Journal of Immunological Methods 469 (2019) 18-25

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Revista de métodos inmunológicos

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Trabajo de investigación

Evaluación del desempeño de anti-fijo Leishmania infantum promastigotes inmunoglobulina G (IgG) detectada
por citometría de flujo como herramienta de diagnóstico para la leishmaniasis visceral ☆

Elis D. Silva un , • , Beatriz C. Oliveira un , Andresa P. Oliveira un , Wagner JT Santos un , George T. Diniz un ,
Osvaldo P. de Melo Neto un , Carlos HN Costa segundo , Mauro RB Silva C , Luiz D. Andrade un ,
Zulma M. Medeiros un , re , 1 , Valéria RA Pereira un , 1
un Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-Pernambuco), Instituto Aggeu Magalhães, Recife, Pernambuco, Brasil
segundo Instituto de Doenças Tropicais Natan Portella (IDTNP), Teresina, Piauí, Brasil
C Universidade Estadual do Piauí, Teresina, Piauí, Brasil
re Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Pernambuco, Recife, Brasil.

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: La leishmaniasis visceral (LV) es una enfermedad grave, causada por protozoos Leishmania infantum y L. donovani
Citometría de flujo que se diagnostica ampliamente mediante herramientas serológicas. Estos, sin embargo, tienen limitaciones de desempeño que limitan su uso
IgG para la correcta identificación de los casos. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de la citometría de flujo con parásitos fijos para
Serodiagnóstico
el diagnóstico de LV, comparándola con otras cuatro pruebas serológicas. Muestras de dos regiones endémicas de LV en Brasil, diagnosticadas
Leishmania infantum
por examen directo (DG1) y por al menos dos o una prueba serológica estándar (DG2 y DG3, respectivamente), así como pacientes con
Leishmaniasis visceral
enfermedad de Chagas crónica (CG1) y controles sanos ( CG2) se utilizaron en este estudio. Los resultados de la citometría de flujo se expresaron
como niveles de reactividad de IgG, basados en el porcentaje de parásitos fluorescentes positivos (PPFP). Usando una dilución de suero 1: 4096,
un análisis de la curva ROC de la titulación del suero en citometría de flujo ha indicado una PPFP del 2% como punto de corte para segregar los
resultados positivos y negativos. En el presente estudio, la citometría de flujo tuvo el mejor desempeño para DG1 (sensibilidad del 96%) mientras
que rK39 (prueba rápida inmunocromagráfica) y DAT (prueba de aglutinación directa) también se asociaron con alta sensibilidad y especificidad. La
concordancia sustancial y los índices kappa observados sugirieron desempeños similares entre estas dos pruebas y la citometría de flujo. IFAT
(prueba de anticuerpos inmunofluorescentes) y ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) tuvieron rendimientos más bajos y los valores
más bajos de concordancia con la citometría de flujo. Juntos, estos hallazgos sugieren que aunque se necesitan ajustes para reducir la reactividad
cruzada con otros tripanosomátidos,

1. Introducción donovani complejo Organização Pan-Americana da Saúde., 2018 ).

La leishmaniasis visceral (LV) es una enfermedad desatendida y altamente letal, que es
endémica en 76 países y se encuentra en 12 países de América, siendo Brasil el que tiene la
endemicidad más alta y es responsable del 96% de los casos notificados en las Américas. En este
continente, la enfermedad es causada por los protozoos. Leishmania infantum, parte de Leishmania
El diagnóstico de LV se basa en los signos y síntomas clínicos de los pacientes y se confirma
mediante pruebas de laboratorio ( Chappuis et al., 2007 ). La dificultad para diagnosticar a los
pacientes retrasa el tratamiento y, por tanto, aumenta la letalidad de la enfermedad ( Coura-vital et al.,
2014 ). A pesar de la disponibilidad de varias pruebas, ninguna puede diagnosticar todos los casos y
su efectividad varía entre las diferentes regiones geográficas ( Boelaert y col.,

Abreviaturas: IFAT, prueba de anticuerpos inmunofluorescentes; DAT, prueba de aglutinación directa; DG, grupo de diagnóstico; CG, grupo de control; FITC, isotiocianato de fluoresceína; PPFP, porcentaje de parásitos
fluorescentes positivos; IC: intervalo de confianza; PPV, valor predictivo positivo; VPN, valor predictivo negativo; AC, precisión; VL, leishmaniasis visceral; CV, coeficiente de variación

☆ Revista de métodos inmunológicos

• Autor correspondiente.

Dirección de correo electrónico: dionisio.elis@gmail.com (ED Silva).

