Versión 2. F1000Res . 2014; 3: 298.

PMCID: PMC4617322
Publicado en línea el 8 de mayo de 2015. Otras versiones
Doi: 10.12688 / f1000research.5919.2 PMID: 26535110

Efecto de las condiciones ambientales y culturales sobre el pH medio y el

rendimiento del crecimiento de explantes de cultivos de brotes de abeto
de Douglas ( Pseudotsuga menziesii )
Chien-Chih Chen , 1 Rick Bates , 2 y John Carlson a, 3
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, Biosystems Research Complex, Clemson, SC,

29634, USA
2Department of Plant Science, The Pennsylvania State University, University Park, PA, 16802, USA
3Department of Ecosystem Science and Management, The Pennsylvania State University, University Park, PA,

16802, USA
aEmail: jec16@psu.edu

CCC performed the experiments, analyzed the data, and wrote the first draft of this manuscript. All authors
contributed equally in data interpretations as well as writing and further refinement of the manuscript.

Competing interests: No competing interests were disclosed.

Accepted 2015 May 6.

Copyright : © 2015 Chen CC et al.

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Licence, which
permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Cambios de versión

Revisado. Enmiendas de la versión 1

Hicimos ligeros cambios gramaticales en esta revisión para que quede más claro. Los cambios
importantes incluyen: - Modificación del título - Explicaciones adicionales para comparar dos tipos de
medios, para usar un amplio rango de pH, para usar una sola concentración de MES, para el uso de MES
y para explicar la sugerencia de subcultivo de 21 días y desarrollo de explantes . - Modificación de
subtítulos (ahora cambio de pH medio con explantes) - Se agregó una nueva tabla para comparar la
formulación del medio

Resumen de la revisión por pares

Fecha de revisión Nombre (s) del revisor Versión revisada Estado de revisión
2015 16 de octubre Vibha Srivastava Versión Aprobado
2015 octubre 6 Isabel Arrillaga Versión Aprobado
2015 febrero 10 Isabel Arrillaga Versión Aprobado con reservas
2015 febrero 6 Vibha Srivastava Versión Aprobado con reservas

Abstracto
Se ha demostrado que el nivel de pH medio de los cultivos de tejidos vegetales es esencial para muchos
aspectos del desarrollo y crecimiento de explantes. Sensibilidad o tolerancia al cambio de pH medio in
vitrovaría según los requisitos específicos de cada especie. Los objetivos de este estudio son 1)
determinar el cambio de pH del medio a lo largo del tiempo en condiciones de almacenamiento y con
presencia de explantes, 2) evaluar los efectos del cambio de pH del medio en el rendimiento del
crecimiento del explante y 3) evaluar los efectos de agregar un estabilizador de pH, 2 - Ácido (N-
morfolino) etanosulfónico (MES) que se usa comúnmente en el medio de micropropagación de abeto de
Douglas. Los brotes vegetativos se recolectaron en la primavera antes de romper la latencia de los árboles
donantes jóvenes y maduros para realizar estas evaluaciones. El medio, con o sin MES, fue preajustado a
cinco niveles de pH antes de agregar MES, agar y esterilizar en autoclave. Se midieron los cambios de pH
del medio y los parámetros de crecimiento del explante en ocho tiempos de incubación diferentes. En
general, MES proporcionó un pH medio más estable, en relación con los valores de pH iniciales, en
condiciones de almacenamiento de luz y oscuridad, así como con presencia de explantes. Se encontró una
tendencia general de disminución del pH del medio con el tiempo al comparar explantes de genotipos de
donantes jóvenes y maduros. El crecimiento de la altura y el peso del explante aumentaron con el tiempo,
pero difieren entre los explantes de los genotipos de donantes juveniles y maduros. Nuestros hallazgos
sugieren que una práctica de subcultivo de 21 días puede mantener mejor la frescura media, el nivel de
pH medio y el crecimiento deseable del explante.

Palabras clave: pH medio, Pseudotsuga menziesii, abeto de Douglas, micropropagación, ácido 2- (N-
morfolino) etanosulfónico, MES

Introducción
La industria de los árboles de Navidad juega un papel importante en la agricultura de Pensilvania, así
como en todo el país. El objetivo de este proyecto de micropropagación fue desarrollar un sistema de
propagación clonal fiel al tipo para aliviar el costo de la variación de árbol a árbol de la propagación
convencional de plántulas. Comprender los materiales vegetales y sus condiciones de crecimiento puede
brindar una mejor ayuda para las etapas posteriores del desarrollo en el cultivo de tejidos.

Se ha demostrado que el pH medio de los cultivos de tejidos vegetales es muy importante para muchos
aspectos del desarrollo y crecimiento de explantes. La sensibilidad o tolerancia al cambio de pH medio in
vitro varía según los requisitos específicos de cada especie. Al igual que el pH del suelo, el nivel de pH
medio puede influir en la absorción de nutrientes ( Ramage y Williams, 2002 ), el ajuste del pH celular (
Ballarin-Denti y Antoniotti, 1991 ), el enraizamiento y el crecimiento celular ( de Klerk et al. , 2008 ;
Leifert et al. , 1992 ), la expresión de genes vegetales y las respuestas de pH transcripcional en raíces (
Lager et al. , 2010 ), y la eficiencia de Agrobacterium-transformación mediada ( Ogaki et al. , 2008 ; Rai
et al. , 2012 ). El pH del medio también puede actuar para facilitar o inhibir la disponibilidad de
nutrientes en el medio, como la absorción de amonio in vitro que se facilita con un pH estable de 5,5 (
Thorpe et al. , 2008 ).
Las fluctuaciones del pH del medio pueden atribuirse a componentes del medio, esterilización en
autoclave, intercambio iónico y condiciones ambientales. Los componentes del medio pueden modificar
el pH antes y después del autoclave ( Owen et al. , 1991 ; Skirvin et al. , 1986 ). Sales orgánicas,
inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, sacarosa, agentes gelificantes y reguladores del crecimiento de las
plantas son los componentes comunes que se agregan al medio de cultivo de tejidos. Williams y col.
(1990) informaron que la adición de agar elevaba significativamente el pH del medio antes de la
esterilización en autoclave cuando el pH preajustado variaba de 3,5 a 5,5 en medio MS ( Murashige &
Skoog, 1962), mientras que se encontró un menor incremento de pH para el pH del medio preajustado en
el rango de 5.5 a 7.0, y el pH disminuyó para el pH del medio preajustado en el rango de 7.0 a 8.0. Por el
contrario, el pH del medio posterior al autoclave aumentó para un pH preajustado de 3,5–4,5, pero se
observó una disminución más significativa del pH del medio con un pH preajustado de 5–8. Las adiciones
de ácidos orgánicos sintéticos u naturales generalmente aumentan la capacidad de amortiguación media (
Thorpe et al. , 2008 ). Se sabe que los compuestos orgánicos como el ácido 2- (N-morfolino)
etanosulfónico (MES) ayudan a mantener un rango de pH medio adecuado para el desarrollo de explantes
( de Klerk et al. , 2008 ; Parfitt et al. , 1988 ; Yuan et al. , 2012). También se encontró que las adiciones
de MES y vitaminas mejoran el crecimiento del embrión durante la etapa de inicio de la embriogénesis
somática del abeto de Douglas ( Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco) (Franco 1950) ( Pullman et al. ,
2005 ).

