EXPOSICIÓN ARTICULO CATHERINE MEZA

El resveratrol regula la expresión de genes involucrados en la síntesis de CoQ en el

hígado de ratones alimentados con una dieta alta en grasas

El resveratrol (RSV) es una molécula natural bioactiva que induce la actividad

antioxidante y aumenta la protección contra el daño oxidativo. Se puede utilizarse para
mitigar los daños asociados a las enfermedades metabólicas y el envejecimiento. Y en
particular, el RSV regula diferentes aspectos del metabolismo mitocondrial. Sin
embargo, no se dispone de información sobre los efectos del RSV sobre la coenzima Q
(CoQ), que es un componente central en la cadena de transporte de electrones
mitocondrial. Aquí, informamos por primera vez que RSV modula los genes COQ y los
parámetros asociados al síndrome metabólico en ratones. Los ratones alimentados con
dieta alta en grasas (HFD) presentaron un mayor aumento de peso, triglicéridos (TG) y
niveles de colesterol mientras que el RSV revirtió los TG para controlar el nivel pero no
el peso ni el colesterol. HFD indujo una disminución de COQnivel de ARNm del gen,
mientras que el RSV invirtió esta disminución en la mayoría de los genes COQ . Sin
embargo, el VSR no mostró efecto sobre los niveles de CoQ 9 , CoQ 10 y CoQ total, ni
tampoco en las enzimas antioxidantes dependientes de CoQ. HFD influyó en la
dinámica mitocondrial y los marcadores de mitofagia. RSV moduló los niveles de PINK1
y PARKIN y su proporción, lo que indica la modulación de la mitofagia. En resumen,
informamos que el RSV influye en algunas de las adaptaciones metabólicas de la HFD
que afectan a la fisiología mitocondrial, mientras que también regula los niveles de
expresión génica de los COQ en un proceso que puede asociarse con la dinámica y el
recambio mitocondrial.

INTRODUCCIÓN
¿Qué es la coenzima Q? (CoQ)

 Es un componente lipídico redox (redox=oxido-reducción) de las membranas

celulares.
 Aunque se puede encontrar lisosomas, peroxisomas, o el retículo endoplasmico
como tal se encuentra en mayores cantidades muy significativas dentro de las
mitocondrias.
 Es un componente esencial de la cadena de transporte de electrones en todas
las membranas celulares, incluyendo las mitocondrias.
 Es el principal antioxidante lipófilo endógeno. (se producen en el propio
organismo y tiene tendencia a ligarse o combinarse con lípidos)
 Protege a los lípidos de la membrana celular contra la oxidación y mantiene un
ciclo oxido-reducción con α-tocoferol en las membranas, y también acido
ascórbico dentro y fuera de las células para mantener su respectiva actividad
antioxidante.
  Se ha descubierto que una nueva enzima redox ligada al lado externo de la
membrana plasmática de hepatocitos (células del hígado) reduce la CoQ
 ¿Dónde se sintetiza la CoQ? En las mitocondrias desde donde se traslada al resto
de membranas celulares, es un complejo proceso gobernado por 13 genes que
codifican esta coenzima. Por lo que la doisfunion de cualquiera de estas
proteínas reduce significativamente la producción de CoQ causando asi
enfermedades mitocondriales graves en seres humanos.
¿Qué es estilbeno polifenol resveratrol? (RSV)