1 Coautores senior.

https://doi.org/10.1016/j.jim.2019.02.009
Recibido el 28 de junio de 2018; Recibido en forma revisada el 8 de febrero de 2019; Aceptado el 22 de febrero de 2019 Disponible online el 25 de

febrero de 2019

0022-1759 / © 2019 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

ED Silva y col.
2008 ; Cunningham et al., 2012 ; Abass et al., 2015 ). Leishmania La identificación en los aspirados de
médula ósea es el estándar de oro para el diagnóstico de LV, pero su ejecución de rutina se ve
obstaculizada por la necesidad de profesionales calificados y un entorno de recolección apropiado ( Maia
et al., 2012 ). Las pruebas serológicas son muy utilizadas para el diagnóstico de LV, pero tienen
limitaciones, como la falta de discriminación entre infecciones recientes y tardías, lo que imposibilita
resuspensión en formaldehído al 2% (Merck Millipore Darmstadt, Alemania) y almacenamiento a 4 °
su uso como criterio de curación. Además, pueden reaccionar de forma cruzada con otros parásitos ( Boelaert
y col., 2004 ; Sakkas et al., 2016 ).
En este contexto, los estudios con citometría de flujo han demostrado su capacidad para
diagnosticar LV ( Andrade et al., 2007 ) y la enfermedad de Chagas ( Vitelli-Avelar et al., 2007 ). La
citometría de flujo tiene valores de alta sensibilidad y especificidad, y podría utilizarse como criterio
de diagnóstico y curación de la enfermedad de Chagas ( Martins-Filho y col., 1995 ; Matos et al., 2011 );
leishmaniasis cutánea Rocha et al., 2002 ; Pereira et al., 2012 ); VL ( Lemos et al., 2007 ; García et al.,
2009 ), y también para el control posterior a la vacuna de la leishmaniasis visceral canina ( Andrade et
al., 2007 ; Ker et al., 2013 ).
Los objetivos de este estudio fueron evaluar el rendimiento de la citometría de flujo y su
comparación con otras cuatro pruebas serológicas para el diagnóstico de leishmaniasis visceral.
Además, también hemos evaluado el rendimiento de la citometría de flujo para detectar reactividad
cruzada en pacientes con enfermedad de Chagas crónica.
2. Materiales y métodos
2.1. Muestras de suero y población de estudio
La población se definió por conveniencia del tamaño de la muestra, con las muestras de suero
de dos áreas endémicas de LV del noreste de Brasil (Pernambuco y Piauí) divididas en tres grupos
de diagnóstico (GD) y dos de control (GC). DG1, 2 y 3 se definieron mediante la identificación del
parásito en aspirado de médula ósea y cuatro pruebas serológicas (DAT, ELISA, prueba rápida rK39
e IFAT). Los grupos fueron: pacientes DG1-51 con LV positiva según la presencia de Leishmania parásitos línea roja debajo indica la presencia de IgG anti-rK39, lo que representa un resultado positivo.
en aspirados de médula ósea; Pacientes DG2-73 con LV positiva confirmada por al menos dos
pruebas serológicas; Pacientes DG3-82 con LV positiva confirmada por al menos una prueba
serológica; Pacientes CG1-15 con enfermedad de Chagas crónica; CG2-18 individuos sanos sin
antecedentes de LV de áreas no endémicas. Todas las muestras de suero se recolectaron en tubos
Vacutainer (BD Biosciences), procesados por centrifugación (1000 gramo, 10 min, temperatura
ambiente), inactivado por calentamiento durante 30 min a 56 ° C y centrifugado a 4 ° C, 1000 gramo por
cinco minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante se dividió en alícuotas y se mantuvo a
-20 ° C hasta su uso posterior. Todo el suero humano fue recolectado después de la aprobación de
su uso por los correspondientes comités de ética de la Universidad Federal de Piauí (0116 /
2005) y de IAM-FIOCRUZ (CAEE 51603115.7.0000.5190).
2.2. Preparación de parásitos
Las formas promastigote de L. infantum cepa MHOM / BR / 70 / BH46 se cultivaron a 26 ° C in
vitro en el medio de Schneider asociado con el medio Novy-MacNeal-Nicolle (NNN). Los parásitos se
sometieron a expansión y se centrifugaron a baja velocidad (400 gramo, 10min, temperatura
ambiente). Para los ensayos ELISA, las células de promastigote sedimentadas se lavaron tres veces
con una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, 4 ° C, seguido de resuspensión en
tampón de lisis (NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 ) suplementado con 1 mM de
los inhibidores de la proteasa N-etilmaleimida (NEM) y fenilmetilsulfonil
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fluoruro (PMSF). La lisis se realizó mediante ciclos de congelación-descongelación, seguidos de
centrifugación a 10.000 gramo durante 15 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante y se cuantificó el
contenido de proteína mediante el ensayo de Bradford siguiendo procedimientos estándar. El
antígeno soluble crudo se almacenó a -80 ° C hasta su uso posterior. Para la prueba de anticuerpos
inmunofluorescentes (IFAT), el sedimento de promastigote se lavó una vez con PBS seguido de
C hasta su uso en los ensayos. Para la citometría de flujo, el mismo sedimento de promastigote se
lavó tres veces con PBS que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, a 4 ° C, seguido de
resuspensión para la fijación en paraformaldehído al 1% e incubación durante la noche. Las células
fijadas se lavaron luego de nuevo con PBS más FBS al 10% y la resuspensión final se ajustó a 5 ×
10 6 promastigotes / mL, luego se utiliza para el ensayo de citometría de flujo.
2.3. Identificación directa de parásitos
Se obtuvieron aspirados de médula ósea (1ml) para análisis parasitológico con el fin de detectar
Leishmania parásitos, preparando los frotis por aposición de portaobjetos. Los portaobjetos se
tiñeron con una tinción panóptica (Ranylab, Barbacena, Brasil) y se evaluaron con un microscopio
óptico (100 ×). Se evaluaron al menos tres frotis de médula ósea para cada paciente ( Da Silva et al.,
