Obtencion de Alfa Amilaza A Partir de La Cascara de Banano

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
TRABAJO DE TITULACIÓN
PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE:
INGENIERO QUÍMICO
TEMA:
“PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN
ESTADO SÓLIDO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES
(CÁSCARAS DE BANANO) UTILIZANDO BACILLUS SUBTILIS”
AUTORES:
EDDER ALEXANDER MENDOZA CAMEJO
MELANIE ALEXANDRA MARTÍNEZ VERA
DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN:

ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSC.
GUAYAQUIL, SEPTIEMBRE 2018

CARRERADE INGENIERÍA QUÍMICA ANEXO 10
UNIDAD DE TITULACIÓN
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: “PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN ESTADO
SÓLIDO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES (CÁSCARAS DE BANANO)
UTILIZANDO BACILLUS SUBTILIS”
AUTORES: MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA

MENDOZA CAMEJO EDDER ALEXANDER
TUTOR: ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO:
FECHA DE PUBLICACIÓN: SEPTIEMBRE/2018 No. DE PÁGINAS: 92
ÁREAS TEMÁTICAS: BIOTECNOLOGÍA
PALABRAS CLAVES/ ALFA AMILASA, ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, CÁSCARAS DE BANANO,
KEYWORDS: RESIDUOS AGROINDUSTRIALES
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras):
La producción creciente de residuos ya es una problemática de interés mundial, el residuo es una materia que no simboliza una utilidad
o un valor económico para el dueño, los residuos agroindustriales son una gran fuente de contaminación por lo que debe buscarse
alternativas de uso y así obtener productos de interés, siendo la biotecnología una aplicación metodológica que en nuestro país está en
desarrollo; optando por uno de sus objetivos la modificación de productos dándole un valor agregado. Existen organismos
microscópicos de uso industrial para distintos procesos en este grupo tenemos las Bacillus. En esta investigación se utilizó las cáscaras
de banano verde como sustrato y cepas de Bacillus subtilis, para la producción de la enzima alfa amilasa realizándose una serie de
estudios para determinar cual sería la temperatura, el tiempo y el pH del medio óptimo para la producción de la enzima alfa amilasa,
determinándose su actividad por el método del ácido 3, 5 dinitrosalicílico y la concentración de proteínas por el método de L owry.
Demostrándose que, a una temperatura de incubación de 35°C, un tiempo de incubación de 24 horas y a un pH
del medio de 7 se obtiene una actividad enzimática de 8,13UE/ml, respectivamente, indicando que las cáscaras
de banano verde resultaron ser un buen sustrato para realizar la fermentación en estado sólido en la producción
de la alfa amilasa.
ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: E-mail:
melanie.martinezv@ug.edu.ec
0960636953 edder.mendozac@ug.edu.ec
0986602159
CONTACTO CON LA Nombre: Universidad de Guayaquil – Facultad de Ingeniería Química

INSTITUCIÓN: Teléfono: 042- 229 - 2949
E-mail: http://www.fiq.ug.edu.ec/
I
Guayaquil, 20 de agosto del 2018

ING. SANDRA PEÑA MURILLOS, MSc.
DIRECTORA DE LA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
Ciudad. –
De mis consideraciones:
Envío a Ud. El informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación

“PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES (CÁSCARAS DE BANANO) UTILIZANDO
BACILLUS SUBTILIS” de los estudiantes MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA
con C.I. 092948131-5 y MENDOZA CAMEJO EDDER ALEXANDER con C.I.
093109129-2, indicando que han cumplido con todos los parámetros establecidos en la
normativa vigente:
 El trabajo es el resultado de una investigación.
 El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.
 El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.
 El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento.
Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del
trabajo de titulación con la respectiva calificación.
Dando por concluida esta tutoría de trabajo de titulación, CERTIFICO, para los fines
pertinentes, que los estudiantes están aptos para continuar con el proceso de revisión
final.
Atentamente,
ING. CECILIA UZCA SORNIOZA, MSc.

TUTORA DE TRABAJO DE TITULACIÓN
C.I. 092116021-4
II
III
Guayaquil, 31 de agosto de 2018
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR
Habiendo sido nombrado ING. MARINA ALVARADO, MSc., tutor del trabajo de
titulación “PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN ESTADO
SÓLIDO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES (CÁSCARAS DE BANANO)
UTILIZANDO BACILLUS SUBTILIS” certifico que el presente trabajo de titulación,
elaborado por MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA con C.I. 092948131-5 y
MENDOZA CAMEJO EDDER ALEXANDER con C.I. 093109129-2 , con mi respectiva
supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título de INGENIERO
QUÍMICO, en la carrera de Ingeniería Química/ Facultad de Ingeniería Química, ha sido
REVISADO y APROBADO en todas sus partes, encontrándose apto para su
sustentación.
ING. MARINA ALVARADO, MSc.

DOCENTE TUTOR REVISOR
C.I. 090546354-3
IV
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL

USO NO COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO
ACADÉMICOS
Nosotros, MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA con C.I. No 092948131-

5 y MENDOZA CAMEJO EDDER ALEXANDER con C.I. No. 093109129-2,
certifico que los contenidos desarrollados en este trabajo de titulación, cuyo
título es ”PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN
ESTADO SÓLIDO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES (CÁSCARAS DE
BANANO) UTILIZANDO BACILLUS SUBTILIS” son de mi absoluta propiedad
y responsabilidad Y SEGÚN EL Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA
ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E
INNOVACIÓN*, autorizo el uso de una licencia gratuita intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la presente obra con fines no
académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso del
mismo, como fuera pertinente.
_________________________ __________________________
MARTÍNEZ VERA MELANIE A. MENDOZA CAMEJO EDDER A.

C.I. No. 092948131-5 C.I. No. 093109129-2
Dic./2016) Artículo 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en las instituciones de educación superior y centros
académicos, u otros análogos, sin

perjuicio de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos patrimoniales corresponderá a los autores. Sin
embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines
académicos.
V
DEDICATORIA
Primeramente esta meta va dedicado al ser supremo, mi mayor fortaleza
Dios, y a los seres más importantes de mi vida mis padres Ricardo Martínez
Elizalde, Alexandra Vera Macías, y a mis pequeños Kaori y Lucero, esto es
para ellos.
Mélanie Alexandra Martínez Vera
VI
AGRADECIMIENTOS
Al iniciar la meta llamada Ingeniería Química, siempre le dije a Dios que
sea su voluntad, iluminándome en cada paso que proceda al aceptar
estudiar esta carrera, a Él le debo absolutamente todo.
A mis amados padres, su apoyo incondicional siempre ha estado, el esfuerzo
de ellos es único, ellos han sido los protagonistas de mis metas, Dios no se
equivocó al elegirlos como mis padres, son los mejores. Ustedes son mi
mayor motivación.
A la persona con el corazón más noble que conozco, mi gran amigo Edder
Alexander, desde el primer día de primer semestre me has apoyado, gracias
por todo amigo.
A la Ingeniera Cecilia Uzca, quien nos ha apoyado desde el principio, su
dedicación, tiempo, enseñanza ha sido incondicional, forma una parte muy
importante en la realización de este trabajo.
A los docentes que nos brindaron su apoyo, Ing. Wilfrido Terán, Ing.
Mariana Navarro.
A mi hermano, por su apoyo.
A los niños de mi corazón, Kaori y Lucero, por todo su amor.
Gracias.
Mélanie Alexandra Martínez Vera
VII
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios porque gracias a él he podido culminar mi
carrera.
A mis padres Marisol Camejo Cortéz y José Mendoza Pico por haberme
apoyado incondicionalmente en el transcurso de mi carrera universitaria.
A mi hermana Diana Mendoza.
Edder Alexander Mendoza Camejo
VIII
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por todo el esfuerzo y apoyado que me han brindado en toda
mi formación profesional.
A mis tías por haberme apoyado en el transcurso de mi carrera.
A la Ing. Cecilia Uzca Sornoza por su apoyo, colaboración y asesoramiento
en la realización de nuestro trabajo de titulación
Al Ing. Wilfrido Terán Verzola y a la Ing. Mariana Navarro Almeida por
habernos brindado su apoyo en la realización de esta investigación.
A mi compañera de tesis Mélanie Martínez por haberme brindado su
amistad y confianza a lo largo de nuestra carrera universitaria.
Edder Alexander Mendoza Camejo
IX
ÍNDICE
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA ..................................... I

CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD .............................................................. III
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR ......................................................................IV
LICENCIAGRATUITAINTRANSFERIBLEYNOEXCLUSIVAPARAELUSONO COMERCIAL DE LA
OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS ............................................................................V
DEDICATORIA ........................................................................................................VI
AGRADECIMIENTOS .............................................................................................VII
DEDICATORIA ......................................................................................................VIII
AGRADECIMIENTOS ..............................................................................................IX
ÍNDICE ......................................................................................................................X
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................XIII
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................. XIV
RESUMEN ............................................................................................................. XV
ABSTRACT .......................................................................................................... XVI
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ....................................................................................................... 3
EL PROBLEMA ................................................................................................. 3
1.1 Planteamiento del problema........................................................................................ 3
1.2 Formulación y sistematización de la investigación ................................... 3

1.2.1 Formulación del problema de investigación ................................................................ 3
1.2.2 Sistematización del problema de investigación .............................................................. 4
1.3 Justificación de la Investigación ................................................................. 4

1.3.1 Justificación teórica ..................................................................................................... 4
1.3.2 Justificación metodológica .......................................................................................... 4
1.3.3 Justificación práctica ................................................................................................... 5
1.4 Objetivos de la Investigación....................................................................... 6

1.4.1 Objetivo general .......................................................................................................... 6
1.4.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 6
1.5 Delimitación de la investigación .................................................................. 6

1.5.1 Delimitación Temporal ................................................................................................. 6
1.5.2 Delimitación Espacial .................................................................................................. 7
1.5.3 Delimitación del Contenido .......................................................................................... 7
1.6 Hipótesis ....................................................................................................... 7

1.6.1 Variables Independientes ............................................................................................ 7
1.6.2 Variables Dependientes .............................................................................................. 8
X
1.6.3 Operacionalización de las variables ............................................................................ 9
CAPÍTULO II .................................................................................................... 10
MARCO REFERENCIAL ................................................................................. 10
2.1 Marco Teórico............................................................................................................ 10
2.1.1 Enzimas Amilasas ..................................................................................................... 10
Clasificación. ............................................................................................................. 10
Alfa amilasa. ........................................................................................................... 11
Beta amilasa ........................................................................................................... 13
Glucoamilasa ......................................................................................................... 13
Pululanasa. ............................................................................................................. 14
Aplicaciones de la amilasa en la industria ............................................................. 14
Conversión del almidón. ....................................................................................... 14
Industria de los detergentes. ............................................................................... 17
Producción de alcohol combustible .................................................................... 17
Industria alimenticia .............................................................................................. 18
Industria Textil ....................................................................................................... 18
Producción de enzimas por fermentación sólida. ................................................. 19
2.1.2 Residuos agroindustriales ......................................................................................... 20
2.1.3 Producción del banano en Ecuador .......................................................................... 21
2.1.4 Banano ...................................................................................................................... 22
Composición química del banano ........................................................................... 23
Cáscaras de banano ................................................................................................. 24
Composición química de la cáscara de banano ................................................ 25
Usos de la cáscara de banano ............................................................................. 25
2.2 Marco Conceptual ..................................................................................................... 26
2.2.1 Enzimas ..................................................................................................................... 26
2.2.2 Bacillus ...................................................................................................................... 26
2.2.3 Bacillus subtilis .......................................................................................................... 27
2.2.4 Método del ácido 3,5 Dinitrosalisílico (DNS) ............................................................. 27
2.2.5 Valoración de proteínas por el método de Lowry...................................................... 28
2.3 Marco Contextual ...................................................................................................... 28
CAPÍTULO III ................................................................................................... 30

