5980 1397es PDF

Fundamentos de la
espectroscopía
UV-visible moderna
Conceptos básicos
Tony Owen
 Copyright Agilent Technologies 2000
Todos los derechos reservados. Esta prohibida la
reproducción, adaptación o traducción, sin el
permiso previo y por escrito, excepto aquello
permitido por la ley de Derechos de Autor.
Impreso en Alemania 06/00
Número de publicación 5980-1397ES
Prólogo
Prólogo En 1988 publicamos un libro titulado “The Diode-Array

Advantage in UV/Visible Spectroscopy”. En ese momento,
aunque los detectores de diodos estaban en el mercado
desde 1979, sus características y sus ventajas comparados
con los espectrómetros convencionales de barrido, no eran
demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar
aquella situación. El libro fue bien recibido y se
distribuyeron varios miles de copias.
Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos
que este es un momento adecuado para otra publicación.
Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluación
de datos; las Buenas Prácticas de Laboratorio tienen ahora
gran importancia; y la nueva generación de espectrofotó-
metros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento.
Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los
aspectos de importancia de la espectroscopía UV-visible,
para la obtención de resultados. El control por microproce-
sador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea
menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes
de instrumentos, nos gustaría creer que los equipos son
ahora más fáciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el
conocimiento de los fundamentos de la espectroscopía
UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los
peligros del tratamiento y la química de muestras, sigue
siendo esencial para obtener buenos resultados.
Además, quisieramos demostrar que la idea de “una medida
a una sola longitud de onda” es insuficiente para obtener
resultados óptimos. Múltiples medidas a múltiples longitu-
des de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan
lugar a la mejor exactitud y precisión de resultados y
proporciona la información necesaria para detectar errores.
Me gustaría aprovechar esta oportunidad para agradecer a
mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para
nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre
espectroscopía UV-visible, durante años.
iii
iv
Contenidos
capítulo 1 Principios y aplicaciones de
espectroscopía UV-visible
Principios básicos................................................................................................ 2
El espectro electromagnético.................................................................... 2
Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3
Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3
Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6
Derivadas de espectros .............................................................................. 6
Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8
Aplicaciones ........................................................................................ 9
Señal/ruido .......................................................................................... 9
Consideraciones instrumentales .................................................... 10
Análisis cualitativo ............................................................................................ 10
Identificación:
espectros y estructura .............................................................................. 10
Confirmación de la identidad .................................................................. 11
Color ........................................................................................................... 13
Otra información cualitativa.................................................................... 14
Temperatura de fusión de las proteínas y los ácidos nucléicos . 14
Actividad enzimática ........................................................................ 15
Consideraciones instrumentales ............................................................. 16
Análisis cuantitativo.......................................................................................... 16
Ley de Beer ................................................................................................ 16
Requisitos de la muestra.................................................................. 20
Análisis multicomponente ....................................................................... 21
Principio de aditividad ..................................................................... 21
Método de ecuaciones simultáneas simples ................................. 21
Método de mínimos cuadrados....................................................... 24
Otros métodos................................................................................... 26
Requisitos de la muestra.................................................................. 27
Requisitos instrumentales........................................................................ 27
Cuantificación indirecta ................................................................................... 28
Derivatización química............................................................................. 28
Valoraciones espectrofotométricas ........................................................ 28
Ensayos cinéticos enzimáticos................................................................ 28
capítulo 2 Instrumentación
Diseño instrumental .......................................................................................... 32
Componentes............................................................................................. 32
Fuentes .............................................................................................. 33
v
Contenidos
Dispositivos de dispersión .............................................................. 34

Detectores ......................................................................................... 35
Optica ................................................................................................. 38
El espectrofotómetro convencional ....................................................... 38
El espectrofotómetro de diodos.............................................................. 39
Configuración ............................................................................................ 41
Diseño de haz simple ....................................................................... 41
Diseño de doble haz ......................................................................... 42
Diseño con división de haz.............................................................. 44
Diseño de doble
longitud de onda ............................................................................... 45
Medida de un espectro ............................................................................. 45
Parámetros instrumentales clave .................................................................... 46
Resolución espectral ............................................................................... 46
Exactitud y precisión de longitud de onda ............................................ 50
Exactitud y precisión fotométrica .......................................................... 51
Luz dispersa....................................................................................... 51
Ruido .................................................................................................. 52
Rango dinámico lineal .............................................................................. 53
Deriva ......................................................................................................... 55
capítulo 3 Tratamiento y medida de muestra

Muestras líquidas ............................................................................................... 58
Cubetas....................................................................................................... 58
Material .............................................................................................. 58
Tipos de cubeta................................................................................. 59
Fuentes de error ............................................................................... 60
Cuidado de las cubetas .................................................................... 61
Elección de disolvente ............................................................................. 61
Efecto del disolvente, concentración, pH y temperatura .................... 62
Muestras sólidas ................................................................................................ 64
Sin referencia............................................................................................. 64
Indice de refracción.................................................................................. 65
Geometría de la muestra .......................................................................... 65
Absorbancia débil.............................................................................................. 66
Cambiar la anchura
de rendija.................................................................................................... 66
Promedio de tiempo ................................................................................. 67
Promedio de longitud de onda ................................................................ 67
Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68
Interferencia....................................................................................................... 69
Tipos de interferencia............................................................................... 69
Otros compuestos absorbentes ...................................................... 70
Dispersión.......................................................................................... 70
Técnicas de corrección ............................................................................ 71
vi
Contenidos
Isoabsorbancia.................................................................................. 72
Análisis multicomponente............................................................... 72
Modelar el fondo............................................................................... 73
Referencia interna ............................................................................ 74
Corrección de tres puntos ............................................................... 74
Espectroscopía derivada ................................................................. 75
Problemas fotoquímicos ................................................................................... 79
Fluorescencia ............................................................................................ 79
Descomposición de la muestra........................................................................ 80
capítulo 4 Desarrollo y validación del método

Desarrollo del método ...................................................................................... 82
Linealidad................................................................................................... 83
Exactitud.................................................................................................... 87
Precisión..................................................................................................... 88
Sensibilidad................................................................................................ 89
Rango.......................................................................................................... 91
Selectividad................................................................................................ 91
Robustez..................................................................................................... 93
Requisitos instrumentales........................................................................ 94
Validación del método....................................................................................... 94
capítulo 5 Operación de rutina

Verificación del rendimiento del instrumento ............................................... 96
Parámetros de test .................................................................................... 96
Exactitud y precisión de longitud de onda.................................... 97
Exactitud y precisión fotométrica.................................................. 98
Luz dispersa....................................................................................... 98
Resolución......................................................................................... 99
Ruido .................................................................................................. 99
LLanura de la línea de base ........................................................... 100
Estabilidad....................................................................................... 100
Linealidad ........................................................................................ 100
Patrones ................................................................................................... 101
Patrones de emisión ....................................................................... 101
Patrones sólidos de absorción...................................................... 101
Patrones líquidos de absorción..................................................... 102
Requisitos de las normas........................................................................ 104
GLP/GMP ......................................................................................... 104
Farmacopea europea ..................................................................... 104
Farmacopea de
Estados Unidos ............................................................................... 106
Métodos americanos de test estándar ......................................... 107
vii
Contenidos
Recomendaciones ................................................................................... 109

Autotest del instrumento ................................................................................ 114
Idoneidad del sistema ..................................................................................... 115
Operación apropiada....................................................................................... 115
Almacén electrónico............................................................................... 116
Procedimientos estándar de operación................................................ 116
Datos colaterales ............................................................................................. 116
Longitudes de onda de confirmación ................................................... 117
Espectros completos .............................................................................. 117
Estadísticas .............................................................................................. 119
apéndice A Exactitud y precisión

Definición de los términos ............................................................................. 122
apéndice B Características de los

espectrofotómetros de diodos
Ventajas de la espectroscopía de diodos ...................................................... 124
Rápida adquisición espectral................................................................. 124
Medida multilongitud de onda simultánea........................................... 125
Reselección de longitud
de onda ..................................................................................................... 126
Sensibilidad.............................................................................................. 127
Estadísticas de las medidas ................................................................... 127
Robustez y
fiabilidad................................................................................................... 127
Area abierta de muestra ......................................................................... 128
Desventajas de la espectroscopía de diodos................................................ 128
Resolución ............................................................................................... 128
Luz dispersa ............................................................................................. 129
Descomposición de
la muestra................................................................................................. 129
Complejidad............................................................................................. 130
Errores en la medida de muestras fluorescentes................................ 130
apéndice C Referencias
indice
viii
capítulo 1
capítulo 1 Principios y
aplicaciones de
espectroscopía
UV-visible
1
Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible
Este capítulo presenta la teoría básica y los principios
de la espectroscopía UV-visible, proporcionando una
valiosa visión de los usos y limitaciones de esta
técnica para el análisis químico. También se revisan,
brevemente, las aplicaciones principales de la
espectroscopía UV-visible.
Principios básicos
El espectro La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende sólo una

electromagnético pequeña parte del espectro electromagnético, que incluye
otras formas de radiación como radio, infrarrojo (IR),
cósmica y rayos X (Figura 1).
Frecuencia [Hz]
Ultravioleta Visible Infrarrojo

Rayos cósmicos
Rayos gamma
Microondas
Ultravioleta
Televisión
Infrarrojo
Rayos X
visible
Rádar
Radio
NMR
Longitud de onda [m]

Figura 1
El espectro electromagnético
2
La energía asociada con la radiación electromagnética se

define por la siguiente ecuación:
E = hν
donde E es la energía (en julios), h es la constante de

Planck (6.62 × 10-34 Js) y ν es la frecuencia (en segundos).
Longitud de onda y La radiación electromagnética puede considerarse una

frecuencia combinación de campos eléctricos y magnéticos alternos
que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como
la radiación actúa como una onda, puede clasificarse según
la longitud de ésta o la frecuencia, relacionadas por:
ν = c⁄λ
donde ν es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de

la luz (3 × 108 ms-1) y λ es la longitud de onda (en metros).
En espectroscopía UV-visible, la longitud de onda
normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m).
De las ecuaciones anteriores se deduce que radiación con
longitud de onda más corta tiene mayor energía. En espec-
troscopía UV-visible, la luz UV de longitud de onda más
pequeña tiene la energía más alta. En algunos casos, esta
energía es suficiente para causar reacciones fotoquímicas
no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el compo-
nente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).
Origen de los espectros Cuando la radiación interacciona con la materia, pueden

UV-visible ocurrir varios procesos como reflexión, dispersión,
absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorción y
reemisión) y una reacción fotoquímica (absorbancia y
rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros
UV-visible, sólo es deseable que ocurra absorbancia.
Como la luz es una forma de energía, la absorción de la luz
por la materia causa que aumente el contenido de energía
de las moléculas (o átomos). La energía potencial total de
3
una molécula, generalmente se representa como la suma de

sus energías electrónica, vibracional y rotacional:
E total = E electronica + E vibracional + E rotacional
La cantidad de energía que una molécula posee en cada

forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados
discretos. La diferencias de energía entre los diferentes
estados siguen el orden:
E electronica > E vibracional > E rotacional
En algunas moléculas y átomos, los fotones de luz UV y

visible tienen suficiente energía para causar transiciones
entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz
absorbida es aquella que tiene la energía requerida para
mover un electrón desde un nivel de energía inferior a uno
superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones
electrónicas en el formaldehído y las longitudes de onda de
la luz que las causan.
transición
transición
Figura 2
Transiciones electrónicas en el formaldehído
4
Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia

muy estrechas, a longitudes de onda características de la
diferencia entre los niveles de energía de las especies
absorbentes. Esto es cierto para los átomos, como se
muestra en la Figura 3.
Figura 3
Transiciones electrónicas y espectros de los átomos
Sin embargo en las moléculas, los niveles de energía

vibracional y rotacional están superpuestos sobre los
niveles de energía electrónica. Como pueden ocurrir
muchas transiciones con diferentes energías, las bandas se
ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor
en las disoluciones, debido a las interacciones
disolvente-soluto.
5
niveles de energía electrónica

niveles de energía vibracional
niveles de energía rotacional
transición electrónica
Figura 4
Transiciones electrónicas y espectros UV-visible en moléculas
Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la

absorbancia cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación
incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz
absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La
transmitancia normalmente se da en términos de una
fracción de 1 o como porcentaje, y se define como se indica
a continuación:
T = I ⁄ I o o % T = ( I ⁄ I o ) × 100
La absorbancia se define:
A = – log T
Para la mayoría de las aplicaciones se utilizan valores de
absorbancia, ya que la relación entre ésta y tanto la
concentración como el paso óptico es, normalmente, lineal.
Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

función de longitud de onda (λ), las derivadas son:
6
Orden cero: A = f(λ )
dA
Primer orden: ------- = f ′( λ )
dλ
2
A-
d--------
Segundo orden:
2
= f ″( λ )
dλ
La Figura 5 de la página siguiente muestra los efectos de la
derivación en una banda gaussiana simple. Las derivadas de
los espectros son siempre más complejos que el espectro de
orden cero.
La primera derivada es la velocidad de cambio de la
absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina
en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que
la λmax de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una
banda positiva y una negativa con un máximo y un mínimo a
las mismas longitudes de onda que las de los puntos de
inflexión de la banda de absorbancia. Este función bipolar
es característica de todas las derivadas de orden impar.
La característica más significativa de la derivada de
segundo orden es una banda negativa con un mínimo a la
misma longitud de onda que la del máximo de la banda de
orden cero. Esta derivada también muestra dos bandas
satélite positivas, a cada lado de la banda principal. La
cuarta derivada muestra una banda positiva con un máximo
a la misma longitud de onda que el máximo de la banda de
orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda
negativa o positiva, con mínimos o máximos a la misma
longitud de onda que la λmax de la banda de absorbancia.
7
Absorbancia Absorbancia
1ª derivada 2ª derivada
3ª derivada 4ª derivada
Figura 5
Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia
Obtener las derivadas de los Pueden utilizarse métodos ópticos, electrónicos y

espectros matemáticos, para generar las derivadas de los espectros.
Aunque las técnicas ópticas y electrónicas fueron la base de
la primitiva espectroscopía UV-visible, han sido muy
superadas por los métodos matemáticos.
Para calcular la derivada a una longitud de onda
determinada (λ), se selecciona una ventana de ± n puntos y
se ajusta un polinomio por el método de mínimos
l
Aλ = a 0 + a 1 λ + … + a l λ
8
cuadrados. Los coeficientes a0 … al a cada longitud de onda

son los valores derivados, donde a1 es la primera derivada,
a2 es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un
método muy eficaz para realizar los cálculos, que son la
base del algoritmo de derivación en la mayoría de los
instrumentos comerciales. Este método también suaviza los
datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el número
de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio
no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por
mínimos cuadrados da lugar a una aproximación suavizada
a los puntos originales de los datos.
Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de
primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil
más complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no
aumenta la información intrínseca contenida. De hecho,
disminuye debido a la pérdida de datos, como los factores
de desplazamiento (offset) constantes.
Aplicaciones Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para

resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas
solapadas para el análisis cualitativo (vea “Confirmación de
la identidad” en la página 11) y, más importante, reducir los
efectos de interferencias debidas a dispersión, matriz u
otros compuestos absorbentes para el análisis cuantitativo
(vea “Espectroscopía derivada” en la página 75).
Señal/ruido Un efecto no deseado de la derivación es la disminución de

la relación S/N en las derivadas de orden superior. Esta
disminución se debe a la discriminación (“Espectroscopía
derivada” en la página 75) y al hecho de que el ruido
siempre muestra las señales más agudas del espectro. Por
tanto, si los datos espectrales utilizados en el cálculo de
derivadas tienen intervalos de 2 nm, el ruido tiene una
anchura de banda de 2 nm. Si la banda del analito tiene una
anchura de 20 nm, la S/N de la primera derivada será 10
veces peor que en el espectro de orden cero. Puede
utilizarse la técnica polinómica de suavizado de
Savitzky-Golay para mitigar la disminución de S/N, pero
9
debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de

suavizado distorsiona el espectro derivado.
Consideraciones Para que la resolución de las derivadas aumente, es nece-

instrumentales sario un incremento de la reproducibilidad de longitud de
onda del espectrofotómetro. Pequeños errores de λ pueden
resultar en errores de señal mucho mayores en el modo
derivada que en el modo de absorbancia.
El efecto negativo de la derivación sobre S/N también
demanda un aumento de las características de bajo ruido
del espectrofotómetro. Si éste puede barrer y promediar
múltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la
derivación.
Análisis cualitativo
Identificación: Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas

espectros y estructura bandas anchas. Comparada con técnicas como infrarrojo,
que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopía
UV-visible proporciona información cualitativa limitada. La
mayor parte de la absorción de los compuestos orgánicos
resulta de la presencia de enlaces π (es decir, insaturados).
Un cromóforo es un grupo molecular que, normalmente,
contiene un enlace π. Cuando se inserta en un hidrocarburo
saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia
UV-visible), se forma un compuesto con una absorción
entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromóforos y
las longitudes de onda de sus máximos de absorbancia.
Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia
Cromóforo Fórmula Ejemplo λmax (nm)
Carbonilo (cetona) RR’C=O Acetona 271
Carbonilo (aldehído) RHC=O Acetaldehído 293
10
Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia
Carboxilo RCOOH Acido acético 204
Amida RCONH2 Acetamida 208
Etileno RCH=CHR Etileno 193
Acetileno RC=CR Acetileno 173
Nitrilo RC=N Acetonitrilo < 160
Nitro RNO2 Nitrometano 271
La presencia de una banda de absorbancia a una

determinada longitud de onda es una buena indicación de la
presencia de un cromóforo. Sin embargo, la posición del
máximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno
molecular del cromóforo y del disolvente en el que pueda
disolverse la muestra. Otros parámetros, como pH y
temperatura, también pueden causar cambios tanto en la
intensidad como en la longitud de onda de los máximos de
absorbancia.
Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces,
aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las
bandas de absorción. Para algunos sistemas moleculares,
como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relación
entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada
sistemáticamente.
Los iones de los metales de trasición también tienen niveles
de energía electrónica que causan absorción de 400–700 nm
en la región visible.
Confirmación de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una

identidad identificación absoluta, se usan frecuentemente para
confirmar la identidad de una sustancia mediante la
comparación del espectro medido con uno de referencia.
Cuando los espectros son muy similares, pueden utilizarse
espectros derivados. Como se muestra en la Figura 6, el
11
número de bandas aumenta con el orden de derivada. Este

aumento de complejidad de los espectros derivados puede
ser útil en el análisis cualitativo, para caracterizar materia-
les o para identificación. Por ejemplo, el espectro del
esteroide testosterona muestra una única banda ancha, sin
estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la
segunda derivada muestra seis picos distintos.
El efecto de mejora de resolución puede utilizarse también
en la identificación. La Figura 6 muestra una simulación por
ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura
de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por
30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una
banda con un máximo entre los dos componentes, es decir,
no están resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas
son claramente visibles, con máximos centrados cerca de la
λmax de las bandas de los componentes.
Absorbancia
4ª derivada
Figura 6
Mejora de la resolución
12
Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

color de la materia está relacionado con su absortividad o
reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al
que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.
Figura 7
Transmisión y color
Long. de onda [nm] Color absorbido Color complementario

rojo verde azulado
naranja azul verdoso
amarillo-verde púrpura
verde rojo-púrpura
verde azulado rojo
azul verdoso naranja
azul amarillo
violeta amarillo-verde
Figura 8
Absorbancia y colores complementarios
13
En la práctica, tanto la generación como la sensación de

color son muy complejas y dependen de muchos factores,
como el espectro del iluminante y, en el caso de sólidos, de
la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas
especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentación para
medida de color. Cuando están equipados con el software
apropiado, la mayoría de los espectrofotómetros pueden
utilizarse para medir el color. Una discusión a fondo sobre
este tema está fuera del objetivo de este libro. Varias
publicaciones2,3 discuten en detalle el color y su medida,
muy correctamente.
Otra información La espectroscopía UV-visible puede utilizarse para determi-

cualitativa nar muchas características físico-químicas de los compues-
tos y, por tanto, puede proporcionar información como la
identidad. A continuación se presentan dos ejemplos.
Temperatura de fusión de las Los espectros de absorbancia de las proteínas resultan

proteínas y los ácidos principalmente de la presencia de los aminoácidos
nucléicos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. Una proteína
a temperatura ambiente tiene una estructura o
conformación terciaria específica que crea un entorno
electrónico determinado para los aminoácidos aromáticos.
Si se calienta la proteína, a una cierta temperatura, se
desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el
entorno electrónico de los aminoácidos aromáticos cambia,
lo que resulta en cambios o variaciones espectrales.
Puede utilizarse análisis multicomponente (vea “Análisis
multicomponente” en la página 21) para determinar la
cantidad de cada aminoácido aromático que está presente
en una proteína intacta.4
El ácido desoxirribonucléico (DNA) en su estado nativo,

consta de dos cadenas de moléculas de desoxirribosa
enlazadas helicoidalmente. Las cadenas están unidas por
enlaces de hidrógeno entre las bases purina y pirimidina (la
adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina
(G-C)). Estas bases son las principales responsables de la
14
absorbancia UV del DNA, con un máximo a 260 nm. Como

en un sistema multicomponente, la absorción observada de
una molécula de DNA debe ser igual a la suma de las
absorbancias individuales:
A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina
Sin embargo, la absorbancia observada es siempre

significativamente menor que la esperada debido a que el
enlace de hidrógeno entre las bases cambia su entorno
electrónico. Cuando se calienta una molécula, el enlace de
hidrógeno se rompe, la doble hélice se desenrosca y la
absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la
esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de
desnaturalización también se conoce como fusión. En un
experimento de fusión de DNA, se aumenta paso a paso la
temperatura de una disolución de DNA y se mide la
absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representándose
como una curva de fusión.
El punto medio del rango de temperatura sobre el que
ocurre la fusión, es el valor Tm. El Tm de una muestra
particular de DNA depende principalmente del porcentaje
de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales
contiene tres enlaces de hidrógeno (en contraste, cada
pareja A-T contiene dos enlaces de hidrógeno). Cuanto
mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor
es el Tm observado.
Actividad enzimática La actividad de una enzima es una medida de su eficacia

como catalizador. La concentración de enzima en una
preparación impura puede expresarse en términos de
unidades por mililitro y la actividad específica de la
preparación, puede expresarse en unidades por miligramo
de proteína. Al purificarse la enzima, la actividad específica
aumenta hasta un límite (el de la enzima pura).
Como la velocidad de reacción varía con factores tales
como concentración del sustrato, pH, fuerza iónica y
15
temperatura, las condiciones bajo las que se determina la

actividad deben estar definidas con precisión. Estas
condiciones son, normalmente, las óptimas de ensayo a una
temperatura fija (25, 30 o 37 °C), con todos los sustratos
presentes en condiciones de saturación. Para determinar la
actividad, se prepara un sistema con concentraciones
conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se añade
un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad
de reacción. Las medidas de actividad se realizan
principalmente en el campo de la investigación donde se
aislan y purifican enzimas, así como para la fabricación de
kits de ensayos enzimáticos, en los que la actividad de la
enzima debe ser igual en todos los lotes.
Consideraciones La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud

instrumentales fotométrica absoluta son muy importantes para el análisis
cualitativo, particularmente para la identificación y
confirmación de compuestos desconocidos. A menudo, se
comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos
a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden
haber sido medidos a una resolución instrumental definida.
Análisis
cuantitativo
Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y sólo 50 salen
por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos
50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idéntica, sólo
saldrán 25, etc. La Figura 9 muestra la representación de la
transmitancia frente a la concentración.
16
Transmisión
Paso óptico
Figura 9
Transmitancia y concentración: la ley de Bouguer-Lambert
Generalmente se piensa que Lambert (1760) formuló la

primera ecuación matemática sobre este efecto, aunque
ahora parece que se le adelantó Bouguer en 1729. La
expresión matemática es:
– kb
T = I ⁄ Io = e
donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad

transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es
una constante y b es el paso óptico (normalmente en
centímetros).
La ley de Beer es idéntica a la ley de Bouguer, excepto
porque está expresada en términos de la concentración. La
cantidad de luz absorbida es proporcional al número de
moléculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10
muestra una representación de la transmitancia frente al
paso óptico.
17
Transmisión
Paso óptico
Figura 10
Transmitancia y paso óptico: ley de Beer
Combinando las dos leyes se obtiene la ley

