UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO

BIOLÓGICAS

“IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
RELACIONADOS CON EL BIODETERIORO DEL
BALUARTE DE SAN CARLOS, DE LA CIUDAD DE SAN
FRANCISCO DE CAMPECHE, MÉXICO”

T E S I S

EN OPCIÓN AL TITULO DE:

BIÓLOGO

PRESENTA:

ROCIO GUADALUPE ESCAMILLA PÉREZ

SAN FRANCISCO DE CAMPECHE, CAMP., MÉXICO 2010

 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO

BIOLÓGICAS

“IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
RELACIONADOS CON EL BIODETERIORO DEL
BALUARTE DE SAN CARLOS, DE LA CIUDAD DE SAN
FRANCISCO DE CAMPECHE, MÉXICO”

T E S I S

EN OPCIÓN AL TITULO DE:

BIÓLOGO

PRESENTA:

ROCIO GUADALUPE ESCAMILLA PÉREZ

SAN FRANCISCO DE CAMPECHE, CAMP., MÉXICO 2010

 DEDICATORIA 

A Dios
A quien le debo todo lo que soy y sobre todo el haberme permitido
alcanzar una meta más en mi vida.

A mi familia:
A mi madre Rosa María Pérez Chúc, por su amor, sacrificio y
permitirme concluir esta faceta de mi vida. A mis hermanos Michael
del Jesús Escamilla Pérez y Yajairo Emmanuel Escamilla Pérez, por
su apoyo.

Compañeros y Amigos
Por alentarme, apoyarme y brindarme su amistad, a lo largo de estos
años de trabajo. Si los nombro, no terminaría.

A mi novio
Por su invaluable apoyo y compañía para la culminación de este
trabajo.
 AGRADECIMIENTOS

Al proyecto:
“Influencia del entorno urbano en los procesos de degradación de edificios
militares y religiosos de la época colonial en la ciudad de Campeche”,
financiado por el Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Campeche
clave CAMP-2005-C01-028.

A mis Asesores:
Dr. Javier Reyes Trujeque
Dr. Víctor Monteón Padilla

A los centros de investigaciones:

En corrosión (CICORR), enfermedades tropicales (CIET) de la Universidad

Autónoma de Campeche; al Centro de Investigaciones Avanzadas
CINVESTAV-UNIDAD MÉRIDA y al Centro de Ecología Pesquerías y
Oceanografía del Golfo de México (EPOMEX), en especial al Dr. Maurilio
Lara.

A los Directores, profesores investigadores y todo el personal administrativo,

los cuales me acogieron y facilitaron sus equipos, laboratorios etc., durante
el desarrollo del trabajo experimental.
 RESUMEN  

Se sabe que los microorganismos pueden ser los responsables de la

destrucción de edificios históricos. Dentro de este marco se define al
biodeterioro del patrimonio cultural, como el daño físico o químico efectuado
por microorganismos biológicos en objetos, monumentos o edificios
pertenecientes a la propiedad cultural, es influido por dos factores
fundamentales: el medio ambiente y los organismos que crecen sobre o dentro
del sustrato a degradar.

Por lo que cada microorganismo posee una forma peculiar de degradar

dicho patrimonio, en este trabajo se presentan los resultados obtenidos
mediante técnicas de biología molecular (Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR), por sus siglas en Ingles y Electroforesis); y de microscopía
(Microscopía óptica, Microscopía electrónica de Barrido (MEB)) y técnicas de
Espectroscopia (Espectroscopia de Rayos por Energía Dispersiva (EDS)); para
la identificación de los microorganismos relacionados con el biodeterioro del
Baluarte de San Carlos de la ciudad de San Francisco de Campeche, el cual
forma parte del complejo histórico Arquitectónico reconocido por la UNESCO
como Patrimonio Cultural de la Humanidad desde el año de 1999.

Los resultados indican que los microorganismos relacionados con el

biodeterioro del Baluarte de San Carlos son principalmente bacterias
(pertenecientes al Phila cianobacteria, protobacteria y actinomicete).
Encontrándose en todas las muestras colectadas del Baluarte de San Carlos.
Desde las formas cocoides hasta las filamentosas, las cuales son
potencialmente dañinas de las edificaciones históricas. De igual manera, en el
Baluarte, se muestra la ausencia de microorganismos eucariontes como los
hongos.
 ÍNDICE 
Pag.
I INTRODUCCIÓN 1
II OBJETIVOS 3
3.1 Objetivo general 3
3.2 Objetivos particulares 3
III HIPÓTESIS 4
IV MARCO TEÓRICO 5
4.1 Antecedentes 5
4.2 La roca y la construcción de edificios históricos 5
4.3 El deterioro en monumentos pétreos 6
4.4 Ubicación del área de estudio 8
4.4.1 Materiales de construcción del Baluarte de San Carlos 10
4.5 Biodeterioro 11
4.5.1 Tipos de biodeterioro 12
4.5.1.1 Biodeterioro físico-mecánico 12
4.5.1.2 Biodeterioro estético 13
4.5.1.3 Biodeterioro químico asimilatorio 13
4.5.1.4 Biodeterioro químico desasimilatorio 13
4.5.2 Microorganismos implicados en el biodeterioro pétreo 13
4.5.2.1 Bacterias 13
4.5.2.2 Algas. 16
4.5.2.3 Hongos 16
4.5.2.4 Líquenes 17
4.6 Técnicas y métodos de detección de microorganismos 18
V MATERIALES Y MÉTODOS 19
5.1 Trabajo de campo 19
5.1.1 Muestreo 19
5.1.2 Observación macroscópica 19
5.2 Trabajo de laboratorio 21
5.2.1 Procesamiento de las muestras 21
5.2.1.1 Observación microscópica 21
5.2.1.2 Análisis microbiológico 22
5.2.1.2.1 Extracción de ADN 22
5.2.1.2.2 Determinación de la concentración del ADN 22
5.2.1.2.3 Amplificación del gen 16S y 18S del rADN por PCR 22
5.2.1.2.4 Purificación de los productos de PCR 23
5.2.1.2.5 Secuenciación de los productos de PCR 24
5.3 Trabajo de gabinete 24
5.3.1 Identificación de secuencias 24
5.3.2 Tratamiento de la información 24
VI RESULTADOS 25
6.1 Trabajo de Campo 25
6.1.1 Observación macroscópica del Baluarte de San Carlos 25
6.2 Trabajo de laboratorio 27
6.2.1 Observación microscópica 27
6.2.2 Análisis morfológico y elemental mediante (MEB/EDS) 33
6.3 Análisis microbiológicos 40
6.3.1 Obtención del ADN 40
6.3.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa 41
6.3.3 Purificación de los productos de PCR 42
6.4 Trabajo de Gabinete 43
6.4.1 Secuenciación 43
VII DISCUSIÓN 45
VIII. CONCLUSION 51
IX REFERENCIAS 52
X ANEXOS 59
10.1 Anexo A 59
10.1.1 Estudios Microscópicos, Químicos y Biológicos 59
10.2 Anexo B 59
10.2.1-. Medio de Agar-Sangre 59
10.2.2 Soluciones 60
10.3 Anexo C 61
10.3.1 Técnica de Microscopía Electrónica de Barrido acoplado 61
(MEB/EDS)
10.3.2 Técnica de extracción de ADN con FCI 62
 ÍNDICE DE FIGURAS
Pag.
Figura 1 Ubicación geográfica del estado de Campeche 9
Figura 2 Sitio de muestreo del centro histórico de la ciudad de San
Francisco de Campeche, Campeche. 9
Figura 3 Vista de planta del Baluarte San Carlos 19
Figura 4 Esquema de muestreo realizado en el Baluarte San Carlos 19
Figura 5 Cara oeste y suroeste del Baluarte de San Carlos 26
Figura 6 Cara este del Baluarte de San Carlos 26
Figura 7 Cara sur del Baluarte de San Carlos 27
Figura 8 Cara norte del Baluarte de San Carlos 27
Figura 9 Micrografías de las muestras recolectadas del Baluarte de
San Carlos 30
Figura 10 Micrografías de microorganismos provenientes del Baluarte
de San Carlos, obtenidas mediante microscopia óptica 31
Figura 11 Micrografías de protozoos en las muestras recolectadas 32
Figura 12 Micrografías electrónicas MEB/EDS del Baluarte de San
Carlos 35
Figura 13 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes
de la cara norte del Baluarte de San Carlos 36
Figura 14 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes
de la cara sur del Baluarte de San Carlos 37
Figura 15 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes
de la cara oeste del Baluarte de San Carlos 38
Figura 16 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes
de la cara suroeste del Baluarte de San Carlos 38
Figura 17 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes
de la cara este del Baluarte de San Carlos 39
Figura 18 Análisis de integridad de las muestras y controles 40
Figura 19 Perfiles obtenidos de las muestras, utilizando cada uno de 41
los primers 41
Figura 20 Muestras de ADN purificadas 43
 ÍNDICE DE TABLAS 

Pag.
Tabla 1 Factores de alteración 7
Tabla 2 Ejemplos de la caracterización de materiales alterados 7
Tabla 3 Actividades microbianas que afectan la roca 18
Tabla 4 Estudios Microscópicos, Químicos y Biológicos 59
Tabla 5 Codificación de muestras recolectadas del Baluarte de San
Carlos 20
Tabla 6 Secuencias de los primers usados 23
Tabla 7 Descripción de las muestras tomadas de cada cara del
Baluarte de San Carlos 28
Tabla 8 Análisis elemental de las muestras del Baluarte de San
Carlos 33
Tabla 9 Concentración y pureza del ADN 40
Tabla 10 Muestras amplificadas 42
Tabla 11 Afiliación taxonómica de los microorganismos identificados
en muestras provenientes del Baluarte de San Carlos 44
 I  INTRODUCCIÓN 

Desde la antigüedad, las rocas son utilizadas ampliamente por sus

características estructurales y durabilidad, como material básico en la
construcción de obras monumentales que posteriormente adquieren valor
histórico-cultural. Estas edificaciones pétreas son susceptibles al deterioro, sea
de tipo natural o antropogénico. Aunque los procesos naturales son lentos, las
diversas actividades de la sociedad industrializada están contribuyendo a una
aceleración dramática en la velocidad con que ocurre el deterioro (Martín,
1990). Durante mucho tiempo el deterioro biológico o biodeterioro se consideró
poco importante, sin embargo, hoy se sabe que, no sólo causa cambios en la
estética del monumento, sino también un conjunto de procesos de alteración
mecánica y química más profundos, que son propiciados no sólo por
macroorganismos (plantas y animales superiores), sino también por aquellos
que no se pueden observar a simple vista, los microorganismos (Nimis, 2001;
De los Ríos et al. 2008).

La investigación dirigida específicamente al deterioro microbiano de

materiales se refiere fundamentalmente a la aclaración de los mecanismos
implicados, la identificación y fisiología de los organismos involucrados, siendo
el control o prevención del daño el propósito final.

1
 En la actualidad las áreas particularmente activas en la investigación
sobre el biodeterioro son las biopelículas y el desarrollo de técnicas
moleculares para el estudio de los agentes causantes de deterioro microbiano
(Dennis, et al., 2004). Esto resulta de gran importancia para poder proteger y
conservar nuestro Patrimonio Artístico y Cultural.

En este sentido, las edificaciones coloniales de carácter civil, militar y

religioso de la cuidad de San Francisco de Campeche construidas durante los
siglos XVI al XVIII y que en 1999 fueron declaradas Patrimonio Cultural de la
Humanidad por la UNESCO, muestran en la actualidad, visibles signos de
actividad microbiológica. Por consiguiente el presente trabajo busca la
identificación de microorganismos relacionados con el biodeterioro del Baluarte
de San Carlos, una estructura militar representativa del sistema defensivo de la
ciudad. Para ello se utilizaron técnicas de biología molecular como la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR); y las técnicas de análisis de materiales
como Microscopía Electrónica de Barrido (MEB); y Espectroscopia de Rayos X
por Energía Dispersiva (EDS).

Este estudio, es parte del proyecto de investigación “Influencia del

entorno urbano en los procesos de degradación de edificios militares y
religiosos de la época colonial en la ciudad de Campeche”, financiado por el
Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Campeche (Reyes, 2005), con
lo que se busca profundizar la comprensión del biodeterioro por
microorganismos en monumentos históricos en San Francisco de Campeche,
México, donde investigaciones relacionadas con este tema resultan escasas.

2
 II  OBJETIVOS 
 
2.1-. Objetivo general

Identificar microorganismos relacionados con el biodeterioro del Baluarte

San Carlos, de la ciudad de San Francisco de Campeche, México.

2.2.- Objetivos particulares

Realizar una caracterización morfológica y química de las colonias

microbianas presentes en el Baluarte de San Carlos, de la ciudad de San

Francisco de Campeche, mediante el empleo de técnicas microscópicas y

espectroscópicas.

Adaptar una metodología de estudio basada en técnicas de Biología

Molecular para la identificación de la microbiota relacionada con el biodeterioro

del Baluarte de San Carlos.

Utilizar el programa informático BLAST, para la identificación de

secuencias homólogas entre la base de datos del NCBI y de los
microorganismos presentes en el Baluarte de San Carlos.

3
 III  HIPÓTESIS

El biodeterioro es un suceso natural, observado en casi todo tipo de

material, por lo que en el baluarte de San Carlos de la ciudad de San Francisco

de Campeche construido con materiales calizos, se espera encontrar

microorganismos relacionados con el biodeterioro.

4
 IV  MARCO TEÓRICO
4. 1.- Antecedentes

En la ciudad de San Francisco de Campeche se tienen investigaciones

realizadas por Chiquini (2003), quien caracterizó la microflora en la fachada de
su Catedral, mediante el uso de técnicas microbiológicas. Reportando la
presencia de bacterias y de hongos, en diferentes tipos de substratos. Mientras
que Jurado, et al., (2007) realizó un estudio en la Iglesia de San Roque,
localizada en el centro histórico, de la ciudad, utilizando técnicas moleculares,
para la identificación de microorganismos relacionados con el biodeterioro de
las superficies pétreas de la iglesia.

