulatory factor family.
Within the NLS of IRF2BPL2 lies a Serine residue (Ser526) that has been
found phosphorylated in proteomic studies, raising the possibility that this
phosphorylation may be critical for its localization and functional activity.
Substitutions of Serine at position 526 to Alanine (non-phosphorylable)
and Aspartic acid (phospho-mimetic) have been generated by site-directed
mutagenesis. Preliminary results suggest that Ser526 phosphorylation is
important for IRF2BPL localization and function. Moreover, we have
found that IRF2BPL overexpression leads to a decreased colony formation
in both non-transformed and HRasV12-transformed NIH3T3 cells, which
is associated with an early accumulation of cleaved caspase-3, suggesting
increased apoptotic cell death. Taken together, our results point to an
important function of IRF2BPL in the negative regulation of transcriptional
activity and cellular proliferation.
P18r-32
Regulation of c-Src tyrosine kinase activity
by calmodulin
Silviya R. Stateva1, Estefanía Anguita1, Valentina Salas2, Gustavo
Benaim3, Antonio Villalobo1
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de
Investigaciones Científicas – Universidad Autónoma de Madrid,
Madrid, ES, 2Universidad Central de Venezuela, Facultad de
Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Caracas, VE,
3
Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto
de Biología Experimental & Instituto de Estudios Avanzados (IDEA),
Caracas, VE
Calmodulin (CaM) is a Ca2+-receptor protein that regulates more than
one hundred target proteins with and without enzymatic activity in Ca2+-
dependent and independent manners and modulates a myriad of cellular
processes, some of which are vital for tumorigenesis (i.e. cell proliferation,
apoptosis and autophagy) [1]. c-Src is a non-receptor tyrosine kinase
that participates in signaling pathways that transduces events initiated
by different types of cellular receptors and adhesion molecules, and
controls many cellular functions including: cell migration, proliferation,
differentiation, apoptosis and stress-response, among others [2]. It has been
previously demonstrated that CaM directly interacts with c-Src in a partial
Ca2+-dependent manner and that trifluoperazine, a CaM antagonist, inhibits
the phosphorylation of c-Src, suggesting that CaM plays an important
role in survival signals in pancreatic tumor cells [3]. We demonstrate in
this work that recombinant c-Src directly binds CaM in Ca2+-dependent
and independent manners, suggesting that this kinase likely has more
than one CaM-binding domain. A couple of IQ-like motifs identified
in silico in c-Src could be responsible for the binding of CaM to this
kinase in the absence of Ca2+. We also show that CaM enhances the auto-
phosphorylation and tyrosine kinase activity of c-Src in the absence and
presence of Ca2+, most strongly in the former condition. We are testing
whether the CaM antagonist W-7 inhibits or not the hydrogen peroxide-
induced phosphorylation of c-Src in human breast adenocarcinoma SK-
BR-3 cells, and whether or not CaM-dependent protein kinase II and/or the
CaM-regulated protein phosphatase calcineurin, play a role in this process.
Bibliografía
[1] Berchtold MW, Villalobo A (2014) Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell
Res. 1843: 398-435.
167
Pósters
[2] Thomas SM, Brugge JS (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 513-609.
[3] Yuan K, Jing G, Chen J, Liu H, Zhang K, Li Y, Wu H, McDonald JM,
Chen Y (2011) J. Biol. Chem. 286: 24776-]24784.
Funded by SAF2011-23494, S2011/BMD-2349 and PITN-GA-2011-289033
to AV.
P18m-33
Papel de la AMPK (proteína quinasa activada
por AMP) en la amplificación de la señalización
tumoral por glucosa
Ana Chocarro-Calvo1, José Manuel García-Martínez2, María
Gutiérrez-Salmerón2, Valle Montalvo-Romeral2, Antonio De la Vieja3,
Custodia García-Jiménez2
1
Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford,
Headington, Oxford, UK, 2Facultad Ciencias de la Salud.
Universidad Rey Juan Carlos, Alcrocón, ES, 3Instituto de Salud
Carlos III, Majadahonda, ES
Estudios epidemiológicos asocian un aumento en la incidencia de cánceres
sitio-específicos con la diabetes. Las células tumorales sufren alteraciones
del metabolismo de la glucosa, de lípidos y de proteínas por lo que la
reprogramación del metabolismo energético celular ha despertado un fuerte
interés clínico como estrategia para combatir la enfermedad. La proteína
AMPK permite a la célula adaptarse al estrés metabólico por lo que
representa una diana molecular importante en cáncer y diabetes. Nuestro
grupo ha demostrado que la hiperglucemia amplifica la señalización
tumoral por Wnt/b-catenina en cánceres asociados a diabetes a través de
aumentos en niveles y actividad de la acetil transferasa p300.
Objetivos: Caracterizar el papel de la AMPK en la amplificación de la
señalización tumoral por glucosa.
Metodología: Usamos células tumorales intestinales murinas (STC-
1) y humanas (HT-29) en normo o hiper-glucemia. Los tratamientos
incluyen inhibidores/activadores de AMPK, sobreexpresión y depleción
de AMPK. Las alteraciones en las proteínas se miden por western Blot,
inmunofluorescencia e inmunoprecipitaciones.
Resultados: La hiperglucemia aumenta la fosforilación de AMPK (T172)
correlacionando con un incremento en los niveles, acetilación y actividad
acetiltrasferasa de p300. Estos efectos son reproducidos por la activación
de AMPK mediante Metformina/AICAR o la sobreexpresión de una forma
silvestre y son bloqueados por un inhibidor de AMPK (Compuesto C) o su
depleción mendiante siRNA específico.
Conclusiones: La AMPK media la amplificación de la señalización
tumoral por hiperglucemia en cánceres asociados a diabetes y sugiere un
nuevo mecanismo de adaptación de la célula tumoral a estas condiciones
de estrés metabólico.
P18-34
Latexin enhances retinoic acid-mediated
differentiation in human neuroblastoma-derived
SH-SY5Y cells
Carla Granados1, María Sánchez-Osuna2, Josep Vendrell1, Irantzu
Pallarès1, Víctor J. Yuste2
1
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de
Ciències i Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat
Autònoma de Barcelona , Barcelona, ES, 2Cell Death, Senescence
and Survival Group, Departament de Bioquímica i Biologia
Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de Medicina,
Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES
Latexin, the only known endogenous carboxypeptidase inhibitor, was
initially identified in the lateral neocortex of rat brain and has been used
as a marker of neurons in the developing brain. Latexin also plays a
role in regulating hematopoietic stem cells homeostasis, inflammation,
168
XXXVII Congreso SEBBM
and protein aggregation. Interestingly, latexin expression appears down-
regulated in several cancer cells because of hypermethylation of its
promoter. Thus, the over-expression of latexin in these cells prevents
tumour growth, suggesting a possible involvement of latexin in tumour
suppression. Retinoic acid (RA) is a natural metabolite of vitamin A that
plays an essential role in neural development. RA induces differentiation
through the regulation of genes involved in cell proliferation, cell cycle
and cell death. Among these genes, RA has been found to activate the
expression of a number of tumor suppressors such as retinoic acid receptor-
β(RARB), tazarotene-induced gene 1 (TIG1) or thioredoxin reductase. In
our study, we demonstrate that RA induces the expression of latexin in SH-
SY5Y neuroblastoma cells. Moreover, SH-SY5Y cells that constitutively
and stably express latexin, present enhanced RA-mediated differentiation,
as shown by both increased levels of the neuron specific enolase (NSE)
differentiation marker, and decreased levels of the DNA-binding protein
inhibitor (ID1) dedifferentiation marker. These first results encourage us
to further characterize the molecular pathways behind latexin-mediated
tumor suppression activity, likely involving cellular differentiation, which
seem of great interest to unveil the initial stages leading to the development
of certain types of cancer.
P18-35 (R18-7)
Development of a luminescence-based
mitocondrial calcium assay optimized
for high-throughput screening
Paloma Navas Navarro1, Javier García-Sancho2, Britta Jehle3, Joe
Lewis3, Fabiana Perocchi4, María Teresa Alonso Alonso2
1
Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2Instituto
de Biología y Genética Molecular (IBGM) - Universidad de Valladolid
- Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Valladolid, ES,
3
Chemical Biology Core Facility - EMBL Heidelberg, Heidelberg, DE,
4
Maximilians-Universität (LMU) Munich, Munich, DE
Mitochondria are capable of uptaking large amounts of Ca2+ via a
membrane- potential, ruthenium-red-sensitive mechanism recently
identified as the mitocondria calcium uniporter. Mitochondria Ca2+ uptake
controls intracellular Ca2+ signalling, cell metabolism, cell survival and
other celular functions by buffering cytosolic Ca2+ levels and regulating
mitochondrial effectors. Mitochondrial Ca2+ signaling pathways are
considered drug targets, as their regulation can determine cell fate in
disease models such as ischemia-reperfusion injury, neurodegeneration,
cardiomyopathies or metabolic disorders. However, till present, no
selective and specific compounds with therapeutic potential are available
to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis.
