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TESIS
HUANCAYO - PERÚ
2017
JURADO EXAMINADOR
i
Dedicado a mi madre Sra. Feliciana Requena de Chamorro y hermanos quienes me impulsaron
a superarme cada día, también por su incondicional e invaluable apoyo brindado hasta el día
de hoy.
ii
Agradecimientos
• A la empresa IMBAREX S.A. por permitirnos usar su equipo de extracción con CO2-
supercrítico.
• Y a todos aquellos que han estado junto a mí durante el desarrollo de este trabajo de
investigación
INDICE GENERAL
iii
LISTA DE TABLAS ix
RESUMEN 1
I. INTRODUCCIÓN 2
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1 CAROTENOIDES 4
2.1.1 Presencia y distribución de los carotenoides 4
2.1.2 Estructura de los carotenoides 5
2.1.3 Propiedades generales 8
2.1.3.1 Propiedades físicas 8
2.1.3.2 Propiedades espectroscópicas 8
2.1.4 Estabilidad de los carotenoides 10
2.1.4.1 Efecto de la oxidación 10
2.1.4.2 Efecto de la temperatura 11
2.1.4.3 Efecto de la luz 12
2.1.4.4 Efecto del pH 12
2.1.5 Biodisponibilidad de los carotenoides 13
2.1.6 Actividad biológica 13
2.2 EXTRACCION DE COMPUESTOS BIOACTIVOS ....... 14
2.2.1 Métodos de extracción 14
2.2.2 Extracción mediante fluidos supercríticos 16
2.2.3 Fluidos supercríticos 16
2.2.4 Factores que afectan el rendimiento de extracción con fluidos supercríticos 19
2.2.4.1 Preparación de la muestra 19
2.2.4.2 Tamaño de partícula 20
2.2.4.3 Parámetros: temperatura y presión 20
2.2.4.4 Humedad 20
2.2.4.5 El uso de cosolventes 21
2.2.5 El CO2 fluido supercrítico 21
2.2.6 Etapas principales del proceso de extracción supercrítica 22
2.2.7 Equipamiento para la extracción supercrítica 23
2.3 ANTECEDENTES DE EXTRACCION POR FLUIDOS SUPERCRITICOS 24
2.4 LA ZANAHORIA 28
2.4.1 Descripción 28
2.4.2 Clasificación Taxonómica 28
2.4.3 Propiedades 29
2.4.4 Aporte Vitamínico 29
iv
2.4.5 Los carotenos y el color de las zanahorias 30
III. MATERIALES Y METODOS 31
supercríticos- CO2 33
3.4.1.1 Acondicionamiento de la zanahoria 33
3.4.1.2 Descripción del flujo de procesamiento 34
3.4.1.3 Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por el
método convencional (tetrahidrofurano – metanol) 35
v
VI. RECOMENDACIONES 64
VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA 65
VIII. ANEXOS 73
LISTA DE FIGURA
46
vi
con CO2-supercrítico a 280 bar y 40 °C. 47
52
vii
Tabla 5. Propiedades criticas de las sustancias más comúnmente empleadas
en condiciones supercríticas
27
Tabla 18. Comparación de rangos múltiples por Duncan para las temperaturas 62
viii
RESUMEN
I. INTRODUCCION
1
A nivel mundial, la preocupación por el aprovechamiento de residuos ha tomado gran
fuerza entre la comunidad científica y a nivel industrial. Sin embargo los residuos
sólidos de zanahoria generados en las transformaciones agroindustriales y por las
pérdidas postchosecha en el Perú aún no han sido aprovechados eficientemente, en
parte por desconocimiento y por la falta de métodos apropiados para la extracción de
carotenoides.
Es importante destacar que las zanahorias, al igual que otras hortalizas, desempeñan
un papel muy importante en el equilibrio de la dieta humana, especialmente por su
composición en vitaminas, minerales y otros compuestos bioactivos, caracterizándose
además por ser pobre en grasa y rica en fibra dietética. Los estudios de calidad
nutricional de las zanahorias, muestran que tienen alto contenidos de β-caroteno
(Fraser y Bramley, 2004), que estos pueden variar con factores físicos y ambientales,
y además tienen alta capacidad antioxidante (Nicolle, Simon, Rock, Amouroux y
Remesy, 2004). Los pigmentos responsables del color de las zanahorias, son de
importancia para los científicos de alimentos y nutrición debido a su provitamina A y a
la actividad antioxidante. β-caroteno constituye una porción grande (60 – 80 %) de los
carotenoides en la zanahoria seguido de α-caroteno (10 – 40 %), luteína (1 – 5 %) y
otros carotenoides menores (0,1 – 1 %) (Sun y Temelli, 2006).