Ortega-Morales et al., (1998, 2000, 2001, 2004); realizaron varias

investigaciones de biopelículas microbianas en monumentos Mayas, en la
península de Yucatán, con el objetivo de identificar a los microorganismos, que
están participando en el biodeterioro de las edificaciones históricas-culturales.

Por otra parte Reyes, (2004) y Gutiérrez (2008) caracterizaron las

costras de deterioro formadas en las superficies pétreas de edificios históricos
de la ciudad, mediante técnicas microscópicas y espectroscópicas, reportando
la naturaleza biológica de dichas costras.

Pero dichas investigaciones son rebasadas por el amplio material a

estudiar y la carencia de grupos de investigación consolidados dedicados al
tema del biodeterioro en la región.

4.2.- La roca y la construcción de edificios históricos

Las rocas son agregados minerales formados por procesos naturales de

amplia distribución en la corteza terrestre. Los diferentes tipos de rocas se
establecen en función de dos características esenciales: sus componentes
minerales (mineralogía) y su modo de agregación (textura).

5
 Dichas características se conocen como características petrográficas y
dan lugar al aspectos distintivos de los diferentes tipos rocosos (Alonso et al.,
2006).

La roca es un material tradicionalmente utilizado en la construcción por

propiedades como dureza, resistencia y durabilidad. Su uso como un medio de
expresión artística se extiende desde la edificación de monumentos antiguos y
edificios históricos a estatuas en pequeña escala. Los materiales utilizados
para éstas edificaciones, tanto en épocas pasadas como actuales, se sitúan
entre los más abundantes de cada zona (Warscheid y Braams, 2000; Alonso et
al., 2006).

En esté caso, la cuidad de San Francisco de Campeche, está situada en

la península de Yucatán, donde las rocas sedimentarias producidas por la
descomposición y sucesiva reconsolidación de materiales ígneos; en especial
las areniscas y calizas son las más comunes de ésta región, por lo que éste
material se utiliza tradicionalmente desde tiempos prehispánicos tal y como lo
demuestran la gran cantidad de vestigios mayas existentes en la región (Martin,
1990).

4.3.- El deterioro en monumentos pétreos

La alteración de los materiales de construcción no es un fenómeno

reciente pues ya era conocido desde la antigüedad. En este sentido el
patrimonio construido de muchas ciudades con edificaciones se ve amenazado
por el deterioro, lo que provoca perdidas irreparables de carácter histórico,
cultural y económico.

Para poder caracterizar los materiales pétreos dañados, se analizan los

factores de alteración, los cuales son capaces de inducir cambios en las
propiedades del material pétreo, a través de determinados mecanismos, que
conduce a modificaciones perjudiciales en una o más propiedades del material
(Martín, 1990; Videla, 2000; Gómez de Saravia, 2001).

6
 Los principales factores que afectan a una edificación pétrea, según la
clasificación establecida por ASTM E-632 (Standard Practice for Developing
Accelerated Tests to Aid Prediction of the Service Life of Building Components
and Materials), se encuentran citados en la Tabla 1.

Tabla 1 Factores de Alteración

FACTORES DE ALTERACIÓN

Ambientales Biológicos
Organismos vivos como los:
Radiación solar, temperatura, agua,
microorganismos, animales, plantas
contaminantes del aire y el viento.
inferiores y superiores.
De uso De incompatibilidad
Diseño del edificio, mantenimiento, Interacciones químicas y físicas perjudiciales
desgaste y abrasión. entre los diferentes materiales.

De tensión
Las cargas sostenidas del peso de
edificio y viento.

La Tabla 2 señala algunos ejemplos de caracterización de materiales

alterados, indicándose los factores de alteración que, a través de ciertos
mecanismos, producen cambios en el material que pueden evidenciar el
proceso que se está llevando a cabo (Martín, 1990).

Tabla 2 Ejemplos de la caracterización de los materiales alterados

FACTORES DE INDICADORES DE
MECANISMOS DE ALTERACIÓN
ALTERACIÓN ALTERACIÓN
Cristalización en la superficie de Ca
CO2 y/o SO3 en
CO3 y/o CaSO4 en calizas puras Concreciones
presencia de agua
porosas
CO2 en presencia Solubilización por formación de Ca Costras
de agua (H2CO3) en Areniscas Incrustaciones
Efectos volumétricos: ciclos de
Agua Disyunciones
humectación/secado e hielo/deshielo.
Smog y sustancias Costras negras
Ataque químico de la roca
orgánicas ác. Disgregación
Costras, Decohesión
Agua Solubilización de calizas
/intergranular

7
 En general el deterioro de los materiales pétreos puede ser de manera
natural o antropogénica. El deterioro antropogénico es debido a la acción
humana, por ejemplo: la modernización, la delincuencia, la contaminación, las
guerras y sus efectos son palpables a corto plazo. Por otra parte el proceso
natural, diverge en dos vertientes: el llamado intemperismo y el factor biológico
o biodeterioro.

El intemperismo tiene origen en lentos procesos de alteración

ocasionados por el agua, aire, temperatura, humedad, radiación solar, etc., que
causan degradación de las rocas por pérdida de compacidad y de coherencia;
la alteración de minerales, movilización de sales y aparición de microfracturas
que facilitan el asentamiento de microorganismos. Mientras el biodeterioro es
ocasionado por los organismos vivos como: plantas superiores, animales,
insectos y microorganismos (Martín, 1990; Saiz-Jiménez y Ariño, 2000;
Warscheid y Braams, 2000; Dennis et al., 2004;).

Dentro del deterioro natural, los factores implicados actúan de manera

natural y sinérgica en las construcciones pétreas. Sin excepción alguna, el
patrimonio cultural de la cuidad de San Francisco de Campeche, muestra
indicadores de alteración tanto en edificaciones mayas como coloniales (Corvo
et al., 2009).

4.4.- Ubicación del área de estudio

El Baluarte de San Carlos, se encuentra en la ciudad de San Francisco de

Campeche, capital del estado de Campeche. Situado al sureste de la República
Mexicana en la parte occidental de la Península de Yucatán, (limita al norte y
noroeste con el estado de Yucatán, al este con el estado de Quintana Roo y
Belice, al sur con la República de Guatemala y el estado de Tabasco y al oeste
con Tabasco y el Golfo de México) (Figura 1).

8
 Figura 1 Ubicación geográfica del estado de Campeche

Dentro de la ciudad, el Baluarte de San Carlos se ubica entre las calles 8

y Circuito Baluarte, del Centro Histórico. El Baluarte fue ignaurado el 15 de
noviembre de 1676, pero fue hasta el 18 de diciembre del año siguiente cuando
concluye su construcción. Ocupa una superficie de 1,549.21m2. Tiene forma
pentagonal y está construido con mampostería de roca calcárea, sascab y
cantera. Actualmente, es el Museo de la Ciudad (Gutiérrez, 2008) (Figura 2).

Figura 2 Sitio de muestreo dentro del centro histórico de la ciudad de San Francisco
de Campeche, Campeche (Google earth, 2008).

9
 El estado de Campeche, cuenta con tres tipos de climas: Am cálido
húmedo con abundante lluvia en verano, AW cálido subhúmedo con lluvias en
verano y BS1(h') seco cálido. En general, el clima en el municipio de
Campeche es cálido subhúmedo. Presenta una precipitación pluvial de 1,300 a
1,500 mm; el período de lluvias es de junio a octubre y la temperatura media
anual es de 27°C (Reyes, 2005).

4.4.1.- Materiales de construcción del baluarte de San Carlos

El Baluarte de San Carlos fue edificado con tres tipos diferentes de

materiales: rocas calcáreas, cantera y mortero; de igual forma la mayoría de las
construcciones campechanas del periodo colonial, fueron edificadas utilizando
una técnica regional para la elaboración de los muros, conocida como
mampostería; de igual forma el mortero utilizado como liga y para el revoco,
contemplan el uso de un material propio de la Península de Yucatán
denominado comúnmente sascab (Huitz, 2005).

La mampostería, es una construcción o parte de ella realizada a base de

piedras sin labrar, aparejadas en forma irregular unidas entre sí por un material
cementante llamado mortero (Chiquini, 2003). Las rocas utilizadas en la
mampostería de las construcciones del centro histórico de la ciudad de San
Francisco de Campeche, provienen de las formaciones calcáreas circunvecinas
a la ciudad (INEGI, 1984) las cuales geológicamente son de origen
sedimentario, constituidas principalmente por carbonato de calcio, bajo la forma
mineral de calcita y en menor cantidad de dolomía y aragonita (Diario Oficial de
la Federación, 1996).

Las rocas calcáreas son aquellas que por calcinación se transforman en

cal, pudiendo ser de varios colores, desde blancas hasta negras, de grano fino
y compactas. Su dureza es de tres en la escala de Mohs, ya que la calcita es
su principal componente.

10
 Por otra parte la cantera, es el nombre que se le da un segundo tipo de
roca sedimentaria, de origen orgánico y naturaleza calcárea, en la cual se
pueden observar a simple vista restos de animales marinos como moluscos y
foraminíferos. Mientras que los morteros, son mezclas elásticas y plásticas
cuyos principales componentes son la arena y el agua. Los cuales son
empleados con una doble función, como revestimiento de superficies débiles
tales como columnas, paredes, etc.; y como material de unión, ya sea entre
ladrillos, rocas y sillares (Morales, 2004; Martínez-Ramírez et al., 2008).

4.5.- Biodeterioro

Hueck (1965, 1968) definió el biodeterioro como cualquier cambio

indeseable en las propiedades de un material causado por la actividad de los
seres vivos. Que conlleva a procesos físicos de disgregación o químicos de
descomposición.

Un factor importante para la colonización del material pétreo es la

presencia de materia orgánica, fuente de carbono necesaria para el
metabolismo microbiano. En muchos casos son aportados por las deyecciones
de las aves, que enriquecen el substrato (Saiz-Jiménez y González, 2008).

La colonización del substrato pétreo por microorganismos se ve

influenciada por la naturaleza química, estructura física y origen geológico de
las rocas; sales minerales y substancias orgánicas presentes en la superficie,
calidad del aire, luminosidad, contenido de agua y temperatura (Camuffo, 1995;
Caneva et al., 1995; Dolske, 1995; Mitchell y Gu, 2000). Por lo tanto agentes
físicos, químicos y biológicos se encuentran asociados y actúan
sinergéticamente en el deterioro (Warscheid and Braams, 2000; Videla, 2001;
De la Rosa, et al., 2002).

Si el proceso de biodeterioro del material pétreo es superficial, ocurre

por la acción de microorganismos epilíticos, mientras que, si es interno, se dice
que lo causan microorganismos endolíticos (Alonso et al., 2006; Gómez et al.,
1995; Gómez-Alarcón et al., 1995).

11
 A la facilidad de colonización de un substrato se conoce como
bioreceptividad. En monumentos pétreos la bioreceptividad es variada, debido
a que pueden crear diferentes condiciones microclimáticas en zonas muy
reducidas (cornisas, hendiduras, superficies expuestas entre otros), que
resultan idóneas para el desarrollo de microorganismos (Ariño y Gómez, 2001).

Entre los mecanismos de biodeterioro destacan los siguientes:

a) Excreción de ácidos orgánicos e inorgánicos, que atacan los minerales
que conforman el substrato pétreo.

b) Excreción de sustancias poliméricas extracelulares que absorben agua,

formando los llamados biofilms o biopelículas, que modifican la
absorción y difusión del agua dentro del material pétreo.

c) Producción de costras o pátinas que originan pérdida de material por

su posterior desprendimiento.

d) Daño mecánico producidos por el crecimiento de microorganismos en

el interior las rocas, que originan la aparición de microfisuras que
sensibilizan al material pétreo (Aparecida de Resende, 2001; Gómez
de Saravia, 2001; Videla et al., 2003).

4.5.1.- Tipos de biodeterioro

De acuerdo a los efectos producidos por los organismos sobre el

substrato ya sea orgánico o inorgánico, existen diferentes tipos de biodeterioro
entre los que se tienen los siguientes (Dennis et al. 2004):

4.5.1.1.- Biodeterioro físico-mecánico

El organismo altera o distorsiona el material por su crecimiento o

movimiento y no lo utiliza como fuente nutritiva.

12
4.5.1.2.- Biodeterioro estético

Se debe a la simple presencia de un organismo (vivo o muerto) ó sus

productos metabólicos, los cuales causan el manchado superficial. En muchos
casos, el biodeterioro estético se produce simplemente por la presencia de una
película superficial de microorganismos (biofilm) y sus productos.

La formación de biopelículas microbianas, son de gran importancia por la

compleja relación entre comunidades microbianas sésiles, caracterizadas por
células adheridas irreversiblemente a un substrato, encerradas en una matriz
de sustancias extracelulares poliméricas de naturaleza polisacárido, pueden
producir modificaciones en los valores de pH, concentraciones iónicas y
condiciones de óxido-reducción en la interfase entre el substrato y el medio
circundante, causando alteraciones químicas y físicas en la roca (Ortega-
Morales et al., 1998; Videla y Saiz-Jiménez, 2001; Gorbushina et al., 2002;
Guiamet et al., 2005; Little y Ray, 2005).

4.5.1.3.- Biodeterioro químico asimilatorio

Este tipo de biodeterioro se debe a que los organismos vivos utilizan el

substrato, donde se encuentran, como fuente nutritiva o energética.

4.5.1.4.- Biodeterioro químico desasimilatorio

El material sufre alteraciones químicas, pero no como un resultado

directo del consumo de éste por los organismos, sino por productos
excretados, compuestos pigmentados o ácidos que afectan el material pétreo.