2005 ).
2.4. Prueba rápida rK39 (IT LEISH)
El protocolo de prueba rápida IT LEISH se realizó de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Bio Rad Laboratories; Marnes-la-Coquette, Francia) utilizando 10 μl de suero. Anti- Leishmania-
los anticuerpos específicos son capturados por un conjugado (proteína A y oro coloidal) que
reacciona con el antígeno recubierto de membrana (k39). Después de cinco minutos, aparece una
línea roja arriba que indica la presencia de la IgG (control), lo que valida el kit. La aparición de otra
2.5. Prueba de aglutinación directa (DAT)
La DAT se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Royal Tropical Institute,
Amsterdam, NL). La prueba se realizó en placas de fondo en V de 96 pocillos (Greiner Bio One,
Alemania) con diluciones de suero en serie que varían de 1:50 a 1: 51200. Los resultados se leyeron
después de una incubación durante la noche a temperatura ambiente. El título de DAT está indicado
por la dilución más alta en la que la aglutinación es visible. Los sueros con títulos de 1: 6400 se
consideraron positivos ( El Harith y col., 1988 ).
2.6. Prueba de anticuerpos inmunofluorescentes (IFAT)
La prueba IFAT se realizó con un protocolo interno desarrollado por el Grupo de Investigación
de Inmunología de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias del Instituto Aggeu Magalhães -
FIOCRUZ, PE, utilizando 10 μl de la suspensión antigénica de L. infantum promastigotes aplicados a
la región delimitada en los portaobjetos IFAT (PERFECTLAB, São Paulo, Brasil) y dejándolo reposar
durante dos horas a 37 ° C. Posteriormente, los portaobjetos se recubrieron con 10 µl de las
muestras de suero de los pacientes en títulos que variaban de 1:20 a 1: 320 en PBS, pH 7,2. Se
incubaron dos sueros de control (positivo y negativo) en una cámara húmeda durante 30 min a 37 °
C. Después de la incubación, se eliminó el exceso de suero de los portaobjetos lavándolos tres veces
mediante inmersión en PBS, pH 7,2, en intervalos de 10 min. Anti humano
ED Silva y col.
Se añadió a los portaobjetos IgG conjugado con isotiocianato de fluoresceína-FITC (Sigma Chemical
Corp., St. Louis, MO) preparado en azul de Evans (40 mg) en solución tampón PBS (previamente
diluido en una proporción 1:10 en el mismo tampón) en un Dilución 1:50, incubándolos en las mismas
condiciones mencionadas anteriormente. Después de la reacción, los portaobjetos se lavaron tres
veces durante 10 min en PBS y se dejaron a temperatura ambiente. El montaje se realizó con
glicerina tamponada pH 8,5 y luego se observaron los portaobjetos bajo un microscopio de
fluorescencia, con un objetivo de 100X. Los sueros se consideraron positivos a partir de la dilución
1:40.
2.7. ELISA
La prueba ELISA se realizó según lo descrito por Oliveira y col. (2011) .
Brevemente, se sensibilizaron placas de 96 pocillos (Greiner Bio One, Alemania) con 600 ng por
pocillo de crudo L. infantum antígeno y se mantuvo a 4 ° C durante la noche. Las placas se aspiraron,
se bloquearon durante una hora a 37ºC con leche en polvo desnatada al 2% en PBS que contenía
Tween 20 al 0,05% (PBS-T) y se lavaron cuatro veces con PBS-T. Los sueros se diluyeron a 1: 900 en
PBS-T que contenía un 10% de leche desnatada en polvo y se añadieron a los pocillos por triplicado y
se incubaron durante una hora a 37ºC. Después de tres lavados con PBS-T, se añadió el anti-IgG
conjugado con peroxidasa (Calbiochem, EMD Millipore, Billerica, MA) diluido a 1: 2000 y las placas se
incubaron durante una hora más a 37 ° C. Luego, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con o-
fenileno
diamina (OPD) y H 2 O 2. La reacción se detuvo añadiendo 2 M
H 2 ENTONCES 4 ( 50 μl / pocillo) y las placas se leen a 490 nm (Spectra Max 190, Molecular Devices,
Sunnyvale, EE. UU. O MRX II, Dynex Technologies,
Chantilly, Estados Unidos). En cada placa estaban presentes sueros de control positivo y negativo
para estandarizar las lecturas y variaciones. El punto de corte entre las lecturas de reactivo y no
reactivo se calculó como la media de los controles negativos más dos desviaciones estándar.
2.8. Citometría de flujo
El ensayo de citometría de flujo para detectar anticuerpos contra formas promastigotas de L. infantum se realizó de acuerdo con
Rocha y col. (2002) . Brevemente, la suspensión del parásito (2,5 × 10 5 / pocillo) se incubó en placas de fondo en U de 96 pocillos a 37 °
C durante 30 min en presencia de diferentes diluciones de suero (1:64 a 1: 8192). Después de la incubación, los parásitos se lavaron
dos veces con 150 μl de PBS, pH 7,2, más FBS al 10% y luego se incubaron a 37 ° C durante 30 min, protegidos de la luz, con el
anti-IgG humano conjugado con isotiocianato de fluoresceína-FITC ( Sigma Chemical Corp, St. Louis, MO) diluido 1: 200 en PBS-FBS
al 10%. Después de otro lavado, los parásitos marcados con FITC se fijaron con 200 μl de paraformaldehído al 1% y se mantuvieron
alejados de la luz durante 30 min a 4 ° C hasta que se sometieron a lectura en el citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson San
Jose, CA), utilizando el software " Cell Quest Pro ”. Los parásitos marcados se sometieron a la adquisición del citómetro con 10.000
eventos por muestra. Los promastigotes se identificaron en función de sus propiedades de dispersión de luz frontales (FSC) y laterales
(SSC) específicas. Después de los ajustes de ganancia de FSC y SSC, los parásitos asumieron una distribución característica de
estos parámetros y se evaluó su fluorescencia. Para cada ensayo, además del control interno conjugado con FITC, se incluyeron
controles sin marcar por cuadriplicado, así como controles negativos y positivos para validar el ensayo. Para estos controles, en lugar
