Daniel Alberto Grajales Hernández

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
INDUCCIÓN DE LIPASAS/ FERULOIL ESTERASAS DE

Aspergillus ochraceus CON RESIDUOS DE LA INDUSTRIA
DEL MAÍZ PARA LA SÍNTESIS DE ÉSTERES DE VALOR
BIOTECNOLÓGICO.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADÉMICO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
I.BQ. DANIEL ALBERTO GRAJALES HERNÁNDEZ
GUADALAJARA, JAL. MAYO 2015.

Contenido
Índice de Figuras ix
Índice de tablas xii
RESUMEN xiii
INTRODUCCIÓN GENERAL .............................................................................................. xv
CAPÍTULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 1
1.1 BIOCATÁLISIS COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLÓGICA. ........................ 2
1.1.1 CATALIZADORES. .......................................................................................... 2
1.1.2 BIOCATALIZADORES..................................................................................... 4
1.2 ENZIMAS. ................................................................................................................. 6
1.2.1 INTERACCIONES ENZIMA-SUSTRATO. ..................................................... 7
1.2.2 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS. .................................................................... 9
1.2.3 HIDROLASAS: ENZIMAS VERSÁTILES EN LA INDUSTRIA. ................ 10
1.2.4 CARBOXIL ÉSTER HIDROLASAS............................................................... 11
1.2.5 LIPASAS Y ESTERASAS. .............................................................................. 11
1.2.6 El GRUPO DE LAS CARBOHIDRATO ESTERASAS. ................................ 17
1.2.7 FERULOIL ESTERASAS: FAES.................................................................... 18
1.2.8 HISTORIA DE LAS FAES. ............................................................................. 22
1.3 LOS HONGOS......................................................................................................... 30
1.3.1 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS. .......................................................... 31
1.3.2 MORFOLOGÍA DE LOS HONGOS. .............................................................. 32
1.3.3 ESPORULACIÓN DE HONGOS. ................................................................... 33
1.3.4 LOS ASCOMICETOS...................................................................................... 33
1.4 PRODUCCIÓN DE LIPASAS Y ESTERASAS FÚNGICAS POR
FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO. .................................................................... 37
1.4.1 ASPECTOS GENERALES DE LA FMS. ....................................................... 38
v
1.5 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DEL MAÍZ: ALTERNATIVA
PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOCATALIZADORES EN LA
INDUSTRIA. .................................................................................................................. 41
1.5.1 LA INDUSTRIA DEL MAÍZ........................................................................... 41
1.5.2 NIXTAMALIZACIÓN..................................................................................... 42
1.5.3 RESIDUOS DEL PROCESO DE NIXTAMALIZACIÓN. ............................. 42
1.6 LOS ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS Y SUS ÉSTERES.................................... 45
1.6.1 LOS ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS........... ¡Error! Marcador no definido.
1.6.2 POTENCIAL BIOLÓGICO DE LOS ÁCIDOS
HIDROXICINÁMICOS Y SUS ÉSTERES. .................................................................. 46
1.7 ÉSTERES DE LUTEÍNA Y SU IMPORTANCIA
BIOTECNOLÓGICA. .................................................................................................... 50
1.8 LAS LIPASAS Y ESTERASAS DE Aspergillus ochraceus (Aoc)
COMO HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS...................................................... 52
CAPÍTULO 2: JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS. .................................... 55
2.1 JUSTIFICACIÓN..................................................................................................... 56
2.2 HIPÓTESIS.............................................................................................................. 56
2.3 OBJETIVO GENERAL. .......................................................................................... 57
2.3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. .......................................................................... 57
CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................ 58
3.1 MATERIALES......................................................................................................... 59
3.1.1 REACTIVOS Y CONSUMIBLES. .................................................................. 59
3.1.2 MATERIAS PRIMAS. ..................................................................................... 59
3.1.3 ENZIMAS......................................................................................................... 59
3.1.4 CEPA DE ESTUDIO........................................................................................ 60
3.2 MÉTODOS............................................................................................................... 60
3.2.1 TRATAMIENTO DE LAS MATERIAS PRIMAS. ........................................ 60
3.2.2 DESARROLLO DE LOS PROCESOS FERMENTATIVOS PARA
LA PRODUCCIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPASA/ FERULOIL
ESTERASA. ................................................................................................................... 62
3.2.3 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA................................................. 64
3.2.4 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA HIDROLASA
RESPONSABLE DE LA ACTIVIDAD DE SÍNTESIS. ............................................... 69
vi
3.2.5 SÍNTESIS DE BUTIL HIDROXICINAMATOS VÍA
ALCOHÓLISIS DE METIL HIDROXICINAMATOS. ................................................ 70
3.2.6 SÍNTESIS DE DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LA AocFae1. ...................... 75
CAPÍTULO 4: PRODUCCIÓN PREFERENCIAL DE LAS LIPASAS Y ÉSTERESAS
DE Aspergillus ochraceus UTILIZANDO RESIDUOS DEL MAÍZ............................. ……76
4.1 INTRODUCCIÓN. .................................................................................................. 77
4.2 ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN DE FAES DE
Aspergillus ochraceus POR Fs Y FMS. ......................................................................... 78
4.3 INDUCCIÓN PREFERENCIAL DE LAS DISTINTAS CARBOXIL
ÉSTER HIDROLASAS DE Aoc. ................................................................................... 80
4.3.1 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE LOS
BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS EMPLEANDO
CASCARILLAS DE MAÍZ............................................................................................ 80
4.3.2 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE LOS
BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS EMPLEANDO FRACCIONES
DEL NEJAYOTE. .......................................................................................................... 84
4.3.1 EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES HIDROLÍTICAS
POST-TRATAMIENTO DE LOS BIOCATALIZADORES PARA SU
SELECCIÓN. ................................................................................................................. 86
4.4 SÍNTESIS DE ÉSTERES DE BUTIL p-CUMARATO Y
DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LOS BIOCATALIZADORES
ENRIQUECIDOS EN DIFERENTES ACTIVIDADES FAE Y LIPASA. ................... 88
4.4.1 EVALUACIÓN DE LAS VELOCIDADES INICIALES EN LA
SÍNTESIS DE BUTIL p-CUMARATO CON LOS BIOCATALIZADORES
ENRIQUECIDOS. .......................................................................................................... 88
4.4.2 EVALUACIÓN DE LA CONVERSIÓN RELATIVA EN LA
SÍNTESIS DE DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LOS
BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS. ................................................................. 89
4.5 SELECCIÓN DE LAS MEJORES CONDICIONES PARA LA
SÍNTESIS DE BUTIL HIDROXICINAMATOS CON LA AocFae1. .......................... 91
4.6 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO...................................................................... 93
CAPÍTULO 5: PURIFICACIÓN PARCIAL Y DETERMINACIÓN DE LOS
PERFILES HIDROLÍTICOS DE LA AocFae1. .................................................................... 95
5.1 INTRODUCCIÓN. .................................................................................................. 96
vii
5.1.1 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA AocFaE1 A PARTIR DEL
EXTRACTO OBTENIDO CON EL CONCENTRADO DEL NEJAYOTE. ................ 97
5.1.2 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA AocFae1 POR
CROMATOGRAFÍA DE PROTEÍNAS. ....................................................................... 98
5.1.3 EFECTO DE LA LONGITUD DE CADENA ACILO EN LA
ACTIVIDAD HIDROLÍTICA DE LA AocFae1 EMPLEANDO ÉSTERES
DE p-NITROFENILO. ................................................................................................. 103
5.1.4 HIDRÓLISIS DE LOS METIL ÉSTERES DE ÁCIDOS
HIDROXICINÁMICOS POR AocFae1. ...................................................................... 104
5.2 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO.................................................................... 106
CAPÍTULO 6: CARACTERIZACIÓN EN SÍNTESIS DE LA AocFae1....................... 107
6.1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................ 108
6.2 IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DE REACCIÓN PARA LA
SÍNTESIS DE BUTIL FERULATO CON LA AocFae1. ............................................ 110
6.2.2 CARACTERIZACIÓN DE LA AocFae1 COMO
BIOCATALIZADOR: SÍNTESIS DE ÉSTERES ALQUÍLICOS DE
ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS. .............................................................................. 115
6.2.3 COMPARACIÓN DE LA AocFae1 CON OTRAS CARBOXIL
ÉSTER HIDROLASAS EN LA SÍNTESIS DE ÉSTERES DE ÁCIDOS
HIDROXICINÁMICOS. .............................................................................................. 119
6.2.4 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO............................................................. 125
CAPÍTULO 7: CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS......................... 127
7.1 CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................... 128
7.2 PERSPECTIVAS ................................................................................................... 129
CAPÍTULO 8: BIBLIOGRAFÍA..................................................................................... 131
viii
Índice de Figuras
Figura1. Energía de activación (ΔG) de una reacción química. ...................................... 3
Figura 2. Distribución de ventas de biocatalizadores en el mundo.. ............................... 5
Figura 3. Modelo de llave cerradura para la catálisis enzimática.................................... 7
Figura 4. Gráfico hiperbólico de la ecuación de Michelis-Menten y su
ecuación. ........................................................................................................................... 9
Figura 5. Ejemplos de ésteres insolubles así como de ésteres solubles o
parcialmente solubles en agua. ....................................................................................... 11
Figura 6. Estructuras de 3 lipasas con lid en su conformación abierta y
cerrada............................................................................................................................. 14
Figura 7. Disposición de la estructura secundaria del α/β fold...................................... 15
Figura 8. Disposición clásica de la triada catalítica de una serin-proteasa.................... 16
Figura 9. Mecanismo de reacción de la hidrólisis de un éster catalizada por
la triada catalítica. ........................................................................................................... 17
Figura 10. Tipos de ésteres que hidrolizan las carbohidrato esterasas.. ........................ 18
Figura 11. Ácidos hidroxicinámicos unidos a compuestos solubles e
insolubles.. ...................................................................................................................... 18
Figura 12. Estructura cristalina de la AnFaeA............................................................... 27
Figura 13. Tipos de esporas y esporóforos de acuerdo a la clasificación
actual de hongos.............................................................................................................. 32
Figura 14. Fotografía de las partes constitutivas del conidióforo del género
Aspergillus ...................................................................................................................... 35
Figura 15. Estructura química de la Ocratoxina A. ....................................................... 36
Figura 16. Esquematización de un sistema clásico de fermentación en
medio sólido en un biorreactor de columnas.. ................................................................ 39
Figura 17. Representación esquemática de una cámara de fermentación con
charolas clásica. .............................................................................................................. 40
Figura 18. Ácido cinámico e hidroxicinámicos.. ........................................................... 45
Figura 19. Representación de la pared celular de las plantas conteniendo
heteroxilanos ferulados. .................................................................................................. 46
Figura 20. Mecanismo antioxidante del ácido ferúlico.. ¡Error! Marcador no definido.
Figura 21. Estructura química de la luteína. .................................................................. 50
ix
Figura 22. Diagrama de bloques del proceso de ultra y nanofiltración para
la valorización del nejayote ............................................................................................ 61
Figura 23. Reacción de hidrólisis de triglicéridos durante la cuantificación
de actividad lipasa determinada con el método espectrofotométrico de
Mateos y col.................................................................................................................... 65
Figura 24. Reacción de esterificación de Fischer-Speier para la generación
de metil ferulato. ............................................................................................................. 66
Figura 25. Reacción de hidrólisis de metil hidroxicinamatos durante la
cuantificación de actividad lipasa determinada con el método
espectrofotométrico de Rámirez y col. ........................................................................... 67
Figura 26. Cinéticas de actividad feruloil esterasa producida por
fermentación en medio sumergido (Fs) y fermentación en medio sólido
(FMS).............................................................................................................................. 78
Figura 27. Zimogramas de las cinéticas de producción de Faes por Fs y
FMS ................................................................................................................................ 80
Figura 28. Cinéticas de actividad Fae y lipasa de las fermentaciones
inducidas con cascarillas de diferentes variedades de maíz............................................ 82
Figura 29. Zimogramas de actividad Fae de las fermentaciones inducidas
con cascarillas de diferentes variedades de maíz. .......................................................... 84
Figura 30. Análisis de los fermentos obtenidos con las distintas fracciones
del nejayote. .................................................................................................................... 85
Figura 31. Actividad Fae y lipasa de los biocatalizadores seleccionados
antes y después del tratamiento.. .................................................................................... 87
Figura 32. Zimogramas de actividad Fae y lipasa. ........................................................ 87
Figura 33. Síntesís de butil p-cumarato con los biocatalizadores
seleccionados. ................................................................................................................. 89
Figura 34. Síntesís de dipropionil luteína con los biocatalizadores
seleccionados. ................................................................................................................. 90
Figura 35. Efecto de diferentes parámetros en la síntesis de butil
hidroxicinamatos con AocFAe1.. ................................................................................... 92
Figura 36. Comparación de la actividad específica Fae y lipasa de los
extractos crudos enriquecidos en AocFae1 obtenidos con cascarilla de maíz
y nejayote. ....................................................................................................................... 97
Figura 37. Cromatograma de purificación de AocFae1 por interacción
hidrofóbica. ..................................................................................................................... 99
x
Figura 38. Cromatograma de purificación de AocFae1 por intercambio
iónico. ........................................................................................................................... 100
Figura 39. Zimogramas de actividad Fae y lipasa de la purificación de
AocFae1 ........................................................................................................................ 101
Figura 40. Cromatograma de purificación de AocFae1 por exclusión
molecular ...................................................................................................................... 101
Figura 41. SDS-PAGE de las fracciones parcialmente puras obtenidas por
cromatografía de exclusión molecular. ......................................................................... 102
Figura 42. Perfil hidrolítico de AocFae1 utilizando ésteres de p-nitrofenilo. ............. 104
Figura 43. Hidrólisis de metil hidroxicinamatos empleando AocFae1 ....................... 105
Figura 44. Estructura química del metil cinamato y distintos isómeros de
ésteres metílicos de ácido cumárico.............................................................................. 105
Figura 45. Hidrólisis de metil cinamato y los isómeros de metil cumarato
empleando AocFae1 ..................................................................................................... 106
Figura 46. Efecto de la concentración porcentual de butanol en el medio de
reacción sobre la actividad de síntesis de AocFae1. ..................................................... 110
Figura 47. Efecto de la cantidad de agua en la mezcla de reacción sobre la
actividad de síntesis de AocFae1. ................................................................................. 111
Figura 48. Efecto protector de la seroalbumina bovina sobre la actividad de
síntesis de AocFae1. ..................................................................................................... 113
Figura 49. Efecto del pH aparente sobre la actividad de síntesis de
AocFae1. ....................................................................................................................... 113
Figura 50 Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad de
síntesis de AocFae1. ..................................................................................................... 114
Figura 51. Velocidad inicial en la síntesis de butil hidroxicinamatos por
AocFae1.. ...................................................................................................................... 115
Figura 52. Síntesis de alquil ferulatos usando AocFae1.............................................. 117
Figura 53. Efecto de la ramificación del butanol en la síntesis de x-Butil
ferulato usando AocFae1. ............................................................................................. 118
Figura 54. Efecto de la posición hidroxilo del anillo arómatico del ácido
cumárico en la síntesis de butil cumaratos usando AocFae1........................................ 119
Figura 55. Velocidad inicial en la síntesis de los 4 butil hidroxicinamatos
con los biocatalizadores seleccionados. ........................................................................ 121
Figura 56. Comparativo de la síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos
llevados a cabo usando AocFae1 y RML.. ................................................................... 124
xi
Índice de tablas
Tabla 1. Clasificación de las enzimas de acuerdo con la Enzyme Commission..................... 10
Tabla 2. Tabla de lipasas comerciales y su aplicación industrial. .......................................... 12
Tabla 3. Clasificación de la Faes de acuerdo a Crepin. .......................................................... 19
Tabla 4. Sustratos utilizados para la determinación de la actividad feruloil esterasa. ............ 20
Tabla 5. Soluciones tampón utilizadas para la evaluación del pH óptimo de la AocFae1 en la
síntesis de butil ferulato. ......................................................................................................... 73
Tabla 6. Composición de las microemulsiones utilizadas para la síntesis de los ésteres de
ácidos hidroxicinámicos.......................................................................................................... 75
Tabla 7. Diseño de las combinaciones inóculo/fermentación con dos variedades de cascarillas
de maíz. ................................................................................................................................... 81
Tabla 8. Nomenclatura y características de los biocatalizadores seleccionados antes del
tratamiento. ............................................................................................................................. 86
Tabla 9. Coeficiente de partición Agua:Octanol de los solventes utilizados en la síntesis del
butil ferulato............................................................................................................................ 93
Tabla 11. Resumen de la purificación de la AocFae1, mediante cromatografía de proteínas
............................................................................................................................................... 103
Tabla 12. Determinación dela actividad lipasa sobre los inmovilizados comerciales .......... 120
xii
RESUMEN
Las lipasas y feruloil esterasas (Faes) son hidrolasas que se caracterizan por catalizar una
gran variedad de reacciones de hidrólisis y síntesis. El hongo filamentoso Aspergillus
ochraceus (Aoc), aislado de los residuos del café, tiene una maquinaria enzimática capaz de
hidrolizar diversos compuestos fenólicos y ésteres de distinta naturaleza propios del residuo,
por lo cual es una fuente interesante de lipasas y Faes. Con anterioridad, nuestro grupo de
trabajo sugirió la producción de al menos tres lipasas y demostró que se pueden inducir dos
Faes. Además, fermentos sólidos secos de este hongo fueron capaces de sintetizar el butil p-
cumarato y la dipropionil luteína; ambos productos de gran interés en la industria cosmética y
alimenticia principalmente por su capacidad antioxidante.
Por lo anterior, los esfuerzos de este trabajo se concentraron en identificar la hidrolasa

responsable de llevar a cabo las reacciones de síntesis. Para esto, se desarrollaron estrategias
fermentativas usando residuos del maíz para inducir preferencialmente cada una de las
hidrolasas de interés. En particular, utilizando diferentes cascarillas de maíz se logró generar
un biocatalizador enriquecido con una Fae de aproximadamente 30 KDa (AocFae1), y tras
evaluarlo en las dos reacciones modelo, la evidencia sugirió que la AocFae1 estaba
involucrada en ambas reacciones. Por lo tanto, se produjo la AocFae1 vía fermentación
sólida usando nejayote concentrado, mediante una membrana de 200Da, como inductor ya
que mediante su uso no se detectó actividad lipasa durante la fermentación, enriqueciendo la
actividad específica del extracto enzimático (de 0.081 a 0.264 U/mg de proteína). Hasta
donde llega nuestro conocimiento, este es el primer reporte en donde se utiliza el nejayote
como inductor de la actividad feruloil esterasa en un hongo filamentoso.
Posteriormente, se realizó la purificación parcial de la AocFae1 usando cromatografía de

líquidos rápida para proteínas; empleando etapas secuenciales de interacción hidrofóbica,
intercambio iónico y exclusión molecular. Con esto, se logró enriquecer 32.3 veces la
actividad de la AocFae1, y se obtuvo una actividad especifica de 8.9 U/mg sobre metil
ferulato.
La proteína se evaluó en la síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos usando un sistema

ternario (isooctano/alcohol/agua; 73/25/2; v/v/v). Con este sistema, la AocFae1 fue capaz de
xiii
sintetizar los cuatro butil hidroxicinamatos con una velocidad inicial comparable a lo
reportado en la literatura, y teniendo una ligera preferencia por sintetizar el butil cafeato
(3.46 U/mg de proteína; Butil cafeato> Butil ferulato> Butil p-cumarato> Butil sinapinato).
Además, fue capaz de aceptar cadenas de hasta 8 carbonos y el sec-butanol para la síntesis de
los ésteres ferulados (0.089 y 0.47 U/mg de proteína, respectivamente), y de realizar todos
los isómeros de butil cumarato (2.14, 1.74, 1.08 U/mg de proteína para meta, para y orto
respectivamente). Subsecuentemente, se evaluó mol a mol la capacidad de síntesis de ésteres
de ácidos hidroxicinámicos de la AocFae1 contra la preparación comercial inmovilizada de la
lipasa de Rhizomucor miehei (Lipozyme; RML), que mostró la mejor actividad con
respecto al resto de las hidrolasas empleadas en el estudio; demostrando que la velocidad
inicial de AocFae1 es comparable con RML en la síntesis de butil ferulato (85.2 contra 96.1
U/mol de proteína) pero inferior en la de butil sinapinato (12.8 contra 100.7 U/mol de
proteína). No obstante, AocFae1 fue capaz de sintetizar el butil cafeato, producto que no fue
capaz de sintetizar RML. Esto indica un perfil complementario de ambas enzimas para la
síntesis de una amplia gama de ésteres de ácidos hidroxicinámicos.
Por otra parte, se evaluó la AocFae1 en la síntesis de dipropionil luteína (DPL).

Infortunadamente, en las condiciones evaluadas no fue capaz de sintetizar este producto, por
lo cual se descartó como responsable de la síntesis.
Mediante este trabajo se logró utilizar el nejayote para la inducción de una Fae con
aplicación en la síntesis de ésteres de alto valor biotecnológico comparable a la de
biocatalizadores utilizados actualmente en la industria. Además esto da pie a investigaciones
más profundas para la identificación de la hidrolasa capaz de sintetizar los ésteres de luteína,
ya que las herramientas necesarias para ello se han implementado
xiv
INTRODUCCIÓN GENERAL
El uso de la biocatálisis para la obtención y transformación de compuestos biotecnológicos
data de hace ya más de 100 años, pero desde hace sólo 30 se ha reconocido el potencial de
los catalizadores naturales para la síntesis de compuestos no naturales. Actualmente, los
biocatalizadores son ampliamente utilizados en procesos a nivel industrial en distintos ramos.
Las enzimas han sido los biocatalizadores más estudiados, son moléculas complejas de
carácter proteico que tienen la capacidad de llevar a cabo un sinfín de reacciones químicas
que sustentan la vida, por lo que pueden ser encontradas en cualquier organismo. Algunas de
ellas tienen una increíble afinidad por catalizar reacciones muy específicas, en donde un sólo
sustrato es convertido en un sólo producto. Esta característica es la más destacada, y ha
hecho que se cobre un especial interés por aislarlas y usarlas en procesos industriales, donde
normalmente se utilizan catalizadores químicos inespecíficos que dan lugar a un gran número
de subproductos que muchas veces no son de interés.
El grupo de las hidrolasas, que catalizan la ruptura de una molécula a través de la liberación
de agua, ha sido de los más estudiados y utilizados en biotecnología por su versatilidad para
utilizar una amplia variedad de sustratos. De este grupo destacan las lipasas (EC 3.1.1.3) y
feruloil esterasas (Faes; EC 3.1.1.73), las cuales hidrolizan ésteres de cadena larga y ésteres
de ácidos hidroxicinámicos, respectivamente.
Generalmente estas hidrolasas son obtenidas de hongos filamentosos, ya que las secretan
para la obtención de una fuente de carbono simple a partir de otra más compleja. En
particular, los géneros Rhizopus, Rhizomucor y Aspergillus, ha sido bastante socorridos para
la producción de éstas. Tradicionalmente las lipasas y feruloil esterasas se producen
utilizando fermentación en medio sumergido (Fs) y más recientemente con fermentación en
medio sólido (FMS) [1]. Se ha demostrado que el empleo de residuos agroindustriales como
el salvado de trigo, pulpa de remolacha azucarera y cascarilla de maíz pueden inducir lipasas
y Faes [2]. El uso de la cascarilla de maíz resulta particularmente atractivo debido a que es
rico en compuestos fenólicos libres o ésterificados, y por su alto contenido de lípidos
presentes en el gérmen, los cuales son inductores adecuados para la producción de ambas
hidrolasas.
xv
Por otra parte, diversas investigaciones se han enfocado a explotar la especificidad y
selectividad de las lipasas y Faes para producir ésteres con valor biotecnológico.
Específicamente para funcionalizar moléculas y poder integrarlas a alimentos o cosméticos;
así como también sintetizar/producir/generar precursores para nuevos farmácos que permitan
contrarrestar los crecientes problemas de las enfermedades crónico degenerativas [3]. Un
grupo de particular interés son los ésteres de ácidos hidroxicinámicos y los de algunos
carotenoides como la luteína.
El principal interés de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos radica en su actividad

antioxidante, antitumoral, antiviral, fotoprotectora, entre otras [4]. Estas actividades también
se han observado en su forma libre; sin embargo, al esterificar la función ácida con alcoholes
de diferente longitud o compuestos hidrofílicos como ácido ascórbico o glicerol se logran
potenciar [5-8]. Naturalmente los ácidos hidroxicinámicos están ampliamente distribuidos en
el reino vegetal, se han reportado en algunos granos como el maíz y el café con un contenido
de hasta el 3% (p/p) [9]. En la mayoría de los casos, se encuentran esterificados en forma
monomérica o dimérica a unidades de arabinosa, xilosa, galactosa o ácido quínico. En los
cereales, estas moléculas sirven de conexión entre la lignina y la hemicelulosa ayudando a
fortalecer la estructura de la pared celular [10-12]. En la actualidad, se han desarrollado
procesos industriales para extraer este tipo de ácidos y usarlos como precursores de los
ésteres previamente mencionados, entre otras moléculas con valor industrial.
Por otra parte, la luteína es un dihidroxicarotenoide encontrado comúnmente en los

miembros de la especie Tagetes (Cempaxúchitl) [13]. Aquí, la luteína está ésterificada con
ácidos grasos de cadena larga como láurico, mirístico y palmítico [14]. Tradicionalmente, los
ésteres de luteína se utilizan durante la alimentación de pollos para proveer el color amarillo
característico de la piel, que a su vez resulta en una coloración más intensa en las yemas de
los huevos, lo cual hace que los consumidores los encuentren más atractivos [14]. En el
humano, la luteína puede reducir el riesgo de la degeneración macular relacionada con la
edad (AMD, por sus siglas en inglés) [15-17]. Además, estudios previos sugieren que
también puede ayudar a mantener la salud cardiaca reduciendo el riesgo de aterosclerosis
[18].
xvi
A pesar de las multiples propiedades de la luteína, su disposición en la naturaleza limita su
uso, ya que los ésteres de cadena larga son poco asimilables por los organismos superiores.
La forma libre es asimilable; sin embargo, los múltiples dobles enlaces en la molécula libre la
hacen susceptible a la oxidación, degradación por acción de la luz UV y altas temperaturas
[19]. Recientemente, se ha comprobado que la luteína esterificada con ácidos grasos de
cadena corta presenta una biodisponibilidad similar a la forma libre e incrementa su
estabilidad a la luz UV y temperatura, permitiendo su empleo en la formulación de nuevos
productos. Por lo tanto, se requiere encontrar las herramientas biotecnológicas capaces de
funcionalizar estas moléculas.
Dentro de nuestro grupo de trabajo se han logrado obtener los ésteres de las moléculas
mencionadas utilizando la maquinaria enzimática de Aspergillus ochraceus (Aoc; NCBI:
EU805804). Este hongo filamentoso fue aislado de los residuos de la industria del café, por
lo que está naturalmente adaptado a altas concentraciones de compuestos fenólicos como los
ácidos hidroxicinámicos; y sus enzimas están diseñadas para hidrolizar sus ésteres y hasta
utilizar los productos de la hidrólisis como fuente de carbono.
En trabajos previos se demostró que este hongo puede expresar diferentes carboxil éster
hidrolasas, entre ellas tres lipasas y dos Faes. En estos trabajos se empleó la fermentación en
medio sólido (FMS) [20, 21] utilizando lípidos y residuos de la industria del maíz como
soporte/sustrato para la inducción de estas hidrolasas. Los fermentos sólidos obtenidos, se
emplearon exitosamente en la síntesis del butil p-cumarato, así como la dipropionil luteína
[21, 22]. No obstante, hasta este trabajo, había sido imposible dilucidar qué actividad
enzimática era responsable de catalizar las reacciones antes mencionadas.
Tras el intento de identificar si alguna de las lipasas era responsable de llevar a cabo las
reacciones modelo, se realizó un estudio enfocado a purificar esta actividad. La inducción de
las lipasas se realizó en presencia de lípidos, lo que dificultó enormemente los protocolos de
purificación debido a la formación de complejos lipoprotéicos, y no fue posible evidenciar a
las lipasas como las responsables de la síntesis de ésteres de luteína. Una alternativa para
contrarrestar esto es mediante el uso de residuos agroindustriales con bajo contenido de
lípidos, como inductores de las enzimas de interés.
xvii
Algunos residuos agroindustriales interesantes, son los generados por la industria del maíz.
Por la naturaleza de la dieta en México, grandes cantidades de este cereal son procesadas por
la industria, generando residuos sólidos (cascarillas) y líquidos (nejayote). Actualmente el
residuo líquido de la industria del nixtamal (nejayote), es un gran problema en materia
ambiental. Sin embargo, la valorarización del nejayote ha demostrado que es rico en
compuestos fenólicos como arabinoxilanos y ácido ferúlico [23]. Por lo tanto, podrían ser un
recurso novedoso para la producción de hidrolasas, e incluso podría inducir la producción
preferencial de Faes sobre otras hidrolasas, como las lipasas.
Por lo tanto, en este trabajo de tesis se postula que la actividad enzimática responsable de las
síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos y de luteína, podría inducirse
preferencialmente y purificarse, empleando residuos de maíz como inductores en el cultivo
de Aspergillus ochraceus, lo que permitirá finalmente caracterizar las enzimas involucradas y
explotar de manera más adecuada sus capacidades biocatalíticas.
El trabajo realizado para alcanzar este objetivo se detalla en siete capítulos, al término de
cada capítulo de resultados se da una conclusión parcial que engloba lo más relevante de
cada etapa del trabajo.
El primer capítulo, la revisión bibliográfica, da a conocer al lector todas las bases necesarias
para la comprensión de los fenómenos descritos y lo ubicará en un plano general de
actualidad que permitirá entender los alcances del trabajo realizado.
Los capítulos dos y tres describen la problemática, hipótesis, objetivos y metodología

planteada para la realización de este trabajo.
En el cuarto capítulo se muestra un estudio comparativo de la fermentación en medio

sumergido y sólido empleando distintas cascarillas de maíz como inductores de las
actividades de interés, así como la selección del sistema fermentativo empleado durante el
desarrollo del trabajo. Posteriormente, se muestra la evaluación de cada uno de los residuos
de la industria del maíz, en la producción preferencial de cada una de las hidrolasas
involucradas en la síntesis. Las estrategias utilizadas en esta sección permitieron finalmente
identificar la hidrolasa responsable de la actividad de síntesis de ésteres de ácidos
hidroxicinámicos.
xviii
En el quinto capítulo se remarcan las ventajas de utilizar inductores adecuados para la
producción de la AocFae1, destacando el hecho de que una mayor producción de la AocFae1
no siempre esta ligada a una mayor actividad específica. Por último, se describe la estrategia
empleada para lograr la purificación parcial de la AocFae1.
En el sexto capítulo, con el catalizador (AocFae1) libre de otras actividades contaminantes,

se demostró el potencial catalítico de la AocFae1 en la síntesis de los ésteres de cuatro ácidos
hidroxicinámicos, además, se puso a prueba contra otra serie de ésteres para ver la influencia
de algunos motivos estructurales en la reacción de esterificación, como la longitud de la
cadena alquilo o la posición del hidroxilo en el anillo aromático del ácido cumárico.
Finalmente, en el capítulo siete se dan a conocer las conclusiones generales de este trabajo,
así como las perspectivas que permitirán encaminar estudios futuros sobre este interesante
tema.
xix
Capítulo 1:Revisión bibliográfica
CAPÍTULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1
1.1 BIOCATÁLISIS COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLÓGICA.