4.5.2.- Microorganismos implicados en el biodeterioro pétreo

En general la microflora presente en los edificios históricos, constituye

un complejo ecosistema donde el substrato principal es el material pétreo, el
cual sufre deterioro debido a la actividad microbiana.

13
 Entre los microorganismos que intervienen en el biodeterioro, se
encuentran, las bacterias, algas, hongos y líquenes principalmente.

4.5.2.1.- Bacterias

Son organismos unicelulares procariontes, incluyendo tanto organismos

autótrofos como heterótrofos. Generalmente poseen una pared celular
compuesta por peptidoglicano. Entre las bacterias que atacan a los
monumentos y edificios pétreos pueden mencionarse las tiobacterias, las
silicobacterias y las bacterias nitrificantes (Videla et al., 2000).

Por otro lado Kumar y Kumar (1999) señalan que en ambientes

tropicales se diferencian tres grupos de bacterias como posibles causantes del
deterioro en estructuras pétreas:
a) Bacterias quimioautotróficas sulfuoxidantes. Pueden degradar
la roca por la producción de ácidos inorgánicos, como sulfúrico (H2SO4), que
reacciona con los componentes de la roca para formar costras de compuestos
sulfatados (por ejemplo, yeso). Dichos compuestos pueden ser disueltos por
el agua de lluvia, o precipitados y recristalizados en el interior de los poros de
la roca, causando exfoliaciones.

Las rocas de origen calcáreo son más susceptibles a estos procesos.

Las bacterias nitrificantes, por su parte, oxidan el amoníaco (NH3) a nitrito (NO2-
) e iones nitrato (NO3-), para posteriormente formar ácido nítrico (HNO3), que
disuelve la roca y origina la aparición de eflorescencias de sales solubles de
NO3- (Videla et al., 2003).

b) Bacterias heterótrofas. Este grupo, que también incluye

Actinomicetes, que son especialmente activas en rocas calizas y areniscas
calcáreas. Su mecanismo de degradación ocurre por la acción de ácidos
biogénicos, que disuelven la roca a través de la movilización de cationes como
calcio (Ca), fierro (Fe), manganeso (Mn), aluminio (Al), y silicio (Si); mientras
otras provocan decoloración superficial.

14
 c) Cianobacterias. Las cianobacterias, son un filo del reino Bacteria
comúnmente conocidas como cianófitas o cianofíceas, son un grupo
morfológicamente diverso de procariontes fototrópicos. Poseen la habilidad de
sintetizar clorofila a. Su principal característica es la presencia de dos
fotosistemas y el uso de agua como fotoreductante en la fotosíntesis. Esto
ocurre en ambientes iluminados y tienen una gran diversidad morfológica. En
tamaño, su rango va desde formas unicelulares de menos de 1µm de ancho
hasta formas filamentosas de 5-100 veces más grandes que las bacterias
(Gómez de Saravia, 2001).

Las cianobacterias producen deterioro estético, físico y mecánico del

substrato pétreo. Por sus características fototrópicas y autotróficas, son
generalmente los colonizadores primarios de las rocas, sirviendo luego como
fuente de carbono para el crecimiento de las comunidades bacterianas y
fúngicas heterotróficas. Estos microorganismos oxidan algunos minerales de
Fe y Mn, ocasionando la disolución de los cationes de la roca y cambios
cromáticos superficiales.

Son los principales responsables de la formación de costras

pigmentadas, generalmente de color oscuro que afectan al substrato
estéticamente, pueden crecer a bajos niveles de luz e incluso, ocasionalmente,
en ausencia de luz, metabolizando materia orgánica preformada (Videla y Sáiz-
Jiménez, 2001; Lamenti y Tomaselli, 2003).

Desde el punto de vista ecológico, Dupuy et al. (1976), diferencian dos

grupos de cianobacterias que habitan los monumentos:
I) Aquellas que pueden resistir condiciones extremas, como luz intensa y
periodos de sequía. Principales agentes de ensuciamiento de las
superficies externas de edificaciones, por la presencia de una vaina
fina coloreada (Gloeocapsa, Nostoc, Scytonema, etc.).

II) Aquellas que viven bajo condiciones de escasa luminosidad y humedad

constante. Desarrollan vainas y forman gruesos crecimientos

15
 coloreados en el interior de la pared de los edificios. Por ejemplo
Aphanocapsa biformis, Scytonema julianum, etc.

4.5.2.2.- Algas

Son organismos eucarióticos unicelulares filamentosos o pluricelulares,

autotróficos capaces de formar colonias que carecen de tejido vascular y
contienen clorofila a. Presentan gran tendencia a agruparse y fijarse a diversos
substratos, dependiendo principalmente de las condiciones de humedad, calor,
luz y nutrientes inorgánicos (como el Ca y Magnesio (Mg)); mediante una serie
de procesos que originan la formación de biofilms (Pereza, 2005).

4.5.2.3.- Hongos
A este grupo pertenecen organismos unicelulares o pluricelulares que se
alimentan mediante la absorción directa de nutrientes a través de una fina
pared celular y su posterior distribución por difusión simple al protoplasma. Son
organismos eucariontes de tamaño y forma variables, poseen filamentos
llamados hifas que forman el micelio o cuerpo vegetativo.

Los hongos se consideran quimioheterótrofos estrictos que producen

una gran variedad de enzimas extracelulares; por lo que al igual que muchas
especies bacterianas generan manchas de diferentes tonalidades, como
resultado de su metabolismo (García, et al., 2005).

Pueden originar degradación mecánica y química en los substratos

rocosos. La degradación química se basa en la producción de ác. orgánicos
como: acético (C2H4O2), glucónico (C6H12O7), oxálico (C2H2O4), cítrico
(C6H8O7), málico (C4H6O5) y succínico (C4H6O4), capaces de solubilizar
cationes esenciales para su metabolismo o pueden ser empleados por otros
organismos como nutrientes (Kumar y Kumar, 1999; De Sousa et al., 2001).

Mientras que la degradación mecánica se origina por la penetración del

micelio fúngico en las grietas o fisuras en las que se desarrollan, causando
perdida del material (Aparecida de Resende, 2001; Gaylarde, 2001).

16
4.5.2.4.- Líquenes. Son una simbiosis entre un hongo y un alga o cianobacteria
que se comportan como un único organismo; el hongo (micobionte) se encarga
de proteger al alga de la radiación directa del sol, le brinda agua y sales
minerales, mientras que el alga o cianobacteria (fotobionte), realiza la
fotosíntesis y proporciona nutrientes al hongo. Conjuntamente, estos
organismos producen una estructura macroscópica simple conocida como talo
(Ariño y Gómez, 2001; Gorbushina, 2007).

Los talos pueden presentar diversas formas dependiendo de los

simbiontes:
I) Los líquenes de talo crustáceo se adhieren muy íntimamente a la roca y
son difíciles de eliminar. Se ha sugerido que este tipo de liquen
puede proteger las superficies de la roca de las inclemencias
ambientales no biológicas.

II) Los líquenes de talo foliáceo penetran a poca profundidad, ya que usan
estructuras de anclaje de tipo filiforme.

III) Los líquenes de talo fructiculoso están generalmente anclados al

substrato por una estructura que recuerda a un botón; estos dos tipos
son relativamente fáciles de eliminar sin causar mucho daño a la roca
(Dennis, et al. 2004).

En general se consideran dos tipos de procesos originados por los

líquenes durante su colonización, los procesos mecánicos, que producen la
desintegración del substrato, mediante la penetración de las hifas entre los
minerales que conforman la roca.

Los procesos químicos que conducen a la descomposición del substrato,

por ejemplo el CO2 producido durante la respiración microbiana, que es
transformado en ácido carbónico (HCO3), que al combinarse con Ca y otros
cationes, forman ácido oxálico, además de la producción de sustancias
quelantes, producto de su metabolismo (Rosato, 2001).

17
 De manera general en la Tabla 3 se describen los efectos y actividades
de los microorganismos implicados en el deterioro pétreo.

Tabla 3 Actividades microbianas que afectan la roca (Dennis, et al. 2004).

PRINCIPAL ORGANISMO
ACTIVIDAD MICROBIANA EFECTO OBSERVADO
IMPLICADO
Algas, cianobacterias y Presencia de células o Decoloración
hongos productos metabólicos

Todos Formación de biopelículas Retención de agua

Algas, bactérias Presencia de células vivas, Crecimiento de organismos

fotosintéticas y muertas o productos celulares heterótrofos y superiores
cianobacterias

Bacterias oxidantes del Fe y Oxidación de cationes Formación de pátinas

del Mn, hongos, translocados
cianobacterias
Hongos, bacterias, Producción de ácidos Degradación
cianobacterias y líquenes

Todos Movilización y quelación de Debilitamiento y disolución

iones del material
Algas y cianobacterias Captación de protones por las Disolución alcalina
células

4.6.- Técnicas y métodos de detección de microorganismos causantes de

biodeterioro

Los métodos normalizados de detección e identificación de

microorganismos que se utilizan también en estudios sobre biodeterioro, se
muestran en la Tabla 4 (Anexos A). Que por su área de estudio se pueden
dividir en microscópicos, químicos y bioquímicos (Metals Hand Book, 1988; De
Sousa et al., 2001; Piñar et al., 2002; Saiz-Jiménez 2003; Arocena et al., 2007;
De los Ríos y Acaso, 2005; De los Ríos, et al., 2008).

18
 V  MATERIALES Y MÉTODOS

5.1.- Trabajo de campo

5.1.1.- Muestreo

Para la toma de muestras de interés biológico contenidas en el material

pétreo, se realizó un examen visual previo de todas las bioalteraciones
presentes en los muros del Baluarte de San Carlos.

Tomándose pequeñas porciones de los muros del monumento, con una

espátula a distintas alturas (1.5 m, 3 m y 4.5 m aproximadamente) de cada cara
del edificio catalogándose por su ubicación geográfica en: cara norte (N), sur
(S), este (E) y oeste (W), a su vez, cada cara se dividió en tres bloques
verticales (a, b y c.) y tres niveles horizontales (1, 2, 3).

En las Figuras 3 se muestra la planta estructural del Baluarte de San

Carlos y se esquematiza el método de muestreo realizado en uno de los muros
del Baluarte, delimitando las zonas y niveles de muestreo. Las muestras se
guardaron en tubos cónicos estériles de 50 ml, previamente rotulados. Se
mantuvieron en frío a 5ºC, en una pequeña nevera con hielo hasta su llegada al
laboratorio donde se almacenaron en un Ultracongelador (Revco, a -40 °C),
hasta el momento de su procesamiento y análisis.

Figura 3 Vista de planta del baluarte

Figura 4 Esquema del muestreo
San Carlos: Cara Norte (N), Sur (S),
realizado al Baluarte San Carlos, en
Este (E), Suroeste (SW), y Oeste (W).
una de sus caras.

19
 Cabe señalar que todos los instrumentos como pinceles, pinzas,
espátulas, probetas o platillos que fueron utilizados, así como cualquier otro
accesorio que estuviera en contacto con la muestra, fueron esterilizados
previamente.

En la Tabla 5, se muestran los códigos empleados para la identificación

de las muestras que incluyen número de asignación a la muestra, altura de
recolección y la orientación del muro.

Tabla 5 Codificación de muestras recolectadas del Baluarte de San Carlos

MUESTRA CÓDIGO CARA ALTURAS

1 N-/AyB2 2.10 m
Norte
2 N-D1 1m

3 S-A2 3m

4 S-D1 Sur 15 cm

5 S-B2 2m

6 W-A2 2.6 m
Oeste
7 W-B1 1.6 m

8 SW-E1 1.4 m
Suroeste
9 SW-C2 2.10 m

10 E-B3 4.70 m
Este
11 E-C1 1.50 m

5.1.2.- Observación macroscópica

La observación macroscópica se realizó in situ, tomando en cuenta la

presencia de colonias microbianas, su coloración, tamaño, forma, tipo de
substrato y condiciones que la rodeaban. Todos estos datos fueron anotados y
tomados en cuenta para el procesamiento de las muestras.

20
5.2.- Trabajo de laboratorio
5.2.1.- Procesamiento de las muestras

El procesamiento de las muestras se realizó en el Laboratorio de

Enfermedades Transmitidas por Vector y Zoonosis del Centro de
Investigaciones en Enfermedades Tropicales (CIET), y en el Centro de
Ecología, Pesquerías y Oceanografía del Golfo de México (EPOMEX),
pertenecientes a la Universidad Autónoma de Campeche.

Mientras que el análisis superficial y trabajo preparativo de las muestras

se realizó en el Laboratorio de Preservación del Patrimonio Cultural del Centro
de Investigación en Corrosión (CICORR) y el Laboratorio de Microscopía
Electrónica del Departamento de Física Aplicada, del Centro de Investigaciones
Avanzadas (CINVESTAV, UNIDAD-Mérida).

5.2.1.1.- Observación microscópica

Las muestras se dividieron en dos partes, se tomaron 2 g

aproximadamente y se colocaron en un microtubo de 2 ml para la realización
de los análisis superficiales (en este apartado se incluyen las pruebas de
microscopía y de espectroscopia). La parte restante de dichas muestras, se
dejaron para el análisis biológico.

Para la observación microscópica, se empleó un microscopio

estereoscopio (IROSCOPE ES-240), un microscopio óptico, Carl Zeiss
(Axioscop 40) y se recolecto material fotográfico de cada una de las muestras,
con una cámara digital Coolpix S210, Nikon.

Se utilizo un Microscopio Electrónico de Barrido PHILIPS XL30 ESEM,

acoplado a un Espectrómetro de Energía Dispersiva de Rayos X (MEB/EDS)
(Anexo C), para obtener una caracterización morfológica con más detalle y un
análisis elemental de cada una de las muestras recolectadas del Baluarte de
San Carlos.