MARCO METODOLÓGICO ............................................................................. 30
3.1 Nivel de investigación ................................................................................ 30
3.2 Diseño de investigación ............................................................................. 30
3.3 Metodología de la investigación ................................................................ 30
3.4 Materiales y equipos .................................................................................. 31
3.5 Diseño experimental ................................................................................... 32
3.5.1 Aislamiento de las bacterias ...................................................................................... 32
3.5.2 Preparación del sustrato ........................................................................................... 33
3.5.3 Determinación del contenido de humedad del sustrato ............................................ 33
3.5.4 Preparación del inóculo ............................................................................................. 34
3.5.5 Fermentación en estado sólido ................................................................................. 34
3.5.6 Producción de la enzima alfa amilasa ....................................................................... 35
3.5.7 Extracción de la enzima ............................................................................................ 36
3.5.8 Determinación de la actividad enzimática ................................................................. 36
XI
3.5.9 Determinación de la concentración de proteínas ...................................................... 41
3.5.10 Determinación de la Estabilidad Operacional ........................................................... 44
3.5.11 Comparación de la actividad enzimática de la alfa amilasa a partir de las cáscaras
de banano verde con la alfa amilasa obtenida del almidón de papa ..................................... 45
3.5.11.1 Fermentación en estado sólido ........................................................................... 45
CAPÍTULO IV................................................................................................... 47
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................ 47
4.1 Resultados .................................................................................................. 47
4.1.1 Determinación del contenido de humedad del sustrato ............................................ 47
4.1.2 Determinación de la actividad enzimática ................................................................. 47
4.1.3 Determinación de la concentración de proteínas ...................................................... 50
4.1.4 Estabilidad Operacional de la enzima alfa amilasa................................................... 52
4.1.5 Rendimiento .............................................................................................................. 53
4.2 Discusión de los resultados ...................................................................... 54

CAPÍTULO V.................................................................................................... 59
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................... 59
5.1 Conclusiones .............................................................................................. 59
5.2 Recomendaciones ...................................................................................... 60
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 61
ANEXOS .......................................................................................................... 70
Anexo 1.1 Preparación del sustrato .................................................................... 70
Anexo 1.2. Aislamiento de las cepas de Bacillus sp. ......................................... 71
Anexo 1.3 Preparación del inóculo ..................................................................... 72
Anexo 1.4 Fermentación en estado sólido .......................................................... 72
Anexo 1.5 Extracción de la enzima ...................................................................... 73
Anexo 1.6 Determinación de la actividad enzimática ......................................... 74
Anexo 1.7 Determinación de la concentración de proteínas.............................. 75
Anexo 1.8 Extracto curdo enzimático .................................................................. 75
XII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura α-amilasa. .................................................................................... 12

Figura 2 Estructura de la Amilosa ............................................................................... 15
Figura 3 Estructura de la amilopectina ........................................................................ 16
Figura 4 Banano Ecuatoriano ..................................................................................... 23
Figura 5 Grado de Maduración del banano ................................................................. 24
Figura 6 Gráfica de calibrado para la determinación de la actividad enzimática ......... 39
Figura 7. Gráfica de curva de calibrado para determinación de proteínas................... 43
Figura 8. Efecto del tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa amilasa.
................................................................................................................................... 47
Figura 9 Efecto del tiempo de incubación en la producción de la enzima
alfa amilasa ................................................................................................................ 48
Figura 10 Efecto del pH del medio de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa…………………………………………………………………………………………48
Figura 11. Efecto del tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa amilasa
................................................................................................................................... 50
Figura 12 Efecto de la temperatura de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa ....................................................................................................................... 50
Figura 13 Efecto del pH del medio de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa ....................................................................................................................... 51
Figura 14 Estabilidad operacional de la enzima alfa amilasa (Cáscaras de banano) . 52
Figura 15 Estabilidad operacional de la enzima alfa amilasa (Almidón de papa) ........ 53
XIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Operacionalización de las variables ................................................................ 9

Tabla 2 Composición química del banano .................................................................. 23
Tabla 3 Composición química de la cáscara del banano ............................................ 25
Tabla 4 Materiales y equipos requeridos..................................................................... 31
Tabla 5 Condiciones de operación para la producción de la enzima alfa amilasa ....... 35
Tabla 6 Volúmenes de solución de glucosa, agua destilada y reactivo DNS ............... 38
Tabla 7 Cuantificación de la actividad enzimática ....................................................... 41
Tabla 8 Volúmenes de agua, solución patrón de BSA, Reactivo de Lowry y Folin-
Ciocalteau diluido ....................................................................................................... 43
Tabla 9 Condiciones de operación para determinar la estabilidad operacional de la
enzima alfa amilasa .................................................................................................... 45
XIV
“PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN

ESTADO SÓLIDO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES
(CÁSCARAS DE BANANO) UTILIZANDO BACILLUS SUBTILIS”
Autores: Martínez Vera Melanie Alexandra, Mendoza Camejo Edder Alexander
Tutor (a): Ing. Cecilia Uzca Sornoza, MSc.
RESUMEN
La producción creciente de residuos ya es una problemática de interés mundial,

el residuo es una materia que no simboliza una utilidad o un valor económico
para el dueño, los residuos agroindustriales son una gran fuente de
contaminación por lo que debe buscarse alternativas de uso y así obtener
productos de interés, siendo la biotecnología una aplicación tecnológica que en
nuestro país se encuentra en desarrollo; optando por uno de sus objetivos la
modificación de productos dándole un valor agregado. Existen organismos
microscópicos de uso industrial para distintos procesos en este grupo tenemos
las Bacillus. En esta investigación se utilizó las cáscaras de banano como
sustrato y cepas de Bacillus subtilis, para la producción de la enzima alfa
amilasa realizándose una serie de estudios para determinar cuál sería la
temperatura, el tiempo y el pH del medio óptimo para la producción de la
enzima alfa amilasa, determinándose su actividad por el método del ácido 3, 5
dinitrosalicílico o DNS y la concentración de proteínas por el método de Lowry.
Demostrándose que a una temperatura de incubación de 35°C, un tiempo de
incubación de 24 horas y a un pH del medio de 7 se obtiene una actividad
enzimática de 8,13 UE/ml, respectivamente, indicando que las cáscaras de
banano resultaron ser un buen sustrato para realizar la fermentación en estado
sólido en la producción de la enzima alfa amilasa.
Palabras claves: Alfa amilasa, actividad enzimática, cáscaras de banano,

Método del ácido 3,5 dinitrosalicílico o DNS, Residuos agroindustriales
XV
“PRODUCTION OF ALPHA AMYLASE BY SOLID STATE

FERMENTATION OF AGROINDUSTRIAL WASTE USING
BACILLUS SUBTILIS”
Authors: Martínez Vera Melanie Alexandra, Mendoza Camejo Edder Alexander
Advisor: Ing. Cecilia Uzca Sornoza, MSc.
ABSTRACT
The growing production of waste is already a problem of global interest, the

waste is a matter that does not symbolize a utility or an economic value for the
owner, the agroindustrial waste is a great source of contamination, so it must
look for alternatives of use and thus obtain products of interest, being
biotechnology a technological application that in our country is in development;
opting for one of its objectives the modification of products giving it an added
value. There are microscopic organisms for industrial use for different
processes in this group we have the Bacillus. In this research, banana peels
were used as a substrate and strains of Bacillus subtilis, for the production of
the enzyme alpha amylase. A series of studies were carried out to determine
the temperature, time and pH of the optimum medium for the production of the
alpha amylase enzyme, its activity being determined by the 3, 5 dinitrosalicylic
acid or DNS method and the concentration of proteins by the Lowry method. It
is demonstrated that at an incubation temperature of 35 ° C, an incubation time
of 24 hours and a pH of 7, an enzymatic activity of 8.13 EU / ml is obtained,
respectively, indicating that the banana peels turned out to be a good substrate
to carry out fermentation in the solid state in the production of the enzyme alpha
amylase.
Keywords: Alpha amylase, enzymatic activity, banana peels, 3.5 dinitrosalicylic