Después de colocar los explantes en el medio, también se han informado fluctuaciones del pH del medio
para varias especies. El pH del medio de pino piñonero ( Pinus taeda ) cultivado en medio de suspensión
líquida mostró una disminución posterior del pH de 5,5 a 4,6 dentro de los 5 días de incubación seguido
de un aumento del pH a 6,0 en 19 días de incubación ( Pullman et al. , 2005 ). También se encontró una
disminución significativa del pH medio después de colocar brotes de mulla mullas ( Ptilotus exaltatus )
en medio MS durante 4 semanas ( Williams et al. , 1990 ) y se encontró una curva en forma de U de
fluctuación del pH medio en el cultivo de la punta de los brotes de manzano silvestre ( Malus sp. .cv.
Almey) y pera ( Pyrus communisL. cv. Seckel) en medio MS ( Singha et al. , 1987 ). Según Skirvin et al.
(1986) y Thorpe et al. (2008) , la absorción de nutrientes del explante in vitro es una función del
intercambio iónico donde la deposición de iones de hidrógeno libres (H + ) e iones de hidroxilo (OH - ) en
el medio puede contribuir al pH del medio ácido o alcalino. En contraste, los eventos quelantes inducidos
por la fotooxidación que se unen al hierro libre, reduciendo la disponibilidad de hierro, también pueden
influir en el pH del medio ( Hangarter & Stasinopoulos, 1991 ). La secreción de metabolitos secundarios
de plantas en el medio de cultivo es común in vitro ( Dörnenburg & Knorr, 1995 ), pero su papel y
función en la alteración del pH del medio y la absorción de nutrientes no están claros.

Las fluctuaciones del pH medio pueden involucrar muchos factores y eventualmente pueden volverse
problemáticas para el cultivo de tejidos. El cultivo de brotes de abeto de Douglas se puede cultivar en una
versión modificada (mDCR) del medio revisado de cotiledones de abeto de Douglas (DCR, Gupta y
Durzan, 1985 ; Gupta y Durzan, 1987a). Sin embargo, las interacciones entre la especie y su medio de
cultivo no se comprenden bien. Para garantizar un desarrollo óptimo del cultivo de brotes y proporcionar
brotes de alta calidad para el desarrollo posterior del protocolo de enraizamiento, el pH medio puede ser
un indicador clave para determinar el tiempo óptimo de subcultivo. El pH medio se puede utilizar además
como una herramienta de diagnóstico para algunos síntomas de crecimiento anormal, como la necrosis,
causada por una deficiencia de nutrientes inducida por un pH bajo. El estudio de los efectos del pH del
medio también puede extenderse al desarrollo de explantes y las relaciones de nutrientes in vitro (Singha
et al., 1990). Por lo tanto, los objetivos de este estudio son 1) determinar el cambio de pH del medio
durante varios tiempos en condiciones de almacenamiento y en presencia de explantes, 2) evaluar los
efectos del cultivo prolongado sobre el pH del medio y el rendimiento del crecimiento del explante, y 3)
evaluar los efectos de la adición de un estabilizador de pH, MES al medio de micropropagación de abeto
de Douglas.
materiales y métodos
Para este estudio se utilizaron yemas vegetativas de árboles donantes jóvenes (HF205 y HF210) y
maduros (PS-2) recolectados en la primavera de 2006. Estas muestras de yemas se recolectaron antes de
romper el letargo. Para clasificar la juventud, se seleccionaron como donantes juveniles los abetos
Douglas de la fuente de semillas de Lincoln plantados 10 años antes y que aún no producían conos en la
Granja de Investigación de Horticultura de Penn State del Centro de Investigación y Educación Agrícola
Russell E. Larson en Rock Springs. El árbol donante maduro seleccionado, un genotipo de árbol de
Navidad de élite resultante de un estudio genético previo realizado por Gerhold (1984), tenía más de 40
años y crecía en un huerto de semillas ubicado en el campo de golf de Penn State University. Estas
muestras de yemas se almacenaron en una cámara fría a 4 ° C hasta el inicio del cultivo. La preparación,
esterilización y disección de las muestras de yemas recolectadas siguió a Traore et al. (2005) .

Este estudio consistió en un diseño factorial de cuatro factores con tres repeticiones para cada
combinación de factores. Se ingresaron para las evaluaciones dos genotipos juveniles, HF205 y HF210, y
un genotipo maduro, PS-2. El medio basal fue mDCR, una versión modificada de las sales basales de MS
desarrolladas para el abeto de Douglas por Gupta y Durzan (1985 y 1987a) que posteriormente
modificamos y clasificamos como mDCR. Se proporciona una comparación de los componentes entre
DCR y mDCR en tabla 1. Se utilizaron dos tipos de medios, incluidos solo mDCR y mDCR con 2 g / L
de MES (mDCR + MES) (M3671, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los niveles de pH del medio
se preajustaron a 3.6, 5.1, 5.7, 6.3 y 7.8 antes de agregar 7 g de agar, MES y esterilizar en autoclave. Esta
amplia gama de niveles de pH del medio preajustados permitiría evaluar la capacidad de amortiguación
del medio y la respuesta y el ajuste del crecimiento del explante después de colocarlo en los tipos de
medio correspondientes. Estos niveles de pH medios preajustados también se limitaron a los niveles de
pH que no interferirán con la solidificación del gel. Debido a los materiales vegetales limitados, la
adición de una concentración de MES informada anteriormente ( de Klerk et al. , 2008 ; Höfer et al. ,
1999 ; Parfitt et al. , 1988 ; Wilson y col. , 1989 ) sirvió como base para la comparación en las
necesidades de evaluación antes mencionadas. Se colocaron cinco yemas vegetativas disecadas
esterilizadas en la superficie de cada genotipo en cada combinación de tratamiento. Los controles
consistieron en medio sin presencia de explantes, en cada nivel de pH. Se colocaron en plena oscuridad
frente a la luz en cámaras de crecimiento a 25 ° C. Para los tratamientos, los explantes se diseccionaron y
se colocaron en medios mDCR versus mDCR + MES para la incubación durante 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 y
35 días.
Tabla 1.
Comparación de la formulación media de DCR frente a mDCR.

