Desarrollo del método CCD

Al establecer la metodología por CC se utilizó una muestra de referencia no comercial,

consistente en una fracción enriquecida en alcaloides marcadores de especies oxindólicos,
obtenidos por partición ácido-base clásico del extracto etanólico de corteza de tallo de U.
tomentosa previamente secada y molido, recolectado en Cruzeiro do Sul, Acre (datos sobre
identificación y exsiccata en Miranda et al., 2003) y proporcionado por la empresa Biosapiens.
Esta fracción fue sometido a cromatografía líquida de alta resolución (CLAE) con detector
ultravioleta (UV) a 245 nm, con caracterización de alcaloides oxindólicos marcadores
pentacíclicos para sus tiempos de retención en las condiciones descritas en la literatura (Laus;
Keplinger, 1994) y por HPLC acoplado a un detector de fotodiodos espectrometría de masas y
de matriz (CLAE-DAD-EM) con monitorización de iones [M + 1] + en m / z 369 y análisis Espectros
UV (Mazzei, 2004; Lopez-Avila et al., 1997). Para obtener sustancias estándar, la fracción fue
reflujo con metil t-butil éter que conduce a la precipitación, después de enfriar, mitrafilina (2)
que posteriormente se purificado por cristalización en el mismo disolvente. EL sobrenadante se
secó a presión reducida y secuencialmente a cromatografía en columna (CC) en gel sílice con
gradiente de disolvente hexano-acetato etil metanol y HPLC en fase inversa para aislamiento
pteropodina (5) e isopterópodo (6) (Laus; Keplinger, 1994; Mazzei et al., 2002). Las sustancias
puras eran estructuralmente identificado por espectrometría en el región infrarroja (IV),
técnicas de resonancia hidrógeno nuclear y carbono-13 (1H NMR) y 13C) (300MHz y 75MHz
respectivamente, CDCl3, TMS estándar interno) en una y dos dimensiones y análisis los
espectros UV y EM en HPLC-DAD-EM y sus datos comparados con los disponibles en la literatura
(Seki et al., 1993; Lopez-Avila et al., 1997). La determinación de pureza se realizó integrando los
cromatogramas de iones totales en HPLC-EM.

Mitrafilina (1): sólido cristalino blanco; CLAEDAD-

EM: λmax 244 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 3,86 min (pureza> 95%); RMN 1H: 1,11 (3H, d, J 6,6
Hz, H-18), 2,11 (2H, m, H-15 y 20), 2,42 (1H, dd, J 2,6, 10,1 Hz, H-3), 3.60 (3H, s, CH3O), 4.37 (1H,
qd, J 3.0, 6.6 Hz, H- 19), 7,43 (1H, s, H-17), 7,91 (1H, s, NH); RMN 13C: 15,1 (C-18), 50,9 (CH3O),
55,7 (C-7), 74,0 (C-19), 74,8 (C-3), 107,1 (C-16), 114,9 (C-12), 122,8 (C-10), 123,2 (C-9), 154,3 (C-
17), 167,3 (C-22), 181,2 (C-2); IV (KBr) νmáx 1622, 1705, 1725; 3269, 3412 cm-1.

Pteropody (5): sólido cristalino blanco;

HPLC-DAD-EM: λmax 247 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 4,82 min (99% de pureza); RMN 1H: 1,41
(3H, d, J 6,2 Hz, H-18), 1,58 (1H, m, H-20), 2,44 (1H, ddd, J 4,4, 4,7, 11,5 Hz, H- 15), 3.60 (3H, s,
CH3O), 4.56 (1H, qd, J 6.2, 10.6 Hz, H- 19), 7,49 (1H, s, H-17), 7,93 (1H, ls, NH); IV (KBr) νmáx
1624, 1701, 3257 cm-1.

Isopteropody (6): sólido cristalino blanco;

HPLC-DAD-EM: 247 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 7,49 min (100% de pureza); RMN 1H: 1,41 (3H,
d, J 6,2 Hz, H-18), 1,59 (1H, m, H-20), 2,57 (1H, dd, J 2,8, 11,7 Hz, H-3),3,60 (3H, s, CH3O), 4,35
(1H, qd, J 6,2, 10,8 Hz, H-19), 7,41 (1H, s, H-17), 8,80 (1H, s, NH); RMN 13C: 18,8 (C- 18), 51, 2
(OCH3), 71,4 (C-3), 124,7 (C-9), 127,8, 140,5 (C-13), 167,8 (C-22), 181,6 (C-2); IV (KBr) νmáx 1633,
1679, 1700, 1719, 3247 cm - 1.
Los análisis CCD se desarrollaron en placas de gel de sílice prefabricadas (hoja de cromatografía
Merck, gel de sílice 60 F254, 0,2 mm). Las muestras fueron aplicada manualmente, utilizando
una microjeringa de 25 mmμL (Hamilton ref. 80465).