Beer-Bouguer-Lambert:
– kbc
T = I ⁄ Io = e
donde c es la concentración de las especies absorbentes

(normalmente expresada en gramos por litro o miligramos
por litro). Esta ecuación puede transformarse en una
expresión lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se
expresa en la forma decádica:
A = – log T = – log ( I ⁄ I o ) = log ( I o ⁄ I ) = εbc
donde ε es la absorción molar o coeficiente de extinción.

Esta expresión se conoce como ley de Beer. La Figura 11
muestra una representación de la absorbancia frente a la
concentración.
18
Absorbancia [UA]
Concentración
Figura 11
La ley de Beer–Bouguer-Lambert
El coeficiente de extinción (ε) es característico de una

sustancia en condiciones definidas de longitud de onda,
disolvente y temperatura. En la práctica, el coeficiente de
extinción medido también depende de las características
del instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no
se utilizan valores predeterminados del coeficiente de
extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se
construye una curva de calibración o curva de trabajo para
la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones
patrón con concentraciones conocidas del analito.
Para transiciones electrónicas, la diferencia de energía
entre los estados fundamental y excitados, es relativamente
grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable
que todas las moléculas estén en estado electrónico
fundamental. La absorción y vuelta al estado fundamental,
son procesos rápidos y el equilibrio se alcanza muy
rápidamente. Por consiguiente, la absorción de luz
UV-visible es cuantitativamente muy exacta. La simple
relación lineal entre la absorbancia y la concentración y la
relativa facilidad de medida de la luz UV-visible, ha hecho
19
de la espectroscopía UV-visible la base de miles de métodos

analíticos cuantitativos.
Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de
Beer, existe una relación lineal similar entre la
concentración y la amplitud, para todos los órdenes de
espectros derivados:
Orden cero: A = εbc
dA dε
Primera derivada: ------- = ------ bc
dλ dλ
n n
A-
d-------- d ε
n derivada: = -------- bc
dλ′ dλ′
a λ, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de

extinción, b es el paso óptico y c la concentración.
Para cuantificar un solo componente, la selección de
longitudes de onda es más difícil con espectros derivados
que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes
picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par
tienen un máximo o un mínimo a la misma λmax que el
espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden
impar esta longitud de onda es un punto de corte con el
cero. Tomando la diferencia entre el máximo más alto y el
mínimo más bajo se obtiene la mejor S/N pero puede
resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias
de otros componentes.
Requisitos de la muestra Para resultados exactos, la muestra a analizar debe

contener sólo el componente absorbente para el que se ha
realizado la calibración. Si la muestra es una disolución,
debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que
sea posible corregir una interferencia con una segunda
longitud de onda.
20
Análisis Se han realizado casi tantos análisis multicomponente con

multicomponente espectros UV-visible como de un solo componente, pero
debido a que las técnicas usadas en análisis multicompo-
nente a menudo producían resultados incorrectos (como se
detalla a continuación), no eran muy aplicados. Sin
embargo, los instrumentos modernos producen datos más
precisos y las modernas técnicas de ajuste de curvas dan
lugar a resultados más exactos y, quizás más importante,
indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas
razones, los análisis multicomponente UV-visible se han
hecho más populares.
Principio de aditividad Según la ley de Beer (“Ley de Beer” en la página 16), la

absorbancia es proporcional al número de moléculas que
absorben radiación a la λ especificada. Este principio es
cierto si hay presente más de una especie absorbente.
Todos los métodos cuantitativos multicomponente están
basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla
a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la
absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa λ.
Método de ecuaciones El método simple de análisis multicomponente se basa en

simultáneas simples medidas a un número de longitudes de onda igual al número
de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda
elegidas normalmente son aquellas del máximo de
absorbancia de cada componente. Para la calibración, se
mide la absorbancia de patrones puros de concentración
conocida, para determinar el coeficiente de extinción de
cada componente a cada longitud de onda seleccionada.
La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la
suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud
de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de
extinción y de la concentración de cada componente. Así,
para dos componentes x e y, las ecuaciones son:
A′ ( x + y ) = A′ x + A′ y = e′ x bc x + e′ y bc y
21
A″ ( x + y ) = A″ x + A″ y = e″ x bc x + e″ y bc y
donde A′ es la absorbancia a longitud de onda ′, A′′ es la

absorbancia a longitud de onda ′′, e′ es la absortividad
molar a longitud de onda ′, e′′ es la absortividad molar a
longitud de onda ′′, c es concentración y b es el paso óptico.
Estas ecuaciones se resuelven fácilmente para determinar
la concentración de cada componente. Si las medidas
siempre fueran perfectas, podrían obtenerse resultados
exactos incluso para mezclas de componentes con espec-
tros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las
medidas que pueden afectar significativamente a la exacti-
tud de los resultados si los espectros están muy solapados.
La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos compo-
nentes sin solapamiento de los espectros en los máximos.
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm]

Figura 12
Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral
En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de

dos componentes con un solapamiento significativo de los
espectros, en los máximos de absorbancia.
22
Absorbancia [UA]

Figura 13
Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral
significativo
Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las

absorbancias medidas deberían ser:
Con poco solapamiento espectral Con solapamiento espectral
A’(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A’(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1
A’’(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 A’’(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9
Si ocurre un error del 10 % en la medida de A′(x + y) y

A′′(x + y), es decir, A′(x + y) = 0.99 (- 10 %) y A′′(x + y) = 0.99
23
(+ 10 %), el cálculo cuantitativo da lugar a los resultados

mostrados en la Tabla 2:
Tabla 2 Comparación de los resultados de análisis multicomponente para ejemplos con

poco y sustancial solapamiento espectral
Poco solapamiento Mucho solapamiento
Concentración Concentración Concentración

Componente nominal calculada % error calculada % error
x 1 0.9 - 10 % 0 - 100 %
y 1 1.1 + 10 % 1.98 + 98 %
Método de mínimos Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el

cuadrados uso de información espectral adicional, es decir puede
utilizarse una serie de datos para cuantificación, en lugar de
sólo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un
ajuste por mínimos cuadrados de los espectros patrón al
espectro de la muestra medida, da lugar a resultados
cuantitativos.5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la
mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con
un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.
24
Real Medido
Absorbancia [UA]

Figura 14
Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada
longitud de onda
Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200–240 nm), los

resultados cuantitativos del método de mínimos cuadrados
tienen un error < 1 % comparados con un error de
aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos
longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3 Comparación de los resultados de análisis multicomponente de los métodos de

ecuaciones simultáneas simples y mínimos cuadrados
Usando sólo 210 y

230 nm Usando 200–240 nm
Concentración Concentración Concentración

Componente nominal calculada % error calculada % error
x 1 0.0 - 10 % 1.003 + 0.3 %
y 1 1.98 + 10 % 0.995 - 0.5 %
25
Este método permite el análisis de las mezclas más

complejas y de mezclas simples de componentes con
espectros similares.
El residual del cálculo de mínimos cuadrados es un buen
indicador de lo bien que los espectros patrón ajustan en los
espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador
de la probable exactitud de los resultados.
Un ejemplo de análisis multicomponente es la
cuantificación de cinco hemoglobinas en sangre, con
mínima preparación de la muestra.7 La Figura 15 muestra
los espectros de absorción de los derivados de
hemoglobina. Este análisis se realizaba anteriormente
utilizando varias técnicas analíticas, incluyendo
espectroscopía y valoraciones.
Sulfhemoglobina
Oxihemoglobina
Carboxihemoglobina
Absorbancia [UA]
Hemoglobina (pH 7.0–7.4)

Desoxihemoglobina
Figura 15
Espectros de absorción de derivados de hemoglobina
Otros métodos Otros métodos estadísticos de análisis multicomponente

incluyen mínimos cuadrados parcial (PLS), regresión del
componente principal (PCR) y mínimos cuadrados múltiple
(MLS). En teoría, estos métodos ofrecen algunas ventajas
26
sobre los descritos anteriormente, pero en la práctica el

proceso de calibración es mucho más complejo.
Requisitos de la muestra Los métodos de ecuaciones simultáneas simples y mínimos

cuadrados dan lugar a resultados exactos sólo si se realiza
calibración utilizando patrones puros o mezclas de
patrones, para cada componente de la muestra que
contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe
tener ninguna capacidad adicional de absorción.
Requisitos La cuantificación de un componente normalmente se reali-

instrumentales za midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de
patrones y a continuación, el desconocido. Esta calibración
debería eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la
exactitud de longitud de onda y fotométrica absolutas,
fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la
reproducibilidad fotométrica es esencial para resultados
precisos. Si se mide sólo en el máximo de absorbancia, la
reproducibilidad de λ es también de poca importancia
debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con λ
es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del
lateral de la banda, la reproducibilidad será muy
importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es
crítico, ya que la calibración supone una relación lineal.
Un análisis multicomponente exacto requiere una S/N
excelente, especialmente si se utiliza el método de ecua-
ciones simultáneas simples. En mínimos cuadrados, los
datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incor-
poran al cálculo, haciendo que la reproducibilidad de λ sea
también esencial. Además, como se necesitan más datos, es
necesario un barrido rápido para buena productividad.
27
Cuantificación
indirecta
Derivatización química Debido a que muchos compuestos exhiben débil o ninguna

absorbancia en las regiones UV o visible, se han
desarrollado varios métodos con derivatización química.
Tales métodos, normalmente implican el añadir un reactivo
orgánico, que forma un complejo con fuerte absortividad.
La etapa final de medida es prácticamente igual que la de
los métodos directos. Con esta técnica, la elección
apropiada del reactivo puede mejorar significativamente
tanto la sensibilidad como la selectividad.
Valoraciones En análisis volumétricos, el cambio de color que señala el

espectrofotométricas final de una valoración normalmente se detecta
visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y
puede ser una fuente de error. El uso de un
espectrofotómetro para detectar el final, introduce la
objetividad y la automatización en el análisis.
Ensayos cinéticos El análisis UV-visible directo de un componente en matrices

enzimáticos biológicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difícil. Las
interferencias de otros componentes a menudo
imposibilitan la medida directa de una propiedad
específica, como la absorbancia. La separación del
compuesto de interés puede ser costosa y pesada y por
tanto, impracticable en el análisis de rutina.
Pueden utilizarse ensayos enzimáticos en el análisis
indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en
una matriz compleja. Si se selecciona la enzima
cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior
a la adición de la enzima, será el resultado sólo de la
reacción del compuesto o compuestos específicos. Esta
selectividad es la base de los ensayos enzimáticos.
28
Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos tipos:

ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad
de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen
temperatura, pH, actividad enzimática, concentración de la
enzima y concentración del sustrato. Sin embargo, si todos
los parámetros están controlados a un nivel constante, la
velocidad de reacción es directamente proporcional a la
concentración del sustrato. Con los ensayos de punto final,
se seleccionan las condiciones de manera que la conversión
del sustrato a producto se complete dentro de un periodo
razonable de tiempo (5–20 min). La diferencia entre la
absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la
cantidad de sustrato.
29
30
capítulo 2
capítulo 2 Instrumentación
31
Instrumentación
Idealmente, los instrumentos analíticos siempre dan
lugar a medidas correctas de un parámetro químico o
físico-químico, pero en la práctica todos los equipos
están sujetos a error. En este capítulo se revisan los
componentes básicos de un espectrofotómetro y las
distintas configuraciones instrumentales posibles. Se
discuten también los parámetros instrumentales clave
y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.
Diseño instrumental
Componentes Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la

transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de
la longitud de onda de la radiación electromagnética. Los
componentes clave de un espectrofotómetro, son:8
• una fuente que genera una banda ancha de radiación
electromagnética
• un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud
de onda particular (o más correctamente, una banda de
ondas) de la radiación de la fuente
• un área de muestra
• uno o más detectores para medir la intensidad de la
radiación
32
Instrumentación
Otros componentes ópticos, como lentes o espejos,

transmiten la luz a través del instrumento.
Fuentes La fuente ideal de luz sería aquella que generara una

intensidad constante a todas las longitudes de onda, con
bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no
existen. Dos son las fuentes utilizadas, comúnmente, en los
espectrofotómetros UV-visible.
La primera fuente, la lámpara de arco de deuterio, produce

Irradiación espectral
un buen continuo de intensidad en la región UV y ofrece

una intensidad útil en la región visible (Figura 16). Aunque
las modernas lámparas de arco de deuterio tienen bajo
ruido, éste, a menudo, es un factor limitante en el ruido
general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz
de una lámpara de arco de deuterio disminuye de modo
homogéneo. Estas lámparas tienen una vida media (el
tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de
Figura 16a
Espectro intensidad de la lámpara su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.
de arco de deuterio
La segunda fuente, la lámpara halógena de wolframio

(Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro

UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lámpara
tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, típicamente, una
vida útil de 10000 h.
La mayoría de los espectrofotómetros utilizados para medir
el rango UV-visible contienen ambos tipos de lámparas. En
Longitud de onda [nm] estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para
Figura 17 cambiar de lámpara según corresponda, o se mezcla la luz
Espectro intensidad de la lámpara procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola
halógena de wolframio
banda ancha.
33
Instrumentación
Una fuente alternativa de luz es la lámpara de xenon

(Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones
completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido
de las lámparas actuales de xenon es significativamente

peor que el de las lámparas de deuterio o wolframio, las
lámparas de xenon se utilizan sólo para aplicaciones como
medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal
en una intensidad elevada.

Figura 18
Espectro intensidad de la
lámpara de xenon
Dispositivos de dispersión
Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda

(a) Prisma
de luz sean dispersadas con ángulos distintos. Cuando se
combinan con una rendija adecuada de salida, pueden
utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, más
exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una
fuente continua. Comúnmente, se utilizan dos dispositivos
de dispersión, prismas y redes holográficas de difracción,
en los espectrofotómetros UV-visible.
(b) Red de difracción Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un
arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotómetros.
Los prismas son simples y baratos, pero la dispersión
resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Además,
el ángulo de dispersión depende de la temperatura.
Por esto, la mayoría de los espectrofotómetros modernos
contienen redes holográficas en lugar de prismas. Estos
1er orden
2º orden dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras
muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecáni-
Figura 19 camente, pero actualmente se utiliza un proceso óptico
Dispositivos de dispersión holográfico. Las dimensiones de las hendiduras son del
mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va
34
Instrumentación
dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de

aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que
incide sobre la red se refleja con diferentes ángulos,
dependiendo de λ. Las redes holográficas producen una
dispersión angular lineal con la longitud de onda y son
insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de
diferentes órdenes, que se solapan (Figura 19b). Como
resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que sólo la
luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cóncava
dispersa y enfoca la luz, simultáneamente.
Un monocromador consta de una rendija de entrada, un
dispositivo de dispersión y una rendija de salida. Idealmen-
te, lo que sale es luz monocromática. En la práctica, sin
embargo, es una banda, óptimamente, simétrica. La anchura
de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda
instrumental (IBW).
Detectores Un detector convierte una señal de luz en una señal

eléctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en
un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad.
Normalmente, los espectrofotómetros contienen un tubo
fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.
El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conver-

sión de la señal con varias etapas de amplificación, dentro
del cuerpo del tubo. El material del cátodo determina la
sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a
una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo.
Cátodo Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles
Anodo
de luz. Sin embargo, en aplicaciones analíticas espectroscó-
Figura 20 picas, una alta sensibilidad está asociada con bajas
Detector tubo fotomultiplicador concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo
que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para
detectar con exactitud pequeñas diferencias entre las
medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo
ruido a altos niveles de intensidad.
35
Instrumentación
Cada vez más, los fotodiodos se utilizan como detectores en

espectrofotómetros (Figura 21). Tienen un rango dinámico
más ancho y son más robustos que los fotomultiplicadores.
En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material
semiconductor permite que los electrones fluyan a su
través, reduciendo la carga en un condensador conectado a
él. La carga necesaria para recargar el condensador, a
intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la
luz. Los primeros fotodiodos tenían baja sensibilidad en el
rango UV, pero este problema se ha corregido en los
detectores modernos. Los límites de detección son, aproxi-
madamente, 170–1100 nm para detectores de silicio.
Contacto metálico Fotón
capa p Región
intrínseca
capa n
Bloque de oro
Figura 21
El detector de fotodiodos
Algunos espectrofotómetros modernos contienen una

matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodio-
dos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada
diodo tiene un condensador dedicado y está conectado, por
un interruptor, a una línea común de salida. Los interrup-
tores se controlan por un registro de cambio (Figura 22).
Inicialmente, los condensadores están cargados. Cuando
los fotones penetran el silicio, se generan portadores de
36
Instrumentación
carga eléctrica libres que descargan los condensadores.

Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el
periodo de medida para cada ciclo de barrido.
Luz
Fotodiodo
Condensador
Registro
de cambio
Interruptor
transistor
Línea de vídeo
Ciclo de lectura
Figura 22
Diagrama esquemático de una matriz de fotodiodos
La cantidad de carga necesaria para recargar los condensa-

dores es proporcional al número de fotones detectados por
cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de
luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la
variación de intensidad de luz sobre el rango completo de
longitud de onda. La matriz, típicamente, comprende entre
200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la
aplicación. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofo-
tómetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el área
fotosensible mide, aproximadamente 25 × 0.5 mm. El ciclo
de lectura, que corresponde al tiempo de iluminación, es
100 ms.
La tecnología de matriz de fotodiodos es similar a la del
microprocesador. Las matrices son dispositivos complejos
pero, debido a su estado sólido, tienen mayor fiabilidad.
37
Instrumentación
Optica Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se

utilizan lentes o espejos cóncavos. Las lentes son baratas
pero sufren de aberración cromática, es decir, luz de
diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente
el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseño
cuidadoso, la aberración cromática de las lentes
individuales de un sistema óptico, puede utilizarse para
cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema
óptico eficaz con estos componentes simples y baratos.
Las lentes acromáticas combinan múltiples lentes de
diferentes cristales con distintos índices de refracción, en
una lente bastante libre de aberración cromática. Estas
lentes se utilizan en las cámaras. Ofrecen un buen
rendimiento, pero a un coste relativamente alto.
Los espejos cóncavos son menos costosos de fabricar que
las lentes acromáticas, completamente libres de aberración.
Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fácilmente,
resultando en una pérdida de eficacia.
En cada superficie óptica, incluyendo las interfases entre
los componentes de una lente acromática, el 5–10 % de la
luz se pierde por absorbancia o reflexión. Por lo tanto,
idealmente, los espectrofotómetros deberían estar
diseñados con un mínimo número de superficies ópticas.
El espectrofotómetro La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotómetro

convencional convencional de haz simple. La luz policromática de la
fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un
monocromador, que transmite selectivamente una estrecha
banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el área de
muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se
determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el
detector cuando no hay muestra (el blanco) y
comparándola con la intensidad de la luz que alcanza el
detector después de atravesar la muestra. Como se indica
anteriormente, la mayoría de los espectrofotómetros
contienen dos lámparas, de deuterio y de wolframio y
38
Instrumentación
utilizan tubos fotomultiplicadores o, más recientemente,

fotodiodos, como detectores.
Muestra
Monocromador
Detector
Rendija de salida
Dispositivo de
dispersión
Fuente Rendija de
entrada
Figura 23
Esquema de un espectrofotómetro convencional
Este diseño es el adecuado para medir la absorbancia en un

solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo,
para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes
de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar
estas tareas con un espectrofotómetro convencional, deben
rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el
problema de irreproducibilidad mecánica en las medidas.
Además, la adquisición de datos en serie es un proceso
inherentemente lento.
El espectrofotómetro La Figura 24 muestra un diagrama esquemático de un

de diodos espectrofotómetro de diodos. La luz policromática de una
fuente atraviesa el área de muestra y es enfocada en la
rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz
sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una
banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz
detectada por un diodo está relacionada con el tamaño de la
39
Instrumentación
rendija de entrada del policromador y con el tamaño del

diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma función que
la rendija de salida de un monocromador.
Matriz
de diodos
Policromador
Muestra Dispositivo de
dispersión
Fuente Rendija de
entrada
Figura 24
Esquema de un espectrofotómetro de diodos
El policromador (rendija de entrada más dispositivo de

dispersión) y la matriz de diodos están contenidos en una
unidad conocida como espectrógrafo. Como las posiciones
relativas de la muestra y el elemento dispersivo están
invertidas respecto a un instrumento convencional, esta
configuración, a menudo, se denomina óptica inversa.
Para minimizar posibles reacciones fotoquímicas, se utiliza
un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que
pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el
obturador se abre automáticamente y la luz pasa a través de
la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia
entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y
sin muestra, según se describe en “El espectrofotómetro
convencional” en la página 38. Un espectrofotómetro de
diodos es, inherentemente, muy rápido debido a su
capacidad de adquisición paralela de datos y de barrido
40
Instrumentación
electrónico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de

onda y es de elevada fiabilidad.
Configuración Comercialmente, existen varias configuraciones de

espectrofotómetros. Cada una de ellas tiene ventajas y
desventajas.
Diseño de haz simple Tanto los espectrofotómetros convencionales como los de

diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple
son de bajo coste y el sencillo sistema óptico ofrece alto
rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los
espectrofotómetros de referencia utilizados por
instituciones como el National Institute of Standards and
Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National
Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz
simple.
Los espectrofotómetros de matriz de diodos son
particularmente adecuados para la configuración de haz
simple, ya que se adquieren espectros muy rápidamente y
porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y
muestra es mínimo. Además, pueden utilizarse referencias
internas para reducir aún más los efectos de deriva de la
lámpara (consulte “Referencia interna” en la página 74).
La Figura 25 muestra el sistema óptico de un moderno
espectrofotómetro de diodos, el Agilent 8453. Esta
configuración de haz simple tiene un número mínimo de
componentes ópticos, obteniéndose la eficacia más
elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite
medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolución.
41
Instrumentación
Obturador
Lente
Lámpara
de
Muestra wolframio
Lente Lámpara
Rendija de deuterio
Red
Matriz de
1024 diodos
Figura 25
Diagrama óptico del espectrofotómetro de diodos Agilent 8453
Diseño de doble haz En un espectrofotómetro convencional de haz simple, el

blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un
intervalo de varios segundos para una medida a una
longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida
de un espectro completo. Las variaciones de la lámpara
pueden dar lugar a errores significativos en intervalos
largos de tiempo.
El espectrofotómetro de doble haz fue desarrollado para
compensar los cambios de intensidad de la lámpara entre
las medidas de blanco y muestra. En esta configuración, se
coloca un chópper en el paso óptico, cercano a la fuente. El
chópper hace que al detector llegue intermitentemente la
luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a
una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y
muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por
lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad
de la lámpara (deriva).
La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotómetro
de doble haz. Comparado con los diseños de haz simple, los
42
Instrumentación
instrumentos de doble haz contienen más componentes

ópticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para
obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos
de medida. Además, el diseño mecánico más complejo del
espectrofotómetro de doble haz, puede resultar en una
menor fiabilidad.
Monocromador
Rendija
de salida Referencia
Dispositivo
de dispersión
Rendija de Chópper
Fuente entrada Detector
Muestra
Figura 26
Sistema óptico de un espectrofotómetro de doble haz
Tradicionalmente, la mayor estabilidad de los instrumentos

de doble haz, ha sido fundamental en el diseño de los espec-
trofotómetros de alto rendimiento. Sin embargo, recientes
avances en el diseño de lámparas y de la electrónica han
mejorado la estabilidad de los espectrofotómetros de haz
simple y han llevado a un resurgimiento de esta configura-
ción. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensi-
bilidad y más facilidad de uso, con derivas sólo un factor de
dos, peores que las de los instrumentos de doble haz.
El primer espectrofotómetro de diodos comercial, el
HP 8450A, era un diseño multihaz (Figura 27). El director de
haz se usaba para alternar el paso de luz por la posición de
referencia y hasta por cuatro posiciones de muestra (en la
figura sólo se muestra una de ellas).
43
Instrumentación
Lámpara visible
Espejos de
Celda de esquina de
Lámpara UV referencia la cubeta
Elipse de
Espejo de la fuente
la fuente
Espejo superior
Elipse del director del haz
UV espectrógrafo
Celda de
muestra
Visible
Espejos
esquina
Red Rendija del
de cubeta
espectrógrafo y Espejo inferior
holográfica
matrices del detector director del haz
Figura 27
Sistema óptico del espectrofotómetro de diodos HP 8450A
Diseño con división de haz El espectrofotómetro con división de haz (Figura 28) simula
el espectrofotómetro de doble haz pero utiliza un divisor en
lugar de un chópper para dirigir la luz por los pasos de
blanco y muestra, simultáneamente, hasta dos detectores
idénticos pero separados. Esta configuración permite medir
el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseño
de división de haz es mecánicamente más simple que el
instrumento real de doble haz y requiere menos elementos
ópticos, el uso de dos detectores independientes introduce
otra posible fuente de deriva.
44
Instrumentación
Monocromador
Rendija de
salida
Dispositivo Referencia Detector
de dispersión
Rendija
Fuente de entrada
Muestra Detector
Figura 28
Sistema óptico de un espectrofotómetro con división de haz
Este diseño proporciona alta estabilidad, aunque no tan

elevada como el instrumento de doble haz ya que dos
detectores pueden variar independientemente y, bajo ruido,
aunque no tan bueno como el del instrumento de haz
simple, ya que la luz se divide de manera que menos del
100 % atraviesa la muestra.
Diseño de doble Con un espectrofotómetro de doble longitud de onda,

longitud de onda puede medirse simultáneamente a dos λ en aplicaciones
especiales, como el estudio de dos reacciones concurrentes
en una muestra. El monocromador contiene dos disposi-
tivos de dispersión (transformándolo en un duocromador),
con la salida combinada en un haz simple. Estos instrumen-
tos complejos, normalmente, son significativamente más
costosos que los convencionales y han sido sustituidos por
espectrofotómetros de diodos, que son instrumentos
multilongitud de onda.
Medida de un espectro El grado de interacción de la muestra con la radiación

(transmitancia o absorbancia) se determina midiendo la
intensidad de la radiación incidente (sin la muestra) y la
45
Instrumentación
intensidad transmitida (con la muestra). Estas intensidades

se denominan Io y I, respectivamente, en las ecuaciones de
“Transmitancia y absorbancia” en la página 6.
Como la mayoría de las muestras medidas en espectrosco-
pía UV-visible están en disolución, debe medirse el blanco
en una cubeta que contenga el disolvente puro utilizado
para preparar la muestra. Este proceso elimina de la medida
de la muestra, cualquier absorbancia debida al disolvente.
Con un instrumento de haz simple, la cubeta con el disol-
vente se coloca en el espectrofotómetro y se mide el blanco.
Entonces, se mide la disolución de muestra en la misma
cubeta. Todos los instrumentos modernos almacenan
automáticamente los valores de referencia Io, que se usan
para calcular los valores de absorbancia de la muestra.
Con un instrumento de doble o haz dividido, se necesitan
dos cubetas. Ambas se llenan incialmente con disolvente
puro y se realiza la denominada medida de balance. Esta
medida refleja la diferencia de absorbancia entre los dos
pasos ópticos utilizados. Entonces, se llena una cubeta con
disolución de muestra y se miden Io e I, de modo
prácticamente simultáneo. El espectro resultante se corrige
restando el espectro de balance.
Parámetros En esta sección se discuten algunos parámetros instrumen-

instrumentales tales que pueden afectar a la exactitud y la precisión de los
valores de absorbancia (vea en el Apéndice A la definición
clave de los términos exactitud y precisión). En el capítulo 3
“Tratamiento y medida de muestra” se describen fuentes de
error relacionadas con el tratamiento de muestra.
Resolución espectral La resolución espectral es una medida de la capacidad de

un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de
onda adyacentes. Dos λ se consideran resueltas, normal-
mente, si el mínimo entre los dos picos de la señal de salida
del detector es menor que el 80 % del máximo. Esto se
46
Instrumentación
conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 29 muestra

esquemáticamente un caso para dos líneas de emisión
adyacentes (la entrada al instrumento) y la señal actual que
es la salida del detector.
Señal de
Intensidad salida del detector
Longitud de onda Longitud de onda
Figura 29
Definición de resolución
Absorbancia La resolución está muy relacionada con la anchura de

banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define
I como la anchura, a la mitad de su intensidad máxima, de la
banda de luz que sale del monocromador (ver la Figura 30).
0.5 I
SBW Longitud de
onda
Figura 30
Anchura de banda espectral
instrumental
47
Instrumentación
Absorbancia La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de

la relación de la SBW a la anchura de banda natural (NBW)
de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la
banda de absorción de la muestra a la mitad de su máximo
de absorción (Figura 31).
Longitud de
NBW
onda
Figura 31
Anchura de banda espectral natural
Una relación SBW/NBW de 0.1 o menos, dará lugar a una

medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o
mejor.8,9 A una relación SBW/NBW mayor de 0.1, el
espectro medido se distorsiona progresivamente, como se
muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden resolverse
Absorbancia
correctamente y ocurrirán errores significativos en los

valores de absorbancia, a la mayoría de las longitudes de
onda. SBW es principalmente una función de las anchuras
de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de
la dispersión generada por la red de difracción. No son
inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores
resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la
relación S/N.10
Longitud de onda
Figura 32
Efecto de variar la SBW sobre la
forma de la banda medida
48
Instrumentación
En los espectrofotómetros modernos, el intervalo de

muestreo utilizado para digitalizar el espectro para su
Absorbancia
Espectro
original evaluación y almacenamiento, también afecta a la
resolución (en un espectrofotómetro de diodos, la
digitalización ocurre en la propia matriz). La Figura 33
muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande
Proceso de relativamente a la SBW, la resolución del instrumento se
muestreo degradará. Un intervalo de muestreo más pequeño mejora
la resolución pero resulta en ficheros espectrales mucho
Absorbancia
Espectro
más grandes, que pueden ser difíciles de manejar. En la
digitalizado
práctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor
igual o más pequeño que la SBW.
Cuando se consideran requisitos instrumentales, es
Longitud de onda importante determinar cuál es la resolución necesaria.
Figura 33 Como se trató en el capítulo 1 “Principios y aplicaciones de
Efecto del muestreo digital espectroscopía UV-visible”, las bandas de absorción en la
región UV-visible son más bien anchas, particularmente
para muestras en disolución. Para aproximadamente el 99 %
de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es más que
adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de
bandas con una NBW de 20 nm o mayor.
Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para
medir muestras con una NBW más estrecha de 20 nm (por
ejemplo, benceno), resultará en un error en las medidas de
absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la
NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de
absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW
más estrecha. Sin embargo, la mayoría de las medidas
UV-visible se utilizan para cuantificación, lo que
normalmente requiere sólo medidas relativas (por ejemplo,
la absorbancia de una concentración desconocida relativa a
la absorbancia de un patrón). Una calibración realizada
utilizando patrones, que encierran la concentración de la
muestra desconocida, dará lugar a resultados cuantitativos
exactos incluso para bandas muy estrechas.
49
Instrumentación
Exactitud y precisión de La diferencia entre exactitud y precisión de longitud de

longitud de onda onda, normalmente, no se entiende demasiado bien (vea en
el Apéndice A una explicación de la diferencia entre ellas).
La exactitud de longitud de onda es importante para
comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos.
Sin embargo, en la mayoría de los análisis UV-visible las
medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente
a un patrón y, la precisón de longitud de onda (es decir, la
repetitividad) es más importante.
La Figura 34 muestra el efecto de una pobre repetitividad de
longitud de onda. Si se selecciona una λ en el máximo de
absorción para medidas cuantitativas, los pequeños errores
que ocurran al reprogramar el espectrofotómetro a esa
longitud de onda, tendrán un mínimo efecto sobre la
absorbancia medida. Este método da lugar a los resultados
cuantitativos más reproducibles. Por otro lado, elegir una
longitud de onda en un lateral de la banda de absorción, con
el mismo error al reprogramar λ, resultará en errores
significativos en la absorbancia medida. En este caso, no
serán fiables los resultados cuantitativos.
Error = 0.0 UA
Absorbancia [UA]
Error = 0.1 UA (10 %)

Figura 34
Efecto de una pobre repetitividad de la longitud de onda
50
Instrumentación
Todos los textos estándar sobre espectroscopía UV-visible

señalan que, para una cuantificación exacta, la longitud de
onda analítica debe estar en el máximo de absorción,
incluso aunque otras longitudes de onda puedan dar lugar a
una mejor selectividad. Sin embargo, estos textos están
basados en técnicas de barrido mecánico convencional y no
se aplican a los instrumentos de diodos, que tienen una
repetitividad de longitud de onda prácticamente absoluta.
Exactitud y precisión Suponiendo un buen diseño óptico y electrónico, sólo dos

fotométrica factores influyen en la exactitud y precisión fotométrica: la
luz dispersa y el ruido.
Luz dispersa La luz dispersa se define como aquella luz detectada de

cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de
banda de la longitud de onda seleccionada. La ecuación
utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, la
absorbancia, es:
T = ( I + Is ) ⁄ ( Io + Is )
donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz

incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la
intensidad de la luz dispersa.
La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende
de la luz transmitida. Si Is es prácticamente constante, se
convierte en el término dominante a bajos niveles de I. A
elevada absorción, la luz dispersa causa un hábito negativo
en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el
factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la
concentración que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve
comprometida la exactitud fotométrica del instrumento. La
Figura 35 muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa
sobre la absorbancia medida, comparada con la
absorbancia actual.
51
Instrumentación
0.00 % Luz dispersa

0.01 % Luz dispersa
Absorbancia medida [UA]

0.10 % Luz dispersa
1.00 % Luz dispersa
Absorbancia real [UA]
Figura 35
Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra
Ruido Un espectrofotómetro, típicamente, tiene dos factores de

ruido. El primero (ruido fotónico o Schott) resulta de la
distribución estadística de los fotones emitidos por una
fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de la
intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja
concentración con bajas absorbancias, este factor puede
evitar una medida exacta de la pequeña diferencia entre dos
niveles de luz. El segundo factor es inherente a la
electrónica del instrumento (amplificador del detector,
convertidor analógico-digital, etc.) y es independiente de la
intensidad medida. Este factor se convierte en significativo
a altos niveles de absorbancia, donde la señal de muestra es
muy pequeña. Puede minimizarse mediante un buen diseño.
El ruido afecta negativamente a la precisión de las medidas
y, para una medida sola, puede introducir también errores
en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse
aumentando el tiempo de medida (vea “Promedio de
tiempo” en la página 67).
52
Instrumentación
Rango dinámico lineal Una especificación citada con frecuencia y, a menudo, mal
entendida, es el rango del instrumento. En la mayoría de los
casos, éste es simplemente el rango numérico que un
instrumento puede mostrar. Una especificación más útil es
el rango dinámico lineal que especifica para una desviación
aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia),
los valores mínimo y máximo de absorbancia.
Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes
absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido.
Por tanto, el error debido a la luz dispersa (%) es igual a
( A t – Am )100 ⁄ At
donde At es la absorbancia real y Am es la absorbancia

medida.
At = – log ( I ⁄ I o )
Am = – log [ ( I + I s ) ⁄ ( I o + I s ) ]
donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad
de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La
Figura 35 muestra el error debido sólo a la luz dispersa.
Además, la absorbancia medida puede ser errónea debido al

ruido del instrumento.
Por consiguiente, el error debido al ruido (%) es igual a
( A t – A m ) ⁄ ( A t × 100 )
donde A t = – log ( l ⁄ l o )
y A m = A t + T ⁄ 100 × A pn + A en
o Am = T ⁄ 100 × A pn – A en
53
Instrumentación
donde Apn es el ruido fotónico en UA, Aen es el ruido

electrónico en UA y T es la transmitancia como porcentaje.
El error total a cualquier absorbancia es la suma de los
errores debidos a la luz dispersa y el ruido. La Figura 36
representa el error total para un ejemplo con ruido fotónico
de ± 0.0004 UA y ruido electrónico de ± 0.0001 UA. El
gráfico muestra que las medidas de absorbancia hechas
desde, aproximadamente, 0.3 a 1.0 UA tienen la exactitud y
precisión más elevadas. El rango dinámico instrumental
puede determinarse a partir del error de medida aceptable.
% Error
Curva de error de luz dispersa

Curva de error de luz dispersa + ruido
Curva de error de luz dispersa - ruido
Absorbancia [UA]
Figura 36
Error de absorbancia teórica frente a absorbancia
54
Instrumentación
Deriva Otra causa potencial de error fotométrico es la deriva. Esta

normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la
lámpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la
electrónica del instrumento también pueden causar deriva.
Un buen diseño instrumental puede minimizar la deriva,
pero este efecto puede reducir la exactitud de los
resultados, especialmente en un periodo prolongado de
tiempo (Figura 37). Con datos a múltiple longitud de onda,
el problema de la deriva puede minimizarse utilizando
técnicas como la de referencia interna (vea “Referencia
interna” en la página 74).
Error
Absorbancia [UA]
Figura 37
Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida
55
Instrumentación
56
capítulo 3
capítulo 3 Tratamiento y
medida de
muestra
57
Tratamiento y medida de muestra
Conocidas las limitaciones instrumentales y si el
espectrofotómetro opera correctamente, las mayores
fuentes de error en espectroscopía UV-visible están
relacionadas con el tratamiento y la química de la
muestra. En este capítulo se discuten las potenciales
fuentes de error y los pasos para evitarlas.
Muestras líquidas
Cubetas La espectroscopía UV-visible se utiliza principalmente, para

medir líquidos o disoluciones. Esto es más simple y permite
un análisis cuantitativo más exacto que realizar medidas de
reflectancia en sólidos. En esta técnica, una cubeta debe
contener el líquido o disolución en el área de muestra.
Material Idealmente, las cubetas deberían ser completamente

transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la
absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinámico
lineal efectivo para la muestra. Por ejemplo, si el límite
superior del rango dinámico lineal es 2.5 UA pero la cubeta
absorbe 1 UA, el rango restante utilizable para la muestra
estará entre 1 y 2.5 UA, que es sólo 1.5 UA.
Las cubetas más baratas son de plástico, normalmente
acrílico. Estas cubetas no son resistentes a todos los
disolventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm,
haciéndolas inadecuadas para medir en esta región. La
58
consistencia (absorbancia y paso óptico) puede variar entre

cubetas, dependiendo del fabricante.
Las cubetas de vidrio son ligeramente más caras que las de
plástico pero son más duraderas y, con el cuidado apropia-
do, pueden durar años. El vidrio absorbe por debajo de
320 nm y por tanto, no es adecuado para medir en este área.
Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transpa-
rentes por debajo de 210 nm. Las mejores cubetas son de
sílice fundida sintética de alta pureza, siendo
razonablemente transparentes por debajo de 190 nm.
La Figura 38 muestra la absorción de los diferentes
materiales. Observe que todos exhiben al menos el 10 % de
pérdida por transmisión a todas las longitudes de onda.
Sílice
fundida
Transmitancia [%]
Cuarzo
fundido
Plástico Vidrio
acrílico
Vidrio
óptico
Figura 38
Características de transmisión óptica de los materiales de cubetas
Tipos de cubeta Existe una amplia gama de cubetas pero aquí sólo se
describen las más importantes. La cubeta más utilizada es la
rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden
tener pasos ópticos de 1 a 100 mm, pero el más popular es
10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una
59
anchura exterior de 12.5 mm. Cuando el volumen de

muestra es limitado, a menudo se utilizan cubetas con
apertura (Figura 39b).
Si el volumen de muestra es muy limitado, pueden utilizarse

microcubetas que reducen la apertura del área de muestra a
una sección muy pequeña (2 × 2.5 mm), Figura 40a. Sólo se
requieren aproximadamente 60 µl de muestra para medir.
Con ultramicrocubetas especiales, pueden medirse volúme-
nes por debajo de 5 µl. Para aplicaciones automatizadas, se
utilizan cubetas de flujo (Figura 40b). Las cubetas moder-
nas se conectan a un tubo de transferencia de muestra.
Puede disponerse de cubetas de flujo de varios tamaños de
apertura y geometrías, con amplio rango de paso óptico.
Figura 39
En las cubetas con apertura y microcubetas, se bloquea
Cubetas estándar (a) y con
apertura (b) parte del haz de luz, se reduce el rendimiento y se compro-
mete de algún modo, la sensibilidad. La pérdida de
sensibilidad depende del grado de apertura y de la
geometría óptica.
Fuentes de error
Si las cubetas están apropiadamente diseñadas y utilizadas,