Macronutrientes
Cantidad a agregar (mg / L)
Fórmula molecular Nombre compuesto
DCR mDCR
KNO 3 Nitrato de potasio 340.000 1000.000
(NH 4 ) 2 SO 4 Sulfato de amonio - 200.000
KCl Cloruro de potasio - 300.000
MgSO 4 · 7H 2 O Sulfato de magnesio heptahidratado 370.000 250.000
CaCl 2 · 2H 2 O Cloruro de calcio dihidrato 85.000 150.000
NaH 2 PO 4 · H 2 O Fosfato de sodio monobásico monohidrato - 90.000
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O Fosfato de sodio dibásico heptahidratado - 30.000
Ca (NO 3 ) 2 · 4H 2 O Nitrato de calcio tetrahidratado 556.000 -
KH 2 PO 4 Dihidrógeno fosfato de potasio 170.000 -
NH 4 NO 3 Nitrato de amonio 400.000 -
Micronutriente
ZnSO 4 · 7H 2 O Sulfato de zinc heptahidratado 8.600 3.000
H 3 BO 3 Ácido bórico 6.200 3.000
CuSO 4 · 5H 2 O Sulfato cúprico pentahidratado 0,250 0,125
FeSO 4 · 7H 2 O Sulfato ferroso heptahidratado 27.800 13.900
MnSO 4 · H 2 O Sulfato manganoso monohidrato 22.300 5.300
C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 · 2H 2 O Sal disódica de EDTA dihidrato 37.300 18.700
KI Yoduro de potasio 0,830 0.375
CoCl 2 · 6H 2 O Cloruro de cobalto hexahidratado 0,025 0,125
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O Molibdato de sodio dihidrato - 0,125
NaMoO 4 · 2H 2 O Óxido de sodio y molibdeno dihidrato 0,250 -
NiCl 2 Cloruro de níquel (II) 0,025 -
Vitamina
C 6 H 12 O 6 myo- inositol 200.000 1.000
C 6 H 5 NO 2 Ácido nicotínico 0.500 0,100
C 12 H 17 ClN 4 OS · HCl Tiamina HCl 1.000 1.000
C 8 H 11 NO 3 · HCl HCl de piridoxina 0.500 0,100
NH 2 CH 2 COOH Glicina 2.000 -

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Nota: Medios revisados de cotiledones de abeto de Douglas (DCR, Gupta y Durzan, 1985 , Gupta y Durzan, 1987a
); medios revisados de cotiledón de abeto de Douglas modificado (mDCR)
Durante el proceso de disección, se tomaron medidas de las muestras para el peso inicial de la yema (mg)
y el peso de la placa de Petri (PD) (mg) con medio solidificado. Después de cada tratamiento y tiempo de
incubación, se registraron el pH final del medio, el peso final de PD (mg) y el peso final del explante
(mg). El cambio de peso del explante (mg) se obtuvo restando los pesos iniciales de las yemas de los
pesos finales del explante. El pH del medio se midió en cinco posiciones en las placas, entre los
explantes, usando un medidor de pH Thermo Orion PerpHecT (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
MA, EE. UU.). Los análisis de datos se realizaron utilizando Minitab (Minitab Inc., State College, PA,
EE. UU.), Y SigmaPlot (Systat Software Inc., Chicago, IL, EE. UU.) Generó gráficos, incluido el modelo
lineal general ANOVA (GLM), Tukey Honestly Significant Prueba de diferencia (HSD) y regresión lineal
con significancia establecida en p <

Resultados

El pH del medio y el peso del explante cambian durante los tiempos de incubación para
cultivos de brotes de abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii) cultivados en diferentes
medios:

Conjunto de datos 1: Las columnas de datos A a E son Condiciones (condiciones de incubación

como en luz u oscuridad a 25 ° C), tipo medio (mDCR se refiere a una versión modificada del
medio revisado de cotiledón de abeto Douglas, y mDCR + MES se refiere al medio mDCR con la
adición de Ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico), pH inicial (niveles preajustados de pH del
medio), tiempo de incubación (días) y medición del pH (medición del pH del medio después del
tratamiento).

Conjunto de datos 2: El conjunto de datos 2 es la comparación de la medición del pH del medio

antes y después del autoclave (columna de datos A y B, respectivamente).

Conjunto de datos 3: Las columnas A a E del conjunto de datos 3 son genotipo, pH inicial (pH del
medio preajustado), tipo de medio (mDCR se refiere a una versión modificada del medio revisado
de cotiledón de abeto Douglas, y mDCR + MES se refiere al medio mDCR con la adición de 2-
(N-morfolino) ácido etanosulfónico), Medición de pH (cambios de pH del medio según
tratamientos) y Tiempo de incubación (días).

Conjunto de datos 4: El conjunto de datos 4 consiste en cambios de peso de las yemas individuales
antes y después de los tratamientos de acuerdo con cada genotipo. Las columnas A a G son
genotipo, pH inicial (pH del medio preajustado), tipo de medio (mDCR se refiere a una versión
modificada del medio revisado del cotiledón de abeto Douglas, y mDCR + MES se refiere al
medio mDCR con adición de 2- (N- morfolino) ácido etanosulfónico), Peso de yema inicial (mg),
Peso de yema final (mg), Incremento de peso de yema (mg) y Tiempo de incubación (días).

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Copyright : © 2015 Chen CC et al.

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Cambio de pH del medio de cultivo después del autoclave y almacenamiento

Después de la esterilización en autoclave, se encontraron cambios de pH del medio de acuerdo con el pH
de cada medio preajustado. De 100 muestras, el medio mDCR mostró un mayor grado de fluctuaciones
de pH que el mDCR + MES post-autoclave. Los medios ajustados inicialmente a pH 3.6, 5.1 y 5.7
mostraron un aumento de pH para ambos tipos de medios (cambios de pH de 0.83, 0.58, 0.17 y 0.76,
0.22, 0.11 para mDCR y mDCR + MES, respectivamente) mientras que el medio inicialmente a pH 7.8
mostró una disminución pH (-0,66 y -0,59 para mDCR y mDCR + MES, respectivamente). El medio de
pH preajustado 6,3 mostró un pH reducido en mDCR (-0,11) pero un pH aumentado para mDCR + MES
(0,05). En general, el almacenamiento en la oscuridad fue mejor para mantener estable el pH del medio
que el almacenamiento en la luz. En general, el pH del medio fue 5,8 (n = 400) cuando se mantuvo en la
oscuridad en comparación con el pH 5,4 (n = 400) en la luz ( P= 0,000). Durante los tiempos de
incubación probados, el pH del medio mostró solo una ligera tendencia decreciente en la condición de
almacenamiento oscuro. En contraste, el pH del medio tuvo una tendencia decreciente más fuerte cuando
se incubó a la luz. El medio mDCR + MES mantuvo el medio con menos cambio de pH durante los
tiempos de incubación en comparación con el medio mDCR a la luz ( Figura 1).

Figura 1.
El pH del medio cambia durante los tiempos de incubación de los medios mDCR y mDCR + MES
incubados en condiciones de luz y oscuridad.

El pH del medio se preajustó a 3.6, 5.1, 5.7, 6.3 y 7.8 antes de agregar 7 g / L de agar, MES y autoclave. El
medio se incubó en una cámara de crecimiento con plena luz u oscuridad a 25 ° C hasta que alcanzó el
requisito de incubación. El pH posterior al autoclave se registró usando un medidor de pH en cada tiempo de
incubación. Los puntos de datos representan el pH medio (n = 5 para cada punto de datos) y se ajustaron con
líneas de regresión lineal. Consulte el conjunto de datos 1 para conocer los datos sin procesar.

