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La toma de muestras para el posterior procesamiento, con el fin de comprobar el diagnostico presuntivo establecido por el
clínico, puede realizarse a partir del :
Animal vivo:
1. Lesiones: la toma depende del tipo de lesión con la que estemos tratando, por ejemplo si hablamos de una
lesión alopecica y sospechamos de hongos, tomamos muestras de la periferia de la lesión y recogemos los
pelos de esa zona(que se remiten en sobre). Si son lesiones nodulares se procede a la puncion-aspiracion.
2. Secreciones: si hablamos de una epifora por ejemplo, tomaremos la muestra con un hisopo estéril (por
rotación) y lo colocamos en un recipiente, también estéril ,para la ruta bacteriológica. si tomamos una
muestra de leche, no olvidar realizar el despunte primero (no lavar nunca, porque contaminaremos el pezon
ya que los mo caeran por gravedad al mismo), la leche se colocara en un recipiente esteril y refrigerada en
heladera.
3. Biopsia de tejido
4. Excreciones: generalmente se elije como muestra para ruta virologica.
5. Líquidos corporales: se obtienen generalmente por puncion
Animal muerto:
1. Necropsia: en la observación directa (sin apertura) controlamos: presencia de secreciones, estado de mucosas,
tiene ambos ojos? en qué condiciones están?, posee tatuajes, lesiones, tiene todos los miembros?. Luego se
realiza la apertura desde menton al ano (pequeños animales)
PUNCION: PAF/PAAF: la punción puede realizarse: con aspiración(PAAF) para masas sólidas y quistes, sin aspiración (PAF) para
masas sólidas únicamente, y con o sin movimientos en abanico solo para masas sólidas. No olvidar realizar tricotomia e
higiene de la zona.
Si la muestra fue tomada para citologia, se procede a depositar la muestra en el porta y luego extenderla.
PUNCION DE TORAX Y ABDOMEN: el objetivo es tanto diagnostico como terapeutico, se pueden tomar muestras de pulmon y
estructuras abdominales, para abdomen se pueden realizar ecoguiada. Despues explican todo el proceso de abdominocentesis
que ya lo vimos en cx.
- Pericardio EIC 4-6, sobre el impulso cardiaco (aproximación lenta hasta recibir el liquido)
- Pleural EIC7-8 (dorsal para aire, ventral para liquido)
- Pulmon preferentemente ecoguiada (> riesgo que las anteriores).
HISOPADO CONJUNTIVAL
HISOPADO RECTAL
1. Introducir el hisopo ligeramente húmedo con solución fisiológica esteril
2. Retirar el hisopo y colocarlo en mediode transporte. Rehumedecer para hacer gota pendiente o observacion directa
mediantemicroscopio.
LAVAJE ESTOMACAL
1. Intubación para evitar aspiración
2. sondeo (medición previa a la colocación de la distancia de la sonda al estómago o control ecográfico)
3. Aspiración del contenido o lavaje con solución fisiológica estéril
LAVAJE BRONQUIAL
1. Oxigenación previa del animal
2. Luego se introduce la sonda por el tubo endotraqueal hasta alcanzar lugar adecuado
3. Se descarga por la sonda solución fisiológica estéril atemperada levemente
4. Se intenta recuperar la mayor cantidad posible del líquido descargado.
RECOLECCIÓN DE ORINA
- Punción: para Cultivo y/o estudio físico químico.
- Compresión manual y recolección de camilla (Estudio físico - químico unicamente no sirve para cultivo): se puede
hacer con el animal sedado elevando la cola, o con el animal sin sedar fijando su cadera con nuestro codo y con agarre
nucal: estas maniobras son necesarias para gatos: imaginen que no se va a quedar tranquilo si le estamos apretando la
vejiga)
Una vez obtenidas las diferentes muestras, se elige la ruta a seguir (bacteriológica, virológica o micológica), correspondiéndose
la misma con las sospechas del clínico.
