UNIVERSIDAD POLITECNICA DEL CENTRO

Ambientes acidófilos
surgen naturalmente de actividades geoquímicas, como pueden ser la producción de gases sulfurosos
de emanaciones volcánicas. También es posible crear ambientes ácidos debido a la propia actividad o
metabolismo de los organismos otro lugar donde es posible encontrar acidófilos es en las escorias de
las minas, en soluciones con pH 0.5 a 1.

Metodología toma de muestras: se seleccionaron los puntos de muestreo con la finalidad de obtener
muestras representativas de distintas zonas, a partir de estos se tomaron 5 submuestras con el
método de barreno que este consiste en obtener muestras del suelo en distintas profundidades
mediante la perforación se les mide temperatura y pH se miden con pHmetro ATC con compensación
de temperatura.

Las muestras son recolectadas en envases de plástico previamente esterilizado procurando mantener
la temperatura constante desde el punto de muestreo hasta su posterior análisis en el laboratorio,
utilizando para ello neveras con sistemas de refrigeración portátil.

Una vez en el laboratorio, las muestras fueron almacenadas en una cámara acondicionada son
sistemas de iluminación y temperatura a 37°C, para el procesamiento de las 5 muestras se tamizan en
un tamiz de 2mm y son incubadas a 37°C, 24 horas después se toma el pH del suelo y las muestras son
procesadas. (Navarro y Navarro 2018)

Técnicas de aislamiento Hongos:

para aislar el aislamiento podemos encontrar dos métodos que se mencionan a continuación:
 Técnica de dilución en tubo:
Se realiza un pre-enrequicimiento de las 5 muestras, se pesan 100 g del suelo y se adicionan a 900
mL de caldo nutritivo, se incuba a 37°C por 24 horas.

A partir de la primera dilución (pre-enrequicimiento) se realizaron tres diluciones seriadas de 10−2

a10−4 en 9 mL de agua destilada estéril; cada dilución se sembró en superficie de agar nutritivo y
Agar extracto de suelo, por duplicado a 37°C por 48 horas. (Hamaky et al,2005)

Después de las 48 horas se incubación las cepas recuperadas son aisladas mediante el método de
siembra por agotamiento en agar nutritivo, se incuban a 37°C por 48 horas para obtener así
cultivos puros de la cepa. (Hamaky et al,2005)

 Técnica de aspersión directa:

 Se realiza un Medio de Agar Nutritivo y se siembra suelo directamente en la superficie del medio
distribuida uniformemente, se incuba a 73°C por 48 horas, a partir de las colonias obtenidas se
realizan aislamientos en Medio Agar Nutritivo y se incuban a 37°C por 48 horas y se obtendrán
medios de cultivos puros. (García y Ordoñez 2003)

 FOTÓTROFOS
Ambiente  alcalófilos

Metodología toma de muestras

 Muestras en liquido: Las muestras se realizan a partir de estanques, tomándose un total de 45
muestras en tres muestreos diferentes las muestras se inoculan por triplicado en medio solido
extendiéndose con una espátula. Las muestras de agua se siembran se siembran directamente
(100 µ/placa) y se realizan diluciones con agua salina estéril sembrando 100 µ de la dilución
10−1 .

 Muestras solido: se recogen muestras de sedimentos con raspados en las rocas y se

recolectan en frascos estériles y se conservan en nevera, las muestras de sedimento se
inoculan diluyendo 1 g de muestra en 10 mL agua salina estéril, se centrifugan a 1000 rpm por
5 minutos y posteriormente se siembran mediante diluciones seriadas a 10−3 para la toma de
pH con tiras.

 Técnicas de aislamientos Fotótrofos: para el aislamiento se prepara un Medio indicador de

pH Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH se incuba a 73°C por 48 horas y se
obtendrán medios de cultivos puros para la clasificación de los microorganismos.

NOM: La NORMA Oficial Mexicana NOM-021-RECNAT-2000, Que establece las especificaciones de

fertilidad, salinidad, clasificación de suelos. Estudios, muestreo y análisis.

La norma mencionada anteriormente rige nuestros dos ambientes seleccionados ya que en la sección
2, punto cinco hace referencia a la determinación de muestras que se pueden realizar para
determinación de pH y establece el nivel de pH que deben de contener los suelos para considerarlo
acidófilos.

En la sección 3 punto siete subíndices 7.1.2 nos menciona las consideraciones que se deben de tener
para clasificación de suelos y las condiciones en las que muestras deben ser transportadas y
analizadas en el laboratorio para suelos con pH alcalino.
b) Justifica que factores ambientales debes tomar en cuenta in situ e in vitro de tus dos ambientes
contrastantes para la obtención de los microorganismos. Se necesita que el estudiante justifique
claramente la razón fisiológica por la cual tendrá éxito en el aislamiento.