acid method or DNS, agroindustrial residues.
XVI
INTRODUCCIÓN
La biotecnología es un área multidisciplinaria que está en desarrollo y
presenta una extensa rama de usos, debido a su capacidad de convertir
residuos en productos de un alto valor agregado. En nuestro país existe una
serie de recursos potenciales que se los puede aprovechar a nivel
biotecnológico, el aprovechamiento de este representa un concepto
fundamental para el surgimiento de un país con una economía en vías de
desarrollo; la tendencia mundial está en busca de una producción más limpia,
abriendo un campo para el uso de productos biológicos estables, eficaces y
con un bajo impacto ambiental, entre estos productos se encuentran las
enzimas.
Las enzimas en la actualidad gozan de un amplio campo de aplicación, sus
fuentes de obtención son muy variadas, a nivel industrial las más importantes
son las pertenecientes a la micro fauna como bacterias y hongos.
Ecuador disfruta de condiciones climáticas excepcionales, junto con las
riquezas de sus suelos permite colocarse entre uno de los productores
agrícolas de excelente calidad. Tiene una producción muy extensa de
alimentos con elevados porcentajes de almidón como: banano, papa, plátano,
yuca, arroz, maíz y otros. La producción de banano es una de las mayores
actividades, colocándolo en el mayor productor de dicha fruta, lo cual le da la
existencia de muchas empresas generadoras de su residuo, convirtiéndose en
un problema ambiental y económico; su bajo costo y la escasa utilización
industrial, posibilitan su uso en la producción de enzimas alfa amilasa,
1
planteando una alternativa de obtención por medio de un proceso competitivo y
rentable en el país.
En los procesos de fermentación sólida estos residuos son considerados
como los mejores sustratos debido a su alto contenido de almidón y nutrientes
necesarios para el crecimiento de distintos microorganismos.
Las alfa amilasas se encuentran en el grupo de las enzimas de mayor
consumo, y de gran importancia a nivel industrial y biotecnológico, teniendo
como función degradar el almidón; es muy requerida en la industria textil,
papelera, farmacéutica, alimenticia y cervecera.
El presente trabajo tiene como objetivo producir enzimas alfa amilasas
empleando cáscaras de banano como sustrato y bacterias, especialmente las
Bacillus subtilis.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema.
La biotecnología es una aplicación tecnológica que en nuestro país se
encuentra en desarrollo; uno de sus objetivos es la modificación de productos
dándole un valor agregado.
Los residuos agroindustriales representan un problema tanto ambiental
como económico, debido al costo que representa su disposición final. Sin
embargo, estos residuos se los puede aprovechar como materia prima y así
obtener productos de interés.
Las enzimas son biocatalizadores usadas con diferentes propósitos a nivel
industrial. En Ecuador no se cuenta con los recursos necesarios para llevar a
cabo la selección, reproducción, aislamiento y purificación de las mismas.
En este proyecto se plantea la posibilidad de producir enzima alfa amilasa
por medio de la fermentación en estado sólido, aprovechando las cáscaras de
banano verde ecuatoriano, esperando obtener una actividad enzimática similar
a la alfa amilasa obtenida a partir del almidón de papa.
1.2 Formulación y sistematización de la investigación
1.2.1 Formulación del problema de investigación
¿La cáscara de banano verde ecuatoriano es un sustrato alternativo al
almidón de papa para la producción de la enzima alfa amilasa?
3
1.2.2 Sistematización del problema de investigación
¿Afectan la temperatura, el tiempo de incubación y el pH del medio en la
producción de la enzima alfa amilasa, obtenida a partir de las cáscaras de
banano verde ecuatoriano?
¿Cuál será la temperatura, el tiempo y el pH óptimo en la producción de la
enzima alfa amilasa, obtenida a partir de las cáscaras de banano verde
ecuatoriano?
1.3 Justificación de la Investigación
1.3.1 Justificación teórica
En Ecuador no existe una investigación donde se haya utilizado la bacteria
Bacillus sp. y residuos agroindustriales (cáscaras de banano) para la obtención
de alfa amilasa.
El déficit de conocimiento en esta área de investigación nos motiva a
realizar el proyecto de investigación “PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO DE DESECHOS
AGROINDUSTRIALES (CÁSCARAS DE BANANO) UTILIZANDO BACILLUS
SUBTILIS” y de esta forma dejar un nuevo aporte para esta área de
investigación.
1.3.2 Justificación metodológica
La amilasa se produce en bacterias, hongos, plantas y animales. Sin
embargo, debido a las estrategias de producción eficientes, los
microorganismos tienen un potencial sustancial para contribuir a una serie de
4
aplicaciones industriales. Dentro de los microorganismos de importancia
industrial se encuentran los del género Bacillus debido a sus tasas de
crecimiento rápido, que conducen a cortos ciclos de fermentación, a su
capacidad para secretar proteínas en un medio extracelular y a la seguridad en
el manejo general.
Se han realizado varios estudios sobre la producción de amilasa
utilizando la técnica de fermentación de estado sólido, empleando la bacteria
Bacillus subtilis y diferentes sustratos como el salvado de trigo, el salvado de
arroz, granos de lenteja, yuca, maíz y cáscaras de banano.
Esta investigación tiene como propósito la obtención de alfa amilasa a
partir de la cáscara de banano verde utilizando como microorganismo la
bacteria Bacillus sp. para lo cual se determinará la temperatura optima, el pH
optimo, la actividad enzimática, el rendimiento, la estabilidad operacional y el
efecto que produce la temperatura de incubación y el pH del medio en la
producción de la alfa amilasa.
1.3.3 Justificación práctica
La amilasa es una de las enzimas más utilizadas en las industrias, hidroliza
almidón y se usa comercialmente para la producción de jarabe de azúcar a
partir de almidón que consiste en: Glucosa, maltosa y oligosacáridos
superiores.
Las amilasas son de gran importancia en aplicaciones biotecnológicas que
van desde alimentos, fermentación, detergentes, productos farmacéuticos,
elaboración de cervezas, textiles, hasta industrias papeleras. Para satisfacer
5
las demandas más altas de estas industrias, se requiere una producción de
amilasa de bajo costo. Cabe recalcar que para la ejecución de este proyecto se
utilizarán las cáscaras de banano verde debido a que tienen una mayor
concentración de almidón, que las cáscaras de banano maduro y de esta
manera se pretende dar un valor agregado a este residuo.
1.4 Objetivos de la Investigación
1.4.1 Objetivo general
Producir alfa amilasa por fermentación en estado sólido de los residuos
agroindustriales (cáscaras de banano) utilizando Bacillus subtilis.
1.4.2 Objetivos específicos
I. Obtener alfa amilasa a partir de las cáscaras de banano verde
ecuatoriano.
II. Determinar la temperatura y pH óptimo para la producción de la enzima
alfa amilasa.
III. Caracterizar la actividad enzimática de la alfa amilasa obtenida.
IV. Definir el rendimiento y la estabilidad operacional.
1.5 Delimitación de la investigación
1.5.1 Delimitación Temporal
El desarrollo experimental y teórico de la investigación fue realizado
durante un periodo aproximado de 4 meses.
6
1.5.2 Delimitación Espacial
La investigación se desarrolló en los laboratorios de Microbiología y
Biotecnología de la Facultad de Ingeniería Química en la Universidad de
Guayaquil, llevándose a cabo la experimentación que determinó la actividad
enzimática y la estabilidad operacional de la enzima alfa amilasa obtenida a
partir de las cáscaras de banano verde y Bacillus sp.
1.5.3 Delimitación del Contenido
La investigación se desarrolló basándose en estudios biotecnológicos, en
los cuales se han utilizado una variedad de sustratos y microorganismos para
la elaboración de enzimas. Se tomó como base de referencia artículos
científicos publicados de otros países para la ejecución de esta investigación.
1.6 Hipótesis
A partir de las cáscaras de banano verde, será posible producir la enzima
alfa amilasa con una actividad enzimática similar a la alfa amilasa obtenida a
partir del almidón de papa.
1.6.1 Variables Independientes
 Condiciones de incubación (producción)
 pH
 Tiempo
 Temperatura
 Condiciones de estabilidad operacional
 Tiempo
7
 Temperatura
1.6.2 Variables Dependientes
 Actividad enzimática
 Rendimiento
8
1.6.3 Operacionalización de las variables
Tabla 1. Operacionalización de las variables
Tipo de Variable Variable Subvariable Definición Unidad de Medición

Condiciones de pH Escala de secuencia numérica indicadora de
Incubación acidez o alcalinidad de una solución acuosa. -
(producción)
Tiempo Periodo en el cual se realiza una acción o Horas (h)
acontecimiento.
Independiente Temperatura Es una magnitud que indica los niveles térmicos Grados Centígrados (°C)
presentes en un cuerpo
Condiciones de Tiempo
estabilidad Periodo en el cual se realiza una acción o Horas (h)
operacional acontecimiento.
Temperatura
Es una magnitud que indica los niveles térmicos Grados Centígrados (°C)
presentes en un cuerpo
Caracterización de Actividad Se define como la cantidad de enzima que 𝑈𝐸
Dependiente actividad enzimática cataliza un micromol de sustrato durante un 𝑚𝑙
enzimática minuto.
Rendimiento Rendimiento Es la relación entre la concentración de producto 𝑈𝐸
y la concentración de biomasa producida. 𝑔 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
UE⁄ = Unidades enzimáticas por mililitro
ml
UE⁄
g biomasa = Unidades enzimáticas por gramos de biomasa Elaborado por autores
9
CAPÍTULO II
MARCO REFERENCIAL
2.1 Marco Teórico
2.1.1 Enzimas Amilasas
Enzimas que hidrolizan las moléculas de almidón dando como producto
dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa.
Las amilasas tienen una potencial aplicación en grandes cantidades de
procesos industriales. [1] Estas enzimas se las encuentran ampliamente
distribuidas en tejidos vegetales donde desempeñan un papel importante en la
degradación del almidón en la germinación de las semillas y en tejidos
animales cumple funciones digestivas [2]. En la naturaleza se encuentran
ampliamente distribuidas, se las obtiene de animales (saliva y páncreas),
plantas (malta) y microorganismos (hongos, mohos y bacterias). [3]
Las amilasas se las emplean en el procesamiento del almidón, hidroliza
sus enlaces y obtiene productos de bajo peso molecular como la maltosa,
glucosa y unidades de maltotriosa, tiene gran importancia en el área
biotecnológico constituye cerca del 25% del mercado enzimático industrial. [4]
Clasificación.
Las amilasas se clasifican dependiendo el tipo de hidrólisis que ejerce en la
molécula de almidón, estas son:
10
Alfa amilasa.
Enzima de mayor popularidad e importancia del tipo de las amilasas
industrial, es una endo-enzima capaz de hidrolizar los enlaces glucosídicos α-
1,4 de las moléculas de amilopectina y amilosa para la obtención de
maltotriosa, maltosa y oligosacáridos de distintos tamaños. Esta enzima no
fragmenta las unidades terminales de glucosa ni los enlaces α-1,6. [5]
La participación de las alfa amilasas es la más importante para el inicio del
proceso de degradación del almidón. [6]
La actividad de las alfa amilasas depende del ión de calcio que contienen,
además este elemento estabiliza la conformación global de la enzima. [7]
La α-amilasa se la conoce como licuante puesto que disminuye de una
forma rápida la viscosidad de soluciones de almidón. Los mecanismos de
acción y propiedades de la α-amilasa en las moléculas de almidón dependerán
de las variaciones de proceso y de los microorganismos empleados para su
obtención. [8]
La α-amilasa está compuesta de una cadena polipeptídica que contiene 3
dominios: A, B Y C mostrada en la figura 1. El más grande es el dominio A,
presenta una estructura grande, en forma de barril. El dominio B se inserta
entre los dominios A y C uniéndose al dominio A, por medio de un enlace
disulfuro. El dominio C posee una estructura de hoja β que se une al dominio A,
por una cadena polipeptídica simple, siendo un dominio diferente con
desconocida función. La unión al sustrato (sitio activo) de la α-amilasa, se sitúa
11
en una larga hendidura localizada en los extremos de los dominios A y B. El
calcio (Ca2+) se encuentra entre los dominios A y B y actúa en su estabilidad.[8]
Figura 1 Estructura α-amilasa.

El dominio A se los distingue por el color rojo, el dominio B por el amarillo y el
C en púrpura. En el centro catalítico, el (Ca2+) se identifica en la esfera azul y
el ion cloruro en la esfera amarilla. Las estructuras verdes están ligadas al sitio
activo y a los sitios de unión a la superficie. [9]
La utilización de microorganismos para la producción de estas enzimas
presentan una gran ventaja, la capacidad económica y teniendo disponibilidad
de facilidad de manipulación de los mismos para la obtención de enzimas con
las características requeridas, este grupo se ha derivado de varias bacterias,
hongos y levaduras, sin embargo las de fuentes bacterianas y fúngicas
dominan su aplicación en el sector industrial. [10]
12
Las La α-amilasas de origen bacteriano son producidas especialmente por
el género Bacillus como B. subtilis, B. licheniformis, B.amyloliquefaciens y B.
stearothermophilus, estos microorganismos son conocidos por ser buenos
productores y tener una amplia aplicación en procesos industriales; las α-
amilasas termoestables son mayoritariamente de origen bacteriano. [11]
Beta amilasa
Se la define como una exo-enzima con la capacidad de romper los enlaces
glucosídicos α-1,4 del almidón en la parte externa, las unidades de maltosa
son separadas de los extremos no reductores por hidrolisis alterna de la
cadena. Su actividad es progresiva deteniéndose al momento de alcanzar una
ramificación por no poder hidrolizar los enlaces de la amilopectina y del
glucógeno α-1,6 dando lugar a la formación de β-dextrinas limitantes. Las β-
amilasas atacan a la amilosa, desde un extremo, siendo menos efectiva que la
α-amilasa. [12]
Estas enzimas tienen un grupo sulfhídrilo importante para la actividad
enzimática; son sensibles a una elevada acidez, inactivándose en pH acido.
[13]
Glucoamilasa
Enzima de acción externa, hidroliza los enlaces α-1,4 y α-1,6 perteneciente
a los extremos no reductores, produciendo su producto final, la glucosa,
partiendo de almidón y polímeros. [12]
13
Esta enzima no puede hidrolizar el almidón a glucosa debido que para la
ruptura necesita que una enzima de acción interna participe, como es el caso
de la α-amilasa.[14]
Esta enzima es estabilizada por el calcio encontrándose en la
desnaturalización por el calor, no es necesario de un activador para su
actividad. [12]
Pululanasa.
Esta enzima es desramificante, actúa sobre los enlaces de la amilopectina
α-1,6 liberando como producto único la maltosa, se las utiliza para mejorar la
sacarificación, porque elevan el rendimiento para liberar glucosa. [15]
Aplicaciones de la amilasa en la industria
Las amilasas, presentan un gran potencial de aplicación en numerosos
procesos de la industria textil, alimenticia, detergente, farmacéutica, papel y de
fermentación, con el avance de la biotecnología estas enzimas se expanden en
otras áreas como la medicina, química analítica y clínica. [16]
El uso de las amilasas en las principales industrias se las describe a
continuación:
Conversión del almidón.
El uso más importante de la α-amilasa recae en la industria del almidón,
donde se la utiliza para la hidrólisis convirtiendo el almidón en jarabe de
glucosa en el proceso de licuefacción. [17]
14
a. Almidón
Es un polímero de glucosa semicristalino, a través de un enlace
glucosídico se une a otro, está formado por amilopectina y amilosa.
Constituyente importante en la dieta humana, para cumplir este propósito es
procesado enzimáticamente y químicamente en una variedad de productos
distintos como: jarabe de glucosa, hidrolizados de almidón, derivados de la
maltodextrina, fructosa y ciclodextrinas, de la industria alimentaria. A pesar de
la cantidad de plantas capaces para producir almidón, son pocas las plantas
que se utilizan para el procesamiento industrial de este. Las principales fuentes
industriales de obtención son papa, maíz, trigo y tapioca, pero debido a las
limitaciones como la resistencia térmica, la baja resistencia al corte la tendencia
a la retrogradación y la descomposición térmica limitan su aplicación en
diferentes industrias alimentarias. [18]
La amilopectina y la amilosa tienen distintas propiedades y estructuras. La
amilosa es un polímero lineal que consta en hasta 6000 unidades de glucosa
con enlaces glucosídicos α-1,4 como se observa en la figura 2
Figura 2 Estructura de la Amilosa