Cambio de pH medio con explantes

Después de colocar los explantes en el medio, el pH del medio se vio significativamente influenciado por
todos los factores: genotipo, tipo de medio, nivel de pH inicial y tiempo de incubación (todos P = 0,000).
El pH general del medio fue 5.45 del medio incubado con explantes de genotipo PS-2 (n = 1355), que fue
significativamente mayor que el pH de 5.41 y 5.19 para los medios incubados con explantes de los
genotipos HF210 (n = 1384) y HF205 (n = 950), respectivamente. El pH del medio de mDCR + MES (n
= 1,805) fue significativamente mayor que el pH del medio mDCR solo (n = 1,884) (5,45 frente a 5,28,
respectivamente) ( P= 0,000). Se observaron tanto la disminución del pH del medio durante el tiempo de
incubación como la variación entre los genotipos. Los medios con la adición de MES pudieron mantener
mejor el pH del medio estable hasta 21 días de incubación de cada uno de los 5 niveles de pH iniciales
diferentes ( Figura 2). Independientemente del nivel de pH inicial, el tiempo de incubación tuvo un fuerte
efecto significativo en el pH del medio ( P = 0,000). En general, para ambos tipos de medios, el pH
medio del medio mostró el valor más bajo de 5,04 (n = 435) a los 21 días de incubación. Por el contrario,
el pH medio más alto de 5,88 se registró en el día 42 de incubación (n = 125). El pH general del medio en
cada pH inicial (3.6, 5.1, 5.7, 6.3 y 7.8) mostró diferencias significativas entre sí, incluyendo 4.90 (n =
744), 5.08 (n = 740), 5.30 (n = 745), 5.57 (n = 740) y 5,99 (n = 720), respectivamente. El estabilizador de
pH del medio MES demostró su capacidad para evitar que el pH del medio caiga en los extremos superior
o inferior de los niveles iniciales de pH. Dentro de los genotipos individuales, tanto el tipo de medio
como el tiempo de incubación mostraron efectos significativos sobre el pH del medio para todos los
genotipos ( P= 0,000).
 Abrir en una ventana separada
Figura 2.
El pH del medio cambia durante los tiempos de incubación de tres genotipos en medios mDCR y
mDCR + MES.

Los genotipos incluyeron un genotipo maduro, PS-2 y dos genotipos juveniles, HF205 y HF210. Después de
la esterilización y disección de la superficie, los brotes vegetativos internos de los tres genotipos anteriores se
colocaron en medio mDCR o mDCR + MES para una incubación de hasta 42 días. Estos brotes se incubaron
en una cámara de cultivo a 25 ° C con un régimen de luz ajustado a 16 horas de luz seguido de 8 horas de
oscuridad cada día. El pH del medio se registró usando un medidor de pH cuando la muestra alcanzó cada
requisito de incubación donde se registraron cinco valores de pH dentro de cada placa de Petri. Los puntos de
datos representan el pH medio. Consulte Conjunto de datos 2 y Conjunto de datos 3 para obtener los datos
sin procesar.

El efecto de MES sobre el crecimiento de explantes

Para la respuesta de crecimiento de los explantes, el genotipo ( P = 0,000), el tiempo de incubación ( P =
0,000) y el pH inicial ( P = 0,012) mostraron efectos significativos sobre el incremento del peso del
explante (mg). La adición de MES a los medios no mostró un efecto significativo en el incremento del
peso del explante ( P = 0.281) ( figura 3). En general, el genotipo HF210 (30,86 mg, n = 264) y PS-2
(22,50 mg, n = 190) tuvieron un incremento de peso significativamente mayor que el genotipo HF205
(13,83 mg, n = 205) ( P = 0,000). El incremento de peso del explante de HF210 no mostró una diferencia
significativa en comparación con PS-2 ( P = 0,2903). Sin embargo, se observó una tendencia clara en la
disminución del peso del explante después de 28 días de incubación en medio solo mDCR para HF210.
El pH del medio inicial de 3.6 produjo un cambio de peso de la yema significativamente mayor ( P =
0.005) que el pH del medio 7.8 (25.89 vs 19.23 mg, n = 134 vs 130, respectivamente). Aunque se observó
una tendencia creciente en el cambio de peso del explante de yemas, el peso de las yemas no mostró
aumentos significativos durante la primera semana de incubación.

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Figura 3.
Cambios medios en el incremento de peso del explante (mg) entre genotipos y tipos de medio en cada
nivel de pH inicial.

Los genotipos incluyeron un genotipo maduro, PS-2, y dos genotipos juveniles, HF205 y HF210. Después de
la esterilización y disección de la superficie, los brotes vegetativos internos de los tres genotipos anteriores se
colocaron en medio mDCR o mDCR + MES en cada nivel de pH inicial (3.6, 5.1, 5.7, 6.3 y 7.8) para una
incubación de hasta 42 días. Las yemas se incubaron en una cámara de crecimiento a 25 ° C con un régimen
de luz ajustado a 16 horas de luz seguido de 8 horas de oscuridad cada día. El cambio de peso de las yemas
se registró usando una balanza electrónica cuando las muestras alcanzaron cada punto de tiempo de
incubación. Los puntos de datos representan el incremento de peso medio (mg). Consulte el conjunto de
datos 4 para conocer los datos sin procesar.
Al comparar los genotipos individuales, el tipo medio mostró efectos no significativos sobre el
incremento del peso del explante de los tres genotipos ( P > 0.05). Para el HF205, las diferencias de peso
se observaron solo en los extremos superior e inferior de los niveles iniciales de pH dados ( Figura 4). El
tiempo de incubación mostró un efecto significativo sobre el incremento del peso del explante para los
tres genotipos ( P = 0,000). Para los tres genotipos, el peso del explante no mostró diferencias
significativas durante los primeros 7 días de incubación. Sin embargo, posteriormente, el crecimiento del
peso del explante aumentó drásticamente para los genotipos PS-2 y HF210. HF205 mostró un incremento
de peso mucho menor que los otros dos genotipos ( Figura 5).

Abrir en una ventana separada

Figura 4.
El incremento medio del peso del explante cambia (mg) entre los tipos de medio en cada nivel de pH
inicial de HF205.

Después de la esterilización y disección de la superficie, los brotes vegetativos internos de HF205 se

colocaron en medio mDCR o mDCR + MES a cada nivel de pH inicial (3,6, 5,1, 5,7, 6,3 y 7,8) para una
incubación de hasta 42 días. Estos brotes se incubaron en una cámara de cultivo a 25 ° C con un régimen de
luz ajustado a 16 horas de luz seguido de 8 horas de oscuridad cada día. El cambio de peso de las yemas se
registró utilizando una balanza electrónica cuando la muestra alcanzó cada punto de incubación. Las barras
verticales representan el cambio de peso medio (mg) ± SE Las medias que comparten la misma letra indican
una diferencia no significativa entre las medias ( P > 0,05). Se utilizó la comparación múltiple de Tukey
(HSD).
 Figura 5.
Cambios medios en el peso del explante (mg) durante los tiempos de incubación de PS-2, HF205 y
HF210.

Después de la esterilización y disección de la superficie, se colocaron yemas vegetativas internas de tres

genotipos en medio mDCR o mDCR + MES a cada nivel de pH inicial (3.6, 5.1, 5.7, 6.3 y 7.8) para la
incubación hasta 42 días. Estos brotes se incubaron en una cámara de cultivo a 25 ° C con un régimen de luz
ajustado a 16 horas de luz seguido de 8 horas de oscuridad cada día. El cambio de peso de las yemas se
registró utilizando una balanza electrónica cuando la muestra alcanzó cada punto de tiempo de incubación.
Las barras verticales representan el cambio de peso medio (mg) ± SE Los tamaños de las muestras de
acuerdo con el tiempo de incubación (1 a 42 días) fueron para HF205, n = 45, 15, 15, 30, 30, 20, 20 y 30,
para HF210, n = 30, 30, 30, 30, 30, 31, 30, 38 y 15, y para PS-2, n = 15, 30, 30, 30, 30, 16, 33 y 6. Significa
compartir lo mismo La letra indica diferencia no significativa entre medias ( P> 0,05). Se utilizó la
comparación múltiple de Tukey (HSD). Consulte el conjunto de datos 4 para conocer los datos sin procesar.