21
5.2.1.2.-Análisis microbiológico
5.2.1.2.1.- Extracción de ADN

Para la extracción de ADN de las muestras y de los controles

(Saccharomyces cerevisiae, para los grupos de eucariontes y Escherichia coli,
como blanco de bacterias), se utilizó el método de extracción con fenol
cloroformo isoamílico (FCI) (Anexos C).

Este método consiste en la lisis de células por mecanismos químicos

que ayudan a romper la estructura tridimensional de las macromoléculas como
proteínas o ácidos nucleicos, consiguiendo su desnaturalización y separando el
ADN del resto de los componentes celulares, por medio de su purificación
(Martínez et al., 2006).

La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante

electroforesis en un gel de agarosa al 2%, a 85V por 1hora, su posterior tinción
con bromuro de etidio (1μg/ml) y observación con un Transiluminador de luz
ultravioleta (UV), ECX-15M.

5.2.1.2.2.- Determinación de la concentración del ADN.

Una vez extraído el ADN se determinó la concentración e integridad. Se

realizó una dilución de 1:200 del ADN, con agua estéril a un volumen final de
200 μl y se leyó a una a una longitud de onda 260 (ADN) y 280 nm (proteínas),
con un Espectrofotómetro, JENWAY 6305. La concentración de ADN se cálculo
considerando a 1U DO Abs260nm= 50μg/μL de ADN de cadena doble.

5.2.1.2.3.- Amplificación del gen 16S y 18S del rADN por PCR

Para la identificación de microorganismos se amplifican secuencias del

ADN que codifica para el ARNr 16S debido a que están presentes en todos
organismos, presentando regiones altamente conservadas y regiones variadas;
permitiendo así distinguir los microorganismos a cualquier nivel filogenético.

22
 Por lo que se utilizó la técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR), es una técnica in vitro de síntesis del ADN, en la cual un
segmento particular de ADN molde se amplifica al ser flanqueado por un
cebador o primer (Rodríguez y Barrera, 2004; Piñar et al., 2002; Saiz-Jiménez
2003; De los Ríos y Acaso, 2005).

Se colocaron aproximadamente 200 ng de ADN genómico en 50 µl de la

mezcla. Mientras que la dilución de la Taq polimerasa, fue de 2.5 U por cada
ensayo de PCR se realizó a un volumen final de 50 μl.

En la Tabla 6, se describen las secuencias de estos primers u

oligonucleicos, los cuales tienen una longitud de 20 a 25 bases.

Tabla 6 Secuencias de los primers usados

PRIMER SECUENCIAS REFERENCIAS
616F AGAGTTTGATYMTGGTGGCTCAG Zimmermann et al.,
2005
907R CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
Weisburg et al., 1991.
Cya 106 F CGGACGGGTGAGTAACGCGTCGTGA Nübel et al., 1997
Bonazza et al., 2007.
Cya 781Ra GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT
Cya 781Rb GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT

Euk A AACCTGGTTGATCCTGCCAGT Diez et al., 2001

González y Saiz-
Euk B TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
Jiménez, 2005

UNIFOR CTYAAAKRAATTGRCGGRRRSSC
UNIREV CGGGCGGTGTGTRCAARRSSC

Las amplificaciones por PCR fueron llevadas a cabo en un

Termociclador (TC-512), bajo las siguientes condiciones: 95°C durante 2
minutos; 35 ciclos de 95°C por 15 segundos, 55°C por 15 segundos, 72°C
durante 1 minuto; y un paso final de 72°C durante 10 minutos (Jurado, 2005;
2008). Para corroborar los productos de PCR, se realizó una electroforesis en
gel de agarosa, con un volteje de 85.

23
5.2.1.2.4.- Purificación de los productos de PCR

Se empleó un Kit comercial (The Wizard ADN Clean-Up System,

Promega), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

5.2.1.2.5.- Secuenciación de los productos de PCR

Los fragmentos amplificados de 8 muestras de ADN, se secuenciaron en

el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Para la secuenciación se utilizaron los primers anteriormente descritos

en la Tabla 6, a una concentración de 10 pmol.

5.3-. Trabajo de gabinete

5.3.1-. Identificación de secuencias

La homología de las secuencias se realizó utilizando el programa

informático de alineamiento de secuencias de tipo local de ADN (BLAST, por
sus siglas en ingles). Para esto se utilizó el programa GenBank, cuya interface
se encuentra disponible en el NCBI (National Centre for Biotechnology
Information).

5.3.2-. Tratamiento de la información

Dentro de este apartado se analizó toda la información bibliográfica

recopilada durante el trabajo, dando pauta al diseño de los esquemas de
trabajo de campo y de laboratorio.

Se capturaron y analizaron cada uno de los resultados obtenidos durante

el estudio, desde la toma de muestras hasta la identificación de los
microorganismos relacionados con el biodeterioro del baluarte de San Carlos.

24
 VI  RESULTADOS

6.1-. Trabajo de Campo

6.1.1-.Observación macroscópica del Baluarte de San Carlos

Si bien es cierto que todos los materiales durante cierto tiempo, sufren
deterioro, es decir cambios en su naturaleza, que pueden manifestarse en su
aspecto externo como interno, las condiciones de exposición de los
monumentos históricos determinan en gran medida los procesos de
biodeterioro.

El Baluarte de San Carlos fue construido como parte del sistema

defensivo de la cuidad, protegiendo el puerto de los ataques marinos de los
piratas. En su ubicación original en la zona costera de la cuidad, estaba
influenciado por el oleaje y las brisas marinas. Por lo que, los daños que
presenta el edificio estuvieron condicionados principalmente por dichos
factores.

En la Figura 5, se puede observar que en las caras oeste (W) y suroeste

(SW), presentan pérdida generalizada del aplanado y pintura, cambios
cromáticos, cristalización de sales y formación de oquedades debido a los
canales de drenaje pluvial; crecimiento de colonias microbianas principalmente
de coloración oscura y procesos erosivos que han originado pérdida de
mortero, disgregación de materiales de unión y arenización del material
constituyente de la mampostería.

Por su parte la Figura 6 muestra la cara este (E), con colonias

microbianas de color café-oscuras, presencia de pinturas amarilla y rosa en las
paredes del monumento, las cuales se ven relacionadas con la ausencia de los
microorganismos, y diversos procesos de intemperismo como erosión, que
originan la pérdida del aplanado, la formación de pequeñas oquedades y
estrías en varias rocas por la acumulación y filtración del agua.

25
 Figura 5 a) Cara oeste y b) Suroeste del Baluarte de San Carlos

Figura 6 Cara este del Baluarte de San Carlos

La cara sur (S) se puede dividir en tres zonas, donde la zona 1 y 3 son
ocupadas en su totalidad por biocostras cafés a negras, con pérdida del
aplanado y cambios cromáticos superficiales; en la zona 3 se observa la mayor
pérdida de mortero, por intemperismo y una gran abundancia de
microorganismos negros (Figura 7).

Por otra parte la zona 2 presenta disolución de sales de la pared por la

filtración del agua provocada por las lluvias, con presencia de cambios
cromáticos que van desde amarillo hasta naranja. A diferencia de las zonas 1 y
3, la zona 2 presenta menos pérdida de material y aun conserva porciones de
pintura (amarilla-ocre) en su superficie.

26
 Figura 7 Cara Sur del Baluarte de San Carlos.

Por su parte en la cara norte (N), se observa la presencia de colonias

microbianas sobre el mortero, generalmente de color negro y otras de menor
abundancia de color blanco, verde y crema; así como una franja capilar de 1 m
de altura desde la base del muro. Se observa perdida de material por erosión y
la bioalveolización debido al crecimiento de plantas superiores y helechos;
ocasionando la formación de cavidades, profundas e interconectadas (Figura9).

a)
b)

Figura 8 a) Cara norte b) Desarrollo de plantas superiores y helechos en zonas libres

de aplanado

6.2-.Trabajo de laboratorio
6. 2.1-.Observación microscópica

En el laboratorio se realizó una observación microscópica, empleando un

microscopio estereoscópico y óptico.

27
 En la Tabla 7 se presenta la descripción de las muestras observadas al
microscopio, que incluye una caracterización general de los microorganismos y
tipo de substrato.

Tabla 7 Descripción de las muestras tomadas de cada cara del Baluarte de

San Carlos.

CARA SUBSTRATO OBSERVACIONES

Norte Mortero de color claro, con Presencia de microorganismos negros
presencia de fragmentos de epilíticos desarrollados en mortero, con
costra de colores café claro a hifas visibles. Colonias endolíticas
oscuro con morfología granular verdes, tanto en el mortero como en
y aspecto compacto. fragmentos de costra.

Sur Mortero húmedo disgregado, Presencia de microorganismos

con incrustaciones marinas, epilíticos negros de fácil
fácilmente desprendible. desprendimiento, debido a la humedad
Presencia de fragmentos de del mortero. Se observa la presencia
costra de color café claro sobre de microorganismos que disgregan el
residuos de pintura. material por medio de sus hifas.
Este El mortero presenta restos de Microorganismos epilíticos negros y
pintura amarilla, la cual parece endolíticos verdes, con hifas que
estar cristalizada e integrada a penetran la estructura de la muestra.
la costra de deterioro que se Pequeños fragmentos de costras
forma sobre el mortero. oscuras cristalizadas.
Oeste Se observa perdida del Presencia de microorganismos
aplanado, con zonas epilíticos negros desarrollados en
arenizadas, debido mayormente partes alteradas del mortero y pintura.
a la erosión. Presenta Se observan microorganismos verdes
alteraciones cromáticas y zonas y blancos de forma endolítica.
con pintura amarilla.
Suroeste El mortero se observa Presencia de colonias de
quebradizo y frágil, microorganismos verdes, que crecen
consecuencia del intemperismo debajo de colonias negras
y la actividad microbiana. desarrolladas sobre el mortero y roca.
Presenta incrustaciones El material se muestra disgregado y
marinas. Mientras que el de coloración oscura.
substrato rocoso se presenta
poroso y erosionado.

28
 En la Figura 9 se presentan las micrografías de muestras representativas de
cada cara del Baluarte de San Carlos, a magnificaciones de 2X y 4X. La
descripción se muestra a continuación:

a) Microorganismos negros y verdes desarrollados sobre mortero húmedo,

con material disgregado depositado sobre la masa microbiana, cuya
estructura y aspecto miceliar indica la presencia de un liquen foliáceo.

b) Colonias microbianas de color negro, dispersas sobre mortero con

pintura amarilla. Sobre los restos de pintura se pueden observar
pequeños fragmentos de costra, producto de los procesos de
disolución/cristalización de sales.

c) Microorganismos negros en pequeñas colonias definidas y desarrolladas

de manera epilítica en mortero, en el que se observa la presencia de
restos de pintura amarilla.

d) Vista general de una muestra del Baluarte de San Carlos con

microorganismos negros desarrollados sobre mortero, de igual manera
se presentan fragmentos de costras cafés y pequeños líquenes
crustáceos de coloración azulada, en la parte inferior de la micrografía.

e) En esta fotografía se puede observar claramente las hifas que

conforman el micelio de microorganismos desarrollados sobre substrato
pétreo, y la interface entre el material pétreo y la microbiota, donde se
observa claramente el material pétreo completamente degradado,
húmedo y de color café claro (tierra).

f) Costra típica de deterioro del Baluarte de San Carlos de color café claro
y aspecto heterogéneo, debido a la presencia de nucleaciones y zonas
planas, en su superficie. En este caso la costra se encuentra sobre el
mortero y roca.

29
 Figura 9 Micrografías de las muestras recolectadas del Baluarte de San Carlos

La Figura 10, fotografías de microorganismos presentes en muestras

provenientes del Baluarte de San Carlos obtenidas con un microscopio óptico a
diferentes magnificaciones (40 y 100 X).

30
Figura 10 Micrografías de microorganismos presentes en muestras provenientes del
Baluarte de San Carlos, obtenidas mediante microscopia óptica.

En la Figura 10A se muestra una cianobacteria filamentosa, uniseriada,

no identificada. Por otra parte en las Figura 10A.1, B.1, D y E se pueden
observar cianobacterias, filamentosas uniseriadas, con falsas ramificaciones y
mucilago evidente al microscopio óptico, que pertenecen al género Scytonema
(Dennis et al. 2004).

31
 En las Figuras 10B y 10C (parte central) se observan una cianobacteria
unicelular del genero Pleurocapsa. Mientras que las micrografías de las partes
superior derecha e inferior izquierda de la figura 19C, muestran a los generos
Chlorococcum y Chlorella respectivamente.

La Figura 10C.1, corresponde a un alga filamentosa, uniseriada, sin

heterocisto y sin vaina mucilaginosa marcada, probablemente perteneciente al
género Oscillatoria.

Por su parte, en la Figura 10D.1 se observan dos tipos de cianobacterias

uniseriadas, sin ramificaciones, con distintas terminaciones. Se tratan de
Geitlerinema, con el extremo reducido y ligeramente doblado con la presencia
de una caliptra esférica y Lyingbya con el extremo redondeado y células más
largas que anchas.

La Figura 10E.1, muestra a Lyingbya, con un protozoo, Podophrya, fijado

a su filamento mediante un pedúnculo. De igual manera se puede observar,
que el filamento superior posee un heterocisto, mientras que en el filamento de
inferior de lado derecho muestra la presencia de un necridio.

La Figura 11, muestra tres fotografías de microorganismos,

pertenecientes al reino Protista. En la Figura 11A se observa un Stylonychia,
por su parte la Figura 11B pertenece a un Nematodo; mientras en la Figura
11C se observa a un Podophria.

Figura 11 Micrografías de protozoos en las muestras recolectadas.

32
6.2.2.- Análisis morfológico y elemental mediante MEB/EDS

En base al análisis realizado con el microscopio óptico, se tomó una

muestra representativa de cada muro del Baluarte de San Carlos, para el
análisis MEB/EDS.

En la Tabla 8 se presentan los resultados generales del análisis

realizado mediante EDS.