de usar una única muestra representativa negativa o positiva, optamos por preparar un conjunto de sueros verdaderos negativos o
positivos y usamos una alícuota de cualquiera de los dos como controles. Además del control interno conjugado con FITC, se
incluyeron controles sin marcar por cuadriplicado, así como controles negativos y positivos para validar el ensayo. Para estos
controles, en lugar de usar una única muestra representativa negativa o positiva, optamos por preparar un conjunto de sueros
verdaderos negativos o positivos y usamos una alícuota de cualquiera de los dos como controles. Además del control interno
conjugado con FITC, se incluyeron controles sin marcar por cuadriplicado, así como controles negativos y positivos para validar el
ensayo. Para estos controles, en lugar de usar una única muestra representativa negativa o positiva, optamos por preparar un conjunto
de sueros verdaderos negativos o positivos y usamos una alícuota de cualquiera de los dos como controles.
20
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2.9. Variaciones intra e interensayo
Para investigar la variación intraensayo, se procesaron triplicados de cinco muestras de control
diferentes en un ensayo. La variación interensayo se evaluó comparando 27 controles altos, 5
controles medios y 5 controles bajos que se ejecutaron en tres ensayos independientes. El
coeficiente de variación (CV) para las variaciones intra e interensayo se calculó mediante la fórmula:
CV = Desviación estándar x 100.
media
2.10. Estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión GraphPad Prism
7.0 y la curva ROC, por Medcalc Software versión 15.8. El rendimiento de cada prueba se evaluó
mediante los siguientes índices estadísticos: Sensibilidad = [verdaderos positivos ÷ (verdaderos
positivos + falsos negativos)] × 100; especificidad = [verdaderos negativos ÷ (verdaderos negativos +
falsos positivos)] × 100; valor predictivo positivo - VPP = [verdaderos positivos ÷ totales positivos] ×
100; valor predictivo negativo - VPN = [verdaderos negativos ÷ totales negativos] × 100 y precisión =
[(verdaderos positivos + verdaderos negativos) ÷ (verdaderos positivos + verdaderos negativos +
falsos positivos + falsos negativos)] ( Eusebi, 2013 ). Se utilizó la prueba t de Student para determinar
las diferencias entre grupos. El nivel de concordancia para cada una de las pruebas (ELISA, IFI,
DAT, prueba rápida rK39) con citometría de flujo se determinó por porcentaje de concordancia y el
índice kappa (ĸ) con intervalo de confianza del 95% y valores de p <0,05 se consideraron
significativos. .
3. Resultados
3.1. Optimización de los parámetros de citometría de flujo para la identificación de formas IgG
anti-promastigota de L. infantum
Establecer los ensayos de citometría de flujo y definir los datos de reactividad de IgG contra L.
infantum Con los mejores índices de rendimiento, se evaluaron promastigotes incubados con FITC
(isotiocianato de fluoresceína) anti-IgG humana conjugada en el citómetro de flujo en ausencia de
sueros humanos (control interno) y después de la incubación con sueros VL positivos o negativos,
con resultados representativos. se muestra en la Figura 1 . Después de la identificación del
promastigote ( Figura 1 A), se analizó la intensidad de fluorescencia relativa de FITC de cada evento.
Se colocó un marcador en la representación del control interno conjugado con FITC ( Figura 1 B) y se
utiliza en todos los análisis de datos informados aquí para determinar para cada muestra el
porcentaje de parásitos fluorescentes positivos (PPFP). Figura 1 C y D ilustran los resultados de los
niveles de fluorescencia para un suero de control negativo y positivo, respectivamente, con los
valores de PPFP derivados.
A continuación, para evaluar las diluciones óptimas que se utilizarán con los sueros con el fin de definir
mejor las muestras positivas y negativas, representamos gráficamente los valores promedio de PPFP
obtenidos de cinco grupos de sueros definidos: DG1 - VL positivo confirmado por Leishmania visualización;
DG2 - VL positivo confirmado por al menos dos pruebas serológicas; DG3 - VL positivo confirmado por al
menos una prueba serológica; CG1 - Enfermedad de Chagas; CG2 - sueros de control sanos.
Figura 2 luego compara los valores de serorreactividad promedio para IgG para los diferentes
grupos, expresados en PPFP, con diferentes diluciones de suero (curva de titulación que varía de
1:64 a 1: 8192). Del gráfico que se muestra, la titulación del suero de mayor diferencia en reactividad
considerando solo
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Figura 1. Gráficos de serología de citometría de flujo representativos utilizados para analizar la reactividad de IgG anti-fijo L. infantum promastigotes en muestras de suero humano. Los promastigotes se seleccionaron en un
diagrama de puntos en función de su FSC (tamaño) versus SSC (granularidad). Se encontró que los parásitos fijos asumían una distribución homogénea (A). La intensidad de fluorescencia relativa de FL1 / FITC se cuantificó en
ausencia de suero humano pero en presencia de anti-IgG humana conjugada con FITC (control interno). Esta condición conduce al establecimiento de un valor máximo de reactividad y determinación del marcador M1 (región
positiva) (B). La reactividad de IgG se proporciona en histogramas para cada muestra de suero como PPFP, que representa la frecuencia del cambio del parásito hacia una mayor intensidad de fluorescencia, a través de M1. Este
marcador se mantuvo para determinar la reactividad en todos los análisis de datos realizados en sueros de muestras negativas (C) y positivas (D) para LV.