Observaciones morfológicas de explantes

Después de crecer en medio durante 28 días o más sin subcultivar, los explantes mostraron varias
deformidades de crecimiento como clorosis, expansión retardada de la aguja, oscurecimiento de la punta,
oscurecimiento del fondo de los explantes y medio circundante, vitrificación e incluso muerte. Estos
síntomas ocurrieron especialmente en los extremos inferior y superior de los niveles de pH iniciales,
después de un cultivo prolongado. Independientemente de los niveles de pH iniciales dados, el
crecimiento del explante no mostró un retraso evidente en las primeras etapas de cultivo. Las
deformidades mencionadas solo se encontraron en los períodos más largos de cultivo. La condensación de
humedad era un problema común en el sistema de cultivo de tejidos basado en placas. Algunas de las
deformidades observadas pueden haber estado asociadas con una cantidad excesiva de gotas de agua que
caen sobre la superficie del medio o entran en contacto con los explantes.
Discusión
En general, el medio mDCR con MES proporcionó más estabilidad de los valores de pH preajustados
después del autoclave tanto en ausencia como en presencia de explantes en el medio. Observamos que
después del autoclave, el pH del medio cambió, pero el medio mDCR con MES mostró una menor
fluctuación del pH del medio que sin MES. El almacenamiento del medio en la oscuridad dio como
resultado una menor fluctuación del pH del medio que el almacenamiento a la luz. Para el medio mDCR
incubado con explantes, el pH mostró una disminución gradual que fue seguida por un fuerte aumento
durante el tiempo de incubación. Sin embargo, el medio mDCR + MES mostró una disminución más
lenta del pH o fue seguido por un cambio de pH del medio convergente para todos los niveles de pH
preajustados. La ganancia de peso del explante con el tiempo mostró una relación inversa con el cambio
de pH medio, pero también difirió entre los genotipos juveniles y maduros. La adición de MES no mostró
una influencia significativa sobre el crecimiento del peso del explante. Sin embargo, se observó una clara
disminución en el crecimiento del peso del explante después de 28 días de incubación en el medio solo
mDCR.

El almacenamiento medio es una práctica común en el cultivo de tejidos. El uso de medio prefabricado
tiene dos propósitos principales. Una es mantener el medio durante un período de tiempo para observar si
se produce alguna contaminación en el medio. Esto asegura el máximo rendimiento de crecimiento del
explante logrado cuando no hay antibióticos presentes en el medio. El otro propósito es facilitar los
arreglos oportunos de iniciaciones y transferencias culturales de rutina. Owen y col. (1991) demostraron
que la luz afecta el almacenamiento del medio posterior al autoclave, lo que resulta en una reducción del
pH del medio durante el tiempo de almacenamiento. Nuestros datos confirmaron sus hallazgos. El pH del
medio fue más estable en la oscuridad, independientemente de la presencia de MES. La adición de MES
podría estabilizar el pH del medio en condiciones de luz, tanto en presencia como en ausencia de
explantes.

La fluctuación del pH del medio puede verse influenciada por muchos factores. La hidrólisis, la
degradación enzimática, la fotooxidación y la fotólisis de los componentes del medio sensibles a la luz
pueden contribuir a la fluctuación del pH del medio. La hidrólisis de sacarosa a menudo requiere la
división de las moléculas de agua y la ruptura de los enlaces glicosídicos de los disacáridos. Una vez que
se ha producido la ruptura de los enlaces glicosídicos, los iones de hidrógeno de la división de las
moléculas de agua se unen a la glucosa, mientras que los grupos hidroxilo se unen a la fructosa. Dado que
el medio de cultivo de tejidos a menudo se ajusta a condiciones ligeramente ácidas (pH 5,2 a 5,8), el
autoclave proporciona una temperatura adecuada para catalizar la hidrólisis de sacarosa. Se informó que
la hidrólisis de sacarosa autocatalizada facilitada por ácido depende tanto del pH como de la temperatura,
donde un pH más bajo a una temperatura determinada promueve una mayor hidrólisis de sacarosa ( Heidt
y col. , 1952 ; Wann y col. , 1997 ). La disponibilidad de iones de hidrógeno en la solución del medio
ácido también depende de la capacidad amortiguadora de los componentes de los nutrientes ( Thorpe et
al. , 2008 ). Además, las fuentes de carbono, la cantidad de carbohidratos y los agentes gelificantes actúan
juntos para determinar la cantidad de hidrólisis de sacarosa y el pH del medio después del autoclave.
Como resultado, el medio con un pH original más bajo puede volverse más alto, mientras que el medio
con un pH original más alto puede volverse más bajo para alcanzar el equilibrio de la solución.

Una vez que los explantes se introducen en los recipientes del medio, la sacarosa se convierte en
monosacáridos inter e intracelularmente mediante invertasa u otras enzimas vegetales ( Thorpe et al. ,
2008 ). Egger y Hampp (1993) encontraron que la actividad óptima de la invertasa ácida soluble estaba a
pH 4.1 en abeto en desarrollo ( Picea abies(L.) Karst.) Agujas. También informaron que otras enzimas de
síntesis de sacarosa, sacarosa fosfato sintasa y sacarosa sintasa, eran dependientes del pH para sus
actividades óptimas (pH 7,7 y 6,7, respectivamente). Por tanto, como los explantes albergan numerosas
actividades biológicas, deben equilibrar los niveles de pH en consecuencia para cada una de las
reacciones bioquímicas. La absorción y liberación de iones se convierte en el mecanismo por el cual las
células se ajustan a los requisitos de pH. Dodds y Roberts (1995) atribuyeron que la fluctuación del pH
medio después del autoclave puede ser el resultado de un desequilibrio de la absorción de aniones y
cationes.

La fotoquímica puede inducir aún más la degradación de compuestos fotosensibles en el medio y

desencadenar la fluctuación del pH. La fotólisis es un evento introducido por fotones. Por ejemplo,
cuando una molécula de agua recibe energía de los fotones durante el proceso de fotosíntesis, se produce
la fotólisis para generar electrones, iones de hidrógeno y oxígeno. Si los iones de hidrógeno libres no se
unen a otros sustratos y se excretan en el medio, pueden causar una fluctuación del pH del medio.
Hangarter y Stasinopoulos (1991) informaron de una fotooxidación de EDTA catalizada por Fe inducida
por luz, que provocó un crecimiento reducido de las raíces de Arabidopsis thalianaecotipo Columbia. Se
considera que el EDTA, un quelante de iones, es un agente tampón en el medio de cultivo de tejidos.
Después de que ocurrió la fotooxidación, se producen formaldehído y ácido glioxílico, que pueden ser
tóxicos para los explantes, junto con un aumento de óxido férrico quelado que los explantes no pueden
usar fácilmente. Este cambio inducido por la luz de la capacidad amortiguadora definitivamente podría
alterar la disponibilidad de nutrientes en el medio y afectar aún más la fluctuación del pH del medio.