In situ: De manera natural se conservan en ambientes con caracteristicas tales como:

 PH por debajo 5
 Grietas volcanicas
 Aguas termales
 Lugares normalmente humedos y acidos
 Se consideran como bacterias probioticias, por que son beneficiosas para la salud del humano,
se encuentran en los intestino, en la boca y en la vagina, su funcion es la de prevenir
infecciones.
 Para poder vivir en un medio con una gran concentración de protones deben asegurarse de
que sus proteínas no se desnaturalizan. Para eso, todas las proteínas que sintetizan tienen un
alto peso molecular, de manera que se forman más enlaces entre aminoácidos.
 Además, la estructura secundaria es mucho más estable, dificultando la rotura de los
enlaces que la mantienen y haciendo que la proteína siga siendo funcional a pesar de estar en
un ambiente con estas características.
 Sin embargo, un dato curioso es que se han encontrado microorganismos en minas ricas en
ácido sulfúrico que no presentan pared celular, con lo que estaban más expuestas a estas altas
concentraciones de protones sin protección aparente (Thermoplasma acidophilum).

In Vitro:

 Disponibilidad de nutrientes exudados por el microorganismo.

 Cantidad de luz y temperatura disponible en la cámara.
 Preparación de medio del Medio Agar Nutritivo.
 Técnica de cultivo: La bio-oxidación es una técnica que se puede utilizar como un tratamiento
viable antes de la cianuración para mejorar la recuperación de oro (Canales et ál., 2002) y la
extracción de otros metales (Solisio et ál., 2002). Esta oxidación es catalizada principalmente
por microorganismos acidófilos autótrofos que crecen bajo condiciones drásticas de pH y
concentración de metales disueltos (Rossi, 1990) característicos de puntos de oxidación de
sulfuros en minas, y son los principales responsables de la generación de drenajes ácidos
(Johnson y Hallberg, 2003).

C) Describe de manera fundamentada cuales estrategias utilizarías para la identificación de los

grupos: Hongos, Bacterias y Fotótrofos (al menos dos métodos por cada grupo).
  HONGOS
Ambiente  alcalófilos
Las pruebas mencionadas a continuación nos ayudaran a la identificación y clasificación de la manera
en que los hongos pueden vivir en ambientes alcalófilos y como se adaptan a estos medios.

1. Fisicoquímica
Prueba PCR: La técnica de la PCR se basa en provocar la elaboración de copias de determinadas regiones del
genoma (totalidad del DNA de un individuo), que se denominan secuencias diana, Este proceso se denomina
amplificación. Esta técnica incluye tres etapas caracterizadas, cada una de ellas, por una temperatura detenida.

1.-DESNATURALIZACiÓN DEL DNA: Separación, a alta temperatura (superior a los 90°C), de las dos cadenas de
la doble hélice. El aumento de la temperatura intensifica la agitación de las moléculas, con lo que éstas se
rompen por sus enlaces más débiles (los puentes de hidrógeno) con lo que se separan las dos cadenas de la
doble hélice. En un DNA totalmente desnaturalizado todas las cadenas son simples.

2.-HIBRlDACIÓN DE LOS INICIADORES: Los iniciadores ("primers") son pequeñas cadenas de DNA de cadena
simple (típicamente de unos 15 a 30 nucleótidos) que han sido diseñados para unirse por complementariedad
de bases a detenidas zonas del genoma. Este proceso se denomina hibridación. Normalmente se utilizan dos
iniciadores que se hibridan a los extremos de la secuencia diana y que son complementarios, cada uno de ellos,
a uno de los dos filamentos. La hibridación se lleva a cabo disminuyendo rápidamente la temperatura de la
mezcla. Al disminuir la temperatura, las cadenas complementarias tenderían a reasociarse, pero debido a la
elevada concentración de los iniciadores añadidos a la mezcla de la reacción, la fonación de complejos DNA-
molde e iniciadores se ve favorecida respecto a la reasociación de las cadenas sencillas. La temperatura a la
que se realiza la hibridación depende de la longitud y secuencia de los iniciadores. De estos últimos depende la
especificidad de la ampliación.

3.- EXTENSIÓN DE INICIADORES: Mediante la acción de una polimerasa de DNA, se consigue que el extremo 3'-
OH de cada iniciador aumente su longitud utilizando como molde el DNA original y, como materiales de
construcción, los cuatro nucleótidos Por esta razón, la polimerización se realiza a 72°C, que es la temperatura
óptima de funcionamiento de la Taq-polimerasa. En esta etapa, es crítica la concentración de Mg -1+, un catión
decisivo para el correcto funcionamiento de la enzima.

2. Bioquímicas
Identificación genotípica: Inferencia filogenética La filogenia es el estudio de las relaciones evolutivas.
Un análisis filogenético no sólo nos indica las relaciones evolutivas entre las secuencias o especies, las
cuales descienden de ancestros comunes, también puede indicarnos cuales son las distancias entre
ellas. Los métodos de reconstrucción filogenética más habituales asumen que todas las secuencias o
especies provienen a partir de un ancestro común mediante divergencias evolutivas (Bioinformatics at
Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, COMAV; 2018).

 FOTÓTROFOS
 1. Fisicoquímica
Microscopia Laser Confocal (CLSM): La aplicación CLSM permite el análisis in vitro del estado de los
pigmentos fotosintéticos en células individuales de los microorganismos fotótrofos, tomando en
cuenta la región de la longitud de onda de emisión y la intensidad de la fluorescencia emitida
(autoflorescencia).