Por otra parte, los fluidos supercríticos han sido usados ampliamente en la extracción
de diversos compuestos naturales a partir de plantas debido a las propiedades que
presentan y principalmente porque no dejan residuos en el producto final y además por
ser amigable con el medio ambiente. El dióxido de carbono (CO2) en estado
supercrítico es uno de los disolventes más utilizados en este tipo de tecnología debido
a que su temperatura critica es baja (31,1 °C) esto permite que sea un disolvente
apropiado para la extracción de compuestos termolábiles como es el caso de los
2
carotenoides que sufren descomposición térmica por arriba de 65 °C, además es
barato, fácil de transportar y no es toxico.
Objetivo General:
Objetivos Específicos:
3
II. REVISION BIBLIOGRÁFICA
2.1 CAROTENOIDES
Los carotenoides son pigmentos naturales más comunes, son los responsables de la
gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos incluidos en los alimentos
vegetales y en algunos alimentos de origen animal, también presentes en pájaros,
insectos, peces y crustáceos. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia
que se dividen en dos grandes grupos según su estructura química, los
hidrocarbonados llamados carotenos y los oxigenados denominados xantofilas
(Rodríguez- Amaya 1999). Desempeñan una gran diversidad de funciones biológicas
en las plantas sino que también son importantes para los animales y los seres
humanos. (Esteban, Moran, Berrecil y Garcia, 2015). Pero el papel más importante en
la dieta humana es su capacidad como provitamina A, sin embargo para obtener
beneficios de los carotenoides, estos deben absorberse, transportarse y ser
depositados en ciertos tejidos (Dutta, Chadhuri y Chakraborty, 2005).
4
Son varios los factores que afectan el contenido de carotenoides en las plantas,
entre los cuales se pueden mencionar, los factores genéticos, el estadío de
madurez del vegetal, su procesamiento y almacenamiento; factores ambientales
como, la exposición a la luz (a mayor exposición mayor concentración de
carotenoides), condiciones del cultivo y enfermedades de los vegetales
(Fennema, 2000).
5
Tabla 1. Estructura y características de los carotenos comunes en los
alimentos
6
Tabla 2. Estructuras y características de las xantofilas comunes en los
alimentos
7
2.1.3. Propiedades generales
8
estructural distintivo de los carotenoides es un sistema extenso de
dobles enlaces conjugados, el cual consiste en alternar enlaces
carbono-carbono simple y doble. Por lo general se denomina cadena
poliénica. Esta parte de la molécula conocida como el cromóforo, es
responsable de la capacidad de los carotenoides de absorber luz en la
región visible (480-780 nm) y en consecuencia su gran capacidad de
coloración. (Mínguez, Perez y Hornero, 2005) y (Rodríguez- Amaya,
1999). El color se acentúa a medida que se extiende el sistema
conjugado de dobles enlaces y la presencia de diferentes grupos
funcionales determinaran en última instancia las características
espectroscópicas propias de cada pigmento. La ciclación causa algún
impedimento, por tanto el β-caroteno y el caroteno son de color
naranja y rojo - naranja respectivamente, aunque tienen el mismo
número de enlaces dobles conjugados que el licopeno (once). La
intensidad y matiz de los colores en los alimentos dependen de que
carotenoides están presentes, sus concentraciones y estado físico.
(Rodríguez- Amaya, 1999).
9
Figura 2. Espectro de absorción ultravioleta/visible para los
carotenoides.
Los carotenoides, son insolubles en agua y por lo tanto las pérdidas por lixiviación
durante el lavado y procesamiento de frutos son mínimas. Otros tratamientos
empleados en las industrias alimentarias, como por ejemplo el tratamiento a alta
presión, parecen no afectar significativamente a los niveles de carotenoides en
diversos productos vegetales (Meléndez et al., 2004).
10
que se oxidan más rápidamente cuando se extraen del fruto o se purifican,
es decir la intensidad de la oxidación de los carotenoides depende si el
pigmento se encuentra en el laboratorio y de las condiciones ambientales
(Díaz, 2008). En presencia de oxigeno se produce una degradación
oxidativa, a menudo paralela a la oxidación de lípidos. La tasa de
oxidación depende de la presión parcial de oxígeno, actividad del agua y
temperatura. Los carotenoides, en general son más estables en sistemas
con elevado grado de instauración, ya que el propio sistema acepta más
fácilmente oxígeno y radicales libres, antes que el carotenoide.
Inversamente, en sistemas con lípidos saturados los carotenoides
presentan mayor inestabilidad. (Begoña, Granado y Navarro, 2001). En
consecuencia estos compuestos pueden actuar como pro- o antioxidantes
dependiendo del potencial redox de la molécula y del entorno, entre otros
factores. Los carotenoides que contienen 9 o más dobles enlaces
conjugados pueden inactivar ciertas formas reactivas de oxígeno, como
el oxígeno singlete. En este sentido, el β-caroteno posee como
característica importante, que lo diferencia del resto de antioxidantes
solubles en grasas (como la vitamina E), la de ser más efectivo a bajas
presiones de oxígeno (Meléndez et al., 2004).