Finalmente cabe destacar que la muestra debe ser representativa del proceso infeccioso. Hay que tener en cuenta no estar en
tratamiento antibiótico durante el muestreo.( Paso a explicar las rutas y al final cada prueba específicamente)
RUTA BACTERIOLOGICA EXAMEN DIRECTO:
Examen Indirecto
Procesamiento muestra según caso:Cultivo (medios Sabouroud,
Dixon, Lactrimel, Agar sangre (atb, cicloheximida: inhibidores)
(28ºC, 21 días para resultado neg.):
Observación al microscopio (Azul de lactofenol, etc).
Taxonomía al observar micelio de fructificación.
Aislamiento - Identificación (Pruebas bioquímicas/
Morfología MACRO y al MO)
Formol 10% :1 parte de formol puro (formaldehido al 40%) 9 partes de agua Tiempo de fijación: 8 hs a
24 hs dependiendo del tamaño de la muestra.
Formol bufferado: formol puro: 100 ml fosfato sódico monobásico, 4 g fosfato sódico dibásico
(anhidro), 6,5 g agua destilada, 900 ml pH: 7-7,2.Tiempo de fijación: 3 hs
Relación muestra/fijador: 1/9 para que el fijador pueda penetrar por todos los lados de la muestra.
Pueden colocarse varias muestras en el mismo frasco, respetando las proporciones del fijado.Rotular
colocando una etiqueta en el cuerpo del frasco. Se puede introducir un papel, escrito con lápiz, dentro del
frasco con los mismos datos que la etiqueta.
Procesamiento en el labo: Las muestras son incluidas en parafina para darle firmeza al tejido y mantener su estructura.
• Se hacen cortes de 5 µ de espesor con un micrótomo.
• Se colorea y se observa al microscopio:
Hematoxilina / eosina: ofrece distintas tonalidades (azules y rosadas) para reconocer estructura y detalles celulares.
Puede indicar presencia de algún agente etiológico que requerirá coloraciones especiales para una mejor visualización.
Gram: (+) las bacterias se ven de color azul/negro (-) las bacterias se ven color rojo
Ziehl Neelsen: para bacterias ácido alcohol resistentes Estas bacterias y los ceroides se verán de color fucsia o rojo
PROTOCOLO DE REMISION
DATOS DEL PROFESIONAL QUE REMITE: Apellido, nombre, TE, e-mail.
DATOS DEL PROPIETARIO: Apellido y nombre.
DATOS DEL ESTABLECIMIENTO: RENSPA. Tipo de explotación.
DATOS DEL ANIMAL: N de caravana u otro tipo de identificación, nombre.
DESCRIPCION MACRO: Breve descripción de la lesión por el veterinario remitente, peude agregarse algún dato observado por
el patólogo al cortar o procesar la muestra.
DESCRIPCION MICRO: Estructura, componentes y detalles celulares, distribución de las células, limites de la lesión, índice
mitótico, vascularización, metástasis. Presencia de bacterias, hongos y cuerpos de inclusión.
COLORACIONES: Indicar que coloraciones se utilizaron.
DIAGNOSTICO.
FIRMA LUGAR Y FECHA
FUNDAMENTOS DE TINCIONES Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS
GRAM
Fundamento: El colorante primario (cristal violeta) tiñe a todas las bacterias. El lugol actúa de mordiente. Al decolorarse (con
alcohol-acetona) las bacterias grampositivas no se decoloran conservando el cristal violeta y las gramnegativas pierden el
color. Al colocar el colorante secundario (safranina) las gramnegativas que estaban sin color se colorean de rosa y las
grampositivas continúan violetas
Procedimiento:
1) Rotular
2) Extender
3) Secar
4) Fijar (3-4 pasadas por la llama)
5) Cristal violeta 1 min
6) Lavar
7) Lugol 1 min
8) Lavar
9) Alcohol acetona 15 seg
10) Lavar
11) Safranina 1 min
12) lavar
1. Se esteriliza el ansa en el mechero y se toma la muestra sembrándola en medios sólidos y/o líquidos. Posteriormente
se incuba en condiciones favorables para el microorganismo sospechado (de rutina a 37ºC en aerobiosis durante 24-
48 hs)
2. AISLAMIENTO:Si en el primocultivo se observan varias colonias de diferentes características se realiza el reaislamiento,
repicando cada colonia por separado para obtener cultivos en pureza, es decir, con iguales características
macroscópicas de las colonias y microscópicas al Gram: afinidad tintorial, forma y agrupación.