La amilosa consta de hasta 6000 unidades de glucosa con enlaces
glucosídicos α-1,4[8]
15
La amilopectina consta de cadenas cortas de α-1,4 unidas a lineales de 10
a 60 unidades de glucosa y α-1,6 unidas a cadenas laterales con 15-45
unidades de glucosa, como se muestra en la figura 3
Figura 3 Estructura de la amilopectina

Constan enlaces cortos α-1,4 cadenas lineales α-1,6 y cadenas laterales con
unidades de glucosa. [8]
b. Hidrólisis ácida
El almidón se lo puede hidrolizar por ácido sulfúrico y clorhídrico y así
alcanzar la conversión del almidón a D-glucosa, esta reacción es de primer
orden y endotérmica, la acidez cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos,
se reduce el peso molecular del almidón quedando intacta la estructura
cristalina, ya que la acidez solo penetra en sus regiones amorfas.[19]
La reacción de sacarificación en su rendimiento es función de la
concentración de la acidez, almidón y temperatura, presentando serios
inconvenientes como la formación de productos no deseados, falta de equipos
16
resistentes al ácido, baja flexibilidad; por lo mencionado anteriormente las
enzimas se convierten en una excelente alternativa. [20]
c. Hidrólisis enzimática
Un gran número de amilasas de origen microbiano en la actualidad se
encuentran disponibles en el mercado industrial, reemplazando completamente
la hidrólisis química en el procesamiento de almidón. [21]
Este proceso comprende etapas de licuefacción y sacarificación. La
licuefacción es la hidrólisis parcial del almidón en dextrinas, para este proceso
se requiere de α-amilasas con la condición de que el almidón previamente se
encuentre gelatinizado; la sacarificación es la hidrólisis total del almidón,
conversión de dextrinas a glucosa, para este proceso se requieren de
glucoamilasas provenientes de Aspergillus niger. [22]
Industria de los detergentes.
Las amilasas ocupan el segundo lugar de las enzimas más utilizadas en la
fabricación de detergentes, ya que mejoran su capacidad de eliminar manchas
difíciles, haciendo que este producto sea ambientalmente seguro. Enzimas con
capacidad de degradar residuos de alimentos con alto contenido en almidón
como lo son las salsas, papas, natillas, chocolates y así obtener dextrinas y
oligosacáridos de menor tamaño. [23]
Producción de alcohol combustible
Para la producción de etanol el sustrato más empleado es el etanol, debido
a que sus materias primas están fácilmente disponibles en casi todo el mundo y
17
por su bajo precio. Para este procedimiento el almidón será solubilizado y
sometido a procesos enzimáticos con el objetivo de obtener azucares
fermentables. Ocurre primero la licuefacción utilizando α-amilasa, luego ocurre
la sacarificación, transformando las dextrinas en azúcares por la actividad de la
glucoamilasa y el último proceso es la fermentación que es la transformación
de glucosa en etanol al momento de emplear microorganismos como es el caso
de la levadura Sacchoromyces cerevisiae. Estos procesos se los realiza a
diferentes temperaturas y óptimo pH dependiendo a la máxima velocidad de la
reacción de la enzima. [24]
Industria alimenticia
En la industria de alimentos procesados como los pasteles, zumos de
frutas, cervezas y jarabes de almidón se emplean las amilasas, además tienen
una amplia aplicación en la industria de la panificación. [1]
Estas enzimas la añaden a la masa del pan y de esta forma degradan el
almidón presente en las harinas en dextrinas de menor tamaño para
posteriormente ser fermentadas por levadura; las amilasas activan la
fermentación y disminuyen la viscosidad de la masa, además generan azúcar
mejorando el sabor y cualidades del pan, posee una función de
antienvejecimiento en la transferencia de calor y aumentan la retención de
suavidad de los productos salientes del horno. [25]
Industria Textil
Las amilasas son aplicadas en esta industria en el proceso de
desengomado, este consiste en eliminar el almidón aplicado al hilo de la tela
18
con la función de fortalecimiento, garantizando un proceso de tejido seguro y
rápido. El almidón y su uso como factor de apresto llama la atención por su
bajo costo y la disponibilidad en casi todas las regiones del mundo. [1]
Producción de enzimas por fermentación sólida.
La SSF (Solid State Fermentation) está basada en el desarrollo de
microorganismos en sólidos húmedos (sustrato). El sustrato en su composición
tiene agua retenida en su matriz porosa permitiendo realizar funciones de vida
del microorganismo, esta capacidad varía dependiendo el tipo del material, en
la SSF el agua libre surge cuando se prevalece la capacidad de saturación de
la matriz sólida. [26]
La SSF (Solid State Fermentation) tiene parecido con el habitad de
naturaleza del microorganismo, por lo que le permite crecer en este medio
fácilmente, añadiendo un valor agregado a los residuos usados como sustratos.
[26]
Consiste de un proceso donde la materia sólida tiene una baja actividad de
agua (aw) esta influye en sus factores fisiológicos de los microorganismos
como son de tipo de esporulación, de crecimiento y germinación de esporas,
además de la producción de enzimas, metabolitos y actividad de las mismas.
[27]
La SSF presenta ventajas como técnicas más simples, productividad
superior, inversión de capital más bajo, baja cantidad de efluentes
contaminantes, menor requerimiento de energía y mejor recuperación del
19
producto, motivo por el cual se ha establecido que la SSF es el mejor sistema
para producir enzimas. [12]
2.1.2 Residuos agroindustriales
Los residuos agroindustriales pueden ser utilizados para generar nuevos
productos con un valor comercial. Las nuevas tecnologías pueden ser capaces
de recuperar, reciclar y dar sustentabilidad a la obtención de componentes de
alto valor agregado, los cuales pueden ser utilizados a nivel industrial. [28]
Los residuos agroindustriales pueden ser de origen animal o vegetal, y
estos a su vez pueden dividirse en siete grupos: 1) cereales, 2) raíces y
tubérculos, 3) plantas oleaginosas, 4) frutas y verduras, 5) productos cárnicos,
6) pescados y mariscos y 7) productos lácteos. [28]
Dependiendo del origen del residuo se pueden obtener nuevos
compuestos bioactivos, ingredientes alimenticios, enzimas, antibióticos,
biocombustibles, alimentos para animales y producción de composta. [28]
Recientes investigaciones en las cuales se emplean técnicas
biotecnológicas han aprovechado los residuos agroindustriales para producir
enzimas. Entre las enzimas que se han obtenido hasta el momento a partir de
residuos agroindustriales se encuentra la papaína, celulasa, peptinasa, lipasa y
lacasa.[29]
La biotecnología es un área en desarrollo que en la industria presenta
una amplia aplicación; permite convertir los residuos agroindustriales en
productos de mayor valor agregado, por medio de procesos de transformación
química, microbiológicos o extracción directa.[30]
20
Los residuos agroindustriales son generados partiendo del consumo
directo de productos de primer orden o de su industrialización en distintas
industrias, principalmente de la industria alimenticia. Presentan un gran
potencial para ser aplicados en procesos de la rama biotecnológica, por su bajo
precio, factibilidad de adquisición y su composición nutricional, son fuentes de
nitrógeno, carbono y minerales, pudiendo ser utilizados como sustratos para el
desarrollo de microorganismos. [31]
Las características de estos residuos varían según la materia prima, y del
proceso de donde han sido generados sin embargo comparten una
característica que es la concentración de materia orgánica, compuestas por
distintos porcentajes de lignina, celulosa, pectina y hemicelulosa, siendo
considerados como excelentes sustratos en los procesos de fermentación
sólida. [32]
La celulosa se la define como un polímero lineal de D-glucosa, posee una
estructura cristalina que resiste la hidrólisis y regiones amorfas capaces de
soportar degradación. La hemicelulosa pertenece a los polímeros
heteropolisacáridos, estos proporcionan unión entre la lignina y la celulosa. La
lignina es un heteropolímero tridimensional, ramificado y amorfo, formado por
grupos de alcoholes aromáticos que le proveen soporte a la estructura,
impermeabilidad, rigidez y protección a la hemicelulosa y celulosa. [33]
2.1.3 Producción del banano en Ecuador
La producción de banano en el país es un sector clave en la economía,
genera 2 millones de empleos. Las exportaciones de banano representan el
21
10% de las exportaciones totales del país. [34] El banano es el segundo
producto más importante del país después del petróleo [35]
Ecuador es el líder en el mercado internacional de banano. En 2017 el país
exportó 3 mil millones de dólares en bananos, el 24.6% de las exportaciones
totales en el mundo. [36]. Europa es el principal destino de las exportaciones
de banano de Ecuador y a la vez el país es el principal origen de las
importaciones de banano del continente. [34]
Los productores de banano en Ecuador principalmente están concentrados
en las provincias de El Oro, Guayas y Los Ríos, las mismas que abarcan el
41%, 34% y 16% de los productores, respectivamente. En la provincia de El
Oro se sitúan la mayor parte de los pequeños productores de banano del país
(aproximadamente 42%), mientras que los grandes productores principalmente
en las provincias de Guayas y Los Ríos. [37]
2.1.4 Banano
Conocido científicamente como Musa paradisiaca, planta perteneciente
a las Musáceas, llega a alcanzar una altura de 2 m a 3 m y un tallo de 20 cm de
diámetro. Su fruto es una falsa baya que mide de 7 a 30 cm de largo y en
algunos casos hasta 5 cm de diámetro, su cubierta depende de un pericarpio
coriáceo verde en el fruto inmaduro y amarillo intenso en el fruto maduro; su
forma es falcada o lineal, su pulpa es blanca a amarilla rica en almidón y dulce.
[38]
Actualmente su fruto ocupa el segundo lugar de las frutas con mayor número
de producción, se aproximan a los 101 millones de toneladas. [39]
22
Figura 4 Banano Ecuatoriano [37]
Composición química del banano
Tabla 2 Composición química del banano
Composición química del banano

Componente Banano verde Banano maduro
Agua 69,58% 75,12%
Almidón 15,37% 4,21%
Celulosa 7,54% 0,92%
Sacarosa 9,36% 15,57%
Glucosa 0,58% 5,29%
Dextrosa 1,82% 1,76%
Gomas 0,67% 1,60%
Tanino 0,06% 0,01%
Proteínas 2,10% --
Ceniza 0,76% 0,76%
Fuente: Espinal [40]