El uso de la biocatálisis para la obtención y transformación de compuestos biotecnológicos
no es nada nuevo, desde hace más de 100 años se han utilizado células completas, organelos
o enzimas aisladas para este propósito. Sin embargo en aquellos días; la biocatálisis se
desarrolló para la elucidación de rutas metabólicas y la comprensión de algunas
biotransformaciones [24]. No es hasta mucho tiempo después que se reconoce el potencial de
los biocatalizadores naturales para generar compuestos sintéticos. En 1980 se sugirió que las
enzimas pueden ser catalizadores más eficientes que los de origen químico; y no es hasta
1990, cuando la síntesis orgánica se convirtió en un tema popular. Desde este evento, el uso
de enzimas como biocatalizadores ha sido ampliamente estudiado e incluso ha ganado
terreno en los procesos a nivel industrial.
En la actualidad, algunos biocatalizadores pueden ser usados casi de igual forma que los
catalizadores químicos, ya que la manera de obtenerlos se ha simplificado y llevado a escala
industrial, lo que permite reducir los costos de producción. Además ofrecen la gran ventaja
de catalizar una gran cantidad de reacciones mucho más complejas y específicas, que
difícilmente pueden ser igualadas por los catalizadores químicos.
Si tomamos en cuenta que alrededor del mundo cerca del 80% de todos los procesos
químicos se realizan utilizando un catalizador, y que generan un valor anual de alrededor de
400 mil millones de Euros, los procesos biocatalíticos pueden llegar a representar el principal
pilar de la biotecnología aplicada [25].
1.1.1 CATALIZADORES.
Los catalizadores son sustancias que facilitan una reacción química, ya que hacen que la
reacción se lleve a cabo más rápido abriendo una ruta más eficiente para que esto ocurra [26].
La ruta en la que ocurre la reacción tiene que pasar una barrera energética conocida como
energía de activación (ΔG), que es la energía necesaria para que exista la interacción entre
los reactantes y dé lugar al producto. Una vez alcanzada (estado de transición), el resto de la
reacción ocurre sin requerimientos energéticos o incluso liberando energía. Es decir, cuando
se utiliza un catalizador para acelerar la reacción, en realidad se está disminuyendo la ΔG
necesaria para que esta se lleve a cabo (Figura 1).
2
Figura1. Energía de activación (ΔG) de una reacción química. En azul se muestra la ΔG que se requiere cuando
no se emplea un catalizador y en rojo cuando es catalizada.
El catalizador sólo es un intermediario, y no forma parte de la reacción química, por lo cual

al final de cada ciclo de reacción se puede regenerar y reutilizar en un nuevo ciclo, por lo que
sólo se requieren cantidades muy pequeñas del mismo. La cantidad utilizada de catalizador
para una reacción química, es decir el cociente entre catalizador/sustratos, refleja la eficiencia
del mismo.
Los catalizadores pueden ser de distinta naturaleza y complejidad, desde un simple protón
hasta enormes complejos de aminoácidos como las enzimas, sin embargo, se les ha
clasificado por el estado físico en el que se encuentran. De este modo surge la clasificación
de los catalizadores como homogéneos y heterogéneos.
Los catalizadores homogéneos son todos aquellos que se encuentran en el mismo estado
físico que los sustratos, usualmente líquido. Un ejemplo, es la esterificación de ácidos grasos
con metanol para la síntesis de ésteres metílicos vía Fisher-Speier. En este caso la reacción se
cataliza con un ácido fuerte en un medio totalmente homogéneo y anhidro [27].
Por otro lado, en las reacciones en las que el catalizador presenta un estado físico distinto al
de los reactantes, se le cataloga como catalizador heterogéneo. Son bastante comunes en los
procesos industriales, ya que un catalizador heterogéneo no se mezcla en la reacción
permitiendo su fácil recuperación y reuso. Un ejemplo, es la reacción de hidrogenación del
propeno para la producción de propano en la industria petroquímica. En esta reacción los
3
sustratos se encuentran en estado gaseoso y es catalizada en varios pasos por un catalizador

metálico como el níquel, el paladio o el platino [26].
Dependiendo de los autores, esta clasificación puede variar, algunos incluso agrupan a los
biocatalizadores en un grupo totalmente diferente a los mencionados anteriormente, aunque
estos también puedan ser de carácter homogéneo (preparaciones enzimáticas líquidas) y
heterogéneo (inmovilizados enzimáticos).
1.1.2 BIOCATALIZADORES.
En la gran mayoría de los casos los biocatalizadores (catalizadores de origen biológico) son
enzimas, aunque también pueden ser ácidos nucleicos (ribozimas), organelos celulares o
incluso toda una célula.
Las enzimas son biocatalizadores extremadamente eficientes, ya que en algunos casos

pueden realizar hasta 1000 ciclos catalíticos por segundo, comparados con los 10 a 1000
ciclos por hora de su contraparte química [26]. Además, algunos de ellos tienen la
peculiaridad de transformar un sustrato específico en un sólo producto. Esto es lo que los
hace tan codiciados, ya que la gran mayoría de los procesos catalizados químicamente,
generan subproductos que no son útiles, por lo que se requieren etapas de purificación
posteriores a la síntesis, y los rendimientos pueden llegar a ser pobres. Un caso destacado es
la síntesis del edulcorante aspartame, lograda a través de la reacción de condensación del N-
benziloxicarbonil L-aspartato y el metil éster de la fenilalanina. En esta reacción se utiliza un
sustrato racémico, por lo cual se pueden generar dos productos distintos, uno conocido por
ser el edulcorante y otro de características organolépticas no deseadas (amargo), el uso de la
termolisina permite la generación específica del edulcorante y no del isómero amargo en una
sola etapa [28].
1.1.2.1 MERCADO DE LOS BIOCATALIZADORES EN LA

ACTUALIDAD.
Actualmente el mercado de los biocatalizadores está en constante crecimiento debido a la
amplia gama de posibilidades en las que pueden ser aplicados. Estas aplicaciones pueden ser
catalogadas en 6 grandes categorías [29]:
4
1. Cuidado del hogar: en este apartado se catalogan todos los productos que son
empleados para tareas del hogar, como detergentes, limpiadores multiusos, etc.
2. Comidas y bebidas: que para su generación requieren algún tipo de proceso
biocatalítico, por ejemplo la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa para la
producción de leche deslactosada.
3. Bioenergía: biocatalizadores utilizados para la generación de biocombustibles como
biodiesel o en etapas previas de obtención de las materias primas.
4. Alimentación y otros: son los biocatalizadores producidos para el tratamiento de
alimentos para el ganado, así como los catalizadores generados que no entran en
alguna otra categoría.
5. Microorganismos: son los biocatalizadores en los cuales se requiere toda la célula
para su uso y aprovechamiento.
6. Biofarma: en esta categoría entran los biocatalizadores empleados en la industria
farmacéutica para la generación de compuestos con actividad antiinflamatoria,
antiviral, etcétera; generalmente son usados para la obtención de compuestos
enantioméricamente puros.
Actualmente, la mayoría de los biocatalizadores producidos son utilizados para la generación

de productos del cuidado del hogar, con hasta un 34% del total de ventas (Figura 2A). Cabe
destacar que en el ramo de las ventas de biocatalizadores, hay contados competidores, siendo
Novozymes el más destacado, acaparando hasta un 47% del total de ventas en el mundo
(Figura 2B).
Figura 2. Distribución de ventas de biocatalizadores en el mundo. A.Distribución de las ventas dentro del
campo de aplicación de los biocatalizadores en el año 2012 [29]. B. Distribución de ventas por empresa del
mercado de enzimas para su uso industrial [29].
5
Por lo anterior, en la actualidad el descubrimiento y estudio de nuevos biocatalizadores es

necesario, ya que como propósito general, la industria pretende ampliar el uso de estos para
la implementación de procesos y productos amigables con el ambiente.
1.2 ENZIMAS.
Las enzimas comprenden un grupo de catalizadores de origen proteico. De acuerdo con la
naturaleza de los aminoácidos que forman la cadena primaria, las enzimas adoptan una
configuración tridimensional, generada por interacciones débiles entre ellas las fuerzas de
Van der Walls, puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, enlaces iónicos, etc; y por
interacciones fuertes, como los enlaces covalentes formados por la oxidación de dos residuos
de cisteína. La enzima adoptará la conformación tridimensional que requiera una menor ΔG
[30].
En la gran mayoría de los casos, las enzimas tienen localizados residuos hidrofóbos en el
centro de la estructura e hidrofílicos en la superficie, como consecuencia, la enzima está
cubierta por un delgada capa de moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno, que
representa del 5 al 10% del peso total de ella. Esta monocapa es necesaria para la retención
de su estructura tridimensional y la conservación de su actividad catalítica. Por lo tanto, las
interacciones que existen en la superficie de la enzima son más fuertes que las que existen en
el centro, lo cual genera una estructura con núcleo suave y superficie rígida. Lo anterior
facilita movimientos conformacionales durante la catálisis y por lo tanto resalta su carácter
como catalizador dinámico.
Del mismo modo, la plasticidad de la enzima representa una desventaja, ya que son
intrínsecamente inestables en solución y se pueden desnaturalizar a causada de un incremento
en la temperatura, pH extremos o altas concentraciones de sal. Lo anterior ha fundado una
serie de prejuicios en contra de las enzimas como catalizadores en la industria, ya que se
creen que son extremadamente sensibles; sin embargo esto mismo sucede con un gran
número de catalizadores químicos. Cuando ciertos parámetros se preservan, las enzimas
suelen ser catalizadores muy estables [31, 32].
6
1.2.1 INTERACCIONES ENZIMA-SUSTRATO.

El primer mecanismo de reacción propuesto para una enzima lo realizó Fisher en 1894 [33].
El propone que un sustrato interactúa mecánicamente con la enzima del mismo modo que lo
haría una llave en una cerradura (lock and key). Por lo tanto, sólo los sustratos que entran en
en el sitio activo de la enzima se convertirán en productos (Figura 3). Sin embargo, esto no
explica los mecanismos de reacciones más complejas como las acopladas.
Figura 3. Modelo de catálisis enzimática de llave y cerradura. 1. Sustrato conformado por dos azúcares unidas
mediante un enlace glicosídico. 2. Sitio activo de la enzima, geométricamente configurado al sustrato. 3.
Atracción del sustrato y la enzima. 4. Unión enzima-sustrato. 5. Ruptura del enlace glicosídico mediante una
molécula de agua (hidrólisis). 6. Liberación de los productos. 7. Regeneración de la enzima libre.
En 1958 Koshland propone el modelo de ajuste inducido (induced-fit) [34], en este se sugiere
que las enzimas no son rígidas, si no que tienen cierta flexibilidad, lo que permite que la
enzima en presencia del sustrato pueda cambiar su conformación de tal modo que pueda
“envolver” al sustrato, permitiendo de este modo la catálisis. Este modelo puede explicar por
qué varios sustratos con diferente grupo reactivo pueden ser catalizados por la misma
enzima, el ejemplo más claro de este ajuste inducido son las lipasas, ya que pueden catalizar
reacciones con sustratos (aminas, ácidos fenólicos, carotenoides, etc.) distintos a su sustrato
natural (triglicérido). Hasta la fecha este modelo es uno de los más aproximados a la realidad.
7
1.2.1.1 MODELO DE MICHAELIS-MENTEN.

El Modelo de Michaelis-Menten es uno de los modelos de cinética enzimática más conocido,
ya que describe la velocidad de casi cualquier reacción enzimática en donde tanto los
sustratos y la enzima se encuentran en la misma fase. Este modelo surge a partir del trabajo
“Kinetics of Invertase Action”, en él, se demuestra que la velocidad de la reacción depende
de la concentración de sustrato, siguiendo una relación hiperbólica (Figura 4), y se
comprueba que la catálisis enzimática es debida a la formación de un complejo enzima-
sustrato. Esta relación se pudo expresar en la famosa ecuación que lleva el nombre de los
autores, Michaelis-Menten [35, 36]. Desde ese entonces, esta ecuación ha sido usada en un
sin número de ensayos enzimáticos y se colocardo, tal vez, como la mejor forma de describir
el comportamiento de una enzima en solución acuosa homogénea.
De la ecuación de Michaelis-Menten, se derivan dos constantes que ayudan a comprender la

especifidad de la enzima por su sustrato; Vmax, la cual indica la máxima velocidad de una
enzima a concentraciones saturantes de sustrato, y KM, que ofrece un valor numérico a la
afinidad de la enzima por un sustrato. KM es conocida como la constante de Michaelis y se
define tradicionalmente como la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad
de la Vmax. Estas constantes han sido ampliamente utilizadas para caracterizar un gran
número de enzimas; sin embargo, el cociente Vmax/KM ha logrado trascender como la mejor
forma de conocer la especifidad de una enzima por un sustrato.
8
Figura 4. Gráfico hiperbólico de la ecuación de Michelis-Menten y su ecuación. El eje de las X corresponde al

rango de concentraciones usadas para determinar las constantes Vmax y Km. Sobre el eje de la Y, los valores de
velocidad inicial de cada ensayo.
Esta ecuación no aplica para todas las enzimas y existen modelos más precisos para describir
las cinéticas en donde los reactantes no se encuentran en solución acuosa, o simplemente no
están en la misma fase, aquí existen otros fenómenos como de adsorción/desorción que
implican otra secuencia de pasos en la catálisis enzimática. Lo anterior es una de las causas
por las que ha sido necesario generar una clasificación de enzimas.
1.2.2 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS.

E 1955, la “International Union of Biochemistry and Molecular Biology” creó la Comisión
de Enzimas (EC por sus siglas en inglés) la cual generó 6 categorías globales que incluyen
las enzimas actualmente descubiertas. Esta clasificación se basa exclusivamente en la
reacción que catalizan, por lo que dos enzimas totalmente distintas en origen (animal,
vegetal, bacteriana, etc), tamaño o estructura tridimensional, se pueden clasificar dentro de la
misma categoría.
La EC recurre a una nomenclatura, en la que se utilizan 4 números separados por un punto

para pasar de una categoría general a otras más particular, tiene una forma general EC
A.B.C.D. donde EC se antepone para hacer referencia a la Comisión de Enzimas (Tabla 1);
A, denota el tipo principal de reacción que se cataliza; B, indica el subtipo, indicando la clase
de sustratos o el tipo de molécula transferida; C, indica la naturaleza del co-sustrato, y D,
indica el número individual de la enzima. Por ejemplo, una feruloil esterasa (de las cuales se
hablará más adelante), está clasificada por la EC como EC 3.1.1.73, en este caso el número 3
indica que pertenece al grupo de las hidrolasas, el siguiente número indica que son enzimas
que actúan sobre el enlace éster, el tercer dígito indica que la enzima pertenece al grupo de
las carboxil éster hidrolasas, y, finalmente, el número 73 indica el grupo que hidroliza, el
enlace éster entre una molécula de ácido ferúlico y un grupo hidroxilo de naturaleza variada.
1.2.3 HIDROLASAS: ENZIMAS VERSÁTILES EN LA INDUSTRIA.

Este grupo de enzimas cataliza reacciones de hidrólisis, es decir, la ruptura de una molécula
en productos con la intervención de agua. Su función principal en los seres vivos es de
digestión, ya que generan moléculas más pequeñas con el fin de poder ser asimiladas por el
9
organismo [28]. Un ejemplo son las lipasas, que hidrolizan triglicéridos para generar ácidos
grasos que pueden ser acoplados al ciclo de Krebs en la mayoría de los seres vivos. Debido a
esta función digestiva, algunas hidrolasas están especializadas para ser catalizadores robustos
y aceptar sustratos de diversa complejidad [28].
Tabla 1. Clasificación de las enzimas de acuerdo con la Enzyme Commission.

Numeración Clasificación global Tipo de reacción que catalizan
EC
1 Oxidoreductasas Catalizan reacciones de óxido-reducción.
Transfieren H u O de un compuesto a otro.
2 Tranferasas Transfieren un grupo funcional de un compuesto a
otro.
3 Hidrolasas Generen dos productos a partir de un sustrato por
medio de hidrólisis.
4 Liasas Adicionan o remueven grupos de sustrato sin
necesidad de hidrólisis.
5 Isomerasas Reacomodan moléculas para dar lugar a isómeros.
6 Ligasas Unen dos moléculas para dar lugar a una nueva

por medio de la liberación de ATP.
Otra ventaja que presentan las hidrolasas es su capacidad para catalizar reacciones de
síntesis. Esto se puede lograr desplazando el sentido de la reacción en sentido contrario,
eliminando el agua de la reacción y sustituyéndola con otro donador de electrones como un
alcohol. Esta estrategia es muy socorrida para lipasas. Otra forma de realizar la síntesis de
moléculas, es mediante el uso de sustratos solubles en agua para formar productos insolubles,
de esta forma la reacción se vuelve irreversible y se favorece la síntesis como en el ya citado
caso de la termolisina para la producción de aspartame [37].
Por lo anterior, las hidrolasas son el grupo de enzimas más usado en la industria. Se estima
que en más del 40% de los procesos catalizados por enzimas se utilizan hidrolasas. Entre sus
aplicaciones se encuentran la formulación de detergentes, aditivos alimenticios, la industria
10
del cuero, biocombustibles, textiles, papel, síntesis de fármacos, etc. [38, 39]; además, se
adicionan a fórmulas comercilaes como aditivos.
1.2.4 CARBOXIL ÉSTER HIDROLASAS.

Este grupo de enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces éster en presencia de agua. Entre
las enzimas más importantes de este grupo están las lipasas y esterasas.
1.2.5 LIPASAS Y ESTERASAS.

Las lipasas y esterasas pueden tener diferente origen microbianos, vegetales y animales,
en la mayoría de los casos, su rol es digestivo, ya que catalizan la hidrólisis de ésteres con el
fin de obtener carbono utilizable para el organismo huésped [40]. La diferencia entre ambas
es el tipo de sustratos que aceptan; mientras que las lipasas pueden hidrolizar ésteres poco o
nada solubles en agua, como los triglicéridos, las esterasas sólo son capaces de llevar a cabo
la hidrólisis de ésteres solubles en agua (Figura 5).
Figura 5. Ejemplos de ésteres insolubles, solubles o parcialmente solubles en agua.
En general, las lipasas (EC 3.1.1.3) han tenido un rol más destacado en biocatálisis, ya que
pueden utilizar sustratos insolubles en agua. La formación de interfaces agua/compuestos
apolares, permite que las lipasas sean más activas catalíticamente. Esta propiedad ha sido
explotada en la manufactura de lácteos y quesos.
Actualmente hay más de 70 preparaciones enzimáticas enriquecidas con lipasas que han sido
ampliamente estudiadas y utilizadas en campos como la industria de detergentes, alimenticia,
etc. Algunas de ellas se enlistan en la Tabla 2.
11
Tabla 2. Tabla de lipasas comerciales y su aplicación industrial.

Industria Aplicación Nombre comercial Proveedor
Lipase A “Amano” 6 (Aspergillus niger) Amano
Piccnate (Mucor miehei) Gist-Brocades
Producción EMC (sabores tipo cheddar) Lipomod™ 187P-L187P (fungal lipases) Biocatalysts
Producción EMC (sabores tipo cheddar) Lipomod™ 224P-L224P (páncreas porcino) Biocatalysts
Lácteos Producción EMC (sabores tipo queso azul) Lipomod™ 338P-L338P (Penicillium roquefortii) Biocatalysts
Producción EMC (sabores tipo queso azul) Lipomod™ 34P-L034P (Candida cylindracea [rugosa]) Biocatalysts
Sabor a queso (sabores tipo cheddar) Lipomod™ 621P-L621 (Penicillium sp./Aspergillus sp.) Biocatalysts
Producción EMC (sabores tipo cheddar) Lipomod™ 29P-L029P Biocatalysts
Mejoramiento de sabores de queso Palatase® (Rhizomucor miehei) Novozymes
Lipase A “Amano” 6 (Aspergillus niger) Amano
Lipase M “Amano” 10 (Mucor javanicus) Amano
Lipase G “Amano” 50 (Penicillium camembertii) Amano
Aceites y grasas Lipase F-Ap15 (Rhizopus oryzae) Amano
Lipase AY “Amano” 30 (Candida rugosa) Amano
Newlase F (Rhizopus niveus) Amano
Interésterificación de aceites vegetales Lipozyme® TL IM Novozymes
Ingredientes farmacéuticos Lipase MY (Candida cylindracea [rugosa]) Meito Sangyo
Síntesis de compuestos quirales Lipase ALC, Lipase ALG (Achromobacter sp.) Meito Sangyo
Síntesis de compuestos quirales Lipase PLC, Lipase PLG, Meito Sangyo
Farmacéutica Lipase TL (Pseudomonas stutzeri) Meito Sangyo
Síntesis quiral Lipase AK “Amano” (Pseudomonas fluorescens) Amano

Síntesis quiral Lipase AYS “Amano” (Candida rugosa) Amano
Lipase PS “Amano” (Pseudomonas cepacia) Amano
Lipolase®, Lipolase® Ultra, Lipo Prime™, Lipex® Novozymes
Detergentes
(Thermomyces lanuginosus)
Emulsificante Lipopan® F Novozymes
Panadería
Mejoramiento de la textura y color de la harina Lipomod 627P-L627P (Rhizopus oryzae) Biocatalysts
Encalado de cuero NovoLime® (con proteasa) Novozymes
Cuero
Dispersión de grasas Greasex®, NovoCor® AD Novozymes
Producción de isopropil miristato Novozym® 435 (Candida antarctica B) Novozymes
Cosméticos
(componente cosmético)
Papel Control de tono Resinase® (Candida rugosa) Novozymes
Fideos y Mejoramiento de la calidad de los fideos Noopazyme® Novozymes
pastas y pastas basadas en trigo
Suplemento dietético Lipase L036P-L036P (Rhizopus oryzae) Biocatalysts

Varios Delipidación de la clara de huevo Lipomod™ 34P-L034P (Candida cylindracea) Biocatalysts
Usos variados Lypolyve CC (Candida cylindracea) Lyven
Fuente: Houde, 2004 [39]
12
Por otra parte, las esterasas son un grupo enzimático menos disponible. Existen menos de una
docena de esterasas (EC 3.1.1.1) conocidas, como las esterasas de hígado de cerdo y caballo.
Éstas se han utilizado para llevar a cabo la mayor parte de hidrólisis altamente selectivas de
ésteres carboxílicos [42]. Otras esterasas importantes son la acetil colin esterasa y la
colesterol esterasa. Particularmente, la colesterol esterasa se ha utilizado con sustratos
voluminosos debido a las características de su sustrato natural. Del mismo modo, algunas
acetil y feruloil esterasas están involucradas en rutas metabólicas dando acceso a fuentes de
carbono a través de la degradación de hemicelulosa y por lo tanto han sido utilizadas como
auxiliares en la síntesis de biocombustibles y para la obtención de ácidos hidroxicinámicos
[41].
Una de las principales ventajas de ambas hidrolasas es que catalizan la hidrólisis de una
amplia gama de sustratos naturales y no naturales, reteniendo su alta enantio- y
regioselectividad. Estas propiedades han servido para llevar a cabo obtener fármacos
enantioméricamente puros, proteger y desproteger intermediarios sintéticos y modificar
ésteres y triglicéridos [28].
A pesar de que la gama de sustratos utilizables por las lipasas y esterasas es distinta,
comparten características estructurales muy parecidas, de las cuales se hablará a
continuación.
1.2.5.1 MOTIVOS ESTRUCTURALES

Estructuralmente, las lipasas son un grupo de enzimas que poseen dominios altamente
conservados, como el plegamiento /, y su sitio activo; de tal suerte que sólo varían en la
composición de algunos aminoácidos, manteniendo la estructura terciaria intacta. Por su gran
similitud con las esterasas, a continuación se explicarán algunos fenómenos recurrentes en
ambas hidrolasas a través del ejemplo de las lipasas.
1.2.5.2 LA FUNCIÓN DEL LID EN LAS LIPASAS/ESTERASAS

Un rasgo altamente distintivo de algunas lipasas en comparación con el resto de las enzimas
es la existencia de un dominio hélice - lipofílico en la cadena polipeptídica que funciona
como cubierta o “lid” para el sitio catalítico [43]. El lid sólo se abre bajo la presencia de
interfaces agua-lípido (Figura 6) [44]. Hay que enfatizar que este dominio no está presente
13
en todas las lipasas, existe evidencia de que algunas sólo contienen vestigios de este lid,
como la lipasa B de Candida antárctica [45]. Algunas esterasas que comparten mayor
homología con las lipasas también han mostrado vestigios de esta estructura (feruloil esterasa
A de A. niger).
Figura 6. Estructuras de 3 lipasas con lid en su conformación abierta (izquierda) y cerrada (derecha). Lipasa de
Candida rugosa (CRL; A), Lipasas de Rhizomucor miehei (RML, B), y Thermomyces lanuginosus (TLL, C). El
lid está marcado en rojo, la triada catalítica en verde y el loop flexible de RML y TLL en azul [46].
Por otra parte, los dominios de unión al sustrato de las lipasas están altamente conservados,
mientras que otras partes de la macromolécula sólo tienen pequeñas regiones conservadas.
1.2.5.3 EL plegamiento /.

El plegamiento / es un un plegamiento terciario adoptado por algunas proteínas que no
tienen una similitud de secuencia obvia; lo que sugiere que el curso de la evolución permitió
que divergiera de un ancestro común y ahora esté presente en una gran cantidad de carboxil
éster hidrolasas. Recientemente las estructuras cristalinas de algunas hidrolasas demostraron
un incremento considerable en la variabilidad de la arquitectura del plegamiento y la
especificidad del sustrato. Estas pequeñas variaciones han hecho posible distinguir a las
diferentes familias de este grupo de hidrolasas [47]. Por ejemplo, algunas lipasas tienen un
14
túnel estrecho para el donador acilo, pero el sitio de unión alcohólico es más amplio. Por otro
lado, también existen lipasas con un sitio de unión acilo amplio y el alcohólico más estrecho.
Estructuralmente el plegamiento α/β consiste en una hoja β paralela (sólo la segunda hebra β
es antiparalela) de ocho hebras, rodeada de ambos lados por hélices . Además muestra un
giro superhelicoidal a la izquierda, con la primera y última de las hebras cruzándose entre sí
en un ángulo de aproximadamente 90° (Figura 7). Aunque exsten diferencias significativas
en el arreglo de estas cadenas; sólo la hélice C parece estar bien conservada, ya que tiene
una posición estratégica en el centro de la hoja β y juega un papel clave en el correcto
posicionamiento del residuo nucleófilo en el sitio activo.
Figura 7. Disposición estructural secundaria del α/β fold. Las hélices  se representan como cilindros y están
identificados con letras (A-F). Las hojas  están representadas por flechas y numeradas del 1 al 8. La triada
catalítica se representa con puntos negros.
1.2.5.4 LA TRIADA CATALÍTICA Y EL MECANISMO DE REACCIÓN

DE LAS LIPASAS/ESTERASAS
La triada catalítica comprende una serina, acido aspártico o glutámico y una histidina. Esta
triada es similar a la de las serin-proteasas pero su diferencia radica en la estructura primaria
y por lo tanto en su ubicación en el α/β fold (Figura 8).
15
Figura 8. Disposición clásica de la triada catalítica de una serin-proteasa. Verde: Aspartato, Azul: Histidina,
Rojo: Serina.
Esta triada catalítica es la responsable de llevar a cabo la reacción de hidrólisis en la gran

mayoría de lipasas y esterasas. La catálisis comienza con la acilación (Figura 9), este paso
involucra un protón que se transfiere entre el aspartato, histidina y la serina de la triada
catalítica (Figura 9E). Cuando esto ocurre, el grupo hidroxilo de la serina queda activado.
Posteriormente, el grupo hidroxilo activado de la serina realiza un ataque nucleofílico al
grupo carbonilo del sustrato (Figura 9-1). El primer intermediario tetraédrico se forma con
una carga negativa sobre el oxígeno de su grupo carbonilo. El agujero oxianión estabiliza la
distribución de la carga y restaura el estado energético del intermediario tetraédrico formando
al menos dos puentes de hidrógeno. Entonces el componente alcohólico es liberado del
enlace con el intermediario (Figura 9-2), mientras que el componente acilo del sustrato se
mantiene covalentemente unido a la serina en el intermediario acil-enzima (Figura 9-3). La
deacilación ocurre cuando un segundo nucleófilo (agua o alcohol) ataca al intermediario acil-
enzima liberando el producto de la reacción (el ácido; Figura 9-4) y regenerando a la enzima
(Figura 9-5) [40].
16
Figura 9. Mecanismo de reacción de la hidrólisis de un éster catalizada por la triada catalítica. Para la hidrólisis
el segundo nucleófilo es agua, y para la alcohólisis es un alcohol. Por lo tanto durante el curso de la reacción de
hidrólisis se forman. 1. El complejo enzima sustrato. 2. El primer intermediario tetrahédrico. 3. El complejo
acil-enzima. 4. El segundo intermediario tetrahédrico. 5. La enzima libre.
1.2.6 El GRUPO DE LAS CARBOHIDRATO ESTERASAS.

Las carbohidrato esterasas son un grupo de enzimas que catalizan la O- u N- acilación de
sustituyentes sacáridos. Como un éster contiene una función alcohólica y una ácida, se
consideran dos clases de carbohidrato esterasas, las que actúan sobre sustratos en los que el
azúcar juega el rol del ácido como en los ésteres metoxilados de pectina (Figura 10A) o las
que lo hacen sobre sustratos donde el azúcar juega el rol dela función alcoholólica, tales
como los acetil xilanos (Figura 10B).
Dentro del grupo de las carbohidrato esterasas están las feruloil esterasas, un caso de
creciente interés debido a sus aplicaciones que serán mencionadas a continuación.
17
Figura 10. Ésteres donde pueden actuar las carbohidrato esterasas. A. Cuando el carbohidrato corresponde a la
función ácida (alcohol en rosa), y B. Cuando el carbohidrato cumple la función alcohólica (ácido en azul).
1.2.7 FERULOIL ESTERASAS: FAES.

Las feruloil esterasas (EC 3.1.1.73) son esterasas específicas que pueden hidrolizar los
enlaces que unen al ácido ferúlico y otros ácidos hidroxicinámicos unidos covalentemente a
azúcares como arabinosa, xilosa y galactosa, que forman parte de la pared celular de algunos
cereales (insolubles; Figura 11A). Además pueden hidrolizar otros oligosacáridos o
carbohidratos que se encuentra de forma soluble en las plantas, un ejemplo de estos últimos
es el ácido clorogénico, una estructura conformada por ácido cafeico y ácido quínico unidos
mediante enlace éster (Figura 11B).
Figura 11. Ácidos hidroxicinámicos unidos a compuestos solubles e insolubles. A. Ácido ferúlico unido a
arabinosa correspondiente de una estructura insoluble de hemicelulosa. B. Ácido cafeico unido mediante enlace
éster al ácido quínico, que forman el ácido clorogénico (soluble).
1.2.7.1 CLASIFICACIÓN DE LAS FAES Y LOS SUSTRATOS PARA SU

IDENTIFICACIÓN.
Actualmente las Faes son un grupo controversial de carbohidrato esterasas, debido a que
existen diferencias estructurales muy marcadas entre ellas. Actualmente, existe poca
evidencia de una relación estructural entre ellas, por lo que los intentos de clasificación han
18
sido en base a las diferencias de estructura y de homología de secuencia. La primera y más

sencilla es la propuesta por Crepin en 2004 [48], en donde se les clasifica de acuerdo a los
metil hidroxicinamatos que hidrolizan, la liberación de diferulatos y su homología de
secuencia primaria con otras enzimas de la familia de las hidrolasas (Tabla 3).
Tabla 3. Clasificación de las Faes de acuerdo a Crepin.

Tipo C Tipo D
Tipo B
Tipo A A. niger FaeB P. Equi EstA
Parámetro P. funiculosum FaeB,
A. niger FaeA T. stipitatus FaeC P. fluorescens
N. crassa Fae1
XYLD.
Pulpa de remolacha
Medio de inducción Pulpa de remolacha
Salvado de trigo azucarera- Salvado de Salvado de trigo
preferencial azucarera
trigo
Hidrólisis de metil
MS, MF, MpC MF, MpC, MC MS, MF, MpC, MC MS, MF, MpC, MC
ésteres
Liberación de ácido
Si (5-5’) No No Si (5-5’)
diferúlico
Familia 1 de las
Similitud de Clorogenato esterasa,
Lipasas carbohidrato esterasas, Xilanasa
secuencia tanasa
acetil xilan esterasas
*MS: Metil sinapinato, MF: Metil ferulato, MpC: Metil p-cumarato, MC: Metil cafeato.
Tomando los datos publicados en la literatura sobre la FaeA de A. niger (Número de acceso:
AF361950), FaeB de P. funiculosum (AJ291496), Fae-1 de N. crassa (AJ293029), FaeC de
T. stipitatus (AJ505939), FaeB de A. niger (AJ309807), XYLD de P. fluorescens (X58956) y
la EstA de P. equi (AF164516) Crepin propone 4 categorías (A, B, C y D) para clasificar las
Faes [48]. En esta clasificación las enzimas con preferencia hacia sustratos metoxilados en el
anillo aromático y con mayor homología de secuencia con lipasas fueron clasificadas como
Faes tipo A. Las Faes con preferencia hacia sustratos hidroxilados y con homología de
secuencia con acetilxilan esterasas fueron catalogadas como tipo B. Por último, las que no
muestran preferencia de sustrato, es decir que aceptan tanto metoxilados e hidroxilados
fueron catalogadas como tipo C y D, siendo la única diferencia entre estas dos la capacidad
de liberarar compuestos diferulados. Además, en cuanto a homología de secuencia las tipo C
son más semejantes a las tanasas y las D a las xilanasas. En un trabajo más reciente, Udatha,
clasifica a las Faes en 12 familias, en base a su secuencia de aminoácidos [49]. No obstante,
esta clasificación no ha sido del todo aceptada o utilizada.
La clasificación de Crepin, sin lugar a dudas ha sido la más utilizada, esto probablemente
debido a lo sencillo que resulta clasificar de acuerdo a los 4 sustratos sintéticos previamente
mencionados. Por otro lado, muchos investigadores se han esforzado por encontrar los
19
sustratos que pueden aceptar este tipo de enzimas, desde los ésteres de 4-nitrofenol [50],
hasta los complejos triferulados que se encuentran en la pared celular de algunos granos
como el trigo. La lista de sustratos utilizados para la caracterización de estas enzimas se
presenta en la Tabla 4.
Tabla 4. Sustratos utilizados para la determinación de la actividad feruloil esterasa.
Tipo de
Sustrato Estructura Método de obtención
sustrato
Hidrólisis ácida suave y
5-O-(trans-feruloil)-
purificación con resina
arabinofuranosa
amberlite XAD-2.
2-O-[5-O-(trans-
feruloil)-β-L- Hidrólisis enzimática de
arabinofuranosil]-D- salvado de trigo.
xylopiranosa;
O-(5-O-[(E)-feruloil]-- O O
HO
O
O
HO OH
Hidrólisis enzimática de
L- arabinofuranosil)- OH
O OH OH
Cynodon dactylon L.
(13)-O--D- O
OH
O
Pers. Después
xilopiranosil-(14)-D- O
OH
purificación por HPLC
xilopiranosa
Naturales {5-O-[(E)]-feruloil]-[O-
-D-xylopiranosil-
(12)]-O--L-
Cynodon dactylon L.
arabinofuranosil-
Pers. Después
[13]}-O--D-
xilopiranosil-(14)-D-
xilopiranosa
O--D-xilopiranosil-
(14)-O-{5-O-[(E)-
feruloil]--L-
Cynodon dactylon L.
arabinofuranosil-
Pers. Después
[13]}-O--D-
xilopiranosil-(14)-D-
xilopiranosa
20
Metil 5-O-(trans- Ésterificación catalizada

feruloil)-arabinofuranosa por ácido
Ésterificación catalizada
Metil Ferulato
por ácido
Metil p-cumarato
por ácido
Sintéticos
Metil cafeato
por ácido
Metil sinapinato
por ácido
Metil cinamato
por ácido
4-nitrofenil 2-O-(E) Secuencia

feruloil--D- quemoenzimática ,
xilopiranósido empleando
(Realizado para transésterificación
posiciónes 3, 4 y 5) catalizada por lipasas
O-
4-nitrofenill 5-O-(E)- N+
Secuencia
O
Cromóforos feruloil-α-L- quemoenzimática ,
O
arabinofuranósido O
OH O empleando
(Realizado para O
O
transésterificación
OH
posiciónes 2, 3 y 4) catalizada por lipasas

HO
Umbeliferil 5-O-feruloil- Catalisis química de 3

L arabinofuranósido pasos
21
Procedimiento
enzimático
4-metil umbeliferil
quemoselectivo de 4
ferulato;
pasos
Fuente: Rámirez, 2015 [51]
1.2.8 HISTORIA DE LAS FAES.
1.2.8.1 PRIMEROS HALLAZGOS E INCIDENCIA DE FAES.