Aequorin is a calcium-binding photoprotein that emits bioluminescence
when it is reconstituted with its cofactor coelenterazine. We have developed
an aequorin-based assay to monitor mitocondrial Ca2+kinetics and we
have optimized it for high-throughput screening using a 96-well-plate-
reader platform. A bioluminescence-based assay has several advantages
over a fluorescence-based one: 1) targeting of the aequorin probe to
mitochondria matrix is extremely precise, thus permitting the selective
measurement inside the organelle;2) aequorin can be reconstituted with
different prosthetic groups allowing to cover a large dynamic range of Ca2+
concentration, from 10-7 to 10-3 M; 3) aequorin has a low Ca2+ buffering
effect and it is nearly insensitive to changes in Mg2+ or pH that may occur
inside mitochondria; 4) it has a high signal-to-noise ratio, making it an
ideal Ca2+ sensor for high-throughput screening; 5) the raw luminescent
signal can be calibrated in Ca2+ concentration by discharging all the
remaining aequorin. We have engineered a HeLa monoclonal cell line that
stably expresses a mitochondrial matrix-targeted GFP-Aequorin fusion
protein. Aequorin was reconstituted with coelenterazine n, which reduces
its affinity for Ca2+, it has a slower consumption rate and allows to monitor
Ca2+ kinetics for long periods of time.
Granada 2014
P18-36
Regulation of Zic1 gene expression by nitric
oxide and its role in the regulation of sonic
Hedgehog pathway in mouse embryonic stem
cells
Amparo Beltrán Povea, Carmen Salguero Aranda, Rafael Tapia
Limonchi, Ana Belén Hitos Prados, Irene Díaz Contreras, Gladys
Cahuana Macedo, Bernat Soria Escoms, Francisco Bedoya Bergua,
Juan R. Tejedo Huaman
Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa
(CABIMER), Sevilla, ES
Our laboratory has developed a protocol for endoderm differentiation
of mouse embryonic stem cells which consists in exposing cells to
high concentrations of a nitric oxide donor for 19 hours. This treatment
suppresses the expression of pluripotency genes such as Oct4 and Nanog,
and induces differentiation events of early acquisition of epithelial
morphology and expression of markers of definitive endoderm such as
Pdx1. We observed in previous studies in mouse embryonic stem cells
(mESC) that nitric Oxide causes an increase of the expression of Zic-
1, a marker of differentiation toward ectoderm, so we decided to study
this gene in endodermic differentiation process. It has been proved that
Zic1 and Gli proteins physically and functionally interact through their
zinc finger domains, and that Zic1 is essential to the regulation of Sonic
Hedgehog (Ssh) pathway in neural development. The aim objective of
this study is to determine if Zic1 is regulated by NO, and if this gene
has a role in the regulation of Ssh pathway in mESC related with
endoderm development. In our early studies in mouse embryonic stem
cells (mESCs) we have analysed Zic1 gene and protein expression of
cells treated with high concentration of nitric oxide, as well as the DNA
methylation on its promoter region, showing that the expression of Zic1
in presence of Nitric Oxide was increased, without significant changes
on DNA methylation. Furthermore, we found that the transcription
factor Egr1 could active to Zic1 expression after NO treatment. Then
we proved that Zic1 coexpressed with Pdx1 in cells treated with NO, in
adult pancreatic cells and in pancreas tissue, which are enough evidence
to suspect that Zic1 may be involved in the process of differentiation
to endoderm. Finally, we determined that NO treatment suppresses Ssh
signaling pathway, decreasing the expression of it targets genes. To test
whether this modification is promoted by Zic1, we developed gain and
loss of function assays of Zic1, reveling thus the possible role of Zic1
in Ssh signaling pathway inhibition and differentiation process toward
endoderm in mESC.
Subvencionado por:
- Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de
Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-900000)
- Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011)
P18m-37
Sam68 participa en las vías de señalización de
leptina e insulina en células de cáncer de mama
Flora Sánchez-Jiménez1, Antonio Pérez-Pérez1, Jenifer Martin-
González2, Antonio M. Carmona-Fernández1, Victor Sánchez-
Margalet1
1
Hospital Universitario Virgen Macarena, Montemayor, ES,
2
Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología,
Universidad de Sevilla, Sevilla, ES
Introducción: La obesidad y la resistencia a la insulina son factores de
riesgo bien conocidos para el desarrollo del cáncer de mama en mujeres
postmenopáusicas. La elevación de los niveles de leptina e insulina modulan
positivamente el crecimiento de estas células tumorales. La proteína Sam68
es una proteína de unión a ARN que también interacciona con proteínas de
señalización. Se ha demostrado previamente la sobreexpresión de Sam68
Pósters
en células de cáncer de mama. Además, Sam68 puede ser reclutado en
las vías de señalización de leptina e insulina como substrato del receptor,
habiéndose mostrado su participación en la proliferación, crecimiento
celular y efectos antiapoptóticos mediados por estas hormonas en diferentes
tipos celulares.
Objetivos: Estudiar la expresión de Sam68 y su nivel de fosforilación
medidos por leptina e insulina en diferentes líneas celulares de cáncer de
mama (MCF7, MDA-MB-231 y BT-474), estudiando asimismo el efecto
de la inhibición de la expresión de Sam68 mediante siRNA.
Resultados: En nuestro trabajo se ha demostrado un incremento en
la cantidad de proteína y expresión génica de Sam68 en respuesta al
estímulo con leptina o insulina en todas las líneas celulares de cáncer de
mama estudiadas. Además, tanto la estimulación con leptina como con
insulina, promovieron un incremento en la fosforilación en tirosina de
Sam68, regulando negativamente su capacidad de unión a RNA en estas
líneas celulares. La inhibición de la expresión de Sam68 resultó en una
menor activación de las vías MAPK y PI3K en la estimulación con ambas
hormonas.
Conclusión: Estos resultados sugieren la participación de Sam68 en la
señalización de los receptores de leptina e insulina en células de cáncer de
mama, mediando los efectos tróficos de estas hormonas en proliferación y
crecimiento celular.
P18r-38
Leptin prevents apoptosis triggered by increased
temperature in placental explants
Antonio Pérez-Pérez1, Ayelen Toro2, Flora Sánchez-Jiménez1, Jenifer
Martín-González3, Teresa Vilariño-García1, Cecilia Varone2, Víctor
Sánchez-Margalet1
1
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular,
Hospital Universitario Virgen Macarena, 13 Facultad de Medicina,
Sevilla, ES, 2Departamento de Química Biológica, IQUIBICEN,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos
Aires, Buenos Aires, AR, 3Department of Stomatology (Endodontics
section), School of Dentistry, University of Sevilla, Sevilla, ES
Maternal fever is common during pregnancy and and has for many
years been suspected to harm the developing fetus. Whether increased
maternal temperature produces exaggerated apoptosis in trophoblast
cells remains unclear. Since p53 is a critical regulator of apoptosis we
hypothesized that increased temperature in placenta produce abnormal
expression of proteins participating in the p53 pathway and finally
caspase 3 activacion. Moreover, leptin, produced by placenta, has
demonstrated to promote the proliferation and survival of trophoblastic
cells. That is why, we aimed to study the possible role of leptin
preventing apoptosis triggered by high temperature, as well as the
molecular mechanisms underlying this effect.
Fresh placental tissue was collected from normal pregnancies. Placental
explants were exposed to increased temperature (40ºC and 42ºC) for
different time points. We employed 10 nM leptin which is the optimal
leptin concentration. Western blotting and real-time PCR were performed
on tissue lysate for protein and mRNA expression of p53 and downstream
effector proteins, p21, Bax, Mdm2 and caspase 3.
Maximal apoptotic effect of high temperature was obserbed after 3 h
incubation of trophoblasts. Protein and mRNA expression of p53, p21,
Bax, Mdm2 and caspase 3 were significantly increased in explants at
40ºC and 42ºC in compared with explants to 37ºC. Conversely, this
increased expression was significantly attenuated by leptin 10 nM at both
40ºC and 42ºC.
These data illustrate the potential role of leptin for inhibiting the excessive
apoptosis in villous trophoblast triggered by high temperature. However,
the upstream regulation of p53 with regard to exaggerated apoptosis in
response to elevated temperature merits further investigation.
169
Pósters
P18r-39
PTEN mediates the inhibition of c-Src oncogenic
activity promoted by connexin43 in glioma cells
and astrocytes
Ana González Sánchez, Marta Domínguez-Prieto, Sandra Herrero-
González, Jose M Medina, Arantxa Tabernero
Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de
Castilla y León), Salamanca, ES
Gliomas are the most common brain tumors and they present a very bad
prognosis. One of their characteristics is a high activity of the oncogen,
c-Src, and a low expression of connexin43 (Cx43), the main protein
forming gap junction channels in astrocytes. In previous works we showed
that restoring Cx43 to glioma cells inhibits c-Src activity. Since c-Src
activity is inhibited by c-terminal Src kinase (Csk) phosphorylation and
PTEN dephosphorylation, we investigated wether Cx43 could regulate
c-Src activity by recruiting or regulating said enzymes.