11
temperatura de cocinado y contacto con agua, mayor es la retención de
carotenoides. De entre las distintas formas de cocinado evaluadas (al
vapor, cocidas a presión, trituradas, etc), la cocción de las zanahorias en
agua y sin presión resultó ser la que producía una mayor retención de los
carotenoides estudiados (Meléndez et al., 2004).
12
2.1.5. Biodisponibilidad de los carotenoides
13
Los carotenoides también se han relacionados con un aumento del sistema
inmune y una disminución del riesgo de enfermedades degenerativas tales
como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, degeneración macular
14
Tabla 3. Métodos empleados para la extracción de compuestos naturales
(pigmentos).
Técnicas de
extracción Descripción
La muestra se coloca en el recipiente de extracción y se
mantiene en contacto con el disolvente extractante en el
tiempo necesario a una temperatura determinada. Se hace
Maceración necesaria una filtración de la muestra
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y se
lixivia con el disolvente caliente en un extractor soxhlet
Soxhlet durante un tiempo determinado. La evaporación del se hace
convencional por separado.
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y es
introducida en el disolvente hirviendo durante 30 - 60 min.
El recipiente es entonces sometido a la extracción soxhlet
Soxhlet con el reflujo del disolvente. Es posible hacer una
Automatizada evaporación del disolvente.
La muestra es tratada con enzimas para degradar los tejidos
y paredes celulares para facilitar de esta forma el proceso
Enzimático de extracción
La muestra a extraer se coloca en un recipiente de
extracción y se le aplica ultrasonido, pudiendo controlar la
Asistida por temperatura se hace necesario la filtración y en ocasiones
ultrasonido la centrifugación del material
La muestra se coloca en una cámara de alta presión y es
extraída con el fluido supercrítico que puede circular a
través de la muestra en circuito cerrado o abierto (CO2), a
presiones mayores a 72 atm y a temperaturas mayores de
31,1 °C. Después de la despresurización los analitos son
Fluidos recogidos en un pequeño volumen de disolvente orgánico
supercríticos o en una trampa sólida
Asistida La muestra se coloca en un recipiente abierto o cerrado y se
por le adiciona el disolvente de extracción. Seguidamente se le
microondas suministra energía en forma de microondas.
Fuente: Coronel (2012)
15
2.2.2 Extracción mediante fluidos supercríticos
16
solubilidad de un soluto en el fluido supercrítico aumenta (Velasco, Villada y
Carrera, 2007). Para una temperatura constante, a bajas presiones se
favorecerá la disolución de analitos no polares o poco polares, mientras que a
presiones más altas se disolverán los polares y los de peso molecular más alto
(Luque de Castro, Valcarcel y Tena, 1993). En la figura 3. se presenta las
propiedades más importantes de un fluido supercrítico.
17
punto triple (PT), donde coexisten los tres estados, y el punto crítico (PC), al
final de la curva de vaporización. Se advierte, además, que la línea de
vaporización, línea PT – PC, tiene la singularidad de desaparecer en el punto
PC, el punto crítico, a unos valores termodinámicos de presión y temperatura
que se denominan presión crítica (Pc) y temperatura crítica (Tc),
respectivamente (Luque de Castro et al., 1993).
18
Tabla 5. Propiedades criticas de las sustancias más comúnmente
empleadas en condiciones supercríticas
Peso Densidad
molecular Presión Temperatura critica
Compuesto (g/mol) critica(bar) critica (°C) (g/mL)
Dióxido de carbono 44,01 72 31,1 0,47
Agua 18,02 214,8 374,2 0,32
Amoniaco 17,03 109,8 132,5 0,23
Argón 39,95 48,6 -122,4 0,73
Acetona 58,08 47,0 235,0 0,28
Etanol 46,07 72,0 243,4 0,28
Metanol 32,04 78,9 239,0 0,27
Metano 16,04 46,0 -82,6 0,17
Etano 30,07 47,6 32,3 0,20
Al igual que ocurre con el punto crítico, la región supercrítica también tiene unas
propiedades que la hacen peculiar (Shi, 2004 y Mukhopadhyay 2000)
19
• La viscosidad es mucho más baja que la de los líquidos, lo que confiere
propiedades hidrodinámicas de menor viscosidad si se comparan con los
líquidos.
• La bajísima tensión superficial permite una alta penetrabilidad a través de
sólidos porosos y lechos empaquetados.
20
La extracción con CO2 - supercrítico aumenta la densidad con la
presión constante y la solubilidad aumenta con la temperatura por
encima del cruce de presión. La temperatura afecta en gran medida
la tasa de extracción a presiones superiores a la adhesión (Sun y
Temelli, 2006).