 Es un compuesto bioactivo iplicado en la modulación de muchos procesos

fisiológicos en el organismo
 Su actividad antioxidante se basa en la capacidad de introducir enzimas
antioxidantes endógenas a través de la activación de un factor de transcripción
derivado del eritroide nuclear (Proteína que controla el modo en que se
expresan ciertos genes. Estos genes ayudan a proteger la célula del daño que
causan los radicales libres (moléculas inestables elaboradas durante el
metabolismo normal))
 Modula la dinámica y el recambio mitocondrial y las defensas
antioxidantes, lo que puede explicar los efectos positivos que tiene en el
envejecimiento y enfermedades metabólicas
 cambia la fisiología mitocondrial en ratones en condiciones de HFD
 afecta los niveles de CoQ y la actividad de las oxidorreductasas dependientes de
CoQ en animales viejos en un efecto órgano-dependiente.
DEBIDO A LO MENCIONADO ANTERIORMENTE EN EL PRESENTE ESTUDIO DEL
ARTÍCULO, SE QUISO SABER SI LOS EFECTOS DEL ESTILBENO POLIFENOL
RESVERATROL (RSV) EN ANIMALES OBESOS TAMBIÉN INCLUYEN LA REGULACIÓN DE
LA SÍNTESIS DE COQ Y LA MODULACIÓN DE GENES COQ Y SI ESTA REGULACIÓN ESTÁ
ASOCIADA CON LA MODULACIÓN DEL SISTEMA MITO / AUTOFAGIA.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales y métodos fueron:
En primera instancia se utilizaron animales, ratones macho en especifico. Se dividieron
doce ratones de 4 semanas en tres grupos, y a estos se les alojo en condiciones
ambientales ricas en grupos de 4 animales por jaula de polibicarbonato, bajo un ciclo de
luz/oscuridad de 12h con una temperatura oscilada entre los 22 y 23 °C y un 50% de
humedad. (proyecto aprobado por el comité de ética de la U. Pablo de olavide, y el
seguimiento de normas para investigación con el uso de animales) .
Luego de que se determinara el peso durante un periodo de 8 smeanas, los animales
fueron asignados de forma aleatoria en 3 grupos:
 A) Dieta estándar grupo control (n=4), con 13% de energía grasa
B) Dieta alta en grasas (HDF, n=4), con 49% energía en grasa de manteca de cerdo
C) Dieta alta en grasas + resveratrol (HDF + RSV+ n=4), suinistrando agua que
contenía etanol al 0,18% utilizado como vehículo para RSV (180 μl de etanol / 100
ml de H2O). El grupo tratado con RSV bebió agua que contenía RSV (180 μL de 0,1
g / ml de solución etanólica de trans-RSV en etanol / 100 ml de H2O) (Cayman
Chemicals, Ann Arbor, MI, EE. UU.) Desde el principio. El RSV y el agua tratada
con vehículo se suministraron siempre en botellas opacas para evitar la
descomposición del RSV dependiente de la luz, como se indicó
anteriormente . Los frascos se cambiaron dos veces por semana para evitar la
degradación del RSV. Como los animales bebieron alrededor de 4-5 ml / día y el
peso de los animales alimentados con HFD fue de alrededor de 40 g, la dosis
calculada de VSR estuvo entre 720 y 900 μg / animal / día (18-22,5 mg / kg / día).

Una vez finalizado el experimento, los animales se sacrificaron mediante dislocación

cervical en condiciones de ayuno (ayuno O / N) y se extrajo sangre por punción cardíaca
inmediatamente. Los órganos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido
después de la disección y se mantuvieron a -80 ° C hasta el análisis
En segunda instancia, se realizó un análisis de metabolitos sanguíneos, en el cual la
sangre se introdujo en tubos heparinizados con litio, para posteriormente centrifugar x
10 minutos. El plasma se dividió a 80°c hasta el análisis. Luego se analizaron las enzimas
del colesterol total y los triglicéridos.
En tercera instancia se realizó una Transferencia por ranura para así detectar los grupos
carbonilos de proteínas, esta se realizó utilizando un sustrato de detección de
quimioluminiscencia. 
En cuarta instancia, se realizó un Aislamiento de mitocondrias extraidas del hígado y
transferencia Western en el cual dichas mitocondrias se extrajron del hígado con
ciertos procesos químicos.
En quinta instancia se determinó la expresión del ARN total obtenido de muestras de
hígado luego de una homogenización hecha con con TRIZOL (un inhibidor de ARNasas,
y mantiene la integridad de los ácidos nucleicos durante la homogeneización del tejido)
.Para determinar el mejor gen de mantenimiento utilizado como referencia, se
comparo los niveles con 4 genes constituitivos comparamos los niveles con cuatro
genes constitutivos: b-actina ( proteínas altamente conservadas que están involucradas
en la motilidad celular, estructura e integridad), HSP90 (una proteína chaperona que
ayuda a otras proteínas a plegarse adecuadamente, estabiliza proteínas contra
situaciones de hipertermia y apoya en la degradación de proteínas.) HPRT(La
hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa es una transferasa que cataliza la
 conversión de hipoxantina en monofosfato de inosina y guanina en monofosfato de
guanosina.) y 18S (El ARN ribosómico 18S es una parte del ARN ribosómico)

En sexta instancia se realizaron determinaciones de CoQ10, en la que luego de ciertos

procesos los niveles totales de CoQ se detectaron mediante un detector electro
químico y se expresaron como pmol/mg de proteína