3. IDENTIFICACIÓN: Sólo cuando el cultivo esta en pureza, se procede a la identificación mediante las capacidades
bioquímico-metabólicas (PRUEBAS BIOQUÍMICAS) y/o la detección de genes específicos (PCR: Reacción en Cadena de
la Polimerasa).SIEMPRE se realizan a partir de un cultivo puro y en fase exponencial de crecimiento (cultivo jóven).Se
realizan las pruebas bioquímicas “caseras” según el microorganismo sospechado. Se evalúan diferentes capacidades
como la presencia de enzimas (ej: citocromo oxidasa, catalasa, etc.), la capacidad de crecer en ciertos medios (ej. agar
Manitol salado) o la capacidad de utilizar diferentes sustratos (ej: citrato, fenilalanina, etc.).
4. Luego se recurre a la ayuda de tablas de lectura para identificar género y especie.
PRUEBAS CASERAS:
CATALASA: Detección de la enzima catalasa al agregar agua oxigenada. Catalasa positiva: Formación de burbujas.
Catalasa negativa: Ausencia de burbujas
OXIDASA: positiva Viraje de color del disco comercial
COAGULASA: Detección de la capacidad de coagular el plasma citratado de conejo.
CAPACIDAD DE HEMÓLISIS: Detección de la producción de hemolisinas en agar sangre:
Gamma hemolìtico: Sin Hemólisis, Alfa hemolìtico: Hemólisis incompleta, Beta hemolìtico: Hemólisis completa.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS COMERCIALES:
Se realizan las pruebas bioquímicas en una galería comercial (foto debajo)incubando la bacteria en pocillos con el
agregado de diferentes reactivos.
Luego se coloca la galería en un lector específico que realiza la lectura mediante un software. Así se determina el
microorganismo que coincide con ese perfil bioquímico.
ANTIBIOGRAMA
Se realiza el perfil de sensibilidad antibiótica mediante el método de difusión. Recordar que se evalúa sensibilidad “in vitro” y
que debe tenerse en cuenta el agente, el huesped y la ubicación de la infección para que el tratamiento antibiótico sea eficaz.
PROCESAMIENTO DE PELOS PARA EL MICOLOGICO
Elementos necesarios: mechero, porta, cubres, placa, bisturi, ansa, pinza, jeringa, KOH al 40%
1. Colocar la muestra en placa estéril para facilitar su manejo. Colocar pelos sobre un portaobjetos limpio y desengrasado.
2. Separar los pelos con ayuda del ansa/aguja.
3. Cortar los pelos con bisturí estéril.
4. Utilizar KOH 40% para digerir la queratina y decolorar.
5. Colocar una gota de KOH 40% en un cubreobjetos.
6. Colocar el cubreobjetos sobre la muestra en proceso.
7. Calentar el preparado pasándolo por la llama del mechero.
8. Observar al microscopio óptico.
ELISA
Fundamento: Permite identificar la presencia de anticuerpos (Atc) o antigenos (Atg) mediante la unión específica con sus Atg o
Atc respectivamente, unidos éstos a un soporte inerte. Para evidenciar la reacción se necesita un anticuerpo conjugado
marcado con una enzima que transforma un sustrato incoloro en un producto coloreado.
Procedimiento de ELISA indirecto (aclaran solo este porque es más utilizado que el directo o el sándwich)
1. Adsorción del Ag a la placa de 96 hoyos.
2. Incubación por 1h a 37°C o 16hs a 4°C.
3. Remoción del exceso de Ag lavando con PBS-Tween.(LAVADOYSECADO).
4. Agregado la solución bloqueante (leche 10%enPBS-tween): bloquea proteínas que podrían interferir.
5. Incubación por 1 h a 37°C.
6. Lavado y Secado.
7. Agregado las muestras de suero por duplicado o triplicado.
8. Incubación por 1 h a 37°C.
9. Lavado.
10. Agregado el anticuerpo anti-especie conjugado con enzima.
11. Incubación por 1 h a 37°C.
12. Lavado.
13. Agregado del sustrato de la enzima
14. Incubación según indicaciones del sustrato utilizado.
15. Agregado de la solución de frenado (depende de la enzima utilizada). Modifican el pH y detienen la reacción.
16. Lectura a simple vista o cuantificada por Espectrofotometría.
Las diferencias respecto al indirecto son: que en el directo se agrega directamente un único ac marcado, y en el sándwich lo
que se adsorbe a la placa es un ac, luego se agrega la muestra (contiene ag o ac) y luego otro ac marcado.