2.2.4.4 Humedad
21
La mayoría de los sistemas utilizan dióxido de carbono supercrítico como
disolvente, ya que es inerte, gaseoso en condiciones de presión y temperatura
ambiente, no tóxico, no inflamable, reciclable, disponible en alta pureza, no
deja residuos, y opera a temperaturas y presiones seguras (Corbin, 2014). Es
más inocuo para el medio ambiente (se puede considerar como un disolvente
verde en todas sus aplicaciones), a pesar de que este gas es la principal causa
del efecto invernadero, cualquier aumento del efluente de CO2 derivados de la
extracción con fluido supercrítico industrial seria insignificante, plantas
comerciales recirculan CO2 por lo que su uso como un disolvente de extracción
no aumenta la cantidad ya presente en la atmosfera (Barbosa, Tapia y Cano,
2005). Tiene un bajo costo, lo que hace que su uso no sea muy costoso una
vez que se tiene el equipamiento de extracción, presenta además una alta
capacidad de solvatación, selectividad y una gran efectividad de extracción,
en muchas ocasiones superiores a los métodos tradicionales que utilizan
disolventes orgánicos (Mustapa, Manan, Mohd, Setianto y Mohd, 2011)
22
ajuste de temperatura remoción o adición de energía térmica, por medio de
intercambiador de calor o resistencias eléctricas, para que el fluido comprimido
alcance la temperatura requerida, la extracción se lleva a cabo en un recipiente
extractor a alta presión, el cual contiene la matriz que será procesado, en esta
etapa el fluido entra en contacto con la matriz y arrastra el soluto de interés, la
fase móvil que consiste en el fluido CO2-supercrítico y los componentes
solubilizados se transfiere al separador donde el poder de solvatación del
fluido se reduce mediante el aumento de la temperatura y / o disminuyendo la
presión del sistema, el extracto se precipita en el separador, mientras que el
fluido CO2-supercrítico se libera ya sea a la atmósfera o se recicla de nuevo al
extractor (Mendiola, 2008 y Shi, 2004).
23
Figura 5. Esquema de un extractor de fluidos supercríticos
Fuente: Reglero, Señoráns y Ibañez (2005).
24
disolventes orgánicos, llegaron a la conclusión de que la extracción de carotenoides a
partir de zanahoria con fluidos supercríticos es una técnica de separación viable porque
este fluido es inerte y no deja ningún residuo final no genera residuos al medio
ambiente.
Sun y Temelli (2002) estudiaron la extracción de carotenoides de zanahorias secas
Daucus carota L. con CO2 - supercrítico, empleando temperaturas de 40, 55, 70 °C y
presiones de 276, 413 y 551 bar, los principales carotenoides en el extracto de aceite
de zanahoria cruda fueron α-caroteno, β-caroteno y luteína. Comprobaron que el
rendimiento de la extracción de carotenoides totales aumentaron trabajando a
condiciones de a 55 °C y a 276 bar, obteniendo (738,9 µg/g). No hubo tendencia clara
para el cambio en el rendimiento de la luteína con la temperatura y presión.
La extracción supercrítica con CO2 tiene también inconvenientes. Por ejemplo (Daood
et al., 2002) han descrito dificultades de extracción de los diésteres de las xantofilas en
determinadas condiciones, así como el riesgo de isomerización de trans a cis de los
carotenoides.
La extracción supercrítica con CO2 también puede ser utilizada para extraer pigmentos
clorofílicos (Del Valle y Aguilera, 1999; Uquiche, Del Valle y Orriz, 2004). También
puede disminuirse la solubilidad de estos pigmentos a 45 °C y 36 MPa con un aumento
de humedad de los pelets. Además, esta solubilidad depende más de la presión (con
un aumento de rendimiento del 82 % desde 22 a 50 MPa) que de la temperatura (con
un aumento máximo de rendimiento del 29 % de 35 a 45 – 65 °C)
25
Tabla 6. Solubilidad del β- caroteno con CO2 supercrítico
Temperatura Presión Solubilidad
Autor (K) (Mpa) (Y2 x 10-7 (mol/mol)
(313-343) ± (6,2-34,3) ± (0,01-23,03) ±
Hansen et al., (2001) 0,2 0,2 30%-50%a
(308-323) ± (9,9-29,8) ± (0,22-5,0) ±
Sakaki, (1992) 0,1 NR 10%a
(310-340) ± (9,7-26,0) ± (0,15-17,0) ±
Subra et al., (1997) NR 0,1-1,5 0,02-0,7
(313-333) ± (12,0-29,9) ± (0,02-6,27)
Mendes et al., (1999) NR NR ±5%-10%a
(313-343) ± (25,7-43,9) ± (0,09-25,4) ±
Cygnarowicz et al., (1990) NR NR NR
26
Tabla 7. Extracción de carotenos con CO2 supercrítico
Zanahoria Extracción Muestra 0,5 g Extracción P: Las condiciones óptimas se obtienen a 50 °C 342 bar y 10 % de
(deshidratada para de carotenos 342, 456 y 570 bar T: 30, 40 y etanol. En estas condiciones se obtienen una extracción de 605 µg/g
congelación 50 °C µL/min t:1 h de α- caroteno y 485 µg/g de β-caroteno sobre peso seco
) Vega et al.,
(1996)
Boniatos Spanos Extracción de
et al., (1993) βcaroteno Extracción
Pretratamientos
P: 138, 276 y 414 bar T: 38 °C y
48 °C Las muestras crudas presentan poca eficiencia de extracción a
causa de su alto contenido de humedad.