Es poco clara la evidencia de quien encontró los primeros indicios de la actividad feruloil
esterasa, sin embargo, una gran cantidad de autores señalan el trabajo de Mckenzie como el
primero en mostrar esta evidencia, en 1987. En este reporte se advierte que las preparaciones
enzimáticas extracelulares de Streptomyces olivochromogenes cultivados con cascarilla de
trigo (rico en xilanos) presentaron liberación de ácido ferúlico, es decir, actividad feruloil
esterasa [52]. Más tarde el mismo grupo de trabajo realizó intentos por purificar esta esterasa
a partir de otro microorganismo, Schizophyllum commune, el cual produjo una esterasa que
libera ácido ferúlico de salvado de trigo libre de almidones, y de ésteres de azúcares con
ácido ferúlico que fueron aislados de la cascarilla de trigo. La Fae, que fue purificada
parcialmente por cromatografía de intercambio iónico usando una columna dietil amino etil
(DEAE), liberó cantidades significativas de ácido ferúlico del salvado de trigo sólo en la
presencia de fracciones ricas en xilanasas, esto generó la primer evidencia de que las Faes
actúan en sinergia con otras carbohidrato esterasas para la degradación de la pared celular
[53].
En 1990, Borneman propone el uso de metil ésteres de ácidos hidroxicinámicos (Tabla 3 y 4)

para determinar la producción de Faes en cultivos de Piromyces MC-1, Neocallimastix MC-2
y Orpinomyces PC-2, PC-3 y PC-1. Encontró que la liberación del ácido ferúlico era hasta 4
veces mayor que la del ácido p-cumárico [54]. Por su parte Smith y colaboradores usaron
estos mismos sustratos sintéticos (MF y MpC) en busca de actividad feruloil esterasa en 40
hongos mesofílicos y 13 termofílicos. En este caso Aspergillus awamori y Aspergillus
phoenicis fueron los mejores productores de baterías enzimáticas capaces de degradar
preparaciones de xilanos, y particularmente A. phoenicis mejor en la producción de esterasas
capaces de hidrolizar MF y MpC [55].
22
Con los métodos de detección implementados anteriormente y los antecedentes de este tipo
de esterasas, en 1991, Faulds purificó y caracterizó la primer Fae proveniente de
Streptomyces olivochromogenes cultivado sobre xilanos de avena. La estrategia que empleó
fue, como primer paso, intercambio iónico débil (DEAE), posteriormente intercambio
aniónico fuerte (MonoQ), filtración en gel y finalmente cromatografía de interacción
hidrofóbica. La Fae purificada tuvo un peso de 29 KDa, su pH y temperatura óptima fueron
5.5 y 30°C, respectivamente [56].
A partir del hallazgo anterior, Faulds y Williamson comenzaron a trabajar con el modelo de
Aspergillus niger, y purificaron dos Faes contenidas en cócteles comerciales de pectinasas
provenientes de ese hongo filamentoso. Las FaeI y FaeII como las nombraron, tuvieron
actividad preferencial sobre MC y MpC; y MS y MF, respectivamente [50]. Los indicios de
Faes con preferencias por sustrato distintos, llevaron a este grupo de trabajo a realizar un
gran número de ensayos para lograr comprender la función catalítica de estas dos Faes en el
hongo, con lo cual convirtieron al hongo A. niger en el modelo más estudiado y comprendido
de Faes fúngicas hasta la fecha.
1.2.8.2 Aspergillus niger COMO PRODUCTOR DE FAES CON DIFERENTE

ESPECIFICIDAD POR SUSTRATO.
Para el año 1994, Faulds y Williamson lograron purificar la FaeIII de Aspergillus niger,
llamada así debido a sus previos descubrimientos [50] y a que las propiedades de ésta fueron
distintas a las ya reportadas en los trabajos anteriores [57]. La inducción de esta nueva Fae se
logró cultivando A. niger en xilanos de avena. Posteriormente la purificación se realizó en
tres etapas (precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de interacción hidrofóbica e
intercambio iónico), la proteína constó de un peso molecular y punto isoeléctrico de 36 KDa
y 3.3, respectivamente. Utilizando MF como sustrato detectaron una actividad específica de
67 U/mg de proteína, un pH y temperatura óptimos de 5 y 55-60°C, respectivamente. Una de
las cualidades más atractivas de esta Fae fue que resultó 420 veces más activa que la
anteriormente purificada de Streptomyces olivochromogenes. A su vez, en este trabajo se
demostró por primera vez la necesidad del grupo metoxilo en el carbono tres (C3) del anillo
bencénico para que esta Fae pueda llevar a cabo la catálisis.
23
Posteriormente los autores demostraron que la FaeII es una versión proteolizada de la FaeIII,
debido a que se encontraron características bioquímicas similares y el mismo perfil
hidrolítico sobre los 4 metil hidroxicinamatos [57].
La FaeI y FaeIII se caracterizaron utilizando los cuatro metil hidroxicinamatos, y 11 sustratos

de oligosacáridos ferulados provenientes de pulpa de remolacha azucarera con el fin de
conocer la especificidad de ambas esterasas. Se observó que ambas Faes mostraron una
mayor actividad sobre los sustratos naturales que por los metil hidroxicinamatos. No
obstante, la FaeI no mostró preferencia por alguna de las posiciones del enlace arabinosa-
ferúlico, al hidrolizar todos los oligosacáridos ferulados evaluados. Sin embargo la FaeIII,
mostró una clara preferencia al hidrolizar únicamente los sustratos que contenían el ácido
ferúlico unido a la posición O-5 de la arabinofuranosa, mientras que no se observó hidrólisis
sobre los ésteres que contenían el ácido en la posición O-2. El mejor sustrato para ambas
Faes fue el éster de 3 residuos sacáridos, los sustratos con más residuos no fueron
hidrolizados [58]. Con este trabajo, se propone por primera vez que Aspergillus niger es
capaz de producir Faes con diferente especificidad hacia los oligosacáridos ferulados.
Más tarde, Faulds y col. sustentan la teoría de que la liberación de ácido ferúlico con ambas
Faes a partir de la cascarilla de maíz completa, está limitada por factores estéricos y no por la
naturaleza del enlace éster, ya que no se observó liberación de ácido ferúlico, inclusive
utilizando otras carbohidrato esterasas complementarias [59].
Por otra parte, la FaeI seguía siendo obtenida a partir de cócteles comerciales de pectinasas y
se desconocía cuáles eran las condiciones ideales para que se expresara. En 1996, Brézillon
cultivó cepas distintas de A. niger (CBS 120.49; CS180) sobre pulpa de remolacha azucarera
[60] y logró producir una nueva Fae. Usando la cepa CBS 120.49, se encontró ausencia en la
producción de FaeIII, lo que sugirió que la pulpa de remolacha azucarera no contiene los
componentes necesarios para la inducción de ésta, pero si para la de una nueva Fae
(reconocida por su distinto perfil hidrolítico contra los metil hidroxicinamatos).
Complementario a este trabajo, Kroon logra purificar y caracterizar la nueva Fae observada
por Brézillon, a través del cultivo de la cepa CS180 (A. niger) sobre pulpa de remolacha
azucarera, y la denomina CinnAE debido a que su perfil de hidrólisis sobre los metil ésteres
va desde el más hidroxilado hasta el más metoxilado (cafeico>p-
24
cumárico>ferúlico>>>sinapínico). Del mismo modo la CinnAE fue capaz de hidrolizar los

oligosacáridos ferulados provenientes de la pulpa de remolacha azucarera, cualidad que no
posee la FaeIII [61, 62].
1.2.8.3 COMPRENSIÓN DEL FENÓMENO DE INDUCCIÓN DE LAS

FAES EN Aspergillus niger.
La explicación del cómo y por qué A. niger expresaba distintas Faes en los residuos probados
en el cultivo, comenzó a volverse tema de discusión. Una de las aportaciones más
importantes en este campo la realizó deVries en 1997 [63]. En este trabajo se clonó y
caracterizó el gen responsable de la codificación de una feruloil esterasa (faeA), y tras
sobreexpresar la proteína en una cepa de A.niger, se observó que todas las características
bioquímicas de esta correspondían a las de la FaeIII [57]. La exitosa clonación de este gen,
dejó el campo abierto para que años después se pudiera dilucidar el fenómeno de expresión
del gen mediante inductores precisos.
Con respecto a los inductores, Faulds en 1997, empleó xilanos de avena para la inducción de
la actividad FaeIII de A. niger. Utilizando este sustrato, el cual tenía cantidades no
detectables de ácido ferúlico, logró producir hasta 0.13U/mg de proteína. Lo más
sobresaliente de este trabajo fue que tras la adición de 100 a 300 mg de ácido ferúlico por
litro, se demostró que el ácido logró inducir hasta 2.3 veces más la FaeIII que los xilanos de
avena [64]. Posteriormente deVries complementa estos estudios y concluye que los dos
sistemas regulatorios de Aspergillus niger, previamente reportados, afectan la expresión de
los genes encargados de la producción de carbohidrato esterasas, incluyendo las Faes. En
primer lugar, la proteína CreA, previene la transcripción de estos genes en presencia de
sustratos fácilmente metabolizables para el microorganismo, es decir tiene un papel de
represor catabólico para dicha batería proteica. Por otro lado, se encuentra el activador
transcripcional XlnR que es el necesario para la transcripción de estas carbohidrato esterasas
en ausencia de fuentes de carbono sencillas. Estos dos sistemas no explican del todo la
regulación del gen faeA. Para esto deVries y col. demuestran que además de estos dos
factores también influye su respuesta a ciertos compuestos aromáticos. Es decir, el gen faeA
es expresado, en presencia de un grupo metoxilo en C3, un hidroxilo en C4, y ningún
sustituyente en C5, en el anillo aromático. Del mismo modo la posición C1 parece ser la
25
menos importante para la expresión de esta hidrolasa [65]. Lo anterior es congruente con lo
observado por Faulds con los xilanos de avena y la influencia del ácido ferúlico adicionado.
Para concluir estos trabajos, en 2002, localizan un segundo gen que codifica para una
segunda feruloil esterasa de 521 aminoácidos en A. niger, el gen faeB, y el análisis de las
propiedades de la Fae sugieren que es, de hecho, la previamente estudiada CinnAE. La
expresión de este gen se logra solamente en la presencia de ciertos compuestos aromáticos
como el ácido cafeico y el ácido p-cumárico que tienen en común la hidroxilación en la
posición C4 del anillo aromático, y ningún sustituyente metoxilado. Lo anterior se confirmó
cuando se empleó el ácido cinámico como inductor, carente de sustituyentes en el anillo, ya
que no se expresó este gen. Del mismo modo ningún compuesto de tipo oligosacárido
ferulado, como arabinoxilanos y pectina logran la expresión de esta CinnAE.
La comparación de la actividad enzimática de estas dos enzimas de A. niger, ahora llamadas

AnFaeA (FaeIII) y AnFaeB (CinnAE), frente a pectina de remolacha azucarera y
arabinoxilanos de trigo, demuestra que ambas enzimas están involucradas en la degradación
de dichos polisacáridos, pero que tienen preferencias opuestas por estos sustratos. La
AnFaeA prefiere los arabinoxilanos de trigo mientras que la AnFaeB es más activa hacia las
pectinas de remolacha azucarera [66].
1.2.8.1 MOTIVOS ESTRUCTURALES INVOLUCRADOS EN EL

MECANISMO DE REACCIÓN DE LAS FAES.
Paralelo a los trabajos de inducción de la AnFaeA, también se realizan ensayos para conocer
las propiedades del sitio catalítico de las dos feruloil esterasas. Para ello Kroon y
colaboradores sintetizaron 19 diferentes metil fenilalcanoatos, con características
estructurales distintas, variando desde los sustituyentes en el anillo bencénico, hasta la
longitud de la cadena acril que une al anillo bencénico con el enlace éster. Estos
experimentos demuestran que para la AnFaeA la presencia del grupo metoxilo en C3 del
anillo aromático es esencial para la actividad, y por el contrario reduce la actividad de la
AnFaeB, en este caso las hidroxilaciones son responsables de un aumento en la actividad de
la misma. Por otro lado, se demostró que la longitud entre la unión anillo aromático-enlace
éster debe se entre 4 y 8 Å, de lo contrario la actividad de ambas Faes se nulifica [67].
26
A pesar de la valiosa aportación de Kroon, seguían siendo necesarios más estudios para
entender el mecanismo de catálisis de las Faes y no fue hasta 7 años después, que el grupo de
cristalografía de Madrid encabezado por Juan Hermoso, se dió a la tarea de cristalizar la
AnFaeA (Figura 12). Este trabajo permitió comprender a profundidad la homología entre la
AnFaeA con algunas lipasas (previamente descrita por Crepin [48]) como la de R. miehei y
T. lanuginosus, encontrando homología de secuencia del 37 y 30%, respectivamente. Cabe
resaltar que ambas lipasas provienen de una de las familias más alejadas del resto de las
lipasas y presumiblemente son el eslabón más cercano que une a estas dos clases de carboxil
éster hidrolasas.
Figura 12. Estructura cristalina de la AnFaeA. (A) Representación de listones con α-hélices, hojas β y espirales
coloreadas en cian, amarillo, y gris respectivamente. Los segmentos helicoidales y espirales que forman la
región del lid se muestran en azul. La triada catalítica (Ser133, Asp194, His247), los iones sulfato y la
asparragina unida a la N-glicosilación se muestran en representación de esferas y palos. (B) Diagrama
topológico de la AnFaeA con los elementos de la estructura secundaria identificados (hojas β, α-hélices) y las
posiciones de la triada catalítica etiquetadas, el lid está resaltado en azul oscuro [68].
Así la estructura tridimensional de la AnFaeA permitió identificar algunos motivos

estructurales presentes en las lipasas (ver sección 1.3.1.1), como el tradicional pliegue /, y
una triada catalítica conformada por una serina (Ser133), histidina (His247) y aspartato
27
(Asp194). Es decir, las Faes presentan el mismo mecanismo de reacción que las serin-
proteasas y las lipasas. Una de las características más sorprendente fue la presencia de un lid
conformado por 14 aminoácidos. Sin embargo, a diferencia de sus lipasas homólogas, en éste
al menos 6 aminoácidos apolares cambiaron por polares, haciendo un lid más hidrofílico.
Adicionalmente el lid de la AnFaeA tiene el único sitio de N-glicosilación en la proteína
(Asn79), el cual sirve para anclarlo en una conformación abierta [68].
En un trabajo complementario Faulds y Hermoso, realizaron 5 mutaciones puntuales sobre la

secuencia primaria de la AnFaeA. Se cambió la serina catalítica por una alanina (Ser133Ala),
además de la tirosina 80 y triptófano 260 por 2 residuos de serina y valina (Tyr80Ser,
Tyr80Val, Trp260Ser y Trp260Val) debido a que se creía que estaban ligados a la actividad
catalítica de la proteína. Estos experimentos lograron dilucidar el acoplamiento al complejo
ferúlico-arabinosa, permitiendo ver el rol que juega la Tyr80 como estabilizador del anillo
aromático del ferúlico en el sitio catalítico y del Trp260 como posible estabilizador de la
parte sacárida del sustrato. Complementariamente, la sustitución de ambos residuos por
residuos más pequeños logró ampliar la especificidad por sustratos, logrando hacer que las
mutantes aceptaran el MC como sustrato, el cual la proteína original no acepta [69].
1.2.8.2 CONVERGENCIA DESPUÉS DE DIVERGENCIA: LAS

LIPASAS COMO FUNCIÓN ANCESTRAL DE LAS FERULOIL
ESTERASAS.
Las increíbles similitudes entre la AnFaeA y la lipasa de R. miehei, soportan la hipótesis de
que las lipasas son una función ancestral de las Faes tipo A [68]. De igual forma, la
transposición de la AnFaeA con las feruloil esterasas modulares de Clostridium
thermocellum demostraron poca homología estructural, sin embargo, únicamente cuando se
forma el complejo enzima-sustrato con moléculas diferuladas existe una similitud estructural
con la AnFaeA. Estos estudios señalan que las Faes tipo A pudieron haber tenido un ancestro
en común, que evolucionó para dar lugar a diferentes secuencias, pliegues y funciones, es
decir el ancestro común diverge en nuevas proteínas (evolución divergente). Estas nuevas
formas, posteriormente pudieron converger en un ámbito funcional (convergencia evolutiva)
para dar lugar a los 4 tipos de Faes [68].
28
Años más tarde Levasseur y col. realizaron un análisis evolutivo con el fin de identificar de
qué modo estaban relacionadas las lipasas con las Faes tipo A, y si alguna de las dos era la
función ancestral de la otra, tal como lo había sugerido Hermoso.
Mediante la reconstrucción del árbol filogenético de este tipo de carboxil éster hidrolasas,
determinaron que efectivamente las lipasas son la función ancestral de las feruloil esterasas
tipo A y que muy probablemente esta neofuncionalización de las lipasas pudo haberse debido
a cambios ambientales.
Del mismo modo, el estudio evaluó, que existen sitios específicos en la estructura de la
enzima que fueron seleccionados para la alteración de la función, es decir, que dan lugar a
una “selección positiva”, los sitios seleccionados positivamente fueron involucrados en el
cambio evolutivo. Se estableció que al menos 3 sitios bajo selección positiva están
involucrados en el cambio funcional de las lipasas en Faes tipo A, es decir, estos hicieron
posible cambiar de la función lipasa a Fae. Además muchos aminoácidos seleccionados
positivamente fueron localizados en zonas específicas conocidas por tener gran significancia
para la especificidad por el sustrato y la actividad catalítica de las Faes tipo A. Anteriormente
Hermoso argumentó que la plasticidad del sitio activo de las lipasas y Faes depende de la
naturaleza de los residuos de aminoácidos, y sobre las modificaciones entre los sitios activos.
Se identificaron 33 residuos seleccionados positivamente como posibles candidatos de esa
plasticidad.
Por último, el análisis de los fenómenos ambientales que pudieron haber dado lugar a dichos
cambios evolutivos, sugiere que tras la aparición de las plantas terrestres (Embryophyta), los
organismos de la familia Aspergilli, obtuvieron una ventaja evolutiva al adquirir actividad
feruloil esterasa, ya que se presenta como una función indispensable para el consumo de los
azúcares en la pared celular de las plantas al hacer más accesibles estas fuentes de carbono.
Esto derivó en evolución de tipo perfectivo, para finalmente lograr que la función Fae
prevaleciera a lo largo del tiempo en dichos organismos [70].
Más evidencia se suma cuando se analiza la gran cantidad de trabajos que existen de la
síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos utilizando lipasas [71-73], y más recientemente
de su actividad hidrolítica [74]
29
1.2.8.3 ACTUALIDAD DE LAS FAES.

En los últimos 15 años se ha reportado la purificación y caracterización de una cantidad
considerable de nuevas Faes con amplias especificidades por sustratos. Recientemente estas
enzimas han sido utilizadas para la síntesis de ésteres alquílicos de los metil
hidroxicinamatos, en particular las Faes de Talaromyces stipitatus [75], Sporotrichum
thermophile [76, 77] y Fusarium oxysporum [78, 79]. La reacción de síntesis más empleada
ha sido la alcohólisis de metil hidroxicinamatos para su conversión en propil o butil
hidroxicinamatos, debido a que se han encontrado una gran cantidad de actividades
biológicas de interés asociadas a estos compuestos [79, 80].
Por otro lado, pocas estructuras tridimensionales de nuevas Faes han sido resueltas. En 2014,
se resolvió la estructura tridimensional de la FaeB de A. orizae [81]. Este nuevo hallazgo
podría detonar nuevamente el interés por dilucidar las relaciones estructura-función que ha
sido un poco abandonado en la actualidad para este tipo de enzimas.
Tanto para su aplicación en la biotecnología como para la realización de estudios de

estructura-función es imperante buscar y estudiar Faes de nuevas fuentes que permitan
comprender a fondo esta interesante familia de carbohidrato esterasas. Para ello, se ha
demostrado que los hongos son excelentes productores de Faes, por lo que en la siguiente
sección se abordarán aspectos generales de estos interesantes microorganismos y en
particular del género Aspergillus.
1.3 LOS HONGOS.

Los hongos son organismos eucarióticos pluricelulares o unicelulares que pueden ser de
carácter microscópico o macroscópico. En la actulidad se conocen alrededor de 72, 000
especies distintas, pero se estima que el número total de miembros en este reino puede ser
cercano a 1, 600, 000 especies [82].
La gran mayoría de los hongos se desarrollan como saprófitos en el suelo, sobre restos de
plantas o incluso sobre las vivas. Un número más restringido de especies son oportunistas y
pueden volverse patógenos para los animales y los humanos. Otras tantas especies son
simbióticas ya sea asociadas a algas (líquenes) o a las raíces de las plantas (micorhizos).
30
Los hongos se organizan a nivel celular, fundamentalmente, en el talo, el cual constituye el

aparato vegetativo (generalmente en fase haploide); este se caracteriza por una gran variedad
de estructuras, que van desde la forma unicelular (levaduras) a la forma filamentosa,
pudiendo presentar un grado considerable de diferenciación. Al conjunto de filamentos (o
hifas) se le denomina micelio. En sí, los hongos no poseen verdaderos tejidos, como es el
caso de las plantas y los animales, y se reproducen por medio de esporas, ya sea de manera
sexual o asexual.
1.3.1 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS.
La gran variedad de morfologías en los hongos hace necesaria una clasificación, en la cual se
clasifican de acuerdo al tipo de espora y esporóforo. En la Figura 13 se muestra de manera
esquemática como lucen algunas de las diferentes esporas y esporóforos de las distintas
ramas filogénicas. En general, los hongos se pueden clasificar en 5 filos, y las principales
características que los diferencían entre sí, se describen a continuación.
Quitridiomicetos: La principal característica de este filo es la producción de zoosporas, la

cuales son esporas que cuentan con un flagelo que ayuda a que se dispersen en medio acuoso,
recordando el origen acuático de los hongos.
Zigomicetos: Los miembros de esta familia de hongos se caracterizan por la formación de

zygosporas con paredes gruesas, de origen sexual y esporangiosporas no nadadoras, de
origen sexual. Una de las especies más representativas de este filos son el grupo de los
mucorales, como Rhizomucor miehei.
Glomeromycota: Esta división se caracteriza por no tener una reproducción sexual conocida,
y además son los únicos hongos que son simbiontes obligatorios, a través de las plantas
terrestres. Con estas forman las micorrizas, que es un tipo de asociación que consiste en la
penetración de las hifas al interior de la planta, donde forma vesículas alimenticias conocidas
como arbúsculos.Otra característica pecualiar de esta división son sus esporas de gran
tamaño con varios núcleos.
Ascomicetos: Los miembros del filo de los ascomicetos abarcan a todos aquellos hongos que
involucran la producción de ascosporas haploides mediante la meiosis de los núcleos
31
diploides en el asca. La mayoría de los ascomicetos también llevan a cabo esporulación

asexual (conidiosporas), la cual se desarrolla en las hifas aéreas (conidióforos), que, por lo
general, sobresalen por encima del sustrato.
Figura 13. Tipos de esporas y esporóforos de acuerdo a la clasificación actual de hongos. A) Zoospora de
Oedogonium. B) Ascosporas dentro de un asca de Podospora fimiseda. C) Basidio con basidiosporas de
Hyphaloma appendiculatum. D) Conidióforo con conidiosporas de Aspergillus.
Basidiomicetos: En esta clasificación se entran todos hongos en los que el proceso de

reproducción sexual involucra la producción de basidosporas haploides, que se forman en el
basidio, donde los núcleos diploides llevan a cabo meiosis. Es un grupo muy importante de
hongos con cerca de 22, 000 especies conocidas y su principal característica es que forman
cuerpos fructíferos macroscópicos que forman los tradicionales “champiñones”[82].
1.3.2 MORFOLOGÍA DE LOS HONGOS.

La gran mayoría de los hongos se presenta bajo la forma filamentosa caracterizada por una
estructura tubular, ramificada y plurinuclear, usualmente llamada hifa. El diámetro de las
hifas varía considerablemente (3-10 µm) en función de las condiciones ambientales, de su
posición dentro de la colonia y sobre todo entre una especie y otra. Como se mencionó, las
hifas forman una red que es denominada micelio y se pueden presentar en tres formas:
No septadas (cenocítica): Estas hifas no presentan tabiques transversales o septos derivados

de sus paredes. En algunos casos se pueden formar algunos tabiques pero sólo en la base de
las estructuras reproductoras.
Septadas con células mononucleadas: La hifa se encuentra seccionada a todo lo largo del
tabique, se forman del crecimiento interno de la pared de las hifas que forman un anillo
32
periférico, dejando un poro central a través del cual pasa el citoplasma y el núcleo de un
compartimento a otro.
Septado con células multinucleadas: Se encuentra más de un núcleo en cada tabique.
1.3.3 ESPORULACIÓN DE HONGOS.

Cuando los nutrientes del entorno se agotan, los hongos deben encontrar una manera para
propagarse y alcanzar otras regiones ricas en ellos. Esto se logra a través del mecanismo de
esporulación. Mediante la producción de esporas, el hongo logra diseminarse y alcanzar otros
sustratos o bien permanecer en un estado latente.
Los esporóforos (del griego “portadores de esporas”) y las esporas son muy diversas, de ahí
que los taxonomistas hayan podido clasificar los diferentes tipos de hongos en base a esto.
Los esporóforos que resultan de un proceso sexual de reproducción pueden llegar a ser tan
complejos que incluso algunos tipos de hongos conforman estructuras macroscópicas
denominadas cuerpos fructíferos (e.g. champiñones, setas). Estas estructuras tienen la
finalidad de elevarse muy por encima del sustrato colonizado e incrementar el transporte de
las esporas mediante las corrientes aéreas aumentando las posibilidades de preservar la
especie.
Algunas esporas especializadas pueden permanecer en estados latentes y ser muy resistentes
a condiciones adversas; por otra parte, otras han desarrollado maneras de ser catapultadas en
el aire para que se diseminen de forma muy efectiva. Estas últimas por lo general no
muestran mucha resistencia, por lo que no son capaces de permanecer en estado latente por
mucho tiempo.
1.3.4 LOS ASCOMICETOS.

Los miembros del filo Ascomycota (ascomicetos) son todos aquellos cuyo proceso sexual
involucra la producción de ascosporas haploides mediante meiosis de un núcleo diploide en
un asca. También pueden llevar a cabo esporulación asexual, produciendo conidiosporas las
cuales se forman a partir de hifas aéreas especializadas (conidióforos) que se levantan por
encima del sustrato.
33
Existe al menos unos 18, 000 ascomicetos saprófitos y parásitos que forman ascocarpos.
Además otras 14, 000 especies forman asociaciones con organismos fotótrofos y constituyen
el grupo de los líquenes. Otros ascomicetos, que se solían denominar Hemiascomycetes
(medio ascomiceto) no producen ascocarpos, sólo ascis solitarias dispersas, no son muy
númerosos pero constituyen un grupo importante de hongos de los cuales el género
Aspergillus forma parte.
1.3.4.1 HONGOS DEL GÉNERO Aspergillus.

Los hongos del genero Aspergillus están incluidos dentro de una subclasificación de
ascomicetos llamada Eurotiales. El nombre del género Aspergillus deriva de la forma que
poseen sus conidióforos microscópicos, debido a su semejanza con el instrumento utilizado
en las iglesias para dispersar agua bendita ("Aspergillum"). Un conidióforo usualmente brota
perpendicular a una hifa y se eleva, desarrollando en su punta una esfera denominada
vesícula; a partir de las vesículas nace un tipo de hifa más corto del cual pueden brotar
conidias u otra clase de hifa especializada en la producción de estas. Muchos autores
denominan al tipo de hifa que sale directamente de las vesículas estigmata primario y aquel
que nace de este estigmata secundario.
Las conidias producidas no son viables desde el inicio, así que se forman cadenas de conidias
y de estas puede haber varias en una misma vesícula confiriéndole al conidióforo su
apariencia característica. En la Figura 14 se puede apreciar un esquema de un conidióforo de
un hongo del género Aspergillus que muestra las características mencionadas. Las conidias
son muy hidrófobas, no se mojan, en realidad son las corrientes de aire, quienes en la
madurez las separan del conidióforo y las distribuyen en el ambiente. Los Aspergillus son
muy tolerantes a bajas actividades de agua, pueden crecer sobre sustratos con un alto
potencial osmótico y pueden esporular en una atmósfera con baja humedad relativa.
El género Aspergillus, así como otros géneros, está dividido en subgéneros y secciones, que
se denominan de manera informal grupos. De estos destaca A. niger que es uno de los más
estudiados, A. nidulans importante por su peculiar proceso de reproducción o el grupo de A.
glaucus excepcionales por su notable tolerancia a las bajas actividades de agua. El grupo de
A. restrictus comparte esta propiedad siendo capaz de crecer incluso sobre el vidrio y
34
alimentándose de trazas orgánicas. Otros grupos como el de A. ochraceus y A. flavus

destacan por su capacidad de producir micotoxinas.
Figura 14. Fotografía de las partes constitutivas del conidióforo del genero Aspergillus. a: Vesícula. b:
Estigmata primaria. c: Estigmata secundaria. d: Conidiospora.
1.3.4.1.1 Aspergillus ochraceus Y SU ROL EN LA BIOTECNOLOGÍA.

Aspergillus ochraceus es un hongo filamentoso que ha sido frecuentemente aislado de
granos, oleaginosas y diferentes vegetales [83]. Actualmente este hongo es más reconocido
por la producción de ocratoxinas que por su rol en la biotecnología, ya que se han realizado
pocos trabajos precisamente por su potencial actividad fitopatógena.
La ocratoxina A (OTA) de A. ochraceus (Figura 15) ha sido la más estudiada. Consiste en

una dihidroisocumarina ligada por un enlace amida al carboxilo de la fenilalanina. Se han
descrito muchos efectos tóxicos asociados a la OTA, tales como inhibición de la síntesis de
proteínas, inducción de peroxidación de lípidos, estrés oxidativo y daño al DNA. Además
esta micotoxina es considerada como nefrotóxica, citotóxica, carcinogénica, teratogénica, e
inmunosupresora. Por todo lo anterior, los estudios que se han realizado empleando
Aspergillus ochraceus han sido más dirigidos a encontrar rutas de inhibición de la OTA o
incluso rutas para producirla [84].
35
Figura 15. Estructura química de la Ocratoxina A.
Hasta la fecha, los trabajos más interesantes no relacionados con la producción de

ocratoxinas, se han realizado con el fin de obtener enzimas para su aplicación industrial.
Amar en 2010 reportó la purificación y caracterización de una lacasa azul (llamada así por
tener 4 sitios de cobre) de aproximadamente 68 kDa, con una temperatura y pH óptimos de
60°C y 4.0, respectivamente. La purificación de esta enzima se realizó con la finalidad de
explotar su potencial industrial en la degradación de colorantes textiles para la bioremedación
de suelos [85].
Por otro lado, varios autores describieron la producción, purificación y caracterización de

xilanasas de A. ochraceus [86-89], estas enzimas son de particular interés debido a que
pueden ser utilizadas en la industria del papel. Las -xilanasas se han empleado para el pre-
blanqueamiento de pulpa de celulosa, demostrando que durante la aplicación incrementa
significativamente el brillo en las pulpas del proceso Kraft, esto permite reducir el uso de
cloro activo [86].
Otro trabajo de interés biotecnológico fue producir y caracterizar una -D-fructofuranosidasa

(invertasa) termoestable, inducida con bagazo de caña, para hidrolizar la sacarosa y
fructooligosacáridos en la industria alimenticia. Por otro lado, Batomunkueva y col.
utilizaron Aspergillus ochraceus para la producción de proteasas extracelulares con actividad
fibrinolítica y anticoagulante [90].
Hasta la fecha, las lipasas y esterasas de A. ochraceus no han sido foco de atención, lo que
abre una ventana de oportunidad, para su estudio, caracterización y aplicación en procesos
industriales.
36
1.4 PRODUCCIÓN DE LIPASAS Y ESTERASAS FÚNGICAS POR

FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO.
Los hongos están naturalmente adapatados a vivir en ambientes con una baja actividad de
agua y crecer de manera superficial sobre sustratos sólidos. No obstante, el 90% de la
producción de lipasas comerciales se lleva a cabo por fermentación sumergida (Fs).
Actualmente se están realizando grandes esfuerzos para justificar el empleo de la
fermentación en medio sólido (FMS) para la producción de hidrolasas a partir de hongos.
Estudios comparativos entre Fs y FMS han demostrado que el uso de la FMS para este fin
permite alcanzar una mayor productividad volumétrica, las hidrolsas producidas en ocasiones
son más estables y que además los costos de producción son menores [91-94].
Dentro de los estudios comparativos más relevantes podemos mencionar el de Mateos-Díaz y

col., quienes produjeron, purificaron y caracterizaron la lipasa de Rhizopus homothallicus
producida por FMS y Fs. Las características moleculares de las lipasas (peso molecular y N-
terminal) producidas por los dos tipos de fermentación revelaron que se trataba de la misma
hidrolasa. Sin embargo, la lipasa producida por FMS poseía una mayor actividad específica y
termoestabilidad. Además, las lipasas producidas mostraron diferente actividad de hidrólisis
sobre la posición interna de pseudoglicéridos sintéticos [91].
Del mismo modo Asther y col. cultivaron el hongo Aspergillus niger para la producción de
Faes utilizando pulpa de remolacha azucarera como inductor/fuente de carbono, no
solamente encontraron que por FMS se obtenía una mejor productividad volumétrica, si no
que también era posible inducir una Fae distinta a la producida por Fs [95].
El uso de residuos agroindustriales como soportes para la FMS, como las tortas de extracción
de aceite, salvado de trigo, cascarillas de arroz, maíz, etcétera, puede reducir
considerablemente el costo de producción de los metabolitos de interés [96, 97]. Un ejemplo
de esto es el trabajo de Castilho y col. [93], en el cual realizaron un análisis de costos para la
producción de la lipasa de Penicillium restrictum. Este grupo encontró que usando un sistema
de FMS los costos se abatían un 78% en comparación a lo requerido con la Fs.
A pesar de la gran cantidad de ventajas descubiertas de este sistema fermentativo, la falta de

fermentadores de FMS a escala industrial ha limitado hasta la fecha el uso de esta técnica
37
[98]. Por lo tanto más estudios enfocados a solventar este cuello de botella son
indispensables.
1.4.1 ASPECTOS GENERALES DE LA FMS.

La FMS ha sido definida como el cultivo de microorganismos sobre sólidos (soporte)
húmedos en ausencia parcial o total de agua libre [98, 99]. Algunos parámetros importantes y
decisivos a considerar durante la producción de enzimas por FMS son el tipo de fermentador,
de soporte, de inductor, el control de nutrientes (medio de impregnación), la temperatura,
humedad, aireación, entre otros. Estas variables afectan directamente al desarrollo del
microorganismo y por lo tanto al perfil de actividades enzimáticas, ya que se puede expresar
más de una proteína con la actividad de interés.
1.4.1.1 TIPOS DE FERMENTADORES PARA LA FMS.

Un fermentador de FMS debe ser diseñado y fabricado teniendo en cuenta factores como el
tipo de microorganismo, de sustrato y agitación a trabajar, así como también la técnica de
esterilización, inoculación, muestreo y recuperación del metabolito a obtener. Lo anterior,
con el fin de reducir la heterogeneidad del medio y proveer al microorganismo un ambiente
estable para su desarrollo. Además los fermentadores pueden acoplarse a sistemas de
monitoreo y/o control de los parámetros fundamentales mencionados en el apartado anterior.
En las secciones siguientes se describen las ventajas y desventajas de los dos tipos de
fermentadores utilizados para la realización de este trabajo.
1.4.1.1.1 FERMENTADOR DE COLUMNAS (ESCALA LABORATORIO).

La FMS a escala laboratorio se lleva a cabo en placas Petri, frascos, matraces Erlenmeyer de
boca ancha, botellas de Roux, y botellas de rodillos. [100]. Existen varios biorreactores a
pequeña escala, tales como los de columna. Mauris Raimbault y JC Germon en ORSTOM en
1980, diseñaron los biorreactores de columnas, para el cultivo de Aspergillus niger en harina
de yuca. Consistían en pequeñas columnas (diámetro: 22 mm, altura: 210 mm) que podían
contener hasta 20 g de material sólido previamente inoculados (Figura 16) [101].
Aproximadamente 24 de estas columnas se colocan en un baño de agua termo-regulada y se
hace pasar aire saturado en agua por el lecho de cada columna a un flujo de 4-6 L/h.
38
Figura 16. Esquematización de un sistema clásico de fermentación en medio sólido (FMS) en un biorreactor de
columnas. A. Disposición de una columna de FMS. B: Disposición del sistema de columnas para la producción
de metabolitos por FMS. 1: Columna de cristal. 2: Medio sólido inoculado. 3: Tapón de silicón. 4: Burbujeador
para la saturación del aire. 5: Difusor de aire. 6: Entrada de aire.
Los biorectores de columna, son de gran utilidad para la caracterización y optimización del
medio, para obtener datos que permitan realizar estudios cinéticos del microorganismo, que
constituyen una parte importante de la investigación [103]. Sin embargo, la dificultad en el
uso de estos, radica en la obtención del producto y la mala eliminación de calor. Pandey y
col. determinaron que el rendimiento de los biorreactores de columna para la producción de
glucoamilasa esta en función de las dimensiones de la cama de sustrato, ya que las columnas
más altas incrementaron la productividad [102]. No obstante, a una altura de 18 cm la
productividad disminuyó, debido a que la tasa de aireación se reduce [101].
1.4.1.1.2 FERMENTADOR DE CHAROLAS (ESCALA PILOTO).