In this work we show that silencing PTEN expression in C6 glioma cells
stably transfected with Cx43 (C6Cx43) reverted the effect of Cx43 on
c-Src activity and on cell proliferation. These results indicate that PTEN
participates in the inhibition of c-Src activity promoted by Cx43. Using
confocal microscopy and co-inmunoprecipitation studies, we confirmed
the interaction between Cx43, PTEN and c-Src in C6 glioma cells
transfected with Cx43 and astrocytes in primary culture. In addition, we
found Csk in this inmunocomplexes, suggesting that Cx43 can recruit the
machinery required to inactivate c-Src. Finally, we found that restoring
Cx43 expression in C6 glioma cells, in addition to reduce c-Src activity
and proliferation, upregulates PTEN and Csk.
According with the results, it could be concluded that PTEN and Csk
participate in the inhibition of the activity of c-Src promoted by Cx43 in
glioma cells and astrocytes.
P18-40
Regulación de los niveles de PLK1 por la E3
ligasa SKP1-CUL1-F-box
Ana Cristina Rivas1, Servando Giráldez1, Joaquín Herrero-Ruiz1, Mar
Mora-Santos1, María Cristina Limón-Mortés1, Carmen Sáez2, Miguel
Ángel Japón2, Maria Tortolero1, Francisco Romero1
1
Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad
de Sevilla, Sevilla, ES, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS),
Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla
y Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario
Virgen del Rocío, Sevilla, ES
PLK1 (Polo-Like Kinase1) es una quinasa de serina/treonina que interviene
en muchos de los eventos que tienen lugar durante la mitosis, como la
entrada en mitosis, la maduración de los centrosomas, el ensamblaje del
huso mitótico, la separación de las cromátidas hermanas, la activación del
complejo APC/C y la salida de mitosis y el inicio de la citocinesis. Además,
PLK1 está implicada en la replicación del ADN y en el restablecimiento
del ciclo celular tras el punto de control de G2 producido por los daños
en el ADN. Durante el ciclo, PLK1 se degrada vía APC/C-proteasoma
comenzando su degradación al final de la mitosis y continuando a lo largo
de la fase G1. PLK1 también se degrada por el APC/C en G2 en respuesta
al daño en el ADN. Por otra parte, recientemente hemos descrito que en
la fase S los niveles de PLK1 están controlados por la ligasa de ubicuitina
SCFFBXW7α. En este caso, PLK1 es ubicuitilada y degradada vía proteasoma
en condiciones no estresantes e incrementándose este efecto tras radiación
ultravioleta. Esta degradación contribuye a la parada del ciclo celular en
la fase S al impedir la formación de los complejos de pre-replicación (pre-
RC), lo que reduce la proliferación celular. Dado que se ha descrito que las
ligasas de ubicuitina SCFFBXW7α y SCFβTrCP pueden regular la estabilidad de
un mismo sustrato, tanto cooperando como interfiriendo en la degradación
del mismo, hemos estudiado el efecto de SCFβTrCP sobre PLK1 y sus
posibles implicaciones en las funciones de la quinasa.
170
XXXVII Congreso SEBBM
P18r-41
Transporte núcleo-citoplasmático del complejo
SNF1 de Saccharomyces cerevisiae
Montserrat Vega1, Alejandra Fernández-Cid2, Alberto Riera2, Pilar
Herrero1, Fernando Moreno1
1
Departamento de bioquímica y biología molecular, Universidad
de Oviedo, Oviedo, ES, 2MRC Clinical Sciences Centre - Imperial
College Faculty of Medicine, London, UK
La familia de proteín quinasas AMPK/SNF1 es esencial para establecer
en todas las células eucariotas, incluidas las levaduras, la regulación
metabólica adecuada en respuesta a diferentes tipos de estrés. El complejo
SNF1 de S.cerevisiae está constituido por tres subunidades, una subunidad
catalítica Snf1 y dos subunidades reguladoras, Snf4 y una de las tres
subunidades implicadas en la localización subcelular del complejo (Sip1,
Sip2 o Gal83). En S. cerevisiae, este complejo se requiere no solo para la
adaptación de la levadura a diferentes condiciones ambientales, entre las
que se incluye el estrés nutricional generado por condiciones de limitación
de glucosa, sino que también está implicado en procesos de desarrollo.
En esta comunicación presentamos datos de la influencia de los niveles
de glucosa en la distribución subcelular y mecanismo de transporte al
núcleo del complejo SNF1. Experimentos de coinmunoprecipitación de
cromatina (ChIP) demuestran que las tres proteínas que forman parte del
complejo SNF1 (Snf1, Gal83 y Snf4), están presentes en el núcleo tanto
en condiciones de alta como de baja glucosa. Hasta ahora el sistema de
importación y exportación utilizado por estas proteínas era desconocido.
Aquí mostramos la interacción de estas tres proteínas con las importinas
del sistema clásico de importación, Kap95 y Kap60, así como su
interacción con la exportina Xpo1, en condiciones de alta y baja glucosa.
Experimentos in vitro muestran que la interacción de Snf4, Snf1 y Gal83
con las importinas Kap60 y Kap95, está regulada por la presencia de
Gsp1GDP y Gsp1GTP. Demostrando que la direccionalidad del transporte
núcleo-citoplásmico viene dada por la GTPasa Gsp1 en función de si está
cargada con GDP (citoplasma) o GTP (núcleo).
P18r-42
Mechanism for the specific targeting of
methyltransferases to chemoreceptors in
Pseudmonas aeruginosa PAO1
Andrés Corral Lugo, Cristina García Fontana, Manuel Espinosa
Urgel, Tino Krell
Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES
Chemosensory pathways are major signal transduction mechanisms in
bacteria. Methyltransferases of the CheR family and methylesterases of
the CheB family control chemoreceptor methylation, and this dynamic
posttranslational modification is necessary for proper chemotaxis of bacteria.
Studies with enterobacteria that contain a single CheR or CheB show that,
in addition to binding at the methylation site, some chemoreceptors bind
CheR or CheB through additional high-affinity sites at distinct pentapeptide
sequences in the chemoreceptors. We investigated the recognition of
chemoreceptors by CheR proteins in the human pathogen Pseudomonas
aeruginosa PAO1. Of the four methyltransferases in PAO1, we detected
an interaction only between CheR2 and the chemoreceptor methyl-
accepting chemotaxis protein B (McpB), which contains the pentapeptide
GWEEF at its carboxyl terminus. Furthermore, CheR2 was also the only
paralog that methylated McpB in vitro, and deletion of the pentapeptide
sequence abolished both the CheR2-McpB interaction and the methylation
of McpB. When clustered according to protein sequence, bacterial CheR
proteins form two distinct families-those that bind pentapeptide-containing
chemoreceptors and those that do not. These two families are distinguished
by an insertion of three amino acids in the β-subdomain of CheR. Deletion
of this insertion in CheR2 prevented its interaction with and methylation
of McpB. Pentapeptide-containing chemoreceptors are common to many
bacteria species; thus, these short, distinct motifs may enable the specific
assembly of signaling complexes that mediate different responses.
Granada 2014
P18-43
Singularidad de SUMO en la regulación de las PHD
Almudena Gerpe-Pita, Amelie Schöber, Onintza Carlevaris, Edurne Berra
CIC bioGUNE, Derio, ES
Utilizando el oxígeno como sustrato, las PHD (Prolyl Hydroxylase Domain
containing proteins) son enzimas que catalizan la hidroxilación de sus
proteínas dianas sobre un residuo prolina. Estas dioxigenasas, conservadas
a lo largo de la evolución y de las que se han descrito tres isoformas en
mamíferos (PHD1-3), se identificaron inicialmente como los sensores de
oxígeno responsables de regular la estabilidad de la subunidad α del factor
de transcripción HIF (Hypoxia Inducible Factor), el “jefe de orquesta” de
la cascada de señalización de hipoxia y el mantenimiento de la homeostasis
de oxígeno. No obstante, las PHD no son enzimas redundantes y si bien
PHD1, 2 y 3 comparten ciertos substratos y tareas, es evidente que también
muestran ciertas especificidades en cuanto a su función y regulación.