Elaborado por autores
La fruta verde contienen entre el 20-22% de materia seca,
especialmente en forma de almidón, cuando está madura, el almidón se
convierte en azucares simples como lo son: fructosa, sacarosa y glucosa, los
azucares del fruto maduro son fácilmente detectables. [40]
23
Cáscaras de banano
Las cascaras de bananos representan el 30-40% del peso total de la fruta.
[41]
Se caracterizan como una fuente de compuestos lignocelulósicos, como
vitaminas, hidratos de carbono y minerales (esenciales y no esenciales) existen
compuestos lignocelulósicos con tres componentes importantes, celulosa,
lignina y hemicelulosa, la composición de la cáscara de banano va a variar
según la planta. [42]
A medida que el banano va madurando, el contenido de almidón en sus
cascaras va reduciendo, debido al rompimiento de almidón en azucares.
Figura 5 Grado de Maduración del banano [37]
Las cáscaras de banano representan alrededor de un 95% de los residuos
que se generan del banano, los cuales no son aprovechados por los
agricultores, ya que ellos están enfocados en la comercialización del fruto.
Estos residuos no contribuyen con la nutrición del suelo, ya que impactan
negativamente en el medio ambiente causando problemas en los cultivos,
24
acumulan agua y favorece al crecimiento de hongos en lugares inadecuados.
[43]
Composición química de la cáscara de banano
Tabla 3 Composición química de la cáscara del banano
Composición química de la cáscara del banano

Banano Banano
Componente verde maduro
% Humedad 91,62 95,66
% Proteína cruda 5,19 4,77
% Fibra Cruda 11,58 11,95
Energía bruta,
4383 4592
Kcal
% Calcio 0,37 0,36
% Fósforo 0,28 0,23
% Ceniza 16,3 14,58
% Almidón 39,89 4,88
Fuente: Mahindrakar, A./ Gaurav, J/ Emaga, T [44] [45] [46]
Elaborado por autores.
Usos de la cáscara de banano
Las cáscaras de banano verde han sido utilizadas para la producción de
etanol debido al alto contenido de almidón y celulosa (13,2%) [47] y es
considerada como una materia prima potencial para la industria del bioetanol.
[48]
Se han realizado estudios donde han utilizado las cáscaras de banano
para la obtención de celulosa, en los cuales se ha obtenido la celulosa similar a
la que se utiliza en la industria papelera con un alto contenido de lignina. [49]
La Universidad Federal de Sao Carlos, realizó estudios donde demostró
que las cáscaras de banano tienen la capacidad de limpiar aguas
25
contaminadas con metales pesados de una manera eficaz y a un bajo costo.
[50]
Las cáscaras de banano también se las ha utilizado para la producción de
complejos enzimáticos como la lacasa. Enzima que es utilizada como
blanqueador en la pulpa de la madera y la industria de papel, en la desinfección
con cloro y en la eliminación de compuestos fenólicos de las aguas residuales.
[51]
2.2 Marco Conceptual
2.2.1 Enzimas
Se las define como proteínas globulares, conformadas por una o varias
cadenas polipeptídicas, tienen función de actuar como catalizadores de
distintas reacciones químicas. [52]
2.2.2 Bacillus
Género de bacterias Gram positivas, resisten condiciones adversas de
pH y temperatura, se encuentran en sedimentos acuáticos y en suelos.[53] Su
rango de pH de crecimiento activo esta entre 5,5 -8,5, dentro de sus especies
más representativas, tenemos las Bacillus brevis y Bacillus subtilis.[54]
Se pueden encontrar en este género especies patógenas, y especies de
interés industrial. Dentro de sus aplicaciones industriales tenemos: Síntesis de
antibióticos, fermentadores industriales, industria alimenticia, e industria textil.
[53]
26
2.2.3 Bacillus subtilis
Bacteria perteneciente al género Bacillus, Gram positiva, generalmente se
la encuentra en el suelo. Bacillus subtilis es uno de los microorganismos con
mayor aplicación para producir sustancias químicas específicas y enzimas
industriales. [55]
2.2.4 Método del ácido 3,5 Dinitrosalisílico (DNS)
El método del ácido 3,5 Dinitrosalisílico (DNS) también conocido como el
método del DNS, se lo utiliza para calcular las concentraciones de azucares
reductores en distintos materiales, su procedimiento está basado en una
reacción redox, entre el DNS y azucares reductores que se encuentran en la
muestra. [56]
Este método prueba la existencia de un grupo carbonilo libre (C=O),
presente en los llamados azúcares reductores. Esto implica la conversión de
azúcar reductor a furfural en condiciones alcalinas, lo que reduce uno de los
grupos nitro (-NO2) del grupo DNSA al amino (-NH2) para producir ácido 3-
amino-5-nitrosalicílico de color marrón anaranjado, con un máximo de
absorbancia. [57]
Este método a través de los años ha sufrido varias modificaciones con el
objetivo de adecuarse a análisis de diferentes materiales con la ventaja de que
su productividad y alta sensibilidad; debido a que es un método que utiliza la
espectrofotometría. [56]
El método del DNS no es recomendado usarlo en las determinaciones de
azúcares reductores de muestras altamente coloreadas.[56]
27
2.2.5 Valoración de proteínas por el método de Lowry
El método de Lowry se basa en la valoración cuantitativa de las proteínas,
es el método ampliamente más utilizado para estimar la cantidad de proteínas
en muestras. En primer lugar las proteínas son pre-tratados con iones de cobre
en solución alcalina, y luego los aminoácidos aromáticos en la muestra tratada
reducen el ácido presente en el reactivo de Folin. El producto final de esta
reacción tiene un color azul. La cantidad de proteínas en la muestra se puede
estimar a través de la lectura de la absorbancia (a 750 nm) del producto final de
la reacción Folin frente a una curva estándar de una solución de proteína
estándar seleccionada.[58]
2.3 Marco Contextual
En nuestro país el rechazo de banano no es aprovechado eficientemente
debido a que es desechado al aire libre acarreando problemas ambientales y
económicos para los productores, sin embargo, esta fruta ofrece la posibilidad
de generar bioproductos de valor agregado debido a su composición
química.[59]
Se han realizado importantes avances en la ingeniería genética referente a
la producción de enzimas recombinantes en microorganismos. Estos
microorganismos deben garantizar la seguridad de su uso, deben cerciorarse
de que no sean patógenos, ni que produzcan algún compuesto tóxico. Los
microorganismos ideales son aquellos que tienen una larga tradición de uso en
los alimentos como las levaduras de la industria cervecera y los fermentos
lácticos. Entre los principales microorganismos se encuentra la Bacillus sp., las
cuales son de crecimiento rápido, de manipulación segura y producen grandes
28
cantidades de enzimas, generalmente mediante la fermentación.[60]
[61][62][63]
29
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1 Nivel de investigación
El presente trabajo de investigación es de tipo descriptivo, debido a que se
establece la relación causa-efecto entre las diferentes temperaturas y tiempos
de incubación sobre las variables dependientes como son el rendimiento y la
actividad enzimática.
3.2 Diseño de investigación
En este proyecto se realizó una investigación de tipo experimental. La cual
consistió en someter un objeto a una serie de determinadas condiciones o
estímulos (variables independientes), para observar cuales son los efectos que
en ellas se producen (variables dependientes).
3.3 Metodología de la investigación
El trabajo de investigación fue realizado en los laboratorios de
Microbiología y Biotecnología de la Facultad de Ingeniería Química de la
Universidad de Guayaquil. El procedimiento consta de una serie de pruebas
experimentales con la finalidad de demostrar la efectividad de la fermentación
de las cáscaras de banano y del Bacillus sp. en la producción de alfa amilasa.
Se realizaron una serie de pruebas, en las que se monitoreó la temperatura,
tiempo de incubación y el pH del medio en la producción de alfa amilasa; al
igual que el tiempo y temperatura en el estudio de estabilidad operacional de la
30
alfa amilasa obtenida a partir de las cáscaras de banano verde y de la alfa
amilasa obtenida a partir del almidón de papa.
3.4 Materiales y equipos
En la tabla 4 se muestran los materiales, equipos y reactivos que se

utilizaron para realizar esta investigación.
Tabla 4 Materiales y equipos requeridos
Materiales Equipos Reactivos
Matraces Erlenmeyer Centrífuga Hettich Agua destilada

rotofix 32a
Tubos de ensayos Extracto de levadura
Estufa de secado
Pipetas Memmert UNE 200 Agua de peptona
Agitadores Incubadora NaCl (Cloruro de sodio)

Memmert IF110
Espátulas HCl 0.1N (Ácido clorhídrico)
Espectrofotómetro
Vidrios reloj NaOH 0.1N (Hidróxido de Sodio)
Genesys 10 uv
Gradillas BSA (Suero de albúmina bovino)
Autoclave All
Algodón American modelo DNS (Ácido 3,5 dinitrosalicílico)
25X
Gasas D- Glucosa
Potenciómetro
Papel filtro N°1 Thermo Scientific Agar nutritivo
modelo Orion 3 Star
Embudos KCl (Cloruro de potasio)
Tamices MgSO4.7H2O (Sulfato de Magnesio)
Cajas Petri Na2HPO4.2H2O (Fosfato disódico

dihidratado)
Asas de Drigalski
NaH2PO4.2H2O (Fosfato monosódico
Cáscaras de banano dihidratado)
Almidón de papa
Cepas de Bacillus sp.