Tabla 8 Análisis elemental de las muestras del Baluarte de San Carlos

MUESTRA
ELEMENTO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ca ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++++ ++ ++++ +++ + +
C ++ ++ ++ ++++ ++++ ++ ++++ ++ +++ + ++++
O ++++ ++ ++ +++ ++++ ++ ++++ ++ +++ +++ ++
Si ++++ + + ++ + + ++ + ++ ++++ +
Al ++ + + ++ + + + + ++ +++ +
S + + + ++ + + + + ++++ + +
Na ++ - + - + - + - ++ - +
Cl - - + ++ + - + - +++ - -
Mg + - + - + - + - ++ - +
K + + + ++ + + + + ++ + +
P + + - - - - - - ++ - -
F - - + - + - + - - - -
Fe + - - - - + - + - + -
Cr - - - - - - - - - + -
Ti - - - - - - - - - + -
Ba - - - - - - - - - - +

Se encontró la presencia de 16 elementos químicos. Cabe señalar que en

ninguna de las muestras se presentaron todos los elementos. Las muestras
que presentaron la mayoría de estos elementos y que además los compartieron
corresponden a M3, M5 y M7 con presencia de 11 elementos, seguidas de M6,
M8 y M10 en esta última muestra se presentaron dos elementos más que no se
encontraron presentes en ninguna otra muestra (Ti y Cr).

33
 Cabe señalar que los elementos que estuvieron presentes en todas las
muestras corresponden a Ca, C, O, Si, Al, S y K.

Los resultados muestran que las caras norte y oeste, presentan mortero
de superficie heterogénea, con algunas zonas sin presencia de
microorganismos, ni costras de deterioro. En zonas en las que los
microorganismos están presentes, sus hifas se entrelazan y penetran el
mortero, causando su disgregación. El análisis EDS indica Ca como elemento
mayoritario; O, C y Si como secundarios; mientras que Al, P y S, se encuentran
a niveles traza.

Las muestras de la cara sur, presentan una costra de deterioro, cuyo

elemento principal es Ca. Como secundarios se encuentran C, O, Si y Fe; y
como elementos traza Al, K y S.

La muestra proveniente del muro suroeste, presenta una costra delgada

sobre material pétreo, formando pequeños aglomerados e hifas entrelazadas.
Un análisis de EDS general, realizado en la muestra indica Ca, como elemento
predominante, seguido de Si. O y C. Como elementos traza se tienen Al, S, K y
Fe.

Por su parte la muestra de la cara este, contienen varias barras de silicatos

inmersas en hifas de microorganismos desarrollados en la muestra. Si aparece
como elemento mayoritario, junto con O, Ca y C, como secundarios. Mientras
que los elementos trazas están representados por Na, Al, Mg, K, Ba y S.

En la Figura 12 se observan las microfotografías de muestras

representativas, del Baluarte de San Carlos, mediante MEB con su respectivo
EDS.

34
 Figura 12 Micrografías electrónicas MEB/ EDS del Baluarte de San Carlos

Por otra parte en las Figuras 13-17 se muestran las micrografías

electrónicas puntuales de estructuras y/o partículas presentes en las muestras
recolectadas del Baluarte de San Carlos y a su derecha se presenta su análisis
de EDS.

35
 Figura 13 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes de la cara
norte del Baluarte de San Carlos

En la Figura 13 se muestran dos micrografías electrónicas tomadas de

muestras provenientes de la cara norte del Baluarte de San Carlos. La Figura
22A (1000X), se trata de un microorganismo redondeado e inmerso en un
costra casi uniforme. Por otra parte la Figura 13B (1000X), muestra un
conglomerado de hifas que conforman una biopelícula microbiana, con material
disgregado. A ambas muestras se les realizo un EDS, observándose como
elemento mayoritario, C y O, como secundario Si (Figura 13A). Como
elementos trazas tenemos al Ca, Al, S, Mg, Na, F, K y Cl. Por su parte, la
Figura 13B muestra como elemento principal a C; como elementos segundarios
se tiene Ca y O; y como elementos trazas P, S, Si, K, Cl y Al. Cabe destacar
que a la Figura 13A se trató de un EDS general mientras que en la Figura 13B
se trato de un análisis puntual.

En la Figura 14 se presentan dos micrografías electrónicas tomadas de

muestras de la cara sur. La Figura 14A (2000X) muestra una barra de silicatos
de unos 6 µm de ancho y unos 50 µm de largo, y partículas de mortero
disgregado sobre la superficie de la muestra.

36
 El análisis EDS general indica O, Si y Ca como elementos principales y
como elementos trazas C, Al, Na, Mg, P, K, S y Fe. Por su parte, la Figura 14B
(2000X) es un acercamiento de la micrografía de la Figura 12 cara sur, el
espectro EDS correspondiente indica como elemento principal Ca, y como
elementos traza O, C, Fe, Si, Al, K y S.

Figura 14 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS, provenientes de la

cara sur del Baluarte de San Carlos

En la Figura 15 se presentan dos micrografías electrónicas obtenidas de

muestras de la cara oeste del Baluarte de San Carlos. En la Figura 15A (500X)
se puede observar hifas entrelazadas (de 8-10 µm de ancho), que conforman
una biopelícula desarrollada en la superficie del mortero y algunos
microorganismos redondeados sobre las hifas. La Figura 15B (2000X),
corresponde a un acercamiento a organismos, los cuales miden 10 µm. El EDS
general de la Figura 15A muestra que los elementos mayoritarios son C y O,
mientras que entre los elementos secundarios Si y Ca; como elementos trazas
se tienen Al, Mg, S, F, Cl, K y Na. La Figura 15B indica que el elemento
principal es el C, como elementos secundarios se tienen O y Ca; mientras que
los elementos traza son S, Si, Cl, K y Al.

37
Figura 15 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS de la cara oeste del Baluarte
de San Carlos

Figura 16 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS de la cara suroeste del

Baluarte de San Carlos

La Figura 16, muestra dos micrografías electrónicas, tomadas a muestra

de la cara suroeste. La Figura 16A (500X), presenta una costra oscura en
desarrollo y en medio partículas esféricas rugosas, que podrían tratarse de
contaminantes atmosféricos, revelando a S como elemento mayoritario seguido
de C, Ca, O y Cl; como elementos secundarios y un menor pico de Na, K, Al, Si
y Mg.

38
 En la Figura 16B, (2000X), se observa una zona de transición con costra y
mortero con crecimiento microbiano. El análisis EDS general mostró que los
elementos mayoritarios son C y O; mientras que entre los elementos
secundarios se tienen Ca, S y Si. Como elementos trazas se encuentran Al, K,
Cl, Na, Mg y F.

Figura 17 Micrografías electrónicas, mediante MEB/EDS de la cara este del Baluarte

de San Carlos

La Figura 17 presenta dos micrografías electrónicas tomadas de

muestras provenientes de la cara este del Baluarte de San Carlos. La Figura
17A (500X), muestra un conjunto de hifas de una biopelícula y la presencia de
una barra inmersa en dicha biopelícula. Otra zona de la muestra se presenta en
la Figura 17B, donde se puede observar el crecimiento de hifas sobre mortero.
El análisis EDS puntual realizado sobre la barra de la Figura 17A, muestra un
mayor pico de Si y como elementos secundarios Al y O. Como elementos
trazas Fe, Ca, K, S, C, Cr, y Ti. En la Figura 17B, el análisis EDS general,
muestra que el pico mayor es C; y como elementos trazas se presentan O, Ca,
K, Si, S y P.

39
6.3.- Análisis microbiológicos
6.2.1.- Obtención del ADN

Los resultados de la concentración y calidad del ADN en muestras y

controles, se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Concentración y pureza del ADN

FENOL CLOROFORMO ISOAMÍLICO

MUESTRA Concentración ADN Pureza
µg/µl (260 nm/280 nm)
1 1.79 µg/10 µl 1.67 nm
2 1.28 µg/30 µl 1.58 nm
3 1.28 µg/10 µl 1.59 nm
4 3.04 µg/10 µl 1.75 nm
5 1.93 µg/10 µl 1.56 nm
6 1.30 µg/10 µl 1. 76 nm
7 1.67 µg/10 µl 1.52 nm
8 1.75 µg/20 µl 1.50 nm
9 4.66 µg/10 µl 1.70 nm
10 4.37 µg/10 µl 1.67 nm
11 2. 33 µg/15 µl 1.73 nm
E. coli 437 µg/20 µl 1.60 nm
S. cerevisiae 46875 µg 20 µl 1.79 nm

La Figura 18, muestra las bandas de ADN de las muestras y controles, de gran
peso molecular al analizar su integridad por electroforesis.

Figura 18 Análisis de integridad de las muestras y controles

40
6.3.2- Reacción en Cadena de la Polimerasa

Los resultados de las muestras amplificadas fueron de ~500 pb, ~1000

pb, ~650 pb y de ~2750 pb respectivamente.

En la Figura 19 se muestran los amplificados de las muestras M1y M2

con cada uno de los primers utilizados en el estudio (pocillos 2-9). Mientras que
en el pozo 1 se encuentra el control para eucariontes, en el pozo 10 una
muestra blanco y en el pozo 11 el Marcador de peso molecular de 250 pb.

Figura 19 Perfiles obtenidos de las muestras, utilizando cada uno de los primers;
donde U= Universales, E= Eucariontes, B= Bacterias, C= Cianobacterias, Bl= Blanco,
M= Marcador y Sc= S. cerevisiae.

Todas las muestras, con excepción de la 9 amplificaron con primers de

bacterias y cianobacterias mientras que de los primers universales, sólo
amplificaron los controles de E. coli a 900 pb y S. cerevisiae a 500 pb (Tabla
10). Por otra parte con los primers para eucariontes no se obtuvieron
amplificados de las muestras del Baluarte de San Carlos. Cabe señalar que
para su control S. cerevisiae amplifico a 2750 pb.

41
 Tabla 10 Muestras amplificadas

PRIMERS
MUESTRAS
Bacterias Cianobacterias Eucariontes Universales

M1  
 
M2  
 
M3  
 
M4  
 
M5  
 
M6  
 
M7  
 
M8  
 
M9    
M10  
 

M11  
 

CONTROLES

E. coli    

S. cerevisiae  
 
= muestra amplificada = muestra no amplificada

6.3.3- Purificación de los productos de PCR

En la Figura 20 se pueden observar los productos de PCR ya purificados

de la muestra M1, (amplificada con los primers de bacterias y cianobacterias) y
los controles (S. cerevisiae con primers universales y específicos; y a E. coli
con primers específicos), obtenidos de las muestras provenientes del Baluarte
de San Carlos, que corresponde a lo reportado en la Tabla 10.

42
 Figura 20 Muestras de ADN purificadas

6.4- Trabajo de Gabinete

6.4.1- Secuenciación

Los productos de PCR que fueron secuenciados corresponden a las

muestras: M1B, M2B, M4B, M6B, M8B, M10B, M11B y M11C. De ellas se
encontró que las bandas amplificadas correspondían en todos los casos a
bacterias y cianobacterias.

Dentro de las bacterias se identificó a Proteobacteria, Pseudomona sp.,

en M4, M8 y M2; de igual manera en M4, se encontró a Actinobacteria
(Brevibacterium) con un 97 % de similitud. Cabe destacar que a excepción de
M4B, se reportó a una bacteria incultivable, con rangos de 97 % a 83 %.

En cuanto a las cianobacterias, se encontró en M10 al orden

Chroccocales con 82 % de similitud. Mientras en M6 se presentó el género
Chroococcidiopsis (83 % de similitud). Cabe destacar que M6, M11B y M11C,
se observó la presencia de una cianobacteria incultivable cuyos rangos de
similitud oscilaron entre 93 % y 83 %.

43
 En la Tabla 11 se enlista la muestra de origen y afiliación taxonómica de
los microorganismos encontrados, señalando su porcentaje de similitud y
número de bases, con respecto al GenBank (NCBI).
Tabla 11 Afiliación taxonómica de los microorganismos identificados en muestras
provenientes del Baluarte de San Carlos.

No. DE MUESTR MICROORGANISMO No. % DE

ACCESO A BASES SIMILITUD

AY972169.1 4B Pseudomona plecoglossicida P13 16S RNAr 1254 97

AB461012.1 Pseudomonas sp. IK1_29 gen por 16S rRNA 1251 97
EF682071.1 Pseudomona putida DN1.2 16S RNAr 1251 97
GU335250.1 Pseudomonas putida strain X16 16S 1184 97
ribosomal RNA gen
EU073968.1 Brevibacterium tolerante al frio CMGS4 16S 1184 97
ribosomal RNA
GU296674.1 2B Pseudomona aeruginosa ANSC 16S 1478 99
ribosomal RNA gen,
FJ985806.1 Pseudomonas aeruginosa 16S RNAr gen. 1478 99
GU183597.1 Bacteria incultivable clon NMG51 16S RNAr 1478 99
AY972169.1 Pseudomonas plecoglossicida strain P13 16S 1424 97
ribosomal RNA gen
EF071544.1 6B Bacteria incultivable clon JordanB10 16S 558 83
ribosomal RNA gen
FJ230829.1 Bacteria incultivable clon Prehnite45 16S 544 89
ribosomal RNA gen
DQ914865.2 Chroococcidiopsis sp. CC3 16S RNAr gen 544 83
Cianobacteria incultivable clon HK04-B10 16S 538 84
EU751504.1 ribosomal RNA gen
AM934704.1 8B Psedomona sp. Incultovable clon 16S rRNA 1399 97
FM208263.1 Pseudomona sp. DSM 8628 16S rRNA gen, 1399 97
AY699600.1 Bacteria de suelo incultivable clon SAL2d22 1399 97
16S ribosomal RNA gen 97
AY699599.1 Bacteria de suelo incultivable clon NAP7d5 1399 97
16S ribosomal RNA gen 97
AY972169.1 Pseudomona plecoglossicida 16S ribosomal 1424 97
RNA gen
AB461012.1 Pseudomonas sp. IK1_29 gen del 16S rRNA 1423
EF682071.1 Pseudomonas putida DN1.2 16S RNAr gen 1423
FJ230797.1 10B Bacteria incultivable clon QuartzC3 16S RNA 617 83
ribosomal gen
DQ129645.1 Bacteria incultivable clon AKIW1142 16S 612 84
RNAr gen
FJ589716.1 Chroccocales cianobacteria LEGE 060123 573 82
16S RNA ribosomal gen
AJ344552.1 Chroococcidiopsis sp. BB79.2 parcial 16S 569 82
RNAr gen, SAG 2023
AM746687.1 11B Bacteria incultivable parcial 16S rRNA gen, 1168 95
clone A9
EF032781.1 Cianobacteria incultivable clon HAVOmat11 1094 93
16S ribosomal RNA
FJ790611.1 11C Bacteria incultivable clon QB35 16S 673 86
ribosomal RNA gen
FJ891047.1 Cianobacteria incultivable clon AY6_17 16S 664 86
ribosomal RNA gen

44
 VII  DISCUSIÓN 

En las observaciones microscópicas se encontró una gran cantidad y

diversidad de bacterias tanto filamentosas, como móviles en comparación con
lo observado por Videla y Saiz Jiménez (2001) en monumentos Mayas, quienes
reportaron una mayor cantidad y diversidad de bacterias móviles con respecto
a la escases de formas filamentosas. No obstante, otros autores reportan que
en superficies más porosas el número de tipos filamentosos aumenta, lo que es
condicionado por la naturaleza del substrato y el ambiente en el que se
desarrollan los microorganismos (Crispim et al., 2004).