La SUMOilación es una modificación postraduccional que conlleva la
conjugación covalente de SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier). El
proceso de SUMOilación implica una cascada de reacciones enzimáticas
en la que intervienen un complejo único de activación, Uba2/Aos1 o SAE1/
SAE2, una enzima de conjugación (Ubc9), una E3 específica para ciertos
sustratos (PIAS, RanBP2 o Pc2 son algunos ejemplos) y deSUMOilasas,
responsables de la deconjugación de SUMO. La interacción dinámica entre
SUMOilación y deSUMOilación modula importantes vías de señalización
molecular y entre ellas, la cascada de señalización de hipoxia. Por ello, nos
planteamos estudiar el papel de SUMO en la regulación de las PHD. En esta
presentación discutiremos nuestros resultados más recientes sobre el papel
singular de SUMO en la regulación de PHD1, 2 y 3, su implicación en las
rutas dependientes e independientes de HIF y su relevancia fisiopatologica.
P18-44
La activación de ERK 1/2 es suficiente para
restaurar la degradación proteica mediada por
dexametasona en células de músculo esquelético
José Dámaso Vílchez Rienda1, Rafael Salto González1, María Elena
Cabrera Cazorla1, Joan J Guinovart i Cirera2, María Dolores Girón
González1
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad
de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Instituto de
Investigación Biomédica, Universidad de Barcelona y CIBER de
Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Barcelona, ES
La atrofia muscular se desarrolla en situaciones de ayuno prolongado,
enfermedades como cáncer, diabetes, SIDA o sepsis y en condiciones como
el envejecimiento, denervación o tratamiento con glucocorticoides. En
estas situaciones, se produce una disminución en la síntesis de proteínas
conjuntamente con un aumento en su degradación. La degradación de
proteínas en músculo esquelético está mediada por la actividad de dos
rutas conservadas: ubiquitina-proteasoma y un aumento de la autofagia
lisosomal. La primera ruta, responsable del recambio de la mayoría de
proteínas musculares solubles y miofibrilares, se activa como resultado
de una expresión aumentada de ubiquitina y ligasas de ubiquitina, como
ATROGEN1 y MuRF1. La autofagia juega un papel muy importante en la
degradación proteica en el músculo esquelético e implica un incremento en
la transcripción de una serie de genes como LC3, p62 y Bnip3. Ambas rutas
están moduladas por el factor de transcripción Forkhead box O3 (FoxO3).
FoxO3 normalmente está fosforilado por Akt y en estado inactivo en el
citosol, pero en ausencia de una represión de Akt, se transloca al núcleo donde
induce la expresión de una serie de genes relacionados con los dos sistemas
de degradación. En cultivos de células musculares de rata L6, el tungstato
sódico, activador de ERK 1/2, es capaz de inhibir la degradación inducida
por dexametasona. El tungstato promueve la fosforilación de FoXO3a, lo
que conduce a su inactivación e inhibición de su translocación al núcleo
y por tanto, a una disminución en la actividad del promotor de ubiquitina
así como una menor expresión de las ligasas de ubiquitina. Asimismo, el
tungstato reduce la formación de autofagosomas, la expresión de la forma
Pósters
lipidada de LC3, la degradación de p62 y reduce los niveles de mRNA de
Bnip3 en células tratadas con dexametasona. Estos resultados obtenidos en
cultivos celulares apoyan la idea de que la activación de ERK 1/2 disminuye
la degradación proteica a través de los dos sistemas celulares, proteasoma y
lisosomal, por lo que el tungstato sódico podría ser un agente útil situaciones
fisiopatológicas en las que se presentase una atrofia muscular.
Proyecto Financiado por la Fundación Botín.
P18-45
Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis
towards protein amino acids and the non-protein
amino acid gamma-aminobutyrate (GABA)
Miriam Rico Jiménez1, Francisco Muñoz Martínez1, Cristina Gracía
Fontana1, Matilde Fernandez2, Bertrand Morel3, Álvaro Ortega4,
Juan Luís Ramos1, Tino Krell1
1
Estacion experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Bioilíberis
SL, Granada, ES, 3Departamento de Química Física, Facultad de
Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES,4Universidad de
Murcia, Murcia, ES
The paralogous receptors PctA, PctB and PctC of Pseudomonas aeruginosa
were reported to mediate chemotaxis to amino acids, intermediates of amino
acid metabolism and chlorinated hydrocarbons. We show that the recombinant
ligand binding regions (LBRs) of PctA, PctB and PctC bind 17, 5 and 2
L-amino acids, respectively. In addition, PctC-LBR recognized GABA but
not any other structurally related compound. L-Gln, one of the three amino
acids that is not recognized by PctA-LBR, was the most tightly binding ligand
to PctB suggesting that PctB has evolved to mediate chemotaxis primarily
towards L-Gln. Bacteria were efficiently attracted to L-Gln and GABA, but
mutation of pctB and pctC, respectively, abolished chemoattraction.
The physiological relevance of taxis towards GABA is proposed to reside in
an interaction with plants. LBRs were predicted to adopt double PDC (PhoQ/
DcuS/CitA) like structures and site directed mutagenesis studies showed that
ligands bind to the membrane-distal module. Analytical ultracentrifugation
studies have shown that PctA-LBR and PctB-LBR are monomeric in the
absence and presence of ligands, which is in contrast to the enterobacterial
receptors that require sensor domain dimers for ligand recognition.
P18-46
Protein kinase CK2 affects the stability of the
HB-EGF receptor ErbB4 in 786-O cells
E. Alcaraz1, J. Vilardell1, E. Sarró2, M. Plana1, A. Meseguer2, E. Itarte1
1
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat
Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2Fisiopatologia
Renal, CIBBIM, Institut de Recerca Hospital Universitari Vall
Hebron, Barcelona, ES
Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), a member of the EGF
family, binds and activates ErbB1 and ErbB4. ErbB4 is expressed as different
alternatively spliced isoforms that are characterized by variant extracellular
juxtamembrane (JM) and intracellular cytoplasmic (CYT) domains. The JM
domain of type a (JM-a) can be cleaved by ADAM 17 in response to binding
of ligands to the receptor, or the activation of PKC. The proteolytic fragment
can be further cleaved by γ-secretase, which releases the intracellular domain
as a soluble fragment of 80kDa (CYT2-ICD) which can translocate into the
nucleus where it functions as a co-activator or co-repressor for a number of
transcription factors. In previous studies we had observed that protein kinase
CK2 was involved in the response to HB-EGF in the renal cell carcinoma 786-
O cell line. To study the potential role of CK2 in ErbB4 receptor processing,
we generated a stable transfected 786-O cell line that expresses JMa-Cyt2
ErbB4 isoform, characteristic of renal cells. Treatment of these cells with
the CK2 inhibitor CX-4945 resulted in a marked reduction of ErbB4 levels.
Under the same conditions, CX-4945 did not affect the levels of the membrane
171
Pósters
protein transferrin receptor or of the CK2 substrate Iκ. Destabilization of
ErbB4 promoted by CX-4945 did not cause to the accumulation of CYT2-
ICD, as occured in response to HB-EGF or PMA, but to the complete loss
of bands detected with the anti-ErbB4 antibody. Treatment with lysosomal
proteinases inhibitors (leupeptin and pepstatin) attenuated the effect of CX-
4945 on CYT2-ICD leading to its accumulation. Moreover, interaction
between CK2 (CK2α and, in particular, CK2β subunit) and ErbB4 receptor
has been detected by pull down analysis, and downregulation of CK2β using
siRNAs decreased the expression of ErbB4. To sum up, CK2 seems necessary
to maintain ErbB4 levels within the cell. Supported by grants BFU2009-
10189 (MCINN) and SAF-2011-29506 (MINECO).
P18-47
MDN-0066 a novel inhibitor of VHL/HIF pathway
produced by a new Pseudomonas species
Bastien Cautain, Nuria De Pedro, Javier Pascual, Jesus Martin,
Fernando Reyes, Olga Genilloud, Francisca Vicente
Fundacion MEDINA, Armilla, ES
Throughout recent history, metabolites of microbial origin have had an
extraordinary impact on the welfare of humanity. In fact, natural products have
largely been –and still are– considered an exceedingly valuable platform for
the discovery of new drugs against diverse pathologies. Such value is partly
due to their higher complexity and chemical diversity as compared to those of
synthetic and combinatorial compounds. Mutations in the Von Hippel-Lindau
(vhl) gene are responsible for VHL disease, congenital polycythemia, and are
found in many sporadic tumor types. The primary cause of morbidity and
mortality for these patients arises from progression of Renal Cell Carcinoma
(RCC) or end-stage renal disease. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (vhl)
tumor suppressor gene arises in the majority of Renal Cell Carcinoma (RCC)
as well as in other types of cancer and is associated with a high degree of
vascularization and poor prognosis. Loss of pVHL function thus represents
a pathognomonic molecular defect for therapeutic exploitation. In this study,
renal carcinoma cell lines with naturally occurring vhl mutations (RCC4
VA) and their genetically matched wild-type vhl (RCC4 VHL)counterparts
were seeded onto 96-well plates and treated with a collection of 1,040
organic extracts obtained from 130 unicellular bacteria strains belonging to
at least 25 genera of the phyla Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria
and Bacteroidetes. This strategy allowed us to identify several extracts
obtained from the bacterial strain F-278,770T showing biological activities
not associated with previously known active metabolites. The fractionation
and structural elucidation of one of these extracts led to the discovery of a new
lipodepsipeptide (MDN-0066) with specific toxicity in pVHL deficient cells
that is not detectable in cells with pVHL expression rescue. This discovery
demonstrated the feasibility of selectively targeting the loss of the vhl tumor
suppressor gene for potential clinical benefit and may have great impact
on the development of new targeted therapies from natural product for the
treatment of cancer and other genetic diseases.