Los fermentadores en charolas son los biorreactores más sencillos a escala piloto, una de sus
principales ventajas es que no requiere de aeración forzada. Este tipo de bioreactores también
se conocen como tipo Koji. Las charolas pueden estar hechas de madera, plástico o metal,
pueden o no tener perforaciones, sin embargo es recomendable que lo estén para mejorar la
difusión de aire. Las charolas se disponen una encima de la otra, con espacios adecuados
entre ellas, y son colocadas dentro de una cámara con temperatura controlada y bajo un buen
flujo de aire húmedo (Figura 17).
39
Figura 17. Representación esquemática de una cámara de fermentación con charolas clásica. Imágen adaptada a
partir del trabajo de Mitchell y col. (2006). 1: Cámara de fermentación. 2: Charolas dispuestas dentro de la
cámara de fermentación. 3: Charola de FMS perforada para el adecuado flujo de aire y disipación de calor
metabólico. 4: Charola de fermentación con medio sólido inoculado.
Estos reactores se han utilizado para la producción de metabolitos empleando diferentes

microorganismos, tales como bacterias del género Bacillus, Streptomyces, levaduras del
género Candida, pero principalmente hongos filamentosos como los Aspergillus, que son los
más fácilmente cultivables.
Una gran ventaja de este tipo de biorreactores es que con tan sólo aumentar el número de
charolas, se puede escalar fácilmente el proceso. No obstante, los requerimientos de
ésterilidad, espacios y maniobrabilidad hacen este proceso difícil. A pesar de estas
desventajas Rodriguez y col. reportaron que los biorreactores de charolas eran adecuados
para la producción de una lacasa de Trametes versicolor operando con soportes
lignocelulósicos [104]. Otro caso de éxito es la empresa BIOCON, la cual ha usado este tipo
de fermentadores para la producción a gran escala de inmunosupresores. Ellos simplificaron
los problemas de ésterilidad manteniendo las charolas en cuartos suministrados con aire
estéril con filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) y usando un equipo automatizado
para realizar las cubiertas de sustrato en las charolas [101].
40
1.5 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DEL MAÍZ: ALTERNATIVA PARA LA

PRODUCCIÓN DE BIOCATALIZADORES EN LA INDUSTRIA.
Diversos autores han reportado el uso de residuos agroindustriales para la producción de
enzimas. Algunos ejemplos que vale la pena resaltar son el uso de tortas residuales del
proceso de extracción de aceites para la producción de lipasas [96, 105, 106], residuos de la
industria del arroz para la producción de lipasas, celulasas y -glucosidasas [107, 108].
Faulds y col. utilizaron residuos como el salvado de trigo para la producción de la AnFaeA
[64, 109] y residuos de remolacha azucarera para la producción de la AnFaeB [60, 95, 110].
Por otro lado en nuestro grupo de trabajo se ha demostrado que los residuos del café por su
alto contenido de ácidos fenólicos son ideales para la producción de feruloil y clorogenato
esterasas de hongos filamentosos.
La razón por la cual estos residuos funcionan como inductores de dichas actividades, es
porque los componentes de estas materias primas desatan una respuesta a nivel genómico que
permite que el microorganismo exprese las enzimas necesarias para degradarlos y asimilarlos
como fuente de carbono. En el caso particular de las Faes, los ácidos hidroxicinámicos
unidos a azúcares sencillos que conforman estructuras lignocelulósicas desatan esta respuesta
genómica. Es por esto que los residuos del maíz, ricos en ácido ferúlico unidos a los
arabinoxilanos [111], son potenciales inductores de esta actividad [59, 97, 110, 112].
En México son abundantes los residuos de la industria del maíz, ya que la dieta diaria de los
habitantes depende en gran medida de este cereal. Es por esto que estos residuos se perfilan
como una alternativa económica para la producción de hidrolasas útiles en la industria.
1.5.1 LA INDUSTRIA DEL MAÍZ.

Actualmente en México se producen dos principales variedades de maíz, el maíz blanco y
amarillo. El grano de maíz blanco se utiliza principalmente para la obtención del nixtamal
empleado en la elaboración de las tradicionales tortillas y tamales. Sin embargo, también se
emplea para la obtención de aceite e insumos para la fabricación de barnices, pinturas,
cauchos artificiales y jabones. Por otra parte, el grano de maíz amarillo se utiliza para
consumo humano en una amplia variedad de platillos; sin embargo, su principal destino es la
alimentación del ganado y la producción de almidones [113].
41
Según cifras de la Organización Mundial de la Alimentación, en México, el 45 % del

consumo nacional de calorías proviene de alimentos derivados del maíz, ya que las tortillas
son parte esencial de la dieta de los habitantes. En este ámbito, México es el principal
consumidor de tortilla en el mundo, y se estima que más del 94% de la población la consume.
Por lo que el volumen de producción y consumo es cercano a los 22 millones de toneladas
por año [114] y para satisfacer esta demanda son procesadas aproximadamente 30 millones
de toneladas anuales de maíz.
1.5.2 NIXTAMALIZACIÓN.
En el proceso de generación de harinas de maíz, la operación más importante es la
nixtamalización, que tiene como finalidad liberar el pericarpio (cascarilla) del grano del
maíz, así como el germen, para lograr harinas con características organolépticas más
agradables. En esta etapa el maíz se calienta a temperaturas cercanas a la ebullición en
presencia de cal, los tiempos de cocción varian de 15 min a 2 h según los prácticas de
manufactura o dependiendo del tipo de maíz. Posteriormente, el maíz se macera en la misma
solución hasta por un día. El control de calidad de esta etapa se evalua retirando el pericarpio
del grano con los dedos.
Actualemente, la nixtamalización es llevada a cabo en México, Centroamérica, Estados

Unidos y algunas partes de Europa. El proceso tradicional requiere de aproximadamente 75
litros de agua por cada 50 Kg de granos de maíz, lo que genera una cantidad similar de aguas
residuales.
1.5.3 RESIDUOS DEL PROCESO DE NIXTAMALIZACIÓN.
1.5.3.1 NEJAYOTE.
Tras la culminación del proceso de nixtamalización se genera un caldo alcalino conocido
como nejayote, el cual contiene sólidos en suspensión como la cascarilla de maíz y sólidos en
solución como almidones, dextrinas, compuestos fenólicos, entre otros. Dentro de las
propiedades fisicoquímicas del nejayote se pueden mencionar que tiene un pH alrededor de
11, 3 % de sólidos totales, 0.8 % de cenizas, 0.9 % de carbohidratos y una conductividad
cercana a los 4.5 mS/cm [23]. También se reporta la presencia de compuestos bioactivos
42
como arabinoxilanos, fibra dietética y compuestos fenólicos tales como ácido p-cumárico,
ferúlico, dihidroferúlico y dehidrotriferúlico.
Se calcula que la industria del nixtamal genera entre 16 a 22 millones de m3/año de nejayote.
Además por su elevada carga orgánica e inorgánica se considera un residuo líquido altamente
contaminante, ya que genera una demanda bioquímica de oxígeno (DBO) del orden de los 7 a
10 mil mg O2/L. Cabe resaltar que la mayor parte de las empresas tienen como practica
desechar el nejayote sin previo tratamiento a los cuerpos de agua. Esto representa un grave
problema ambiental debido a que la normatividad ambiental vigente (NOM-002-ECOL
1996) señala una DBO de 200 mg O2/L como límite máximo en la descarga.
Para una mejor comprensión de la magnitud de la contaminación causada por los residuos
líquidos de la nixtamalización, es necesario señalar que, para degradar 1 Kg de DBO en un
ambiente cerrado se requieren 1.2 Kg de O2. Por otro lado, 1 L de agua viable para el
desarrollo de la flora y fauna acuática únicamente contiene 6 mg de O2 disuelto. Esto quiere
decir que una descarga de 1 Kg de DBO contamina 200, 000 L de agua viable, es decir una
cantidad 2, 000 veces mayor a la tratada. Por lo tanto, los 16 a 22 millones de m3 anuales de
nejayote que pueden descargarse en cuerpos de agua, comprometen alrededor de 38, 000
millones de m3 de agua “limpia”. Sin embargo, debido a la elevada complejidad de estos
efluentes, la problemática ambiental que generan ha sido muy difícil de resolver y hasta la
fecha los sistemas de tratamiento de aguas residuales probados no han sido exitosos.
La mayor parte de los esfuerzos se han centrado en generar tecnologías alternas a la

nixtamalización tradicional, en las que se reduce drásticamente la producción del efluente y
consumo de agua (solicitudes de patente MX PA05011797, WO 2009143416, WO
2004023892, EP 0883999, MX PA05011797). Una alternativa de aprovechamiento de este
efluente es integrarlo a procesos biotecnológicos. Por ejemplo, a través del uso de
membranas de ultra y nanofiltración se han logrado fraccionado compuestos de valor
agregado del nejayote (arabinoxilanos de distinto grado de polimerización y ácido ferúlico).
Además, la etapa final del proceso permite recuperar agua, la cual se puede reincorporar a la
etapa de nixtamalización [115].
43
1.5.3.2 RESIDUOS SÓLIDOS.

El pericarpio es el principal componente de los residuos sólidos de la industria del maíz; es
liberado durante la nixtamalización y generalmente se le conoce como cascarilla de maíz. La
cascarilla se recupera del nejayote antes de su disposición y en función del proceso de
obtención varian sus características fisicoquímicas.
La cascarilla de maíz esta compuesta principalmente de heteroxilanos (50 %, p/p), celulosa

(20 %) y ácidos fenólicos (4 %, principalmente ácido ferúlico y diferúlico) [116-118]. El
ácido ferúlico es el compuesto fenólico predominante en la cascarilla de maíz y en su
mayoría está unido covalentemente a los polisacáridos de la pared celular [119]. Además
contiene almidón (9–23 %), proteínas (10–13 %), lípidos (2–3 %) y cenizas (2 %).
Por su composición, la cascarilla de maíz es un material adecuado para la producción de

enzimas como lipasas y Faes. Previamente, Faulds y col. [109] lograron liberar ácido ferúlico
a partir de este material lignocelulósico con las Faes de Aspergillus niger; lo cual evidenció
su uso como inductor de dicha actividad. De este modo, Mathew y col. confirmaron esta
hipótesis, ya que utilizaron la cascarilla de maíz para la producción de las Faes de Aspergillus
flavipes, Phanerochaete and Trametes sp [97]. Algunos autores coinciden en que la cascarilla
de maíz contiene más ácido ferúlico y compuestos ferulados que otros residuos como el
salvado de trigo y la pulpa de remolacha azucarera [59] que se consideran inductores ideales
de Faes [50, 62]. No obstante, como la complejidad de las estructuras de los compuestos de
la cascarilla de maíz es superior, su uso como inductor de Faes no es tan habitual.
Por otra parte, la industria de producción de harinas y almidones de maíz generó en el año
2011 alrededor de 960 mil toneladas de cascarillas de maíz. Actualmente la cascarilla de
maíz obtenida a partir de este proceso no se aprovecha a nivel industrial, solamente se usan
en pequeñas cantidades como forraje.
Cabe resaltar, que el uso de los residuos del maíz para producir hidrolasas no solamente
contribuye a la resolución del grave problema ambiental, sino que también permite valorizar
estos y otra clase de residuos agroindustriales mediante el empleo de dichas hidrolasas para
obtener ácidos hidroxicinámicos de fuentes naturales y su posterior transformación a ésteres
con alto valor agregado.
44
1.6 LOS ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS.

Los ácidos hidroxicinámicos (AHs) son un grupo de compuestos que se han nombrado de
esta forma debido a la semejanza con el ácido cinámico, un ácido fenólico que se caracteriza
por la presencia de un anillo aromático unido a una función acrilo. Estos compuestos se
caracterizan por la hidroxilación en posición para en el anillo arómatico, a su vez pueden
tener o no hidroxilaciones o metoxilociones en posiciones adyacentes a este hidroxilo
(Figura 18).
Figura 18. Ácido cinámico e hidroxicinámicos. 1. Ácido cinámico. 2. Ácido p-cumárico. 3. Ácido cafeico. 4.
Ácido ferúlico. 5. Ácido sinapínico.
Los AHs están distribuidos por todo el reino vegetal, ya sea en especias, vegetales, granos,
cereales y frutas, en la gran mayoría de los casos tienen una función estructural. Unen las
cadenas de hemicelulosa y lignina de la pared celular (ferúlico y p-cumárico; Figura 19),
incrementando la resistencia de las plantas hacia la degradación microbiana [68].
El representante principal del grupo de los AHs es el ácido ferúlico, por su abundancia en la
naturaleza. Actualmente es el único que tiene un papel relevante en la industria, por su papel
como precursor de la vainillina. En este proceso de dos etapas se utiliza el ácido ferúlico
como sustrato del hongo Aspergillus niger (CMGCC0774) para formar ácido vainíllico que
posteriormente es fermentado por el hongo Pycnoporus cinnabarinus para sintetizar el
producto final. La vainillina, obtenida en este proceso, es reconocida como natural y tiene
muchas ventajas sobre la vainillina obtenida por síntesis química o extracción, las más obvia
es la relación calidad/precio. Mientras la vainillina de extracción tiene un costo entre $1200 y
$4000 USD/Kg la “biovainillina” se mueve en el mercado a un precio 10 veces menor [120].
45
Figura 19. Representación de la pared celular de las plantas conteniendo heteroxilanos ferulados. Las cadenas
de heteroxilanos intercaladas entre la microfibras de celulosa contienen ésteres del ácido ferúlico de forma
monomérica y 5-5’ ácido diferúlico y 8-O-4′ diferulatos [68].
Además se han demostrado que los AHs tienen propiedades benéficas para la salud humana
como antioxidante, reductores de los niveles altos de lípidos, triglicéridos y glucosa en
sangre, supresores de la formación de melanina, fotoprotectores contra los rayos UV e
inhibidores o preventivos de algunos tipos de cáncer como el de mama, colon, pulmón,
estómago y lengua; así como también del daño cerebral por proteínas relacionadas con el
Alzheimer [4]. Cabe resaltar que la actividad biológica de los ácidos hidroxicinámicos se
potenciar a través de su modificación con otras moléculas. La modificación más socorrida ha
sido la esterificación, con la finalidad de cambiar su balance hidrofílico/lipofílico y de esta
forma integrarlos a formulaciones cosméticas o de alimentos. En la siguiente sección se
hablará más a fondo sobre los beneficios a la salud de los AHs y sus ésteres.
1.6.1 POTENCIAL BIOLÓGICO DE LOS ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS Y SUS

ÉSTERES.
Uno de los principales atractivos de los AHs es su potencial antioxidante y su efecto
protector contra los rayos UV [7, 121-123]. La molécula del AH debe estas propiedades a su
estructura. Las sustituciones hidroxilo en el anillo fenólico y la cadena acrilo la hacen un
46
excelente captor de electrones. Cualquier radical libre que choca con el ácido ferúlico puede
robar fácilmente un hidrógeno de las sustituciones del anillo para hacer de este un radical
fenoxi (Figura 20a); este queda estabilizado debido a que el electrón desapareado puede
moverse a través de toda la molecula por la serie de insaturaciones conjugadas (Figura 20b-
f). Este fenómeno resta reactividad al radical y disminuye la posibilidad de que se inicie una
reacción en cadena de radicales, y su destino más probable es su condensación con otro
radical, incluso con otra molécula de AH, generando el dimero curcumina (cuando el captor
es ácido ferúlico o p-cumárico). La cantidad de hidroxilos, potenciales donadores de protones
en estas reacciones, hacen que los AHs sean más o menos eficientes en el proceso
antioxidante, siendo el ácido cafeico el que tiene el mayor potencial, seguido del p-cumárico,
ferúlico y sinapínico [121, 123-125].
Figura 20. Mecanismo antioxidante del ácido ferúlico. En la figura se muestra la captación de un electrón
proveniente de un radical libre y su resonancia a través de toda la molécula.
Del mismo modo, el efecto contra la luz UV se logra con la formación de un radical fenoxi,
lo cual lleva a una isomerización cis-trans al pasar de la configuración mostrada en la Figura
20f a una forma estable con la captación de un hidrógeno. Esta absorción de la radiación UV
es capaz de inhibir otras reacciones de radicales libres.
Las características anteriores permiten que los AHs puedan funcionar como un antioxidante
importante en la preservación de la integridad fisiológica de las células que están expuestas al
aire y a la radiación UV. Cabe resaltar que estas propiedades se pueden explotar si los AHs
se incorporan a alimentos o lociones cosméticas, en estas últimas se ha mostrado un efecto
supresor de la melanina [4]. Además su adición en los alimentos puede inhibir la
peroxidación de lípidos y descomposición oxidativa.
47
Estudios especializados de estas moléculas, han demostrado que una alteración en el balance
hidrofílico/lipofílico puede potenciar la mayor parte de las actividades antes mencionadas,
por lo cual la esterificación de estas moléculas se ha vuelto una modificación recurrente en
los AHs.
Se han realizado trabajos para la síntesis de ésteres de AHs para mejorar su balance
hidrofílico, con la finalidad de mejorar su solubilidad en alimentos acuosos y de esta forma
aprovechar su actividad antioxidante, antiviral e antiinflamatoria [6]. El 1-sinapoil glicerol y
1-p-cumaroil glicerol sintetizados con la feruloil esterasa tipo A de A. niger son ejemplos de
moléculas modificadas para mejorar su solubilidad en agua. Asimismo, con esta Fae, se ha
reportado la síntesis de oligosacáridos que contienen residuos de D-arabinofuranosil C-5, tal
como feruloil D-arabinosa, estos funcionan como inhibidores potenciales de la α-(1→5)-
arabinosiltransferasa implicada en el montaje de la pared celular arabinano-micobacteriana.
Las infecciones micobacterianas y más notablemente la tuberculosis son conocidas como
causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo [77, 126].
Por otra parte, la lipofilización de los AHs mediante su esterificación con cadenas alifáticas,
también puede mejorar algunas de sus características biológicas. Por ejemplo, diversos
autores han reportado la utilidad del ácido ferúlico para evitar la formación de la placa -
amiloide, que es el principal factor en el desarrollo del Alz Heimer. En este caso, el carácter
más lipofílico del etil éster del ácido ferúlico permite su transporte a través de la barrera
hematoencefálica, mejorando así la eficiencia del poder antioxidante. [123, 127-129].
Otras actividades de gran interés encontradas en los ésteres de ácidos hidroxicinámicos, son
su potencial para la inhibición de la oxidación del LDL. Moléculas como el Arbutin ferulato
[72] mostraron mejoras de hasta el 10% en su potencial antioxidante. Por otra parte, Vafiadi
y col. realizaron ensayos con los 4 ésteres butílicos y sec-butílicos de los ácidos
hidroxicinámicos y demostraron que son antioxidantes más efectivos que su contraparte libre,
indicando que la ésterificación incrementa la actividad antioxidante, especialmente en
compuestos dimetoxilados como el ácido sinapínico, comparados con compuestos
metoxilados-hidroxilados como el ácido ferúlico [80].
48
Los derivados ésterificados del ácido ferúlico y caféico, como el hexil cafeato y ferulato
mejoraron su actividad quimioterapéutica sobre células de cáncer de mama, con respecto a
las moléculas sin ésterificar [130]. Estos resultados demostraron que los derivados
incrementaron su citotoxicidad hacia líneas celulares de este tipo de cáncer, aunque la
magnitud y tipo de efectos podrían ser dependientes del tipo de célula.
Estudios similares se realizaron utilizando ésteres del ácido caféico (etil, propil y octil
cafeato), para evaluar la actividad antitumoral en líneas celulares de adenocarcinoma de
cérvix humano. En este caso se encontró una inhibición superior en el crecimiento de las
células y mayor citotoxicidad de los ésteres en comparación con sus ácidos correspondientes,
en particular el propil cafeato fue la molécula que mostró una actividad más acentuada contra
este tipo de células [131].
Estas interesantes propiedades han hecho que exista un creciente interés en la síntesis de
ésteres de AHs. Comúnmente la síntesis de los derivados de cadena corta y lineal de AHs se
lleva a cabo de manera no específica vía catálisis química. Sin embargo, esta estrategia no es
efectiva para la síntesis de derivados de cadena mediana a larga (>C3) o con múltiples
sustituyentes, debido a que se generan subproductos que dificultan la purificación y afectan
negativamente los rendimientos.
Por lo tanto, la biocatálisis es una estrategia atractiva para la obtención y funcionalización de

AHs, ya que existen diferentes carboxil éster hidrolasas como las lipasas, feruloil esterasas y
clorogenato esterasas con el potencial de llevar a cabo este tipo de reacciones.
Las lipasas, cuyo rol natural es hidrolizar el enlace éster de los triglicéridos de cadena larga;
son capaces de aceptar sustratos diferentes, tanto naturales con estructuras complejas, como
sintéticos. Algunas lipasas pueden presentar características estructurales únicas que le
permiten aceptar a los ácidos fenólicos como sustrato. Esto probablemente se deba a que la
actividad lipasa es la función ancestral que evolucionó molecularmente a una clase específica
de feruloil esterasas (tipo A) con mayor especificidad hacia sustratos fenólicos (véase sección
1.2.9.2). Diversos trabajos publicados han señalado que lipasas, como las tipo B de Candida
antarctica [72, 73], la de Rhizomucor miehei [8] , de Thermomyces lanuginosus [132, 133],
entre otras, han sido capaces de lograr la alcohólisis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos
49
(etil, butil, octil ferulato, hexil cafeato, fenetil éster del ácido caféico, entre otros) con
rendimientos del 20 a 98% dependiendo estrechamente de las condiciones a las que se lleve a
cabo la reacción [134-136]. Sin embargo, algunas reacciones como la síntesis de derivados
del ácido caféico, las llevan a cabo con una baja velocidad y se logran pobres rendimientos
en la reacción [73]. Por lo tanto, estas reacciones no convencionales para las lipasas, en
ocasiones pueden ser complejas. El problema anterior se puede contrarrestar si se emplean
Faes.
Trabajos como los del grupo de Topakas y Vafiadi han comprobado que la Faes son
catalizadores eficientes utilizando sistemas ternarios para la síntesis de ésteres alifáticos, y
con funciones hidrofílicas como carbohidratos [77, 78, 80, 126, 137].
Por todo lo anterior, el rol biotecnológico de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos destaca
la importancia de encontrar catalizadores amigables con el medio ambiente para su
producción, como las lipasas y feruloil esterasas.
1.7 ÉSTERES DE LUTEÍNA Y SU IMPORTANCIA BIOTECNOLÓGICA.

La luteína (Figura 21), un dihidroxicarotenoide encontrado principalmente en las plantas del
género Tagetes, conocidas en México como Cempaxúchitl [13, 138]. Aquí, está unida con
varios tipos de ácidos grasos de cadena larga, como láurico, mirístico y palmítico, en forma
de éster [14, 139].
Figura 21. Estructura química de la luteína.
Tradicionalmente la luteína ha sido utilizada en la alimentación de pollos para dotarlos de un

color amarillo en la piel, ya que los consumidores mexicanos la encuentran más atractiva que
la piel blanca. Del mismo modo, también resulta en una coloración más intensa en las yemas
de los huevos. En este caso la mejora de la tonalidad no es el único beneficio, también hace
que la luteína contenida en la yema se preserve y por lo tanto la eficiencia de asimilación
50
mejore debido al entorno alto en grasas, y de este modo el humano pueda obtener sus efectos
benéficos.
El consumo de este carotenoide tiene beneficios relacionados principalmente con su

actividad antioxidante, la cual protege las células de los radicales libres y reduce la
incidencia de enfermedades crónico-degenerativas. Otra de sus actividades benéficas en el
humano es la reducción del riesgo de la degeneración macular relacionada con la edad
(AMD) [15, 16, 140, 141], la cual es una enfermedad progresiva degenerativa de la mácula,
ésta es una región rica en conos responsable de la agudeza visual [17, 142, 143]. Otra serie de
estudios sugieren que también pueden ayudar a mantener la salud cardiaca reduciendo el
riesgo de aterosclerosis, ataques cardíacos y embolias [18, 144, 145].
Sin embargo, una de las principales desventajas de la luteína libre es su alta susceptibilidad a
la degradación. Los grupos hidroxilo y los múltiples dobles enlaces en la molécula la hacen
sensible a la oxidación y degradación por acción de luz UV y altas temperaturas [19, 146],
por lo cual su uso se ha visto muy limitado. Por otra parte, los ésteres de luteína de cadena
larga han demostrado ser tolerantes a estas condiciones, manteniendo algunas de las
propiedades funcionales; sin embargo su biodisponibilidad es muy pobre.
En trabajos previos se comprobó alimentando gallinas con una dieta a base de luteína
esterificada con ácidos grasos de cadena corta, que está prácticamente igual de biodisponible
que en su forma libre. No obstante, su estabilidad térmica y a la luz UV es mucho mayor,
incrementando enormemente su vida de anaquel y permitiendo la formulación de nuevos
productos. Lo anterior probablemente ocurre del mismo modo en que las formas esterificadas
de retinol y tocoferol (vitamina A y E) son absorbidas en el intestino delgado. Aquí la
microflora intestinal logra hidrolizar los ésteres de los nutrientes anteriores y permiten
posteriormente su asimilación como alcoholes libres [147]. Del mismo modo, se cree que los
ésteres de cadena corta de la luteína pueden ser transformados en luteína libre antes de
empezar el proceso de asimilación [148].
La mayoría de los estudios acerca de los ésteres de luteína se han concentrado en la

comparación de la biodisponibilidad con respecto a su forma libre, así como metódos de
obtención y purificación; hasta la fecha no existen reportes con el objetivo de realizar ésteres
51
de luteína. El único trabajo donde se esto se reporta fue realizado por el grupo de Shigenobu
y col, quienes en 1993, encontraron que en granos de trigo la luteína aparentemente era
ésterificada de forma espontánea con ácidos grasos de cadena larga. Posteriores
observaciones indicaron que esta esterificación estaba siendo realizada mediante acción
enzimática, los autores especularon que carboxil éster hidrolasas como las lipasas podía ser
las responsables de esta catálisis [149].
Como se mencionó anteriormente, los ésteres de cadena corta de luteína pueden ser la
alternativa más adecuada para conservar la biodisponibilidad de la luteína libre así como la
resistencia a la degradación de las formas esterificadas de cadena larga. Por lo tanto se
requieren catalizadores con la capacidad para realizar estas reacciones. Las lipasas y
esterasas se presentan como una opción adecuada.
Evidencia generada en nuestro laboratorio demostró que la lipasa B de Candida antarctica es

capaz de producir el éster propílico de la luteína a partir de vinil propionato y luteína libre,
Además también se encontró que los fermentos secos de Aspergillus ochraceus ricos en
actividad carboxil éster hidrolasa (Lipasa, feruloil esterasa, etc.) también eran capaces de
catalizar esta reacción. Es así como aumenta el interés por las lipasas y esterasas de éste
hongo en particular.
1.8 LAS LIPASAS Y ESTERASAS DE Aspergillus ochraceus (Aoc) COMO

HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS.
A razón del gran interés por encontrar lipasas y esterasas capaces de sintetizar ésteres con
valor biotecnológico, como los ésteres de ácidos hidroxicinámicos o de luteína; nuestro
grupo de trabajo se enfocó en hacer aislamientos de hongos naturalmente adaptados a vivir
en fuentes ricas en ácidos fenólicos, como los residuos del café. El cribado primario se
realizó sobre más de 100 cepas empleando medios de cultivo de composición conocida para
detectar halos de actividad lipasa, feruloil y clorogenato esterasa. Las 7 cepas seleccionadas
se cultivaron por FMS, utilizando pulpa de café para la inducción de las hidrolasas de interés.
A los fermentos sólidos se les monitoreó simultáneamente actividad lipasa, feruloil y
clorogenato esterasa empleando un método espectrofotométrico de cribado de alto
rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) implementado previamente [150].
52
La cepa más destacada fue identificada como ASIII (Aislamiento Superior III).
Posteriormente, observaciones de sus características macro y microscópicas en cultivos en
placa, además de un análisis de secuencia de la región ITS1-I5.8-ITS2, lograron identificar a
dicha cepa como Aspergillus ochraceus (Aoc; NCBI: EU805804).
Los trabajos realizados por Ramirez y col. indicaron que Aoc produce al menos dos Faes con
diferente peso molecular, así como una clorogenato esterasa. A la postre, estos estudios se
concentraron en la purificación y caracterización de la clorogenato esterasa. Los autores
lograron identificar una enzima de aproximadamente 74 kDa, con una remarcable vida media
de 5.5 h a 50°C, y actividad sobre ácido clorogénico y metil cafeato. Hasta la fecha, dicho
perfil no ha sido reportado para ninguna otra clorogenato esterasa [20].
En 2014, Romero-Borbón y col., produjeron, purificaron y caracterizaron una de las Faes de

Aoc, a la cual se denominó AocFae1, mediante su inducción en FMS con residuos de la
industria del maíz (cascarillas). La AocFae1 tiene un peso molecular aproximado de 30 kDa,
además de una temperatura y pH óptimos de 50°C y 6.5, respectivamente. El perfil
hidrolítico y el análisis de la N terminal de la AocFae1 demostraron que es una feruloil
esterasa tipo C de acuerdo a la clasificación de Crepin [48], con preferencia por el metil
ferulato[151].
Adicionalmente, mediante una purificación parcial, estos autores identificaron la segunda Fae
(AocFae2). Aunque hasta la fecha no se conocen sus características bioquímicas, se sabe que
tiene un peso molecular aproximado de 76 kDa y que al igual que la AocFae1 es una feruloil
esterasa inespecífica. A diferencia de la AocFae1, la AocFae2 es capaz de liberar ácido
caféico a partir del ácido clorogénico [20].
Trabajos complementarios por Mateos y col. dieron a conocer que esta cepa también
producía grandes cantidades de actividad lipasa cuando se utilizan lípidos como inductor en
la FMS. En este caso, se lograron identificar al menos 3 lipasas mediante ensayos
zimográficos; sin embargo, no fue posible purificar la lipasa expresada mayoritariamente
debido a que el uso de lípidos en los cultivos generaba complejos lipoprotéicos que
interfirieron con los protocolos de purificación [152].
53
Estos trabajos demostraron la capacidad de Aspergillus ochraceus para expresar hidrolasas

que permiten la supervivencia del hongo en residuos con altas concentraciones de ácidos
fenólicos y lípidos. Cabe resaltar que en ensayos realizados en nuestro laboratorio, se
demostró que además Aoc es capaz de utilizar el etil ferulato como única fuente de carbono
[22].
En estudios posteriores, se probaron los fermentos secos de Aoc ricos en lipasas y feruloil
esterasas, en la alcohólisis de metil hidroxicinamatos en butil hidroxicinamatos, logrando
resultados satisfactorios. Además estos fermentos también fueron capaces de realizar la
síntesis de dipropionil luteína.
Estos resultados demostraron que ciertas hidrolasas de Aoc pueden emplearse como
herramientas biotecnológicas para la producción de ésteres con alto valor agregado. Sin
embargo, lo anterior dejó muchos cabos sueltos, ya que tanto las lipasas como las feruloil
esterasas tienen la capacidad de catalizar este tipo de reacción y la evidencia obtenida hasta
ese momento sugería que Aoc puede producir hasta 5 de ellas (2 Faes y 3 lipasas) por lo cual,
la incógnita de qué carboxil éster hidrolasa es la responsable de la reacción quedó en el aire,
lo que abre una ventana de oportunidad para su estudio.
Una alternativa atractiva es usar los residuos del maíz como inductores de este tipo de
hidrolasas, ya que son ricos en compuestos fenólicos ésterificados y en lípidos (contenidos en
el germen residual). Además de darles un uso alternativo con miras a su escalamiento, lo que
podría conllevar a una resolución parcial del grave problema ambiental que por ahora
representan.
54
Capítulo 2: Justificación, hipótesis y objetivos
CAPÍTULO 2: JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y

OBJETIVOS.
55
2.1 JUSTIFICACIÓN.
En estudios realizados por nuestro grupo de trabajo, se demostró el enorme potencial
catalítico de ciertas enzimas producidas por Aspergillus ochraceus. Este hongo filamentoso
es capaz de producir distintas hidrolasas por fermentación en medio sólido (FMS). Algunas
evidencias indican que los fermentos sólidos obtenidos usando lípidos y cascarilla de maíz
como inductores, sintetizan compuestos como la dipropionil luteína y el butil p-cumarato,
que poseen diferentes actividades biológicas, entre ellas antioxidante, antitumoral, etc.
Debido a la naturaleza de los fermentos sólidos secos utilizados como biocatalizadores en

estas reacciones, no es posible saber que enzima es capaz de llevarlas a cabo. La literatura
sugiere que las lipasas y las feruloil esterasas pueden ser responsables de esta reacción de
síntesis. No obstante, Aspergillus ochraceus puede producir hasta 5 hidrolasas pertenecientes
a esta clasificación, lo cual dificulta la identificación de la responsable de la actividad de
sintésis.
Con la finalidad de explotar las lipasas o feruloil esterasas de Aoc, se realizaron intentos por
purificarlas. Los ensayos de purificación de la actividad lipasa, indicaron que la actividad
está fuertemente asociada a los lípidos del medio de cultivo, lo que impide su purificación,
inclusive después realizarse un protocolo de delipidación. Por otra parte, los bajos
rendimientos en la purificación de la actividad feuloil esterasa de Aspergillus ochaceus no
permitieron realizar ensayos de síntesis debido a las grandes cantidades de proteína
requeridas en estos ensayos.
Por lo anterior, una estrategia que podría utilizarse para lograr identificar y purificar la lipasa
o feruloil esterasa responsable de la síntesis de las moléculas de interés, es mediante el uso de
medios de cultivo con bajos contenidos de lípidos, como los formulados con residuos del
maíz (cascarillas y nejayote) y de este modo obtener cantidades suficientes para lograr
finalmente caracterizar la lipasa o Feruloil esterasa en cuestión.
2.2 HIPÓTESIS.
Empleando los residuos de la industria del maíz como inductores en el cultivo de Aspergillus
ochraceus, será posible identificar y purificar parcialmente la lipasa o feruloil esterasa que
cataliza la síntesis de ésteres de valor biotecnológico.
56
2.3 OBJETIVO GENERAL.

Inducir las lipasas/feruloil esterasas de Aspergillus ochraceus empleando residuos de la
industria del maíz para identificar y purificar parcialmente la responsable de catalizar la
síntesis de ésteres de valor biotecnológico.
2.3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

 Encontrar las condiciones que permitan inducir y producir preferencialmente las
distintas lipasas y feruloil esterasas empleando los diferentes residuos del maíz.
 Elucidar y generar la(s) hidrolasa(s) responsable(s) de la síntesis de butil p-cumarato
y dipropionil luteína.
 Purificar parcialmente la hidrolasa y conocer su perfil hidrolítico.
 Caracterizar en síntesis la hidrolasa responsable de las reacciones de interés.
57
Capítulo 3: Materiales y métodos
CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS.
58
3.1 MATERIALES.
A continuación se enlistan todos los reactivos, materias primas, enzimas y cepas empleadas
para el desarrollo de las técnicas analíticas utilizadas durante la realización del presente
trabajo.
3.1.1 REACTIVOS Y CONSUMIBLES.

Los ácidos hidroxicinámicos (ácido cafeico, o-cumárico, m-cumárico, p-cumárico, ferúlico,
sinapínico y clorogénico), tributirina (TC4), trioctanoina (TC8), vinil propionato (VC3), p-
nitrofenol (pNP), rojo de fenol, éter etílico, isooctano CHROMASOLV®, hexano
CHROMASOLV®, metanol, etanol, n-propanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, tert-
butanol, fenetil alcohol, Triton X100®, N-lauroilsarcosina (NLS), tetrametiletilendiamina
(TEMED), seroalbúmina bovina (BSA), reactivo de Bradford, fosfato dibásico de potasio
(K2HPO4), sulfato de magnesio (MgSO4), Urea, MOPS, MES, TRIS, ácido fosfórico, ácido
clorhídrico (HCl), ácido acético, hidróxido de sodio (NaOH), cloruro de sodio (NaCl), sulfato
de amonio ((NH4)2SO4), glucosa, silica gel (130-170 mesh) y la arena de cuarzo se
adquirieron en Sigma-Aldrich-Fluka-Vetec. El hexano, éter etílico y de petróleo ACS fueron
marca Karal. El agar bacteriológico y papa dextrosa se compraron marca BIOXON. La
acrilamida, bis-acrilamida, glicina, azul de Coomasie y marcadores de peso molecular de
rango bajo fueron adquiridos de BIORAD. Las membranas con corte nominal de 3, 30 y 50
kDa fueron de celulosa regenerada y se adquirieron en Millipore. La luteína libre fue
generosamente donada por VEPINSA S.A. de C.V. Los metil y butil hidroxicinamatos fueron
sintetizados en nuestro laboratorio vía esterficación de Fisher-Speier.
3.1.2 MATERIAS PRIMAS.

Las cascarillas de maíz amarilla y blanca fueron generosamente donadas por CPI ingredients
y MINSA, respectivamente. El nejayote se obtuvo de una tortillería local, el bagazo de caña
utilizado fue donado por el Ingenio azucarero de Tamazula, Jalisco.
3.1.3 ENZIMAS.
La lipasa B de Candida antarctica (CALB), Rhizomucor miehei (RML), Thermomyces
lanuginosus (TLL), Candida rugosa (CRL) y la de Aspergillus niger (ANL), tanto líquidas
como inmovilizadas fueron compradas de Sigma-Adrich. Las preparaciones enzimáticas NS-
000002 y Depol 740 se obtuvieron de Biocatalyst. Las feruloil esterasas tipo A y B (AnFaeA
59
y AnFaeB), de A. niger se produjeron en nuestro laboratorio a partir de las cepas

amablemente donadas por el INRA-Francia y la purificaron se realizó de acuerdo a los
protocolos de Record y Levasseur [153, 154].
3.1.4 CEPA DE ESTUDIO.