su contribución a los errores de absorbancia debe ser
mínima. Sin embargo, el analista debe estar al tanto de
varias fuentes potenciales de error.
Como la absorbancia medida depende del paso óptico, la
precisión de éste es importante en las medidas absolutas.
La tolerancia de paso óptico para cubetas de alta calidad es
± 0.01 mm para pasos entre 0.5 y 100 nm.11 Para una
exactitud cuantitativa máxima, debe utilizarse la misma
cubeta para las medidas de patrón y muestra.
Figura 40 Cuando se coloca en el haz, una cubeta se transforma en un
Cubetas micro (a) y de flujo (b) componente óptico activo. Superficies ópticas no planas o
no paralelas pueden desviar el haz y causar errores de
absorbancia (vea “Geometría de la muestra” en la página
60
65). Las mejores cubetas tienen superficies ópticas muy

planas y paralelas que minimizan su influencia como
componente óptico. La cubeta siempre debe colocarse en la
misma dirección en el soporte para asegurar que los efectos
ópticos son idénticos en las medidas de blanco y muestra.
En cubetas con apertura, las partes que no contienen la
muestra deben estar apropiadamente cubiertas (como en
las figuras) para evitar transmisiones y reflexiones no
deseadas a través de las paredes. Si se utilizan cubetas sin
cubrir, las medidas serán erróneas. El grado de error
depende de la geometría óptica del área de muestra. Si el
haz óptico se enfoca de manera que gran proporción de luz
atraviesa una apertura muy pequeña de la cubeta, los
resultados con cubetas sin cubrir serán razonablemente
exactos, ya que la óptica hará el efecto de auto-cubierta. En
cambio, si el haz óptico es ancho y colimado (paralelo),
pasará mucha luz a través de las paredes de la cubeta en
lugar de atravesar la muestra y las medidas serán inexactas.
Cuidado de las cubetas Las cubetas deben manejarse cuidadosamente para evitar
arañarlas. Debe evitarse tocar las superficies ópticas con
los dedos, ya que la grasa de las huellas dactilares puede
absorber significativamente. Si las superficies ópticas de la
cubeta están ligeramente sucias, pueden limpiarse con un
pañuelo de papel fotográfico. Si la cubeta está muy
contaminada, puede limpiarse con un detergente sulfónico
suave o con un líquido especial de limpieza. En casos
extremos, puede utilizarse un tratamiento con ácido
clorhídrico o nítrico.
Elección de disolvente El disolvente ideal para la preparación de muestras sería

aquel que disolviera todos los tipos de compuestos, sería no
inflamable y no tóxico, además de completamente
transparente a todas las longitudes de onda. El agua
destilada se acerca al ideal pero no es adecuado para
muchos compuestos orgánicos no polares. La Tabla 1 lista
algunos de los disolventes más utilizados. Con la excepción
del agua, todos ellos exhiben una longitud de onda de corte
61
en el rango UV, por debajo del cual absorben demasiado

para realizar medidas de muestra.
Tabla 4 Propiedades de algunos disolventes comunes
Longitud de onda
Disolvente Polaridad* de corte (nm)** Riesgos***
Agua destilada 78.5 < 195 ninguno
Hexano 1.9 199 F
Etanol (absoluto) 24.3 207 F
Metanol 32.6 210 F
Ciclohexano 2.0 211 F
Cloroformo 4.8 246 F/T
Dimetilsulfóxido ninguna 270 H
Acetona 20.7 331 F
* Constante dieléctrica a temperatura ambiente

**
Longitud de onda a la que la transmitancia a paso óptico de 10 mm es < 25 %
***
F = inflamable; T = tóxico; H = riesgo para la salud
Con disolventes orgánicos volátiles, como acetona o

cloruro de metileno, es aconsejable utilizar una cubeta
cerrada para eliminar la evaporación, que podría dar lugar a
cambios rápidos de concentración.
Efecto del disolvente, Varios factores, que incluyen el disolvente utilizado, junto
concentración, pH y con la concentración, pH y temperatura de la muestra,
temperatura pueden afectar a la posición e intensidad de las bandas de
absorción de las moléculas. Estos parámetros deben
controlarse para asegurar máxima precisión y para poder
comparar espectros medidos bajo diferentes condiciones.
La polaridad de un disolvente puede modificar el entorno
electrónico de un cromóforo absorbente. En general, la
magnitud de la variación puede correlacionarse con la
62
polaridad del disolvente. Por tanto, por ejemplo, el máximo

de absorción de la acetona puede variar de 259 a 279 nm,
dependiendo del disolvente. Para análisis comparativo,
debe utilizarse un solo disolvente para todas las medidas.
La concentración, normalmente, sólo afecta a la intensidad
de las bandas. A concentraciones más altas, sin embargo,
las interacciones moleculares (por ejemplo, dimerización)
pueden causar cambios en la forma y posición de la banda
de absorbancia. En último término, estos cambios afectan a
la linealidad de la concentración frente a la relación de
absorbancia y puede llevar a resultados cuantitativos
inexactos.
Los efectos del pH sobre los espectros de absorbancia
pueden ser muy grandes y resultar, principalmente, de las
variaciones del equilibrio entre dos formas diferentes. Por
ejemplo, los indicadores de pH cambian de color a
diferentes valores. Si el espectro de la muestra se afecta por
el pH, debe utilizarse un regulador para controlar este
parámetro. Observe, sin embargo, que la mayoría de los
reguladores exhiben una absorbancia significativa, lo que
puede afectar al rango de longitud de onda sobre el que
pueden realizarse las medidas.
La temperatura también puede afectar a las medidas
UV-visible. Una simple expansión, especialmente en
algunos disolventes orgánicos, puede ser suficiente para
cambiar la absorbancia aparente y, por lo tanto, la exactitud
de los resultados cuantitativos. Además, la temperatura
puede afectar a los equilibrios, químicos o físicos. Un buen
ejemplo de equilibrio físico es la desnaturalización de los
ácidos nucléicos al aumentar la temperatura, lo que cambia
la absortividad. Finalmente, sobre todo en disolventes
orgánicos, pueden ser significativos los cambios del índice
de refracción con la temperatura. Si las corrientes de
convección causan que haya diferencias de temperatura en
distintas partes de la cubeta, el efecto Schlieren resultante
puede cambiar la absorbancia aparente. Si se observa que la
temperatura tiene efecto considerable sobre las medidas,
63
debe controlarse este parámetro utilizando un soporte

termostatizado. Este puede ser un simple soporte envuelto
por agua, utilizado junto a un baño de agua circulante, o un
controlador Peltier de temperatura, más sofisticado. Con
disolventes orgánicos, es aconsejable utilizar una cubeta
cerrada para minimizar el efecto Schlieren.
Muestras sólidas Varios factores pueden interferir con la medida exacta y

precisa de muestras sólidas transparentes, como vidrios o
cristales.
Sin referencia A menudo se miden muestras sólidas para determinar el

espectro o cuantificar un componente de la matriz. Sin
embargo, una muestra de la matriz que no contenga el
analito, no siempre puede conseguirse. En este caso, puede
realizarse la medida del blanco con aire, ya que no es
posible obtener un blanco real (matriz sin analito). Este
proceso, en el mejor de los casos, resultará en un
desplazamiento constante a todas las longitudes de onda y,
en el peor, en un espectro medido que será una mezcla del
analito y la matriz. Es posible el análisis cuantitativo exacto
si se dispone de dos o más patrones y si se utiliza una curva
de calibración que no esté forzada a pasar por cero. La
intersección con el eje Y representa, entonces, la
absorbancia debida a la matriz. Si no se dispone de
múltiples patrones, la referencia interna utilizando una
longitud de onda de referencia a la que no haya absorbancia
del analito, es a menudo, una alternativa viable.
64
Indice de refracción
Haz colimado La carencia de una muestra de referencia también causa un

cambio significativo del índice de refracción entre el blanco
(aire) y la muestra sólida. Si el haz óptico se colima
perpendicularmente a la muestra, este efecto no es
importante. Sin embargo, si el haz se enfoca, la muestra
sólida se convierte en un componente activo óptico y altera
Muestra Detector la longitud del paso. Este cambio del paso óptico puede, en
último caso, causar una modificación significativa del grado
Haz enfocado de iluminación del detector entre el blanco y la muestra
(Figura 41), resultando en un error de la absorbancia
aparente. Este problema es muy difícil de detectar y, si el
instrumento es de diseño de enfoque de haz, no tiene fácil
solución. Sin embargo, este efecto puede minimizarse
colocando la muestra tan cerca del detector como sea
Luz no posible.
detectada
Figura 41
Efecto del índice de refracción
Geometría de la A menudo las muestras sólidas pueden ser de vidrio, filtros

muestra de plástico moldeados o lentes (por ejemplo, lentes de
cristales solares). Estas muestras son componentes ópticos
activos del sistema y desvían o cambian la longitud focal del
haz de luz. Como resultado, el detector falla al detectar
parte de la luz (Figura 42), que se mide, entonces, como
absorbancia aparente. Este efecto puede probarse rotando
o invirtiendo la muestra en su soporte y puede minimizarse
colocando la muestra tan cerca del detector como sea
posible.
65
Area fotosensible
Detector Detector
Muestra plana Muestra “con bordes”
Figura 42
Efecto de una geometría no plana de la muestra
Absorbancia débil Un problema en química analítica es la baja sensibilidad,

que puede ser debida a una baja concentración de la
muestra o a una absortividad muy débil del analito. A bajas
absorbancias, el ruido en las medidas resulta en una
pérdida de precisión de manera que cualquier medida
simple puede ser inexacta. Reducir directamente el nivel de
ruido mejora la precisión de los resultados. La
especificación de ruido debe ser un parámetro clave en la
selección del espectrofotómetro, pero observe que variar
los parámetros de medida reducirá el nivel de ruido.
Cambiar la anchura Si el espectrofotómetro tiene una anchura variable de

de rendija rendija, el nivel de ruido puede reducirse aumentando esta
anchura para que más luz atraviese los componentes
ópticos. Este aumento de la rendija da lugar a una mejor
relación S/N pero reduce la resolución del instrumento.
66
Promedio de tiempo
Tomar la media de los datos reduce el ruido por la raiz

S/N = 5.5 cuadrada del número de puntos promediados. La Figura 43
Absorbancia [UA]
muestra la mejora de la relación S/N con el aumento del

tiempo de integración, para un colorante a muy baja
concentración. Las medidas se realizaron utilizando un
0.1 seg espectrofotómetro de diodos con tiempos de integración de
0.1 y 1.6 s. La mejora actual es cercana al valor teórico
esperado de cuatro. Observe que ampliar el tiempo de
integración mejorará la sensibilidad sólo hasta que otros
S/N = 18 efectos, como la deriva, sean dominantes.
Absorbancia [UA]
1.6 seg

Figura 43
Efecto del t de integración en S/N
Promedio de longitud Otra técnica es promediar la longitud de onda. La Figura 44

de onda muestra una banda ancha de absorción. Las medidas
cuantitativas convencionales se realizan en el máximo de
absorción. Si se dispone de los datos a todas las longitudes
de onda, pueden incluirse en la media valores adicionales a
ambos lados del máximo. La reducción del ruido es
equivalente a la raiz cuadrada del número de puntos. Sin
embargo, cuantos más datos se añaden, la absorbancia
media se reduce, lo que tiene un efecto negativo sobre la
señal. Para una particular anchura de banda de absorción,
un número determinado de puntos dará lugar a la S/N
óptima (Figura 44).
67
S/N
Señal
Ruido
Absorbancia
Absorbancia
Longitud de onda # de puntos
NBW Rango
óptimo
Figura 44
Efecto del promedio de longitud de onda sobre S/N
La deriva también afecta a la exactitud de las medidas de

absorbancia. Puede utilizarse una referencia interna
(“Referencia interna” en la página 74) para mejorar la
precisión y la exactitud a bajos niveles de absorbancia.
Absorbancia fuerte Cuando las muestras absorben fuertemente, puede

excederse el rango dinámico lineal del instrumento, siendo
la relación entre absorbancia y concentración, no lineal
(“Rango dinámico lineal” en la página 53). La solución más
fácil a este problema es diluir la muestra a un nivel de
absorbancia dentro del rango dinámico lineal. Con
muestras sólidas esto no es posible. Además, cualquier
etapa de tratamiento de muestra, incluso la dilución,
introduce errores y debe, por lo tanto, ser evitada. Una
alternativa es seleccionar una o más longitudes de onda en
el lateral de la banda de absorbancia, donde la absortividad
es menor (Figura 45). Cuando se utiliza para calibración la
longitud de onda del máximo (241 nm), puede medirse una
concentración máxima de aproximadamente 0.26 mg/ml,
con una exactitud razonable. Sin embargo, utilizar la
68
absorbancia en el lateral de la banda (266 nm) permite

medir concentraciones de hasta 5 mg/ml con igual
exactitud. Un prerrequisito para esta técnica es una
excelente reproducibilidad de longitud de onda (“Exactitud
y precisión de longitud de onda” en la página 50).
Absorbancia medida [UA]

0.1428 mg/ml
espironoloactona
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Concentración [mg/ml]
Figura 45
Cambio de longitud de onda para aumentar el rango dinámico
Interferencia
Tipos de interferencia Idealmente, la absorbancia que ocurre durante las medidas

UV-visible tiene que deberse sólo al analito de interés. Sin
embargo, en la práctica, a menudo aparecen absorbancias
que interfieren con las medidas, por razones químicas o
físicas.
69
Otros compuestos La presencia de cualquier compuesto que absorba en la

absorbentes misma región que el de interés, resultará en un error en la
medida de absorbancia. A veces, sólo está presente un
único compuesto absorbente conocido, por ejemplo un
subproducto de la síntesis de un compuesto farmacéutico.
En otros casos, múltiples especies absorbentes, muchas de
ellas conocidas (por ejemplo, muestras biológicas como
sangre), pueden causar una ancha absorción matriz.
Dispersión Un problema de los análisis farmacéuticos y biológicos es la

dispersión, scattering, causada por las partículas
suspendidas en disolución. En análisis farmacéuticos, estas
partículas suelen ser los excipientes o rellenos utilizados en
las formulaciones de las tabletas o cápsulas. La dispersión
de radiación resulta en una absorbancia aparente de fondo
que interfiere con las medidas de absorbancia. Filtrar las
muestras antes de las medidas elimina la dispersión pero no
siempre es practicable y, a menudo, el analista trabaja con
espectros que incluyen este problema.
La dispersión causa una absorbancia aparente debida a que

Detector la luz, en lugar de pasar a través de la disolución hasta el
detector, se dispersa con cierto ángulo. Por lo tanto, incluso
si no hay absorción, menos luz alcanza el detector, como se
muestra en la Figura 46.
Muestra transparente En la parte UV-visible del espectro, pueden observarse dos
tipos de dispersión. La dispersión Rayleigh ocurre cuando
las partículas son pequeñas relativamente a la longitud de
onda de la luz y es inversamente proporcional a la cuarta
Detector
potencia de λ. La dispersión Tyndall ocurre cuando las
partículas son grandes relativamente a la longitud de onda
de la luz y es inversamente proporcional al cuadrado de λ.
En sistemas químicos, el exponente de la longitud de onda
puede variar de - 4 a - 2, dependiendo de la distribución de
Muestra con dispersión
tamaños de las partículas:
Figura 46
n
Dispersión (Scattering) A scatter ∝ 1 ⁄ λ
70
donde A es la absorbancia debida a la dispersión, λ es la

longitud de onda y n es el orden de dispersión, scattering.
Esta relación causa que el error debido a la dispersión
aumente al disminuir la longitud de onda, Figura 47.
Absorbancia [UA]
dispersión Tyndall
dispersión Rayleigh
Figura 47
Espectros de dispersión
La magnitud del efecto de dispersión puede reducirse

colocando la muestra lo más cerca posible del detector. Sin
embargo, con una dispersión significativa, se pierde luz y la
sensibilidad y la exactitud del análisis cuantitativo se ven
seriamente comprometidas.
Técnicas de corrección Pueden utilizarse varias técnicas para eliminar o reducir los
errores de interferencia. En general, si el origen del error es
conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse.
Por el contrario, si el origen es desconocido y varía de
muestra a muestra, el error puede reducirse pero no
eliminarse. Las técnicas de corrección siempre requieren
datos de al menos dos longitudes de onda. Las técnicas más
sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o
espectrales.
71
Isoabsorbancia Cuando está presente un componente interferente de

espectro conocido, puede eliminarse el error introducido
por este compuesto a la longitud de onda analítica,
seleccionando una longitud de onda de referencia a la que la
interferencia exhiba la misma absorbancia que a la longitud
de onda analítica. La absorbancia a esta longitud de onda de
referencia se resta de la abosrbancia a la longitud de onda
analítica, Figura 48. La absorbancia residual es la
absorbancia real del analito.
Espectro del analito

Espectro interferente
Espectro medido
Absorbancia [UA]
Figura 48
Corrección de isoabsorbancia
Esta técnica es menos fiable cuando los espectros del

analito y de la interferencia son muy similares. Además,
permite corregir sólo una interferencia.
Análisis multicomponente Una extensión de la isoabsorbancia es el análisis

multicomponente, descrito en “Análisis multicomponente”
en la página 21. Aquí, deben medirse como patrones los
espectros de las interferencias. Esta técnica puede
aplicarse con éxito cuando los espectros se solapan de
manera considerable y cuando hay presente más de un
compuesto interferente.
72
Modelar el fondo Modelar el fondo es apropiado cuando la interferencia se

debe a un proceso físico (frecuentemente, dispersión) en la
que la interferencia a la longitud de onda analítica puede
estimarse por extrapolación a partir del modelo en otro
rango de λ. Se selecciona una parte del espectro donde la
absorbancia aparente se debe sólo a la interferencia.
Entonces, se ajusta un polinomio a esta parte del espectro
utilizando un ajuste por mínimos cuadrados al logaritmo de
la absorbancia:
n
A = aλ
log ( A ) = log ( a ) + n log ( λ )
donde A es absorbancia, λ es longitud de onda, n es el orden

de la relación entre absorbancia y longitud de onda y a es
una constante. La absorbancia de fondo al resto de las
longitudes de onda puede estimarse utilizando los
coeficientes determinados por el ajuste. Estos valores se
restan de los valores medidos, para obtener las
absorbancias debidas al analito, Figura 49.
Espectro
medido
Absorbancia [UA]
Espectro extrapolado
de dispersión
Figura 49
Modelo de fondo
73
Referencia interna Una de las técnicas más simples de corrección es la

referencia interna, que utiliza una sola longitud de onda de
referencia. Este método se suele utilizar cuando aparece
deriva de la línea de base entre medidas En general, es
mejor elegir una longitud de onda de referencia lo más
cerca posible de la longitud de onda analítica, pero sin
absorbancia significativa del analito. La absorbancia a la
longitud de onda de referencia se resta de la de la longitud
de onda analítica. Se corrige cualquier interferencia
constante a todas las longitudes de onda, Figura 50. Aunque
en la práctica las interferencias no suelen ser constantes a
todas las longitudes de onda, esta simple técnica a menudo
da lugar a sorprendentes mejoras en la exactitud.
Espectro a
Espectro b
Absorbancia [UA]
Figura 50
Referencia interna
Corrección de tres puntos La corrección de tres puntos, o Morton-Stubbs, utiliza dos

longitudes de onda de referencia, normalmente aquellas a
los lados de la longitud de onda analítica. Se estima
entonces la absorbancia interferente de fondo a la longitud
de onda analítica, usando interpolación lineal (Figura 51).
Este método representa una mejora sobre la técnica de
referencia a una λ, porque corrije cualquier absorbancia de
74
fondo que exhiba una relación lineal con la longitud de

onda. En muchos casos, si el rango de longitud de onda es
estrecho, será una corrección razonable para absorbancias
de fondo no lineales, como la resultante de la dispersión o
de una matriz comleja.
Espectro
medido
Absorbancia [UA]
Figura 51
Corrección de tres puntos (Morton-Stubbs)
Espectroscopía derivada Debido a dos de sus propiedades, la espectroscopía

derivada puede utilizarse para reducir o eliminar la
interferencia de fondo de varios orígenes. Primero,
cualquier interferencia con una relación directamente
proporcional a diferentes órdenes de λ, de forma general
1 n
A = a0 + a1 λ + … + an λ
se elimina por el uso de derivadas de orden cada vez mayor.