con 414 bar T: 38 °C y 48 °C
Caudal de CO2 14-18 min Entre las muestras deshidratadas presentan mayor rendimiento las
deshidratadas por congelación (228 ug/g muestra) que por horno de
Volumen de CO2: 200 L aire forzado (77 ug/g muestra) Un 50 % de los carotenoides se pierde
durante el secado en el horno a causa de reacciones oxidativas.
27
2.4 LA ZANAHORIA
2.4.1 Descripción
Reino: Vegetal
Clase: Angiospermae
Subclase: Dicotyledoneae Orden:
Umbelliflorae
Familia: Umbelliferae
Género: Daucus
29
Especie: Carota L.
2.4.3 Propiedades
30
1,1 a 64,0 mg/100g fresco de β-caroteno 0,53 a 36,0 mg/100g fresco de
αcaroteno y 0,27 mg /100g fresco de luteína
31
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN
3.3.1. Equipos
32
• Fiolas volumétricas
• Balón de destilación de 250 a 500 mL
• Matraces erlenmeyer
• Cápsulas de porcelana
• Matraces Kitazato 250 a 500 mL
• Micro pipetas de 50-100 µL y de 100 - 1000 µL
• Paletas y utensilios de plástico
• Papel filtro Watman # 4
• Pipetas graduadas 1, 2, 5, y 10 mL
• Pinzas metálicas
• Pizeta
• Probetas graduadas de 10, 50, 100, 250 mL
• Placas petri
• Termómetro (-10 °C – 100 °C)
• Vasos de precipitación 10, 50, 100, 250, 600, 1000 mL
• Viales para HPLC
• Jeringas de plástico de 3 mL
• Acrodisco de 0,45 µm
• Tips para 50 - 100 µL y de 100 - 1000 µL.
3.3.3. Reactivos
• Etanol p.a
• Hexano p.a
• Patrón de carotenoides (α caroteno, β-caroteno, luteína)
• Dióxido de carbono al 99,995% de pureza
• Diclorometano grado HPLC
• Metanol grado HPLC
• Acetonitrilo grado HPLC
• Acetato de etilo grado HPLC
• Agua de grado HPLC
• BHT (Hidroxitolueno Butilado).
• Agua destilada
• Tetrahidrofurano Metanol p.a.
• Carbonato de magnesio.
33
3.4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Zanahoria
Lavado
En rodajas de 5 mm de espesor
Cortado
34
a. Se trabajó con zanahorias procedentes de la provincia de Chupaca.
35
Se utilizó el método (Widman, 2004) modificado de acuerdo a las
condiciones de la materia prima. En la figura 8. se muestra el
diagrama de flujo del proceso de extracción, este procedimiento se
realizó con propósitos comparativos.
Extracción
Metanol /Tetrahidrofurano (50:50)
convencional
Cuantificación de
Los carotenoides fueron monitoreados
carotenoides con usando un detector UV-VIS a 450 nm
HPLC
36
Para la extracción directa de muestras de alimentos que no contienen
ésteres de xantofilas, clorofila o tienen bajo contenido de grasa y alto
contenido de carotenoides (zanahoria), se utilizó este método.
37
Se utilizó el método (Nascimento et al., 2009), modificado de acuerdo
a las condiciones de la materia prima. En la figura 9. Se muestra el
diagrama de flujo del proceso de extracción.
Despresurización a 12 bar y 40 ºC
Separación
Temperatura = 40 °C
Evaporación Presión = 0,67 bar
Almacenamiento Temperatura: - 40 °C
38
Preparación de las muestras para la cuantificación de
carotenoides por HPLC
39
Para la identificación de carotenoides se utilizó un equipo de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) SHIMADZU, con
detector de arreglo de diodos.
40
PARTICULAS SECAS DE
ZANAHORIA
P1 P2
T1 T2 T3 T1 T2 T3
Donde:
P1 = Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 200 bar.
P2 =Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 280 bar.
T1 = Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 40 °C.
T2 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 50 °C
T3 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 60 °C
P1=.200 bar.
41
P2=.280 bar.
T1=40 °C.
T2=50 °C.
T2=60 °C.