MES se puede utilizar para estabilizar el pH medio para la micropropagación de abeto de Douglas. MES
se ha empleado en varios sistemas de cultivo de tejidos para mantener estable el pH del medio durante
tiempos de cultivo prolongados. Park & Son (1992) informaron de la adición de MES solo en el medio, o
junto con Ditiotreitol, aumento del rendimiento de protoplasto y viabilidad del sistema de cultivo de
protoplasto de álamo híbrido. De manera similar, se encontró que MES y arabinogalactano-proteína, solos
o combinados, mantienen un pH medio adecuado y mejoran la embriogénesis en el sistema de cultivo de
microesporas de col blanca ( Brassica oleracea var. Capitata ) ( Yuan et al. , 2012 ). Para las especies de
coníferas, MES también se utilizó como estabilizador de pH para abeto plateado ( Abies albaL.) (
Hartmann et al. , 1992 ), abeto blanco ( Picea glauca (Moench) Voss) ( Wilson et al. , 1989 ) y alerce
europeo ( Larix decidua Mill.) ( Korlach & Zoglauer, 1995) sistemas de cultivo de protoplastos. Los
protoplastos, al ser una sola célula sin pared celular, probablemente sean extremadamente sensibles a los
cambios rápidos de pH. Los efectos de los cambios de pH podrían ser tan importantes para el cultivo de
brotes u otras perspectivas de cultivo de tejidos para la productividad del explante. MES puede ser
especialmente importante para mantener estable el pH del medio para la preparación del medio a granel
en proyectos de propagación a gran escala. Una evaluación adicional de las relaciones dosis-respuesta de
MES y la determinación de la concentración óptima de MES podrían beneficiar el desarrollo del sistema
de micropropagación de abeto de Douglas, aunque se ha informado previamente de una amplia gama de
concentraciones de MES exitosas para el abeto de Douglas y otras coníferas ( Thorpe et al. , 2008 ).

En general, nuestros resultados sugieren que una práctica de subcultivo de 21 días puede ser más
adecuada para mantener una frescura media, un nivel de pH medio y un crecimiento de explantes
deseable para el cultivo de brotes de abeto de Douglas. El incremento de peso del explante en varios
niveles de pH del medio preajustado dependía del genotipo. Una evaluación más amplia que incluya más
genotipos podría proporcionar un apoyo más fuerte o más específico para tales interacciones genotipo-
cultivo, aunque este es un factor generalmente bien conocido y esperado en el cultivo de tejidos vegetales
( Thorpe et al. , 2008 ). Por lo general, el incremento del peso del explante exhibió una relación curvilínea
con el pH a lo largo del tiempo in vitro.. Sin embargo, después de 28 días observamos una disminución
del aumento de peso en el genotipo HF210 en mDCR y un cese del aumento de peso en el genotipo
HF205 en ambos medios. Si esta disminución del crecimiento está asociada con el agotamiento de
nutrientes, la degradación de los PGR, el pH medio o una combinación de estos factores, se puede
resolver mediante evaluaciones adicionales del sistema de cultivo de tejidos de abeto de Douglas. Sin
embargo, en base a la fluctuación del pH medio después de la presencia de explantes y observaciones
morfológicas en los explantes, el cultivo prolongado sin subcultivo podría resultar en complicaciones de
crecimiento no deseadas. Por lo tanto, sugerimos subcultivar a los 21 días para el abeto de Douglas como
una mejor práctica de manejo. Aunque puede haber requisitos de pH específicos para especies
individuales, los explantes de genotipos de abeto de Douglas mostraron diversas respuestas o
adaptaciones a los cambios de pH medios. Algunos genotipos pueden tolerar o adaptarse mejor a las
fluctuaciones en el pH medio y mostrar un crecimiento continuo en una amplia gama de niveles de pH.
Los efectos de la MES y la adquisición de nutrientes por explantes en cultivo pueden requerir más
investigaciones sobre aspectos específicos de la dinámica de nutrientes con respecto a los efectos tanto
del medio como de los explantes. in vitro .

Disponibilidad de datos
Los datos a los que se hace referencia en este artículo están protegidos por derechos de autor con la
siguiente declaración de derechos de autor: Copyright: © 2015 Chen CC et al.

Los datos asociados con el artículo están disponibles bajo los términos de la renuncia de datos Creative
Commons Zero "Sin derechos reservados" (CC0 1.0 Dedicación de dominio público).
http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/

Figshare: http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1257689 ( Chen et al. , 2014 ).

Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer a Eric Dice y a todos los miembros del grupo de cultivo de tejidos del
laboratorio JEC por su ayuda en los trabajos de cultivo de tejidos. Gracias también a los Dres. Henry
Gerhold, Larry Kuhns, Haiying Liang, James Sellmer y Abdoulaye Traore por sus valiosos comentarios y
sugerencias, y por proporcionar materiales vegetales.

Notas
[versión 2; árbitros: 2 aprobados]

Declaración de financiación
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Agricultura de Pensilvania (número de concesión PDA
ME 446711 a JEC) y el Centro Schatz de Genética Molecular de Árboles de la Universidad Estatal de
Pensilvania.