las muestras positivas y los controles sanos fue 1: 512. Sin embargo, esta dilución está asociada con
altos niveles de reactividad cruzada y resultados falsos positivos con los sueros de individuos con
enfermedad de Chagas. Por lo tanto, seleccionamos la dilución de 1: 4096, ya que mostró una reducción
sustancial de los resultados falsos positivos con pequeñas disminuciones en los niveles de fluorescencia
para las muestras positivas verdaderas.
3.2. Evaluación del rendimiento de la citometría de flujo para el diagnóstico de LV
la seropositividad para VL fue del 96% para DG1, 92% para DG2, 85% para DG3. A continuación, se
dibujaron curvas ROC individualmente evaluando el rendimiento por citometría de flujo de los tres
grupos de sueros positivos (DG1, DG2 y DG3) en relación con los dos conjuntos de muestras
negativas VL agrupadas (CG1 + CG2). Las curvas Figura 4 ) muestran que, para la dilución de suero
seleccionada, los valores para el área bajo la curva fueron 0,9 (95%, con un intervalo de confianza
[IC] entre 0,90 y 0,99) para el grupo DG1, 0,92 (95%, IC = 0,85– 0,97) para DG2 y 0,9 (95%. IC =
0,83–0,95) para DG3. Las curvas ROC indicaron que el valor de PPFP al 2% sería el punto de corte
apropiado para separar los grupos VL de los individuos negativos.