31
3.5 Diseño experimental
3.5.1 Aislamiento de las bacterias
Las bacterias de Bacillus sp. se obtuvieron de un agroquímico de marca
comercial Biohealth WSG el cual es una mezcla de cepas de Trichoderma con
Bacillus más ácidos húmicos y extracto de alga, el producto es granular soluble
en agua con Registro MAG 032912302, cuya composición es la siguiente:
Extracto de alga aproximadamente 5%, Ácidos húmicos aprox. 75%, materia
seca aprox. 85-90%, Bacillus sp. aprox.107 UFC/g, Trichoderma harzianum
aprox. 106 UFC/g. Para el acondicionamiento de la bacteria se disolvió 1 gramo
del agroquímico en 1 litro de agua destilada esterilizada. Luego se procedió a
preparar un agar nutritivo específico para bacterias de marca comercial
(Criterion), para realizar una siembra masiva. Una vez realizada la siembra se
procedió a incubar a 37°C durante 24 horas. Transcurrida las 24 horas se
realizó una tinción de Gram, para comprobar que solo haya crecido la bacteria
de interés.
Una vez comprobada la presencia de las bacterias de Bacillus sp., se
procedió a inocularla en agua de peptona estéril. Se preparó un agar de
almidón, el cual se lo realizó agregando 1 gramo de almidón de papa y 2,3
gramos de agar nutritivo en 100 ml de agua destilada; se esterilizó en un
autoclave y se colocó en cajas Petri. Se procedió a la siembra de la Bacillus sp.
en el agar del almidón y se mantuvo a 37°C por 24 horas.
32
3.5.2 Preparación del sustrato
Las cáscaras de banano verde con grado de madurez 1 se lavaron con
agua potable para eliminar cualquier tipo de impurezas, luego se secaron en
una estufa a una temperatura de 70°C durante 24 horas.
Una vez que las cáscaras de banano se han secado se procedió a
triturarlas, molerlas y tamizarlas para obtener un tamaño de partículas de 250
µm.
Obtenido el tamaño de partículas deseadas, se almacenó en fundas de
polietileno a una temperatura de 25°C hasta su posterior uso.
3.5.3 Determinación del contenido de humedad del sustrato
Para determinar el contenido de humedad del sustrato se aplicó la
normativa NTE INEN-ISO 712:2013 [64]. Para ello se ajustó la estufa a una
temperatura de 130°C, luego se pesó un crisol de porcelana y se pesó 1,5 g del
sustrato. Alcanzados los 130°C se introdujo el crisol con la muestra y se dejó
en el interior por 4 horas.
Transcurridas las 4 horas se sacaron las muestras y se las dejó enfriar en
un desecador por 20 minutos, se retiró las muestras del desecador y se
procedió a pesar. Se colocó de nuevo las muestras en el interior de la estufa
por 30 minutos hasta alcanzar un peso constante.
33
3.5.4 Preparación del inóculo
Se hizo la preparación del medio líquido de sal mineral, [61] este medio
líquido se preparó siguiendo el protocolo realizado por Kokab, S.[60] cuya
composición es la siguiente: 2 g de glucosa, 0.3 g de extracto de levadura, 0.5
g de agua de peptona, 1.5 g de NaCl (cloruro de sodio), 1.1 g de
Na2HPO4.2H2O (Fosfato disódico dihidratado), 0.61 g de NaH2PO4.2H2O
(Fosfato monosódico dihidratado), 0.3 g de KCl (Cloruro de Potasio) y 0.01 g de
MgSO4.7H2O (Sulfato de Magnesio), todo esto se disolvió en 100 ml de agua
destilada. Se procedió a esterilizar en un autoclave por 15 minutos a una
temperatura de 121°C y se dejó enfriar el medio líquido para poder inocular las
cepas de Bacillus sp. Realizada la inoculación se llevó a incubar a 37°C por 24
horas hasta lograr una etapa de crecimiento logarítmica (106 UFC/ml).
3.5.5 Fermentación en estado sólido
Se empleó el medio líquido de sal mineral para la fermentación en estado
sólido cuya composición se indicó en el literal anterior, con la diferencia que se
añadió 30 g de cáscaras de banano verde deshidratado. Se ajustó el medio a
un pH de 7 usando NaOH 0.1 N y HCl 0.1 N.
Se esterilizó en una autoclave durante 15 minutos a 121°C, se dejó enfriar
y se procedió a agregar 5 ml del inóculo. Las condiciones de operación y la
cantidad del inóculo que se utilizó para realizar la técnica de fermentación en
estado sólido han sido reportadas en publicaciones previas. [60][61][65]
34
3.5.6 Producción de la enzima alfa amilasa
Debido a que a nuestra investigación se centra en definir el proceso más
óptimo para obtener alfa amilasa, las condiciones de producción pH, tiempo y
temperatura (variables independientes) fueron evaluadas con respecto a la
actividad enzimática y rendimiento (variables dependientes) tal como se detalla
en la tabla 5.
Tabla 5 Condiciones de operación para la producción de la enzima alfa amilasa
30°C
Temperatura 35°C
40°C
24 horas
Tiempo 48 horas
72 horas
pH 7
Fuente: Kokab, S. [60]
Como estudio preliminar se decidió mantener el tiempo de 24 h y el pH 7
constantes siguiendo el mismo protocolo que utilizó Kokab, S. [60] y analizar
los rangos de temperatura (30°C – 40°C) de forma que con estos pudiéramos
obtener la mejor temperatura de trabajo. Seleccionada esta temperatura se
profundizó en los estudios que se indican en la tabla 5.
35
Todos estos experimentos se realizaron por duplicado, generándose un
total de 34 muestras. El mismo procedimiento se lo realizó para el sustrato
comercial, La selección de los diferentes niveles de las variables
independientes fueron establecidas considerando las condiciones de
procesamiento empleadas en publicaciones científicas previas donde trabajan
con sustratos diferentes al banano ecuatoriano.
3.5.7 Extracción de la enzima
La enzima alfa amilasa se la extrajo después de la fermentación en estado
sólido a los diferentes tiempos, temperaturas y pH del medio de producción.
Para la extracción se agregó a las diferentes muestras 100 ml de un buffer de
fosfato de sodio de pH 6.9, se agitó manualmente durante hora y media y se
filtró esta solución utilizando papel filtro N°1. [60]
El medio filtrado fue centrifugado a 1000 rpm durante 10 minutos a
temperatura ambiente 25°C. El líquido sobrenadante fue tomado
cuidadosamente con la ayuda de pipetas y utilizado como extracto crudo
enzimático.
3.5.8 Determinación de la actividad enzimática
La actividad enzimática de la alfa amilasa se la determinó utilizando el
método de DNS empleado por Gusakov, A. [66] Para realizar este método se
preparó la solución de DNS (ácido 3, 5 dinitrosalicílico) compuesta por los
siguientes reactivos: 0,5 g de ácido -3,5 dinitrosalicílico, 15 g de tartrato sódico
potásico y 0,8 g de NaOH, se disolvió todo en 100 ml de agua destilada. [66]
36
Para conocer la actividad enzimática se requiere construir una curva patrón
empleando glucosa anhidra grado reactivo, realizada de la siguiente manera:
 Se preparó una solución madre de glucosa a una concentración de 10
mg/ml.
 Luego se preparó la solución patrón de glucosa a diferentes
concentraciones (10-50 mg/ml).
 En tubos de ensayos de 10 ml se colocó la solución de glucosa, agua
destilada y 3 ml del reactivo DNS.
 Una vez que se añadió todos los reactivos, se llevó a baño maría a
100°C por 5 minutos.
 Pasado los 5 minutos se dejó enfriar a temperatura ambiente y se
añadió 5 ml de agua destilada.
 Se agitó y se realizó la lectura de la absorbancia a 540 nm en el
espectrofotómetro.
La cantidad de reactivos empleados para la creación de la curva patrón
de glucosa se muestra en la tabla 6.
37
Tabla 6 Volúmenes de solución de glucosa, agua destilada y reactivo DNS
Solución de Agua destilada Reactivo DNS

Tubos
Glucosa (ml) (ml) (ml)
0 -- 1 3
1 0.1 0.9 3
2 0.2 0.8 3
3 0.3 0.7 3
4 0.4 0.6 3
5 0.5 0.5 3
Los resultados de absorbancia de la glucosa fueron tabulados en Excel y
se creó la curva patrón con su respectiva ecuación (Ver figura 6), misma que
será empleada para la determinación de actividad enzimática del extracto crudo
enzimático (ECE).
38
Curva Estándar de Glucosa
0,7
0,6
y = 0,0118x + 0,0622
0,5
R² = 0,9873
Absorbancia (A)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración (µg/ml)
Figura 6 Gráfica de calibrado para la determinación de la actividad enzimática.

El método del DNS permite detectar grupos reductores, en el que la
actividad enzimática de la alfa amilasa se calcula determinando los µmol de
maltosa liberado por minuto en función de los ml del extracto crudo
enzimático.[61]
𝑈𝐸
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 =
𝑚𝑙
La actividad enzimática se cuantificó mediante la reacción enzima –
sustrato (alfa amilasa – solución de almidón).
Para la determinación de la actividad enzimática se deben realizar blancos
de enzima, de sustrato y de reactivo.
Donde:
39
El blanco de reactivo (BR) se emplea para llevar a cero la absorbancia en
el espectrofotómetro a la longitud de onda requerida por el método
colorimétrico.
El blanco de sustrato (BS) se emplea para reducir el color producido por
contaminantes que pueden acompañar a la solución de almidón como
consecuencia de su hidrólisis.
El blanco de enzima (BE) se emplea para disminuir el color producido por
contaminantes de carácter reductor que acompañan a la enzima.
Los valores de absorbancia obtenidos en la reacción de los blancos de
enzima (BE) y de sustrato (BS) se reducirán de la lectura de la mezcla en
análisis (mezcla de reacción - MR), es decir:
𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑀𝑅 = 𝐴𝑏𝑠 𝑀𝑅 − (𝐵𝑒 + 𝐵𝑠) 𝐸𝑐 1
Para determinar la cantidad real de maltosa liberada por acción enzimática,
el valor de la absorbancia se extrapoló en la curva patrón de glucosa,
obteniendo los mg de maltosa producidos durante el tiempo de reacción
enzimática, o se utilizó la siguiente ecuación de la curva Ec.2.
𝑌 = 0,0118 𝑥 + 0, 0622 𝑅 2 = 0,9873 𝐸𝑐. 2
En la tabla 8 se detallan la composición de los blancos empleados y el
procedimiento para determinación de actividad enzimática.
40
Tabla 7 Cuantificación de la actividad enzimática
BR BE BS MR
Extracto Crudo
-- 0.5 ml -- 0.5 ml
Enzimático
Agua 1 ml 0.5 ml 0.5 ml --
Solución de Almidón -- -- 0.5 ml 0.5 ml
Incubar 7 min a 37°C
DNS 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar 5 minutos en baño maría a 100°C. Enfriar
Agua 8 ml 8 ml 8 ml 8 ml
Leer a 540 nm
3.5.9 Determinación de la concentración de proteínas
La concentración de proteínas se la determinó por medio del método de
Lowry. [58] En el cual se utilizaron los siguientes reactivos para la
determinación de este método:
 Reactivo A: Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 M.
 Reactivo B: CuSO4x5H2O al 1%.
 Reactivo C: tartrato sódico – potásico al 2%.
 Reactivo de Lowry: Se preparó mezclando los reactivos A, B y C en
proporciones de 50: 0,5: 0,5.
 Reactivo Folin – Ciocalteau: Reactivo comercial diluido 1:4 en agua.
 Solución patrón de Albúmina de Suero Bovino (BSA) (1mg/ml).
41
Para la determinación de las proteínas se construye una curva de
calibración o patrón empleando albúmina de suero bovino con una
concentración de 1000 mg/ml que se diluyen para obtener concentraciones en
el intervalo de 50 – 400 mg/ml.[67]
La cuantificación de las proteínas se la realizó midiendo la absorbancia en
un espectrofotómetro a 660 nm, y graficando la absorbancia vs la
concentración de proteínas. Obteniendo de esta manera la curva patrón de
BSA. Una vez obtenida la curva patrón de BSA se aplicó una regresión lineal
donde se representa la función exponencial de los valores de absorbancia
obtenidos frente a la concentración de proteínas en mg/ml.
Para construir la curva patrón se utilizaron tubos de ensayos de 10 ml en
los que se les añadió la solución patrón de BSA, el reactivo de Lowry y se dejó
incubar por 10 minutos en la oscuridad.
Pasado los 10 minutos se añadió 0,5 ml del reactivo de Folin, se agitó y se
dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para que se desarrolle
la reacción coloreada.
Transcurrido los 30 minutos se midió la absorbancia con un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 660 nm.
La cantidad de reactivos empleados para la creación de la curva patrón de
BSA se muestra en la tabla 8 y la curva patrón con su respectiva ecuación se
muestran en la figura 7.
42
Tabla 8. Volúmenes de agua, solución patrón de BSA, Reactivo de Lowry y
Folin- Ciocalteau diluido
Tubo Agua (ml) Solución de Reactivo de Folin diluido

Patrón BSA Lowry (ml) (ml)
(ml)
0 1.0 -- 5 0.5
1 0.95 0.05 5 0.5
2 0.9 0.1 5 0.5
3 0.8 0.2 5 0.5
4 0.7 0.3 5 0.5
5 0.6 0.4 5 0.5
Curva Patrón de BSA

0,45
0,4
y = 0,001x + 0,0052
R² = 0,9962
0,35
Absorbancia (A)
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Concentración (mg/ml)
Figura 7. Gráfica de curva de calibrado para determinación de proteínas.