Y en séptima instancia de materiales y métodos se realizo un análisis estadístico en el

que los datos se indican como la media. Se utilizó el análisis de correlación de Pearson
para determinar la relación entre dos parámetros y se consideró un valor de p de dos
colas con un intervalo de confianza del 95%. La significancia estadística se determinó
con una p <o igual a 0.05.
RESULTADOS
1. Como primer resultado se obtuvo que el resveratrol no revirtió el aumento de
peso en animales alimentados con HFD. Aquí aunque estos aumentaron de peso
durante los 9 meses del experimento el RSV no redujo este aumento como tal,
ni tampoco la ganancia de peso al final del experimento
Los parámetros plasmáticos asociados con el estado de síndrome metabólico de los
animales indicaron que el grupo HFD mostró TG y colesterol más altos que el grupo
control ( Figura 1 C, D). Curiosamente, el VSR pudo disminuir los TG a niveles de control,
pero no pudo disminuir el colesterol total en estos animales. En cuanto a la capacidad
antioxidante en plasma, la HFD no afectó al TAS en plasma y el VSR no produjo ningún
efecto ( Figura 1MI). Sin embargo, en el caso de la carbonilación de proteínas en
Figura 1. Marcadores
plasma, del síndrome
RSV redujo metabólico enlos
significativamente ratones. ( A )
niveles en Peso a lo largo delcon
comparación experimento,
los grupos* de
Diferencia estadística frente al grupo de control, p <0,05. ( B ) Aumento de peso al final de los 9 meses de
control y HFD ( Figura 1 
experimento y fotografía representativa de los animales. ( C ) Niveles de triglicéridos en plasma (nmol /
L). ( D ) Niveles de colesterol total en plasma (nmol / L). ( E ) Estado antioxidante total (TAS) en plasma
(mmol / L). ( F ) Niveles de carbonilación de proteínas plasmáticas en el hígado (unidades arbitrarias). La
significancia estadística se indica en cada figura. HFD: dieta rica en grasas; RSV: resveratrol

2. Como segundo resultado se obtuvo que Los niveles de ARNm del componente
del sintoma CoQ en el hígado se vieron afectados por la HFD y revertidos por el
resveratrol
En general, la expresión relativa de todos los componentes de la síntesis de CoQ se
redujo por HFD ( Figura 2 ). Solo en algunos casos, COQ6 y COQ8 / ADCK3 , los niveles
en relación con el control fueron claramente los mismos. En algunos casos, con
respecto a COQ2 y COQ4 , la disminución no fue estadísticamente significativa aunque
la tendencia a disminuir fue clara. La adición de RSV a HFD revirtió esta disminución que
afecta a la mayoría de los componentes, excepto COQ3 , COQ7 y COQ10 . En el caso
de DPS1 y especialmente en COQ8A / ADCK3 , el efecto del resveratrol produjo un
aumento de los niveles de ARNm por encima de los niveles encontrados en el grupo
control.
Todos estos casos indican que la expresión de los genes implicados en la síntesis de
CoQ en el hígado fue regulada a la baja por HFD y que el RSV puede revertir este efecto
restaurando los niveles a niveles de control aunque no en todos los casos.
Figura 2. Niveles de ARNm de genes COQ en hígado. Los niveles de ARN mensajero se
determinaron mediante qPCR como se indica en la Sección 2.5 . El gen de mantenimiento de la β-
actina se utilizó como control de carga. Las diferencias estadísticas se incluyen en cada figura ( n =
4) por grupo. mDPS1: subunidad 1 de decaprenil-difosfato sintasa; mDLP1: subunidad 2 de
decaprenil-difosfato sintasa; mCOQ2 – mCOQ10: proteínas COQ de ratón.

3. Como tercer resultado se obtuvo que  Los niveles de proteínas COQ no se vieron
afectados por los cambios en la expresión de los genes de síntesis de CoQ
Para determinar si la reducción en la expresión de genes COQ estaba afectando los
niveles de las proteínas, se detectaron proteínas COQ4 y COQ7, que mostraban
diferente respuesta a HFD y HFD + RSV en extractos mitocondriales crudos ( Figura
3 ). Sorprendentemente, no se encontraron cambios en los niveles de proteínas en
estos extractos. La proteína COQ7 mostró una ligera tendencia a disminuir en el
tratamiento con HFD + RSV pero sin alcanzar significación. En el caso de COQ4, la
variación de los niveles mostró una tendencia similar a los niveles de ARNm pero sin
mostrar significación estadística. Esto indica que la regulación en la expresión del
ARNm no representa el comportamiento de los niveles de proteínas en las
mitocondrias hepáticas.