Así, un desplazamiento constante de la línea de base (a0) se
elimina por la primera derivada, una absorbancia de fondo
que aumenta linealmente con λ, se elimina por la segunda
derivada, etc. Desafortunadamente, sólo el desplazamiento
constante de la línea de base es común en espectroscopía
UV-visible.
75
Segundo, y quizás más importante que la primera

propiedad, las derivadas discriminan bandas anchas de
absorbancia relativamente a bandas estrechas de
absorbancia. Esta discriminación resulta del hecho de que
la amplitud (Dn) de una banda gaussiana en la enésima
derivada, es inversamente proporcional a la anchura de
banda original (W) elevada al grado n:
n 1
D ∝ -------n .
W
Por lo tanto, para dos bandas coincidentes de igual
intensidad pero diferente anchura en el orden cero, la
amplitud de la derivada n de la banda más aguda (X) es
mayor que la de la banda más ancha (Y), en un factor que
depende de la anchura de banda relativa y del orden de la
derivada:
n n
DX WY
--------- = ---------
-
n n
DY DX
La Figura 52 muestra el efecto de tomar las derivadas de
dos bandas con NBW de 160 y 40 nm, respectivamente. En
modo absorbancia, estas bandas tienen igual amplitud. En
la primera derivada, la banda más estrecha tiene 4 veces
mayor amplitud y, en la segunda derivada tiene 16 veces
mayor amplitud. Esta propiedad mejora la exactitud de la
cuantificacion de cualquier componente de banda ancha.
Este último puede ser un componente intereferente, como
se muestra en la Figura 52.
76
Absorbancia
Primera derivada
Segunda derivada
Figura 52
Discriminación de bandas anchas en espectroscopía derivada
El espectro resultante de dispersión es también de banda

ancha y el uso de derivadas puede reducir también su
contribución. Por ejemplo, la Figura 53 muestra una banda
de absorbancia con una NBW de 40 nm y la misma banda en
la presencia de fondo de dispersión. Sin ninguna
corrección, la amplitud a 500 nm es 1.0920 A en lugar de
1.0 A, debido a la contribución de la dispersión. La
cuantificación a esta longitud de onda resulta en un error
del + 9.2 %. Tomar la primera derivada reduce la
contribución del componente de dispersión, de manera que
utilizando del máximo al mínimo del pico, la señal en la
presencia de dispersión es 0.02992 A en lugar de 0.03024 (un
error de cuantificación de sólo - 1.1 %).
77
Absorbancia
Espectro medido
Espectro actual
Primera derivada
Figura 53
Corrección de la dispersión por espectroscopía derivada
Normalmente, sin embargo, el problema analítico no puede

definirse de modo tan simple como dispersión, variación de
línea de base o componentes de absorción ancha no
deseados. Lo normal es que una combinación de dos o más
de estos efectos resulte en una matriz de fondo de
absorción ancha. La espectroscopía derivada es una
herramienta excelente para reducir o eliminar estas fuentes
de error difíciles de caracterizar.
78
Problemas
fotoquímicos
Fluorescencia Algunas muestras fluorescen, es decir, emiten luz de un

rango de longitud de onda cuando se irradian con luz de una
longitud de onda más corta (de más energía). Esta luz
emitida resulta en un error en la medida de absorbancia. La
magnitud y posición del error depende de si el instrumento
tiene una óptica convencional o una óptica inversa.
En un instrumento de óptica convencional, la muestra se
ilumina con luz de longitud de onda, variable con el tiempo.
Al barrer el rango de longitud de onda de excitación, ocurre
absorción y se inicia el proceso de fluorescencia que emite
luz a longitudes de onda más largas. Como el detector no
puede diferenciar entre las longitudes de onda individuales,
la absorbancia medida a la longitud de onda de excitación
es muy baja (Figura 54). Al barrer el rango de longitud de
onda de emisión, no aparece fluorescencia y las medidas de
absorción son, por lo tanto, exactas.
Longitud de onda de
Espectro medido con
excitación óptica convencional
Espectro medido con
óptica inversa
Absorbancia [UA]
Longitud de onda
de emisión
Figura 54
Efecto de la fluorescencia sobre el espectro medido de absorbancia
79
En un instrumento de óptica inversa, la muestra se ilumina

con todas las longitudes de onda simultáneamente,
incluyendo luz de la longitud de onda de excitación. Por
tanto, la muestra fluoresce y emite luz pero, como la
selección de longitud de onda ocurre después de que la luz
haya pasado a través de la muestra, la luz emitida es dirigida
a la longitud de onda correcta. La absorbancia medida a la
longitud de onda de emisión es, por lo tanto, muy baja
(Figura 54), pero la absorbancia medida a la longitud de
onda de excitación es correcta.
Optica convencional Un factor adicional que afecta a la magnitud del error es el

denominado ángulo de aceptación del detector, Figura 55.
Detector
La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Si el
ángulo de aceptación es ancho, una parte significativa de la
luz fluorescente alcanzará al detector. Por el contrario, si el
ángulo de aceptación del detector es estrecho, sólo una
Optica inversa pequeña cantidad de luz fluorescente alcanzará el detector
Rendija detector y el error de absorbancia será también pequeño. Los
instrumentos de óptica inversa tienen un ángulo estrecho
de aceptación del detector y por lo tanto son menos
susceptibles al error de fluorescencia.
Colocando un filtro en el haz de luz, puede eliminarse el
Figura 55 error debido a la fluorescencia. En un instrumento
Angulos de aceptación y magnitud convencional, el filtro se sitúa entre la muestra y el detector
del error de fluorescencia para filtrar las longitudes de onda de emisión, mientras que
en un instrumento de óptica inversa, el filtro de coloca
entre la fuente y la muestra para eliminar las longitudes de
onda de excitación.
Descomposición de Algunas muestras son sensibles a la reacción fotoquímica,

la muestra especialmente cuando se exponen a luz UV de baja longitud
de onda. En casos extremos, puede ser necesario un filtro
para eliminar esta luz.
80
capítulo 4
capítulo 4 Desarrollo y
validación del
método
81
Desarrollo y validación del método
Conocer los errores que pueden deberse al instrumen-
to, al tratamiento de muestra y a la propia muestra,
permite desarrollar métodos analíticos que minimicen
sus efectos sobre los resultados. En este capítulo se
revisan los criterios para definir un buen método y las
estrategias para localizar los parámetros óptimos.
Desarrollo del Debido a que la mayoría de las aplicaciones UV-visible son

método la cuantificación de un solo componente, este capítulo está
dirigido a la optimización de tales métodos. El desarrollo
del método implica la selección de una o varias longitudes
de onda que den lugar a los mejores resultados para un
determinado análisis o instrumento. En éste, deben
definirse parámetros como exactitud, precisión,
sensibilidad, linealidad, rango, selectividad y robustez.
Como estos parámetros no pueden ser optimizados al
mismo tiempo, debe determinarse antes del análisis
aquellos que se desea optimizar, así como los requisitos.
Hasta hace poco, la instrumentación limitaba la elección de
longitud de onda (debido principalmente a problemas de
reproducibilidad de λ) y/o no se disponía de las
herramientas adecuadas para comparar las opciones. Estas
limitaciones ya no existen en los instrumentos modernos.
NOTA: El desarrollo del método implica el uso de varias
herramientas estadísticas. Los detalles de estas
herramientas y sus ventajas, están fuera del objetivo de este
libro, pero existen varias publicaciones excelentes.12–15
82
Linealidad Linealidad es la capacidad del método para producir

resultados proporcionales, directamente o mediante una
transformación matemática, a la concentración del
analito en las muestras, dentro de un determinado
rango.16
En las medidas UV-visible, la relación lineal más usual es la
ley de Beer, que indica que la absorbancia de un soluto es
directamente proporcional a su concentración (vea “Ley de
Beer” en la página 16). Una curva de calibración lineal que
relacione la absorbancia con la concentración, debe tener la
forma:
A = kc
donde A es la absorbancia, c es la concentración y k es el

factor de calibración (la pendiente de la curva de
calibración). Por lo tanto, al comprobar la linealidad se
prueba cómo las medidas actuales se ajustan al modelo
teórico (ley de Beer).
Teóricamente sólo se requiere la medida de absorbancia de
un patrón de concentración conocida, como calibrado para
la cuantificación. El valor medido de absorbancia dividido
por la concentración, es la pendiente. Varios parámetros
instrumentales y de la muestra (vea el capítulo 2
“Instrumentación” y el capítulo 3 “Tratamiento y medida de
muestra”) pueden causar desviaciones de la ley de Beer y
pueden resultar errores cuantitativos significativos si la
curva de calibración no está caracterizada con exactitud
(Figura 56). Sin embargo, como estas desviaciones
dependen de la longitud de onda, la selección del valor
apropiado de ésta puede minimizar su influencia sobre los
resultados.
83
Posibles curvas
ica ic a
t eó
r de calibración reales t eór
ció
n ión
br a Absorbancia medida ib rac
ali l
Absorbancia [UA]
a
e c de la muestra d ec
ad rva
Absorbancia medida
C urv Cu
del patrón
Posibles resultados
Concentración conocida de cuantificación
del patrón
Concentración Concentración
Figura 56
Errores potenciales resultantes de una calibración inadecuada
Para construir una curva de calibración, deben medirse los

espectros de un grupo de, al menos, tres disoluciones
patrón del analito. Las concentraciones de los patrones
Absorbancia [UA]
deben “encerrar” el rango de concentración esperado de las

muestras de análisis. Idealmente, todos los valores patrón
medidos deben estar sobre una línea recta, pero en la
práctica, los valores siempre presentan cierta dispersión
(Figura 57). Debe aplicarse un método estadístico para
Concentración
encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de
calibración y, en una segunda etapa, para determinar qué
tipo de curva de calibración da lugar al mejor ajuste. El
método estadístico más frecuente es la regresión lineal, que
también se conoce como el método de mínimos cuadrados.
Absorbancia [UA]
Para comparar dos curvas de calibración, se requiere medir

la bondad del ajuste de los patrones. Varios valores estadís-
ticos, como el coeficiente de correlación, el error estándar
de regresión y la incertidumbre, pueden usarse para esta
medida. De estos, el coeficiente de correlación es el más
Concentración popular. Este valor siempre está entre + 1 y - 1. Un valor + 1
Figura 57 indica una relación lineal perfecta entre absorbancia y
Grupos de datos de calibración concentración, siendo A creciente. Un valor - 1 también
84
indica una relación lineal perfecta, con A decreciente (lo

que puede ocurrir si se usan derivadas). El valor 0 indica
que no hay correlación entre absorbancia y concentración.
Para determinar el mejor valor o combinación de longitudes
de onda, se miden los espectros de un grupo de patrones
puros con un amplio rango de concentraciones. Se aplica
una curva de calibración lineal a cada longitud de onda y se
calculan las estadísticas elegidas para valorar la linealidad.
Para una evaluación más rápida, es útil una representación
gráfica de las estadísticas frente a la longitud de onda.
La Figura 58 muestra los espectros de cuatro patrones de
colorantes amarillos y el correspondiente coeficiente de
correlación para una curva de calibración lineal simple. La
mejor calibración en términos de la linealidad se realiza en
el punto en el que el coeficiente de correlación se aproxima
a la unidad. En este ejemplo, la longitud de onda del
máximo (414 nm) no es idéntica a aquella (402 nm) que dá
lugar a la mejor linealidad. Típicamente, pueden esperarse
valores del coeficiente de correlación mejores de 0.999.
Absorbancia [UA]
Coeficiente correlación
Rango
óptimo
Figura 58
Selección de las longitudes de onda para la mejor linealidad
85
Si una longitud de onda individual no proporciona el grado

requerido de linealidad, puede utilizarse una combinación
de λ. Por ejemplo, el uso de una longitud de onda de
referencia interna para eliminar los errores de variación de
línea de base en las medidas, mejorará los resultados.
Si no puede obtenerse el grado de linealidad deseado con
una curva de calibración lineal simple, puede aplicarse un
tipo diferente de curva para minimizar la influencia de la no
idealidad de los resultados. Típicamente se utilizan
ecuaciones de la forma:
A = a + kc
2
A = kc + k′c
y
2
A = a + kc + k′c
De nuevo, debe utilizarse el coeficiente de correlación u

otra herramienta estadística para valorar la calidad relativa
de las curvas de calibración. Observe que cuando se utilizan
tipos de curva de calibración con mayor grado de libertad,
se requieren más patrones para caracterizar adecua-
damente la curva.
Para análisis multicomponente, también se supone que se
cumple la ley de Beer. Sin embargo, en este caso, el modelo
de cálculo incluye la ley de aditividad para explicar la
absorbancia total a cada longitud de onda. No puede usarse
el test simple de linealidad descrito anteriormente. En su
lugar, puede utilizarse la desviación estándar del residual
para probar el ajuste de los patrones al espectro medido.
Este valor es la suma de los cuadrados de las diferencias a
cada longitud de onda, entre el espectro medido y el
calculado. Puede suponerse que si el residual es cero, es
decir si los patrones pueden ajustarse perfectamente al
espectro medido, la ley de Beer y la ley de aditividad se
86
cumplen en el sistema en estudio. Si la desviación estándar

del residual no es cero, el modelo teórico no refleja el
sistema en estudio ya que una de las leyes no se obedece o
porque está presente un componente para el que no hay
patrón de calibración. En la práctica, sin embargo, el
residual nunca es cero y debe determinarse empíricamente
el valor aceptable para un análisis, utilizando resultados
analíticos que cumplan los requisitos de exactitud y
precisión.
Exactitud La exactitud de un método es el grado de acuerdo entre el

resultado de un test individual generado por el método y el
valor verdadero.16 (Vea en el Apéndice A una explicación
de la diferencia entre exactitud y precisión).
Para determinar qué valor o valores de longitud de onda dan
lugar a la mejor exactitud, se miden los espectros de un
grupo de patrones y se construyen curvas de calibración a
todas las longitudes de onda, como se describió
anteriormente. Se requiere, entonces, una muestra de
concentración conocida. Esta muestra es, idealmente, una
en la que se haya determinado la concentración del analito
utilizando una técnica diferente. Sin embargo, si no se
dispone de esta muestra, puede prepararse una sintética
que contenga un peso conocido. Se mide el espectro de la
muestra, se realiza la cuantificación y se compara con el
valor conocido. Una representación gráfica de los
resultados cuantitativos frente a la longitud de onda,
permite una rápida evaluación.
La Figura 59 muestra los resultados de un colorante
amarillo. Aunque tendría que haberse fijado la longitud de
onda analítica a 414 nm utilizando métodos tradicionales,
aquellos valores que dan lugar a la mejor exactitud están en
la región de los 400 nm.
87
Absorbancia [UA]
Concentración
Concentración medida Rango

Concentración real óptimo
Figura 59
Selección de las longitudes de onda para la mejor exactitud
Como el ruido puede influir en la exactitud de una medida,

es preferible realizar una serie de medidas sobre la muestra
y calcular la media. Este método reduce la contribución del
ruido a errores en la exactitud.
Sin embargo, en análisis multicomponente con rangos
espectrales, no puede deducirse el rango óptimo de
longitud de onda utilizando una técnica tan simple. En su
lugar, debe determinarse el mejor rango a través de un
proceso de tanteo del rango de longitud de onda y
comparando los resultados calculados con los valores
actuales.
Precisión La precisión de un método es el grado de acuerdo entre los

resultados de los tests individuales cuando el
procedimiento se aplica repetidamente a múltiples
muestreos.16 (Vea en el Apéndice A una explicación de la
diferencia entre exactitud y precisión).
Para determinar la precisión se requiere un valor estadís-
tico. La desviación estándar, el porcentaje de desviación
88
estándar relativa (obtenido dividiendo la desviación

estándar por la media y multiplicando por 100) y el intervalo
de confianza, son las funciones más populares para valorar
la precisión o repetitividad de un grupo de medidas.
Para determinar la precisión de un método, se preparan un
grupo de unas 10–20 muestras con la misma concentración.
Entonces, se miden estas muestras y se calcula la cantidad
de analito. La desviación estándar de los resultados es una
medida de la precisión. La Figura 60 muestra un ejemplo de
la dispersión de los resultados y de la desviación estándar
que pueden esperarse de un buen análisis.
Valor [mg/l]
Media = 31.41 mg/l

Desviación estándar = 0.022 mg/l
Número de medidas
Figura 60
Determinación de la precisión de un análisis
Si no se obtiene el nivel deseado de precisión, deben

utilizarse técnicas de reducción de ruido como promedio de
longitud de onda, promedio de tiempo y referencia interna,
para mejorar los valores. Pueden aplicarse las mismas
técnicas en análisis multicomponente.
Sensibilidad Sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una

determinada cantidad de analito y, a menudo, se indica
mediante dos factores analíticos: el límite de detección
(LOD) y el límite de cuantificación (LOQ).16
89
El LOD es la concentración más baja del analito que puede

ser detectada pero no necesariamente cuantificada, en
matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que
la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la
medida. Los resultados de las medidas de algunos
espectrofotómetros listan las desviaciones estándar
basadas en el ruido de la medida. El LOD es,
aproximadamente, tres veces la desviación estándar.
El LOQ es la concentración más baja del analito que puede
determinarse con una precisión y exactitud aceptables, en
matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse
los límites aceptables de precisión y exactitud (que
dependen de los objetivos del análisis). Entonces, pueden
utilizarse las herramientas descritas anteriormente, para
determinar los límites aceptables.
A menudo se supone que la longitud de onda con la máxima
absorbancia da lugar a la mejor sensibilidad. Sin embargo,
como el ruido instrumental puede variar significativamente
con la longitud de onda, esto no siempre es necesariamente
cierto. Un método mejor de determinar el valor o valores de
longitud de onda de sensibilidad óptima, es medir el
espectro de una muestra de baja concentración, varias
veces. Se calculan, entonces, la media y el porcentaje de
desviación estándar relativa de los valores medidos a cada
longitud de onda. El valor de λ con el porcentaje de
desviación estándar relativa más bajo, probablemente dará
lugar a la mejor sensibilidad. La Figura 61 ilustra esta
técnica para un colorante amarillo. Aunque las longitudes
de onda entre 400 y 450 nm ofrecen una sensibilidad
excelente, la mejor se obtiene a 220 nm.
90
Absorbancia [UA]
Rango
% RSD
óptimo
Figura 61
Selección de las longitudes de onda de mejor sensibilidad
En análisis multicomponente, puede utilizarse esta técnica

para identificar los valores óptimos de longitud de onda
para cada componente. Estas λ pueden aplicarse
directamente en el método de ecuaciones simultáneas
simples o como una guía del rango óptimo de longitud de
onda, en el método de mínimos cuadrados.
Rango Rango es el intervalo entre (e incluidos) los niveles

superior e inferior del analito, que han sido calculados
con la precisión, exactitud y linealidad requeridos.16
El rango se determina analizando primero, muestras que
contengan distintas concentraciones del analito y, a
continuación, utilizando las herramientas descritas
anteriormente para calcular la linealidad, precisión y
exactitud de los resultados.
Selectividad Selectividad es la capacidad de un método para

cuantificar con exactitud y especificamente al analito o
analitos, en presencia de otros compuestos.16
91
La presencia de cualquier otro compuesto que absorba a la

longitud de onda utilizada para cuantificar el analito,
resultará en un error cuantitativo. Estos otros compuestos
pueden ser precursores de la síntesis, impurezas conocidas,
excipientes o productos de degradación de la matriz. Si el
tipo de interferencia es conocido, la persona que desarrolla
el método puede examinar los espectros del analito y de la
interferencia, para seleccionar una longitud de onda a la
que el analito tenga una absorbancia significativa pero a la
que sea pequeña la de la interferencia. Si la elección de λ no
evita lo suficiente el efecto de la interferencia, puede
aplicarse una técnica de corrección apropiada, como el uso
de una longitud de onda de isoabsorbancia (vea
“Isoabsorbancia” en la página 72).
Si la identidad y/o los espectros de las posibles
interferencias son desconocidos, puede utilizarse un
método empírico casi idéntico al descrito anteriormente,
para determinar qué longitud o longitudes de onda darán
lugar a la mejor exactitud. En este caso, las muestras de test
deben contener la interferencia. Si se conoce la
concentración del analito en la muestra, la longitud de onda
que dé el resultado más cercano al valor conocido, será la
correspondiente a la mejor selectividad (las impurezas
siempre añaden absorbancia, causando resultados
erróneamente elevados).
En el ejemplo de la Figura 62, la muestra de colorante
amarillo ha sido contaminada con un colorante rojo. La
representación de la concentración frente a la longitud de
onda muestra que las λ entre 390 y 420 nm dan lugar a la
mejor selectividad. Observe que, debido al contaminante, el
rango del error de exactitud es mucho más amplio que para
el colorante amarillo puro (Figura 59).
92
Absorbancia [UA]
Concentración [mg/l]
Concentración medida Rango