Se probaron varios parámetros: ancho aplicación de muestra, espacio de elución, tipos de

desarrolladores, sistemas de control y concentración de muestras fase móvil. Como primer paso
del proceso, Se probaron cuatro sistemas de disolventes como fase móvil, entre los descritos en
la literatura (Keplinger et al., 2002; Philipson; Hemingway, 1975) que combinó la mayor
potencial de separación de alcaloides pentacíclicos en problema con facilidad de manejo:
acetato de etilo / hexano (95: 5), cloroformo / acetona (5: 4), cloroformo / metanol (95: 5),
acetato de etilo / isopropanol / hidróxido de amonio (16: 3: 1). Después de elegir el eluyente, se
probó la distancia de desarrollo óptima. Para ello, las placas cromatográficas con 11,5, 15 y 20
cm de largo, con espacio para correr 10, 13,5 y 18,5 cm respectivamente. Para la prueba de
concentración mínima de detección, y en consecuencia la concentración de análisis ideal, se
preparó una solución 5 mg / mL de la muestra de referencia en metanol. De eso solución, se
aplicaron tasas de 6, 10, 16, 20, 26, 30 y 36 μL. Luego, el ancho de las bandas de aplicación del
La muestra se ensayó con 0,5 y 1 cm. La pantalla de la tinción se realizó mediante exposición a
luz ultravioleta a 254 nm y el desarrollo, pulverizando con reactivo de Dragendorff / nitrito de
sodio al 10% (Wagner; Bladt, 1996). Las placas se documentaron mediante fotografía digital.

Identificación de alcaloides en la placa cromatográfica

Se identificaron los seis alcaloides marcadores placa cromatográfica comparando el Rf del

manchas en la muestra de referencia con los RF estándar aislado y estructuralmente identificado
[mitrafilin (2), pteropody (5) e isopteropody (6)], como se describe previamente, y a través de la
comparación con el orden de elución descrito por Keplinger et al. (2002). Para los estándares,
se aplicó 10 μL de una solución. 1 mg / mL.

Métodos de extracción de alcaloides

Comparar los diferentes métodos de extracción alcaloides, el mismo partido fue tallo de U.
tomentosa, recolectado en Cruzeiro do Sul, Acre, utilizado para obtener la muestra de referencia
y aislamiento de sustancias estándar. Los extractos fueron preparado según una metodología
optimizada por Ganzera et al. (2001), donde 750 mg de material vegetal seco y molidos se
extrajeron con 2,5 mL de metanol con sonicación durante 10 min seguida de centrifugación
durante 5 min min. El proceso se repitió 4 veces y los sobrenadantes juntos. En el tratamiento
con resina básica (Ganzera et al., 2001) los sobrenadantes se transfirieron a matraz aforado de
10 mL y el volumen completo con metanol. Entonces una alícuota de 3 ml y se añaden a esta
resina de nailon 6 de 300 mg Radilon S natural (Radici Plastics Ltda.) (Poliamida 6) tamaño de
partícula 53-125 μm y la mezcla se mantiene bajo agitación magnética durante 15 min. El
sobrenadante fue entonces se secó a presión reducida y se pesó. En la partición ácido-base, los
sobrenadantes resultantes de la extracción después recogidos se secaron a presión reducida y
se pesaron. EL el extracto seco se trató con una solución de ácido clorhídrico 0,1 N en una
proporción de 0,15 ml / mg.

La mezcla se colocó en el baño de ultrasonidos durante 5 min y luego se extrae con acetato de
etilo, siendo el volumen de acetato de etilo usado igual al ácido clorhídrico (3 veces). La
fracciónel agua se alcalinizó con hidróxido de amonio a Ph9-10 y se extrae con el mismo volumen
de acetato de etilo. (4 veces), generando una fracción orgánica enriquecida en alcaloides. La
fracción se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró, se evaporó a presión reducida y se pesó.
A las muestras se aplicaron a las placas por duplicado. Aplicación de la metodología desarrollada
El método desarrollado se aplicó en análisis de muestras de tallo y hojas en U. guianensis,
recolectada en Juruema, Mato Grosso y donada por O.N.G. Pro-Natura (la planta fue identificada
por el el botánico Pierro Delprete del Jardín Botánico de Nueva York y se deposita una exsiccata
en el Herbario Central Universidad Federal de Mato Grosso, con la 24,715), y en muestras de
hojas y corteza U. tomentosa, recolectada en Acre y donada por Embrapa- Acre (datos de
identificación y exsiccata en Miranda et al., 2003). El método también se aplicó en el análisis de
cuatro toterapics basados en U. tomentosa de diferentes proveedores, comprados
aleatoriamente a minoristas local. La descripción de los fitoterápicos analizados y su respectivos
procedimientos de extracción se pueden encontrar en el Tabla 1. Las muestras se aplicaron a las
placas en duplicar.