La cepa de Aspergillus ochraceus utilizada para este estudio es la cepa NCBI: EU805804,
aislada de los residuos de café de la compañía DIVERSIFICADOS DE ARGOVIA, S.A. de
C.V. en el municipio de Tapachula, Chiapas. Las esporas de la cepa se preservaron en una
solución estéril de glicerol al 50% (v/v). La solución de esporas se distribuyó en crioviales de
2 mL. Finalmente estos se almacenaron a -20°C y sirvieron como cepa de partida para todos
los trabajos posteriores.
3.2 MÉTODOS.
3.2.1 TRATAMIENTO DE LAS MATERIAS PRIMAS.
3.2.1.1 BAGAZO DE CAÑA.

El bagazo de caña se molió con ayuda de un molino de martillos marca Pulvex®.
Posteriormente se tamizó y la fracción retenida por la malla 40 se recuperó y lavó con
abundante agua hasta eliminar por completo los azúcares residuales, así como compuestos
solubles en agua. Finalmente se secó a 60°C por convección forzada y se almacenó en bolsas
de polipropileno a temperatura ambiente.
3.2.1.2 CASCARILLA DE MAÍZ AMARILLO.

La cascarilla de maíz amarillo se molió con ayuda de un molino doméstico de cuchillas.
Posteriormente se tamizó y las fracciones retenidas por la malla 40 y 100 se recuperaron y
almacenaron a temperatura ambiente en bolsas de polipropileno.
3.2.1.3 CASCARILLA DE MAÍZ BLANCO.

El almidón, péptidos y otros compuestos solubles contenidos en la cascarilla de maíz blanco
se separaron mediante lavados con abundante agua y posteriormente la mayor parte del
gérmen residual (rico en lípidos) se sedimentó. Consecutivamente, se secó por convección
forzada a 30°C durante 24 h. La cascarilla seca se molió en un molino doméstico de cuchillas
60
y se tamizó. La fracción retenida por la malla 40 y 200 se recuperó y almacenó a temperatura

ambiente en bolsas de polipropileno.
3.2.1.4 NEJAYOTE: GENERACIÓN DE LAS FRACCIONES

ESTANDARIZABLES.
El residuo líquido del proceso de nixtamalización del grano de maíz –Nejayote- se sometió al
proceso de ultra y nanofiltración mostrado en la Figura 22.
Las fracciones utilizadas para los estudios en este trabajo fueron el diafiltrado de 5 kDa (Bd),
retenido de ósmosis (C) y retenido de nanofiltrado (D).
La fracción Bd consta principalmente de oligómeros de arabinosa y xilosa con un grado de

polimerización (DP) teórico superior a 30, y real superior a 10. La fracción C consta de
monómeros de carbohidratos y ácidos hidroxicinámicos (ferúlico, p-cumárico). La fracción D
es un concentrado con todos los componentes del nejayote inicial sin minerales.
Figura 22. Diagrama de bloques del proceso de ultra y nanofiltración para la valorización del nejayote [115]
61
3.2.2 DESARROLLO DE LOS PROCESOS FERMENTATIVOS PARA LA PRODUCCIÓN

DE LA ACTIVIDAD LIPASA/ FERULOIL ESTERASA.
3.2.2.1 INÓCULO Y EXTRACCIÓN DE ESPORAS.
El medio mínimo empleado para el inóculo presentó la siguiente composición (g/L): urea (4),
K2HPO4 (5), MgSO4 (1) y agar bacteriológico (15). Dependiendo del objetivo a evaluar, el
inóculo utilizado para cada fermentación se realizó con tres inductores, la cascarilla de maíz
blanca, amarilla o el retenido de nanofiltrado de nejayote (fracción D). Las cascarillas
molidas y tamizadas se emplearon a una concentración final de 40 g/L. Cuando la fracción D
se empleó como inductor, el agua del medio mínimo fue sustituida por la contenida en dicha
fracción. 50 mL de la solución se depositó en matraces Erlenmeyer de 250 mL y se esterilizó
a 121°C a 15 Psi durante 15 min. Cuando el medio solidificó, a cada matraz se le agregaron
400 µL de la solución de esporas preservada a -20°C y se incubaron a 30°C por 5 días.
Posteriormente a cada matraz se le agregaron 50 mL de una solución al 0.01% de tween 80 y
con ayuda de un agitador magnético se recolectaron las esporas. Finalmente, la solución de
esporas generada se filtró por una gasa estéril y se realizó un conteo en una cámara de Neu
Bahuer para determinar las esporas por mililitro.
3.2.2.2 PRODUCCIÓN POR FERMENTACIÓN EN MEDIO

SUMERGIDO (FS) DE LA ACTIVIDAD LIPASA Y FERULOIL
ESTERASA DE Aspergillus ochraceus.
Para la fermentación en medio líquido se realizó un caldo nutritivo compuesto por (g/L): urea
(4), K2HPO4 (5) y MgSO4 (1); el pH final del medio se ajustó a 6.5. A cada matraz de 250
mL se agregó 50 mL del caldo nutritivo y posteriormente 2 g de cascarilla de maíz tratada
como en la sección 3.2.1.2 y 3.2.1.3, cuyo rol fue de fuente de carbono e inductor de la
actividad lipasa y feruloil esterasa. A continuación cada matraz se inoculó con 1x107
esporas/mL y se incubaron en un agitador orbital marca New Brunswick, a 30°C a 125 RPM
por 8 días. El muestreo se realizó cada 24 h por duplicado retirando 2 mL del medio líquido
fermentado.
62
Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13,500 RPM a 4°C durante 10 minutos, el

sobrenadante se decantó y filtró por una membrana de celulosa regenarada de 0.45m.
Finalmente la actividad lipasa y feruloil esterasa se determinó sobre TC8, MpC y MF como
se describe en la sección 3.2.3.1 y 3.2.3.4.
3.2.2.3 PRODUCCIÓN POR FERMENTACIÓN EN MEDIO SÓLIDO

(FMS) DE LA ACTIVIDAD LIPASA Y FERULOIL ESTERASA
DE Aspergillus ochraceus.
Para la realización de la FMS inicialmente se preparó el medio de cultivo, que consta de una
parte sólida y una parte líquida cuya proporción se designó en función de la humedad
requerida durante la fermentación. La humedad asignada para las fermentaciones realizadas
con cascarilla de maíz y para las realizadas con las fracciones del nejayote fue de 65 y 75%,
respectivamente. Dos tercios de la parte líquida correponden al medio de impregnación, cuya
composición (g/L) fue: urea (6), K2HPO4 (7.5) y MgSO4 (1.5) y pH final de 6.5. El resto de
la parte líquida correponden a una solución de esporas con una concentración de 3x10 7
esporas/mL. La parte sólida constó de bagazo de caña y únicamente para el caso de las
fermentaciones que se hicieron con cascarilla de maíz, se adicionó ésta en una relación 2:1
(cascarilla: bagazo de caña). La parte sólida y el medio de impregnación se esterilizaron por
separado a 121°C a 15 Psi durante 15 min. Posteriormente se mezclaron en condiciones
ascépticas y se homogenizó junto con la solución de esporas. Aproximadamente 25 g de la
mezcla final se colocaron en columnas de vidrio de 2.5x30 cm (d x L). Las columnas se
incubaron en un baño de agua a 30°C con un suministro de aire húmedo de 50 mL/min a
través del lecho. El muestreo se realizó cada 24 h por duplicado retirando 2 columnas para el
caso de las fermentaciones usando cascarilla de maíz y se realizó un único muestreo a las 72
h para las fermentaciones donde se usaron las fracciones del nejayote.
Para el monitoreo de las actividades de interés, se realizó una extracción líquida de la

actividad enzimática utilizando 4mL de tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2 por cada gramo de
bagazo fermentado, se dejó reposar por 20 minutos a 4° C para después extraer la fase
líquida, esta última se centrifugó a 13,500 RPM a 4°C durante 10 min y se filtró por una
membrana de celulosa regenerada de 0.45m. A este extracto se le determinó la actividad
63
lipasa y feruloil esterasa sobre TC8, MpC y MF como se describe en la sección 3.2.3.1 y
3.2.3.4.
3.2.2.3.1 TRATAMIENTO DE SECADO DE LOS FERMENTOS DE FMS PARA SU USO

COMO BIOCATALIZADORES.
Para el uso de los fermentos de la FMS como biocatalizadores para la síntesis de los ésteres
de interés, se secaron utilizando un flujo de aire seco a temperatura ambiente por 24 h. Una
vez secos, los fermentos se molieron con un molino de cuchillas marca KRUPS y se
tamizaron a través de una malla No. 100. A los fermentos secos molidos (denominados
biocatalizadores) se le determinó la actividad lipasa y feruloil esterasa sobre TC8 y MpC
como se describe en la sección 3.2.3.1 y 3.2.3.4. Finalmente se almacenaron en un frasco
ámbar a 4°C para su posterior uso.
3.2.2.4 FERMENTACIÓN EN CHAROLAS PARA LA OBTENCIÓN DE

LA ACTIVIDAD FERULOIL ESTERASA DE Aspergillus
ochraceus.
Para la fermentación realizada en charolas se colocaron 200 g de medio de cultivo para FMS
inoculado (sección 3.2.2.3) en charolas de aluminio de 30x20x8 cm. Estas últimas se
depositaron en cajas de polietileno de 50x30x20 cm con una cama de aproximadamente 5cm
de agrolita con agua para conservar la humedad en el microambiente. El tiempo de
fermentación fue de 120 h tomándose muestras cada 24 h. El muestreo se realizó tomando
fermento en 5 puntos distintos de cada charola, las alícuotas se mezclaron y homogenizaron
para finalmente realizar la extracción de acuerdo a la metodología descrita en la sección
3.2.2.3. Finalmente la actividad lipasa y feruloil esterasa se determinó sobre TC8, MpC y MF
como se describe en la sección 3.2.3.1 y 3.2.3.4.
3.2.3 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
3.2.3.1 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA

ACTIVIDAD LIPASA.
La actividad lipasa se determinó sobre trioctanoina (TC8), un triglicérido de cadena media,

empleando un método espectrofotométrico a pH 7.2 y 30° C, tal como lo reportaron Mateos y
64
col [155]. Inicialmente se preparó una emulsión, añadiendo gota a gota con agitación
constante, una parte de una solución de TC8 50 mM y pNP 5 mM en tert-butanol, en nueve
partes de tampón MOPS 2.5 mM con 0.5% (p/v) de Tritón X100 a pH 7.2. En una
microplaca de 96 pozos, se añadieron 20 L de solución enzimática en un micropozo y
posteriormente se agregó 100 L de la emulsión preparada con anterioridad. La placa se lee
en un espectrofotómetro a 410nm durante 15 minutos. Durante la hidrólisis enzimática de la
trioctanoina se libera un protón por molécula de ácido octanóico hidrolizado, este es captado
por el indicador de pH, pNP, disminuyendo la absorbancia a 410 nm (coloración amarilla;
Figura 24) que es monitoreada espectrofotométricamente. El cambio de absorbancia con
respecto al tiempo se correlaciona con la cantidad de µmoles de ácido graso liberado
mediante una curva estándar de (0 a 1.667 mM) de ácido octanóico en presencia de 0.5mM
de pNP. Una unidad (U) de actividad lipasa se definió como 1 mol de ácido graso liberado
por minuto.
Figura 23. Reacción de hidrólisis del método espectrofotométrico de Mateos y col. utilizando triglicéridos para
la cuantificación de la actividad lipasa. A: 4-nitrofenolato, B: Trioctanoina, C: 4-nitrofenol, D: Ácido octanóico,
E: Glicerol [155].
3.2.3.2 DETERMINACIÓN TITRIMÉTRICA DE LA ACTIVIDAD

LIPASA.
La actividad lipasa se determinó cuantificando los ácidos grasos liberados de una emulsión
de tributirina (TC4; 114 mM) agitada mecánicamente, usando 0.1 N NaOH para su titulación
y un pH-Stato GPT Titrino (Metrohm®). Cada ensayo se realizó en un vaso enchaquetado a
temperatura controlada de 37°C, que contenía 29 mL de una solución tampón de Tris–HCl
2.5 mM y NaCl a 150 mM a pH 8.0. La velocidad de la hidrólisis espontánea del sustrato fue
determinada por 5 minutos antes de la adición de la muestra (10 mg de lipasa inmovilizada).
65
La actividad lipasa fue expresada en U por mg de catalizador. Una unidad de actividad lipasa
corresponde a 1 µmol de ácido graso liberado por minuto.
3.2.3.3 PRODUCCIÓN DE LOS SUSTRATOS PARA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD FERULOIL
ESTERASA.
Los metil hidroxicinamatos, metil sinapinato (MS), metil ferulato (MF), metil p-cumarato
(MpC) y metil cafeato (MC) utilizados para la determinación de la actividad feruloil esterasa
se sintetizaron vía química en nuestro laboratorio. Inicialmente se realizó una solución del
ácido hidroxicinámico al 10% en metanol, se calentó en un matraz balón a 65°C.
Posteriormente se añadió 5% (v/v) de HCl al 37% (v/v) (Figura 23), el tiempo de reacción
fue de 18 a 24 h. La reacción se monitoreó por cromatografía de capa fina (CCF) para lo cual
la mezcla de reacción se diluyó 100 veces en acetato de etilo, y 10 µL de la solución se
inyectaron en una placa de silica gel con revelador UV, la placa se migró con una mezcla de
hexano y acetato de etilo en relación 2:1 (v:v). Al concluir la reacción, la mezcla se llevó a
sequedad utilizando un evaporador rotatorio marca Heidolph®.
Figura 24. Reacción de esterificación de Fischer-Speier para la generación de metil ferulato. El ácido ferúlico
reacciona con el metanol en presencia de un catalizador ácido (HCl) a temperaturas superiores a los 65° durante
un periodo de 12 hasta 24 horas para generar metil ferulato. La reacción se puede llevar a cabo con los 4 metil
hidroxicinamatos.
El producto de reacción seco se llevó a una columna de cromatografía de 20-200 mL

preempacada con sílica gel malla 130-270 impregnada en éter de petróleo. Para obtener el
producto deseado se eluyó con distintas proporciones de mezclas de éter de petróleo: éter
etílico (95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50). La elución de los metil ésteres se logró
utilizando los volúmenes de 60:40 y 50:50. Finalmente, todas las fracciones que contenían el
metil hidroxicinamato con la pureza requerida se agruparon en un reservorio que fue llevado
a sequedad para obtener el producto final.
66
3.2.3.4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD FERULOIL

ESTERASA.
La actividad feruloil se determinó sobre los cuatro metil hidroxicinamatos (MS, MF, MpC y
MC) a pH 7.2 y 30° C, empleando el método espectrofotométrico publicado por Ramirez y
col. En una microplaca, se colocaron 20 L de muestra y 100 L de la emulsión compuesta
por una parte de una solución de cada metil hidroxicinamato 50mM y pNP 5mM en tert-
butanol y nueve partes de tampón MOPS 2.5 mM con 0.15% (p/v) de nLS a pH 7.2. Al igual
que en el método de Mateos [155] la disminución de la absorbancia a 410 nm (coloración
amarilla; Figura 24) es monitoreada espectrofotométricamente y el cambio de absorbancia
con respecto al tiempo se correlaciona con la cantidad de µmoles de ácido hidroxicinámico
mediante una curva estándar (0 a 1.667 mM) del ácido correspondiente en presencia de
0.5mM de pNP. Una unidad (U) de actividad feruloil esterasa se definió como 1 mol de
ácido hidroxicinámico liberado por minuto.
Figura 25. Reacción de hidrólisis del método espectrofotométrico de Ramirez y col. utilizando metil
hidroxicinamatos para la cuantificación de la actividad feruloil esterasa. Condiciones del método A: 4-
nitrofenolato, B: Metil ferulato (se pueden usar todos los metil hidroxicinamatos), C: 4-nitrofenol, D: Ácido
ferúlico, E: Metanol.
3.2.3.5 Determinación de la concentración de proteína.
La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford [18].
3.2.3.6 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

EN LOS INMOVILIZADOS COMERCIALES DE LIPASAS.
Para conocer la cantidad de proteína activa en los soportes de inmovilización se utilizaron
valores de actividad específica sobre tributirina (TC4) reportados para la lipasa B de Candida
67
antarctica, de Rhizomucor miehei, y de Thermomyces lanuginosus por Rogalska en 1993

[156]. Realizando el cociente de las unidades de actividad lipasa por mg de catalizador con la
actividad específica (U/mg de proteína) reportada se puede estimar la cantidad de proteína
activa por mg de catalizador.
3.2.3.7 Identificación de las proteínas responsables de la

actividad enzimática mediante zimogramas.
Para identificar el número de enzimas responsables de la actividad lipasa y/o feruloil

esterasa, se realizaron geles zimográficos. Para ello se realizaron geles de poliacrilamida al
10 ó 12% (p/v) sin SDS. En cada carril se inyectó 40 µL de muestra preparada previamente
con 3 µL de glicerol y 5 µL de tampón simple. Se utilizó como testigo positivo para la
actividad feruloil esterasa la AnFaeA (para geles de actividad sobre MS y MF) y la AnFaeB
(para geles de actividad sobre MpC y MC) y como testigo positivo para la actividad lipasa
RML. El gel se migró en condiciones nativas a 100 V y 4° C durante aproximadamente 4 h.
Posteriormente, a los geles se les realizaron dos lavados con abundante agua destilada y
sucesivamente uno con tampón MOPS 2.5 mM pH 7.2, 4°C. Para el revelado de las bandas
con actividad feruloil esterasa se preparó una emulsión agregando gota a gota 100 µL de una
solución del metil hidroxicinamato 500 mM y 33 L de rojo de fenol a 300 mg/mL (ambas
en DMSO), a 10 mL de tampón MOPS 2.5 mM con 0.15% nLS a pH 7.2 agitando
vigorosamente en un vórtex. La solución se agregó al gel y se incubó a 30°C con agitación
orbital delicada hasta observar la aparición de las bandas amarillas características. Para el
zimograma de actividad lipasa, el gel se tiñó con una solución de rojo de fenol a la misma
concentración señalada anteriormente durante 15 min en agitación delicada.
Simultáneamente un trozo de papel arroz de 10 x 15 cm se embebió con una solución de TC8
en éter de petroleo al 10% (v/v), el papel se retiró de la solución y se dejo evaporar el éter por
aproximadamente 5 min. Finalmente se colocó el gel teñido sobre el papel con TC8 y se
incubó a 30°C hasta observar la aparición de las bandas amarillas características de actividad
lipasa.
68
3.2.4 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA HIDROLASA RESPONSABLE DE LA

ACTIVIDAD DE SÍNTESIS.
3.2.4.1 Purificación parcial de la actividad Fae por

cromatografía rápida de proteínas
3.2.4.1.1 Interacción hidrofóbica.

Un extracto enzimático realizado a partir de la fermentación con charolas (12 L; Sección
3.2.2.4) se concentró utilizando una membrana de 10 kDa de celulosa regenerada en un
equipo de ultrafiltración Cogent marca Millipore, hasta reducir su volumen a 500 mL. Al
extracto concentrado se agregó sulfato de amonio para conseguir una concentración final de
2 M. La solución se centrifugó y filtró para después inyectar por una columna de interacción
hidrofóbica butil sefarosa 4 fast flow de 5 mL marca GE, a un flujo de 1mL/min con ayuda
de un FPLC marca GE modelo AKTA PRIME; utilizando un gradiente desde 2 a 0 M de
(NH4)2SO4 en 20 volúmenes de columna. Se recuperaron fracciones de 5 mL a las cuales se
les monitoreó actividad Fae y lipasa con MpC y TC8, respectivamente. Las fracciones con la
actividad Fae se mezclaron.
3.2.4.1.2 Intercambio aniónico.

La fracciones colectadas de la sección 3.2.4.1.1 se concentraron a 1.5 mL en unidades de
ultrafiltración Millipore de 15 mL de capacidad y corte de 10 kDa. El concentrado se diafiltró
secuencialmente con 15 mL de agua destilada. 3 mL de la muestra se inyectó a una columna
de intercambio aniónico Mono Q 5/50 GL marca GE, previamente equilibrada con tampón
MOPS 2.5 mM, pH 7.2. La elución de la muestra se realizó con un gradiente de 0 a 500 mM
de NaCl en 20 volúmenes de columna a un flujo de 1 mL/min con ayuda de un FPLC marca
GE modelo AKTA PURIFIER. Se colectaron fracciones de 200 L y se determinó actividad
Fae y lipasa sobre MpC y TC8, respectivamente. Las fracciones con mayor actividad
específica (U/mg de proteína) se mezclaron para la siguiente etapa de purificación.
3.2.4.1.3 Exclusión molecular.

La mezcla generada en la sección 3.2.4.1.2 se concentró hasta obtener 200 L cuya
concentración final de proteína fue 10 mg/ml. La muestra se inyectó a una columna de
exclusión molecular HiLoad 16/600 Superdex 200 PG marca GE (Rango de exclusión 10 a
69
600 kDa). La elución se realizó con un gradiente isocrático de 150 mM de NaCl en MOPS
2.5 mM, pH 7.2 en 1.5 volúmenes de columna a un flujo de 1 mL/min con ayuda de un FPLC
marca GE modelo AKTA PRIME. La salida se colectó en fracciones de 1 mL y se determinó
actividad Fae sobre MpC. Las fracciones con mayor actividad específica se mezclaron y
concentraron con una unidad de ultrafiltración de 15 mL de 3 kDa de corte y se diafiltraron
con tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2. Finalmente la muestra se almacenó en alícuotas de 50
L a -20°C.
3.2.5 SÍNTESIS DE BUTIL HIDROXICINAMATOS VÍA ALCOHÓLISIS DE METIL

HIDROXICINAMATOS.
3.2.5.1 Síntesis de butil hidroxicinamatos utilizando

biocatalizadores inmovilizados.
En un vial de reacción ámbar de 4 mL se colocaron 2 mL de una solución de metil

hidroxicinamato 50 mM y butanol 75 mM concentración final en la mezcla de reacción
(0.54%, v/v) en isooctano, con 100 mg/mL de cada biocatalizador (bagazos secos obtenidos
de las fermentaciones sólidas, inmovilizados de CALB, RML y TLL), la mezcla de reacción
se mantuvo a 50°C y 1000 RPM durante 120 h. El curso de la reacción se monitoreó cada 24
h cualitativamente por CCF (ver sección 3.2.3.2) y la velocidad inicial de síntesis se
cuantificó por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de capa
fina de alto rendimiento (CCFAR).
3.2.5.1.1 Determinación cuantitativa de la velocidad inicial de síntesis por

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
El análisis cuantitativo de las reacciones de síntesis se realizó vía HPLC. El equipo empleado
esta compuesto de un automuestreador, bombas, horno, detector UV marca VARIAN y el
sistema operativo Galaxie®. Se empleó una columna Luna® 5 µm Silica (2) 100 Å, 150 x
4.6 mm de PHENOMENEX®. Como fase móvil se empleó una mezcla de hexano: acetato de
etilo en relación 80:20 (v:v) filtrada con una membrana de nylon 0.45 m en un equipo de
filtración Millipore® de vidrio y se desgasificó. Las muestras se prepararon llevando 20 L
de mezcla de reacción a 200 L con acetato de etilo, posteriormente se filtraron utilizando
70
una membrana de nylon de 0.45 m y 35 mm de diámetro para jeringa marca millipore; el

filtrado se depositó en un inserto agilent de 250 L de capacidad, el cual a su vez se colocó
en viales Agilent de 9 mm de diámetro y 1.5 mL de capacidad. El análisis se llevó a 30°C
con un flujo de 1 mL/min, y la detección de sustratos tanto como productos se realizó a 310
nm.
3.2.5.1.2 Efecto de solvente, temperatura y relación molar de sustratos en la

síntesis de butil ferulato con bagazos sólidos secos provenientes de la FMS.
Para evaluar el efecto del solvente de reacción, la temperatura y la relación molar de los
sustratos se tomó como reacción modelo la síntesis del butil ferulato. La reacción se llevó a
cabo como se indica en la sección 3.2.5.1. Los solventes evaluados fueron isooctano, tolueno,
tert-butanol, acetonitrilo y DMSO. Una vez elegido el mejor solvente se evaluó el efecto de
tres temperaturas 30, 50 y 70°C. Finalmente se evaluaron tres relaciones molares de metil
ferulato y butanol (50:75, 50:50, 75:50 mM; respectivamente) en las condiciones
previamente establecidas. La formación del producto se monitoreó cualitativamente por CCF
y la velocidad inicial de síntesis se cuantificó por HPLC.
3.2.5.2 Síntesis de butil hidroxicinamatos utilizando

biocatalizadores líquidos: Sistemas ternarios.
Las reacciones de alcohólisis de los metil hidroxicinamatos se llevaron a cabo utilizando la

metodología empleada por Topakas en 2003, con ligeras modificaciones. En un microtubo
ámbar de 1.5 mL se preparó una microemulsión libre de surfactante utilizando 250 L de una
solución de metil hidroxicinamato 200 mM en butanol, 730 L de isooctano y se agitó hasta
alcanzar homogenidad. Posteriormente se agregaron 20 L de la solución enzimática y la
reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. Alícuotas de 20 L se tomaron a los 15,
30, 60, 120 y 240 min.
Posteriormente el sistema ternario empleado se mejoró para la AocFae1 evaluando los

parámetros más sensibles durante la síntesis de butil ferulato. La formación del producto en
todas las condiciones evaluadas se monitoreó cualitativa y cuantitativamente por
71
cromatografía de capa fina y cromatografía de capa fina de alta resolución (CCFAR),

respectivamente.
3.2.5.2.1 Determinación cuantitativa de la velocidad inicial de síntesis por

cromatografía de capa fina de alta resolución (CCFAR).
Con ayuda de un Linomat 5 marca CAMAG se inyectaron de 1 a 10 µL de la muestra

problema a un 1 cm de la base de una placa de sílica gel de 10x20 cm con revelador para UV.
Para la separación de los metil (sustratos) y butil hidroxicinamatos (productos) se utilizó una
mezcla de hexano:acetato de etilo en relación 2:1 (v:v), como fase móvil. Una vez que la
placa se migró el solvente residual se evaporó a temperatura ambiente. Posteriormente, la
placa se analizó a 294 nm con un densitómetro modelo Scanner 3 marca CAMAG. La
concentración (mM) del producto de síntesis se obtuvo correlacionando la DO con una curva
estándar de 0 a 10 mM del butil hidroxicinamato correspondiente inyectada en la misma
placa.
3.2.5.2.2 Efecto de la concentración de butanol en la síntesis de butil ferulato.
Para evaluar el efecto de la concentración del butanol durante la síntesis de butil ferulato se
probaron cinco concentraciones del alcohol 0.54, 6, 12.5, 25 y 50% (v/v). La concentración
del metil ferulato (MF) se fijó a 50 mM final. Para preparar la microemulsión se disolvió el
MF en el butanol, la mezcla de reacción se llevó a 980 L con isooctano y se agitó en un
vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente se agregaron 20 L de una solución
enzimática en MOPS 2.5 mM, pH 7.2 con 5 U/mL de actividad sobre MpC y se incubó a
30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6 horas de
reacción.
3.2.5.2.3 Efecto de la concentración de agua libre en la síntesis de butil ferulato.
Para evaluar el efecto de la concentración del agua libre durante la síntesis de butil ferulato se
probaron tres concentraciones de agua 1, 2 y 4% (v/v). Para preparar las microemulsiones se
agregaron 250 L de una solución 200 mM de MF en butanol, 10 L de la solución
enzimática (con 5 U/mL de actividad sobre MpC). Posteriormente se adicionaron 0, 10 y 30
L de tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2, las mezclas se llevaron a 1 mL con isooctano y se
72
agitaron vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente la reacción se

incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6
horas de reacción.
3.2.5.2.4 Efecto de la presencia de BSA en la síntesis de butil ferulato.
El efecto protector del BSA sobre la AocFae1 se evaluó añadiendo a 10 L de una solución
enzimática con 10 U/mL de actividad Fae sobre MpC, una solución de BSA a 100 mg/mL en
MOPS 2.5 mM, pH 7.2. La solución se añadió a la microemulsión generada tal como se
indica en la sección 3.2.5.2 y fue llevada a cabo en las mismas condiciones señaladas. La
reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6 horas de reacción.
3.2.5.2.5 Efecto del pH aparente de la microemulsión en la síntesis de butil ferulato.
Para evaluar el efecto del pH aparente durante la síntesis de butil ferulato se probaron seis
diferentes pHs (Tabla 5). Para preparar las microemulsiones se agregaron 250 L de una
solución 200 mM de MF en butanol y 730 L de isooctano. Posteriormente se adicionaron 10
L la solución enzimática (con 10 U/mL de actividad sobre MpC) y 10 L de una solución
de BSA 100 mg/mL en tampón a 50 mM al pH deseado, las mezclas se agitaron
vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente, la reacción se incubó a
30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se analizó a las 3 y 6 h de progreso mediante
CCFAR.
Tabla 5. Soluciones tampón utilizadas para la evaluación del pH óptimo de la AocFae1

en la síntesis de butil ferulato.
pH Tampón utilizado (50 mM)
4 Ácido Cítrico/citrato de sodio
5 Ácido. Cítrico/citrato de sodio
6 MES/NaOH
6.5 MES/NaOH
7 MOPS/NaOH
8 Tris/HCl
9 Glicina/NaOH
73
3.2.5.2.6 Efecto de la cantidad de feruloil esterasa en la síntesis de butil ferulato.
Para evaluar el efecto de la cantidad de feruloil esterasa en la síntesis de butil ferulato se

ensayaron cinco diferentes concentraciones. Para preparar las microemulsiones se agregaron
250 L de una solución 200 mM de MF en butanol y 730 L de isooctano. Posteriormente se
adicionaron 10 L de una solución enzimática con 5, 10, 20, 40 y 80 U/mL de actividad
sobre MpC y 10 L de una solución de BSA 100 mg/mL en tampón a tris/HCl 50 mM a pH
8.0, las mezclas se agitaron vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad.
Finalmente la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. Las muestras se
analizaron a las 3 y 6 h de progreso mediante CCFAR.
3.2.5.2.7 Caracterización de la AocFae1 en la síntesis de ésteres de ácidos

hidroxicinámicos.
Los mejores parámetros obtenidos en los ensayos mencionados anteriormente se utilizaron

para realizar la caracterización en síntesis de la AocFae1 (Tabla 6). Inicialmente se evaluó la
síntesis de los 4 butil hidroxicinamatos, en función de la preferencia de AocFae1 por el metil
hidroxicinamato, se evaluó el efecto de la longitud de cadena del alcohol así como la
isomería del grupo alcohólico del butanol y el efecto de la isomería orto, meta y para del
ácido cumárico. La reacción se realizó agregando 250 L de una solución 200 mM de MF en
butanol y 730 L de isooctano. Posteriormente se adicionaron 10 L de una solución
enzimática con 40 U/mL de actividad sobre MpC y 10 L de una solución de BSA 100
mg/mL en tampón a tris/HCl 50 mM a pH 8.0, la mezcla se agitó vigorosamente en un vortex
hasta lograr la homogenidad. Finalmente la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de
agitación. Las muestras se analizaron a las 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min por HPLC (ver
sección 3.2.5.1.1).
74
Tabla 6. Composición de las microemulsiones utilizadas para la síntesis de los ésteres de

ácidos hidroxicinámicos.
Productos de
Alcohol Metil éster
síntesis
Butil sinapinato Butanol Sinapinato
Butil ferulato Butanol Ferulato
Butil p-cumarato Butanol p-Cumarato
Butil cafeato Butanol Cafeato
Etil Ferulato Etanol Ferulato
Propil ferulato Propanol Ferulato
Butil Ferulato Butanol Ferulato
Octil ferulato Octanol Ferulato
Dodecil ferulato Dodecanol Ferulato
n-butil ferulato n-Butanol Ferulato
sec-butil ferulato sec-Butanol Ferulato
tert-butil ferulato tert-Butanol Ferulato
Butil o-cumarato Butanol o-Cumarato
Butil m-cumarato Butanol m-Cumarato
Butil p-cumarato Butanol p-Cumarato
Concentración de metil éster a 50 mM y alcoholes al 25%.
3.2.6 SÍNTESIS DE DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LA AocFae1.