Concentración real óptimo
Figura 62
Selección de la longitud de onda para la mejor selectividad
Robustez Robustez es el grado de reproducibilidad de los resultados

de test, obtenidos analizando las mismas muestras bajo
varias condiciones normales de test.16
El método no debe afectarse por cambios de tiempo o lugar.
La reproducibilidad del método debe establecerse en varias
condiciones, por ejemplo con diferentes lotes de reactivos,
a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos de
prueba.
La robustez de un método analítico se determina analizando
submuestras de una muestra homogénea, en diferentes
laboratorios y con equipos distintos. Estos tests deben
realizarlos diferentes analistas bajo condiciones
operacionales y medioambientales que pueden variar, pero
que estarán dentro de los parámetros especificados para el
método. El grado de reproducibilidad de los resultados se
calcula, entonces, como una función de las variables del
ensayo. Este valor puede compararse con la precisión del
método en condiciones normales para obtener una medida
de su robustez.
93
Requisitos En el desarrollo de un método analítico, son valiosos los

instrumentales datos espectrales completos, aunque no esenciales, para la
evaluación de todas las opciones posibles. La
reproducibilidad de longitud de onda del instrumento
también debe ser excelente para no restringir la elección de
la longitud o longitudes de onda. Un espectrofotómetro que
mide automáticamente espectros múltiples y calcula los
valores medio y de desviación estándar para cada
absorbancia, puede mejorar la productividad en gran
medida. Finalmente, el software instrumental debe ser
capaz de procesar una gran cantidad de datos y utilizar las
herramientas estadísticas apropiadas. Los cálculos
manuales o la transferencia de los datos desde el
espectrofotómetro a otras aplicaciones para su evaluación,
limitan seriamente la productividad.
Validación del Cualquier método analítico diseñado para ser utilizado en

método un entorno que cumpla las normativas, como un laboratorio
de control de calidad farmacéutico, debe ser validado. La
validación del método es el proceso para determinar si las
características de rendimiento son adecuadas para el
propósito que se pretende.
La Farmacopea de Estados Unidos (USP) contiene guías
para la validación del método.17 Esta validación es similar
al desarrollo del método que incluye estudios sobre
especificidad, linealidad, exactitud o recuperación,
sensibilidad y precisión o reproducibilidad. Sin embargo, la
validación debe realizarse separadamente del desarrollo y
la validación del método.16 Mientras que el desarrollo del
método implica la selección de parámetros y condiciones
específicos, la validación se utiliza para confirmar que las
características de rendimiento del método están de acuerdo
con la aplicación pretendida de los estudios del laboratorio.
94
capítulo 5
capítulo 5 Operación de
rutina
95
Operación de rutina
La espectroscopía UV-visible se considera una técnica
de rutina y ampliamente utilizada en QA/QC y labora-
torios similares. Sin embargo, ni las consideraciones
tratadas en los capítulos previos ni el mejor
desarrollo de método, garantiza buenos resultados.
Este capítulo revisa las etapas para asegurar
resultados exactos y precisos regularmente y, quizás
más importante, para detectar resultados erróneos.
Verificación del En los últimos años, las normas de calidad indicadas por la
rendimiento del ISO 9000 (BS 5750), las Buenas Prácticas de Laboratorio
(GLP), las Buenas Practicas de Fabricación (GMP) y el
instrumento United Kingdom National Measurement Accreditation
Service (NAMAS) han cobrado una gran importancia. Como
consecuencia, en la industria farmacéutica, las recomen-
daciones contenidas en las farmacopeas también han
alcanzado mayor influencia. La verificación del rendimiento
continuo y apropiado de los espectrofotómetros UV-visible,
es un elemento clave de estos requisitos de calidad.
Parámetros de test Aunque no hay una definición clara sobre qué parámetros
deben probarse para verificar el rendimiento del
instrumento, los fabricantes y usuarios, generalmente,
están de acuerdo en que deben incluirse los criterios
descritos a continuación.
96
Exactitud y precisión de La exactitud de longitud de onda es el criterio de rendi-

longitud de onda miento más importante para diferenciar espectros, cuando
se miden en instrumentos distintos. También es importante
en el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de
extinción o factores. Debido a que estos factores dependen
de la longitud de onda, las medidas deben realizarse a
exactamente la misma λ a la que los factores se determi-
naron originalmente. Cuando se comparan espectros o
valores de absorbancia medidos en el mismo instrumento
(como en la mayoría de los análisis cuantitativos en los que
se mide un patrón), sin embargo, la precisión de longitud de
onda es el parámetro crítico (vea “Exactitud y precisión de
longitud de onda” en la página 50).
Para medir la exactitud y precisión de longitud de onda, se
requiere un patrón de referencia. Idealmente, este patrón
debería tener picos bien definidos y muy estrechos, a una
serie de longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y
visible, como se muestra en la Figura 63. Este patrón ideal
no existe, aunque algunos se aproximan. Para los patrones
actuales de exactitud de longitud de onda, como los picos
no son idealmente simétricos, los cambios en la anchura de
la rendija del instrumento afectarán ligeramente a la
posición medida de los picos.
Patrón de absorbancia
Patrón de
Absorbancia [UA]
longitud de onda
Figura 63
Espectros ideales de patrones de absorbancia y longitud de onda
97
Exactitud y precisión La exactitud fotométrica es el criterio más importante para

fotométrica el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de
extinción o factores. Sin embargo, para medidas
comparativas (como las anteriores), la precisión
fotométrica es el parámetro crítico (vea “Exactitud y
precisión fotométrica” en la página 51).
Es necesario un patrón de referencia para medir la
exactitud y la precisión fotométrica. Idealmente, este
patrón tendría absorbancia constante a todas las longitudes
de onda a lo largo de los rangos UV y visible (Figura 63), de
manera que un error de exactitud de longitud de onda no
afecta a los resultados. En la práctica, no existe tal patrón,
aunque los cristales de densidad neutra se aproximan al
ideal en el rango de longitud de onda visible. Los patrones
utilizados, típicamente, tienen picos anchos y valles.
Luz dispersa La luz dispersa es el factor que más afecta a la relación

lineal entre la absorbancia y la concentración a
absorbancias elevadas. Introduce una predisposición
sistemática a menores absorbancias en concentraciones
crecientes. La luz dispersa es también la influencia principal
en el límite superior del rango dinámico lineal para un
análisis (vea “Luz dispersa” en la página 51).
Para medir la luz dispersa, es necesario un filtro.
Idealmente, este filtro absorbería toda la luz de la longitud
de onda a la que que se va a realizar la medida y transmitiría
las longitudes de onda superiores o inferiores (los orígenes
de la luz dispersa, como se muestra en la Figura 64). En la
práctica, sin embargo, este filtro no existe. En su lugar se
utilizan filtros de corte que transmiten toda la luz por
encima o por debajo de una determinada longitud de onda y
que bloquean toda la luz en un rango particular de λ.
98
Transmitancia [%]
Figura 64
Espectro ideal de un filtro de luz dispersa
Resolución La resolución es un factor crítico en la determinación de la

forma de los picos. En general, la resolución instrumental
debe ser aproximadamente 10 veces mejor que la anchura
de banda del pico medido. Si la resolución instrumental no
es suficiente, la absorbancia medida en el máximo de
longitud de onda será demasiado baja. Por consiguiente, la
exactitud fotométrica tiene una predisposición sistemática.
Esta predisposición juega un papel clave si es esencial la
exactitud absoluta pero, como se trata en “Resolución
espectral” en la página 46, es menos importante para
medidas relativas como las de cuantificación.
Medir la resolución es difícil y, a menudo, se utilizan
métodos empíricos como la medida de alturas relativas de
picos y valles, para una muestra con una banda estrecha
(vea “Resolución” en la página 110).
Ruido El ruido es el factor principal que afecta a la precisión de las

medidas de absorbancia. Es especialmente significativo a
bajas absorbancias, a las que suele determinarse el límite de
detección (vea “Ruido” en la página 52).
El ruido se mide, normalmente, a absorbancia cero, es
decir, sin muestra en el paso de luz.
99
LLanura de la línea de base Medir el ruido a todas las longitudes de onda, normalmente,
no es practicable. Sin embargo, la llanura de la línea de base
indica el ruido relativo a todas las longitudes de onda y
revela aquellas con problemas instrumentales resultantes
del cambio de filtro o fuente, por ejemplo.
La llanura de línea de base se mide, normalmente, a
absorbancia cero.
Estabilidad La estabilidad afecta a la exactitud de las medidas de

absorbancia en función del tiempo. La deriva de las
medidas de absorbancia introduce errores sistemáticos en
la exactitud fotométrica (vea “Deriva” en la página 55).
La estabilidad se mide, normalmente, a absorbancia cero.
Linealidad La linealidad a menudo se considera importante para

verificar el rendimiento. Pero debido a que depende mucho
de la muestra, creemos que se mide mejor durante un test
de idoneidad del sistema, como se describe posteriormente.
El problema principal en la verificación del rendimiento es
que todos los parámetros listados anteriormente dependen
de la longitud de onda y, en el caso de la luz dispersa, de la
muestra. Como no es práctico realizar todos los tests a
todas las λ, deben seleccionarse algunas representativas
para el propósito pretendido. Los resultados de estos tests
deben compararse con las especificaciones absolutas de
rendimiento para los métodos en uso. La verificación
demostrará, entonces, eficazmente, si las características de
rendimiento han cambiado de manera que pudiera afectar a
la bondad de los resultados analíticos.
Cumplir los criterios anteriores (determinados utilizando
patrones de referencia) no garantiza, sin embargo, que un
deteminado análisis pueda realizarse con la exactitud y
linealidad requeridas. Debido a que muchos parámetros
dependen de la muestra, la exactitud y linealidad deseadas
sólo pueden lograrse con un test apropiado de idoneidad
del sistema, realizado sobre la propia muestra.
100
Patrones Una discusión detallada sobre todos los patrones y sus

ventajas y desventajas relativas, está fuera del objetivo de
este libro. Existen varias publicaciones excelentes que
cubren estos temas en profundidad.18,19 A continuación
encontrará algunos comentarios generales sobre los
méritos relativos de los tres tipos principales de patrones.
Patrones de emisión Ciertas fuentes de emisión, como las lámparas de mercurio

y deuterio, exhiben líneas agudas a longitudes de onda
específicas que son ideales para los test de exactitud y
precisión de longitud de onda. De hecho, en muchos
espectrofotómetros modernos, se utilizan las líneas de
deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente incorporada, para
comprobar y recalibrar la exactitud de longitud de onda. Sin
embargo, las fuentes de emisión requieren alimentación
eléctrica y, si el instrumento ha sido auto-calibrado
utilizando su lámpara de deuterio, debe utilizarse otro
patrón para verificación. Además, debido a que las fuentes
de emisión no son muestras típicas, no prueban el sistema
completo.
Patrones sólidos de Los patrones sólidos no requieren ninguna preparación, son

absorción fáciles de usar y mantener, son relativamente insensibles a
la temperatura y tienen una buena estabilidad con el
tiempo. Sin embargo, con patrones sólidos no puede
asegurarse la homogeneidad de un patrón a otro o entre
lotes. Por lo tanto, debe calibrarse cada patrón indivi-
dualmente en un espectrofotómetro de referencia. Debido a
que este proceso implica cierto tiempo, los patrones sólidos
tienden a ser caros. Además, como los patrones sólidos no
son absolutamente estables, deben devolverse para ser
recalibrados, con regularidad. Por último, estas muestras
deben mantenerse escrupulosamente limpias y no pueden
utilizarse para probar sistemas de flujo.
101
La Tabla 5 resume algunos de los patrones sólidos más

conocidos, sus usos, sus ventajas y desventajas.
Tabla 5 Algunos patrones sólidos
Patrón Uso Ventajas Desventajas
Cristal de óxido de Patrón de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de La posición de los picos varía de lote a lote
holmio onda 280 a 2000 nm
Cristal de óxido de Patrón de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de La posición de los picos varía de lote a lote
didimio onda 400 a 1920 nm No hay picos por debajo de 400 nm
Granate de neodimio Patrón de longitud de Picos a muchas longitudes de onda de No hay picos por debajo de 350 nm
ytrio aluminio onda 350 a 1000 nm
Cristal de densidad Patrón fotométrico Perfil de absorbancia muy llano en el No es adecuado para el rango UV
neutra rango visible de longitud de onda No es absolutamente estable; debe
recalibrarse regularmente
Metal sobre cuarzo Patrón fotométrico Perfil de absorbancia muy llano en los Problemas frecuentes por error de
rangos UV y visible de longitud de onda interreflexión
Sensible a la temperatura
No es muy estable; debe recalibrarse
regularmente
Patrones líquidos de Estos normalmente son patrones físicos absolutos. En otras

absorción palabras, si se preparan patrones líquidos utilizando mate-
riales puros apropiadamente, poseerán de modo inherente
las propiedades de absortividad, máximos de picos, etc.
requeridos para comprobar la exactitud. Debido a que la
calibración de las disoluciones no es necesaria, los patrones
líquidos pueden ser relativamente baratos. Estos patrones
pueden utilizarse también para comprobar sistemas de
flujo. Además, el proceso de utilizar una disolución como
patrón, es muy similar al de una muestra normal.
La desventaja principal de los patrones líquidos es que, en
general, deben haberse preparado recientemente. Esto
implica tiempo y requiere una razonable habilidad del
operador. Algunos proveedores han intentado solventar
este problema suministrando patrones sellados en cubetas.
Sin embargo, debido a que la propia cubeta contribuye con
102
algo de absorbancia, estos patrones deben calibrarse y

recalibrarse individualmente, lo que incrementa los costes.
Más aún, como los patrones líquidos son menos estables
que los sólidos, deben recalibrarse más a menudo. Ahora
puede disponerse de disoluciones preparadas selladas en
ampollas, para utilizar en cubetas normales, fáciles de
utilizar y de coste adecuado.20
La Tabla 6 resume algunos de los patrones líquidos más
conocidos, sus usos, sus ventajas y sus desventajas.
Tabla 6 Algunos patrones líquidos
Oxido de holmio en ácido Patrón de longitud de Picos a muchas longitudes de onda No hay picos utilizables por encima de
perclórico onda de 240 a 650 nm 650 nm
Oxido de samario en ácido Patrón de longitud de Picos a muchas longitudes de onda No hay picos utilizables por encima de
perclórico onda de 300 a 500 nm 500 nm
Benceno (vapor) Patrón de longitud de Picos muy estrechos de 230 a 260 nm Rango muy limitado de longitud de
onda onda
Dicromato potásico en ácido Patrón fotométrico Picos anchos a 257 y 350 nm y valles No absorbancia en el rango visible
perclórico o sulfúrico anchos a 235 y 313 nm Muy sensible al pH y, como agente
oxidante potente, puede ser inestable
Mezcla de sales de cobalto y Patrón fotométrico Picos a 302, 395, 512 y 678 nm que Bandas más bien estrechas, la exacti-
níquel cubren las regiones UV y visible tud de λ puede afectar a los resultados
Disolución de nitrito sódico (50 g/l) Luz dispersa Cortes a 390 nm Ninguna
Usado para medir luz dispersa a
340 nm o inferior
Disolución de ioduro potásico o Luz dispersa Cortes a 260 nm Tendencia a descomponerse

sódico (10 g/l) Usado para medir luz dispersa a
200 nm o inferior
103
Tabla 6 Algunos patrones líquidos
Disolución de cloruro potásico Luz dispersa Cortes a 200 nm Como la medida se realiza en el lateral
(12 g/l) Usado para medir luz dispersa a de la pendiente de corte, los errores de
220 nm o inferior exactitud de λ pueden afectar a la
medida de luz dispersa
Tolueno en hexano Resolución Fácil método empírico usando pico Sólo puede usarse para determinar la
(269 nm) y valle (266 nm) del resolución en un punto del espectro.
espectro del tolueno Puede variar con λ
Requisitos de las En la sección siguiente se revisan algunos de los requisitos

normas más importantes de las normativas que regulan el uso de los
espectrofotómetros UV-visible.
GLP/GMP Los requisitos de las GLP y GMP para la validación de

instrumentos, puede resumirse como sigue:
Verificación documentada de que el sistema o subsistema
funciona como se pretende en rangos operativos
representativos o anticipados.21
Para espectroscopía, se indica la siguente recomendación:
Donde sea apropiado, deben llevarse a cabo controles
periódicos del rendimiento (por ejemplo, ... la resolución,
alineamiento y exactitud de longitud de onda de los
espectrofotómetros, etc.).22
Farmacopea europea Los requisitos que regulan los espectrofotómetros

UV-visible utilizados para análisis farmacéutico en Europa,
están contenidos en la Farmacopea Europea (EP).23 Estos
requisitos se basan y prácticamente son idénticos a aquellos
listados en las farmacopeas nacionales como la Británica
(BP) y la Alemana (DAB):
Control de longitudes de onda—Verificar la escala de λ
utilizando los máximos de absorción de una disolución de
perclorato de holmio, la línea de una lámpara de descarga
104
de hidrógeno o deuterio o las de arco de vapor de mercu-

rio, mostradas a continuación. La tolerancia permitida es
± 1 nm para el ultravioleta y ± 3 nm para el visible.
241.15 nm (Ho) 404.66 nm (Hg)
253.70 nm (Hg) 435.83 nm (Hg)
287.15 nm (Ho) 486.00 nm (Dβ)
302.25 nm (Hg) 486.10 nm (Hβ)
313.16 nm (Hg) 536.30 nm (Ho)
334.15 nm (Hg) 546.07 nm (Hg)
361.50 nm (Ho) 576.96 nm (Hg)
365.48 nm (Hg) 579.07 nm (Hg)
Control de absorbancia—Comprobar la absorbancia
utilizando disolución de dicromato potásico R a las
longitudes de onda indicadas en la siguiente tabla, que
muestra para cada longitud de onda el valor exacto de A
(1 por ciento, 1 cm) y los límites permitidos.
Longitud de onda
(nm) A (1 por ciento, 1 cm) Tolerancia máxima
235 124.5 122.9 a 126.2
257 144.0 142.4 a 145.7
313 48.6 47.0 a 50.3
350 106.6 104.9 a 108.2
Límite de luz dispersa—La luz dispersa puede

detectarse a una longitud de onda dada, con filtros o
disoluciones adecuados: por ejemplo la absorbancia de
una disolución de cloruro potásico R del 1.2 por ciento
m/V en una cubeta de 1 cm, debe ser mayor de 2 a 200 nm
al compararla con agua como líquido de compensación.
Poder de resolución—Cuando se indique en una
monografía, mida la resolución del aparato como sigue:
105
registrar el espectro de una disolución de tolueno R al

0.02 % V/V en hexano R. La relación mínima de la
absorbancia en el máximo a 269 nm, a aquella en el
mínimo a 266 nm, se indica en la monografía.
NOTA: La BP indica que la relación debe “... no ser inferior
a 1.5 a no ser que se indique lo contrario en la monografía.”
Farmacopea de En los Estados Unidos, los requisitos para los

Estados Unidos espectrofotómetros UV-visible no están tan claramente
definidos como en Europa. La Farmacopea24 de Estados
Unidos (USP) XII, Sección 831 (“Espectrofotometría y
dispersión de luz”) dice:
Comprobar la exactitud de la calibración del instrumento.
... La escala de longitud de onda puede calibrarse también
por medio de filtros adecuados de cristal, con bandas de
absorción útiles en las regiones visible y ultravioleta. Han
sido ampliamente utilizados cristales patrón con didimio
(una mezcla de praseodimio y neodimio). El cristal con
contenido de holmio se considera superior.
Para comprobar una escala fotométrica, puede disponerse
de varios filtros patrón de cristal inorgánico, así como
disoluciones patrón de transmitancia conocida, como
cromato o dicromato potásico.
Este último contiene una referencia cruzada:
Para más detalles relativos a los controles de las escalas de
longitud de onda y fotométricas de un espectrofotómetro,
pueden consultarse las siguientes publicaciones del
National Institute of Standards and Technology ...
El National Institute of Standards and Technology (NIST)
indica varios patrones sólidos y líquidos para determinar la
106
exactitud de longitud de onda, exactitud fotométrica y luz

dispersa.25 La Tabla 7 resume los más importantes.
Tabla 7 Patrones NIST
SRM # Tipo Descripción NIST
930 Filtros de cristal de densidad Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de transmitancia y absorbancia de
neutra espectrofotómetros de absorción visible.
931 Disolución de cobalto y níquel en Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de absorbancia de
mezcla de ácido nítrico y espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible con pasos de banda estrechos.
perclórico
935 Dicromato potásico sólido para Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de absorbancia de
preparar la disolución de test espectrofotómetros de absorción ultravioleta.
2031 Metal sobre cuarzo Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de transmitancia y absorbancia de
espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible.
2034 Disolución de óxido de holmio en Este SRM es para utilizar en la verificación y calibración de la escala de longitud de onda de
ácido perclórico espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible con anchuras de banda espectral
nominal que no exceden 3 nm.
2032 Ioduro potásico sólido para Este SRM se utiliza en la valoración de la energía radiante dispersa heterocrómica (luz dispersa)
preparar la disolución de test en espectrofotómetros de absorción ultravioleta.
Métodos americanos de test La American Standard Testing Methods (ASTM)26 publica

estándar métodos de test para medir las características clave del
rendimiento, de los espectrofotómetros UV-visible:
Exactitud y precisión de longitud de onda: determinada
utilizando una lámpara de descarga de vapor de mercurio
(región UV), una lámpara de arco de deuterio o hidrógeno
(región visible), vapor de benceno (región UV), o cristal de
óxido de holmio o disolución de perclorato de holmio
(regiones UV y visible). La ASTM recomienda que las
longitudes de onda de calibración utilizadas, “encierren” a
la longitud de onda analítica.
Linealidad: determinada preparando una curva de trabajo
analítica con el analito de interés (vea “Idoneidad del
sistema” en la página 115).
107
Exactitud fotométrica: determinada utilizando patrones

NIST 930, 2031 o 935.
Precisión fotométrica: determinada utilizando una
pantalla metálica o un filtro adecuado de cristal.
La importancia de la anchura de la rendija y la resolución se
menciona en la documentación ASTM, pero no se indica
ningún método práctico para medir estos parámetros. Una
publicación ASTM adicional27 describe los patrones y
procedimientos para medir la luz dispersa.
La Tabla 8 resume los requisitos y recomendaciones de
varios estamentos reguladores.
Tabla 8 Parámetros de test y patrones usados por las principales agencias reguladoras
NIST
Tipo de test Patrón USP SRM EP ASTM
Exactitud de Solución de perclorato de holmio — 2034 S X

longitud de onda
Cristal de óxido de holmio X — — X
Lámpara de arco de deuterio X — S X
Lámpara de arco de mercurio X — S X
Vapor de benceno — — — X
Exactitud Disolución de dicromato potásico X 935 S X

fotométrica y
linealidad Cristal de densidad neutra — 930 — X
Solución sales de cobalto y níquel — 931 — X
Metal sobre cuarzo — 2031 — X
Luz dispersa Disolución de cloruro potásico — — S X
Disolución de ioduro potásico — 2032 — —
Disolución de ioduro sódico — — — X
Disolución de nitrito sódico — — — X
Resolución Tolueno en disolución de hexano — — S —
USP: Sólo método de test
108
NIST SRM: Material patrón y método de test