Figura 3. Niveles de proteína de COQ4 y COQ7 en mitocondrias hepáticas. ( A ) Transferencias

occidentales representativas para las proteínas COQ4 y COQ7 en el extracto mitocondrial de las
mitocondrias hepáticas y el marcador de carga Ponceau S. Los carriles incluyen las muestras de
diferentes animales pertenecientes a los tres grupos. ( B ) Cuantificación de WB en relación con los
niveles de control ( n = 4). CTR: control.
DISCUSIÓN se discutieron entonces los resultados con lo conocido previamente
En el estudio:

 Aunque el VSR aumenta la longevidad en animales alimentados con dietas altas en

grasas, fue incapaz de producir el mismo efecto de prolongación en animales alimentados
con una dieta estándar.
 el tratamiento del VSR no disminuyó el peso corporal aunque el perfil de los TG
plasmáticos disminuyó sin afectar los niveles de colesterol
 Se presentó un nuevo aspecto de esta modulación, la regulación de la expresión de los
genes implicados en la síntesis de CoQ que se encuentran reprimidos en condiciones de
HFD.
 El RSV ha demostrado una clara actividad que influye en la función mitocondrial en
muchos modelos que muestran disfunción mitocondrial
 El RSV fue capaz de proteger las mitocondrias contra el daño en un modelo de deficiencia
del Complejo I (deficiencia de NDUFC2), bajo alto estrés salino.
 En humanos, se ha propuesto que el VSR reduce la disfunción metabólica en muchas
enfermedades en las que está involucrada la disfunción mitocondrial, como la diabetes tipo
II, enfermedades cardiovasculares o hepáticas
 La relación más clara de RSV con CoQ se encontró cuando el RSV se consideró un
precursor putativo de la síntesis de CoQ en levadura. Sin embargo, en los animales, y
particularmente en los mamíferos, este hecho parece ser muy poco probable y el VSR no
puede considerarse una fuente de la cabeza fenólica de CoQ
  Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que muestra que el RSV puede influir en
la expresión de genes implicados en la síntesis de CoQ.
 Se ha demostrado que el RSV induce una respuesta antioxidante contra el daño oxidativo
a través de la activación de NRF2 (es un factor de transcripción que no solo modula varias
proteínas antioxidantes sino también la fisiología mitocondrial)
  Si la modulación de COQ Los niveles de ARNm de los genes están modulados por NRF2.
Queda por aclarar ya que hasta la fecha no se dispone de información. Sin embargo, se
sabe que HFD reprime la señal NRF2 y la reducción de los niveles de ARNm de NOQ1 en
nuestro experimento confirman este efecto. Por otro lado, el efecto nulo de RSV en los
niveles de ARNm de NQO1 indica que la modulación del ARNm de la mayoría de
los genes COQ no depende de la actividad de NRF2. No podemos afirmar lo mismo en el
caso de COQ3, COQ7 o COQ10 que muestran la misma falta de respuesta a RSV.
 Consideramos que los aumentos en la fusión mitocondrial inducida por RSV y la
modulación de la mitofagia probablemente pueden afectar la dinámica mitocondrial y
aumentar la renovación de CoQ sin afectar los niveles y proteínas totales de CoQ. Este
hecho podría explicar el aumento de los niveles de ARNm sin afectar los niveles de
proteína de COQ y los niveles de CoQ total.
 En animales viejos alimentados con una dieta estándar, la suplementación con RSV
aumentó la actividad de NQO1 y la actividad de glutatión peroxidasa 1 y los niveles de
proteína, aunque no pudo afectar a CYTB 5 R. Además, en ratones, la influencia del VSR
en las actividades antioxidantes dependía de la edad y del tejido. Por lo tanto, si RSV
modula COQniveles de ARNm y proteínas del gen, es posible que su efecto sea más
importante en animales viejos que en animales jóvenes. Esta misma diferencia relacionada
con la edad ya se ha encontrado con la restricción calórica o el ejercicio en roedores que
afectan el hígado y otros tejidos.

CONCLUSIÓN

En resumen, la administración de RSV a ratones en HFD podría regular algunos parámetros

asociados a HFD como los triglicéridos pero no otros como el aumento de peso o el
colesterol. La renovación mitocondrial está influenciada por HFD y RSV podría regularla a
niveles de control. Mostramos aquí por primera vez que, HFD regula los niveles de expresión
de genes COQ induciendo una disminución mientras que RSV recupera los niveles de ARNm
de muchos de ellos para controlar los niveles. Nuestros resultados indican que los niveles de
ARNm de los genes COQ pueden estar asociados con la tasa de renovación mitocondrial,
mientras que los niveles de CoQ y las proteínas son más estables. Se necesitan más estudios
en otros tejidos y órganos y en animales más viejos para determinar si el efecto del RSV
depende de la edad y del órgano.