Para realizar la síntesis de DPL, se utilizó el sistema de reacción reportado por Mateos y col
[21]. En un vial de reacción ámbar de 4 mL se colocó luteína 10 mM y vinil propionato 100
mM en hexano, con 100 mg/mL de catalizador y se calentó a 50°C con agitación magnética a
1000 RPM durante un plazo de 144 h. La formación del producto se monitoreó cada 24 h
utilizando CCF utilizando como fase móvil una mezcla de éter de petróleo: éter etílico en
relación 1:1 (v:v).
75
Capítulo 4: Resultados
CAPÍTULO 4: PRODUCCIÓN PREFERENCIAL

DE LAS LIPASAS Y ÉSTERESAS DE Aspergillus
ochraceus UTILIZANDO RESIDUOS DEL MAÍZ.
76
4.1 INTRODUCCIÓN.
La gran mayoría de los metabolitos primarios y secundarios son actualmente obtenidos por
fermentación sumergida (Fs), debido a las ventajas que representa el uso de reactores en este
tipo de fermentación, como homogenidad en temperatura, pH, concentración de sustratos,
entre otras. No obstante, la fermentación en medio sólido (FMS) ha empezado a tener un
gran auge, ya que hace posible utilizar residuos agroindustriales económicos, como soporte,
inductor o ambos, reduciendo notablemente los costos de producción [98].
LA Fs y FMS han sido ampliamente socorridas para la producción de enzimas. Entre los
microorganismos más utilizados para la producción de enzimas extracelulares se encuentran
los hongos del género Rhizomucor, Thermomyces y Aspergillus, con los cuales se produce
del 80 al 85% de enzimas comerciales en el mercado [157]. Sin embargo, se ha demostrado
que bajo condiciones de FMS se puede maximizar la producción volumétrica de algunas,
como las amilasas [158], fructosil transferasas [159], pectinasas [160], lipasas [161] y
feruloil esterasas (Faes) [95].
Las lipasas y esterasas de Aspergillus ochraceus son enzimas de particular interés, ya que
han demostrado su capacidad de realizar la síntesis de productos de alto valor agregado [22,
152]. Estudios previos han demostrado que el uso de residuos, como el salvado de trigo o
mazorcas de maíz, pueden ser utilizados para la producción de Faes en Fusarium oxysporum
en FMS [79] y residuos como el licor de maíz, puede inducir la producción de lipasas en el
modelo Rhizpous homothallicus [91]. Lo que sugiere que la inducción de las Faes y lipasas
de A. ochraceus puede ser posible a través del uso de residuos del maíz.
En la siguiente sección, se utilizaron residuos del maíz para la producción las actividades de
interés con A. ochraceus. Primero se describen la elección entre dos estrategias fermentativas
(líquida y sólida) para producir fermentos enriquecidos en actividad Fae, para posteriormente
producir las enzimas de interés de manera preferencial empleando distintos subproductos del
maíz como inductores. Lo anterior como una estrategia para generar biocatalizadores que
permitan dilucidar que hidrolasa es la responsable de las reacciones de síntesis. Finalmente se
evaluaron algunos parámetros como temperatura, solvente, etc., para mejorar la conversión
de los productos de interés.
77
4.2 ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN DE FAES DE Aspergillus

ochraceus POR Fs Y FMS.
A través de estrategias fermentativas como la Fs y la FMS se evaluó la producción de las
Faes expresadas por A. ochraceus (Aoc) y de este modo obtener la mayor actividad
enzimática. Así mismo, se evaluaron las ventajas y desventajas de cada sistema con este
hongo filamentoso y así establecer la estrategia fermentativa para las etapas posteriores de
éste trabajo.
En la Figura 26 se muestra la cinética de actividad feruloil esterasa producida con ambos

sistemas. Al emplear la Fs se observó que las actividades sobre metil p-cumarato (MpC) y
ferulato (MF) incrementaron gradualmente hasta 37.96 y 79.48 mU/mL (Figura 26, líneas
punteadas). Cabe resaltar que dichas actividades se alcanzaron hasta las 180 h de
fermentación, sin observarse un declive en la actividad, lo que sugiere que tiempos más
largos de fermentación pueden incrementar la producción. La detección de la actividad
feruloil esterasa en tiempos largos de fermentación ya se ha reportado para el caso Humicola
grisea en donde la actividad pudo ser cuantificable a partir de las 72 h de cultivo y el máximo
de actividad se observó hasta las 192 h (470 mU/mL). Sin embargo en este último caso la
actividad Fae fue de 5 a 12.3 mayor a la reportada en este trabajo para Aoc.
2,500 Fs MF
Actividad Fae (Fs: mU/mL;
Fs MpC
2,000 FMS MF
FMS: mU/gms)
FMS MpC
1,500
1,000
500
0
0 50 100 150 200
Tiempo (h)
Figura 26. Cinéticas de actividad feruloil esterasa producidas por fermentación en medio sumergido (Fs) y
fermentación en medio sólido (FMS). Las líneas punteadas indican la producción de la actividad Fae de
Aspergillus ochraceus por Fs en mU/mL, mientras que las líneas continuas indican la producción alcanzada por
FMS en mU/gms. La actividad feruloil esterasa se determinó sobre metil ferulato (Naranja) y metil p-cumarato
(verde) a 30°C y pH 7.2.
78
Por otra parte, en el cultivo realizado por FMS, la actividad feruloil esterasa mostró la
actividad máxima con ambos sustratos a las 48 horas de fermentación (MF: 1,572.1 y MpC:
2,533.6 mU/gms) (Figura 26, líneas contínuas) y posteriormente decae de forma gradual. Lo
anterior posiblemente a causa de la producción de proteasas, como lo reportó Ramirez y col
[20]. Además en la FMS, la hidrólisis de MpC es 1.6 veces mayor que sobre MF, contrario a
lo observado en Fs, donde la actividad sobre MpC, es el 0.48 de la actividad sobre MF. Estos
resultados sugieren la producción de más de una Fae en este sistema fermentativo. Asther y
col. observaron este mismo comportamiento [95] comparando la producción de la actividad
Fae en sistemas fermentativos líquido y sólido; ya que observaron que el cociente de
actividades MpC/MF fue de 2.4 en FMS y sólo de 0.5 en Fs en los fermentos de Aspergillus
niger. Los autores atribuyeron el cambio de perfil a la presencia de dos diferentes feruloil
esterasas.
Del mismo modo, la productividad volumétrica obtenida con el sistema en medio sólido fue
de 100 a 335 veces mayor (43.95 y 70.84 mU/cm3.h en MF y MpC) que la obtenida con su
contraparte líquida (0.4415 y 0.2109 mU/cm3.h en MF y MpC). Por lo tanto, la FMS se
seleccionó como sistema de fermentación para realizar las producciones posteriores de las
Faes de Aoc. Resultados similares a los anteriores ya han sido reportados en la producción de
distintas enzimas como lipasas, pectinasas, entre otras [160, 161]
Finalmente, para identificar la o las Faes producidas en cada uno de los sistemas
fermentativos evaluados se realizaron zimogramas de actividad empleando MF como sustrato
(Figura 27A, B). En el extracto enzimático obtenido por Fs fue posible identificar solamente
una banda con la actividad de interés, correspondiente a la AocFae1 que reporta Romero-
Borbón y col. ([151]; Figura 27A), indicando que esta Fae es responsable de la actividad
sobre los dos sustratos empleados en la Figura 26 (líneas punteadas). Esto sugiere que dicha
Fae posee una ligera preferencia sobre MF. Por otra parte, con la FMS fue posible producir
una Fae (AocFae2) además de la producida por Fs, la cual se produjo mayoritariamente a las
48 h y presumiblemente tenga una preferencia sobre MpC (Figura 27B). Lo anterior
confirma la hipótesis de que la preferencia por hidrolizar distintos metil hidroxicinamatos en
ambos sistemas fermentativos analizados anteriormente es resultado de la expresión de
distintas Faes en función del sistema fermentativo empleado. Además producir las Faes por
79
FMS permite reducir los tiempos de cultivo, por ejemplo la AocFae1se produjo en un tiempo
7.5 veces menor por FMS que por Fs.
Figura 27. Zimogramas de las cinéticas de producción de Faes por Fs y FMS. A: Cinética de producción por Fs
monitoreada a las 24, 48, 72, 96 y 180 h. B: Cinética de producción por Fs monitoreada a las 24, 48, 72, 96 y
120 h. BF: Tampón de extracción. LP: Lipasa de Thermomyces lanuginosus como testigo negativo. 002:
Extracto comercial con actividad Fae como testigo positivo. Los zimogramas se revelaron empleando como
sustrato el MF a temperatura ambiente.
Cabe resaltar que una de las ventajas más sobresalientes de emplear la FMS como sistema
fermentativo, es que permite utilizar los fermentos como biocatalizadores (“Whole-cell
biocatalysts”) con tan sólo un tratamiento sencillo de secado, y así inferir cual de las Faes o
lipasas de Aoc es la responsable de llevar a cabo las reacciones de síntesis anteriormente
mencionadas.
4.3 INDUCCIÓN PREFERENCIAL DE LAS DISTINTAS CARBOXIL ÉSTER

HIDROLASAS DE Aoc.
A continuación se describen las estrategias empleadas para producir biocatalizadores

enriquecidos en actividad lipasa y feruloil esterasa con Aoc induciendo con residuos de maíz,
como de cascarillas de diferentes variedades y fracciones de nejayote (ver sección 3.2.1).
4.3.1 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS

EMPLEANDO CASCARILLAS DE MAÍZ.
Con el objetivo de encontrar una estrategia para producir biocatalizadores enriquecidos en

cada una de las Faes de Aoc, se decidió evaluar el efecto de las cuatro combinaciones
posibles inóculo/fermentación con las dos variedades de cascarillas de maíz, debido a que en
80
trabajos previos se observó que el cambio de la materia prima utilizada en el inóculo, podía
repercutir en la expresión de las enzimas durante la fermentación (Tabla 7).
Tabla 7. Diseño de las combinaciones inóculo/fermentación con dos variedades de

cascarillas de maíz.
Combinación Inóculo Fermentación

1 Blanco Amarillo
2 Blanco Blanco
3 Amarillo Amarillo
4 Amarillo Blanco
En la Figura 28 se muestran las cinéticas de actividad Fae y lipasa producidas por FMS de
acuerdo a la estrategia planteada anteriormente. En los ensayos realizados, no se observó una
relación directa entre la producción de actividad Feruloil esterasa y lipasa.
Al emplear la cascarilla de maíz como inductor se obtiene mayor actividad lipasa que Fae
independientemente de la variedad que se use. Esto posiblemente sea resultado de cierta
cantidad residual de grasa en ambas cascarillas.
La combinación 1 mostró la mayor actividad lipasa y feruloil esterasa a las 24 horas (9145 y
2034 mU/gms; Figura 28 A) y se obtuvo hasta 4.5 veces menor actividad feruloil esterasa. A
las 96 horas se observó un segundo máximo sobre la actividad en TC8, lo que puede sugerir
la presencia de dos enzimas con actividad lipasa. Con respecto a la actividad Fae, decayó
gradualmente hasta las 120 horas de fermentación.
81
12500
A
12500
B
9145.04
10000 10000
7500 7500
Actividad enzimática (mU/gms)
5000 5000 3116.2

2033.76
2500 2500 1276.50
0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120
12500 12196.1
C 12500
10751.95
D
10000 10000
7500 7500
5000 5000
2533.6
2500 2500
976.54
0 0
0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 28. Cinéticas de actividad Fae y lipasa producidas con diferentes variedades de cascarilla de maíz. A:
Combinación 1 Blanco: amarillo. B: Combinación 2 Blanco: Blanco. C: Combinación 3 amarillo: amarillo. D:
Combinación 4 Amarillo: Blanco. La actividad feruloil esterasa y lipasa se determinó por triplicado de los
extractos enzimáticos, sobre MpC () y TC8 () respectivamente a 30°C y pH 7.2. Los valores máximos de
cada actividad se indican por encima de cada cinética.
En la combinación 2 se observó solamente un máximo de actividad y no dos como en el resto

de los ensayos, lo que puede sugerir que en esta fermentación se induce una sola lipasa
(Figura 28 A, C y D). Además, la relación entre la actividad lipasa y Fae a las 24 h (177, 658
mU/gms; cociente lipasa/Fae: 0.27; Figura 28B) es inversa al visto a las 48 h (2575, 1160
mU/gms; cociente lipasa/Fae: 2.2), por lo que estos fermentos pueden ser usados como
biocatalizadores complementarios para identificar si la responsable de las reacción de síntesis
es una Fae o lipasa.
Por otra parte, mediante la comparación de las cinéticas obtenidas con las combinaciones 3 y
4 se observó el efecto en la producción de ambas actividades cuando el inóculo se realiza con
maíz amarillo (Figura 28 C y D). Si bien, la actividad lipasa es semejante en ambas
combinaciones (12196 y 10752 mU/mL, respectivamente), se puede apreciar que el máximo
se alcanza en diferentes tiempos de fermentación (24 y 96 h, respectivamente). Esto
probablemente indique que con cada combinación es posible inducir distintas lipasas o que la
82
cascarilla de maíz blanco genere una fase “lag” en la producción de la misma lipasa [153,
162]. Por otra parte con la combinación 3 se alcanzó la mayor actividad Fae, desfasada por
24 h de la máxima actividad lipasa (2534 y 12196 mU/gms, respectivamente; Figura 28 C) y
con respecto a la combinación 4 la relación fue 2.6 veces mayor (977 y 2534 mU/mL,
respectivamente). Cabe resaltar que al producirse una menor actividad Fae con la
combinación 4, fue posible obtener un fermento rico en actividad lipasa (10752, 977 mU/mL;
relación 11; Figura 28 D). Además, la actividad lipasa en este último se duplicó de las 48 a
las 72 h (Figura 28 D), esto permitió obtener dos biocatalizadores para evaluar la actividad
en síntesis de la lipasa, donde se esperaría observar un comportamiento similar en la
velocidad inicial de síntesis.
La variación de las hidrolasas expresadas con la estrategia anterior (combinaciones de

materias primas en el inóculo y la fermentación) no ha sido reportada en la literatura. Sin
embargo la complejidad en la composición de las materias primas, no permite comprender
completamente el fenómeno que se lleva a cabo, por lo tanto se requiere de estudios más a
fondo.
De manera complementaria se realizaron zimogramas de las cuatro cinéticas para identificar

el número de Faes que se indujeron con cada combinación (Figura 29), vale la pena
mencionar que durante la realización de estos ensayos, los zimogramas de actividad lipasa no
habían sido completamente desarrollados, por lo cual no se muestran estos resultados.
Con la combinación 1 y 2 se expresó preferencialmente la AocFae2, esta característica

permitió utilizarlos como biocatalizadores en las reacciones de síntesis (Figura 29 A-B).
Vale la pena mencionar que con la combinación 3 se expresaron ambas Faes de forma similar
y su uso en las reacciones de síntesis no ayudaría a identificar la actividad en síntesis de las
Faes de Aoc. Por lo tanto este fermento se descartó para los estudios posteriores. Por otra
parte, a pesar de que la actividad Fae obtenida con la combinación 4 fue la menor
(976.54mU/gms), fue la única condición donde se expresó de preferencialmente la AocFae1
(Figura 29 D). Por lo tanto este fermento se utilizó como biocatalizador en etapas posteriores
del estudio.
83
Figura 29. Zimogramas de actividad Fae de las cinéticas de FMS con cascarillas de maíz. A: Combinación 1;
B: Combinación 2; C: Combinación 3; D: Combinación 4. En la parte superior de los zimogramas se indican
los tiempos de fermentación en horas. Los zimogramas se revelaron empleando como sustrato el MpC a
temperatura ambiente.
En trabajos anteriores se demostró que cuando la cascarilla de maíz amarillo se empleó para
generar el inóculo y la de maíz blanco durante la fermentación se indujo preferencialmente la
AocFae1 y cuando se usó solamente la cascarilla de maíz amarillo para ambas etapas se
indujó preferencialemente la AocFae2 [20, 151]; tal como se observó en este estudio, lo que
demuestra la alta sensibilidad de Aspergillus ochraceus al tipo de inductor empleado para la
expresión de Faes. Comportamientos similares se han reportado para otros hongos
filamentosos como A. niger y Talaromyces stipitatus, ambos expresan la Fae tipo A en
cultivos formulados con salvado de trigo y la tipo B en presencia de residuos pectínicos de
remolacha azucarera [57, 61, 75].
4.3.2 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS

EMPLEANDO FRACCIONES DEL NEJAYOTE.
Alternativamente se realizaron fermentaciones para la producción de Faes con tres fracciones

de nejayote señaladas como Bd, C y D en el diagrama mostrado en la sección 3.2.1.4. En la
Figura 30 se muestra el análisis de las actividades hidrolíticas (Figura 30 A) y el número de
Faes inducidas cuando se emplean dichas fracciones durante la fermentación (Figura 30 B).
Con los tres medios formulados (Bd, C y D) se observó un crecimiento moderado de Aoc
después de las 72 h (Figura 30 A). En general, los tres fermentos no mostraron cantidades
84
cuantificables de actividad lipasa, esto posiblemente se deba a que por su naturaleza, las
fracciones del nejayote son residuos con un bajo o nulo contenido de grasas [23] lo que no
permite su expresión. Por lo contrario, la actividad Fae fue cuantificable con todas las
fracciones del nejayote, siendo la fracción D, con la que se obtuvo la mayor actividad (1560
mU/gms, sobre MpC). Lo anterior posiblemente se deba a que esta fracción tiene una
composición rica en oligómeros de bajo y alto grado de polimerización (DP), azúcares y
principalmente ácido ferúlico, lo que lo hace un medio rico para la producción de feruloil
esterasas, en concordancia con los trabajos de Faulds y de Vries, los culaes indican que el
ácido ferúlico libre es uno de los principales inductores en la actividad Fae [64, 65].
Posteriormente se realizaron zimogramas sobre MpC para detectar el número de Faes

inducidas con las fracciones (Figura 30B). Se observó que fue posible inducir ambas Faes en
todos los casos, sin embargo, con la fracción D se observó una ligera inducción preferencial
de la AocFae1, aunque con esta última no fue tan marcada como cuando se emplea la
combinación 4 de los estudios con cascarilla de maíz como inductor. Por lo anterior, este
fermento no fue utilizado como biocatalizador para la identificación de la hidrolasa
responsable de la actividad en síntesis, sin embargo, debido al contenido casi nulo de
actividad lipasa, podría representar una opción para la purificación de la atividad Fae.
Figura 30. Análisis de los fermentos obtenidos con las distintas fracciones del nejayote. A: Actividad Fae y
lipasa determinada sobre MpC (verde) y TC8 (morado), respectivamente a 30°C y pH 7.2. B: Gel zimográfico
de actividad Fae revelado con MpC a temperatura ambiente. Bd: Fermento inducido con el diafiltrado de 5 kDa;
C: Fermento inducido con el retenido de osmosis; D: Fermento inducido con el nanofiltrado.
85
4.3.1 EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES HIDROLÍTICAS POST-TRATAMIENTO

DE LOS BIOCATALIZADORES PARA SU SELECCIÓN.
En la Tabla 8 se muestran los biocatalizadores pre-seleccionados para identificar la hidrolasa
de Aoc responsable de llevar a cabo las reacciones de interés. Se seleccionaron 5 fermentos
inducidos con los residuos del maíz y un fermento inducido con lípidos proporcionado
amablemente por Mateos y col. [152], este último debido a que fue capaz de realizar la
síntesis de dipropionil luteína.
Tabla 8. Nomenclatura y características de los biocatalizadores seleccionados antes del

tratamiento.
Combinacióna, tiempo
Biocatalizador Actividad buscada Actividad no deseada
de fermentación (h)
1 1, 24 AocFae2 Lipasa
2 2, 24 AocFae2 Lipasa
3 2, 48 Lipasa Feruloil esterasa
4 4: 60 AocFae1 Lipasa
5 4: 48 AocFae1 Lipasa
6 Fermento inducido con Lipasa Feruloil esterasa
b
lípidos , 48
a
Combinaciones Inoculo/Fermentación, ver Tabla 7.
b
Mateos y col. [152].
Posterior al tratamiento de secado y molienda descrito en la sección metodológica 3.2.2.3.1, a

todos los biocatalizadores se les determinó actividad Fae y lipasa (Figura 31). En general la
actividad Fae aumentó desde un 29 hasta un 200% con respecto a la actividad inicial (Figura
31 A). Únicamente en el biocatalizador 6 se observó una perdida del 13% de dicha actividad.
Por el contrario, el análisis de la actividad lipasa después del tratamiento reveló un
decremento en la mayoría de los biocatalizadores, con perdidas del 92, 72, 42 y 11% para los
biocatalizadores 1, 4, 5 y 6 respectivamente (Figura 31 B). Este fenómeno se puede atribuir
a que las lipasas de Aoc son desactivadas a temperaturas de 30°C en periodos de hasta 15
minutos [152]. En consecuencia los biocatalizadores del 1-5 se enriquecieron en la actividad
FaeA y el 6 quedó enriquecido en actividad lipasa.
86
25
4 A B
ACTIVIDAD LIPASA SOBRE TC8 (U/gms)

Pre tratamiento
ACTIVIDAD FAE SOBRE MpC (U/gms)
Pre tratamiento
Post tratamiento 20 Post tratamiento
3
15
2
10
1
5
0 0
1 2 3 4 5 7 1 2 3 4 5 7
CATALIZADOR CATALIZADOR
Figura 31. Actividad Fae y lipasa de los biocatalizadores seleccionados antes y después del tratamiento. A:
Actividad Fae medida sobre MpC; B: Actividad lipasa medida sobre TC8; En el eje de las x se indica el número
de biocatalizador evaluado de acuerdo a la nomenclatura estiúlada en la Tabla 8. Las actividades se
determinaron por triplicado a 30°C y pH 7.2.
Tras el incremento de la actividad Fae, fue necesario realizar zimogramas con el objetivo de
identificar si los biocatalizadores mantuvieron la relación de Faes por la cuales fueron
seleccionados previamente (ver Tabla 8; Figura 32 A). En la mayoría de los biocatalizadores
después del tratamiento se observó la presencia de las dos Faes, sugiriendo que ambas se
inducen de manera intracelular y pueden ser liberadas tras la molienda (Figura 32 A)[163].
Por otra parte, solamente en el biocatalizador 1 y 6 se observó un aumento en la intensidad de
la banda que corresponde a la AocFae2. Complementariamente los biocatalizadores 4 y 5
fueron los únicos que se mantuvieron enriquecidos con la AocFae1, sin embargo después del
tratamiento su relación Lipasa/Fae se igualó (relación ̴ 1.06). Por lo tanto, solamente el
biocatalizador 1, 5 y 6 mostraron la presencia de actividades enzimáticas parcialmente
aisladas, útiles para la dilucidación de la hidrolasa responsable de las reacciones de síntesis.
Figura 32. Zimogramas de actividad Fae y lipasa. A: Zimograma revelado con MpC; B: Zimograma revelado
con TC8. En la parte superior de los geles se indica el número deL biocatalizador analizado.
87
Posteriormente se realizó un zimograma de actividad lipasa para evaluar las diferencias entre
los tres biocatalizadores (Figura 32 B). Los biocatalizadores 1 y 6 se encuentran
enriquecidos en la misma lipasa, esto representa una ventaja ya que son los únicos que
presentaron la actividad preferencial de la AocFae2 Además tienen una relación Lipasa/Fae
inversa (relación: 0.29 y 20.5 para biocatalizador 1 y 6, respecivamente). Por lo tanto,
podrían ayudar a evaluar la actividad en síntesis de estas dos hidrolasas. Cabe resaltar que en
el biocatalizador 5 se observó la expresión de 2 lipasas diferentes a la observada
anteriormente. Aunque este biocatalizador se empleó por estar enriquecido en la AocFae1, su
actividad de síntesis tuvo cierto grado de incertidumbre.
4.4 SÍNTESIS DE ÉSTERES DE BUTIL p-CUMARATO Y DIPROPIONIL LUTEÍNA CON

LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS EN DIFERENTES ACTIVIDADES FAE
Y LIPASA.
A continuación se muestra el potencial de los tres biocatalizadores seleccionados en la

síntesis del butil p-cumarato y dipropionil luteína, con el fin de identificar a la o las
hidrolasas capaces de llevar a cabo dichas reacciones. Se reportan las velocidades iniciales o
conversiones relativas obtenidas en cada reacción con un biocatalizador enriquecido en la
AocFae2, AocFae1 y en actividad lipasa cuya nomenclatura se mantendrá como 1, 5 y 6,
respectivamente, de acuerdo a lo planteado en la Tabla 8.
4.4.1 EVALUACIÓN DE LAS VELOCIDADES INICIALES EN LA SÍNTESIS DE BUTIL p-

CUMARATO CON LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS.
Con los tres biocatalizadores enriquecidos se evaluó la síntesis por transesterificación del
butil p-cumarato (Figura 33). En general la reacción con los tres biocatalizadores fue muy
lenta y la aparición del producto en función del tiempo fue difícil de monitorear. El análisis
cualitativo se realizó a un punto final de 5 días de reacción, y mostró que usando el
biocatalizador enriquecido con la AocFae1 (5) se llevó a cabo la reacción (Figura 33 A).
Cuantitativamente, el biocatalizador 5 alcanzó la conversión máxima en el estudio de 3.1%, a
una velocidad entre 4 y 9 veces mayor comparada con la de los otros biocatalizadores
(6.35x10-6 moles/min.mg de catalizador; Figura 33 B).
88
Cuando se empleó el biocatalizador 1, enriquecido en la AocFae2 con aparente ausencia de la

AocFae1, también se observa formación del producto pero con una velocidad 4 veces menor
(1.5x10-6 moles/min.mg de catalizador) a la del biocatalizador 5. Esto sugiere fuertemente
que las dos Faes de Aspergillus ochraceus tienen la capacidad de llevar a cabo dicha síntesis,
sin embargo, la AocFae1 es más eficiente que la AocFae2. Dicha eficiencia en síntesis
concuerda con la eficiencia reportada en la hidrólisis del metil p-cumarato por las dos Faes
parcialmente puras [164]; (Figura 34). En donde se observó que la AocFae1 hidroliza MpC
3.2 veces más rápido que la AocFae2.
Figura 33. Síntesis de butil p-cumarato con los biocatalizadores seleccionados. Análisis de la reacción por
CCFAR A: Análisis cualitativo a las 120 h. B: Velocidades iniciales determinadas en la etapa líneal de la
reacción. MpC: Metil p-cumarato; BpC: Butil p-cumarato. Biocatalizadores 1: Enriquecido en AocFae2; 5:
Enriquecido en AocFae1 y 6: Enriquecido en actividad lipasa. Los ensayos se realizaron en presencia de un
control sin catalizdor, con el cual se ratificó la ausencia de producto después de 120 h de reacción.
Paralelamente, el biocatalizador 6 no denotó una velocidad inicial proporcional a la gran

actividad lipasa contenida en él (0.7x10-6 moles/min.mg de catalizador; Figura 33 B). Por
lo tanto, la evidencia sugiere que las Faes de Aoc son más eficientes que las lipasas del
mismo hongo para esta reacción en partícular.
4.4.2 EVALUACIÓN DE LA CONVERSIÓN RELATIVA EN LA SÍNTESIS DE

DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS.
Del mismo modo que en la sección anterior, se evaluó cualitativa y cuantitativamente la
síntesis de la dipropionil luteína con los tres biocatalizadores enriquecidos (Figura 34). En
este caso en particular, se determinó la conversión relativa con respecto al catalizador con la
mayor conversión, usando áreas bajo la curva de los ensayos cromatográficos; esto debido a
la dificultad que representó generar los estándares de monopropionil (intermediario de la
reacción) y dipropionil luteína (DPL).
89
En este caso durante el análisis cualitativo, se observó presencia mayoritaria del producto
cuando se usaron los biocatalizadores 5 y 6 (Figura 34 A). El biocatalizador 5, enriquecido
con la AocFae1, es con el que se alcanza la mayor conversión, sin embargo, la conversión es
1.5 veces más a la que se alcanza con el biocatalizador 6 enriquecido con actividad lipasa
(67.8%). Con ayuda de los ensayos zimográficos (Figura 32) fue posible determinar que la
lipasa mayoritaria en el biocatalizador 6 no es la responsable de esta reacción, debido a que
no se encuentra presente en el biocatalizador 5 donde se encuentra la mayor conversión.
Del mismo modo se puede descartar a la AocFae1, ya que esta se encuentra en cantidades
muy inferiores en el catalizador 6 comparado con el catalizador 5. La AocFae2 también se
descartó debido a que la conversión relativa del biocatalizador 6 fue 2.8 veces mayor que la
obtenida con el biocatalizador 1 (3.4%), dicho incremento no se relaciona directamente con
el incremento de la actividad lipasa en este biocatalizador.
Debido a la falta de evidencia concluyente en estos ensayos, se procedió a realizar los

estudios enfocados únicamente a la AocFae1 en la síntesis de ésteres de ácidos
hidroxicinámicos. No obstante, el catalizador responsable de la síntesis de dipropionil luteína
sigue siendo una opción muy interesante para la generación de esta clase de compuestos.
Figura 34. Síntesís de dipropionil luteína con los biocatalizadores seleccionados. A: Análisis por CCF de la
reacción después de 9 h de reacción. B: Conversión relativa en la síntesis de la dipropionil luteína. Lut:
Luteína; MPL: Monopropil luteína; DPL: Dipropionil luteína; CALB: Lipasa B de Candida antárctica usada
como control positivo de la reacción. Biocatalizadores 1: Enriquecido en AocFae2; 5: Enriquecido en AocFae1
y 6: Enriquecido en actividad lipasa.
90
4.5 SELECCIÓN DE LAS MEJORES CONDICIONES PARA LA SÍNTESIS DE BUTIL

HIDROXICINAMATOS CON LA AocFae1.
Debido a que en las reacciones de síntesis descritas en la sección 4.4.1 se obtuvieron

conversiones menores al 5% en tiempos muy largos de reacción, se decidió evaluar el efecto
del tipo de sustrato, el solvente de reacción, la temperatura y la relación molar de los
sustratos (Figura 35), con el objetivo de mejorar las conversiones alcanzadas. Al evaluar la
preferencia sobre los metil hidroxicinamatos, se demostró que el biocatalizador 5
(enriquecido con la AocFae1) tienen una preferencia marcada sobre el metil ferulato (Figura
35 A). De esta manera fue posible lograr conversiones hasta 9 veces superiores en la síntesis
de butil ferulato que en la de butil p-cumarato, así mismo, el tiempo de la reacción se redujo
2.5 veces. Por otra parte, el biocatalizador no fue capaz de realizar la transesterificación a
partir de metil sinapinato o cafeato en las condiciones de reacción evaluadas en este trabajo.
El perfil de preferencia por sustrato en síntesis (MF>MpC>MS=MC) difiere notablemente
con el perfil reportado para hidrólisis de la AocFae1 (MS>MpC>MF>MC) [164]. Esto muy
probablemente se deba a que algunas de las enzimas contenidas en el biocatalizador también
presentan actividad sobre este tipo de sustratos, contribuyendo en la modificación del perfil
de preferencia. Sin embargo, este tipo de cambios entre los perfiles de hidrólisis y síntesis ya
ha sido reportado para la Fae tipo C de Sporotrichum thermophile purificada a homogenidad,
en donde la preferencia por sustrato cambió de metil cafeato a metil ferulato [165]. Por lo
tanto para los siguiente ensayos se seleccionó como reacción modelo la síntesis de butil
ferulato por transesterificación del metil ferulato.
91
CONVERSIÓN RELATIVA (%) 120 A 120 B

90 90
60 60
30 30
0 0
MS MF MpC MC ISOO TOL TBOH ACN DMSO
SUSTRATOS SOLVENTE
120 C 120 D
CONVERSIÓN RELATIVA (%)
90 90
60 60
30 30
0 0
30 50 70 50:75 50:50 75:50
TEMPERATURA (°C) RELACIÓN MOLAR MF: BUTANOL
Figura 35. Efecto de diferentes parámetros en la síntesis de butil hidroxicinamatos con AocFAe1. A: Perfiles
de preferencia por sustrato. B: Efecto del solvente de reacción en la síntesis de butil ferulato (BF; producto
seleccionado de acuerdo a los resultados obtenidos en el gráfico A) C: Efecto de la temperatura en la síntesis de
BF. D: Efecto de la relación molar en la síntesis de BF. MS: Metil sinapinato; MF: Metil ferulato; MpC: Metil
p-cumarato; MC: Metil cafeato; TOL: Tolueno; TBOH: Tert-butanol; ACN: Acetonitrilo; DMSO: Dimetil
Sulfoxido; ISOO: Isooctano. Relación molar MF:BOH.
Posteriormente se evaluó el efecto del solvente de reacción en la síntesis del butil ferulato
(Figura 35 B). Para ello se escogieron solventes con diferente coeficiente de partición Agua:
Octanol (LogP, Tabla 9). La mayor conversión se alcanzó cuando se empleó el isooctano, un
solvente hidrófobo (con mayor LogP), estas condiciones se asemejan a las ya reportadas para
enzimas como la lipasa B de Candida antarctica [166] en la síntesis de ésteres de ácido
cinámico. Por otra parte, cuando se emplearon solventes con Log P inferiores a 0.6, el
biocatalizador no alcanzó el 1% de síntesis con respecto al logrado con isooctano, esto se
debe a que, como describe Klibanov, solventes con un bajo LogP pueden tener un efecto de
secuestrador del agua que esta asociada a la superficie de la proteína, lo cual rigidiza la
proteína y disminuye su actividad catalítica [167].
92
El efecto de la temperatura se evaluó a 30, 50 y 70°C (Figura 35 C). A 30°C se obtuvieron

conversiones bajas (42% respecto a la observada a 50°C), esto probablemente a causa de la
baja solubilidad del metil ferulato en estas condiciones Al incrementar 20°C la temperatura
de reacción, el metil ferulato se solubiliza más de un 90% y se observa la mejor conversión y
un incremento de 1.5 veces en la misma. A 70°C, en donde el sustrato es completamente
soluble, la conversión cae hasta un 28% del máximo, lo que sugiere desactivación térmica de
la enzima a esta temperatura [164].
Tabla 9. Coeficiente de partición Agua: Octanol de los solventes utilizados en la síntesis

del butil ferulato.
Solvente Coeficiente de partición
(LogP)
Isooctano 4.5
Tolueno 2.69
Tert-Butanol 0.584
Acetonitrilo 0.34
Dimetil Sulfóxido -1.35
Finalmente se evaluaron tres relaciones molares (MF: Butanol; Figura 35 D). La mayor
conversión se obtuvo con la relación 50:75, en donde existe un exceso del 150% de alcohol.
Este resultado, podría sugerir que la AocFae1 pueden tolerar concentraciones altas de alcohol
sin presentar inhibición por sustrato [168, 169]. Esto abre el panorama para usar este tipo de
biocatalizadores en sistemas ternarios como los empleados con las feruloil esterasas tipo A
de A. niger y tipo C de Sporotrichum thermophile, en donde el butanol constituye más del
40% en el medio de reacción [77, 80] o incluso en sistemas libres de solvente.
4.6 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO

Bajo las condiciones de estudio, la cascarilla de maíz resultó ser un excelente inductor de la
actividad Fae (hasta dos feruloil esterasas) cuando se usa un sistema de fermentación en
medio sólido. Así mismo, la productividad volumétrica indicó que éste es el sistema
fermentativo adecuado para las etapas posteriores del trabajo. Además, la variabilidad en la
expresión de las hidrolasas de interés de Aoc en base a los cambios en la materia prima del
93
inóculo o fermentación, permitió generar biocatalizadores enriquecidos en alguna de las dos

Faes.
Por lo tanto, la estrategia de emplear los fermentos sólidos secos (biocatalizadores) en las
reacciones de síntesis modelo resultó ser una herramienta útil para identificar que la AocFae1
es la hidrolasa con mayor actividad en la síntesis del butil p-cumarato.
Es importante remarcar que si los biocatalizadores se someten a tratamientos físicos, como la

molienda, es recomendable realizar los ensayos necesarios que verifiquen la integridad de las
características buscadas, como el perfil enzimático del catalizador.
Desafortunadamente, mediante las estrategias utilizadas, no fue posible identificar la

hidrolasa responsable de la síntesis de DPL. Por lo anterior, este trabajo se enfocó en
purificar parcialmente la AocFae1 para su posterior caracterización en la síntesis de los
ésteres de ácidos hidroxicinámicos.
94
CAPÍTULO 5: PURIFICACIÓN PARCIAL Y

DETERMINACIÓN DE LOS PERFILES
HIDROLÍTICOS DE LA AocFae1.
95
5.1 INTRODUCCIÓN.
Hasta la fecha, más de 30 Faes tanto de hongos como de bacterias han sido purificadas y
caracterizadas. A pesar de ello, las Faes aún son uno de los miembros de la familia de las
carboxil éster hidrolasas menos comprendido.
Nuestro grupo de trabajo se ha enfocado al estudio de las Faes que expresa el hongo
Aspergillus ochraceus (Aoc). Actualmente se cuenta con un protocolo de purificación a
homogenidad de la AocFae1. Sin embargo, los bajos rendimientos alcanzados y la necesidad
por obtener grandes cantidades de proteína para su caracterización en síntesis no lo hacen
factible para la realización de este trabajo. Por lo anterior, se optó por desarrollar un
protocolo de purificación parcial de la AocFae1, con la finalidad de aislarla de cualquier otra
actividad lipasa o Fae, que pudiera interferir con los ensayos de hidrólisis/síntesis. Además
de obtener una cantidad suficiente de enzima para su posterior caracterización en síntesis.
En este capítulo se describen los ensayos de purificación de la AocFae1 a partir de un

extracto crudo enriquecido obtenido de un fermento inducido con el concentrado de nejayote
(fracción D). Éste se utilizó para implementar un protocolo de purificación parcial de la
AocFae1 a través de cromotografía rápida de proteínas (FPLC). Posteriormente, la AocFae1
parcialmente pura se evaluó en la hidrólisis de los metil hidroxicinamatos y ésteres de pNP.
96
5.1.1 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA AocFaE1 A PARTIR DEL EXTRACTO

OBTENIDO CON EL CONCENTRADO DEL NEJAYOTE.
En los ensayos previos se determinó que la AocFae1 fue la enzima responsable de la
transesterificación de metil hidroxicinamatos, y que la actividad lipasa no es capaz de
catalizar esta reacción. Por lo anterior, fue necesario producir un fermento con la mejor
actividad específica Fae y la menor actividad lipasa, ahora una actividad contaminante. Por
lo que se comparó la actividad Fae en los fermentos generados con cascarilla de maíz y con
la fracción D del nejayote (Figura 36).
1
ACTIVIDAD ESPECÍFICA (U/mg)
0.8 Fae
Lipasa
0.6
0.4
0.2
0
Combinación D Nejayote concentrado
Figura 36. Comparación de la actividad específica Fae y lipasa de los extractos crudos enriquecidos en
AocFae1 obtenidos con cascarilla de maíz y nejayote. Las actividades se determinaron por triplicado sobre metil
p-cumarato y TC8 a pH 7.2 y 30°C; la cantidad de proteína se determinó por el método de Bradford
La actividad feruloil esterasa en los extractos enzimáticos obtenidos utilizando el

concentrado de nejayote como inductor (Fracción D) fue hasta 1.6 mayor que 1os obtenidos
con cascarilla de maíz (0.97 y 1.56 U/gms). Además, no se observó actividad lipasa
cuantificable, mientras que con los extractos generados a partir de los fermentos de la
combinación D, se obtuvo hasta 0.9 U/gms.
En términos de actividad específica (Figura 36) la actividad lipasa fue 11 veces mayor que la
Fae utilizando la cascarilla de maíz como inductor. De este modo, se obtuvo hasta 3 veces
mayor actividad Fae con los extractos enzimáticos generados con el nejayote (264.66
mU/mg). Por lo anterior, todas las fermentaciones y extractos enzimáticos fueron generados
con el concentrado del nejayote (Fracción D) para los trabajos subsecuentes.
97
A pesar de que utilizando en la fermentación el concentrado de nejayote se produjeron ambas

feruloil esterasas, los trabajos de Romero-Borbón sugieren una separación sencilla de estas
en base a su hidrofobicidad. Utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), la
AocFae2 (menor hidrofobicidad) es separada debido a que no es retenida en la columna
(Fenil Sefarosa), mientras que la AocFae1 (mayor hidrofobicidad) se retiene fuertemente y
eluye al final del gradiente realizado con sulfato de amonio [151].
5.1.2 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA AocFae1 POR CROMATOGRAFÍA DE