Los análisis superficiales mostraron una relación entre las condiciones

microambientales y la colonización de estos hábitats por los microorganismos.
Se observaron colonias más desarrolladas en las caras este, sur y suroeste;
que en las caras norte y oeste; donde los muros presentaron una perdida
generalizada y arenización de aplanados. Lo anterior sugiere el desarrollo
preferencial de colonias microbianas en zonas erosionadas, libres de aplanado
y pintura.

Sin embargo la colonización de los muros por microorganismos negros

epilíticos, es general y de gran abundancia en el Baluarte de San Carlos en
comparación con los microorganismos con otra coloración. Por otra parte los
microorganismos de color verde, se encontraron preferentemente de manera
endolítica en el mortero y material pétreo.

Estudios sobre la colonización de substratos pétreos muestran que los

factores abióticos, juegan un papel imprescindible en la bioreceptividad de los
materiales (Camuffo, 1995; Caneva et al., 1995; Dolske, 1995; Mitchell y Gu,
2000; Warscheid y Braams, 2000; Ariño y Gómez, 2001; Videla, 2001; De la
Rosa et al., 2002). Factores que juegan un papel importante en la microflora
presente del baluarte de San Carlos.

45
 De igual manera estudios realizados en las paredes internas y externas
de edificios históricos de la cultura Maya en la península de Yucatán,
encontraron una mayor cantidad de biomasa correspondiente a cianobacterias
y, en menor grado hongos (Gaylarde y Gaylarde, 2005). Otros estudios
realizados en edificios Maya, reportan a cianobacteria como la principal
biomasa y causa de degradación de estructuras pétreas, por la producción de
ácidos agresivos, metabolitos alcalinos y surfactantes, así como por la
penetración física de las células en el substrato (Otto-Ortega et al., 2000;
Videla et al. 2003; Crispim et al. 2005).

Por otra parte Dennis, et al. (2004), reportó que bacterias, mohos
mucilaginosos, hongos filamentosos, protozoos y pequeños animales como
ácaros, contenidos en biopelículas maduras desarrolladas en paredes
exteriores. Formando redes tróficas, donde los protozoos se alimentan de
algas, rotíferos, otros protozoos, etc. Estas comunidades microbianas se
relacionan con lo encontrado en las muestras recolectadas del Baluarte de San
Carlos, por lo que se puede inferir que los biofilms encontrados en el baluarte
se encuentran en una etapa inicial de desarrollo (Gaylarde y Gaylarde, 2000;
Madigan, et al., 2003).

Los resultados obtenidos mediante el uso de técnicas moleculares y de

microscopía, muestran la presencia de bacterias y cianobacterias, en todas las
muestras amplificadas. Como se sabe estos microorganismos fotótrofos
solamente requieren de una fuente de carbono, luz solar, agua y minerales
para su crecimiento. Son considerados colonizadores primarios de edificios y
preparan el camino para el desarrollo de bacterias heterotróficas, hongos y
organismos superiores al proporcionales una capa de alimento orgánico (Videla
et al., 2001; Gorbushina, 2007). No obstante, estudios realizados en Brasil,
sobre comunidades microbianas en paredes recién pintadas, mostró la
presencia de hongos antes de que, los fotótrofos empezaran a colonizarlas.
Pudiendo utilizar la suciedad depositada de la atmósfera o los mismos
componentes orgánicos de la pintura como fuente de carbono (Crispim, et al.,
2004).

46
 Trabajos realizados en monumentos arqueológicos Maya, constituidos
con piedra caliza, reportan 91 tipos diferentes de microorganismos fotótrofos,
de ellos el 79.12 % corresponden a cianobacterias (Videla, et al., 2003).
Resultados similares de cianobacterias se reportan para superficies pintadas
de monumentos Maya en México, con una proporción del 76 %; encontrándose
una mayor cantidad de formas filamentosas (45 %) (Crsipim et al., 2004).

Como se sabe el pH de substratos de origen calcáreo es alcalino de

acuerdo a Morales (1994), este factor afecta la actividad microbiana dando
como resultado que en dichos substratos predomine la flora bacteriana (Videla,
et al., 2003). Cabe señalar que los edificios históricos en San Francisco de
Campeche, fueron constituidos con piedra caliza, lo que pudiera favorecer el
desarrollo de bacterias, con respecto a las demás comunidades microbianas.

Bacterias sulfuro-nitrificantes como Bacillus sp., Micrococcus sp.,

Pseudomonas sp. entre otras, son consideradas como microorganismos
comunes en superficies pétreas (Gorbushina et al., 2002; Ortega-Morales y
Hernández-Duque, 1998). Estas especies se reportan como las principales
colonizadoras de monumentos Maya en Uxmal (Ortega–Morales, 2004). Por
otra parte, se sabe que las bacterias del género Pseudomona son productoras
de biopelículas mucilaginosas, las cuales causan biodeterioro químico y
disolución de minerales pétreos (Ortega-Morales y Hernández-Duque, 1998;
Videla, et al., 2000).

Las biopelículas de bacterias, en especial las cianobacterias se pueden

encontrar en los desiertos fríos y calientes, sabanas, bosques tropicales,
regiones templadas e incluso polares. Por lo que son perfectamente adaptables
a periodos de desecación y radiación solar. Debido a sus habilidades
fotosintéticas y de fijación del nitrógeno atmosférico, las cianobacterias son
importantes componentes de las biopelículas en los materiales pétreos
(Ortega-Morales, 2004).

47
 Algunas especies de cianobacterias cosmopolitas del género
Chroococcidiopsis son organismos cripto-endolíticos, (Gorbuschina, 2007).
Estos microorganismos se encontraron en monumentos brasileños, donde junto
con el orden Pleurocapsales, constituyen la mayor parte de la biomasa
presente en edificaciones religiosas con mayor deterioro (Crispim, et al., 2004).

Por el contrario Gloecapsa, Pleucapsales, Scytonema y Lyngbya, son las

cianobacterias más representativas del grupo de las cosmopolitas en
monumentos. García de Miguel et al., (1995) realizó un estudio en Tikal,
Guatemala, encontrando resultados similares, aunque la ausencia de algas
eucariotas, a excepción de Chorella fue notable. Lo que coincide con los
resultados obtenidos en el Baluarte de San Carlos, Campeche.

Por su parte, Campion-Alsumard et al. (1996) y Crispim, et al., (2004)

mostraron la relación entre la presencia de cianobacterias, del grupo
Pleurocapsales o con los géneros Gloecapsa y Scytonema, con células
apicales y un líquido de digestión de carbonato del material pétreo.

La presencia de bacterias quimio-organotróficas, como las

Actinobacterias, se relaciona con su crecimiento en piedra deteriorada. Se cree
que estas bacterias, en fases avanzadas de colonización pétrea, forman un
velo blanquecino o una pátina granulosa con producción de un líquido oscuro
(Gorbushina, 2007). Este velo blanquecino se puede observar en el muro
Oeste del Baluarte de San Carlos (Figura 5A). Por otra parte especies
filamentosas de naturaleza micelial, como Chlorogloeopsis, Lyngybia,
Nodularia, Nostoc, entre otras, poseen la capacidad para penetrar en el
substrato y causar su biomineralización.

Las análisis moleculares mostraron resultados coincidentes con un

estudio previo realizado en la Iglesia de San Roque, en San Francisco de
Campeche, utilizando los mismos primers (Jurado et al., 2007). Donde se
obtuvieron resultados positivos para la presencia de bacterias, cianobacterias;
y negativos para los primers de eucariontes.

48
 Aunque las técnicas utilizadas para la extracción de ADN y su
amplificación fueron diferentes, ambos trabajos muestran similitudes,
destacando la eficiencia de la metodología seguida en este trabajo, además se
resalta la ausencia de los eucariontes en ambos estudios con el uso de los
primers Euk A y Euk B.

Sin embargo no se debe descartar la presencia de Eucariontes y en

especial de hongos, ya que son microorganismos que se encuentran
ampliamente distribuidos en edificaciones a lo largo de todo el mundo (Gómez-
Alarcón, 1995; Videla et al., 2000; Gaylarde y Gaylarde, 2005).

En este sentido un estudio realizado por Chiquini en el 2003, utilizando

técnicas de aislamiento e identificación, para analizar las comunidades
microbianas presentes en la Catedral de la ciudad de San Francisco de
Campeche, reportó la presencia de 103 cepas de microorganismos de las
cuales 60 (58.3 %) fueron bacterias y 43 (41.7 %) hongos.

Los análisis de composición elemental muestran la presencia de Na, Cl y

S, los cuales guardan una estrecha relación con las condiciones ambientales.
Siendo Cl y Na, de origen marino. Por su parte S se origina a partir de las
emisiones antropogénicas y se le considera indicador de la incorporación de
contaminantes provenientes de la atmosfera, como lo reportan estudios
realizados en zonas urbanas europeas como Atenas, Gran Bretaña, Budapest
y Sevilla, entre otras (Moropoulou et al.; 1998; Maravelaki, 2005; Törok y
Rozgonyi, 2004; Reyes, 2004).Sin embargo Arroyo et al., (1995) señalar que S
es un elemento que también se puede asociar a la presencia y actividad
microbiana.

Por otra parte la presencia de Ca, O, C, Mg y Si se atribuye a

constituyentes de minerales normalmente empleados en la fabricación de
morteros u otros constituyentes de la mampostería ya que se sabe que los
aplanados del Baluarte fueron realizados con materiales como arena, cal de
horno y sahscab; este último, resulta ser un tipo de arcilla calcárea típica de la
región (Torres, 2009).

49
 Mientras que la presencia en menor concentración de Al, Cr y Ti, puede
corresponder tanto a compuestos propios del substrato pétreo, como a
elementos incorporados provenientes del entorno. Cabe señalar que la
presencia de elementos como C, O, P y S puede deberse a constituyentes
orgánicos, aunque también son producidos durante la combustión de
combustibles fósiles (Reyes, et al., 2009).

En algunas muestras de la cara norte y oeste, se observa la presencia

tanto de Na como Cl en comparación de las muestras colectadas de las otras
caras, que poseen sólo uno de estos elementos. Lo cual es consistente, ya que
estas caras son las más expuestas a la brisa marina o la ascensión por
capilaridad del agua de mar durante el tiempo en que el edificio estuvo en
contacto con el mar.

Las muestras M1, M6, M8 y la M10 de las caras norte, oeste y suroeste
respectivamente, muestran la presencia de Fe lo que puede atribuirse a los
restos de pintura en el substrato (Gutiérrez, 2008). Esta autora caracterizó
químicamente las costras de deterioro con un estudio realizado en el Baluarte
de San Carlos.

Cabe destacar que el uso de técnicas de microscopia, así como las

microbiológicas son complementarias con las técnicas moleculares, por lo que
los resultados obtenidos en ambas técnicas, no son excluyentes (Crispim, et
al., 2004). Lo cual ha sido de gran importancia en los estudios de biodeterioro
de monumentos históricos.

50
 VIII  CONCLUSIÓN

Se concluye que en el Baluarte de San Carlos, se encuentra una diversa

flora microbiana, compuesta principalmente por bacterias (pertenecientes a las
phyla cianobacteria, protobacteria y actinomicete), relacionados con procesos
de biodeterioro de diversos edificios históricos, mediante el empleo de técnicas
moleculares y de microscopía.

Mediante el análisis de composición elemental se pudo determinar que

gran parte de los proceso de deterioro del Baluarte de San Carlos, ocurren
como consecuencia de procesos naturales de intemperización entre los que se
incluye la acción microbiana.

En este sentido, la adaptación de una metodología fue de gran

importancia para la búsqueda de los microorganismos presentes en el Baluarte
de San Carlos, que puede ser utilizada para el desarrollo de posteriores
estudios sobre biodeterioro que sufren las edificaciones históricas de la ciudad
de San Francisco de Campeche.

El uso del programa informático BLAST, fue herramienta esencial y de

gran eficacia en la identificación filogenética de la microbiota del Baluarte de
San Carlos.