Referencias

1. Ballarin-Denti A, Antoniotti D: Un enfoque experimental para la medición del pH en el espacio

libre intercelular de tejidos vegetales superiores. Experientia. 1991; 47 ( 5 ): 478–482. 10.1007 /
BF01959949 [ CrossRef ] [ Google Académico ]
2. Chen CC, Bates R, Carlson J: pH de los medios y cambios en el peso del explante durante los
tiempos de incubación para cultivos de brotes de abeto Douglas ( Pseudotsuga menziesii )
desarrollados en diferentes medios. Figshare. 2014. Fuente de datos [ artículo gratuito de PMC ] [
PubMed ] [ Google Scholar ]
3. de Klerk GJ, Hanecakova J, Jasik J: Efecto del pH medio y MES en la formación de raíces
adventicias de los discos del tallo de la manzana. Cultivo de órganos de tejidos de células
vegetales. 2008; 95 ( 3 ): 285-292. 10.1007 / s11240-008-9442-5 [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
4. Dodds JH, Roberts LW: Experimentos en cultivo de tejidos vegetales . (Cambridge University
Press, Nueva York) 1995. Fuente de referencia [ Google Scholar ]
5. Dörnenburg H, Knorr D: Estrategias para la mejora de la producción de metabolitos secundarios en
cultivos de células vegetales. Enzym Microb Technol. 1995; 17 ( 8 ): 674–684. 10.1016 / 0141-0229
(94) 00108-4 [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
 6. Egger B, Hampp R: invertasa, sacarosa sintasa y sacarosa fosfato sintasa en agujas de abeto
liofilizadas; Ensayos de lectores de microplacas. Árboles 1993; 7 ( 6 ): 98–103. 10.1007 /
BF00225476 [ CrossRef ] [ Google Académico ]
7. Gerhold HD: Transferencia de los resultados de la investigación genética a los usuarios: el estado
de Pennsylvania colabora con Pennsylvania-TIP [Programa de mejoramiento de árboles, Pinus
sylvestris, Pseudotsuga menziesii ]. Soy Christmas Tree J (Estados Unidos). 1984; 28 ( 2 ): 51–54.
Fuente de referencia [ Google Scholar ]
8. Gupta PK, Durzan DJ: multiplicación de brotes de árboles maduros de abeto de Douglas
(Pseudotsuga menziesii) y pino de azúcar (Pinus lambertiana) . Plant Cell Rep. 1985; 4 ( 4 ): 177-
179. 10.1007 / BF00269282 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Académico ]
9. Gupta PK, Durzan DJ: Establecimiento y multiplicación in vitro de abeto de Douglas y pino de
azúcar juveniles y maduros. Acta Hortic. 1987a; 212 : 483–487. Fuente de referencia
[ Google Scholar ]
10. Gupta PK, Durzan DJ: Micropropagación y especificidad de fase en abeto Douglas de élite maduro.
J Am Soc Hortic Sci. 1987b; 112 ( 6 ): 969–971. Fuente de referencia [ Google Scholar ]
11. Hangarter RP, Stasinopoulos TC: Efecto de la fotooxidación catalizada por Fe de EDTA sobre el
crecimiento de raíces en medios de cultivo de plantas. Plant Physiol. 1991; 96 ( 3 ): 843–847.
10.1104 / pp.96.3.843 [ artículo gratuito de PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
12. Hartmann S, Lang H, Reuther G: diferenciación de embriones somáticos de protoplastos aislados
de cultivos en suspensión embriogénica de Abies alba L. Plant Cell Rep. 1992; 11 ( 11 ): 554–557.
10.1007 / BF00233091 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
13. Heidt LJ, William Southam F, Sullivan EA: hidrólisis autocatalizada de sacarosa por ácido. J Am
Chem Soc. 1952; 74 ( 9 ): 2377–2378. 10.1021 / ja01129a507 [ CrossRef ] [ Google Académico ]
14. Höfer M, Touraev A, Heberle-Bors E: Inducción de la embriogénesis de microsporas de manzana
aisladas. Plant Cell Rep. 1999; 18 ( 12 ): 1012–1017. 10.1007 / s002990050700 [ CrossRef ]
[ Google Scholar ]
15. Korlach J, Zoglauer K: Patrones de desarrollo durante la embriogénesis somática directa en
cultivos de protoplastos de alerce europeo ( Larix decidua Mill.). Plant Cell Rep. 1995; 15 ( 3–4 ):
242–247. 10.1007 / BF00193728 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
16. Lager I, Andreasson O, Dunbar TL, et al. : Los cambios en el pH externo alteran rápidamente la
expresión génica de la planta y modulan las respuestas de auxina y elicitor. Entorno de células
vegetales. 2010; 33 ( 9 ): 1513-1528. 10.1111 / j.1365-3040.2010.02161.x
[ artículo gratuito de PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
17. Leifert C, Pryce S, Lumsden PJ y col. : Efecto de la acidez media sobre el crecimiento y
enraizamiento de diferentes especies vegetales que crecen in vitro . Cultivo de órganos de tejidos de
células vegetales. 1992; 30 ( 3 ): 171-179. 10.1007 / BF00040019 [ CrossRef ]
[ Google Académico ]
18. Murashige T, Skoog F: un medio revisado para un crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de
tejido de tabaco. Planta Physiol. 1962; 15 ( 3 ): 473–497. 10.1111 / j.1399-3054.1962.tb08052.x [
CrossRef ] [ Google Académico ]
19. Ogaki M, Furuichi Y, Kuroda K, et al. : Importancia del pH del medio de cultivo conjunto para la
transformación exitosa de Lilium x formolongi mediada por Agrobacterium . Plant Cell Rep. 2008;
27 ( 4 ): 699–705. 10.1007 / s00299-007-0481-x [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
20. Owen HR, Wengerd D, Miller AR: El pH del medio de cultivo está influenciado por el medio basal,
la fuente de carbohidratos, el agente gelificante, el carbón activado y el método de almacenamiento
del medio. Plant Cell Rep. 1991; 10 ( 11 ): 583–586. 10.1007 / BF00232516 [ PubMed ] [ CrossRef
] [ Google Académico ]
21. Parfitt DE, Almehdi AA, Bloksberg LN: Uso de tampones orgánicos en sistemas de cultivo de
tejidos vegetales. Sci Hortic. 1988; 36 ( 3–4 ): 157–163. 10.1016 / 0304-4238 (88) 90049-0 [
CrossRef ] [ Google Académico ]
 22. Park YG, Son SH: Regeneración de brotes in vitro a partir de protoplastos de mesófilo foliar de
álamo híbrido ( Populus nigra x P. maximowiczil ). Plant Cell Rep. 1992; 11 ( 1 ): 2–6. 10.1007 /
BF00231829 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
23. Pullman GS, Johnson S, Van Tassel S, et al. : Embriogénesis somática en pino piñonero ( Pinus
taeda ) y abeto Douglas ( Pseudotsuga menziesii ): mejora el inicio y el crecimiento del cultivo con
tampón de pH MES, biotina y ácido fólico. Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales.
2005; 80 ( 1 ): 91–103. 10.1007 / s11240-004-9099-7 [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
24. Ramage CM, Williams RR: Nutrición mineral y morfogénesis de plantas. In Vitro Cell Dev Biol -
Planta. 2002; 38 ( 2 ): 116-124. 10.1079 / IVP2001269 [ CrossRef ] [ Google Académico ]
25. Rai GK, Rai NP, Kumar S y col. : Efectos del medio de germinación de la edad del explante, los
parámetros de precultivo, el medio de inoculación, el pH del medio de lavado y el régimen de
selección en la transformación de tomate mediada por Agrobacterium . In Vitro Cell Dev Biol -
Planta. 2012; 48 ( 5 ): 565–578. 10.1007 / s11627-012-9442-3 [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
26. Singha S, Oberly GH, Townsend EC: Cambios en la composición de nutrientes y el pH del medio
de cultivo durante la proliferación de brotes in vitro de manzano silvestre y pera. Cultivo de
órganos de tejidos de células vegetales. 1987; 11 ( 3 ): 209–220. 10.1007 / BF00040426 [ CrossRef
] [ Google Académico ]
27. Skirvin RM, Chu MC, Mann ML, et al. : Estabilidad del pH del medio de cultivo de tejidos en
función del autoclave, el tiempo y el material vegetal cultivado. Plant Cell Rep. 1986; 5 ( 4 ): 292-
294. 10.1007 / BF00269825 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
28. Thorpe T, Stasolla C, Yeung EC, et al. : Los componentes de los medios de cultivo de tejidos
vegetales II: adiciones orgánicas, efectos osmóticos y de pH, y sistemas de soporte . En: George EF
et al. (ed), Propagación de plantas por cultivo de tejidos, tercera edición, volumen 1, antecedentes.
(Springer, Dordrecht, Países Bajos) .2008; 115-173. 10.1007 / 978-1-4020-5005-3_4 [ CrossRef ]
[ Google Scholar ]
29. Traore A, Xing Z, Bonser AL, et al. : Optimización de un protocolo de esterilización y
establecimiento in vitro de yemas vegetativas de abeto Douglas maduro. Hortsci. 2005; 40 ( 5 ):
1464–1468. Fuente de referencia [ Google Scholar ]
30. Wann SR, Veazey RL, Kaphammer J: El carbón activado no cataliza la hidrólisis de sacarosa en los
medios de cultivo de tejidos durante el autoclave. Cultivo de órganos de tejidos de células
vegetales. 1997; 50 ( 3 ): 221–224. 10.1023 / A: 1005947008637 [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
31. Williams RR, Taji AM, Winney KA: El efecto del tejido vegetal de Ptilotus sobre el pH de los
medios in vitro . Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales. 1990; 22 ( 22 ): 153-158.
10.1007 / BF00033629 [ CrossRef ] [ Google Académico ]
32. Wilson SM, Thorpe TA, Moloney MM: expresión mediada por PEG de los genes GUS y CAT en
protoplastos de cultivos en suspensión embriogénica de Picea glauca. Plant Cell Rep. 1989; 7 ( 8 ):
704–707. 10.1007 / BF00272066 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Académico ]
33. Yuan SX, Su YB, Liu YM, et al. : Efectos de pH, MES, arabinogalactano-proteínas en cultivos de
microesporas en col blanca. Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales. 2012; 110 ( 1 ): 69–
76. 10.1007 / s11240-012-0131-z [ CrossRef ] [ Google Académico ]