PROTEÍNAS.
Con el inductor adecuado seleccionado, se realizó una producción en charolas de FMS para
obtener suficiente extracto crudo (12 L) y poder realizar las pruebas de purificación mediante
técnicas de FPLC (Fast protein liquid chromatography). El protocolo implementado por
Romero-Borbón fue utilizado como primera tentativa para lograr la implementación del
presente protocolo.
Inicialmente se realizó una etapa cromatográfica de interacción hidrofóbica utilizando una

columna empacada con butil sefarosa (Sección 3.2.4.1.1), el cromatograma de purificación de
la proteína se presenta en la Figura 37. La actividad Fae se separó en dos picos (línea azul)
que van desde 1320 hasta 400 mM de sulfato de amonio. Una estrategia similar se usó para la
purificación de la feruloil esterasa tipo C de Talaromyces stipitaus (TsFaeC) [75].
98
300 4
2000
250
3
Sulfato de amonio (mM)
1500
200
Actividad FAE (U/mL)
Absorbancia (AU)
150 1000 2
100
500 1
50
0 0 0
-200 -100 0 100 200 300 400 500 600
Volumen (mL)
Figura 37. Cromatograma de purificación de AocFae1 por interacción hidrofóbica. En negro se indica el
gradiente de elución utilizando Sulfato de Amonio. En rojo el monitoreo de la absorbancia a 280 nm. En azul el
monitoreo la actividad Fae durante la elución determinada con metil ferulato a 30°C y pH 7.2.
A partir de los dos picos de actividad Fae se generaron dos fracciones. Los ensayos
zimográficos demostraron posteriormente que ambas actividades se debían a la misma
proteína (Figura 39 A). Además, ambas fracciones tuvieron actividad lipasa, demostrando
que esta actividad es expresada por el microorganismo a pesar de la falta aparente de un
inductor. En particular, el primer pico (de 1320 a 800 mM de sulfato de amonio) retuvo una
mayor actividad específica Fae (6.8 U/mg de proteína), por lo que se seleccionó para
proseguir a la siguiente etapa de purificación. La separación de la AocFae1 en dos picos
mediante esta estrategia podría sugerir la producción de al menos dos isoformas de la
proteína, o dos proteínas con diferentes modificaciones postraduccionales (e.g. glicosilación),
cambiando en cierto grado la hidrofobicidad de la proteína.
La fracción seleccionada de la salida de la butil sefarosa se concentró aproximadamente 10

veces y diafiltró usando una membrana de 3 kDa, reduciendo su volumen hasta 3 mL. Esto se
inyectó en 3 lotes a una columna de intercambio aniónico fuerte de 1 mL de capacidad
(MonoQ; Sección 3.2.4.1.2). Los resultados se muestran en la Figura 38.
99
60 4
1000
50
800 3
40
Absorbancia (AU)
NaCl (mM)
600
30 2
400
20
1
10 200
0 0 0
0 10 20 30 40
Volumen (mL)
Figura 38. Cromatograma de purificación de AocFae1 por intercambio iónico. En negro se indica el gradiente
de elución utilizando cloruro de sodio (NaCl). En rojo el monitoreo de la absorbancia a 280 nm. En azul el
monitoreo la actividad Fae durante la elución determinada con metil ferulato a 30°C y pH 7.2.
La actividad Fae se aisló en un solo pico que eluyó desde 130 hasta 170 mM de NaCl (línea
azul), logrando eliminar tan sólo un 6% de proteína Esto sugiere que la mayor cantidad de
contaminantes no presentaron una carga neta negativa bajo las condiciones evaluadas. Sin
embargo, mediante esta etapa cromatográfica fue posible eliminar la proteína responsable de
la actividad lipasa (Figura 39 B). Cabe resaltar que después de este paso de purificación, fue
posible eliminar la totalidad del color contenido en la muestra. Resultados similares fueron
reportados para la Fae-II de Fusarium oxysporum, en donde la etapa de intercambio iónico
realizada no incrementó significativamente el factor de purificación, pero separó una
considerable cantidad de color de la muestra [78]. Del mismo modo, proteínas como la
TsFaeC se purificaron empleando una estrategia similar, en particular esta Fae eluyó con
concentraciones desde 270 hasta 300 mM de NaCl, usando una columna MonoQ HR 5/5
[75].
100
Figura 39. Zimogramas de actividad Fae y lipasa de la purificación de AocFae1. A. Zimograma de actividad
Fae revelado con metil ferulato. B. Zimograma de actividad lipasa revelado con trioctanoina. EC: Extracto
crudo; BS: Salida de Butil sefarosa; MQ: Salida de MonoQ; SD: Salida de SuperDex.
Finalmente, para incrementar el factor de purificación, el producto de la etapa anterior se

dividió en dos inyecciones, las cuales se inyectaron a una columna de exclusión molecular
(HiLoad 16/600 Superdex 200 PG marca GE, rango de exclusión 10 a 600 kDa). En esta
etapa se obtuvieron 6 fracciones con actividad Fae que eluyeron en un volumen de 87 a 95
mL ((Figura 40; línea azul).
2.5 160 4
2.0
3
155
Absorbancia (AU)
1.5
NaCl (mM)
2
1.0 150
1
0.5
145
0.0 0
140
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Volumen (mL)
Figura 40. Cromatograma de purificación de AocFae1 por exclusión molecular (HiLoad 16/600 Superdex 200
PG marca GE). En negro se indica el gradiente de elución utilizando NaCl. En rojo el monitoreo de la
absorbancia a 280 nm. En azul el monitoreo la actividad Fae durante la elución determinada con metil ferulato a
30°C y pH 7.2.
101
Finalmente, se evaluó el grado de pureza de las fracciones colectadas mediante un gel SDS-
PAGE (Figura 41). Las fracciones D4 y E4 fueron las que mostraron un mayor grado de
pureza, por lo tanto se mezclaron y almacenaron a -20°C. Las fracciones D2, D3, E2 y E3 se
mezclaron y almacenaron a -20°C. Con este lote se realizó la caracterización en síntesis de la
AocFae1.
Figura 41. SDS-PAGE de las fracciones parcialmente purificadas obtenidas por cromatografía de exclusión
molecular. MPM: Marcadores de peso molecular de bajo rando en Da. D1-D4: Fracciones colectadas en la
primer corrida; E1-E4: Fracciones colectadas en la segunda corrida.
El resumen de la purificación de la AocFae1 se presenta en la Tabla 11. La actividad

específica de la AocFae1 alcanzada fue 8.9 U/mg, la cual está 6.3 veces por debajo de su
pureza a homogenidad [151]. Cabe resaltar, que para fines de este estudio el grado de pureza
alcanzado con el protocolo implementado es más que suficiente para obtener resultados
contundentes, ya que se demostró que fue posible separar las distintas FAEs y lipasas
inicialmente presentes en el extracto crudo.
102
Tabla 11. Resumen de la purificación de AocFae1, mediante cromatografía de

proteínas.
Actividad Rendimiento
mg de proteína Factor de
Etapa U totales específica (%)
total purificación
(U/mg)a
Extracto crudo 1544.4 5837.0 0.26 1 100
Extracto
1320.0 1294.0 1.0 3.9 85.5
diafiltrado
Salida Butil
883.1 129.6 6.8 25.8 57.2
Sefarosa
Salida Mono Q 151.0 20.9 7.2 27.4 9.8
Salida Superdex
2.5 0.15 8.9 32.3 0.17
200GL
a
Actividad Fae determinada sobre metil ferulato a pH 7.2 y 30°C.
La AocFae1 se purificó 32 veces con un rendimiento de 0.17%, el cual es bajo comparado

con lo reportado en la literatura. La máxima disminución en el rendimiento se observó previo
a la etapa de intercambio iónico, lo cual puede ser resultado de los pretratamientos de
concentración y diafiltración de la muestra. Protocolos de purificación similares han sido
reportados para la purificación de la AnFaeA y la StFaeC, los cuales involucran etapas de
interacción hidrofóbica, intercambio iónico y exclusión molecular [57, 77]. Sin embargo en
estos protocolos se obtienen rendimientos del 1.3 y 22%, que son de 8 a 138 veces mayores a
los alcanzados con el protocolo implementado para la AocFae1 en este trabajo.
5.1.3 EFECTO DE LA LONGITUD DE CADENA ACILO EN LA ACTIVIDAD

HIDROLÍTICA DE LA AocFae1 EMPLEANDO ÉSTERES DE p-NITROFENILO.
En este ensayo se realizó la hidrólisis de nueve ésteres con diferente longitud de cadena acilo,
que van desde 2 hasta 18 carbonos. Con el fin de evaluar el perfil hidrolítico de la AocFae1
en las mismas condiciones, se realizó la hidrólisis en presencia de detergente (Tritón X100;
Figura 42). La AocFae1 mostró actividad sobre los ésteres con 2 hasta 14 C, hidrolizando
preferencialmente los ésteres de cadena corta como el p-nitrofenol acetato (C2: 8.71 U/mg),
sobre el resto. Este comportamiento es típico de una carboxil esterasa, ya que conforme
incrementa la longitud de la cadena acilo la actividad disminuye. Por otra parte, el cociente
entre la actividad sobre p-nitrofenil acetato y metil ferulato es aproximadamente 1, indicando
103
que no existe una preferencia marcada por hidrolizar el p-nitrofenil acetato como en el caso
de las acetilxilan esterasa [48]. Sorprendentemente, se pudo observar una actividad mínima
sobre p-nitrofenil palmitato (0.004 U/mg), lo cual indica que cuando se emplea este sustrato
durante la búsqueda de actividad lipasa en extractos crudo algunas esterasas pudieran llegar a
generar falsos positivos.
10
0
C2 C4 C5 C8 C10 C12 C14 C16 C18
LONGITUD DE CADENA DE ESTERES DE pNP

Figura 42. Perfil hidrolítico de AocFae1 utilizando ésteres de p-nitrofenilo. C2-C18: indica la longitud de la
cadena acilo del éster de p-nitrofenilo (pNP). Actividades determinadas a pH 7.0 y 30°C.
5.1.4 HIDRÓLISIS DE LOS METIL ÉSTERES DE ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS POR

AocFae1.
En este ensayo se evaluó la preferencia de AocFae1 por hidrolizar los metil
hidroxicinamatos, metil cinamato e isómeros de posición del metil cumarato (orto, meta y
para; Figura 43 y 45). AocFae1 hidrolizó los cuatro metil hidroxicinamatos, lo que permite
catalogarla como una feruloil esterasa tipo C [48]. Los resultados anteriores concuerdan con
el reportado por Ramirez y Romero para esta misma Fae [151, 164] y es semejante a los
reportados para otras feruloil esterasas tipo C como las de Fusarium oxysporum,
Talaromyces stipitatus y Sporotrichum themophile [75, 77] y tipo D de Cellvibrio japonicus
y Neurospora crassa [170, 171].
104
10

8
0
Metil Metil Metil p- Metil
sinapinato ferulato cumarato cafeato
Figura 43. Hidrólisis de metil hidroxicinamatos empleando AocFae1
La AocFae1 mostró una ligera preferencia por hidrolizar el metil ferulato (8.9U/mg de prot.)
al igual que la StFaeC y TsFaeC [75, 77]. La preferencia por MF fue 1.4, 1.68 y 1.87 veces
mayor que MpC, MC y MS, revelando una preferencia MF>MpC>MC>MS, la cual es
similar al de FoFaeC (MF>MC>MpC>MS; [78]).
También se evaluó la capacidad de AocFae1 para llevar a cabo la hidrólisis de distintos

isómeros de ésteres del ácido cumárico y del metil cinamato (orto, meta y para: MoC, MmC,
MpC y MCin, respectivamente; Figura 44) con la finalidad de observar la influencia de la
posición del hidroxilo en el anillo aromático durante la hidrólisis.
Figura 44. Estructura química del metil cinamato y distintos isómeros de ésteres metílicos de ácido cumárico.
La actividad hidrolítica sobre estos ésteres (MmC>MpC>MCin>MoC; Figura 45) muestra

una preferencia de 2 y hasta 5.8 veces por hidrolizar el metil m-cumarato (12.2 U/mg) contra
el metil p-cumarato (6.4 U/mg) y o-cumarato. Lo anterior sugiere que la posición para en el
anillo aromático no es indispensable para la catálisis, contrario a lo que señala la literatura
para el caso de la AnFaeA [67, 69]. Complementariamente, las actividades hidrolíticas
idénticas sobre MpC y Mcin (relación 1.005 MpC/MCin) señalan que el hidroxilo en el anillo
no es indispensable en lo absoluto. Algunos trabajos en hidrólisis con la TsFaeC han
105
demostrado que la posición meta- tiene un efecto potenciador de la actividad catalítica. Por
otro lado, los mismos autores sugieren que la interacción del hidroxilo del o-cumarato con el
doble enlace de la función acril, fomenta un aumento en el impedimento estérico que
disminuye la catálisis [137].

15
12
0
Metil cinamato Metil o- Metil m- Metil p-
cumarato cumarato cumarato
Figura 45. Hidrólisis de metil cinamato y los isómeros del metil cumarato empleando AocFae1.
5.2 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO.

A pesar de obtenerse rendimientos pobres, el protocolo de purificación de la AocFae1
implementado en este trabajo permitió obtener el catalizador con la pureza necesaria para
realizar los ensayos de síntesis.
La cromatografía de intercambio iónico permitió separar definitivamente la actividad lipasa

contaminante, por lo que en trabajos posteriores puede ser utilizada como primer etapa de
purificación cuando sólo esta sea la actividad contaminante.
La hidrólisis preferente de los ésteres de cadena corta de pNP por la AocFae1 permitió
distinguirla como una esterasa clásica, sin embargo fue capaz de hidrolizar el éster de hasta
16 carbonos, por lo cual la hidrolisis de estos esteres no debe ser utilizada para diferenciarla
de otras carboxil éster hidrolasas como las lipasas
Mediante la hidrólisis de los ésteres metílicos de ácidos hidroxicinámicos, se pudo confirmar

que la AocFae1 es una feruloil esterasas inespecífica tipo C.
106
CAPÍTULO 6: CARACTERIZACIÓN EN
SÍNTESIS DE LA AocFae1
107
6.1 INTRODUCCIÓN.
Una parte fundamental en la realización de este trabajo es la caracterización en síntesis de la
AocFae1. A lo largo de este trabajo se ha reconocido el potencial en la síntesis de ésteres de
alto valor agregado, sin embargo su potencial sólo se ha probado en la síntesis del éster
butílico de ácido p-cumárico y la dipropionil luteína. Por lo anterior, fue esencial conocer a
profundidad el comportamiento de esta Fae con diferentes sustratos en síntesis.
Durante todo el trabajo ha sido utilizado un sólo sistema de reacción para la síntesis de los
ésteres de ácidos hidroxicinámicos. Este sistema, ha sido ampliamente utilizado con lipasas
inmovilizadas, liofilizadas con altas tasas de conversión. Sin embargo, las Faes catalizan
pobremente bajo estas condiciones, actualmente la actividad en síntesis de la Faes ha sido
evaluada en sistemas de reacción en donde es necesaria cierta cantidad de agua para llevar a
cabo la reacción (1-5%), lo que incluso permite utilizar esta enzimas en solución acuosa.
Algunos ejemplos de estos trabajos son los sistemas de microemulsiones “water in oil”
utilizados por Giuliani, los cuales ofrecieron en la síntesis de pentil ferulato un grado de
conversión superior a los previamente reportados para la síntesis de ésteres de
hidroxicinámicos por Guyot y Compton [73, 172]. Alternativamente, los sistemas ternarios
usados en los trabajos realizados por Topakas y Vafiadi han demostrado dar buenos
rendimientos utilizando varias Faes como las de A. niger, Fusarium oxysporum,
Sporotrichum thermophile, [77, 78, 80] entre otras. Los sistemas ternarios, también llamados
microemulsiones libres de surfactante, son dispersiones de micropartículas acuosas en el
solvente hidrófobo, termodinámicamente estables y ópticamente transparentes. Además
debido al LogP de los metil hidroxicinamatos (de 1.5 a 1.9) la solubilidad en estos sistemas
es alta por la presencia de hasta un 25% de alcohol con LogP similar [77]. Por tal motivo
estos sistemas se utilizaron como base para desarrollar un sistema ternario para el modelo de
A. ochraceus. Mediante esta estrategia finalmente se pudo conocer el rol de la AocFae1 como
biocatalizador en la síntesis de los ésteres de interés, a través de su caracterización y
comparación con otros catalizadores usados en la actualidad a nivel industrial.
En esta sección se describe inicialmente la implementación de un sistema de reacción que

permitiera aumentar la velocidad inicial y conversión de la reacción. Posteriormente se
describen los resultados de la caracterización de la AocFae1 utilizando los metil
108
hidroxicinamatos como sustratos para la síntesis de una amplia variedad de productos. Del
mismo modo, se utilizó la lipasa B de Candida antárctica (CALB) en conjunto con la lipasa
de Thermomyces lanuginosus (TLL) y de Rhizomucor miehei (RML), así como las Faes tipo
A y B de A niger, para comparar su eficiencia en la catálisis de las reacciones propuestas. De
este modo se determinó cuál o cuáles son los mejores biocatalizadores para sintetizar ésteres
butílicos de los ácidos hidroxicinámicos, ésteres alquílicos del ácido ferúlico, entre otros.
109
6.2 IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DE REACCIÓN PARA LA SÍNTESIS DE

BUTIL FERULATO CON LA AocFae1.
Para la implementación del sistema de reacción, se usaron los parámetros reportados en la
sección 4.4, por lo cual se utilizó como modelo la transesterificación de metil a butil ferulato,
utilizando una concentración inicial de 50 mM del éster metílico correspondiente; además se
fijó el isooctano como solvente de reacción. La temperatura (30°C) fue un parámetro que no
fue evaluado debido a los multiples reportes en donde se reportan pérdidas de hasta el 70%
de actividad después de ser incubadas a temperaturas superiores a los 35°C en el sistema de
reacción [77, 79, 80, 126] Por otra parte, de acuerdo con los trabajos de Topakas y col, se
utilizó un 2% de agua como concentración de partida, en la cual está incluida la solución
enzimática [79].
La cantidad de alcohol/solvente, cantidad de agua, el pH de la solución enzimática, entre

otros factores, fueron evaluados a continuación con el fin de mejorar la velocidad inicial de la
reacción utilizando la AocFae1.
6.2.1.1 EFECTO DE LA CANTIDAD DE ALCOHOL/SOLVENTE EN

LA SÍNTESIS DE BUTIL FERULATO.
El porcentaje de alcohol se varió desde un 0.54% (75mM, de acuerdo con lo observado en la
sección 4.4), hasta un 50%. Los resultados se muestran en la Figura 46.
Velocidad inicial (µmol/min)
3
A 5 B
LogP aparente
4
2
1 3
0 2
0% 10% 20% 30% 40% 50% 0% 10% 20% 30% 40% 50%
Butanol (%) Butanol (%)
Figura 46. Efecto de la concentración porcentual de butanol en el medio de reacción usando AocFae1. A.
Efecto de la concentración de butanol sobre la actividad en síntesis de la AocFae1. B. Coeficiente de partición
aparente en la mezcla de reacciones a diferentes concentraciones de butanol.
Como se observa en la Figura 46 A, se obtuvo una tendencia polinomial definida, en donde

la velocidad máxima de reacción se observó con la concentración del 25% de butanol.
110
Después de pasar el 25% de butanol, la concentración de éste afecta negativamente la

velocidad inicial de síntesis del butil ferulato, este comportamiento se puede deber a diversos
fenómenos ya reportados en la literatura, como el efecto de la mezcla isooctano: butanol
(3.023; Figura 46 B), que a diferentes concentraciones puede tener distintos valores de LogP
aparente. Se ha reportado una relación directa entre el LogP del solvente con la conversión
del producto, utilizando lipasas como catalizadores. Un Log P con valores entre 2 y 4,
favorece la participación de la enzima en la catálisis [173].
En este caso, cantidades superiores a un 25% de butanol reducen hasta un 60% la actividad
en síntesis. Sin embargo en los trabajos de Topakas y Vafiadi, se utiliza una proporción
mayor al 50% de propanol y o butanol y hexano para la síntesis de butil y propil ésteres,
obteniendo rendimientos de entre el 20 y el 74 % de conversión en 120 horas con los
modelos A. niger, Fusarium oxysporum, y Sporothricum thermophile [77, 79, 80]
6.2.1.2 EFECTO DE LA CANTIDAD DE AGUA SOBRE LA SÍNTESIS

DE BUTIL FERULATO.
Para evaluar la cantidad de agua necesaria en el sistema de reacción se utilizó la mejor
proporción obtenida en el ensayo anterior (25% Butanol). Las proporciones de agua
evaluadas fueron 1,2 y 4%, Los resultados se presentan en la Figura 47.
Velocidad inicial ( mol/min)
0
0% 2% 4%
Cantidad de agua (%)
Figura 47. Efecto de la cantidad de agua en la mezcla de reacción sobre la actividad catalítica en síntesis de
AocFae1.
La cantidad necesaria de agua en el sistema de reacción que ofreció los mejores resultados
fue el 2% con 3.66moles/min, Topakas y col. también reportan que el 2% de agua en
sistemas ternarios usados en la transésterificación de butil ésteres ofrece conversiones hasta
111
10 veces más altas que usando porcentajes superiores como 3.2 y 5.5% de agua en el medio
de reacción [77].
Sin embargo, al usarse solamente el 1% de agua se detecta cerca de un 50% menos de

actividad de síntesis con respecto al máximo obtenido, lo cual remarca la importancia de una
cantidad mínima de agua en el medio de reacción. Numerosos autores han reportado que el
agua, en reacciones llevadas a cabo en solventes orgánicos, favorece la flexibilidad de la
enzima, para el caso de lipasas y esterasas [28, 174]. Al aumentarse la proporción de agua al
4% no existió diferencia significativa (3.484moles/min  0.174) contra lo encontrado al
2%; este fenómeno puede ser explicado con lo observado por Giuliani y col. quienes indican
que un aumento en la concentración de agua en la mezcla ternaria de solventes puede
dificultar la máxima tasa de recambio alcanzable por las Faes, posiblemente por encontrarse
compitiendo con la reacción de hidrólisis [175].
En lo consecutivo, se elegió el 2% de agua libre el cual ofreció la mejor velocidad de

reacción y el menor uso de agua.
6.2.1.3 EFECTO PROTECTOR DE LA SEROALBUMNA BOVINA

SOBRE LA ACTIVIDAD SINTÉTICA DE LA AocFae1.
Con la finalidad de intentar reducir el riesgo de desnaturalización de la AocFae1, por factores
como la exposición a solventes, se decidió proteger la AocFae1 con una solución de
seroalbumina bovina a 50mg/mL de concentración final en la fase acuosa. En estas
condiciones se logró aumentar la velocidad inicial de reacción hasta en un 179% (Figura
48). Diversos reportes han demostrado que la seroalbumina como acarreador de enzimas en
catálisis así como en procesos de inmovilización puede ayudar proteger la enzima de daño
térmico o por solventes [176].
112
CONVERSIÓN RELATIVA (%)

300%
200%
100%
0%
Sin BSA Con BSA
Figura 48. Efecto protector de la seroalbumina bovina sobre la actividad de síntesis de AocFae1.
6.2.1.4 EFECTO DEL pH APARENTE EN EL SISTEMA TERNARIO

SOBRE LA SÍNTESIS DE BUTIL FERULATO.
Otro parámetro de importancia para el establecimiento de las condiciones de reacción fue el
pH de la solución acuosa de la enzima en el sistema ternario de reacción. Para realizar este
ensayo se probaron valores de pH desde 4 hasta 9.
12
Velocidad inicial (mol/min)
0
3 4 5 6 7 8 9
Unidades de pH
Figura 49. Efecto del pH aparente sobre la actividad de síntesis de AocFae1.
Como se observa en la Figura 49, existe un aumento gradual de la actividad en síntesis

conforme el pH de la solución enzimática aumenta, observándose la mayor velocidad inicial
a pH 9 con 3.29 moles formadas de producto por minuto. Sin embargo, para los estudios
posteriores se decidió utilizar la solución enzimática a pH 8, ya que no se encontraron
diferencias significativas con respecto al ensayo utilizando la solución a pH 9 (8.950.44 y
113
9.290.46), además pHs cercanos a la neutralidad podrían tener un carácter menos

desnaturalizante para la enzima. Cabe resaltar que este valor de pH es el usado en la solución
enzimática acuosa y no necesariamente refleja el pH de la solución enzimática en la mezcla
de reacción.
6.2.1.5 EFECTO DE LA CANTIDAD DE AocFae1 SOBRE LA

SÍNTESIS DE BUTIL FERULATO.
Finalmente, se determinó la cantidad de AocFae1 necesaria para llevar acabo las reacciones
de síntesis, para este fin, se utilizaron como referencia las unidades de actividad enzimática
en hidrólisis sobre MF. En la Figura 50, se observa que las mU en hidrólisis utilizadas,
mantienen una relación directamente proporcional con las unidades encontradas en la síntesis
de butil ferulato hasta alcanzar un máximo de 24.08 moles/min de producto formado
utilizando 400mU totales de enzima (determinadas en hidrólisis). Al aumentar las mUnidades
totales de enzima hasta 800, no se observa un aumento proporcional ni significativo de la
actividad en síntesis.
40
Velocidad inicial ( moles/min)
30
20
10
0
0 200 400 600 800 1000
Actividad enzimática (mU totales en hidrolisis de MF)
Figura 50 Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad en síntesis de AocFae1.
Este fue el parámetro final que se evaluó para el mejoramiento de la reacción de

transesterificación de metil ferulato en butil ferulato. Con esta serie de ensayos se logró
incrementar la velocidad inicial de reacción 34 veces con respecto al mismo sistema ternario,
y hasta 1000 veces con respecto a los sistemas utilizados al principio de este trabajo
(sistemas para lipasas) y se pasó de conversiones del 3% en 5 días a 17% en 6 horas.
114
6.2.2 CARACTERIZACIÓN DE LA AocFae1 COMO BIOCATALIZADOR: SÍNTESIS DE

ÉSTERES ALQUÍLICOS DE ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS.
6.2.2.1 PREFERENCIA DE LA AocFae1 POR LOS METIL

HIDROXICINAMATOS.
La AocFae1 fue evaluada en la síntesis de transesterificación para obtener 4 butil
hidroxicinamatos. En la Figura 51 se muestra la velocidad inicial de síntesis de cuatro
ésteres butílicos de los ácidos hidroxicinámicos típicos.
5
4
3
2
1
0
SINAPINATO FERULATO p-CUMARATO CAFEATO
BUTIL HIDROXICINAMATO
Figura 51. Velocidad inicial en la síntesis de butil hidroxicinamatos usando AocFae1. Se utilizaron 4 metil
ésteres de ácidos hidroxicinámicos (MS, MF, MpC y MC) como sustratos para llevar a cabo la
transesterificación a sus butil ésteres correspondientes. La reacciones se llevaron a cabo en un sistema ternario
de reacción bajo las mejores condiciones (50mM sustrato, 25% alcohol, 2% agua, pH 8, 5mg/mL de BSA y
400mU de Aoc en hidrólisis de MF).
La AocFae1 mostró una preferencia por utilizar los hidroxicinamatos ligeramente distinta a la
mostrada hidrólisis (MF>MpC>MC>MS), para este caso, la preferencia fue
MC>MF>MpC>MS; (Figura 51). En reportes previos se había observado que esta
preferencia se conserva en hidrólisis y síntesis, para el caso AnFae A en los trabajos de
Vafiadi [137]. Sin embargo para la AocFae1 no se conservó, sugiriendo que la preferencia en
hidrólisis y síntesis no está necesariamente relacionada. Estos ligeros cambios pueden
deberse a la interacción de los solventes con la enzima o incluso con la poca cantidad de agua
en el sistema de reacción que podría conferirle menor flexibilidad a esta enzima [167, 174].
Por otro lado, al igual que en los ensayos en hidrólisis, el metil sinapinato permaneció como
el hidroxicinamato menos aceptado por la AocFae1 en síntesis (0.45 U/mg), esto pudiera ser
115
provocado por el impedimento estérico que el sustituyente en la posición 3 del anillo

bencénico puede provocar. Del mismo modo la mayor hidrofobicidad del compuesto también
pudiera ser una causa de este fenómeno [68, 69, 81].
La velocidad de reacción en la síntesis del butil cafeato y el butil ferulato no mostraron gran
diferencia (3.46 y 2.83 U/mg de proteína), sin embargo, la preferencia por sintetizar el éster
butílico del ácido cafeico en las condiciones de reacción estudiadas es de particular interés,
debido a la importancia biotecnológica que poseen este tipo de ésteres; además son pocos los
reportes en la literatura que hacen mención de enzimas que tengan preferencia por llevar a
cabo la síntesis de ésteres del cafeico.
El perfil de síntesis mostrado en este estudio difiere al de otras Faes como la StFaeC, la cual
muestra preferencia por MF>MS>MpC>MC; con conversiones alrededor del 22% al 5% en
120 horas de reacción.
Para las etapas subsecuentes de la caracterizacion de la AocFae1, se utilizó el metil ferulato

como sustrato, debido a la disponibilidad del material y sobre todo al mayor número de
publicaciones disponibles, lo que nos permite enriquecer la discusión de este trabajo.
6.2.2.2 PREFENCIA DE LA AocFae1 POR ALCOHOLES DE

DISTINTA LONGITUD DE CADENA
La preferencia de la AocFae1 por alcoholes de distinta longitud de cadena se evaluó en la
reacción de transesterificación de metil ferulato en su respectivo éster alquílico empleando
alcoholes que poseen 2 hasta 12 carbonos. La velocidad inicial de síntesis de los distintos
ésteres, durante la reacción de transesterificaciónse muestra en la Figura 52.
116

5
4
3
2
1
0
C2 C3 C4 C8 C12
LONGITUD DE CADENA
Figura 52. Síntesis de alquil ferulatos usando AocFae1. La longitud de la cadena alquilo del éster formado, se
indica con el número que acompaña a la letra C que representa el número de carbonos de la cadena alquilo.
No se detectó actividad de síntesis con alcoholes de 2 y 3 carbonos. No obstante, la mayor

actividad de síntesis se encontró utilizando butanol como sustrato. Resultados publicados por
el grupo de Vafiadi demostraron que la feruloil esterasa A de A. niger también puede realizar
eficientemente este producto, con rendimientos de hasta el 74% en 120 horas [80]. Un
resultado de particular interés fue la síntesis del octil ferulato, ya que la producción de este
compuesto no ha sido previamente reportada para ninguna otra feruloil esterasa, ésta se logró
con una velocidad de hasta 89 mU/mg de proteína. Finalmente, no se detectó conversión en
cadenas más largas a 8 carbonos, Vafiadi y col. sugieren que el alargamiento de la cadena
alquilo incrementa la hidrofobicidad, resultando en una menor compatibilidad de los
sustratos en el sistema ternario de reacción el cual es relativamente polar [137].
6.2.2.3 PREFENCIA DE LA AocFae1 POR ISOMEROS PRIMARIOS,

SECUNDARIOS Y TERCIARIOS DEL BUTANOL, EN LA
SINTESIS DE ÉSTERES BUTÍLICOS DEL ÁCIDO FERÚLICO.
Con la finalidad de conocer la preferencia de la AocFae1 por la posición primaria, secundaria
o terciaria de la función alcohólica de distintos isómeros del butanol, se realizó la
transesterificación del metil ferulato para la producción de n-butil, sec-butil y tert-butil
ferulato.
117

5
4
3
2
1
0
n Sec Tert
ISOMERÍA DEL ALCOHOL
Figura 53. Efecto de la ramificación del butanol en la síntesis de x-Butil ferulato usando AocFae1. n: posición
primaria, sec: posición secundaria; tert: posición terciaria.
Como era de esperarse, el tert-butanol no fue un sustrato aceptado por la AocFae1, sin
embargo esto puede permitir utilizar este alcohol como solvente de reacción para la síntesis
de otros compuestos, como los derivados glicosilados de ácidos hidroxicinámicos, tal como
se ha realizado con la AnFaeA [126].
Por otra parte, la síntesis del sec-butil ferulato fue lograda con éxito, aunque a una velocidad
inicial casi 6 veces menor que su contraparte no ramificada (0.47 U/mg de proteína; Figura
53), mostrando una fuerte preferencia por la esterificación del grupo hidroxilo primario
comparado con el secundario. Vafiadi y colaboradores muestran resultados similares para la
AnFaeA en la síntesis de los ésteres butílicos del ácido sinapínico, alcanzando una velocidad
inicial de 5.76 veces menor en la catálisis del éster sec-butílico del ácido sinapínico [80]. La
alta preferencia por los grupos hidroxilos primarios podría ser aprovechada en la síntesis
regioselectiva de la feruloil L-arabinosa, ésterificando preferencialmente en la posición 5
primaria [126].
6.2.2.4 PREFENCIA DE LA AocFae1 POR LA POSICIÓN orto, meta

o para DEL ÁCIDO CUMÁRICO EN LA SINTESIS DE BUTIL
CUMARATOS.
En esta sección se analizó la preferencia de la AocFae1 por la posición orto-, meta- y para
del ácido cumárico, en la síntesis de sus ésteres butílicoscorrespondientes.
118

5
4
3
2
1
0
orto meta para
POSICIÓN DEL HIDROXILO
Figura 54. Efecto de la posición hidroxilo (orto, meta y para) del anillo arómatico del ácido cumárico en la
síntesis de butil cumaratos usando AocFae1.
Como se vió en secciones anteriores la AocFae1 demostró una velocidad inicial en la síntesis
del butil p-cumarato comparable con la de los otros butil ésteres, con hasta 1.74U/mg de
proteína. Para el caso del butil o-cumarato se obtuvo una velocidad de 1.08U/mg de proteína
y para el butil m-cumarato de 2.14U/mg de proteína, es decir 1.23 veces superior a la del
butil p-cumarato (Figura 54). Este comportamiento no ha sido previamente reportado en la
literatura, y los estudios en síntesis realizados con los isómeros del cumárico han sido pocos
o nulos. No obstante, este perfil en síntesis concuerda con el visto en hidrólisis con la
AocFae1 (Sección 5.1.4), lo cual podría sugerir, para el caso de síntesis, que un sustituyente
hidroxilo en la posición meta, (como en el caso de ésteres del caféico o m-cumárico), permite
un incremento en la actividad catalítica en esta enzima. Un caso similar se reporta para la
esterificación de distintos ácidos fenólicos usando la FoFae-II, aquí se evidencia la necesidad
de la hidroxilación del anillo bencénico en posición para para poder llevar a cabo la catálisis
[79].
No obstante, la evidencia no es concluyente, y para el entendimiento de este fenómeno son

necesarios estudios más profundos al respecto.
6.2.3 COMPARACIÓN DE LA AocFae1 CON OTRAS CARBOXIL ÉSTER HIDROLASAS