El análisis individual mediante citometría de flujo de todas las muestras de suero pertenecientes
a los cinco grupos aquí definidos utilizando la dilución 1: 4096 se muestra en Fig. 3 . En cuanto a las
referencias negativas (CG1 + CG2), la citometría de flujo ha dado falsos positivos en cinco muestras
de individuos con enfermedad de Chagas, mientras que casi todas las que fueron confirmadas
mediante visualización de parásitos (DG1) fueron identificadas como positivas. Se observaron
valores intermedios para los otros grupos. Así,
Para evaluar posibles errores analíticos, también realizamos intra e interensayos para
determinar los coeficientes de variación (CV), parámetros ampliamente utilizados para cuantificar la
precisión de las medidas biológicas. Estos se basaron en los valores de PPFP para seleccionar
suero alto, medio y bajo para usar como en casa control S. Los CV intraensayo variaron del 4% al
13%

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Figura 2. Curva de titulación de anticuerpos IgG detectada por citometría de flujo de Anti-Fixed
Leishmania infantum promastigotes estratificados por grupos. DG1 ( ▲) ( n = 51, DG2 () n = 73, DG3 ( ●)
n = 82, CG1 () n = 15, CG2 () n = 18. El rectángulo gris corresponde a la titulación de 1: 4096 que fue
la región de mayor separación entre los grupos VL positivos analizados y ambos conjuntos de
controles. PPFP = porcentaje de parásitos fluorescentes positivos. Las barras muestran los intervalos
de confianza del 95%.
Fig. 3. Distribución de la reactividad de IgG de formas de promastigota de L. infantum
estratificado por grupos. DG1 ( ▲) n = 51, DG2 () n = 73, DG3 ( ●) n = 82, CG1 () n = 15, CG2 () n = 18.
Todos los grupos están en la dilución 1: 4096 y las muestras por encima del límite de 2% de PPFP
(porcentaje de parásitos fluorescentes positivos) se consideran positivas.
mientras que los CV entre ensayos oscilaron entre el 8% y el 13% ( tabla 1 ), dentro del rango de
variación considerado aceptable, ≤20%. No hay diferencia estadísticamente significativa entre las
medias de los controles ( P> 0,05).
3.3. Comparación entre el rendimiento de las pruebas de citometría de flujo y serológicas en el diagnóstico
de LV
Con base en los resultados anteriores, utilizamos los valores expresados con la dilución 1:
4096 para una comparación de la citometría de flujo con otras pruebas serológicas utilizadas
actualmente: DAT, ELISA e IFAT, todas basadas en extractos o células parásitas enteras; y la prueba
rápida basada en el antígeno rK39 recombinante. La citometría de flujo tuvo el mayor rendimiento
diagnóstico con
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Journal of Immunological Methods 469 (2019) 18-25
el grupo DG1 en comparación con las otras pruebas serológicas, con
Figura 4. Curva ROC por índices de rendimiento, sensibilidad y especificidad de la citometría de flujo para
todos los grupos analizados. El análisis de la curva ROC se aplicó para establecer el mejor punto de corte
para discriminar los valores de PPFP de las muestras positivas y negativas e indicar el área bajo la curva
(AUC = precisión global). Curva ROC de muestras a dilución 1: 4096 que indica un punto de corte del 2%.
sensibilidad del 96%, un valor predictivo positivo del 91% y una precisión del 92% ( Tabla 2 ). La
prueba rápida rK39 fue la mejor prueba en el diagnóstico de casos para el grupo DG2, mientras que
para DG3 se observó la mejor sensibilidad para DAT, teniendo la prueba rápida rK39 un mejor valor
predictivo positivo. La especificidad fue del 85% para la citometría de flujo, del 65% para ELISA y del
100% para otras pruebas.
Luego, los resultados de la citometría de flujo se compararon con las otras cuatro pruebas
serológicas para evaluar la concordancia entre diferentes conjuntos de resultados ( Tabla 3 ). Hubo
una concordancia sustancial (ĸ> 0,6; concordancia> 80%) entre el ensayo DAT y la prueba rápida
rK39 en comparación con la citometría de flujo para todos los grupos, con valores más bajos para las
otras pruebas. De hecho, el IFAT tuvo los valores más bajos de rendimiento y solo la concordancia
promedio (ĸ <0,6; Concordancia <80%) para los tres grupos de sueros positivos para VL.
Luego, nuestro objetivo fue evaluar el valor clínico de la citometría de flujo para el diagnóstico
diferencial entre LV y enfermedad de Chagas en comparación con las otras pruebas serológicas.
Como se indicó anteriormente, el análisis de los valores de PPFP utilizando la dilución de suero 1:
4096 con una PPFP = 2% como punto de corte demostró que el porcentaje de reactividad cruzada
para la citometría de flujo fue del 33% (basado en Fig. 3 ). En cuanto a las otras pruebas, la que
presentó mayor porcentaje de reactividad cruzada fue ELISA (73%), mientras que las otras pruebas
(DAT, rK39 e IFAT) no mostraron reactividad cruzada en nuestras manos, al menos con el suero
disponible para nosotros. .
4. Discusión
En general, el rendimiento del ensayo de citometría de flujo descrito aquí resultó en una mejor
sensibilidad para el diagnóstico de LV en comparación con las cuatro pruebas serológicas utilizadas
en el procedimiento clínico. Esto es especialmente relevante considerando los resultados para el
grupo DG1, donde la citometría de flujo tuvo el mejor desempeño, similar a la prueba rápida rK39, ya
que este es el único grupo con todas las muestras positivas confirmadas solo después de la
visualización del parásito. Este hallazgo corrobora los primeros resultados por García y col. (2009) y Lemos
y col. (2007) indicando un mejor desempeño de la citometría de flujo para el diagnóstico de LV, ahora
con un aumento sustancial en el número de muestras evaluadas e incluyendo la comparación con
otros métodos serológicos. Citometría de flujo luego
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tabla 1
Coeficientes porcentuales de variación (CV) medios intraensayo e interensayo e intervalos de confianza (IC) del 95% para controles alto, medio y bajo en múltiples ensayos de citómetro de flujo anti-IgG para L.
infantum.

Intraensayo Interensayo

No. de muestras % PFPP media (IC del 95% un ) % CV medio (IC del 95%) No. de muestras % PFPP media (IC del 95%) % CV medio (IC del 95%)

Alto control 5 75 (66–84) 4 (0,8–6,5) 27 71 (66–75) 13 (10-16)

Controles medios 5 20 (7-27) 5 (3-7) 5 20 (13-26) 8 (3,5-12)
Controles bajos 5 0,2 (0,1-0,2) 13 (3−23) 5 0,2 (0,1-0,2) 10,5 (7-14)

un CI = intervalo de confianza.

surge como una prueba alternativa para ser utilizada para el diagnóstico serológico de LV. Además,
Tabla 2
demostró ser una alternativa segura y menos invasiva en comparación con la aspiración de médula
Valores de sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos y exactitud de las pruebas
ósea, lo que permite un tratamiento temprano y una reducción de la letalidad, pero aún son necesarios
serológicas utilizadas para el diagnóstico de LV.
ajustes para reducir la reactividad cruzada con tripanosomátidos.
DG1 DG2 DG3

La elección adecuada del antígeno sigue siendo uno de los principales desafíos para las
% De sensibilidad (IC del 95%) un