P18m-48
Papel de la proteína de unión a ARN Sam68 en
la señal de la leptina y la insulina en células de
la granulosa
Teresa Vilariño García1, Antonio Pérez-Pérez2, Victor Blasco
Rodriguez3, Nicolás Prados Nodd3, Manuel Fernández Sánchez3,
Víctor Sánchez Margalet2
1
Departamento Bioquimica Médica y Biología Molecular, Facultad
de Medicina de Sevilla, Sevilla, ES, 2Departamento de Bioquímica
Médica y Biología Molecular, Hospital Universitario Virgen
Macarena, Facultad de Medicina, Sevilla, ES, 3Instituto Valenciano
de infertilidad de Sevilla, Sevilla, ES
La obesidad es un problema medico no solo porque se asocia a la diabetes
tipo 2 y al riesgo cardiovascular, sino también por porque se asocia a ovario
172
XXXVII Congreso SEBBM
poliquístico, resistencia a la insulina y subfertilidad en la mujer en edad
reproductiva.
La proteína de unión a ARN Sam68 se expresa en células de la granulosa
y las hembras de los ratones knockout son subfértiles, con problemas
de ovulación. Ya que hemos encontrado que Sam68 puede reclutarse
a la señal de los receptores de insulina y leptina, planeamos estudiar
la participación de Sam68 en la señal y la acción de los receptores de
insulina y leptina en células de la granulosa. Además, estudiamos la
expresión de Sam68 en células de la granulosa en respuesta a la leptina
y la insulina in vitro.
Las células de la granulosa se obtuvieron a partir de la obtención de
ovocitos para la fertilización invitro. La señalización se studio por
inmunoprecipitación e inmunoblot de las proteínas fosforiladas. La
expression de Sam68 se inhibe por estrategia antisentido. El nivel de
expression de Sam68, los receptors de leptina e insulina se cuantificaron
por RT-PCR e inmunoblot.
Hemos encontrado que Sam68 se tirosín-fosforila por estimulación
con insulin o leptina en células de la granulosa, reclutando Sam68
a los complejos de señalización y disminuyendo la capacidad de
unión al ARN. Además, tanto la leptina como la insulina aumentan
la expresión de Sam68 en las células de la granulosa. Finalmente, la
expresion de Sam68 es necesaria para la activación completa de las
vías de señalización PI3K y MAPK, por insulin y leptina en células de
la granulosa.
En conclusion, Sam68 es reclutado a la señal del receptor de leptina e
insulin, su expression se induce por ambas hormonas, y la expression de
Sam68 es necesaria para la completa activación de la transducción de la
señal de los receptores de insulina y leptina. Sam68 puede ser un nuevo
elemento en la resistencia a la insulina ovárica y la fertilidad disminuida
en mujeres obesas
P18r-49
β3 Integrin is essential for invadopodia
formation in TGF-β lung carcinoma treated
cells
Rafael Peláez Cristóbal, Xabier Morales, Elisabeth Salvo, Saray
Garasa, Ana Rouzaut
Universidad de Navarra/CIMA, Pamplona, ES
Tumor cell migration and invasion are crucial events during cell metastasis,
which is the main cause of death in patients with cancer. Depending on the
mechanical properties of the tumor stroma, cancer cells develop invasive
actin-rich structures capable of degrading the surrounding extracellular
matrix (ECM) known as invadopodia.
Integrins are transmembrane proteins implicated in cell adhesion and
migration. Integrin activation induces signaling cascades conducive
to the reorganization of cell cytoskeleton. Recent reports have
demonstrated the presence of different integrins surrounding the
invadopodia core in breast and melanoma cancer cells. β3 integrin
and αvβ3 heterodimer have been associated with poor prognosis and
increased metastasis in several carcinoma types. We aimed to determine
whether β3 integrin participates in invadopodia formation in lung
carcinoma cells. We based our hypothesis on our previous findings of
specific TGF-β induction of β3 integrin dependent metastasis in lung
carcinoma cells.
In this study, we demonstrated that β3 integrin is temporarily allocated on
the invadopodia of H157 NSCLC cells. β3 integrin silencing or functional
blockade completely abrogates invadopodia formation, even after treatment
with TGF-β (a cytokine that significantly induces invadopodia formation)
while β3 integrin re-expression restores the capacity of invadopodia
formation in integrin deficient cells. Moreover, integrin activation induces
different signal pathways (FAK, SRC, ERK and Small GTPases family)
allowing invadopodia formation.
In conclusion, we demonstrated a dual role of the β3 integrin in invadopodia
formation during cancer cell metastasis: it contributes to the initial cell
Granada 2014
adhesion and then it activates signal pathways implicated in invadopodia
formation.
P18r-50
Mecanismos de regulación de la expresión
de ENA1 en respuesta a pH alcalino: un estudio
cuantitativo
Maria López Malo, Silvia Petrezselyova, David Canadell, Joaquín
Ariño
UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Barcelona, ES
La alcalinización del medio supone una situación de estrés para
la levadura Saccharomyces cerevisiae, que conlleva una respuesta
adaptativa que da lugar a un remodelado de la expresión génica. Uno
de los genes relevantes para la adaptación a pH alcalino es ENA1, que
codifica una Na+ ATPasa implicada en la detoxificación de sodio. En la
regulación del gen ENA1 por pH alcalino están implicadas diversas rutas
de señalización. Una de ellas está mediada por la proteína calcineurina
que desfosforila el factor transcripcional Crz1, permitiéndole la entrada
en el núcleo y por tanto la unión a las secuencias específicas activando
el gen. La respuesta independiente de calcineurina está bajo el control de
dos rutas diferentes, Rim101 y Snf1, en las que está implicado el represor
Nrg1. Si bien este proceso ha sido caracterizado desde un punto de vista
cualitativo, no ha sido investigado desde un punto de vista cuantitativo,
que permita eventualmente el modelado del mismo. Para ello hemos
analizado a lo largo del tiempo en células expuestas a estrés alcalino
diversos parámetros como la tasa de transcripción y la cantidad de mARN
de ENA1, la cantidad de Crz1, su transición citosol-núcleo y su cinética
de unión al promotor de ENA1, así como la cantidad de Ena1 producida.
Un análisis similar para el represor Nrg1 está en curso. De esta manera
confiamos definir los parámetros que gobiernan la expresión de Ena1 en
respuesta a estrés alcalino.
P18r-51
Búsqueda de nuevos mecanismos de actuación
de la proteína fosfatasa Ptc1
Laura Tatjer Recorda, Asier González Seviné, Joaquín Ariño
Carmona
UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Sabadell, ES
Las proteínas fosfatasas de tipo 2C (PP2C) conforman una familia
de enzimas monoméricas, conservadas a lo largo de la evolución,
que en S. cerevisiae están codificadas por 7 genes estructuralmente
relacionados (PTC1-7). La isoforma más estudiada en levaduras es
Ptc1, ya que ésta puede desempeñar múltiples funciones específicas
no compartidas con las otras PP2C. Como consecuencia, un mutante
ptc1 presenta defectos de crecimiento ante diversas formas de estrés,
como los que activan la vía de señalización de la integridad de la pared
celular (p. ej., pH alcalino y el blanco de calcoflúor) o en presencia
de rapamicina, un inhibidor de la vía TOR, la cual señaliza la falta de
nutrientes. Con el objeto de identificar posibles dianas de la acción de
Ptc1, hemos rastreado bibliotecas genómicas para encontrar genes que,
en sobreexpresión, alivien el fenotipo de sensibilidad a pH alcalino,
blanco de calcoflúor y rapamicina del mutante. Como resultado
de la búsqueda se han aislado un total de 25 genes que suprimen o
alivian uno o varios fenotipos característicos del mutante ptc1. Nos
hemos centrado en el estudio de PPH21 y PPH22, que codifican dos
subunidades catalíticas redundantes de la proteína fosfatasa de tipo 2A.
Los resultados obtenidos nos indican que la carencia de Ptc1 estaría
alterando los diferentes complejos fosfatasa-Tap42, que actúan como
efectores de la vía TOR cuando ésta es inhibida.
Financiado por BFU2011-30197-C3-01.