Yijk = u + Pi + Tj + (PT) ij + ε
Donde:
Características Zanahoria
Humedad de equilibrio (%) 8±0,04
Humedad de trabajo (%) 10±0,09
Diámetro de la partícula (mm) 0,250 <Ø<1
45
extracción se realizó con tetrahidrofurano y metanol (1:1)
En la figura 10. se puede observar dos picos cromatográficos bien definidos que al ser
comparados con el cromatograma del patrón de carotenoides, espectros y tiempos de
retención, se puede asegurar la presencia de dos carotenoides siendo el pico
cromatográfico (1) α-caroteno y (2) β-caroteno. La luteína no fue identificada eso nos
señala que no fue extraída por el método convencional (tetrahidrofurano/ metanol) a
diferencia que con la extracción con CO2- supercrítica si se logra solubilizar y extraer
la luteína. Velasco, Villada y Carrera (2007) señalan que la selectividad durante la
extracción puede ser manipulada dada la variación de las diferentes condiciones de
operación temperatura y presión afectando la solubilidad de varios componentes en el
fluido supercrítico. Los carotenoides son pigmentos estables en el ambiente natural,
pero cuando los alimentos se calientan o cuando son extraídos en disoluciones,
aceites o en disolventes orgánicos se vuelven mucho más lábiles (Rodríguez- Amaya,
1999 y Hernández, Candelas, Meza y Minjares, 2010).
4.1.3 Determinación por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) de carotenoides
de zanahoria.
46
carotenoides.
0
T1
47
T2
48
T3
49
T5
En las figuras 12, 13, 14, 15, 16 y 17, se muestra los cromatogramas de los seis
tratamientos aplicados para la extracción de carotenoides de zanahoria. Al comparar
los perfiles cromatográficos de los carotenoides de zanahoria, con el estándar
(Figura 11), se observa la presencia de tres picos plenamente identificados de la
siguiente manera; Luteína (1), α- caroteno (2) y β-caroteno (3) y comparando los
tiempos de retención y espectros se puede asegurar la presencia de estos tres
carotenoides mayoritarios en la zanahoria del valle del Mantaro. Los picos
cromatograficos 2 y 3 indican que son los carotenoides de mayor concentración
presentes en la zanahoria, donde β-caroteno 50,88 %, α- caroteno 36,86 % y la
luteína se encuentra en menor proporción de 1,16 %. También aparecen trazas de
otros carotenoides como el ζ-caroteno en porcentaje de 0,1 al 1 %. Los tres picos
cromatográficos de mayor área son similares a los encontrados por (Alzate, 2013 y
Rodríguez-Amaya, 2001) quienes muestran cromatogramas con fracciones de
carotenoides de zanahoria con similares tiempo de retención y porcentaje de area.
La presencia de otros picos o crestas en el perfil cromatografico de la muestra se
debería a la solubilidad de carotenoides en las condiciones de extracción y
cuantificación.
51
4.1.4 Espectros de los estándares de luteína, α-caroteno y β-caroteno
52
de luteína, α-caroteno y β-caroteno.
(a)
(b)
(c)
53
Figura 18.
Espectros
de los
Estándar Zanahoria
Carotenoides Picos de absorción Picos de absorción α-
caroteno 423 446 474 424 447 475 β-caroteno 426 451 479
427 452 479 luteína 423 446 474 423 446 474
En la tabla 12, se muestra las longitudes de onda máximas que corresponden a los
tres picos o bandas características, obtenidas del estándar y del extracto de
zanahoria. Los valores de longitud de onda máxima en los tres espectros de
absorción del estándar y zanahoria se encuentran dentro de un rango de 423 nm479
nm. El α-caroteno absorbe una longitud de onda máxima de 447 nm, el βcaroteno
es el carotenoide más característico encontrado en la zanahoria absorbe una
longitud de onda máxima de 452 nm, y la luteína absorbe una longitud de onda de
446 nm, las longitudes de onda obtenidas resultan ser muy similares a las reportadas
por (Rodriguez-Amaya, 2001). El espectro en la región visible de los carotenoides
es bastante característico en la longitud de onda comprendida entre 400 y 500 nm
por lo cual suelen ser sustancias coloreadas (Burgos y Calderón, 2009). El bicíclico
β-caroteno, aunque poseen el mismo número de dobles enlaces conjugados como
el licopeno, es de color naranja amarillo y λmax a 450 y 477 nm y una inflexión
(hombro) a 425 nm, el doble enlace en el anillo ε de α-caroteno es de conjugación,
dejando 10 dobles enlaces conjugados (9 en la cadena de polieno y 1 en el β anillo);
por lo tanto, este carotenoide es amarillo claro y su espectro de absorción es más
55
definido con λmax a longitudes de onda ligeramente más cortas (422, 445 y 473 nm)
que los de β-caroteno (Rodriguez-Amaya, 2001).
