Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

PRACTICA No. 3

EXTRACCION DE DNA GENOMICO A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA

INTRODUCCION

El ácido desoxiribonucleico o DNA (DNA) es la molécula que guarda el código genético

de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular,
eucarionte o procarionte, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.

Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del
material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el
conocimiento del código genético, que ya es posible clonar organismos enteros. Los
procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber
con certeza que se había logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para
poder manipularlo. Además algunos de los reactivos usados para estos procesos son
tóxicos y mutagénicos. Hoy día podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en
unas horas.

Es importante señalar que el DNA se encuentra localizado en el núcleo de las células

eucarióticas y por lo tanto solo puede ser obtenido de células nucleadas. Las células de
un organismo eucariótico multicelular no presentan diferencias de tamaño ni secuencia de
su DNA, las diferencias se presentan es a nivel de expresión genética, por lo tanto, si se
quiere conocer o estudiar el DNA de un individuo lo podemos hacer a partir de cualquiera
de sus células nucleadas. La sangre tiene un componente particulado compuesto por
células, en su mayoría son eritrocitos, los cuales durante su desarrollo pierden el núcleo.
Además de los eritrocitos en la sangre tenemos glóbulos blancos, células con núcleo y
que por lo tanto nos pueden servir para obtener DNA.

OBJETIVO

Que el estudiante aprenda a extraer DNA a partir de muestras biológicas, utilizando la

sangre periférica como muestra.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Tubo Falcón de 15 mL
• Micro tubos de 1.5 mL
• Centrifuga para tubos Falcón de 15 mL
• Micro centrífuga
• Puntas amarillas y azules
• Micro pipetas de 20, 200 y 1000 µL
• Guantes de látex
• Tubos vacutainer con EDTA
• Jeringa de 5 mL
• Ligadura
• Cámara de electroforesis submarina
• Fuente de Poder

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• Transiluminador UV
• Sistema para captura de imágenes
• Sangre con anticoagulante (EDTA)
• Regulador de lisis TSNT (2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10 mM
Tris-HCl pH 8.0)
• Fenol saturado con Tris-HCl pH 8.0
• Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1v/v)
• Etanol absoluto y al 70%
• TE 1X (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)
• Regulador de corrida (TAE 1X)
• Regulador de carga 6X
• Agarosa al 0.8% en TAE 1X
• Bromuro de Etidio
• Marcadores de Tamaño Molecular

PROTOCOLO

1. En un tubo de 15 mL colocar 2.5 mL de sangre con anticoagulante (EDTA). Centrifugar

a 3000 rpm por 5 min. Desechar sobrenadante y agregar a la pastilla 1 mL de TSNT (tritón
100X 2%; SDS 1%; NaCl 100mM; Tris-HCl pH 8.0 10mM), mezclar por inversión.

2. Adicionar 2.5 mL de Fenol saturado y mezclar con agitación rápida.

3. Agregar 0.5 mL de cloroformo-isoamílico (24:1) y agitar vigorosamente por 5 min.

4. Añadir 1 mL de TE (10mM Tris-HCl pH 8.0; 1mM EDTA pH 8.0) y mezclar durante 1

min.

5. Dividir el contenido del tubo en 4 tubos de 1.5 mL. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min.

6. Rescatar el sobrenadante y colocarlo en tubos de 1.5 mL nuevos.

7. Precipitar con 2.5 volúmenes de etanol 100%, mezclar gentilmente por inmersión.

8. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 min, desechar sobrenadante y lavar la pastilla

agregando 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar 2 min a 12,000 rpm, descartar
sobrenadante.

9. Dejar secar la pastilla al aire y una vez seca resuspenderla en 10 µL de TE. Verificar
calidad de DNA en un gel de agarosa al 0.8%.

CUESTIONARIO

1. Buscar en la literatura que otros métodos están descritos para la extracción de ácidos
nucleicos a partir de muestras de sangre.
2. ¿De que tipo de células sanguíneas espera obtener su muestra de DNA?

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3. ¿Usted extrae el DNA de 1000 células de hígado, suponiendo que la extracción es al

100%, ¿considera que la cantidad de DNA que se obtenga será diferente de la misma
cantidad de células de bazo y de óvulos? Fundamente su respuesta.
4. Proponga que haría usted para mejorar la práctica

BIBLIOGRAFÍA
1. Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition.
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001.

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PRACTICA No. 4

CUANTIFICACION Y DETERMINACION DEL GRADO DE PUREZA Y CALIDAD

DE ÁCIDOS NUCLEICOS

INTRODUCCIÓN.