Pósters
P18-52
TGFβ2 dictates disseminated tumor cell fate
in target organs through TGFβ-RIII and p38α/β
signaling
Paloma Bragado Domingo
IDIBAPS, Barcelona, ES
Metastases are thought to arise from disseminated tumor cells (DTCs) that
can either initiate growth immediately or reprogram into dormancy. In this
state they can remain undetected for long periods before resuming growth
and forming overt metastases. The mechanisms driving dormancy of DTCs
remain largely unknown. We hypothesize that via a “seed and soil” mechanism
the target organ microenvironment where DTCs lodge controls the timing of
DTCs dormancy and thus their fate. Using head and neck and breast cancer
models we have studied the nature of the organ-derived signals that control the
interconversion of DTCs between dormancy and proliferation states. We found
that the bone marrow (BM) represents a growth restrictive micro-environment
in which DTCs persist for long periods of time in a quiescent/dormant state.
In this tissue, host-derived TGFβ2, but not TGFb1, signaling, activates p38α/β,
inducing a [ERK/p38] low signaling ratio. This results in induction of DEC2/
SHARP1 and p27, downregulation of CDK4 and dormancy of malignant
DTCs. TGFβ2-induced dormancy required TGFβ -receptor-I, TGFβ -receptor-
III and SMAD1/5 activation to induce p27. In contrast, in lungs, which is a
site commonly permissive for metastasis, TGFb2 signals are weaker and
only a short-term dormancy ensues before DTCs start proliferating and fuel
metastases. Importantly, systemic inhibition of TGFβ-receptor-I or p38α/β
activities awakened dormant DTCs fueling multi-organ metastasis. Our work
reveals a “seed and soil” mechanism where TGFβ2 and TGFβRIII signaling
through p38α/β regulate DTC dormancy and defines restrictive (BM) and
-permissive (lung) microenvironments for HNSCC metastasis. By identifying
key pathways controlling dormancy we open opportunities for eradication of
the residual disease.
P19. Transgénesis en mamíferos
P19r-1
IGF1R (insulin-like growth factor type 1 receptor)
regula la regeneración del epitelio bronquiolar
induciendo la diferenciación de las células de Clara
Sergio Piñeiro-Hermida, Icíar P. López, Raquel Torrens, José G. Pichel
Centro de Investigación Biomédica de la Rioja (CIBIR), Fundación
Rioja Salud, Logroño, La Rioja, ES
Los IGF (insulin-like growth factors) son factores pleiotrópicos que regulan
la proliferación, diferenciación y supervivencia celular activando el IGF1R,
su receptor específico. Controlan el desarrollo y la homeostasis del pulmón,
su regeneración tras daño y participan en enfermedades pulmonares como el
síndrome de distrés respiratorio, la fibrosis y el cáncer. Aunque la expresión
pulmonar de IGF1R es ubicua y sus niveles son elevados en el epitelio, la
acción de IGF1R depende de la disponibilidad de los ligandos, del momento
del desarrollo y del tipo celular. Como los ratones deficientes en IGF1R mueren
al nacer por insuficiencia respiratoria debido a la hipoplasia e inmadurez
pulmonar, para determinar la función de IGF1R en el epitelio del pulmón murino
adulto se generaron mutantes condicionales Nkx2.1-Cre; Igf1r fl/fl, que expresan
la recombinasa Cre en el epitelio respiratorio. Estos ratones mutantes expresan
niveles reducidos de mRNA de Igf1r en el pulmón, presentan alteraciones en el
epitelio bronquiolar terminal (adelgazamiento, reducción de la densidad celular
y aumento de la proliferación), pero sin impacto morfológico aparente en el
parénquima alveolar. Durante la recuperación del daño bronquiolar inducido
por la ablación selectiva de las células epiteliales de Clara con naftaleno, la
deficiencia de Igf1r mantiene los defectos histológicos, dispara la proliferación
y retrasa su diferenciación. In vitro, los IGF inducen la expresión de CCSP
(Clara Cell Secreted Protein) en células epiteliales bronquiolares humanas.
173
Pósters
Los resultados demuestran que la señalización mediada por IGF1R en el
epitelio respiratorio regula la regeneración del epitelio bronquiolar dañado,
induciendo la diferenciación de las células de Clara.
P19-2 (R03_19-2)
Retos y nuevas oportunidades en transgénesis
animal mediante las nucleasas de edición
genómica CRISPR-Cas9
Lluís Montoliu, Davide Seruggia
Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES
Las primeras células troncales pluripotentes embrionarias (ES) de ratón se
describieron en 1981 por Martin Evans. En 1986, Mario Capecchi integró
el uso de dichas células y la experiencia en recombinación homóloga
desarrollada por Oliver Smithies para diseñar el protocolo de inactivación
dirigida de genes en el genoma de ratón, proceso por el cual los tres
investigadores recibieron el premio Nobel en 2007. Durante años esta
poderosa tecnología ha permanecido relativamente invariable y ha permitido
la generación de miles de mutaciones en el genoma de ratón. El panorama
cambió a partir de 2009, cuando se publicaron las primeras ratas con genes
inactivados mediante el uso de ZFN. Las nucleasas dirigidas de dedos de
zinc (ZFN) están constituidas por unas proteínas quiméricas con un dominio
de unión a DNA, variable, en función de la secuencia a inactivar, y un
dominio de corte (endonucleasa) de DNA en doble cadena, derivado del
enzima de restricción FokI. Un par de años más tarde, en 2011, apareció la
segunda generación de nucleasas de edición genómica, las TALEN, en los
que de nuevo un dominio de unión a DNA se combinaba con un dominio
endonucleasa. Pero la verdadera revolución no llegaría hasta 2013, cuando
se publicaron los primeros trabajos demostrando el uso de las nucleasas
CRISPR-Cas9, derivadas de bacterias, en las que el reconocimiento no
estaba mediado por una proteína sino por una pequeña secuencia de RNA
que posteriormente interaccionaba con el dominio endonucleasa (Cas9).
Esta tercera (por el momento) versión de las nucleasas de edición genómica
ha supuesto una verdadera revolución en la manera como diseñar y generar
alteraciones genéticas de diverso tipo en prácticamente cualquier organismo.
En el laboratorio hemos realizado la transición desde las TALEN a las
CRISPR-Cas9 con éxito, y por ello comentaré las ventajas y las limitaciones
de estas fabulosas nuevas herramientas de modificación genómica que
están llamadas a substituir, prácticamente por completo, nuestro trabajo de
mutaciones, tradicionalmente abordado a través de células ES.
P19r-3
Inactivación de regiones intergénicas mediante
CRISPR-Cas9 en el genoma de ratón
Davide Seruggia, Marta Cantero, Lluis Montoliu
Centro Nacional de Biotecnologia (CNB-CSIC), Madrid, ES
Apenas un 2% del genoma de mamíferos está ocupado por regiones génicas
que codifican para proteínas. El resto del genoma está plagado de secuencias de
ADN repetidas y de elementos reguladores de la expresión génica, esenciales
para el control en tiempo y espacio de la transcripción. Nuestro laboratorio
está interesado en el estudio estructural y funcional de las secuencias
aisladoras genómicas, capaces de delimitar dominios de expresión e impedir
la interacción entre loci vecinos. Uno de nuestros modelos experimentales es
el locus de la tirosinasa de ratón, cuya mutación está asociada con albinismo.
En experimentos anteriores demostramos la existencia de regiones aisladoras
genómicas en posición 5’ y 3’ del locus de la tirosinasa de ratón. En particular,
la región 5’ contiene elementos fundamentales para la expresión correcta de
este gen que cuando se eliminan en construcciones transgénicas condicionan
una expresión variegada. Desde hace muchos años nuestra intención era
reproducir los experimentos realizados sobre transgenes en el propio locus
endógeno. Sin embargo, la presencia de múltiples secuencias repetitivas
alrededor de estas secuencias intergénicas reguladoras impedía la aplicación
de aproximaciones tradicionales, basadas en recombinación homóloga en
174
XXXVII Congreso SEBBM
células ES. Con la aparición de las nuevas nucleasas de edición genómica, en
particular con las CRISPR-Cas9 ha sido posible diseñar una estrategia para
eliminar estas secuencias reguladoras, intergénicas, directamente del locus
endógeno. Los primeros resultados obtenidos han sido extraordinariamente
positivos, con alteraciones fenotípicas evidentes similares a las obtenidas
anteriormente durante el análisis de ratones transgénicos. En este trabajo
presentaremos los resultados obtenidos aplicando la tecnología CRISPR-
Cas9 para la inactivación específica de secuencias intergénicas in vivo, en
el genoma de ratón.