Citometría de flujo 96 (87–99) 92 (83–96) 85 (76–91) pruebas serológicas y muchas de ellas, incluidas las pruebas ELISA, IFAT y DAT, utilizan extracto de
DAT 94 (84–98) 94,5 (87–98) 91,5 (83–96) antígeno completo de formas de promastigote. Por tanto, es común encontrar reacciones falsas
prueba rápida rK39 92 (81,5–97) 96 (87–99) 88 (79–93) positivas debido a reacciones cruzadas con otras enfermedades ( Caballero et al., 2007 ). Se pueden
ELISA 86 (74–93) 88 (78–93) 78 (68–86)
hacer ajustes en la preparación de antígenos para minimizar el problema de la reactividad cruzada y
ESTOY GORDO 63 (49–75) 73 (61–81,5) 66 (55–75)
se desarrollaron estrategias para vivas y fijas. Leishmania promastigotes para el diagnóstico
Especificidad% (IC 95%)
citométrico de leishmaniasis tegumentaria o cutánea ( Pissinate y col., 2008 ; Pereira et al., 2012 ; Oliveira
Citometría de flujo 85 (69–93) 85 (69–93) 85 (69–93)
et al., 2013 ). El uso de parásitos vivos puede reducir la unión de anticuerpos a las estructuras
DAT 100 (82-100) 100 (82-100) 100 (82-100)
prueba rápida rK39 100 (82-100) 100 (82-100) 100 (82-100) intracitoplasmáticas que se observan en los parásitos fijos (lo que aumenta la probabilidad de
ELISA 67 (50–80) 67 (50–80) 67 (50–80) reacciones cruzadas). Sin embargo, los riesgos de manipulación cuando se usan parásitos vivos es
ESTOY GORDO 100 (82-100) 100 (82-100) 100 (82-100)
un factor limitante, especialmente considerando que el desempeño observado fue similar en ambos
PPV% segundo ( IC del 95%) enfoques ( Lemos et al., 2007 ; García et al., 2009 ), lo que nos lleva a utilizar parásitos fijos en el
Citometría de flujo 91 (80–96) 93 (85–97) 93 (85–97) presente estudio. A pesar de estos ajustes en la preparación del antígeno, aún es necesario evaluar
DAT 100 (93-100) 100 (95-100) 100 (95-100)
cuán variable es esta metodología, pero los intra e interensayos aquí realizados encontraron un
prueba rápida rK39 100 (92-100) 100 (95-100) 100 (92-100)
ELISA 80 (68–88) 85 (76–92) 85 (76–92)
coeficiente de variación dentro de parámetros aceptables ( Reed et al., 2002 ). Sin embargo, todavía

ESTOY GORDO 100 (89-100) 100 (93-100) 100 (93-100) es necesario evaluar la variabilidad de laboratorio a laboratorio, especialmente entre diferentes
regiones, para validar si el rendimiento del método sigue siendo reproducible. Además, en la
NPV% C ( IC del 95%)

Citometría de flujo 93 (79–98) 82 (66,5–92) 70 (55–82) evaluación de reactividad cruzada se observó un porcentaje de positividad en el grupo con
DAT 92 (78–97) 89 (75–96) 82,5 (68–91) enfermedad de Chagas, pero debido a su gran versatilidad, ya se han propuesto estrategias
prueba rápida rK39 89 (75–96) 92 (78–97) 77 (62–87)
mediante citometría de flujo que pueden minimizar los resultados falsos positivos o no concluyentes.
ELISA 76 (58–88) 71 (53–82) 55 (40–69)
( Teixeira-Carvalho et al., 2015 ). Considerando otras pruebas serológicas basadas en formas
ESTOY GORDO 63,5 (50–75) 62 (49–74) 54 (42–66)
cultivadas de promastigote para el diagnóstico de LV, la IFAT es la más utilizada en América del Sur,
Precisión% (95% CI)
siendo una de las pruebas disponibles en los servicios de salud pública en Brasil ( Machado de Assis
Citometría de flujo 92 (84–96) 90 (82–94) 85 (78–91)
DAT 96 (90–99) 96 (91–98) 94 (88–97)
et al., 2016 ; Sakkas et al., 2016 ). Los estudios muestran un IFAT moderado

prueba rápida rK39 95 (88–98) 97 (92–99) 91 (85–95)

ELISA 79 (69–86) 81 (73–87) 75 (66–82)
ESTOY GORDO 77 (67–85) 81 (73–87) 76 (67–83)

un CI = intervalo de confianza.
segundo PPV = Valor predictivo positivo.
C VPN = Valor predictivo negativo.

Tabla 3
Comparación entre la citometría de flujo y las pruebas serológicas utilizadas para el diagnóstico de LV para todas las poblaciones analizadas.

Grupo Pruebas de diagnóstico

DAT prueba rápida rK39 ELISA ESTOY GORDO

% De acuerdo (95% CI un ) DG1 88 (79–93) 87 (78–92) 82 (73–89) 69 (58–78)

DG2 91 (83,5–95) 89 (81–93) 85 (77–90) 76 (67,5–83)
DG3 89 (82–93) 86 (79–91) 81 (73–87) 74 (65–81)
Índice Kappa (IC del 95%) DG1 0,7 (0,5-1,0) 0,7 (0,5-1,0) 0,6 (0,4-0,8) 0,4 (0,2-0,6)
DG2 0,8 (0,6-1,0) 0,7 (0,5-0,9) 0,6 (0,4-0,8) 0,5 (0,3-0,7)
DG3 0,7 (0,6-0,9) 0,7 (0,5-0,9) 0,6 (0,4-0,7) 0,5 (0,3-0,6)

un CI = intervalo confidencial.