Aprobado
Vibha Srivastava , Árbitro 1
1 Departamento de Cultivos, Suelos y Ciencias Ambientales, Universidad de Arkansas, Fayetteville, EE. UU.

Intereses en competencia: No se revelaron intereses en competencia.

Fecha de revisión: 16 de octubre de 2015 Estado: Aprobado. doi: 10.5256 / f1000research.6947.r10838

Apruebo este manuscrito y no tengo más comentarios.

He leído esta presentación. Creo que tengo un nivel adecuado de experiencia para confirmar que tiene un
estándar científico aceptable.

Aprobado
Isabel Arrillaga , Árbitro 1
1
Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Valencia, España
Intereses en competencia: No se revelaron intereses en competencia.

Fecha de revisión: 6 de octubre de 2015. Estado: Aprobado. doi: 10.5256 / f1000research.6947.r10681

He leído esta presentación. Creo que tengo un nivel adecuado de experiencia para confirmar que tiene un
estándar científico aceptable.

Aprobado con reservas

Isabel Arrillaga , Árbitro 1
1 Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Valencia, España

Intereses en competencia: No se revelaron intereses en competencia.

Fecha de revisión: 10 de febrero de 2015. Estado: Aprobado con reservas.

doi: 10.5256 / f1000research.6323.r7619

El efecto del pH en el medio de cultivo es un factor muy importante que muchas veces no se tiene en
cuenta. Este artículo informa sobre los cambios en el pH del medio en varias ocasiones durante el proceso
de cultivo de tejidos y su efecto sobre el crecimiento de los explantes. Desde este punto de vista el
artículo es muy interesante y merece ser aceptado para su publicación. Se han estudiado en profundidad
los cambios en el pH del medio de cultivo después y antes del autoclave y durante el tiempo de cultivo
(ver cualquiera de las ediciones de la serie de libros Plant Propagation by Tissue Culture, George y
Sherrington, Exegetics, Londres).

El documento está bien escrito y los datos están bien analizados. He encontrado resultados muy
interesantes como el efecto de la luz sobre el pH del medio durante el almacenamiento que pueden ser de
interés para los colegas de tejidos vegetales.

Además, tengo algunas preguntas para dirigir a los autores.

1. ¿Por qué utilizar pH por debajo de 5 ?. La mayoría de los medios de cultivo se ajustan a un pH de
5,7 a 6,0 antes de esterilizarlos en autoclave.

2. ¿Encontraron los autores algún problema con el pH bajo y la gelificación del agar ?. En nuestra
experiencia, el pH bajo afecta la solidificación del medio.

3. Se espera el efecto de MES sobre la estabilidad del pH medio.

4. A partir de sus datos en las Figuras 3 y 5, no debería estar de acuerdo con su afirmación “La
práctica de subcultivo de 21 días puede facilitar el mantenimiento de una frescura media, un pH
medio y un crecimiento deseable del explante” (Resumen). Es cierto que el pH del medio aumentó
después de 21 días del inicio del cultivo del explante, pero también es cierto que,
 independientemente del pH del medio, los explantes aumentaron considerablemente de peso
después de 21 días en cultivo. Estos resultados deben enfatizarse y las conclusiones deben
reescribirse.

He leído esta presentación. Creo que tengo un nivel adecuado de experiencia para confirmar que es de un
estándar científico aceptable, sin embargo, tengo reservas importantes, como se describe anteriormente.

Aprobado con reservas

Vibha Srivastava , Árbitro 1
1
Departamento de Cultivos, Suelos y Ciencias Ambientales, Universidad de Arkansas, Fayetteville, EE. UU.
Intereses en competencia: No se revelaron intereses en competencia.

Fecha de revisión: 6 de febrero de 2015. Estado: Aprobado con reservas.

doi: 10.5256 / f1000research.6323.r7372

Este es un artículo descriptivo que analiza las fluctuaciones del pH en los medios de cultivo de tejidos
para la micropropagación del abeto de Douglas y evalúa el efecto de MES, un compuesto comúnmente
utilizado en los medios de cultivo de tejidos, para estabilizar el pH del medio. Se estudiaron parámetros
como el efecto del tiempo de incubación (días) y oscuridad / luz en presencia o ausencia de MES, además
de la morfología del explante (yemas) en medios MES + o -. Como se esperaba, se encontró que MES era
útil para estabilizar el pH en diferentes condiciones y, por lo tanto, se recomienda para los medios de
micropropagación de abeto de Douglas. Este documento podría ser útil para los horticultores,
especialmente aquellos que trabajan en micropropagación; sin embargo, los hallazgos de este artículo, en
mi opinión, son de conocimiento común en el campo del cultivo de tejidos.

Tengo una crítica importante sobre el diseño experimental y el análisis de datos, que me obliga a aprobar
este artículo con reservas: solo se utilizó una concentración, 2 g / L, de MES a lo largo de este estudio. No
se presentó ningún razonamiento para la selección de esta concentración en particular. MES se utiliza en
muchos medios de cultivo de tejidos a diferentes concentraciones. Si bien los autores evitan sacar
conclusiones (con respecto al papel de MES), sugieren que MES jugó un papel en la estabilización del
pH. Esta conclusión no puede fundamentarse sin una curva dosis-respuesta y la determinación de la
concentración óptima.

Una pequeña crítica que tengo está relacionada con la descripción en materiales y métodos. Los medios
de cultivo de tejidos utilizados en este estudio se denominan simplemente por el acrónimo mDCR. Pero
no se proporciona una descripción de este medio, solo se proporciona una referencia. En este documento
no queda claro si se trata de medios basados en MS / B5 / N6, y no se describe qué otros compuestos
están presentes en este medio.

He leído esta presentación. Creo que tengo un nivel adecuado de experiencia para confirmar que es de un
estándar científico aceptable, sin embargo, tengo reservas importantes, como se describe anteriormente.

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