P19r-4 (R03_19-4)
Antizyme Inhibitor 2 expression in the adrenal
gland: study with knock-out mice
Ana Lambertos Escudero1, Bruno Ramos Molina2, Carlos López
García2, Cristina Peñafiel Verdú2, Andrés Joaquín López Contreras2,
Asunción Cremades Campos2, Rafael Peñafiel García2
1
University of Murcia, Los Alcázares, Murcia, ES, 2Department of
Biochemistry and Molecular Biology B and Immunology, Faculty of
Medicine, University of Murcia, Murcia, ES
Polyamines are small organic cations essential for cell proliferation,
differentiation and survival. Ornithine decarboxylase (ODC), the key
enzyme controlling polyamine biosynthesis, is negatively regulated by
proteins termed antizymes (AZs). We recently described a novel antizyme
inhibitor (AZIN2) that stimulates ODC activity and polyamine uptake. To
gain insight on the tissue expression profile of AZIN2 and to explore its
possible physiological role, we generated Azin2 knock-out mice expressing
bacterial β-D-galactosidase as a reporter gene, under the control of the
Azin2 endogenous promoter, what allows a very sensitive and specific
detection of the expression of the gene in the tissues of transgenic mice.
Whole mount analysis and histochemical detection of lacZ using X-gal
staining revealed that Azin2 is expressed in the medulla but not in the
cortex of adrenal glands. The majority of chromaffin cells displayed a
granular-like reactivity, with clusters of cells with both cytosolic and a
more intense superimposed granular staining. No sexual dimorphism
was observed. Azin2 mRNA levels were halved in heterozygous and
dramatically reduced in homozygous mice. Adrenal polyamine and
catecholamine content and mRNA levels of genes related with polyamine
metabolism were not affected by Azin2 deficiency. Microarray analysis
comparing gene expression in wild type and knock-out mice identified 28
genes that were down-regulated more than 2-fold in the adrenal gland of
transgenic mice and 67 genes up-regulated. Bioinformatics tools suggest
that both catecholamine secretion and the amount of secretory vesicles may
be reduced in the adrenal gland of knock-out mice. These results support
the previous view that AZIN2 may participate in vesicular trafficking and
secretion. (Supported by SAF2011-29051).
P19-5 (R03_19-5)
Generación de translocaciones cromosómicas
en células humanas asociadas a cáncer mediante
el empleo de CRISPR-Cas9
Juan Carlos Ramírez1, Raúl Torres1, Sandra Rodríguez-Perales2
1
Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares,
CNIC, Madrid, ES, 2Centro Nacional Investigaciones Oncológicas
(CNIO), Madrid, ES
Las translocaciones son un tipo de reordenamiento cromosómico
frecuentemente descrito en el inicio y/o evolución de muchos tipos de
cáncer. Algunas de ellas producen oncogenes que son responsables de la
transformación maligna. El mecanismo específico que genera este tipo de
reordenamiento es complejo y aún no se conoce en detalle, pero siempre es
desencadenado por la dos roturas de doble hebra (DSB) en el ADN de dos
cromosomas no homólogos. La reparación errónea de esas roturas al reunir
Granada 2014
de manera ilegítima los dos fragmentos de los cromosomas rotos resulta en
la generación de translocaciones .
Para poder tener un conocimiento más completo sobre como afectan las
translocaciones cromosómicas al inicio del cáncer es necesario reproducir
de manera precisa estos reordenamientos. Hemos desarrollado una nueva
estrategia para inducir translocaciones cromosómicas específicas basada en
la capacidad del sistema CRISPR-Cas9 de inducir DSBs en localizaciones
específicas.
Como modelos de estudio hemos elegido las translocaciones t(8;21)/
RUNX1-ETO y t(11;22)/EWSR-FLI1, características de algunos tipos de
leucemia mieloide aguda y del sarcoma de Ewing. Usando el sistema
CRISPR-Cas9 hemos sido capaces de inducir con una elevada frecuencia
estas translocaciones tanto en líneas celulares establecidas, como en
células progenitoras humanas (células hematopoyéticas y mesenquimales).
El análisis por FISH y la secuenciación a nivel de ADN, ARN y proteína
de los genes de fusión generados revelan una alta fiabilidad y precisión
del sistema CRISPR-Cas9, proporcionando una nueva herramienta muy
poderosa para el estudio del cáncer lo que podría llevar al desarrollo de
nuevas terapias basadas en los productos de estas translocaciones.
P20. Transportadores de membrana
P20-1 (R20-1)
Role of Aquaporins in cell proliferation: Functional
inhibition of AQP3 with a gold-based compound
Miriam Echevarría Irusta, Ana Galán-Cobo, Ana Serna, Reposo
Ramírez Lorca, Ismael Sánchez Gomar, Juan José Toledo-Aral
Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario
Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla (Departamento
de Fisiología Médica y Biofísica) - Centro de Investigación
Biomédica en Red sobre Enfermedades Respiratorias (CIBERES) y
Neurodegenerativas (CIBERNED), Sevilla, ES
Objective: Numerous studies indicated an abnormal AQPs expression in
tumor of different origins and a role for these proteins in angiogenesis,
cell migration and proliferation had been shown. Recently we verified that
the gold (III) complex Auphen significantly inhibits the cell proliferation
of AQP3 expressing cells. Then to better understand the role AQPs may
play in the cell proliferation process we explore the effects that stable
overexpression of these proteins (o-AQPs) produce over the proliferation
and cell cycle of wt-PC12 cells as a cellular model.
Methods: Cell cycle by flow cytometry with propidium iodide and cell
proliferation through cell counting and BrdU staining were used. Using
Nocodazole we evaluated the cell response to arrest its cell cycle and the
resistance to apoptosis by Annexin V staining; and proteomic and transcriptomic
techniques were performed to highlight key molecules implicated in cell
proliferation which expression may be altered by overexpression of AQPs.
Finally, in cells with large expression of AQP3 we explore the effect of Auphen
over cyclins expression and cell cycle progression.
Results: Cells with o-AQPs showed higher cell proliferation rate and
larger percentage of cells in phases S and G2/M. After 24h in the presence
of Nocodazole, o-AQPs cells exhibited less modification of the cell cycle
pattern and lower Annexin V specific staining consistent with a higher
resistance to apoptosis. Additionally, in AQP3-expressing cells treated with
Auphen, strong arrest of the cell cycle in the S-G2/M phases, in concordance
with the analysis of cyclins (A, B1, D1, E) levels was observed. The RT-
qPCR analysis comparing o-AQPs cells to wt cells validated interesting
changes in the expression of molecules related with cell proliferation, tumor
and cell cycle progression, such as, Zeb2, Jun, JunB, NF-kβ, Cxcl9, Cxcl10,
TNF, and TNF receptors.
Conclusions: The significant role of AQPs in the cell proliferation process
seems to be connected to increments in the cell cycle turnover. Our results
support the view that larger expression of AQPs confers to the cell a more
Pósters
tumor-like phenotype that contributes to explain the presence of these
proteins in much different type of tumors. A potential therapeutic effect of
Auphen in tumors where cell proliferation can be associated with AQP3
seems promising, but more studies are necessary to clarify this issue.
P20-2 (R20-6)
Occurrence of carbon catabolite repression-
regulated mechanism involved in the transport
of extracellular ADP-glucose in Escherichia coli
Goizeder Almagro1, Manuel Montero1, Alejandro M. Viale2, Mehdi
Rahimpour1, Abdelhatif Bahaji1, Francisco José Muñoz1, Edurne
Baroja-Fernández1, Javier Pozueta-Romero1
1
Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra),
Mutilva, ES, 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario
(IBR, CONICET), Departamento de Microbiología, Facultad de
Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de
Rosario, Rosario, AR
ADP-glucose is the precursor molecule for glycogen and starch biosynthesis
in bacteria and plants, respectively. Due to the high abundance of this
nucleotide-sugar in tubers and endosperms present in the normal diet of
many animals, we explored the possible occurrence of an ADP-glucose
transport system in the enterobacterial species Escherichia coli. To avoid
artifacts resulting from the possible conversion of periplasmic ADP-glucose
breakdown products into glycogen, in this work we used glglC and pgm
null mutants unable to catalyze the reversible conversion of ADP-glucose
into glucose-1-P, and glucose-1-P into glucose-6-phosphate, respectively.
Noteworthy, these cells converted the exogenoulsy added ADP-glucose into
glycogen. Uptake of ADP-glucose was confirmed by the disappearance of
this nucleotide-sugar from the culture medium. ΔpgmΔptsG, ΔpgmΔptsH,
ΔpgmΔptsI and ΔpgmΔcrr cells impaired in the PTS components produced
glycogen from exogenously added ADP-glucose, indicating that the
transport of this nucleotide-sugar is not mediated by PTS. Furthermore,
ΔpgmΔcyaA and ΔpgmΔcrp cells, both impaired in the CRP-cAMP carbon
catabolite repression mechanism, neither incorporated ADP-glucose nor
produced glycogen from ADP-glucose, demonstrating that the uptake of
this nucleotide-sugar is CRP-cAMP regulated in E. coli. Finally, using a
systematic and comprehensive gene-disrupted mutant collection of E. coli
we identified some genes belonging to the CRP-cAMP regulon encoding
membrane proteins whose absence impair ADP-glucose transport.