EP: Método de test y especificación de rendimiento mínimo
ASTM: Sólo método de test
La elección de patrones depende de los análisis a realizar en

el instrumento. Está condición está señalada en los
requisitos GLP, de manera que la verificación debe
realizarse para los rangos de operación pretendido y
anticipado; en las recomendaciones ASTM, de manera que
las longitudes de onda utilizadas para calibración encierren
la longitud de onda analítica; y en las normas NIST. Así por
ejemplo, si el propósito es medir la absorbancia en la región
UV (como en la mayoría de los análisis farmacéuticos), la
exactitud fotométrica debe verificarse no en el rango visible
sino en el UV, preferiblemente a varias longitudes de onda.
De modo similar, no es apropiado verificar la exactitud de
longitud de onda sólo en la línea del deuterio 656.1 nm, ya
que éste no es un indicador fiable de la exactitud de
longitud de onda en la región UV.
Recomendaciones Aunque no hay un grupo definitivo de patrones para

verificar el rendimiento de un espectrofotómetro, se
recomiendan los siguientes tests para aquellos usuarios que
analizan, principalmente, muestras líquidas y que necesitan
cumplir con los requisitos generales de las normas.
Exactitud de longitud de onda: disolución de perclorato
de holmio (40 g/l óxido de holmio en ácido perclórico al
10 % v/v). La Figura 65 muestra el espectro de esta
disolución, medido en un espectrofotómetro Agilent 8453.
109
Absorbancia [UA]
Figura 65
Espectro de disolución de perclorato de holmio
La Tabla 9 muestra los valores especificados por el NIST

para los picos de referencia utilizables para tres anchuras
de banda espectral instrumental (SBWs) diferentes. Estos
valores son preferibles a los EP ya que éstos no especifican
110
la SBW ni la temperatura utilizada y porque los valores EP y

NIST exhiben una discrepancia significativa.
Tabla 9 Valores NIST para picos de disolución de perclorato de holmio28
SBW
0.5 nm 1.0 nm 2.0 nm
241.01 241.08 240.90
249.79 249.87 249.98
278.13 278.10 278.03
287.01 287.18 287.47
333.43 333.44 333.40
345.52 345.47 345.49
361.33 361.31 361.16
385.50 385.66 385.86
416.09 416.28 416.62
— 451.30 451.30
467.80 467.83 467.94
485.27 485.29 485.33
536.54 536.64 536.97
640.49 640.52 640.48
Exactitud fotométrica: disolución de dicromato potásico

(aproximadamente 60 mg/l en ácido sulfúrico 0.01N). La
Figura 66 muestra el espectro del dicromato potásico. Los
valores EP para este patrón, se presentan en la página 104.
111
Absorbancia [UA]
Figura 66
Espectro del dicromato potásico
Si las medidas van a realizarse en la región visible, se

aconseja realizar test adicionales con filtros de cristal de
densidad neutra, como el NIST SRM 930.
Luz dispersa: disoluciones de nitrito sódico (50 g/l), ioduro
sódico (10 g/l) y cloruro potásico (12 g/l) en agua. Estas tres
disoluciones permiten la medida de luz dispersa a tres
longitudes de onda diferentes. La Figura 67 muestra los
espectros de estas disoluciones. En general, se
recomiendan nitrito sódico e ioduro sódico o potásico, pero
para aquellos usuarios que necesiten cumplir con los
requisitos de la EP, también puede ser necesario cloruro
potásico.
112
Transmitancia [%]

Figura 67
Espectros de disoluciones patrón de luz dispersa
Resolución: disolución de tolueno en hexano (0.02 % v/v),

según se especifica en la EP. La Figura 68 representa el
espectro de esta disolución.
Absorbancia [UA]
Figura 68
Espectro de tolueno en hexano
La resolución se estima tomando la relación de la absor-

bancia en el máximo cercano a 269 nm, a aquella en el
mínimo próximo a 266 nm. Esta relación está empíri-
113
camente relacionada con la SBW, como se muestra en la

Tabla 10.29
Tabla 10 SBW y relación 269/266 nm (tolueno)
Relación de la absorbancia a
269 nm a la absorbancia a
SBW (nm) 266 nm
0.25 2.30
0.50 2.20
1.00 2.00
2.00 1.40
3.00 1.10
4.00 1.00
También deben medirse con el área de muestra limpia, el

ruido, llanura de la línea base y deriva. No se requieren
patrones.
Autotest del La verificación completa del rendimiento de un

instrumento espectrofotómetro, necesita tiempo y por consiguiente,
normalmente sólo se realiza a intervalos periódicos. Estos
intervalos se determinan de acuerdo con la estabilidad del
instrumento. Para asegurar que se detecta cualquier
desviación del rendimiento que ocurra entre verificaciones
regulares, el instrumento debe estar equipado con rutinas
auto-test que puedan ejecutarse diariamente. Estas rutinas
deben incluir un control de la operación electrónica y
óptica del espectrofotómetro, así como controles de
exactitud de longitud de onda con una o ambas líneas de la
lámpara de deuterio.
114
Idoneidad del La idoneidad del sistema está diseñada para evaluar los
sistema componentes del sistema analítico, para verificar que el
rendimiento del sistema cumple los estándares requeridos
por el método. La idoneidad del sistema no debe
confundirse con la validación del método. Mientras la
validación se realiza una vez al finalizar el desarrollo del
método, los tests de idoneidad del sistema se ejecutan
periódicamente para determinar si todo es adecuado y/o su
eficacia. Los requisitos de idoneidad del sistema están bien
definidos para los sistemas cromatográficos pero no para
los sistemas de espectroscopía UV-visible.
En la práctica, los analistas han desarrollado sus propias
estrategias para realizar los test de idoneidad del sistema en
instrumentos UV-visible. Dos ejemplos son:
A. Medir y calibrar utilizando un patrón de concentración
igual al 100 % de la concentración del componente
esperado. Entonces, medir y cuantificar el patrón diluido
por un factor de dos. Los resultados de ambas muestras
deben caer dentro de un porcentaje especificado de la
concentración conocida. Volver a medir el patrón confirma
la exactitud de la medida inicial.
B. Primero medir el patrón y a continuación, una serie de
diluciones del mismo y calcular el coeficiente de extinción
(absorbancia dividida por concentración) para cada
concentración. Los valores de los coeficientes de extinción
no deben variar más de un porcentaje especificado.
Operación Sin embargo, buenas medidas del control de calidad, como

apropiada test de verificación del rendimiento del instrumento y
validación del método, así como resultados exactos y
precisos, dependen en gran medida del factor humano.
Aunque este factor no puede eliminarse nunca, pueden
tomarse ciertas medidas para reducir el error humano.
115
Almacén electrónico Los espectrofotómetros modernos están casi todos

controlados por microprocesador u ordenador y ofrecen un
almacenaje electrónico de los parámetros de métodos.
Idealmente, todos los parámetros importantes deben
almacenarse en un solo fichero de método, con un nombre
único. Cuando el operador introduce el nombre del método,
todos los parámetros deben fijarse automáticamente,
eliminando errores potenciales. En particular los entornos
regulados, se beneficiarán de un sistema que evita que los
operadores cambien parámetros de los métodos o que
mantienen un seguimiento e informan de cualquier cambio.
Procedimientos Aunque los espectrofotómetros pueden almacenar y, auto-

estándar de operación máticamente, fijar parámetros, algunos procesos (como
vaciar, enjuagar y llenar cubetas) debe realizarlas el
operador, pudiendo introducir errores. Los operadores
deben estar entrenados en estos procesos y todos los pasos
deben estar documentados con las instrucciones de trabajo.
En un entorno regulado, estos pasos se conocen como
procedimientos estándar de operación (SOP).
Datos colaterales Pueden obtenerse errores o resultados incorrectos, a pesar

de usar la mejor instrumentación, del desarrollo y valida-
ción del método y del entrenamiento del operador. Por
ejemplo, la muestra puede estar contaminada. Mientras un
resultado incorrecto no es necesariamente problemático,
puede tener serias consecuencias el no darse cuenta. La
mayoría de los resultados analíticos obtenidos por
UV-visible se basan en una medida a una longitud de onda.
Con un punto, prácticamente no hay modo de detectar si un
resultado es sospechoso, a menos que sea un resultado
típico y que el actual se desvíe significativamente del valor
conocido. Datos colaterales y medidas múltiples a una λ o
(preferiblemente) a múltiples, puede ayudar a asegurar que
un resultado es correcto. Los datos también pueden
utilizarse para investigar la razón del error.
116
Longitudes de onda de Un modo sencillo de verificar resultados analíticos

confirmación cuantitativos es a través del análisis de confirmación. En
este, se mide la absorbancia a una o más longitudes de
onda, además de a la λ analítica, tanto de patrones como de
muestras. Se realiza la cuantificación a todas las longitudes
de onda analíticas. Si la muestra es pura, los resultados a la
λ analítica y a la longitud o longitudes de onda de
confirmación, será idéntica. Si la muestra está
contaminada, es muy probable que el contaminante
contribuya de modo diferente a la absorbancia a las
longitudes de onda analítica y de confirmación, difiriendo
los resultados. En la Figura 69 se muestra un ejemplo. El
análisis de confirmación también puede utilizarse para
detectar si se ha medido la muestra correcta y si las
medidas están fuera del rango dinámico lineal del
instrumento.
Cafeína
Absorbancia [UA]
Acido salicílico

Figura 69
Análisis de confirmación
Espectros completos Para resultados óptimos, deben adquirirse los espectros

completos de la muestra. Estos espectros pueden
superponerse con los del patrón para comprobar las
117
diferencias, o pueden utilizarse métodos matemáticos para

obtener un factor de coincidencia, que indicará la similitud
entre muestras y patrones. El factor de coincidencia se
obtiene representando los valores de absorbancia a cada
longitud de onda de la muestra, frente a los del patrón. Si
los espectros son idénticos, los puntos representados
estarán sobre una línea recta. La pendiente de esta línea es
la relación de la concentración de la muestra a la del patrón.
Si los espectros no son idénticos, los puntos no estarán en
una línea recta, sino que mostrarán cierta dispersión. La
Figura 70 muestra gráficos de ambos casos. En los dos,
puede utilizarse regresión lineal para ajustar la mejor línea y
puede calcularse el coeficiente de correlación. Este
coeficiente es una medida de la similitud de los espectros
de muestra y patrón. Si son exactamente iguales, el
coeficiente de correlación será 1, mientras que si son
completamente distintos, será próximo a 0.
Correlación = 0.999
Normalizado
Patrón
Desconocido
Longitud de onda [nm] Desconocido [mUA]
Desconocido
Correlación = 0.056
Normalizado
Patrón
Longitud de onda [nm] Desconocido [UA]
Figura 70
Gráficos comparativos de espectros similares y distintos
118
Si se utilizan espectros completos, se dispondrá de toda la

información analítica para reevaluar los resultados y para
determinar por qué un resultado es incorrecto.
Estadísticas Una sola medida no tiene un alto grado de validez. Todas las
medidas incluyen cierta predisposición y variación aleatoria
debidas al ruido. Aunque esta predisposición puede
detectarse utilizando técnicas como las descritas
anteriormente, el ruido también puede dar lugar a errores
significativos. Siempre debe estimarse la precisión de los
resultados realizando múltiples medidas y calculando la
media y la desviación estándar de ésta. La desviación
estándar es un indicador de la validez de una medida.
Controlar los cambios de la desviación estándar con el
tiempo, puede ser útil para diagnosticar muchos problemas
de medida.
119
120
apéndice A
apéndice A Exactitud y
precisión
121
Exactitud y precisión
Definición de los Los términos exactitud y precisión se utilizan a lo largo de

términos esta publicación, pero no pueden ser intercambiados. Por lo
tanto, es importante comprender perfectamente la
diferencia entre ellos. Como analogía, la Figura 71 muestra
el resultado de varios disparos de un rifle sobre una diana.
Figura 71
Ejemplo de precisión y exactitud
En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b),

son precisos pero inexactos; el tirador dispara bien, pero es
evidente una desviación constante. En (c), los disparos son
exactos pero imprecisos: la media de los disparos estaría
justo en el centro de la diana, pero cada uno de los tiros se
desvía significativamente. En (d), los disparos son exactos y
precisos.
122
apéndice B
apéndice B Características
de los
espectrofotómetros
de diodos
123
Características de los espectrofotómetros de diodos
Ventajas de la Como fabricante líder de espectrofotómetros de diodos,

espectroscopía de sabemos que esta tecnología ofrece considerables ventajas
sobre los instrumentos convencionales de barrido. En las
diodos secciones siguientes se revisan las ventajas de la tecnología
de diodos y se comentan algunas de las desventajas.
Rápida adquisición La rápida adquisición espectral hace de los espectrofotóme-

espectral tros de diodos la mejor opción para la medida de sistemas
dinámicos, como detectores en el análisis por inyección en
flujo, en control de procesos y medidas cinéticas. Por
ejemplo, la Figura 72 muestra los espectros medidos a
intervalos de 1 s durante una hidrólisis de sultona. Con
estos datos, puede monitorizarse simultáneamente la
desaparición de reactivo y la aparición de producto.
Absorbancia [UA]
Figura 72
Espectros de la hidrólisis de sultona
Para la mayoría de los usuarios de espectrofotómetros

UV-visible que no trabajan con sistemas dinámicos, la
rápida adquisición espectral ofrece también ventajas.
Debido a su rapidez, este método permite la adquisición de
espectros completos incluso cuando el análisis requiere
sólo una longitud de onda. Los datos espectrales completos
124
pueden utilizarse para corregir errores (“Modelar el fondo”,

página 73 y “Espectroscopía derivada”, página 75) y como
información colateral para confirmar la calidad de los datos
(“Espectros completos”, página 117).
Finalmente, pueden obtenerse espectros completos con
alta productividad para el desarrollo de métodos (vea
“Desarrollo del método”, página 82) y para análisis multi-
componente (vea “Análisis multicomponente”, página 21).
Medida multilongitud La mayoría de los equipos convencionales pueden realizar

de onda simultánea medidas multilongitud de onda, pero deben moverse físi-
camente de un punto a otro del espectro, lo que necesita
tiempo. Con un espectrofotómetro de diodos, todos los
puntos del espectro pueden medirse simultáneamente. Por
consiguiente, las medidas multilongitud de onda se realizan
en el tiempo que un instrumento convencional requiere para
medir a una única λ. Esto facilita el uso de varias técnicas
para eliminar errores (vea “Isoabsorbancia”, página 72,
“Referencia interna”, página 74 y “Corrección de tres
puntos”, página 74). Además, proporciona información
colateral para confirmar la calidad de datos (“Longitudes de
onda de confirmación”, página 117) y mejorar la produc-
tividad del método de ecuaciones simultáneas simples
(“Análisis multicomponente”, página 21). En medidas
multilongitud de onda, es necesario almacenar menos datos
que en medidas espectrales completas. Sin embargo, las
técnicas de eliminación de errores son algo menos eficaces
que las que pueden utilizarse con espectros completos.
Utilizando longitudes de onda alternativas para rangos de
concentración alta y baja, puede maximizarse el rango
dinámico con espectrofotómetros de diodos. Los máximos
de absorción pueden utilizarse para medidas de alta
sensibilidad y una longitud de onda con menor absorción,
en el lateral de la banda de absorción, previene de los
errores debidos a la luz dispersa.
Finalmente, un espectrofotómetro de diodos puede
utilizarse en muchas aplicaciones en las que antes se
125
requerían los costosos equipos de doble λ (“Diseño de doble

longitud de onda”, página 45).
Reselección de longitud Los equipos convencionales de barrido mecánico tienen un

de onda error inherente de reselección de λ (“Exactitud y precisión
de longitud de onda”, página 50) que aumenta con el tiempo
según se desgastan las uniones. También son susceptibles
de deriva de longitud de onda en largos periodos de tiempo.
Como en los instrumentos de diodos no se mueve ninguna
pieza en el cambio de λ o en el barrido, no ocurren errores
mecánicos significativos, con el tiempo.
Datos de todas las zonas del espectro, no afectados por
errores de reselección de λ, son una ventaja para el analista.
Permiten seleccionar la longitud de onda óptima para el
mejor rango dinámico, sensibilidad y selectividad en el
desarrollo del método (“Desarrollo del método”, página 82).
Además, es esencial en técnicas de mejora de sensibilidad
que utilizan promedio de λ (“Promedio de longitud de
onda”, página 67), para disminuir la sensibilidad de com-
puestos muy absorbentes (“Absorbancia fuerte”, página 68)
y para verificar la calidad de datos con λ de confirmación
(“Longitudes de onda de confirmación”, página 117). Otras
técnicas que utilizan datos espectrales completos son
análisis multicomponente (“Análisis multicomponente”,
página 72), desarrollo de métodos (“Desarrollo del método”,
página 82), confirmación de calidad de datos (“Longitudes
de onda de confirmación”, página 117) y espectroscopía
derivada (“Derivadas de espectros”, página 6 y
“Espectroscopía derivada”, página 75).
Una excelente reselección de longitud de onda también
asegura que las diferencias entre medidas se deben a la
muestra y no a errores del instrumento. Por tanto, es
posible la identificación incluso cuando los espectros son
prácticamente idénticos pero exhiben una pequeña
variación de λ.
Además, pueden medirse espectros de patrones, almace-
narlos en disco y recuperarlos días, semanas o incluso
126
meses más tarde, para usarlos en análisis cuantitativo sin

tener que volver a medirlos. Esto mejora la productividad,
especialmente es el caso de compuestos caros, difíciles de
obtener o inestables, que no pueden usarse rutinariamente.
Sensibilidad El rango dinámico de un espectrofotómetro de diodos

puede ampliarse a bajos niveles de absorción. Estos
instrumentos son menos complejos y tienen menos
superficies ópticas que los convencionales. Por ello, la
salida de luz es mayor y los niveles de ruido son inferiores.
La capacidad de adquirir espectros completos rápidamente
también ayuda a mejorar la sensibilidad espectral utilizando
técnicas de promedio de tiempo (“Promedio de tiempo”,
página 67) y promedio de λ (ver “Promedio de longitud de
onda”, página 67).
Estadísticas de las Los espectrofotómetros de diodos barren tan rápidamente

medidas que normalmente se realizan múltiples medidas y se
promedian a la vez. Se calcula la media y la desviación
estándar para cada dato. La desviación estándar es una
medida de la fiabilidad de los datos y se obtiene para cada
valor de absorbancia del espectro. Se suele decir que una
sola medida no tiene significado estadístico.12 Sin embargo,
con espectrofotómetros convencionales, obtener múltiples
medidas requiere mucho tiempo.
Los datos estadísticos son una valiosa herramienta para
evaluar la calidad de los resultados analíticos
(“Estadísticas”, página 119) y pueden también utilizarse en
el desarrollo de métodos (el software de los espectrofotó-
metros Agilent Technologies utiliza automáticamente estos
datos).
Robustez y Los espectrofotómetros de diodos son mecánicamente

fiabilidad simples y no tienen, prácticamente, partes móviles. Como
se desgastan o rompen pocas piezas, estos instrumentos
son muy fiables. El usuario se beneficia del mínimo tiempo
sin utilizar. Además, el coste de mantenimiento es menor
127
que en los instrumentos convencionales, ya que los

espectrofotómetros de diodos no requieren mantenimiento
ni recalibración regular. Se estima que los instrumentos
modernos tienen sólo un fallo cada 10 años (excluyendo
cambios de lámpara).
Area abierta de muestra Debido al diseño de óptica inversa (“El espectrofotómetro

de diodos”, página 39) el área de muestra de un espectrofo-
tómetro de diodos no necesita estar cubierta, ya que el
instrumento no es susceptible de interferencias de la luz
ambiental. Además, este diseño aumenta la productividad
facilitando el cambio de muestra y permite medir un amplio
rango de tipos de muestra, ya que son menores las
restricciones de tamaño. También es más fácil cambiar o
añadir accesorios especiales de muestreo.
Desventajas de la Como los espectrofotómetros de diodos difieren de los

espectroscopía de convencionales de barrido, han surgido muchas objeciones
relativas a su rendimiento. En esta sección, se comentan.
diodos
Resolución En un espectrofotómetro convencional, la resolución puede

cambiarse fácilmente variando la anchura de rendija. Sin
embargo, en un espectrofotómetro de diodos, depende de
un factor adicional: el intervalo de muestreo de la matriz de
diodos. De hecho, este intervalo depende del número de
diodos en la matriz y del rango de longitud de onda medido.
Hasta hace poco, los equipos de diodos tenían algunas
limitaciones al compararlos con instrumentos de 2 nm de
resolución. Este problema se ha corregido en las matrices
modernas, como la del Agilent 8453 (“Diseño de doble haz”,
página 42), que contiene más elementos. Aunque los
instrumentos de diodos no pueden alcanzar resoluciones de
0.5 nm o menos, como los convencionales, en muchos
análisis puede no ser necesaria tanta resolución
(“Resolución espectral”, página 46). Además, con una
128
resolución tan elevada, menos luz alcanza al detector y la

sensibilidad es menor. Por ejemplo, si un espectro se barre
con una resolución de 0.1 nm, puede llevar mucho más de
una hora obtener un espectro con buen S/N.
Luz dispersa En un instrumento de barrido secuencial, se reduce la luz