51
 IV  REFERENCIAS

Alonso F. J.; Esbert R. M.; Ordaz J.; Vázquez P. 2006. Análisis del deterioro en los materiales
pétreos de edificación. Revista Electrónica (3): 23-32.
Aparecida de Resende, M. 2001. Fungus deteriogênicos em prédios hitóricos de pedra. En:
Videla H.A. y Giúdice C.A. (Eds) Jornadas científico tecnológicas sobre prevención y
protección del patrimonio cultural Iberoamericano de los efectos del biodeterioro
ambiental. España. Cooperación iberoamericana subprograma XV CITED para el
desarrollo. Pp.79-103.
Ariño Vila, X. y Gómez-Bolea, A. 2001. Colonización de monumentos y construcciones
pétreas por los líquenes. En: Videla H.A. y Giúdice C.A. Jornadas científico
tecnológicas sobre preservación y protección del patrimonio cultural Iberoamericano
del biodeterioro ambiental. España. Cooperación iberoamericana subprograma XV
CITED para el desarrollo. Pp 95-108.
Arocena J., Siddique T., Thring R., Kapur S. 2007. Investigation of lichens using molecular
techniques and associated mineral accumulations on a basaltic flow in a Mediterranean
environment. Catena 70, 356-365.
Bonazza, A.; Sabbioni, C.; Ghedini, N.; Hermosin, B.; Jurado, V.; Gonzalez, M. J. y Saiz-
Jimenez, C. Did smoke from the Kuwait oil well fires affect Iranian Archaecological
Heritage. Enviromental Science and Technology. Vol. XX
Campion-Alsumard T.;Golubic S.; Pnatazidou A. 1996. On the Euendolithic genus Solentia
ercegovic. Arch Hydrobiol Suppl 117:107-127
Camuffo, Dario. 1995. Intemperismo físico de las rocas. The Science of the Total
Environment. Padova Italy. 167: 1-14
Caneva, G.; Gori, E.; Montefinale, T. 1995. Biodeterioration of monument in relation to climatic
changes in Rome between 19-20th centuries. The Science of the Total Enviromen, 167:
205-214.
Corvo F.; Reyes J.; Valdes, C. y Villaseñor F. 2009. Influence of air pollution and humidity on
limestone materials degradation in historical buildings located in cities under tropical
coastal climates. Springer. 205: 1-4.
Chiquini Herrera M. S. 2003. Análisis microbiológico de la superficie pétrea de la fachada
principal de la catedral de Campeche. Universidad Autónoma de Campeche. Pp. 1-94.
Crispim C. A., Gaylarde P., Gaylarde C. 2004. Biofilms on church wall in Porto Alegre RS,
Brazil, with special attention to cianobacteria. International Biodeterioration and
Biodegradation 54:121-124.

52
Crispim C. A., Gaylarde P., Gaylarde C. y Neilan B. 2005. En: Ortega-Morales, B. O;
Gaylarde, C. C.; Narvaez-Zapata y Gaylarde P.M. (Eds). LABS 5 Fifth Latín América
Biodegradation and Biodeterioration Symposium. Campeche, Universidad de
Autónoma de Campeche, Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional. Pp.71-75.
De la Rosa, M. C.; Mosso, M. A.; Ullán, C. 2002. El aire: hábitat y medio de transmisión de
microorganismos. Observatorio Medioambiental, 5: 375-402.
De los Ríos A. y Ascaso C. 2005. Contributions of in situ microscopy to the current
understanding of stone biodeterioration. International microbiology 8:181-188.
De los Ríos, A., Cámara B., Wierzchos J. y Ascaso C. 2008. Diagnóstico de procesos de
biodeterioro por combinación de microscopía in situ y técnicas de biología molecular.
En: La investigation sobre patrimonio cultural. Sainz-Jiménez, C. y Rogerio Candelera,
Miguel A. (Ed.). Red Temática del CSIC de Patrimonio Histórico y Cultural. Sevilla. Pp.
183-194.
De Sousa Saad, Denise; Gaylarde, Christine; Graham Kinsey; Seugbum Kim. Métodos
moleculares para el deteccaeo de Fungos em biofilmes. En: Biodeterioro de
Monumentos Iberoamericanos. Sainz-Jiménez, C. y Videla, Héctor A. (Ed.) 2001.
Subprograma XV Corrosión e impacto ambiental sobre los materiales CITED. Pp. 45-
56.
Dennis, A.; Kenneth S,; Gaylarde, C. 2004. Introducción al Biodeterioro. 2ª ed. Acribia, S.A.
Zaragoza, España. Pp. 1-211.
Diario Oficial de la Nación, 1996. Caracterización ecológica, ambiental y de los recursos
naturales de la región de los Petenes en Campeche
Diez, B., Pedro´s-Alio, C., L. Marsh, T., Massana, R. 2001. Application of Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis (DGGE) To Study the Diversity of Marine Picoeukaryotic
AsMEBblages and Comparison of DGGE with Other Molecular Techniques. Applied
And Environmental Microbiology, 67(7):2942–295.
Dolske, D.A. 1995. Deposition of atmospheric pollutans to monuments, statues, and buildings.
The Science of the Total Enviroment. 167: 15-31.
Dupuy, P.; Trotet, G.; Grossin, F. 1976. Protection des monuments contie les cyanophyces en
mileu abrite et humide. En: The conservation of stone I, Centro per la conservazione
delle sculture all´Aperto, CR. Rossi-Manaress, ed. Boloyna, 2005-219.
García, D.; Jiménez, J.; Martínez, M.; Castillo, J. 2005. Identificación y aislamiento de Hongos
filamentosos de artefactos del museo “Cornelis Johanes Marrinkelle” y su control por
biocidas. En: Ortega-Morales, B. O; Gaylarde, C. C.; Narváez-Zapata y Gaylarde P.M.
(Eds). LABS 5 Latín América Biodegradation and Biodeterioration Symposium.

53
 Campeche, Universidad de Autónoma de Campeche, Centro de Investigación y
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Pp. 149-155.
García de Miguel, J.M.; Sánchez-Castillo L; Ortega-Calvo J.J.; Gil J.A.; Sainz-Jiménez
C.1995. Deterioration of building materials from the Great Jaguar Pyramid at Tikal,
Guatemala Building. Enviromental 30:591-598.
Gaylarde, C.C. 2001. Os fungus como organismos deteriogénicos em predios históricos
construidos de pedra. En : Biodeterioro de monumentos históricos de Iberoamérica.
Videla Héctor A. (Edit.) CYTED Programa de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo.
Sevilla, España. Pg. 33-44
Gaylarde, P. M. y Gaylarde, C. C. 2000. Algae and Cyanobacteria on painted buildings in Latin
America. International Biodeterioration and Biodegradation 46, 93-97.
Gaylarde, P. M. y Gaylarde, C. C. 2005. A comparative study of the major microbial biomass
of biofilms on exteriors of buildings in Europe and Latin America. International
Biodeterioration and Biodegradation 55, 131-139.
Guiamet, P.S.; Gómez de Saravia, S. G.; Nuñez G. 2005. Biodeterioration of buildings stone
by cyanobacteria, bacteria and fungi. En: Ortega-Morales, B. O; Gaylarde, C. C.;
Narváez-Zapata y Gaylarde P.M. (Eds). LABS 5 Latín América Biodegradation and
Biodeterioration Symposium. Campeche, Universidad de Autónoma de Campeche,
Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Pp.
51-53.
Gómez-Alarcón, G.; Cilleros, B.; Flores, M.; Lorenzo, J.1995. Microbial communities and
alteration processes in monuments at Alcala de Henares, Spain. The Science of the
Total Environment. 167: 231-239.
Gómez, A.; Muñoz, M.; Ariño, X.; Ortega, C. 1995. Microbial communities in weathered
sandstones: the case of Carrascosa of Campo Church, Spain. The Science of the Total
Environment. 167: 249-254.
Gómez de Saravia, S.G. 2001. Las cianobacterias en el deterioro de monumentos. En:
jornadas científico tecnológicas sobre la preservación y conservación del patrimonio
cultural Iberoamericano del biodeterioro ambiental. Videla Héctor A. (Edit.) CYTED
Programa de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. La Plata, Argentina.57-65
González, J. M y Saiz-Jiménez, C.2005. Application of molecular nucleic acid-based
techniques for the study of microbial communities in monument and artworks.
International Microbiology 8:189-194.
Gorbushina, Anna A. 2007. Minireview: Life on the rocks. Environmental Microbiology 9(7):
1613–163.
Gorbushina, A. A.; Lyalikova, N. N.; Vlasov, D. Yu; Khizhnyak, T. V. 2002. Microbial
communities on the monuments of Moscow. Microbiology, 71(3): 350–356.

54
Gutierrez, T.G. 2008. Caracterización de costras de deterioro del Baluarte de San Carlos del
conjunto Histórico-Arquitectónico de la Ciudad de San Francisco de Campeche,
mediante técnicas analíticas avanzadas (Para obtener título de Químico Farmacéutico
Biólogo). Universidad Autónoma de Campeche.
Jurado Lobo, V. 2005. Revisión taxonómica del genero Agromyces gledhill y Casida, 1969, y
descripción de nuevas especies aisladas de ambientes hipogeos. España. Instituto de
Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, CSIC. Pp 1-228.
Jurado Lobo, V.; Benavente, D.; Cuezva, S.; Reyes, J.; Cañaveras, J. C.; Sánchez-Moral, S.;
González J. M. and Sáiz-Jiménez, C. 2007. Deterioro asociado a biopelículas
microbianas en la iglesia de San Roque, Campeche, México. En: Red Temática del
CSIC de Patrimonio Histórico y Cultural, 2008. Editores: Cesáreo Sáiz Jiménez y
Miguel Ángel Rogerio Candelera España. Pp 1-228.
Hueck, H.J. 1965. The biodeterioration of materials as part of hylobiology, Mater Org., 1(1), 5 -
34.
Hueck H.J.1968. The biodeterioration of materials-an appraisal. In Biodeterioration of
materials. Eds. Walters, A. H. and Elphiick, J. S. Elsevier, London, pp. 6-12.
Huitz B.M. 2005. Fortificación de San Francisco de Campeche. Arquitectura, usos,
arqueología y restauración. Diario de campo. Boletín interno de los investigadores del
área de antropología. Pp. 22-25.
INEGI. 1984. Carta Geológica E15-3, Escala 1:250,000. Campeche. Primera impresión.
Kumar, R.; Kumar, A. 1999. Biodeterioration of stone in tropical environments. Instituto de
conservación Getty. Pp. 1-87.
Lamenti G., Tomaselli L. y Tiano P., 2003. Cyanobacteria and Biodeterioration of Monumental
Stones. En: Molecular Biology and Cultural Heritage, 2004. Sáiz-Jiménez (ed.)
Balkema. Sevilla, España. Pp. 73-78.
Little, B.J. y Ray, R. 2005. The role of fungi microbiologícally influenced corrosion. En: Ortega-
Morales, B. O; Gaylarde, C. C.; Narvaez-Zapata y Gaylarde P.M. (Eds). LABS 5 Fifth
Latín América Biodegradation and Biodeterioration Symposium. Campeche,
Universidad de Autónoma de Campeche, Centro de Investigación y Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Pp.71-75.
Lodish H., Berk, A. Lawrence Z.S., Matsudaira P., Baltimore, D., Kaiser, C.A., Scott, M Darnell
J. 2006. Biología cellular y molecular. 5 edición. Panamericana. Argentina. Pp. 973.
Madigan, M., Martinko, J.M. y Parker, J. 2003. Brock biología de los microorganismos. 10ª ed.
Pearson Prentice Hall. España. 1036 Pp.
Maravelaki- Kalaitzaki P. “Black crusts and patinas on Pentelic marble from the Partenon and
Erechtheum (Acropolis, Athens): characterization and origin”. Analytica Chimica Acta
532. 2005, 187-198.

55
Martínez, T.M.; Campos, G.J.; Farías, E.A.; García, P.E. y Granados G.M. 2006. Principios de
Biología Molecular. Secretaria de Educación pública. México. Pp. 236.
Martín Pérez, A. 1990. Ensayos y experiencias de alteración de obras de piedra de interés
histórico artístico. Fundación Ramón Areces. Pp125-149.
Metals Handbook. 1988. Materials characterization. American Society for Metals. 10: 82-85,
109-1011, 639-641, 649-651.
Mitchell, R. y Gu, Ji-Dong. 2000. Changes in the biofilm microflora of limestone caused by
atmospheric pollutants. International Biodeterioratión and Biodegradatión. 46: 299-303.
Morales, R. J. 2004. Manual de análisis de suelos. Universidad Autónoma de Yucatán. México
pp.35-36
Moropoulou A., Bisbikou K., Torfs K., Van Grieken R., Zezza F. and Macri F. Origin and
growth of weathering crusts on ancient marbles in industrial atmosphere. Atmospheric
Enviroment 32, 1998, 967-982.
Nimis, Pier L. 2001, Artistic and Historical Monuments: Threatened Ecosystems. Section II /
Man And The Environment, 4: 557-569.
Nübel, Ulrich, Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. 1997 PCR Primers To Amplify 16S rRNA Genes
from Cyanobacteria. Applied And Environmental Microbiology, 63 (8): 3327–3332.
Ortega-Morales, B. O., Guezennec, J.; Hernandez-Duque, G.; Gylarde, C.C y Gaylarde, P.M.
2000. Phototrophic biofilms on ancient Mayan building in Yucatan, México. Current
Microbiology. 40: 81-85.
Ortega-Morales, B. O. y Hernández-Duque, G. 1998. Biodeterioro de Monumentos Históricos
Mayas. Caso de Biodegradación Microbiana de las Edificaciones en Uxmal (Yucatán).
Ciencia y Desarrollo. 24: 48-53.
Ortega-Morales, B.O.; López-Cortés, A.; Hernández-Duque, G.; Crassous, P.; Guezennec, J.
2001. Extracellular Polymers of Microbial Communities Colonising Limestone Surfaces.
In: R. Doyle (ed), Methods in Enzymology, 336:331-339.
Ortega-Morales, B.O. 2004. Biofilms fouling ancient limestone Maya monuments in Uxmal,
México. Current Microbiology 40, 81-85.
Peraza Zurita, Y.; Cultroneb, G.; Sánchez Castillo, P.; Sebastián, E.; Bolívar, F.C. 2005.
Microalgae associated with deteriorated stonework of the fountain of Bibatauín in
Granada, Spain. International Biodeterioration & Biodegradation 55: 55–61.
Piñar G., Laiz L., Lubitz W. y Saiz-Jiménez. 2002. Estudio Comparativo de Comunidades
Bacterianas en Monumentos Mediante Técnicas Moleculares y Microbiológicas. En:
Biodeterioro de Monumentos de Iberoamérica. 2002. Editores: Saiz-Jiménez, C. y
Videla Héctor, A. CYTED. Pg. 57-79.
Reyes Trujeque, J. 2004. “Criterios diagnósticos para la identificación de los componentes
orgánicos en materia particulada procedente del tráfico automovilístico y su aplicación