43
Para determinar la concentración de proteínas, el valor de la absorbancia
se extrapoló en la curva patrón de albúmina de suero bovino (BSA), obteniendo
los mg de proteínas producidos por mililitros o se utilizó la siguiente ecuación
de la curva Ec.3.
𝑦 = 0,001 𝑥 + 0,0052 𝑅 2 = 0,9962 𝐸𝑐. 3
Donde:
𝑚𝑔
𝑦 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 ( ⁄𝑚𝑙 )
𝑥 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑎 660 𝑛𝑚)
3.5.10 Determinación de la Estabilidad Operacional
Debido a que a uno de nuestros objetivos de investigación es el de
determinar la estabilidad operacional de la enzima producida, se evaluó que la
actividad enzimática luego de someter a la enzima a diferentes tiempos y
temperaturas, tal como se detalla en la tabla 9.
De manera general para el estudio de estabilidad operacional se colocó
0,5 ml de la enzima alfa amilasa obtenida de la cáscara de banano verde y del
almidón de papa, en tubos que se incubaron a 30°C, 40°C, 50°C y 60 °C,
durante dos horas. La enzima se tomó en intervalos de 30 minutos, y se
determinó su actividad enzimática, midiendo la cantidad de maltosa liberada
por acción enzimática, por el método del DNS (ácido 3, 5 dinitrosalicílico).
44
Tabla 9 Condiciones de operación para determinar la estabilidad operacional
de la enzima alfa amilasa
30°C
40°C
Temperatura
50°C
60°C
0.5 h
1.0 h
Tiempo
1.5 h
2.0 h
Todos estos experimentos se realizaron por duplicado, generándose un
total de 96 muestras. El mismo procedimiento se lo realizó para el almidón de
papa. La selección de los diferentes niveles de las variables independientes
fueron establecidas considerando el estudio realizado por Rajshree S., en India
sobre Amylase production by solid state fermentation of agro-industrial using
Bacillus sp. [68] donde se emplearon diferentes sustratos al que se utilizó en
esta investigación.
3.5.11 Comparación de la actividad enzimática de la alfa amilasa a partir
de las cáscaras de banano verde con la alfa amilasa obtenida del
almidón de papa
3.5.11.1 Fermentación en estado sólido
Al igual que en el caso de las cáscaras de banano verde se utilizó el
medio líquido de sal mineral cuya composición se detalló en el literal 3.5.4 con
45
la diferencia que se añadió 20 g de almidón de papa. Se ajustó el medio a un
pH de 7 usando NaOH 0.1 N y HCl 0.1 N.
Se esterilizó en un autoclave durante 15 minutos a 121°C, se dejó enfriar
y se procedió agregar 5 ml del inóculo. Así mismo se mantuvo las mismas
condiciones de operación para la producción de la enzima alfa amilasa a partir
de las cáscaras de banano verde las cuales se detalló en la tabla 5.
46
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1 Resultados
4.1.1 Determinación del contenido de humedad del sustrato
m2 − m3
% humedad = 𝐸𝑐. 4
m2 − m1
m1 = masa del crisol
m2 = masa del crisol con la muestra sin secar (sustrato)
m3 = masa del crisol con la muestra seca (sustrato)
48,02 g − 47,78 g
% humedad =
48,02 g − 46, 52 g
% humedad = 16 %
4.1.2 Determinación de la actividad enzimática
Según el tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa.
Actividad Enzimática
10
8,13 7,57 7,71
8
(UE/ml)
6 4,81 5,15
4,23
4
2
0
24 48 72
Tiempo de incubación (Horas)
Cáscaras de banano Almidón de papa
Figura 8. Efecto del tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa

amilasa a 35°C, pH 7. Elaborado por autores.
47
Según la temperatura de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa.
Actividad Enzimática (UE/ml)
9 8,13
8 7,57
7
5,58 5,61
6 5,02
5 4,36
4
3
2
1
0
30 35 40
Temperatura de incubación (°C)
Cáscara de banano Almidón de papa
Figura 9 Efecto de la temperatura de incubación en la producción de la enzima

alfa amilasa a 24 horas, pH 7. Elaborado por autores.
Según el pH del medio en la producción de la enzima alfa amilasa
9 8,13
8 7,57
6,62 6,75
7 6,04
6 5,56
5
4
3
2
1
0
6 7 8
∆pH de medio
Figura 10 Efecto del pH del medio en la producción de la enzima alfa amilasa

a 24 horas, 35°C. Elaborado por autores.
48
Como se puede observar en las figuras 8, 9 y 10 al producir la enzima
alfa amilasa manteniendo las siguientes condiciones de operación: temperatura
de incubación 35°C, tiempo de incubación de 24 horas y un pH del medio de 7
se tiene una actividad enzimática mayor tanto para las cáscaras de banano
verde como para el almidón de papa. Al usar las cáscaras de banano verde
como sustrato se obtiene una actividad enzimática de 8,13 UE/ml durante las
primeras 24 horas, 7,71 UE/ml después de 48 horas y a las 72 horas 5,15
UE/ml. Con el almidón de papa se obtiene una actividad enzimática de 7,57
UE/ml a las 24 horas, a las 48 horas se obtiene una actividad enzimática de
4,81 UE/ml y las 72 horas 4,23 UE/ml. Conforme se aumenta el tiempo de
incubación en la producción de la alfa amilasa a partir de las cáscaras de
banano verde la actividad enzimática disminuye en un 38,73%, al aumentar la
temperatura de incubación la actividad enzimática disminuye en un 61,82%, al
aumentar el pH del medio en la producción de la alfa amilasa la actividad
enzimática se reduce en un 54,63% . En el caso de la alfa amilasa obtenida a
partir del almidón de papa al aumentar el tiempo de incubación en la
producción de la enzima la actividad enzimática disminuye en un 45,57%, al
aumentar la temperatura de incubación en la producción de la alfa amilasa la
actividad enzimática disminuye en un 63,45%, al aumentar el pH del medio la
actividad enzimática se reduce en un 55,62%. La alfa amilasa obtenida a partir
de las cáscaras de banano verde en comparación con el almidón de papa
tiene un 51,78% más de actividad enzimática.
49
4.1.3 Determinación de la concentración de proteínas
Según el tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa amilasa
Concentración de proteínas
Concentración de Proteínas
450
376,8 384,8
400 350,8
350
300
(mg/ml)
250
174,8 181,8
200
150 105,8
100
50
0
24 48 72
Tiempo de incubación ( Horas)
Figura 11. Efecto del tiempo de incubación en la producción de la enzima alfa

amilasa a 35°C, pH 7. Elaborado por autores.
Según la temperatura de incubación en la producción de la enzima alfa
amilasa
450
384,8
400 350,8
350 294,8
300
(mg/ml)
250
200
150 103,8 105,8 114,8
100
50
0
30 35 40
Temperatura de incubación (°C)
Figura 12 Efecto de la temperatura de incubación en la producción de la

enzima alfa amilasa a 24 horas, pH 7. Elaborado por autores.
50
Según el pH del medio en la producción de la enzima alfa amilasa
Concentración de Proteínas 450 425,8
400 350,8
350 306,8
300
(mg/ml)
250
200 144,8
150 105,8 107,8
100
50
0
6 7 8
∆pH del medio
Figura 13 Efecto del pH del medio en la producción de la enzima alfa amilasa

a 24 horas, 35°C. Elaborado por autores.
Como se puede observar en las figuras 11, 12 y 13 al mantener las
condiciones de operación donde se obtuvo una mayor actividad enzimática, a
una temperatura de incubación de 35°C, tiempo de incubación de 24 horas y
un pH del medio de 7, al usar las cáscaras de banano verde como sustrato se
obtuvo una concentración de proteínas de 350,8 mg/ml y en el caso del
almidón de papa se obtuvo una concentración de 105,8 mg/ml. Conforme se
aumenta el tiempo de incubación en la producción de la alfa amilasa la
concentración de proteínas aumenta en un 31,53% en el caso de la alfa
amilasa obtenida a partir de las cáscaras de banano verde y con el almidón de
papa la concentración de proteínas aumenta en un 22,88%, al aumentar la
temperatura de incubación en la producción de la alfa amilasa la concentración
de proteínas en el caso de la alfa amilasa obtenida a partir de las cáscaras de
banano verde aumenta en un 47,68% y con el almidón de papa aumenta en un
47,96%, al aumentar el pH del medio en la producción de la enzima la
51
concentración de proteínas aumenta en un 45,17% en el caso de la alfa
amilasa obtenida a partir de las cáscaras de banano verde y 42,21% en el caso
del almidón de papa. Al usar las cáscaras de banano verde se obtuvo un
74,29% más de concentración de proteínas que con el almidón de papa.
Pero se observa también que conforme se aumenta la temperatura, el
tiempo y el pH del medio en la producción de la alfa amilasa, la concentración
de proteínas aumenta en ambos caso, esto se debe a que conforme se
modifican las condiciones de operación se agotan los sustratos de almidón y se
generan subproductos como la glucosa, la amilopectina y ácidos glucosídicos.
Todos estos compuestos van a servir como fuentes de nutrientes, pero estos
nutrientes no son específicos para seguir segregando amilasa, sino que se los
utiliza para generar otras enzimas que luego van a remodelar el metabolismo
de la célula para que se mantengan vivas.
4.1.4 Estabilidad Operacional de la enzima alfa amilasa
Figura 14 Estabilidad operacional de la enzima alfa amilasa obtenida a partir

de cáscaras de banano verde. Elaborado por autores.
52
Estabilidad Operacional
8

7
6
5
4
3
2
1
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Tiempo de Incubación (Horas)
30°C 40°C 50°C 60°C
Figura 15 Estabilidad operacional de la enzima alfa amilasa obtenida a partir

del almidón de papa. Elaborado por autores.
En las figuras 14 y 15 se observa que la enzima alfa amilasa obtenida a
partir de las cáscaras de banano verde y del almidón de papa se muestra
estable durante las 2 horas a una temperatura de 30°C. A una hora de
incubación y con temperaturas de 40, 50 y 60 °C la enzima todavía se muestra
estable en ambos casos. Al aumentar el tiempo de incubación y a temperaturas
de 40, 50 y 60°C su estabilidad disminuye tanto en la enzima obtenida con las
cáscaras de banano verde como la obtenida con el almidón de papa.
4.1.5 Rendimiento
𝑌𝑝 𝑈𝐸
= 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝐸𝑐. 5 [69]
𝑠
Yp = concentración de producto (UE⁄L)
g
s = concentración de sustrato ( ⁄L)
53
Cáscaras de banano
𝑌𝑝 8130 𝑈𝐸⁄𝐿
= 𝑔
𝑠 30000 ⁄𝐿
𝑌𝑝 𝑈𝐸
= 0,271
𝑠 𝑔
𝑌𝑝
= 27,1 %
𝑠
Almidón de papa
𝑌𝑝 7570 𝑈𝐸⁄𝐿
= 𝑔
𝑠 20000 ⁄𝐿
𝑌𝑝 𝑈𝐸
= 0,379
𝑠 𝑔
𝑌𝑝
= 37,9 %
𝑠
4.2 Discusión de los resultados
En estudios realizados en Ontario, Canadá por Kokab S. (2003) sobre Bio
– processing of Banana Peel for alpha – amylase production by Bacillis subtilis
[60] donde se ha variado la temperatura, el tiempo de incubación y el pH del
medio en la producción de la enzima alfa amilasa utilizando las cáscaras de
banano como sustrato las cuales fueron cortadas en pequeñas piezas de 40
mm y cepas de Bacillus sp. han reportado que para la producción de la enzima
la temperatura óptima de incubación es de 35°C, el tiempo de incubación es
de 24 horas y el pH óptimo es de 7, obteniendo una actividad enzimática de
9,06 UE/ml porque en este caso se añadió una solución al 0,1% de KH2PO4
(Fosfato monobásico de potasio), pero manteniendo las mismas condiciones de