dispersa colocando filtros en el paso de luz, delante del
monocromador (vea “Luz dispersa”, página 51). Estos filtros
deben cambiarse según la longitud de onda incidente. En un
espectrofotómetro de diodos, utilizar filtros de esta manera,
normalmente, límita el rango de longitudes de onda que
pueden medirse simultáneamente. Por ello, los filtros se
colocan sobre la propia matriz para reducir la luz dispersa.
Sin embargo, como todas las λ de luz están siempre en el
área del detector, la luz dispersa es más problemática que
en los equipos convencionales.
Hasta hace poco, los espectrofotómetros de diodos exhi-
bían niveles más altos de luz dispersa que los convencio-
nales. Sin embargo, el Agilent 8453 está basado en un
proceso patentado que usa la capacidad de barrido rápido
completo de la tecnología de diodos, para reducir
significativamente la luz dispersa. Primero, se barre el
espectro completo. A continuación, se coloca en el paso de
luz un filtro que bloquea toda la luz por debajo de 430 nm, y
se mide el espectro en la región por encima de 430 nm. La
única luz detectada es la dispersa, que se resta de la primera
medida, obteniéndose un espectro con la luz dispersa
corregida. El proceso completo sólo dura 1.5 s (con dos
medidas de 0.5 s) y reduce la luz dispersa a niveles
equivalentes o mejores a aquellos obtenidos con
instrumentos de barrido convencional, con un
monocromador.
Descomposición de Debido a que los espectrofotómetros de diodos irradian la

la muestra muestra con luz de todas las longitudes de onda, se ha
argumentado que la muestra se degradará. Sin embargo, las
intensidades de luz utilizadas en un instrumento de diodos
129
no son mayores que las de uno convencional. Por ello,

cuando se barre un espectro completo, secuencialmente,
con un espectrofotómetro convencional, la cantidad total
de luz (la suma de la luz a todas las longitudes de onda) a la
que se somete a la muestra, es la misma que en un
instrumento de diodos. Si la muestra es fotosensible, ambos
instrumentos la descompondrán en la misma extensión.
Alguna evidencia circunstancial indica que, en algunos
casos, un instrumento de diodos puede adquirir espectros
de compuestos de mayor fotosensibilidad, que no pueden
obtenerse en espectrofotómetros convencionales.
Cuando se mide a una longitud de onda, un instrumento
convencional debería tener clara ventaja sobre un
espectrofotómetro de diodos, ya que somete a la muestra a
mucha menos irradiación. Sin embargo, en la práctica, los
problemas de fotodegradación son extramadamente raros.
En el momento de la publicación de este libro, no se
conocía ningún caso documentado.
Complejidad Algunos usuarios están intimidados por los instrumentos de

diodos porque creen que son muy complicados. Pero
aunque el proceso interno de datos asociado con los
espectrofotómetros de diodos es, por supuesto, mucho más
complejo que en los instrumentos convencionales, el
usuario nunca es consciente de esta diferencia. Y, mientras
los espectrofotómetros de diodos generan muchos más
datos que los convencionales, estos datos se manejan
fácilmente con los modernos softwares. Además, los datos
adicionales tienen numerosas ventajas, como se ha tratado
a lo largo de este libro.
Errores en la medida de Aunque los espectrofotómetros de diodos pueden producir

muestras fluorescentes resultados incorrectos cuando se miden muestras
fluorescentes, los instrumentos convencionales de barrido
también están sujetos a error (en “Fluorescencia”, página 79
se ofrece una explicación).
130
apéndice C
apéndice C Referencias
131
Referencias
1. Savitzky, A.; Golay, M. Anal. Chem., 1964, 36, 1627–1639.

2. Macadam, D.L. Colour Measurement, Springer: Berlin,
1981.
3. Chamberlain, G.J.; Chamberlain, D.G. Colour; its
measurement, computation and application, Heyden:
London, 1980.
4. Levine, R.L.; Federici, M.M. “Quantification of aromatic
residues in proteins; model compounds for second
derivative spectroscopy”; Biochemistry, 1982, 21, 2600–
2606.
5. Kisner, H.J.; Brown, W.B.; Kavarnos, G.J. “Multiple
analytical frequencies and standards for the
least-squares analysis of serum lipids”; Anal. Chem.
1983, 55, 1703.
6. Maris M.A.; Brown, C.W.; Lavery, D.S. “Nonlinear
multicomponent analysis by infrared
spectrophotometry”; Anal. Chem., 1983, 55, 1694.
7. Zwart, A.B.; van Kampen, E.J.; Zijlstra, W.G.
“Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives
with a reversed-optics instrument”; Clin. Chem., 1984,
30, 373.
8. Practical Absorption Spectrometry, Techniques in
Visible and Ultraviolet Spectrometry: Volume 3,
Burgess, C.; Knowles, A., Eds.; Chapman and Hall:
London, 1984.
9. Strong III, F.C. “Correlation of measurements of
absorbance in the ultraviolet and visible regions at
different slit widths”; Anal. Chem., 1976, 48, 2155.
10. Johnson, T.J. Int. Lab., 1982, 12(7), 42, 44–45.
11. Hellma Catalogue, Hellma: Müllheim/Baden, 1994.
12. Sharaf, M.A.; Ilman, D.L.; Kowalski, B.R. Chemometrics,
Chemical Analysis, Vol. 82, Wiley: New York, 1986, 82.
132
Referencias
13. Miller, J.C.; Miller, J.N. Statistics for Analytical

Chemistry, 2nd ed., Harwood: Chichester, 1988.
14. Mark, H. Principles and Practice of Spectroscopic
Calibration, Chemical Analysis, Vol. 118, Wiley: New
York, 1991.
15. Understanding Your Advanced UV-visible Software,
Agilent Technologies, part number G1116-90003, 2000.
16. Paul, W.L. “USP perspectives on analytical methods
validation”; Pharm. Technol., 1991, 15(3), 130–141.
17. Validation of Compendial Methods, United States
Pharmacopoeia XXII, National Formulary, XVII, The
United States Pharmacopoeial Convention, Inc.,
Rockville, MD. 1710–1712, 1990; General Chapter
<1225>.
18. Standards in Absorption Spectrometry, Techniques in
Visible and Ultraviolet Spectrometry: Volume 1;
Burgess, C.; Knowles, A., Eds.; Chapman & Hall: London,
1981.
19. Nowicka-Jankowska, T.; Gorczynska, A.; Michalik, A.;
Wieteska, E. Comprehensive Analytical Chemistry,
Volume XIX, Analytical Visible and Ultraviolet
Spectrometry; Elsevier: Amsterdam, 1986.
20. Operational Qualification and Performance
Verification of UV-Visible Spectrophotometers, Agilent
Technologies, publication number 5965-7438E, 2000.
21. Alford, J.S.; Cline, F.L. “PMA’s computer system
validation committee, computer system validation—
staying current: installation qualification”; Pharm.
Technol., 1990, 14, 88–104.
22. EURACHEM Guidance Document No. 1/WELAC
Guidance Document No. WGD 2: Accreditation for
chemical laboratories: Guidance on the interpretation
of the EN 45000 series of standards and ISO/IEC Guide
25, 1993.
133
Referencias
23. European Pharmacopoeia, 3rd ed., in press.

24. Spectrophotometry and Light Scattering, United States
Pharmacopoeia XXII, National Formulary, XVII, The
United States Pharmacopoeial Convention, Inc.,
Rockville, MD, 1990, 1609–1614, General Chapter <851>.
25. Standard Reference Materials Catalog, National
Institute of Standards and Technology: Gaithersburg,
MD, 1995, 104–106.
26. Standard Practice for Describing and Measuring
Performance of Ultraviolet, Visible, and Near-Infrared
Spectrophotometers, ASTM Standard E 275-83, 1994.
27. Standard Test Method for Estimating Stray Radiant
Power Ratio of Spectrophotometers by the Opaque Filter
Method, ASTM Standard E-387, 1990.
28. SRM 2034 Certificate, National Institute of Standards and
Technology: Gaithersburg, MD, 1992.
29. Pharmeuropa, Special Edition, Technical Guide,
Council of Europe: Strasbourg, 1993.
134
indice
indice
135
Indice
A C descomposición de la muestra, 80,

129–130
aberración cromática, 38 cloruro potásico, 104, 108, 112 desviación estándar, 86–87, 88, 89,
absorbancia, 3, 6, 21, 83, 105 coeficiente de correlación, 84, 85, 90, 119, 127
bandas, 7, 11, 76, 77 86, 118 detector
errores de medida en, 53–54, 60– coeficiente de extinción, 18–19, 21, fotodiodo, 35–36
61, 79 97, 98, 115 matriz de diodos, 36–37
interferencias, 69, 70, 74 color, 13–14 tubo fotomultiplicador, 35
medida de errores en, 65 confirmación detector de matriz de diodos, 36–37
y color, 13 longitud de onda, 117 detector fotodiodo, 35–36
absorbancia débil, 66–68 controlador de temperatura Peltier, detector tubo fotomultiplicador, 35
absorbancia fuerte, 68–69, 126 64 dicromato potásico, 107, 108
ácido nítrico, 107 convencional en ácido perclórico, 103
ácido perclórico, 103, 107, 109 óptica, 79 en ácido sulfúrico, 103
ácido sulfúrico, 103 corrección de tres puntos, 74 diodos
actividad enzimática, 15–16, 29 corrección Morton-Stubbs. Ver espectrofotómetro, 39–40
aditividad, 21, 86 corrección de tres puntos disolución de perclorato de holmio,
Agilent 8453 cristal 107, 108, 109, 111
espectrofotómetro, 41, 42, 109, 129 óxido de holmio, 108 disolvente
aminoácidos, 14 cristal de densidad neutra, 98, 102, efecto del, 62–64
análisis cualitativo, 10–16 108 elección de, 61–62
análisis cuantitativo, 16–27, 58, 64, filtros, 107, 112 dispersión, 84, 89, 118
97, 98, 127 cristal de óxido de didimio, 102 dispersión Rayleigh, 70
análisis multicomponente, 14, 21– cromóforo, 10–11, 62 dispersión Tyndall, 70
26, 125, 126 cuantificación de un solo dispersión (scattering), 3, 9, 70–71
e isoabsorbancia, 72 componente, 20 dispersión Rayleigh, 70
anchura de banda espectral Cubetas, 58 dispersión Tyndall, 70
instrumental (SBW), 47–49, cubetas, 58–61 dispositivos de dispersión, 34–35
110, 111, 114 cuidado de, 61 división de haz
anchura de banda espectral natural material, 58–59 espectrofotómetro, 44
(NBW), 48–49 cubetas con apertura, 60, 61 DNA (ácido desoxirribonucléico),
anchura de rendija, 66, 128 cubetas de flujo, 60 14–15
ángulo de aceptación, 80 cubetas rectangulares abiertas, 59 doble haz
arco de deuterio cubetas sin cubrir, 61 espectrofotómetro, 42–43
lámpara, 101, 107, 108 curva de calibración, 19, 83–85 doble longitud de onda
arco de mercurio curva de trabajo. Ver curva de espectrofotómetro, 45
lámpara, 101, 108 calibración
ASTM (American Standard Testing
Methods), 107–109
autotest, 114 E
D
efecto Schlieren, 63, 64
datos colaterales, 116–119, 125 electromagnética
B débil radiación, 3, 32
absorbancia, 66–68 electromagnético
benceno (vapor), 103, 107, 108 deriva, 42, 44, 55, 68, 100, 114, 126 espectro, 2
blanco, 38, 41, 42, 44, 46, 64, 65 derivatización química, 28 electrónica
británica desarrollo de métodos, 125 energía, 4
farmacopea, 104, 106 desarrollo del método, 82–94 energía electrónica, 4
descarga de vapor de mercurio energía rotacional, 4
lámpara, 107 energía vibracional, 4
136
Indice
ensayos cinéticos enzimáticos, 28 fosforescencia, 3 y análisis multicomponente, 72

error estándar de regresión, 84 fotométrica
espectral exactitud, 51–54, 98, 99, 100, 108,
resolución, 46–49 111
espectrofotómetro precisión, 51–54, 98, 108 L
convencional, 38–39 fotoquímica
espectrofotómetro Agilent 8453, 41, reacción, 3, 80 Lambert. Ver ley de Bouger-Lambert
42, 109, 129 frecuencia, 3 lámpara
espectrofotómetro con división de fuentes de luz, 33–34 arco de deuterio, 33
haz, 44 fuerte halógena de wolframio, 33
espectrofotómetro convencional, absorbancia, 68–69, 126 xenon, 34
38–39 lámpara de arco de deuterio, 33, 101,
espectrofotómetro de diodos, 39–40 107, 108
espectrofotómetro de doble haz, lámpara de arco de mercurio, 101,
42–43 G 108
espectrofotómetro de doble lámpara de descarga de vapor de
longitud de onda, 45 geometría de la muestra, 65 mercurio, 107
espectrofotómetro de haz simple, 41 GLP (Buenas prácticas de lámpara de xenon, 34
espectrofotómetro HP 8450A, 43, 44 laboratorio), 96, 104, 109 lámpara halógena de wolframio, 33
espectros derivados, ??–10, 11–12, GMP (Buenas prácticas de lentes, 38
20 fabricación), 96, 104 ley de Beer, 16–20, 21, 83
espectroscopía derivada, 75–78 Golay. Ver Técnica polinómica ley de Beer–Bouguer-Lambert, 18–
espejos cóncavos, 38 Savitzky-Golay 19
estabilidad, 33, 43, 45, 100 granate de neodimio ytrio aluminio, ley de Bouguer-Lambert, 17
estadísticas, 119, 127 102 límite de cuantificación (LOQ), 89–
Estados Unidos 90
farmacopea, 94, 106–107, 108 límite de detección (LOD), 89–90
europea linealidad, 83–87, 100, 100, 107, 108
farmacopea, 104–106, 108, 110, H llanura de línea de base, 100, 114
113 longitud de onda
exactitud, 87–88, 100 haz simple confirmación, 126
longitud de onda, 50–51, 97, 101, espectrofotómetro, 41 exactitud, 50–51, 97, 101, 103,
103, 107, 108 HP 8450A 107, 108
exactitud fotométrica, 51–54, 98, espectrofotómetro, 43, 44 precisión, 50–51, 97, 101, 107
99, 100, 108, 111 promedio, 67, 89, 126, 127
exatitud fotométrica, 108 referencia, 64, 72, 74, 86
repetitividad, 50, 51
I reproducibilidad, 10, 41, 51, 69, 94
reselección, 126–127
identificación, 10–11, 12, 16 longitud de onda de confirmación,
F idoneidad del sistema, 115 117, 126
Farmacopea Alemana (DAB), 104 incertidumbre, 84 luz dispersa, 51–52, 98–99, 103, 105,
Farmacopea Británica (BP), 104, 106 índice de refracción, 65 108, 112–113, 129
Farmacopea de Estados Unidos interferencia, 9, 20, 28
(USP), 94, 106–107, 108 tipos de, 69–78
Farmacopea Europea (EP), 104– intervalo de confianza, 89
inversa
106, 108, 110, 113
óptica, 40, 79, 80, 128
M
filtros, 35, 80, 98
cristal de densidad neutra, 107, ioduro potásico, 103, 107, 108, 112 matriz, 9, 64, 70, 78
112 ioduro sódico, 103, 108, 112 medida de balance, 46
fluorescencia, 3, 79–80 ISO 9000, 96 metal sobre cuarzo, 102, 107, 108
isoabsorbancia, 72, 92
137
Indice
método de ecuaciones simultáneas P sensibilidad, 28, 60, 71, 89–91, 126,

simples, 21–24, 25, 27, 91 127
método de mínimos cuadrados, 8, patrones de emisión, 101 sultona, 124
24–25, 27, 84, 91 patrones sólidos de absorción, 101
método de mínimos cuadrados pH, 11, 15, 29, 62–63
múltiples (MLS), 26 policromador, 39
método de mínimos cuadrados precisión, 60, 66, 88–89, 94, 119 T
parciales (PLS), 26 longitud de onda, 50–51, 97, 101,
métodos estadísticos, 26, 84 107 técnica polinómica Savitzky-Golay,
coeficiente de correlación, 84, 85, precisión fotométrica, 51–54, 98, 9
86, 118 108 técnicas de corrección, 78, 92, 125
ecuaciones simultáneas simples, prismas, 34 análisis multicomponente, 14, 21–
21–24, 25, 27, 91 promedio de tiempo, 67, 89, 127 26, 72, 125, 126
error estándar de regresión, 84 proteínas, 14 corrección de tres puntos, 74
incertidumbre, 84 espectroscopía derivada, 75–78
mínimos cuadrados, 8, 24–25, 27, isoabsorbancia, 72, 92
84, 91 referencia interna, 41, 55, 64, 74,
mínimos cuadrados múltiples R 89
(MLS), 26 temperatura, 11, 14–15, 19, 29, 62–
mínimos cuadrados parciales rango, 91 64
(PLS), 26 rango dinámico lineal, 53–54, 58, 68, tipos de cubetas, 58–60
regresión del componente 125, 126 con apertura, 60, 61
principal (PCR), 26 reacción de hidrólisis de flujo, 60
microcubetas, 60 de sultona, 124 microcubetas, 60
monocromador, 35 reacción fotoquímica, 3, 80 rectangulares abiertas, 59
redes holográficas, 34–35 sin cubrir, 61
referencia ultramicrocubetas, 60
longitud de onda, 64, 72, 74, 86 tolueno
patrón, 97, 98 en hexano, 104, 108, 113
N valores, 46 transmitancia, 6, 18, 51
NAMAS (Servicio Nacional de referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89
Acreditación de Medidas), 96 reflexión, 3
NIST (National Institute of regresión del componente principal
Standards and Technology), 41, (PCR), 26 U
106–107, 108, 110, 111 resolución, 105, 108, 128–129
nitrito sódico, 103, 112 resolución espectral, 46–49 ultramicrocubetas, 60
NPL (National Physical Laboratory), robustez, 93, 127–128
41 rotacional
energía, 4
ruido, 52, 66, 88, 99, 114, 119 V
ruido Schott, 52
validación del método, 94
O valoraciones espectrofotométricas,
óptica, 38, 61 28
óptica convencional, 79 S vibracional
óptica inversa, 40, 79, 80, 128 energía, 4
óxido de holmio, 109 sales de cobalto, 103, 108
cristal, 102, 107 en ácido nítrico/perclórico, 107
en ácido perclórico, 103, 107 sales de níquel, 103, 108
óxido de samario en ácido nítrico/perclórico, 107
en ácido perclórico, 103 selectividad, 28, 91–93, 126
señal-ruido (S/N), 9–10, 27, 67
138
s1
 Copyright Agilent Technologies 2000

Todos los derechos reservados. Esta
prohibida la reproducción, adaptación o
traducción, sin el permiso previo y por
escrito, excepto aquello permitido por la
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Fundamentos de la

Prólogo En 1988 publicamos un libro titulado “The Diode-Array

Dispositivos de dispersión .............................................................. 34

capítulo 3 Tratamiento y medida de muestra

capítulo 4 Desarrollo y validación del método

capítulo 5 Operación de rutina

Recomendaciones ................................................................................... 109

apéndice A Exactitud y precisión

apéndice B Características de los

Este capítulo presenta la teoría básica y los principios

de la espectroscopía UV-visible, proporcionando una

valiosa visión de los usos y limitaciones de esta

técnica para el análisis químico. También se revisan,

brevemente, las aplicaciones principales de la

El espectro La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende sólo una

Ultravioleta Visible Infrarrojo

Longitud de onda [m]

La energía asociada con la radiación electromagnética se

donde E es la energía (en julios), h es la constante de

Longitud de onda y La radiación electromagnética puede considerarse una

donde ν es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de

Origen de los espectros Cuando la radiación interacciona con la materia, pueden

una molécula, generalmente se representa como la suma de

E total = E electronica + E vibracional + E rotacional

La cantidad de energía que una molécula posee en cada

E electronica > E vibracional > E rotacional

En algunas moléculas y átomos, los fotones de luz UV y

Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia

Sin embargo en las moléculas, los niveles de energía

niveles de energía electrónica

Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la

Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

Orden cero: A = f(λ )

Obtener las derivadas de los Pueden utilizarse métodos ópticos, electrónicos y

cuadrados. Los coeficientes a0 … al a cada longitud de onda

Aplicaciones Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para

Señal/ruido Un efecto no deseado de la derivación es la disminución de

debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de

Consideraciones Para que la resolución de las derivadas aumente, es nece-

Identificación: Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas

Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia

Cromóforo Fórmula Ejemplo λmax (nm)

Carbonilo (cetona) RR’C=O Acetona 271

Carbonilo (aldehído) RHC=O Acetaldehído 293

Tabla 1 Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia

Carboxilo RCOOH Acido acético 204

Amida RCONH2 Acetamida 208

Etileno RCH=CHR Etileno 193

Acetileno RC=CR Acetileno 173

Nitrilo RC=N Acetonitrilo < 160

Nitro RNO2 Nitrometano 271

La presencia de una banda de absorbancia a una

Confirmación de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una

número de bandas aumenta con el orden de derivada. Este

Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

Long. de onda [nm] Color absorbido Color complementario

En la práctica, tanto la generación como la sensación de

Otra información La espectroscopía UV-visible puede utilizarse para determi-

Temperatura de fusión de las Los espectros de absorbancia de las proteínas resultan

El ácido desoxirribonucléico (DNA) en su estado nativo,

absorbancia UV del DNA, con un máximo a 260 nm. Como

A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina

Sin embargo, la absorbancia observada es siempre