INMUNOFLUORESCENCIA
Fundamento: Utiliza un anticuerpo conjugado con un fluorocromo que permite evidenciar la reacción de Ag-Ac por medio de
señales visuales (microscopio de fluorescencia).
Es una técnica serológica de INTERACCIÓN PRIMARIA.
Permite la búsqueda de anticuerpos específicos frente a un antígeno determinado.
Permite la localización de antígenos en: Tejidos-Frotis-Células-Cultivos en monocapa.
Ventajas
• Versátil.
• Sencilla y rápida.
• Permite la detección in situ.
Desventajas
• Preparados de vida muy corta.
• Personal entrenado.
• Necesita microscopio de fluorescencia.
Aplicaciones
• Diagnóstico de enfermedades Infecciosas, parasitarias y autoinmunes.
• Marcaje de moléculas en células y tejidos.
Materiales para la IFI: Micropipetas y tips • Guantes • Tubos eppendorf • Portaobjetos para IFI (adsorbidos con antígenos) •
Microscopio de fluorescencia.
Procedimiento (IFI):
1) Se siembran 10-50 uL muestra en el portaobjetos.
2) Se incuba el porta objetos en cámara húmeda a 37°C por 30 min.
3) Se lava el portaobjetos con PBS (solución de lavado) y se sumerge en el mismo por 10 min.
4) Se colocan de 10-50 uL de anti-Ig conjugado con fluorocromo .
5) Se lava y se incuba como en los pasos 2) y 3).
6) Se coloca una gota de líquido de montaje, se cubre con un cubreobjetos y se observa en microscopio de fluorescencia.
TÉCNICA DE HEMOAGLUTINACIÓN (HA)
La Hemoaglutinación es una propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves, debido a
las proteínas que poseen en la superficie externa (Hemaglutininas). Esta propiedad de algunos patógenos puede usarse para
facilitar su identificación.
Procedimiento:
1. Se distribuyen 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en V.
2. A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensión vírica. Para una determinación precisa del contenido de HA, se
debería hacer a partir de una serie de diluciones muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.
3. A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensión vírica en volúmenes de 0,025 ml.
4. Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0,025 ml de PBS.
5. En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de eritrocitos (de la especie adecuada) al 1% (v/v).
6. La solución se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estáticos los eritrocitos durante unos 40 minutos a
temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20°C, o durante 60 minutos a 4°C si las temperaturas son altas,
considerando que los eritrocitos control deberían sedimentar de una forma distinta.
7. La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en forma de lágrima de
los RBC. Debería leerse la titulación a la dilución más alta a la que se de una HA completa (sin corriente); esto
representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a partir del rango inicial de diluciones.
CAPACIDAD DISCRIMINATORIA
Habilidad de la prueba de clasificar correctamente a los individuos con y sin el evento (sanos y enfermos) Prueba perfecta:
permitiría diferenciar sin errores enfermedad de salud. ¡No existe!
La capacidad discriminatoria se evalúa a través de la sensibilidad y especificidad. La sensibilidad es la capacidad de
identificar como positivos los animales con el evento. se mide sobre el grupo "enfermos".
La especificidad es la capacidad de identificar como negativos los animales sin el evento, se mide sobre el grupo "sanos".
Criterios para fijar un punto de corte:
Consecuencias de un FP
Consecuencias de un FN
Prevalencia
VALORES PREDICTIVOS
FACTOR
ES QUE AFECTAN LOS VALORES PREDICTIVOS:
A partir de una PD se obtiene una PREVALENCIA APARENTE (PA), que es la proporcion de individuos positivos a las PD. Con una
prueba ideal (Se y Es=1) : PR=PA. Cuando la PR es baja es mas probable la ocurrencia de FP que de FN: la PA sobreestima a la
PR. Lo inverso ocurre con alta prevalencia.
PD COMBINADAS
PD A NIVEL RODEO