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18
Técnicas en biología celular y molecular
18.1 El microscopio óptico A causa del tamaño tan pequeño del tema de estudio, la
18.2 Microscopia electrónica de transmisión biología celular y molecular depende más del desarrollo de
18.3 Microscopia electrónica de barrido y nuevos instrumentos y tecnologías que cualquier otra rama de
microscopia de fuerza atómica la biología. Por consiguiente, es difícil aprender acerca de la
biología celular y molecular sin aprender también respecto a
18.4 Uso de radioisótopos la tecnología que se requiere para reunir datos. En este capí-
18.5 Cultivo celular
18.6 Fraccionamiento del contenido de una célula
mediante centrifugación diferencial Empleo de doble marcaje de fluorescencia para la vigilancia de fenómenos
dinámicos dentro de los organelos celulares de células vivas. Las cisternas
18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de de Golgi de una célula de levadura en gemación no se organizan en pilas
proteínas bien definidas como en la mayor parte de las células eucariotas, sino que
18.8 Identificación de la estructura de proteínas y están dispersas en el citoplasma. Cada una de las estructuras ovaladas
complejos multisubunitarios intensamente coloreadas es una cisterna individual, en la que el color se
debe a la localización de moléculas de proteína con tinción fluorescente. Las
18.9 Fraccionamiento de ácidos nucleicos cisternas de color verde contienen una proteína marcada con GFP (Vrg4)
18.10 Hibridación de ácido nucleico que interviene en las actividades iniciales del aparato de Golgi, mientras
18.11 Síntesis química de DNA que las cisternas de color rojo contienen una proteína marcada con DsRed
(Sec7) que participa en actividades tardías de dicho complejo. Esta serie de
18.12 Tecnología de DNA recombinante micrografías revela la composición proteínica de cisternas individuales
18.13 Amplificación enzimática de DNA por PCR durante un lapso aproximado de 13 min (el tiempo transcurrido se indica
18.14 Secuenciación de DNA en el ángulo inferior izquierdo). La punta de flecha y la flecha señalan dos
de estas cisternas todo el tiempo. Estas dos cisternas se automicrografiaron
18.15 Genotecas de DNA
en las filas inferiores de micrografías. En esta serie se aprecia que la
18.16 Transferencia de DNA a células eucariotas y composición proteínica de una cisterna individual cambia con el tiempo de
embriones de mamífero una con proteínas de Golgi “tempranas” (verde) a otra con proteínas de
18.17 Determinación de la función de los genes Golgi “tardías” (rojo). Tales descubrimientos dan apoyo visual directo al
modelo de maduración de las cisternas que se analiza en la pág. 293.
eucariotas por eliminación o desactivación
(Tomada de Eugene Losev, et al., cortesía de Benjamin S.
(silenciamiento) génica Glick; Nature 441:1004, 2006, Fig. 3a. Reimpresa con autoriza-
18.18 Uso de anticuerpos ción de Macmillan Publishers Ltd.)
tulo se revisan los métodos que se emplean más a me-
nudo en este campo sin profundizar mucho en los detalles
y variaciones que se usan. Los objetivos de este capítulo
son: describir las formas en que se utilizan las diversas
técnicas y presentar ejemplos de los tipos de información
18.1 | El microscopio óptico
Los microscopios son instrumentos que producen una ima-
gen aumentada de un objeto. La figura 18.1 muestra los com-
ponentes principales de un microscopio óptico compuesto.
Una fuente de luz, que puede ser externa al microscopio o
estar incluida en su base, ilumina la muestra. La lente conden-
sadora subyacente reúne los rayos difusos de la fuente de luz e
ilumina la muestra con un pequeño cono de luz brillante que
permite ver las partes muy pequeñas de éste después de la
magnificación. Los rayos de luz enfocados en la muestra por
la lente condensadora se reciben en la lente del objetivo del
microscopio. A partir de este punto es necesario considerar
dos conjuntos de rayos lumínicos que entran a la lente del ob-
jetivo: los que ya alteró la muestra y los que no modificó (fig.