23
ED Silva y col.
rendimiento con 88-92% de sensibilidad y 83-88% de especificidad ( Pedras et al., 2008 ; Machado de
Assis et al., 2016 ), pero nuestro estudio mostró una sensibilidad aún menor, a pesar de una mayor
especificidad. En cuanto al diagnóstico parasitológico, el IFAT requiere una infraestructura compleja y
técnicos capacitados, lo que limita el acceso y retrasa el diagnóstico y tratamiento ( Machado de Assis
et al., 2012 ). DAT es una de las pruebas más sencillas y económicas jamás desarrolladas para el
diagnóstico de LV. Un metaanálisis, que evaluó el desempeño de DAT en pacientes con LV, presentó
estimaciones de sensibilidad y especificidad del 94,8% ( Romero y Boelaert, 2010 ), corroborando con
el alto desempeño observado en nuestro estudio. A pesar de sus altos niveles de sensibilidad y
especificidad, el DAT está asociado con problemas en el control de calidad del antígeno,
refrigeración y falta de estandarización de la lectura de la prueba ( Srivastava et al., 2011 ;
Sundar y Rai, 2002 ). Por lo tanto, en el presente estudio, se utilizó un kit DAT comercial para
minimizar este problema y, de hecho, mostró un rendimiento eficiente. Sin embargo, la posibilidad de
cuantificación a partir de PPFP mediante citometría de flujo minimiza limitaciones como la
subjetividad de las lecturas, que se observa en pruebas de aglutinación como DAT. En cuanto al
ensayo ELISA, tiene el rendimiento más bajo entre las diferentes pruebas evaluadas aquí.
Una alternativa al lisado crudo en las pruebas serológicas es el uso de antígenos
recombinantes, como el rK39 utilizado para la prueba rápida, que se utiliza en varios países y la
prueba rápida rK28, que se desarrolló como un antígeno novedoso para el diagnóstico de LV en
Oriente. África ( Pattabhi et al., 2010 ;
Pedral-Sampaio et al., 2016 ). Machado de Assis y col. (2016) mostró que la prueba rK39 presentó la
mejor sensibilidad y costo-beneficio en el diagnóstico de LV. Sin embargo, en algunos países
endémicos como Sudán, la sensibilidad de esta prueba es insatisfactoria, lo que puede estar
relacionado con cantidades bajas de anticuerpos producidos por individuos o con el formato de
prueba por debajo del ideal ( Abass y col., 2013 ). La citometría de flujo, posiblemente asociada al uso
de antígenos recombinantes, puede surgir entonces como una alternativa importante para el
diagnóstico específico de LV.
A pesar de su mayor sensibilidad, los costos asociados al citómetro de flujo siguen siendo una
limitación, ya que requiere un aparato de laboratorio de tamaño mediano, además del mantenimiento
y capacitación del personal ( Shapiro, 2003 ). Sin embargo, eso se minimiza debido a la seguridad de
una mayor sensibilidad. La presencia de detectores fotomultiplicadores proporciona soporte técnico
para el análisis cuantitativo de anticuerpos y proporciona el manejo de ensayos con diluciones de
suero tan altas, en comparación con los que se prueban habitualmente con metodologías estándar ( Vitelli-
Avelar et al., 2007 ). Además, la citometría de flujo ya se ha utilizado en laboratorios clínicos de
países en desarrollo para diagnosticar el VIH / SIDA, el cáncer y la anemia ( Mandy y col., 2002 ; Pati
y Jain, 2013 ; Denes et al., 2015 ; Pang et al., 2018 ). Por tanto, su uso para el diagnóstico serológico
de LV es técnicamente posible y puede ampliarse con la posibilidad de utilizar placas de
microtitulación, que permiten el diagnóstico de varios pacientes simultáneamente ( Rocha et al., 2006 ).
El desempeño observado por la citometría de flujo en el presente estudio refuerza fuertemente esta
posibilidad, además de abrir nuevas vías de investigación con esta técnica como la comprensión de
la respuesta humoral en pacientes con VL y VL-VIH / SIDA. Todavía existe la posibilidad de mejorar
la técnica aún más con, por ejemplo, el uso de antígenos recombinantes asociados con perlas.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por una beca brasileña del MCTI / CNPq / MS-SCTIE - DECIT N °
40/2012 - Investigación en Enfermedades Desatendidas, y por becas de la agencia brasileña
CAPES. Queremos agradecer a Camila Queiroz del Instituto Aggeu Magalhães - FIOCRUZ / PE por
la L. infantum tensión y Walter Lins Barbosa Junior por revisar este manuscrito.
24
Journal of Immunological Methods 469 (2019) 18-25
Conflicto de intereses
Los autores no reportan conflicto de intereses.
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