56
Tabla 13. Tiempos de retención, área y % de área de carotenoides estándar y obtenidos por extracción con CO 2 –supercrítico y
convencional en la zanahoria
Zanahoria
CO2- Zanahoria
Estándar (50 ppm ) supercritica Convencional
Tiempo
Tiempo de Tiempo de de
Retención Área %de Retención Área %de Retención Área %de
Carotenoides (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área
alfa-caroteno
17,08-17,19 2382157 34,58 17,62 5723881 36,86 21,53 205067 28,62
beta-caroteno 19,07-19,50 3830787 55,61 19,15 7776121 50,88 23,47 439769 61,38
En la Tabla 13, se observa, el tiempo de retención, el área y el % de área de los picos de los cromatogramas, se observa claramente la
presencia mayoritaria de β-caroteno y α- caroteno y en menor cantidad la luteína en la zanahoria extraído por CO2-supercrítica, también se
observa que el área obtenida por la extracción convencional (tetrahidrofurano/metanol) es menor tanto para el β-caroteno y α- caroteno y no
hay presencia de la luteína.
54
Tabla 14. Fracciones de carotenoides por extracción con CO2-supercrítico presentes en el extracto de zanahoria
Carotenoides
Presión Temperatura Tiempo α-caroteno β-caroteno Luteína (mg/100g Totales
Tratamiento (Bar) (°C) (h) (mg/100g ms) (mg/100g ms) ms) (mg/100g ms)
55
Las fracciones de α-caroteno, β- caroteno, luteína y carotenoides totales obtenidos en
la extracción con CO2 -Supercrítico bajo diferentes combinaciones de temperatura y
presión se muestran en la Tabla 14, para α-caroteno fue de 4,20 a 12,27 mg/100g ms,
β-caroteno de 14,60 a 71,34 mg/100g ms, luteína 0,51 a 0,89 mg/100g ms y
carotenoides totales fue 21,10 a 84,50 mg/100g ms.
59
La mayor cantidad de carotenoides totales se obtuvo en el T4 (280 bar y 50 °C) seguido
del T3 (200 bar y 50 °C) siendo los tratamientos donde al aumentar la presión de 200 a
280 bar y manteniendo la temperatura de 50 °C se observa un incremento en el
rendimiento de α-caroteno, β-caroteno y carotenoides totales como se puede apreciar
en la tabla 16 y Figura 20, a temperatura constante con el aumento de la presión la
densidad del fluido supercrítico se incrementa y por consiguiente la solubilidad del
analíto en el fluido supercrítico aumenta (Velasco, Villada y Carrera, 2007 y Durante,
Salvatore y Mita, 2014). Sun y Temelli (2002) en su trabajo de investigación reportaron
que a 55 °C y 276 bar de presión obtuvieron 73,89 mg de carotenoides totales /100 g
ms. Nacimiento et al., (2009) en la extracción de carotenoides de zanahorias liofilizadas
con CO2-supercritico a 40 °C y 400 bar obtuvo 24,57 mg de β-caroteno/100 g ms.
Durante et al., (2014) en su trabajo de investigación utilizaron diferentes temperaturas
de 40 a 70 ° C y presiones de 25 a 35 MPa en la extracción con CO2supercritica de
carotenoides de calabaza, ellos encontraron que el rendimiento de carotenoides
aumentó con el aumento de presión y temperatura.
60
80.0
70.0
60.0
alfa-caroteno
50.0
beta-caroteno
40.0
Luteina
30.0
20.0
10.0
0.0
T1 T2 T3 T4 T5 T6
61
90
80
70
60
50
40 convencional
SC-CO2
30
20
10
0
α-caroteno β-caroteno luteina carotenoides
totales
(mg/100g ms)
62
Tabla 15. Análisis de varianza ANOVA de los carotenoides totales de los seis
tratamientos obtenidos con CO2 - SC en la zanahoria.
nivel de nivel de
P T N Media
200 40 2 21,10
200 50 2 75,15
200 60 2 48,88
280 40 2 40,57
280 50 2 84,50
280 60 2 27,47
63
resumido en el (ANEXO VII). Realizado el test de Duncan con un nivel de
significancia de 0,05 se encontró que la diferencia es significativa para el efecto de
la temperatura, resultando mejor el trabajo a la temperatura de 50 °C.
64
Agrupamiento Media N Tratamiento
A 84,50 2 4
A 75,15 2 3
B 48,88 2 5
B 40,57 2 2
C 27,47 2 6
C 21,10 2 1
*letras diferentes significa diferencia significativa
Temperatura
Agrupamiento Media N (°C)
A 30,83 4 40
A 31,18 4 60
B 79,81 4 50
*letras diferentes significa diferencia significativa
65
1. En el tratamiento 2 (40 °C y 280 bar) se obtuvo mayor rendimiento del
extracto de zanahoria que fue de 2,09 g /100 g ms.