EN LA SÍNTESIS DE ÉSTERES DE ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS.
La actividad en síntesis de la AocFae1 en reacciones de transesterificación de ésteres de
ácidos hidroxicinámicos fue evaluada contra otras carboxil éster hidrolasas con la
previamente se ha reportado la síntesis de estos productos. Las enzimas evaluadas fueron 2
119
feruloil esterasas, A y B de Aspergillus niger, y 3 lipasas, la B de Candida antarctica, la

lipasa de Rhizomucor miehei, y la lipasa de Thermomyces lanuginosus.
Para llevar a cabo los ensayos con las Fae se utilizó una solución enzimática con
aproximadamente la misma cantidad de proteína que en los ensayos donde se utilizó la
AocFae1, y las mismas condiciones de reacción.
Los sistemas ternarios utilizados en las reacciones donde están involucradas las Faes no
fueron adecuados para llevar a cabo la síntesis de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos con
lipasas. Por lo anterior, para los sistemas de reacción en donde están involucradas las lipasas,
se decidió utilizar las mejores condiciones encontradas en trabajos anteriores, que
consistieron en utilizar isooctano como solvente de reacción, catalizadores inmovilizados en
soportes comerciales, así como una concentración de alcohol del 75mM, y 50°C para
catalizar la reacción. Para propósitos comparativos, los resultados no se expresan por mg de
proteína, si no por mol de proteína.
6.2.3.1 DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE PROTEÍNA EN

LOS INMOVILIZADOS DE LIPASAS COMERCIALES.
Para llevar a cabo la comparación de lipasas fue necesario determinar la cantidad de proteína
activa contenida en cada inmovilizado, para lo cual se utilizó la estrategia descrita en las
secciones metodológicas 3.2.3.2 y 3.2.3.6. Los resultados se presentan en la tabla 12.
Tabla 12. Determinación dela actividad lipasa sobre los inmovilizados comerciales.
Proteína en el Actividad específica

Unidades totales Actividad del catalizador
Lipasas catalizador (g reportada1 (U/mg de
(U) (U/mg catalizador)
prot/mg cat) proteína)
CALB 21.84 2.14 12.98 165
TLL 49.05 4.85 1.22 3960
RML 19.20 1.91 0.23 8240
Actividad específica determinada sobre tributirina (TC4) de acuerdo con Rogalska y col [156].
La lipasa B de Candida antarctica mostró una actividad comparable al resto de los

biocatalizadores en los ensayos titrimétricos, sin embargo, en concordancia con su actividad
120
específica, contiene 10.6 y 56 veces más proteína en comparación con TLL y RML
respectivamente. Por otro lado, TLL mostró tener 5.3 veces menos actividad que RML,
siendo esta última la lipasa con la mejor eficiencia por mg de proteína en el inmovilizado.
Con este análisis fue posible realizar los ensayos de síntesis subsecuentes y poder comparar
mol por mol la eficiencia de cada catalizador.
6.2.3.2 COMPARACIÓN DE LOS BIOCATALIZADORES EN LA

SÍNTESIS DE ÉSTERES BUTÍLICOS DE ÁCIDOS
HIDROXICINÁMICOS.
Los 6 biocatalizadores mencionados en las secciones anteriores fueron evaluados por su

capacidad para realizar la síntesis de butil hidroxicinamatos. Los resultados se muestran en la
Figura 55. Todos los biocatalizadores fueron capaces de realizar la síntesis del butil ferulato,
sin embargo la AocFae1 y RML fueron los catalizadores con la mejor velocidad inicial en la
síntesis de este compuesto con 85 y 96 U/mol de proteína. En general, todas las lipasas
fueron incapaces de realizar la síntesis del butil cafeato, probablemente debido al carácter
más hidrofílico del sustrato. Solamente la AocFae1 fue capaz de realizar exitosamente los 4
butil hidroxicinamatos (MC>MF>MpC>MS).
120
BS BF BpC BC
Velocidad inicial en sintesis
(U/umol of proteina)
90
60
30
0
AocFAE1 AnFAE A AnFAE B CALB TLL RML
Figura 55. Velocidad inicial en la síntesis de los 4 butil hidroxicinamatos con los biocatalizadores
seleccionados. AocFae1: Feruloil esterasa de Aspergillus ochraceus, AnFaeA, AnFaeB: Feruloil esterasas A y B
de Aspergillus niger. CALB: Lipasa B de Candida antartica, TLL: Lipasa de Thermomyces lanuginosus, RML:
Lipasa de Rhizomucor miehei. BS: Butil sinapinato, BF: Butil ferulato, BpC: Butil p-cumarato, BC: Butil
cafeato.
121
El catalizador que mostró las velocidades iniciales en síntesis más bajas fue la lipasa B de
Candida antarctica, ya que sintetizó butil ferulato y p-cumarato de 527 a 202 veces más
lentamente comparado con el mejor catalizador para la síntesis del mismo butil éster (RML y
AocFae1, respectivamente). Lo anterior sugiere que la actividad de síntesis de CALB
reportada en la literatura se debe principalmente a la alta concentración de proteína contenida
en los biocatalizadores inmovilizados y no a una mayor actividad específica comparada con
otras carboxil esterasas.
Las feruloil esterasas A y B de A. niger mostraron un perfil de síntesis similar al que

muestran en hidrólisis, la AnFaeA mostró una mayor preferencia por los sustratos
metoxilados (MS>MF>MpC) y no fue capaz de realizar la síntesis del butil cafeato, por otra
parte la AnFaeB que usualmente prefiere los ésteres del cafeico en hidrólisis, realizó a una
mayor velocidad el éster butílico del ácido p-cumárico 1.6 veces más que butil cafeato, y de
igual forma que en hidrólisis fue incapaz de aceptar el metil sinapinato como sustrato.
TLL fue un catalizador que mostró velocidades moderadas con respecto al resto, sin embargo
fue capaz de realizar al menos la síntesis de 3 butil ésteres, siendo el metil ferulato el sustrato
más prominente con una velocidad de 8.02 U/mol de proteína, es decir hasta 12 veces
menos eficiente que RML.
Finalmente AocFae1 y RML fueron las enzimas con la mejor capacidad de síntesis, ya que
mostraron velocidades desde 40 hasta 500 veces (mol a mol) más altas que el resto de los
biocatalizadores. Como ya se había mencionado, RML no pudo realizar la síntesis del butil
cafeato, sin embargo pudo realizar la síntesis del butil sinapinato con la mejor eficiencia
entre los 6 biocatalizadores (100.7 U/mol de proteína), la preferencia para utilizar los
ésteres del sinapínico como sustrato puede deberse en gran medida a la alta homología de
secuencia (37%) y topología casi idéntica con la Feruloil esterasa A de A. niger (AnFaeA;
[68]) cuyo perfil tanto hidrolítico como sintético muestran una clara preferencia por este
sustrato[57]. Por otra parte la AocFae1 mostró una mayor afinidad por el butil cafeato
(103.95 U/mol de proteína), mientras que el butil sinapinato fue el producto que se realizó
con la menor velocidad por esta enzima (12.76 U/mol de proteína). En este caso, tanto
RML y AocFae1, mostraron tener perfiles complementarios, para la síntesis de toda la gama
122
de ésteres de ácidos hidroxicinámicos con cadena de 4 carbonos, lo cual prueba el valor

biotecnológico de ambas enzimas como herramientas para la obtención de estos ésteres.
Debido a lo anterior, el potencial de RML y AocFae1 fue evaluado nuevamente con la

síntesis de la serie de ésteres alquílicos del ácido ferúlico (desde 2 hasta 12 carbonos), el cual
fue elegido por ser el sustrato donde ambas enzimas mostraron velocidades iniciales
comparables (96.16 y 85.15 U/mol de proteína respectivamente). También se probó la
capacidad de aceptar alcoholes secundarios o terciarios, así como la influencia de la posición
orto, meta y para del hidroxilo en el anillo bencénico del ácido cumárico para la síntesis de
los ésteres correspondientes.
6.2.3.3 SÍNTESIS COMPARATIVA DE ÉSTERES DE ÁCIDOS

HIDROXICINÁMICOS CON AocFae1 y RML
En la Figura 56, se observa el comparativo de todos los parámetros evaluados entre ambas
enzimas, en la Figura 56 A, se vuelve a mostrar el perfil de preferencia en la síntesis de los 4
butil hidroxicinamatos, ahora en U/mol de proteína. En la Figura 56 B, se muestra el perfil
de AocFae1 y RML en la síntesis de la serie del ferúlico desde 2 hasta 12 carbonos. La
AocFae1 solamente pudo realizar la síntesis de los ésteres de 4 y 8 carbonos, con velocidades
de 85 y 2.69U/mol de proteína. Paralelamente RML sintetizó existosamente todos los
ésteres de esta serie, mostrando una especial preferencia por sintetizar el propil ferulato con
una velocidad de hasta 121.35 U/mol de proteína. Sorprendentemente, esta preferencia
coincide con la observada para la AnFaeA, evidenciando nuevamente su alta homología con
esta enzima inclusive en síntesis. Las velocidades más bajas fueron obtenidas al realizar etil y
dodecil ferulato con 67 y 56U/mol de proteína. La capacidad de catalizar ésteres con
cadenas de hasta 12 carbonos, podría ser favorecida por el carácter hidrófobo de la enzima y
su afinidad por sustratos lipídicos insolubles.
Por otra parte, en la evaluación de posición primaria, secundaria y terciaria del butanol,
ambas enzimas fueron capaces de realizar el sec-butil ferulato (Figura 56 C), no obstante las
velocidades fueron bajas en contraste con los sustituyentes análogos primarios, 5.95 y 29.36
veces menos veloz para AocFae1 y RML, respectivamente. Para este producto en particular
la enzima más promisoria es la AocFae1, los resultados obtenidos con esta, podrían ser
123
mejorados alterando las condiciones de reacción e.g. cambiando el solvente de reacción. Con
respecto a la posición terciaria no se observó conversión después de 96 horas de reacción
para ninguna de las 2 hidrolasas.
120 A 120 B
ACTIVIDAD DE SÍNTEISIS
(U/umol de proteína)
90 90
60 60
30 30
0 0
Sinapinico Ferúlico p-Cumárico Cafeico C2 C3 C4 C8 C12
Hidroxicinamatos Longitud de cadena
120 120
C D
ACTIVIDAD DE SÍNTEISIS
(U/umol de proteína)
90 90
AocFAE I
60 RML 60
30 30
0 0
n Sec Tert orto meta para
Isomería alcohol Posición Hidroxilo
Figura 56. Comparativo de la síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos llevados a cabo por la AocFae1 y
RML. A: Preferencia por metil hidroxicinamato. B: Preferencia por longitud de cadena. C: Preferencia por
ramificaciones en el butanol. D: Preferencia por la posición del hidroxilo en el anillo aromático.
Finalmente, la influencia de la posición del hidroxilo en la síntesis de los ésteres del

cumárico se evaluó utilizando metil orto, meta y para cumarato.
Ambas enzimas mostraron el mismo perfil de síntesis de los 3 butil cumaratos, (BmC> BpC>
BoC; Figura 56 D) donde catalizaron preferentemente la síntesis del butil m-cumarato, con
velocidades iniciales de 64.4 y 110.32 U/mol de proteína para AocFae1 y RML,
respectivamente.
La literatura indica que la posición hidroxilo en posición para- tiene un efecto de

impedimento en el sitio catalítico de las lipasas, para el caso RML la capacidad por aceptar
este sustrato bajó hasta 4.06 veces con respecto a su análogo en posición meta, del mismo
modo la preferencia por este sustrato bajó ligeramente (1.23 veces) para el caso AocFae1, lo
cual sugiere nuevamente cierta similitud entre ambas enzimas.
124
La síntesis del butil o-cumarato fue la más lenta, con velocidades de 32.6 y 20.45 U/mol de
proteína respectivamente, la cercanía del grupo hidroxilo con la cadena central vinilo de la
estructura del metil o-cumarato podría ser la razón de la disminución de las velocidades en la
generación de este producto.
Posterior a la presentación de estos resultados, se observó que AocFae1 y RML mostraron

preferencia por sintetizar diferentes productos. Esto sugiere que el uso de ambos
biocatalizadores de forma complementaria puede ser de gran utilidad para la obtención de
una amplia gama de derivados de ácidos hidroxicinámicos.
6.2.4 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO

A pesar de que los sistemas de reacción para feruloil esterasas y lipasas empleados en la
síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos ofrecieron buenos rendimientos con los
catalizadores utilizados, existen algunas ventajas y desventajas de cada uno de ellos. El
sistema utilizado para las Faes ofrece principalmente la posibilidad de utilizar enzimas
líquidas, esto es de particular importancia debido a que pueden ser utilizados desde extractos
crudos hasta enzimas purificadas a homogenidad, sin necesidad de ser sometidas a procesos
de liofilización, inmovilización, etc., que pueden disminuir o mermar significativamente la
actividad del catalizador. Vale la pena mencionar que a su vez el uso de catalizadores sólidos
o inmovilizados no es un obstáculo en este sistema.
Por otra parte, el uso de más del 20% del alcohol permite una alta solubilidad de los sustratos
utilizados, lo cual podría permitir aumentar aún más la concentración de sustrato (50mM), lo
cual sería imposible en el sistema utilizado para lipasas, donde la solubilidad de los sustratos
en el solvente de reacción (isooctano) ya es bastante limitada.
Para llevar a cabo las reacciones de síntesis con los sistemas ternarios usando feruloil
esterasas, son necesarias temperaturas cercanas a la ambiente (30°C), mientras que utilizando
lipasas en el medio de reacción utilizado, son necesarias temperaturas que van desde los
50°C hasta los 70°C. En particular, esta característica hace que el uso de Faes a nivel
industrial sea más viable por los pocos requerimientos energéticos del sistema. Sin embargo,
unas de las principales limitantes del sistema ternario es la dificultad para la recuperación del
producto en casos donde el alcohol tiene puntos de ebullición superiores al isooctano (e.g.
125
octanol). Sin embargo, la posibilidad de utilizar ambos sistemas o catalizadores en la síntesis

de ésteres de hidroxicinámicos sigue siendo una opción bastante atractiva.
La Feruloil esterasa I de Aoc se destacó como un catalizador eficiente en la síntesis de los 4

ésteres butílicos de ácidos hidroxicinámicos, llevando a cabo la síntesis de estos compuestos
a velocidades similares a las de la literatura.
Los perfiles de hidrólisis encontrados para la AocFae1 difirieron ligeramente de los

encontrados en síntesis, por lo cual no deben ser directamente relacionados ni extrapolados
para la predicción de su actividad en síntesis.
El catalizador CALB (Novozyme 435) demostró ser uno de los catalizadores menos
eficientes usando esta clase de sustratos, ya que se evidenció la alta carga proteica en el
inmovilizado para llevar a cabo las reacciones de trasesterificación. No obstante, no se puede
restar la importancia de este catalizador, ya que de acuerdo a la literatura, con respecto a mg
de catalizador, sigue siendo uno de los más eficientes.
La lipasa de Rhizomucor miehei demostró ser el mejor catalizador para llevar a cabo la
síntesis de ésteres de hidroxicinámicos, además su uso puede ser complementario con la
AocFae1 debido a su poca capacidad para aceptar los ácidos más hidrofílicos.
La mejor capacidad de la AocFae1 para utilizar alcoholes ramificados resalta la importancia

de este catalizador, no obstante se necesitan modificar las condiciones de reacción para poder
llevar a cabo la síntesis del éster sec-butílico del ácido ferúlico con una mejor eficiencia,
estudios complementarios en esta reacción en particular, podrían incluso darnos indicios de
la enantioselectividad de esta Fae.
La posición meta en el anillo bencénico contribuye notablemente a un aumento en la

actividad de síntesis tanto de AocFae1 como RML. Mientras que el impedimento estérico o
las interacciones del grupo hidroxilo en posición orto, disminuyen la actividad de síntesis.
El uso de la AocFae1 y RML se propone como una opción para realizar una amplia gama de
ésteres de ácidos hidroxicinámicos complementarios, además en el mediano plazo pueden ser
una alternativa para ser empleados en procesos a escalas mayores.
126
Capítulo 7:Conclusiones generales y perspectivas
CAPÍTULO 7: CONCLUSIONES GENERALES Y

PERSPECTIVAS
127
7.1 CONCLUSIONES GENERALES

En este trabajo de tesis se logró responder muchas de las preguntas inicialmente planteadas
en los objetivos y de este modo fue posible generar las siguientes conclusiones generales:
Los distintos residuos del maíz son de gran utilidad para la inducción preferencial de las
distintas hidrolasas de Aspergillus ochraceus. Mediante esta estrategia se logró identificar
cual era la enzima responsable de catalizar la transesterificación del butil p-cumarato. Sin
embargo, a pesar de que la evidencia señalaba que la misma enzima podía catalizar también
la esterificación de la luteína, se encontró que una enzima distinta a las detectadas
inicialmente es la responsable de catalizar esa reacción. Por lo cual sigue siendo necesaria la
búsqueda, elucidación, purificación y caracterización de la enzima responsable de producir la
dipropionil luteína.
A partir de los estudios realizados aquí, el nejayote debería ser considerado como un residuo
de gran interés para la inducción de este tipo de feruloil esterasas, ya que mejora
considerablemente la actividad específica y los rendimientos de producción son similares a
los encontrados con otros inductores sólidos. Además el uso de éste, a mayor escala,
contribuiría a disminuir el grave problema de polución que genera.
La mejor forma para aislar AocFae1 y tener un preparado enzimático con actividad feruloil
esterasa libre de otras actividades hidrolíticas (lipasas y otras feruloil esterasas) fue mediante
cromatografía de proteínas (FPLC); esta técnica permitió incrementar 32 el factor de
purificación. AocFae1 pudo ser clasificada como una Feruloil esterasa tipo C en base a su
capacidad de hidrólisis de metil hidroxicinamatos.
Mediante el uso de un sistema ternario de reacción fue posible llevar a cabo la síntesis de una
amplia variedad de ésteres de ácidos hidroxicinámicos logrando velocidades iniciales más de
3 veces mayores a lo reportado en la literatura.
El aumento de la velocidad de síntesis de butil ferulato cuando se usa seroalbumina bovina

como protector, sugiere que la estabilidad de la enzima podría ser mejorada para las
condiciones ensayadas (Medio orgánico, temperatura, etc.)
128
La AocFae1 sintetiza de manera preferencial ésteres del ácido cafeico, colocándolo como un
catalizador con cualidades deseables y con potencial uso en procesos a mayor escala. No
obstante, debido a las propiedades de las esterasas, la generación de ésteres de cadenas
superiores a 8 carbonos no es posible, por lo cual el uso de lipasas parece adecuado. En
particular RML demostró ser un catalizador apropiado para la realización de ésteres de
cadena larga de hidroxicinámicos. Lo anterior sugiere que el uso complementario de ambas
enzimas en sus respectivos sistemas de reacción permitiría producir una gran cantidad de
esteres alquílicos de ácidos hidroxicinámicos
Las herramientas metodológicas generadas en este trabajo de tesis permitieron la

dilucidación de la hidrolasa responsable de la síntesis del butil p-cumarato. Lo anterior
posibilita un estudio más racional de hidrolasas de este tipo, realizando la búsqueda y
purificación en función de la actividad de síntesis.
7.2 PERSPECTIVAS
La caracterización detallada de los residuos del maíz, podría mejorar el entendimiento de los
fenómenos de inducción ocurridos durante la fermentación del hongo Aspergillus ochraceus,
además el uso de arabinoxilanos ferulados de distintas conformaciones y grados de
polimerización, así como otros compuestos derivados de ácidos hidroxicinámicos, en estado
puro ayudarían a comprender la influencia y el mecanismo de expresión de las distintas Faes
que este hongo puede producir.
Con la finalidad de obtener parámetros cinéticos comparables con los de la bibliografía

(Kcat, Km, etc.) es necesario purificar a homogenidad la AocFae1 y realizar los ensayos de
síntesis en estas condiciones.
La purificación y caracterización en hidrólisis (con sustratos distintos a los usados en este

trabajo, e.g. arabinoxilanos ferulados) de la AocFae2 podría ayudar a entender el rol
biológico de ambas Faes expresadas por Aspergillus ochraceus. Usualmente los hongos
filamentosos como A. niger y T. stipitatus se valen de la expresión de diversas proteínas con
actividad Fae (tipo A y B) para la hidrólisis de sustratos de diferente índole, como ésteres
metoxilados o hidroxilados, por citar el ejemplo más sencillo, sin embargo en el modelo
129
Aspergillus ochraceus se expresan dos enzimas con perfiles similares, por lo que estudios
más detallados para comprender su papel metabólico son necesarios.
La expresión de la AocFae1 en un huésped adecuado (Pichia pastoris o Aspergillus niger)

podría permitir realizar estudios más finos de la actividad catalítica de esta enzima. Además
abre la posibilidad de realizar ensayos de inmovilización con la finalidad de mejorar la
estabilidad a solventes y temperaturas.
La resolución de la estructura cristalina de la AocFae1, asi como de otras Faes podría

ofrecernos una mejor perspectiva para el entendimiento de distintos fenómenos, como el
posicionamiento del sustrato, y la influencia de la posición del hidroxilo en el anillo
aromático durante la catálisis.
La producción del sec- butil ferulato por la AocFae1, permite la posibilidad de llevar a cabo
estudios de enantioselectividad con esta enzima, al tratarse de un sustrato racémico. La
enantioselectividad en Faes ha sido un tema poco explotado, existiendo solamente dos
reportes en hidrólisis y con sustratos no homólogos a los naturales.
Es necesario identificar, purificar y caracterizar la enzima responsable de la síntesis de la

dipropionil luteína, el cual es un producto de alto valor comercial. Hasta la fecha podemos
descartar las 2 Faes y una sola lipasa de Aoc como responsables de la reacción, por lo que
estudios más profundos son necesarios.
El mejoramiento de los parámetros de reacción para cada producto debería de realizarse con
el objetivo de alcanzar los mejores rendimientos con la AocFae1. De este modo productos de
alto valor biotecnológico pueden realizarse con mayor eficiencia y con posibilidad de
llevarse a una escala mayor.
130
CAPÍTULO 8: BIBLIOGRAFÍA
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142
ANEXOS
143
La Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química, A. C.
"La Interdisciplinariedad en la Ingeniería Química"
Otorga el presente
RECONOCIMIENTO
a:
Mariana Antonieta Armendáriz Ruiz, Daniel Alberto Grajales Hernández, Jorge Alberto Rodríguez
González, Juan Carlos Mateos Díaz
Por la presentación del trabajo:
"VERSATILIDAD CATALíTICA DE LIPASAS: ALGUNAS EVIDENCIAS DE SU ACTIVIDAD

SOBRE ÉSTE RES DE ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS"
ID: 705
XXXV Encuentro Nacional

Puerto Vallarta, Jalisco México, 6 al 9 de Mayo de 2014
Lipases and feruloyl esterases as a tool for the synthesis of
hydroxycinnamic alkyl esters
a a a a b a,*
Daniel A. Grajales , M. Armendáriz-Ruiz , Rosa Camacho-Ruiz , J. A. Rodríguez , A. Asaff Torres , J.C. Mateos Díaz
a
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, 45019 Zapopan, Jalisco. México.
b
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, 83304 Hermosillo, Sonora. México.
INTRODUCTION
Lipases (3.1.1.3) and feruloyl esterases (3.1.1.73) are carboxyl ester hydrolases which natural roll is to release fatty and hydroxycinnamic acids (HA), respectively. Nonetheless, both kinds of enzymes are
able to synthesize hydroxycinnamic alkyl esters (HAE) in the absence of water. HAE possess enhanced biological activity, such as antioxidant, antimicrobial, among others; compared to free HA [1]. Previous
reports showed that some lipases, such as lipase B from Candida antarctica (CALB), Rhizomucor miehei lipase (RML) and Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) catalyze the synthesis of HAE, with
conversion yields around 30-96% in 5 to 10 days [2]. Moreover, RML has been reported as a common ancestor of the feruloyl esterase (FAE) type A from Aspergillus niger, showing an identical topology and
high sequence homology (37%) [3] , and probably explaining why these kinds of lipases perform the aforementioned reactions. Nevertheless, FAEs should be better biocatalysts than lipases for this kind of
reactions, since they are evolutionarily adapted to accept natural HAE as substrates. In this work we compared the initial rate of butyl hydroxycinnamates synthesis using lipases (CALB, RML, TLL), and FAEs
from A. niger (type A and B) and from A. ochraceus (type C), called AnFAEA, AnFAEB and AocFAEC, respectively. The best biocatalysts found (RML and AocFAEC), were further used to compare their
preference towards different alkyl chain length alcohols; primary, secondary and tertiary butanol hydroxyl position; and ortho, meta, para hydroxy substituents of coumaric acid.
METHODOLOGY
FAEs AND LIPASES SOURCE C O N T E N T D E T E R M I N AT I O N O F A C T I V E HYDROXYCINNAMIC ALKYL ESTERS SYNTHESIS ASSAYS
The recombinant AnFAEA and AnFAEB were produced and purified to HAE synthesis were assessed by transesterification using alcohols and
IMMOBILIZED LIPASE
homogeneity as described in [4] and [5] . Native AocFAEC was Active immobilized lipase content was calculated using 50mM of different methyl hydroxycinnamates as substrates. Isooctane
produced by solid state fermentation and purified after three reported specific activity values. Lipase activity in was employed as reaction solvent for lipases and a ternary solvent
chromatographic steps (Hydrophobic, ionic and exclusion commercial immobilized preparations was determined by reaction system, similar to that used by Topakas [7] for FAEs. All results
chromatography). CALB, RML and TLL were commercial immobilized titrimetric methods using tributyrin as substrate [6]. were obtained by HPLC and expressed in units per mol of pure lipase or
preparations from Sigma-Aldrich. FAE. One unit was defined as the amount of enzyme necessary to
synthetize one mol of product per minute.
O
O
O
O O
O
n-BUTYL FERULATE
BUTYL SINAPATE HO
HO
O x-BUTANOL O
x : n-, sec-, tert-
O
O
O
O n-BUTANOL O
LIPASES O
O
O
O
sec-BUTYL FERULATE
R (C) HO
HO
BUTYL FERULATE O (A) HO
METHANOL O
METHYL FERULATE
O HO O
O
R
O METHANOL
tert-BUTYL FERULATE
BUTYL p-COUMARATE METHYL HYDROXYCINNAMATE HO
HO
O VS O
HO O
O n-BUTANOL
O
BUTYL CAFFEATE METHYL o-COUMARATE O
HO
OH METHANOL BUTYL o-COUMARATE
OH
O O
O
FAEs O
METHYL m-COUMARATE
n-BUTANOL
O
BUTYL m-COUMARATE
O
O
R
O
O (B) (D) METHANOL
O n-ROH + OH O OH O
n-ALKYL ALCOHOL HO n-BUTANOL
HO O O
ALKYL FERULATE METHANOL
METHYL FERULATE
Fig 1: Synthesis reactions for lipases HO
METHYL p-COUMARATE
HO
BUTYL p-COUMARATE
and FAEs METHANOL
RESULTS
All enzymes were able to synthesize butyl ferulate (BF; Fig.1.A and Fig. 2), surprisingly Further studies using RML and AocFAEC, were 120 120
AocFAEC RML
CALB showed the lowest initial rate (< 0.25 U/mol of pure lipase). In contrast, performed to compare their alkyl chain length 90 90
AocFAEC and RML showed the highest initial rate (85 and 96 U/mol of pure enzyme, (Fig.1.B) preference during the Ferulic Acid Alkyl 60 60
respectively) for BF synthesis. Moreover, AocFAEC synthesized preferentially butyl Ester (FAAE) synthesis (Fig.3). RML showed a
30 30
broad range specificity, synthesizing all alkyl chain
caffeate (BC) while RML butyl sinapate (BS), both with similar initial rates (around 100
length FAAEs with an initial rate between 56 to 121 0 0
U/mol of pure protein), showing a complementary substrate specificity (Fig. 2). On the
C2 C3 C4 C8 C12 C2 C3 C4 C8 C12
U/mol of pure protein, while AocFAEC synthesized

ALKYL HYDROXICINNAMATE ALKYL HYDROXICINNAMATE
Fig. 3: Alkyl chain lenght preference of AocFAEC and RML in the FAAE
other hand, it is worth noting that RML and AnFAEA synthesized preferentially almost selectively butyl ferulate. synthesis, using different alcohols.
methoxylated esters, showing 2 to 8 fold higher initial rate per mol of pure protein, in
comparison to hydroxylated ones. This behavior could probably be explained by the In addition, the primary, secondary and tertiary 100 AocFAEC 100 RML
similarity between both proteins (37 % homology). Finally, AnFAEB synthesized hydroxyl position of butanol isomers (Fig.1.C) was 80 80
evaluated in the FAAE synthesis ( Fig.4). As 60 60

preferentially hydroxylated HAE, showing a similar pattern as reported for hydrolysis of
expected, AocFAEC and RML synthesized 40 40
HA methyl esters. 20
primary>secondary> tertiary FAAEs. AocFAEC 20
0 0
100 showed 5 fold higher initial rate for the synthesis of n sec tert n sec tert
Butyl sinapate
sec-butyl ferulate than RML. Neither of both BUTANOL ISOMERS BUTANOL ISOMERS
80 Butyl ferulate Fig. 4: Primary, secondary and tertiary position preference of AocFAEC and
enzymes were able to use tert-butanol as substrate. RML in the FAAE synthesis, using butanol isomers.
Butyl p-coumarate
60 Butyl caffeate 120 120
Finally, ortho (o), meta (m) and para (p) Butyl AocFAEC RML
40 C oumarate (B x C ; Fig. 1.D ) isomers were 90 90
synthesized in order to evaluate the hydroxyl 60 60

20 substituents in the aromatic group of coumaric acid
30 30
(Fig. 5). Both enzymes revealed the same profile
0 (BmC> BpC> B oC), synthesizing preferentially 0 0
orto meta para orto meta para
AocFAEC AnFAEA AnFAEB CALB TLL RML
Fig. 2: Comparative initial rate of lipases and FAEs in the synthesis of butyl
BmC with initial rates of 64 and 110 U/ mol of pure BUTYL COUMARATE ISOMERS BUTYL COUMARATE ISOMERS
Fig. 5: ortho-, meta- and para- hydroxyl position preference of AocFAEC and
hydroxycinnamates protein for AocFAEC and RML, respectively. RML in the butyl coumarate synthesis, using methyl coumarate isomers.
CONCLUSIONS REFERENCES
This comparative study using lipases and FAEs, showed its 1. Fiuza, S.M., et al., (2004). Bioorganic & Medicinal Chemistry. 12(13): p. 3581-3589. 2.Chigorimbo-Murefu, N.T.L., et al.,
complementarity and potential for the synthesis of HAE. (2009). Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 56(4): p. 277-282. 3.Hermoso, J.A., et al., (2004). Journal of
ACKNOWLEDGMENTS Molecular Biology. 338(3): p. 495-506. 4.Record, E., et al., (2003). Applied Microbiology and Biotechnology. 62(4): p. 349-
To the program “Ciencia Básica SEP-CONACYT” project 355. 5. Levasseur, A., et al., (2004). Protein Expression and Purification. 37(1): p. 126-133. 6.Rogalska, E., et al., (1993).
242544-2014 for the funding Chirality. 5(1): p. 24-30. 7. Topakas, E., et al., (2003). Enzyme and Microbial Technology. 33: p. 729-737.

Daniel Alberto Grajales Hernández

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

INDUCCIÓN DE LIPASAS/ FERULOIL ESTERASAS DE

I.BQ. DANIEL ALBERTO GRAJALES HERNÁNDEZ

GUADALAJARA, JAL. MAYO 2015.

Por lo anterior, los esfuerzos de este trabajo se concentraron en identificar la hidrolasa

Posteriormente, se realizó la purificación parcial de la AocFae1 usando cromatografía de

La proteína se evaluó en la síntesis de ésteres de ácidos hidroxicinámicos usando un sistema

Por otra parte, se evaluó la AocFae1 en la síntesis de dipropionil luteína (DPL).

El principal interés de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos radica en su actividad

Por otra parte, la luteína es un dihidroxicarotenoide encontrado comúnmente en los

Los capítulos dos y tres describen la problemática, hipótesis, objetivos y metodología

En el cuarto capítulo se muestra un estudio comparativo de la fermentación en medio

En el sexto capítulo, con el catalizador (AocFae1) libre de otras actividades contaminantes,

CAPÍTULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 BIOCATÁLISIS COMO HERRAMIENTA BIOTECNOLÓGICA.

El catalizador sólo es un intermediario, y no forma parte de la reacción química, por lo cual

sustratos se encuentran en estado gaseoso y es catalizada en varios pasos por un catalizador

Las enzimas son biocatalizadores extremadamente eficientes, ya que en algunos casos

1.1.2.1 MERCADO DE LOS BIOCATALIZADORES EN LA

Actualmente, la mayoría de los biocatalizadores producidos son utilizados para la generación

Por lo anterior, en la actualidad el descubrimiento y estudio de nuevos biocatalizadores es

1.2.1 INTERACCIONES ENZIMA-SUSTRATO.

1.2.1.1 MODELO DE MICHAELIS-MENTEN.

De la ecuación de Michaelis-Menten, se derivan dos constantes que ayudan a comprender la

Figura 4. Gráfico hiperbólico de la ecuación de Michelis-Menten y su ecuación. El eje de las X corresponde al

1.2.2 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS.

La EC recurre a una nomenclatura, en la que se utilizan 4 números separados por un punto

1.2.3 HIDROLASAS: ENZIMAS VERSÁTILES EN LA INDUSTRIA.

Tabla 1. Clasificación de las enzimas de acuerdo con la Enzyme Commission.

6 Ligasas Unen dos moléculas para dar lugar a una nueva

1.2.4 CARBOXIL ÉSTER HIDROLASAS.

1.2.5 LIPASAS Y ESTERASAS.

Figura 5. Ejemplos de ésteres insolubles, solubles o parcialmente solubles en agua.

Tabla 2. Tabla de lipasas comerciales y su aplicación industrial.

Síntesis quiral Lipase AK “Amano” (Pseudomonas fluorescens) Amano

Fideos y Mejoramiento de la calidad de los fideos Noopazyme® Novozymes

pastas y pastas basadas en trigo

Suplemento dietético Lipase L036P-L036P (Rhizopus oryzae) Biocatalysts

Usos variados Lypolyve CC (Candida cylindracea) Lyven

Fuente: Houde, 2004 [39]

1.2.5.1 MOTIVOS ESTRUCTURALES

1.2.5.2 LA FUNCIÓN DEL LID EN LAS LIPASAS/ESTERASAS

1.2.5.3 EL plegamiento /.

1.2.5.4 LA TRIADA CATALÍTICA Y EL MECANISMO DE REACCIÓN

Esta triada catalítica es la responsable de llevar a cabo la reacción de hidrólisis en la gran

1.2.6 El GRUPO DE LAS CARBOHIDRATO ESTERASAS.

1.2.7 FERULOIL ESTERASAS: FAES.

1.2.7.1 CLASIFICACIÓN DE LAS FAES Y LOS SUSTRATOS PARA SU

sido en base a las diferencias de estructura y de homología de secuencia. La primera y más

Tabla 3. Clasificación de las Faes de acuerdo a Crepin.

Tabla 4. Sustratos utilizados para la determinación de la actividad feruloil esterasa.

Metil 5-O-(trans- Ésterificación catalizada

4-nitrofenil 2-O-(E) Secuencia

posiciónes 2, 3 y 4) catalizada por lipasas

Umbeliferil 5-O-feruloil- Catalisis química de 3

Fuente: Rámirez, 2015 [51]

1.2.8 HISTORIA DE LAS FAES.

1.2.8.1 PRIMEROS HALLAZGOS E INCIDENCIA DE FAES.

En 1990, Borneman propone el uso de metil ésteres de ácidos hidroxicinámicos (Tabla 3 y 4)

1.2.8.2 Aspergillus niger COMO PRODUCTOR DE FAES CON DIFERENTE

La FaeI y FaeIII se caracterizaron utilizando los cuatro metil hidroxicinamatos, y 11 sustratos

cumárico>ferúlico>>>sinapínico). Del mismo modo la CinnAE fue capaz de hidrolizar los

1.2.8.3 COMPRENSIÓN DEL FENÓMENO DE INDUCCIÓN DE LAS