P20-3 (R20-2)
Insights into the functional mechanism of secondary
transporters revealed by X-ray crystallography
José Luis Vázquez Ibar
Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES
Atomic structures of membrane transport proteins have revealed important
insights regarding the functional mechanism of membrane transport
proteins. In particular, these structures have confirmed the validity of the
alternate-access model, predicted forty years ago, as the general mechanism
used by these proteins to translocate substrates from one side to another side
of the membrane. In addition, questions like how substrate is recognized by
the transporter and how substrate triggers protein conformational changes
are being answered combining these high-resolution crystal structures with
biochemical and functional assays. In this regard, here I am presenting
two examples of substrate induced-fit mechanism in secondary transport
proteins, the initial step for substrate translocation. First, the latest crystal
structure of the lactose permease of E. coli in occluded state with bound
substrate reveals how substrate is able to sculpt the binding site; revealing
some hints about substrate and proton-motive force coupling. Second, the
structure of the onward-facing conformation of the L-arginine/agmatine
exchanger of E. coli with bound substrate reveals the molecular mechanism
of substrate-induced conformational changes in this transporter.
175
Pósters
P20r-4 (R20-4)
Bases moleculares del efecto dominante negativo
de una mutación de GlyT2 asociada
con hiperplexia
Esther Arribas González1, Jaime de Juan Sanz2, Carmen Aragón
Rueda3, Beatriz López Corcuera3
1
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM - IdiPAZ-
Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid,
Madrid, ES, 2Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical
College , New York, US, 3Centro de Biología Molecular Severo
Ochoa-CSIC-UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de
Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital
Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES
La hiperplexia o “enfermedad de sobresalto” es un síndrome clínico
raro caracterizado por una respuesta exagerada a estímulos triviales
auditivos o táctiles. Este trastorno neurológico puede producir daño
cerebral y/o muerte súbita en neonatos debido a episodios de apnea y
fallos cardiorrespiratorios. La enfermedad es causada por un déficit en
la neurotransmisión glicinérgica inhibidora. La forma presináptica de
la hiperplexia puede originarse por mutaciones en el gen humano del
transportador neuronal de glicina GlyT2 (SLC6A5). GlyT2 media el
reciclado de la glicina desde la hendidura hasta el terminal presináptico
constituyendo la principal fuente de neurotransmisor liberado en las
sinapsis glicinérgicas. Aunque la mayoría de las mutaciones detectadas
son recesivas, produciendo pérdida de función bialélica por inactividad del
transportador o por su ausencia de la membrana, hay un mutante dominante
negativo sobre el tráfico de GlyT2. Hemos explorado las propiedades y
alteraciones estructurales de este mutante y analizado el efecto dominante
negativo que retiene a GlyT2 en el retículo endoplasmático impidiendo su
expresión en superficie. La introducción de una arginina en lugar de Ser-
512 altera el plegamiento del transportador y promueve mejor asociación
con la chaperona calnexina, menor unión a Sec24D y, por tanto, retención
en retículo. Hemos demostrado la formación de oligómeros comunes
GlyT2-S512R. La sobreexpresión de calnexina rescata el efecto dominante
negativo incrementando la cantidad de GlyT2 que alcanza la membrana
y reduciendo la interacción entre GlyT2 y su mutante. El rescate por
chaperonas químicas ha sido investigado en un sistema heterólogo y en
cultivos primarios de neuronas.
P20r-5 (R20-5)
Regulación del transportador neuronal de glicina
GlyT2 por el receptor purinérgico P2X3
Lucía Villarejo López1, Esperanza Jimenez2, Carmen Aragon3,
Beatriz López-Corcuera3
1
Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2Departamento de
Biología Molecular, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,”
CSIC, UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de
Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital
Universitario La Paz, UAM, Madrid, ES, 3Centro de Investigación
Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud
Carlos III - IdiPAZ-Hospital Universitario La Paz, Universidad
Autónoma de Madrid, Madrid, ES
La glicina es el neurotransmisor inhibidor más abundante en áreas
caudales del sistema nervioso central, desempeña un importante papel
en la generación de ritmos motores y permite el procesamiento de
señales nociceptivas, sensoriales y respuestas reflejas espinales. Es,
además, un activador del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) en vías
glutamatérgicas excitadoras donde funciona como agonista obligado del
glutamato. La neurotransmisión mediada por glicina finaliza cuando es
retirada de la hendidura sináptica por los neurotransportadores (GlyT)
presentes en las membranas plasmáticas de la glía adyacente (GlyT1) y en
los botones presinápticos de neuronas glicinérgicas (GlyT2).
Las dos isoformas han sido asociadas a la patogénesis de ciertos desórdenes
del sistema nervioso como la esquizofrenia, alteraciones cognitivas,
176
XXXVII Congreso SEBBM
dependencia de alcohol, dolor, epilepsia, desórdenes respiratorios e
hiperplexia o enfermedad del sobresalto, un desorden neurológico humano
caracterizado por sobresaltos enérgicos y generalizados en respuesta
a estímulos triviales acústicos o táctiles asociado con una deficiente
neurotransmisión glicinérgica inhibidora cuya segunda causa principal son
mutaciones en el gen humano de GlyT2.
Un aspecto de gran interés es el estudio del papel de los transportadores de
glicina GlyT1 y GlyT2 en vías nociceptivas, ya que la red de interneuronas
glicinérgicas localizadas en las astas dorsales de la médula espinal regulan
la transmisión de la señal dolorosa desde la periferia a regiones superiores
del cerebro. Trabajos de eliminación génica han revelado que la actividad
de los GlyTs, puede modular la neurotransmisión glicinérgica, por lo
que conocer la regulación de los GlyTs en vías nociceptivas puede tener
consecuencias terapeúticas.
De hecho, la inyección intratecal de inhibidores de GlyTs produce
analgesia en modelos animales de dolor. Estudios previos, han demostrado
que la neurotransmisión glicinergica puede regularse por la actividad de
receptores purinérgicos.
En este trabajo, hemos descrito cómo el receptor P2X3 es capaz de regular
la actividad de transporte de GlyT2 y proponemos las rutas de señalización
que median esta comunicación intercelular entre neuronas sensoriales e
interneuronas glicinérgicas.
P20-6 (R20-3)
Modulación del tráfico de los transportadores de
nucleósidos concentrativos (CNT) a la membrana
plasmática y sus implicaciones en la acción de
fármacos derivados de nucleósidos
Paula Fernández-Calotti
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de
Barcelona, Instituto de Biomedicina (IBUB). CIBERehd, Barcelona, ES
Los análogos de nucleósidos (AN) constituyen una clase importante de
antimetabolitos proapoptóticos utilizados en el tratamiento de neoplasias
hematológicas, tumores sólidos y enfermedades infecciosas. El ingreso de
estas moléculas a las células se produce a través de los transportadores de
nucleósidos de membrana (TN) concentrativos (hCNT) y equilibrativos
(hENT) contribuyendo a la biodisponibilidad del fármaco y a la citotoxicidad
o capacidad antiviral del mismo. La resistencia a los AN se ha relacionado a
la biodisponibilidad y la entrada a las células entre otras causas.
La regulación de la actividad de los TN de forma específica es un enfoque
adecuado para modular la biodisponibilidad de un determinado AN.
Demostramos que el ácido transretinoico (ATRA) induce el tráfico de
hCNT3 a la membrana plasmática causando un aumento en su actividad
y en la consecuente entrada del AN fludarabina en células de leucemia
linfocítica crónica (LLC) causando una reversión de la resistencia al
fármaco. Recientemente hemos observado que el tráfico de hCNT3 en
células de colon depende de la interacción directa de la porción amino
terminal del hCNT3 con Galectina 4.
Por otro lado, la terapia combinada para el tratamiento de la infección por
el virus de la hepatitis C implica interferón α (IFNα) y el AN ribavirina.
Aunque en condiciones basales hENT1 es el principal transportador de
ribavirina, ningún estudio ha evaluado el papel de hCNT2, un excelente
potencial transportador de ribavirina, en presencia de IFNα. Demostramos
que IFNα induce un rápido y transitorio aumento de la actividad hCNT2 en
células HHL5 derivadas de hepatocitos y un consecuente incremento en la
entrada de ribavirina a estas células.
Es evidente que la expresión de los TN posee un papel fundamental en la
biodisponibilidad y en la respuesta a fármacos AN. El análisis del patrón
de expresión de TN podría ser útil como biomarcador del metabolismo
y acción de fármacos asi como también para predecir la respuesta a una
determinada terapia. Por lo tanto, el estudio de las propiedades regulatorias
de cada TN es fundamental para la mejora de los tratamientos antitumorales
y antivirales.