Una de las propiedades físicas de los ácidos nucleicos, es su capacidad de absorber luz
ultravioleta. La absorción de la luz, depende de la presencia de las bases nitrogenadas.
Para determinar si en una solución tenemos ácidos nucleicos y el grado de pureza se
mide la absorbancia a 260 y 280 nm.
Otra de las propiedades físicas de los ácidos nucleicos, es su carga eléctrica. Podemos
separar moléculas en función del tamaño. Una corriente eléctrica moviliza al DNA a través
de la agarosa. De esta manera, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su
tamaño. Para observar las bandas de DNA de diferentes tamaños, éstos se tiñen con un
colorante que se le añade al gel. La electroforesis en geles de agarosa es muy utilizada
en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con
controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de
moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida. Ambos tienen en común que
adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas. Esto es
importante para evitar que la solución reguladora se desplace por el gel cuando se active
el campo eléctrico. La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que
gracias a su poder de gelificación y propiedades fisicoquímicas, lo han convertido en el
soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular.
Si aplicamos una corriente podemos generar un campo eléctrico en el cual se mueva un
cuerpo cargado. El DNA es una molécula cargada negativamente, por lo que en un campo
eléctrico será atraída hacia el polo positivo. Si colocamos moléculas de diferente tamaño
dentro de una red tridimensional, las moléculas más grandes se moverán más lentamente
que las pequeñas. Un gel de agarosa es simplemente una malla tridimensional por la cual
se moverán moléculas de DNA a diferente velocidad, dependiendo de su tamaño y de la
intensidad del campo eléctrico.

OBJETIVO

Analizar la pureza y calidad de ácidos nucleicos extraídos, mediante espectrofotometría

de luz ultra violeta y electroforesis en geles de agarosa.

MATERIALES Y REACTIVOS.

• Cámara de electroforesis submarina

• Fuente de Poder
• Transiluminador UV
• Registrador de imágenes
• Soporte para hacer el gel con los peines para formar los pozos
• Regulador de corrida ( TAE 1X)
• Regulador de Carga 6X
• Agarosa al 0.8% en TAE 1X
• Bromuro de Etidio

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¡ES MUY IMPORTANTE QUE SE USEN GUANTES Y SE SIGAN LAS INSTRUCCIONES CON
CUIDADO PARA ASEGURAR OBTENER BUENOS RESULTADOS Y EVITA LA
DEGRADACION DE LA MUESTRA!

PROTOCOLO

1. Preparación de gel de agarosa

-Prepara tu molde de vaciado para la agarosa (no olvides el peine). Añade suavemente la
agarosa al 0.8% en TAE 1X con Bromuro de Etidio, previamente calentada a 70°C.
Espera unos minutos a que solidifique
-Quita las barreras del extremo del gel y ponlo en la cámara de electroforesis horizontal.
-Añade el regulador TAE de modo que cubra completamente el gel pero apenas rebase
unos milímetros la superficie del gel
-Saca con cuidado el peine

2. Poner muestras de DNA en el gel de agarosa

-Prepara tus muestras de DNA poniendo en un papel parafilm 2 µl de regulador de carga
6X y 2 µl de la muestra de ácidos nucleicos, mezclarlos con el regulador.
-Tomar los 4 µl con una micropipeta y ponerlos dentro de un pozo del gel de agarosa,
cuidando de no poner la muestra fuera del pozo del gel, cambia de punta cada vez que
cambies de muestra.

3. Tapar cámara y conectar a la fuente de poder

-Cierra la cámara con cuidado y conéctale los cables (rojo con rojo y negro con negro), la
muestra debe migrar al polo positivo (rojo).
-Conecta los cables a la fuente de poder ¡APAGADA!. Prende la fuente de poder y ajusta
el voltaje según las instrucciones que recibas (entre 50 y 100 volts). Fíjate en las burbujas
del lado del electrodo negro (qué significa?) y observa también que el color azul de los
pozos comienza a migrar.
-Continúa la electroforesis hasta que el azul llegue a uno o dos centímetros del borde
opuesto del gel. Parar la corrida apagando la fuente de poder.

4. Captura de Imagen del gel.

Tomar el gel con mucho cuidado y llevarlo a observar en el transiluminador de luz UV
Capturar la imagen obtenida (digitalización).

CUESTIONARIO
1. ¿Por qué se utiliza agarosa?
2. ¿Bajo que principio se separan los ácidos nucleicos?
3. ¿Cuál es la composición del regulador de carga y para que sirven los diferentes
componentes de éste?
4. ¿Cómo ese calcula la pureza del DNA?
5. ¿Porque es importante determinar el grado de pureza de la preparación?
6. ¿De que concentración de agarosa se tendrá que prepara un gel para poder
separar fragmentos de DNA de 200 pb a 500 pb y de 500 pb a 3,000pb?
7. ¿Usted quiere separar fragmentos de DNA con la resolución de 1 base, que matriz
utilizaría y en que técnica se necesita ese grado de resolución?

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BIBLIOGRAFÍA

1. Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition.
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001.

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