54
operación y usando 30 g del sustrato (cáscaras de banano) obtuvo una
actividad enzimática de 4,53 UE/ml como se detalla en la tabla 1. Effect of
varying fermentation period and substrate level on α-amylase production by
Bacillus subtilis [60] Mientras que en esta investigación se comprobó que la
mayor producción de la enzima manteniendo las mismas condiciones de
operación, pero con la diferencia que las cáscaras de banano verde fueron
secadas, molidas y tamizadas hasta obtener un tamaño de partícula de 250 µm
se obtuvo una actividad enzimática de 8,13 UE/ml.
En el 2002, en la Universidad de Agricultura, Departamento de
Química, Faisalabad, Pakistán, Noreen R. realizó un estudio sobre production
of alpha – amylase from Banana Peel by Bacillus subtilis [62] donde obtenía la
enzima a una temperatura de 35°C, 24 horas y a un pH de 7 en la cual la
enzima tenía una actividad enzimática de 10,25 UE/ml. Sin embargo, en esta
investigación se mantuvo las mismas condiciones de operación pero se obtuvo
una actividad enzimática de 8,13 UE/ml, debido a que la preparación del medio
líquido para realizar la fermentación en estado sólido es diferente a la que se
realizó en dicho año ya que utilizó diferentes concentraciones de extracto de
levadura y de licor fermentado de maíz para mejorar así la fuente carbono del
residuo agroindustrial produciéndose una mayor actividad enzimática.
Comparando la actividad enzimática obtenida de 8,13 UE/ml con el
estudio sobre production of alfa amylase using banana waste by Bacillus
subtilis under solid state fermentation realizado en el 2012, en el Departamento
de Microbiología, de la Escuela de Biomedicina y Laboratorio de Ciencias de la
Universidad de Gondar, Etiopía, por Chandrashekhar, U. [61] en el que se
reportó que la mayor producción de alfa amilasa utilizando 50 gramos del

55
sustrato (cáscaras de banano) se la obtuvo a una temperatura de incubación
de 35°C, un tiempo de incubación de 24 horas y un pH del medio de 7
obteniendo una actividad enzimática de 6,97 UE/ml. Es decir en esta
investigación se obtuvo un 53,84% más de actividad enzimática al utilizar una
menor cantidad de sustrato (cáscaras de banano verde).
En el Departamento de Genética y Biotecnología de la Universidad de
Calabar, Nigeria en el año 2014, Ebiamadon A. realizó un estudio sobre
biotechnological potential of alpha amylase production by Bacillus subtilis using
Cassava peel poder as a substrate [63] reportó que la alfa amilasa obtenida a
partir de la cáscara de yuca usada como sustrato, obtuvo una actividad
enzimática de 7,12 UE/ml la cual fue obtenida con un tiempo de incubación de
24 horas, 35 °C y pH 7. En esta investigación se obtuvo alfa amilasa
manteniendo las mismas condiciones de operación, pero con la diferencia que
se utilizó cáscaras de banano verde como sustrato obteniendo una actividad
enzimática de 8,13 UE/ml.
En el 2013, en la Universidad de Thapar, Departamento de
Biotecnología y Ciencias Ambientales, India, Seema B. realizó un estudio
sobre α - amylase and β – galactosidase production on potato starch waste by
Lactococcus lactis subsp lactis isolated from pickled yam [70] en el que obtuvo
la enzima a una temperatura de 35°C, pH 5 con un tiempo de incubación de 24
horas; la enzima tuvo una actividad enzimática de 2,54 UE/ml. Mientras que en
esta investigación también se utilizó almidón de papa como sustrato para
producir alfa amilasa con las mismas condiciones de operación que se utilizó
para obtener la alfa amilasa a partir de las cáscaras de banano obteniendo una
56
actividad enzimática de 7,57 UE/ml. Cabe recalcar que en dicha investigación
se trabajó con un microorganismo diferente.
Respecto a la concentración de proteínas de la enzima alfa amilasa,
existen varios estudios donde solo se menciona el método que se ha realizado
para determinar la cuantificación de proteínas, pero no reportan su resultado.
En esta investigación se realizó el método de Lowry, para determinar la
concentración de proteínas obteniendo una concentración de 350,8 mg/ml.
Noreen, R. en el 2002, Faisalabad, India en su estudio sobre production of
alpha – amylase from banana peel by Bacillus subtilis [62] realizó pruebas para
determinar la estabilidad operacional de la enzima y reportó que esta era
estable a 60°C durante 3 horas que después de este tiempo esta disminuye su
actividad enzimática. Nueve años después, Rajshree S., India, realizó un
estudio sobre amylase production by solid state fermentation of agro-industrial
using Bacillus sp. [68] donde la alfa amilasa se la obtuvo a partir de sustratos
como salvado de trigo y salvado de arroz, donde sometió a la enzima a
diferentes rangos de temperaturas (30°C – 70°C) y diferentes tiempos de
incubación y reportó que está era estable a los 30°C durante dos horas, que al
aumentar la temperatura y el tiempo de incubación esta reduce su actividad
enzimática. También en esta investigación se realizó un estudio sobre la
estabilidad operacional de la α-amilasa obtenida a partir de las cascaras de
banano verde y del almidón de papa, encontrándose una similitud en la
estabilidad de la enzima respecto al estudio realizado en el 2011 en India.[68]
Respecto al rendimiento que se ha obtenido en la producción de la enzima
alfa amilasa en esta investigación no se encontró estudios donde hayan
57
reportado el rendimiento de la enzima obtenida para poder compararla con el
valor que se obtuvo en esta investigación, que en este caso fue de 27,1 %.
58
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
Las cáscaras de banano verde ecuatoriano resultaron ser un buen sustrato
para realizar la fermentación en estado sólido en la producción de la enzima
alfa amilasa utilizando cepas de Bacillus sp. ya que se obtuvo una actividad
enzimática de 8,13 UE/ml.
El grado de madurez de las cáscaras de banano es importante ya que
cuando están verdes presentan una mayor concentración de almidón que
favorecerá el crecimiento del microorganismo, conforme las cáscaras de
banano se maduran el almidón presente en las cáscaras se transforma en
azúcares.
La actividad enzimática de la alfa amilasa obtenida a partir de las
cáscaras de banano verde ecuatoriano sometidas a un tiempo de incubación
de 24 horas, a una temperatura de 35°C y a un pH 7 fue de 8,13 UE/ml.
El almidón de papa sometido a las mismas condiciones de operación
produjo una actividad enzimática de 7,57 UE/ml pudiéndose considerar como
una fuente favorable para la producción de enzima, sin embargo esta actividad
es inferior a la reportada utilizando nuestro residuo agroindustrial.
La temperatura, el tiempo de incubación y el pH del medio desempeñan un
papel importante en la producción de la enzima.
59
La concentración de proteínas al finalizar el proceso de fermentación
realizado a las condiciones óptimas de operación en el caso de las cáscaras de
banano fue de 350,8 mg/ml y en el caso del almidón de papa fue de 105,8
mg/ml.
5.2 Recomendaciones
Motivar a que se realicen más estudios en esta área de investigación.
Realizar estudios para obtener la enzima alfa amilasa a partir de diferentes
sustratos y de diferentes microorganismos en los que se pueda variar otros
parámetros.
Purificar la enzima para presenciar la amilasa a través de análisis de
biología molecular.
Realizar un análisis proximal de almidón y de azúcares presentes en el
sustrato.
Se propone realizar un estudio de mercado para determinar si es factible
producir y vender este enzima a nivel nacional, ya que al momento ninguna
industria produce o vende esta enzima en forma líquida.
Inmovilizar la enzima a través de procesos de diálisis para eliminar restos
de azúcares que acompañen a la enzima.
Probar la enzima a nivel industrial en el área textil y alimentaria ya que esta
enzima en el área textil puede ser utilizada como biodetergente y en la parte
alimentaria se la puede utilizar para mejorar la calidad de la masa en panadería
y pastelería.
60
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69
ANEXOS
Anexo 1.1 Preparación del sustrato
70
Anexo 1.2. Aislamiento de las cepas de Bacillus sp.
71
Anexo 1.3 Preparación del inóculo
Anexo 1.4 Fermentación en estado sólido
72
Anexo 1.5 Extracción de la enzima
73
Anexo 1.6 Determinación de la actividad enzimática
74
Anexo 1.7 Determinación de la concentración de proteínas
Anexo 1.8 Extracto curdo enzimático
75

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN:

GUAYAQUIL, SEPTIEMBRE 2018

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

AUTORES: MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA

INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

CONTACTO CON LA Nombre: Universidad de Guayaquil – Facultad de Ingeniería Química

Guayaquil, 20 de agosto del 2018

Envío a Ud. El informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación

ING. CECILIA UZCA SORNIOZA, MSc.

Guayaquil, 31 de agosto de 2018

CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR

ING. MARINA ALVARADO, MSc.

LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL

Nosotros, MARTÍNEZ VERA MELANIE ALEXANDRA con C.I. No 092948131-

MARTÍNEZ VERA MELANIE A. MENDOZA CAMEJO EDDER A.

académicos, u otros análogos, sin

Primeramente esta meta va dedicado al ser supremo, mi mayor fortaleza

Elizalde, Alexandra Vera Macías, y a mis pequeños Kaori y Lucero, esto es

Mélanie Alexandra Martínez Vera

Al iniciar la meta llamada Ingeniería Química, siempre le dije a Dios que

sea su voluntad, iluminándome en cada paso que proceda al aceptar

estudiar esta carrera, a Él le debo absolutamente todo.

A mis amados padres, su apoyo incondicional siempre ha estado, el esfuerzo

Alexander, desde el primer día de primer semestre me has apoyado, gracias

por todo amigo.

A la Ingeniera Cecilia Uzca, quien nos ha apoyado desde el principio, su

dedicación, tiempo, enseñanza ha sido incondicional, forma una parte muy

importante en la realización de este trabajo.

A mi hermano, por su apoyo.

A los niños de mi corazón, Kaori y Lucero, por todo su amor.

Mélanie Alexandra Martínez Vera

Dedico este trabajo a Dios porque gracias a él he podido culminar mi

apoyado incondicionalmente en el transcurso de mi carrera universitaria.

A mi hermana Diana Mendoza.

Edder Alexander Mendoza Camejo

A mis tías por haberme apoyado en el transcurso de mi carrera.

A la Ing. Cecilia Uzca Sornoza por su apoyo, colaboración y asesoramiento

en la realización de nuestro trabajo de titulación

Al Ing. Wilfrido Terán Verzola y a la Ing. Mariana Navarro Almeida por

habernos brindado su apoyo en la realización de esta investigación.

A mi compañera de tesis Mélanie Martínez por haberme brindado su

amistad y confianza a lo largo de nuestra carrera universitaria.

Edder Alexander Mendoza Camejo

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA ..................................... I

1.2 Formulación y sistematización de la investigación ................................... 3

1.3 Justificación de la Investigación ................................................................. 4

1.4 Objetivos de la Investigación....................................................................... 6

1.5 Delimitación de la investigación .................................................................. 6

1.6 Hipótesis ....................................................................................................... 7

CAPÍTULO III ................................................................................................... 30

4.2 Discusión de los resultados ...................................................................... 54

Figura 1 Estructura α-amilasa. .................................................................................... 12

Tabla 1. Operacionalización de las variables ................................................................ 9

“PRODUCCIÓN DE ALFA AMILASA POR FERMENTACIÓN EN

La producción creciente de residuos ya es una problemática de interés mundial,

Palabras claves: Alfa amilasa, actividad enzimática, cáscaras de banano,

“PRODUCTION OF ALPHA AMYLASE BY SOLID STATE

The growing production of waste is already a problem of global interest, the

Keywords: Alpha amylase, enzymatic activity, banana peels, 3.5 dinitrosalicylic

La biotecnología es un área multidisciplinaria que está en desarrollo y

presenta una extensa rama de usos, debido a su capacidad de convertir