66
VI. RECOMENDACIONES
67
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- Widman, R. (2004). Handbook of food Analytical chemistry. CRC Press Boca Raton
London New York Washington, D.C.
75
-
VIII. ANEXOS
76
77
ANEXO I
1. ORIGEN E HISTORIA
La zanahoria (Daucus carota L.) ha sido cultivada hace más de 3000 años en Asia,
en la región que hoy ocupa Afganistán, si bien algunos autores consideran como
lugar de origen la zona templada del Mediterráneo en ambas regiones se encuentra
en estado silvestre, las primeras zanahorias eran blancas, violetas y amarillas
(Tirador, 2011).
El año 600 a.c se cultivaban zanahorias de color morado en Afganistán. Durante los
siglos IX y X se desarrolló zanahoria de raíz amarilla en Siria y que el cultivo fue
introducido en china a fines del siglo XIII. Las variedades amarillas llegaron a Europa
en el siglo XIV, reportándose el cultivo de la zanahoria en casi todo el continente
europeo. Las variedades de raíz anaranjada se reportaron por primera vez en
Holanda en el siglo XVII, de donde se distribuyeron y popularizaron por toda Europa
y pasaron al continente americano donde los indios de Norteamérica adoptaron la
zanahoria como alimento y la consideraban de gran valor (Morales, 1995).
La zanahoria antes de utilizarse como alimento fue usada como planta medicinal
para curar problemas digestivos y heridas. (Morales, 1995). Durante la edad media
la zanahoria se utilizaba como tinte para la mantequilla y en Francia la hoja se
utilizaba para decorar peinados y sombreros (Tirador, 2011).
2. TIPOS DE ZANAHORIA
78
Existen más de 50 variedades de zanahoria, algunas de ellas son:
En los últimos años se ha dado una mayor importancia al cultivo de productos con
alto valor nutritivo es por eso que en el Perú se ha visto un crecimiento en la
producción de zanahoria, debido a la existencia de diferentes zonas agroecológicas
que ofrecen condiciones favorables para el cultivo de esta hortaliza. En la (Tabla 2)
se aprecia los principales departamentos productores de zanahoria en el 2010,
liderando en la producción los departamentos de Junín y Lima. En Junín se produce
anualmente un promedio del 60% del total de la producción de zanahoria, la cual
abastece principalmente a Lima y otras regiones como la selva central (Sierra
Exportadora, 2010).
79
Producción de zanahorias 2010
superficie % particip.
cosechada (HA) 2012
Departamento
Junín 2,559 30,14
Lima 2,036 23,98
Ica 39 0,46
Piura 34 0,40
Moquegua 23 0,27
Puno 11 0,13
Pasco 7 0,08
Huancavelica 5 0,06
Tacna 5 0,06
80
Tabla 2. Composición química de 100 g de parte comestible de zanahoria sin
cascara.
Componente Contenido
Agua 89,0 g
Carbohidratos totales 9,2 g
Carbohidratos disponibles 6,4 g
Fibra cruda 1,2 g
Fibra dietética 2,8 g
Proteínas 0,6 g
Grasa total 0,5 g
Calcio 33 mg
Fosforo 16 mg
Zinc 0,24 mg
Hierro 0,5 mg
Retinol 1696,0 ug
Vitaminas equivalentes totales 841,0 ug
Vitamina c 17,4 ug
Tiamina 0,04 ug
Riboflavina 0,04 mg
Valor energético 41 kcal
Fuente: Reyes et al. (2009)
81
ANEXO II
6000000
4000000
2000000
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración ppm
82
b) Cromatograma de beta-caroteno (62,5 ppm)
1500000
1000000
500000
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración ppm
83
c) Cromatograma de Luteína (33 ppm)
200000
150000
100000
50000
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración ppm
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
T1 T2 T3 T4 T5 T6
Tratamientos
CO2-
Carotenoides Convencional Supercritico
α-caroteno (mg/100 g ms) 7,22 ±0,08 12,27 ±1,80
β-caroteno (mg/100 g ms) 40,86 ±0,51 71,34 ±1,67
Luteína (mg/100 g ms) - 0,89 ±0,051
carotenoides totales (mg/100g ms) 48,08 ±0,81 84,50±12,3
ANEXO III
Estadístico P- valor
Shapiro-Wilk W 0,984256 Pr>w 0,9954
85
Kolmogorov-Smirnov D 0,10335 Pr>D >0,1500
Cramer-von Mises W-Sq 0,027212 Pr> W-Sq >0,2500
Anderson- Darling A-Sq 0,174807 Pr> A-Sq >0,2500
ANEXO IV.
86
87
ANEXO V.
88
ANEXO VII
89
90
91
92
ANEXO VIII. 8.1.
Análisis estadístico de beta- caroteno de zanahoria
93
94
95
96
97
ANEXO XI
98
99
100
ANEXO X.
101
102
103
104
105
106
ANEXO XI
103