56
 al estudio del deterioro de la Catedral de Sevilla”. Tesis de Doctorado. Facultad de
Química. Universidad de Sevilla, 7-11.
Reyes, J. 2005. Proyecto “Influencia del entorno urbano en los procesos de degradación de
edificios militares y religiosos de la época colonial en la ciudad de Campeche” Clave
FOMIX CAMP.2005-C01-028. Centro de Investigación en Corrosión. Universidad
Autónoma de Campeche.
Reyes, J., Torres, F., Miss, M., Corvo F., Bravo, H., Bartolo- Pérez, P. Azar-Barrios A. 2009.
Effect of the environment on the degradation of colonial and prehispanic buildings in
Campeche, México. En :Environmental degradation os infrastructure and cultural
heritage in coastal tropical climate. González-Sánchez J., Corvo F. y Acuña-González.
Transworld Research Network. 37/661 (2).
Rodríguez Sánchez, I.P. y Barrera Saldaña, H.A. 2004. La Reacción en cadena de la
polimerasa a dos décadas de su invención. Ciencia UANL, 7(3):323-332.
Rosato, V. G. 2001. Líquenes sobre materiales cementíceos, rocas y materiales cerámicos.
En: Videla H.A. y Giúdice C.A. (Eds) Jornadas científico tecnológicas sobre prevención
y protección del patrimonio cultural Iberoamericano de los efectos del biodeterioro
ambiental. España. Cooperación iberoamericana subprograma XV CITED para el
desarrollo. Pp.65-78.
Saiz-Jiménez, C. 1997. Biodeterioration vs Biodegradation: the Role of Microorganisms in the
Removal of Pollutants Deposited on Historic Buildings. Elsewer Science. International
biodeterioration and biodegradation, 40(2-4): 225-232.
Saiz-Jiménez, C. 2003. Molecular Biology and Cultural Heritage. Balkema Publishers. Sevilla,
Spain. Pp. 287.
Saiz-Jiménez, C. y Ariño Xavier. 2000. Colonización biológica y deterioro de morteros por
organismos fotótrofos. En: La Investigación sobre Patrimonio Cultural. Editores: Sáiz-
Jiménez y Rogerio Candelera Miguel. Red Temática del CSIC de Patrimonio Histórico
y Cultural, 2008. Sevilla. Pp. 58-71
Saiz-Jiménez, C. y González Grau, Juan M. 2008. Microbiología y Patrimonio cultural. En: La
Investigación sobre Patrimonio Cultural. Editores: Sáiz-Jiménez y Rogerio Candelera
Miguel. Red Temática del CSIC de Patrimonio Histórico y Cultural, 2008. Sevilla.
Pg.197-215.
Tôrôk Á., Rozgonyi N. 2004. Morphology and mineralogy of weathering crusts on highly
porous oolitic limestones, a case study from Budapest. Environmental Geology 46, 33-
349.
Torres G.F. 2009. Efecto de la lluvia en materiales pétreos del patrimonio histórico del Estado
de Campeche (Maestro en Ciencias Marinas. Opción: Preservación de infraestructura
marina). Universidad Autónoma de Campeche.

57
Videla H.A.; Guiamet P.S.; Gómez de Saravia, S.G. 2003. Biodeterioro de materiales
estructurales de sitios arqueológicos de la civilización maya. Revista del Museo de La
Plata. 44: 1-11.
Videla, Héctor A., Guiamet, Patricia S. y Gómez de Saravia Sandra G. 2000. Biodeterioro de
materiales o corrosión atmosférica: Una dicotomia ficticia. Dos casos prácticos de
biodeterioro del patrimonio cultural Maya. En: biodeterioro de monumentos históricos
de Iberoamérica. Videla Héctor A. (Edit.) CYTED Programa de Ciencia y Tecnología
para el Desarrollo. Sevilla, España. Pg. 5-17.
Videla, Héctor A. y Saiz-Jiménez, C. 2001. Biodeterioro en monumentos. En: biodeterioro de
monumentos históricos de Iberoamérica. Videla Héctor A. (Edit.) CYTED Programa de
Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Sevilla, España. Pg. 1-18.
Warscheid, Th. Y Braams, J. 2000. Biodeterioration of stone: a review. Internacional
Biodeterioration y biodegradation, 46:343-368.
Weisburg, William G., Barns, Susan M., Pelletier, Dale A., Lane, David J. 1991. 16S
Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal Of Bacteriology, 173(2):
697-703.
Welton, R.G, Ribas, S.M., Gaylarde, C., Herrera, L.K.; Anleo, X., De Beile, N. 2005.
Techniques applied to the study of microbial impact on building materials. Materials
and Structures 38: 883-893.
Zimmermann, J., González, J. M., Sáiz-Jiménez, C. 2005. Detection and Phylogenetic
Relationships of Highly Diverse Uncultured Acidobacterial Communities in Altamira
Cave Using 23S rRNA Sequence Analyses. Geomicrobiology Journal, 22:379–388.

58
 X  ANEXOS

10.1.- Anexo A
10.1.1-. Estudios Microscópicos, Químicos y Biológicos

Los métodos normalizados de detección e identificación de

microorganismos utilizados en los estudios de biodeterioro (Metals Hand Book,
1988; De sousa et al., 2001; Piñar et al., 2002; Saiz-jimenez 2003; Arocena et
al., 2007; De los Ríos y Acaso, 2005; De los Ríos, et al., 2008).

Tabla 4 Estudios Microscópicos, Químicos y Biológicos

ESTUDIOS MÉTODOS Y TÉCNICAS

Microscopio óptico, hace posible reconocer la morfología y
estructura de cada grupo de organismo o material.
Microscópicos Microscopio Electrónico de Barrido, da una observación
tridimensional de la morfología de un material orgánico o inorgánico.
Microscopio Electrónico de Transmisión, util para ver
microestructuras de la célula.
Espectroscopia de Rayos X, permite la identificación y
determinación cualitativa y cuantitativa de estructuras y composición
elemental.
Espectroscopia de Absorción UV Visible, herramienta para
Químicos caracterizar moleculas y componentes orgánicos, inorgánicos
presentes en muestras sólidas, líquidas o gaseosas.
Espectroscopia Infrarroja, se emplea para caracterizar materiales
y determinar estructura molecular de componentes orgánicos e
inorgánicos.
Microbiológicas y bioquímicas, permiten estudiar las actividades
Bioquímicos metabólicas de los microorganismos así como su identificación.
Biología molecular, es útil para caracterizar comunidades
microbianas.

10.2.- Anexo B
10.2.1-. Medio de agar-sangre

Se rehidrató 16gr del medio en 400ml de agua destilada. Se dejó

reposar por 15minutos. Se calentó agitando frecuentemente hasta el punto de
ebullición durante 2minutos hasta su completa disolución. Se esterilizó en
autoclave a 121°C (15 Ibs de presión) durante 15minutos. Se enfrió a 45°C y se

59
agregó 5% de sangre humana estéril, sin desfibrinar girando suavemente el
matraz para evitar la formación de burbujas, se homogeneizó y se vació en
cajas de petri de 20ml.

Estas se colocaron en la estufa a 37°C, pasadas 24 hrs. se observaron a

simplevista para ver si hubo o no contaminación. Subsecuentemente las
viables se refrigeraron a 10°C para su posterior uso.

10.2.2-. Soluciones

Acetato de sodio 3M (pH 5.25)

Disolver el acetato de sodio trihidratado (40.81 g) en 200 ml de agua

desmineralizada y ajustar el pH a 5.25 empleando ácido acético glacial.
Añadir agua desmineralizada hasta un volumen final de 250 ml. Esterilizar a
121ºC durante 15 minutos.

Agarosa 2 %.

Agarosa 1.6 g
Buffer TBE 80 ml

Buffer de carga

0.25% Azul bromofenol

30% Glicerol
Aforar con agua bidestilada

EDTA 500 mM

Para 100 ml:

Pesar 18,6 g de EDTA. Ajustar el pH con NaOH primero sólido y luego con
una solución 1M. Poner en autoclave por 15 mn.

Etanol al 70% (V/V)

Etanol absoluto 70 ml

60
 Agua destilada 30 ml
Fenol equilibrado

En 20 ml de agua bidestilada derretir 250 g de fenol en baño de María a

65°C, añadir 250 mg de 8-hidroxiquinolina y 200 ml de buffer Tris-HCl 0.5 M
(pH 8,0), mezclar con agitador magnético por 15 a 20 minutos. Dejar en
reposo hasta que se formen dos fases y luego descartar la fase superior por
aspiración. Añadir 250 ml de Tris-HCL 0.1 M (pH 8,0), agitar por 15 a 20
minutos y descartar la fase superior. Realizar este último paso 2 veces más,
al descartar por tercera vez la fase superior se le agrega 25 ml de Tris-HCl
0.1 M (pH 8,0) con b-mercaptoetanol al 0.2 %.

Fenol Cloroformo Isoamilico

25 partes Fenol equilibrado
24 partes Cloroformo
1 parte Alcohol isoamílico

TBE
Para preparar un litro de TBE
54 gr. Tris base
27 gr. De ác. Bórico
20 ml de EDTA 05 M (pH 8 a 8.5)

10.3.- Anexo C
10.3.1-. Técnica de Microscopía Electrónica de Barrido acoplado
(MEB/EDS)

Esta técnica acoplada, con los sistemas de EDS y los sistemas de

Microscopia Electrónica de Barrido (MEB/EDS), por lo que además de tener
una imagen de la superficie de una muestra, se puede analizar su composición
elemental.

La Microscopia Electrónica de Barrido (MEB), es una técnica se basa en la

interacción de electrones acelerados que inciden sobre una muestra, para

61
liberar electrones secundarios, los cuales interactúan con los átomos que
componen la muestra, produciendo señales que contienen información sobre la
topografía, la composición y otras propiedades de la muestra, como la
conductividad eléctrica. Estos datos se registran en un detector, que convierte
la señal a un potencial, la amplifica y la envía a la pantalla para presentarla
como una imagen.

Mientras que la Espectrometría de Energía Dispersa de Rayos X (EDS),

es una técnica de microanálisis utilizada para el análisis elemental o la
caracterización química de una muestra. Se basa en las interacciones entre la
radiación electromagnética y la materia, que se manifiesta por la emisión de
rayos X en respuesta a los choques de partículas de alta energía con una
muestra. Por lo que su capacidad de caracterización se debe en gran parte al
principio fundamental de que cada elemento tiene una estructura atómica única
lo que permite que los rayos X de un elemento puedan ser identificados.

Por lo que al ser unificadas estas dos técnicas, permite el análisis

morfológico y de composición elemental de diversas muestras. Para ello se
tomó un fragmento de cada muestra (1 x 1 cm). Se colocó en un soporte de
aluminio especialmente diseñado para la técnica, con la ayuda de una espátula
y pinzas estériles, usando como adherentes cintas conductoras de carbón.
Posteriormente cada soporte de muestra se colocó en el portamuestra del
equipo, el cual tiene una capacidad para seis muestras.

Las condiciones de operación fueron de 10 y 25 kV, distancia

aproximada de 12 mm del espécimen y un ángulo de inclinación de 0°; para la
obtención del espectro de rayos X se empleó un detector SATW-Sapphire, con
una resolución de 131.32 Ev.

9.3.2-. Técnica de extracción de ADN con FCI

Se pesaron 150 mg de las muestras y se colocaron en microtubos de 2

ml. Se mezclaron con un agitador vortex durante aproximadamente 1 minuto
hasta su homogeanización.

62
 La cepa de control de Escherichia coli, se cultivo en un medio de agar-
sangre en caja de petri estérile (Anexo A). Pasadas las 24 hrs de crecimiento
se le agrego dos volúmenes de agua estéril con una pipeta Pasteur, las
colonias resuspendidas en agua se colocaron en un microtubo de 2 ml, listas
para su extracción. Por otra parte S. cereviciae (levadura casera) se tomaron
150 mg y se colocaron en un microtubo de 2 ml.

Se colocaron 500 µl de agua estéril y 500 µl de FCI en cada uno de los

microtubos, se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 minutos, observándose la
formación de dos fases, se recuperó la fase acuosa y se colocaron en otros
microtubos, se agregó FCI volumen- volumen y se centrifugó a 10,000 rpm por
10 min.

Posteriormente se retiró el sobrenadante y se colocaron en otros

microtubos. Se agregaron acetato de sodio al 10 % y 3 volúmenes de etanol
absoluto. A continuación se dejaron a -20°C por 24 hrs. Se centrifugó a 10,000
rpm por 5 min. Se desechó el sobrenadante, y se lavó el pellet 2 veces con 500
µl de etanol al 70 %, mezclando suavemente, para posteriormente centrifugar,
una vez terminado dicho proceso, se dejó secar a temperatura ambiente por 15
min.

Una vez evaporizado el etanol, se agregaron 20 µl de agua inyectable

para PCR y se colocaron en un microtubo de 100 µl y se refrigeraron a -20oC
hasta su uso.

63