18.2). Este último grupo se refiere a la luz proveniente del
condensador que pasa en forma directa a la lente del objetivo
y constituye la luz de fondo del campo visual. El primer grupo
de rayos de luz surge de las múltiples partes de la muestra y
forma la imagen del mismo. La lente del objetivo enfoca estos
rayos de luz para formar una imagen real y magnificada del
objeto dentro de la columna del microscopio (fig. 18.1). Un
segundo sistema de lentes, la lente del ocular, emplea la imagen
formada por la lente del objetivo como objeto para formar
una imagen virtual y aumentada. Un tercer sistema de lentes
localizado en la parte frontal del ojo utiliza la imagen virtual
producida por la lente del ocular como objetivo para producir
una imagen real en la retina. Cuando el tornillo de enfoque
Lente del ocular
Lente del objetivo
Muestra
Lente condensadora
Fuente de luz
Figura 18.1 Diagrama de un corte a través de un microscopio
óptico compuesto, es decir, un microscopio que tiene lentes tanto
de objetivo como oculares.
que pueden obtenerse mediante tales técnicas. Se co- 733
mienza con el instrumento que permitió a los biólogos des-
cubrir la existencia de células, con lo que se establece un
punto de partida para toda la información que se presenta
en este libro.
del microscopio de luz se gira, la distancia relativa entre la
muestra y la lente del objetivo cambia, lo que permite que
la imagen final se enfoque con exactitud en el plano de la re-
tina. La magnificación total obtenida por el microscopio es el
producto de las magnificaciones logradas por la lente del ob-
jetivo y la lente del ocular.
Resolución
Hasta este punto sólo se consideró la magnificación de un
objeto sin prestar atención a la calidad de la imagen producida,
Plano de enfoque
de la imagen
Plano de foco de
la fuente de luz
Lente del objetivo
2α Longitud focal de
la lente del objetivo
Plano de la muestra
Lámpara
( ) Rayos de luz que forman la imagen
18.1 El microscopio óptico
( ) Luz de fondo del campo
Figura 18.2 Trayectos que siguen los rayos de luz que forman la
imagen de la muestra y los que forman la luz de fondo del campo.
Los rayos de luz de la muestra se enfocan en la retina, mientras
que los rayos del fondo están fuera de foco, con lo que se produce
un campo brillante difuso. Como se explica en el texto, el poder de
resolución de una lente del objetivo es proporcional al seno del án-
gulo ␣. Las lentes con mayor poder de resolución tienen longitudes
focales más cortas, lo que significa que la muestra se sitúa más cerca
de la lente del objetivo cuando se enfoca.
734
(a) (b) (c)
Figura 18.3 Magnificación contra resolución. La transición de
(a) a (b) proporciona al observador una mayor magnificación y reso-
lución, mientras que la transición de (b) a (c) sólo produce una ma-
yor magnificación (magnificación vacía). De hecho la calidad de la
imagen se deteriora conforme la magnificación vacía aumenta.
o sea, el nivel al cual los detalles de la muestra se conservan en
la imagen. Supóngase que se mira una estructura en el micros-
copio con una lente del objetivo relativamente potente (p. ej.,
63⫻) y una lente ocular que amplifica la imagen del objetivo
cinco veces más (un ocular 5⫻). Asúmase que el campo está
compuesto por cromosomas y es importante identificar el nú-
mero que hay, pero algunos están muy cerca unos de los otros
y no pueden distinguirse como estructuras separadas (fig.
18.3a). Una solución podría ser cambiar los oculares para in-
crementar el tamaño de los objetos que se observan. Si se
cambiara de un ocular 5⫻ a uno 10⫻, lo más probable es que
la capacidad para contar el número de cromosomas aumentara
(fig. 18.3b) porque ahora la imagen de los cromosomas produ-
cida por la lente del objetivo se extiende sobre una parte más
grande de la retina. Mientras más fotorreceptores proporcio-
nen información respecto a la imagen, más detalles pueden
verse (fig. 18.4). Sin embargo, si se cambia a un ocular 20⫻, no
es probable que se perciban más detalles aunque la imagen sea
más grande (fig. 18.3c), es decir, que ocupe más superficie re-
tiniana. El cambio de ocular no proporciona más información
porque la imagen producida por el objetivo no tiene más deta-
lles que aumentar con el mayor poder del ocular. El segundo
cambio en el ocular sólo brinda magnificación vacía (como en
la fig. 18.3c).
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
La calidad óptica de una lente del objetivo se mide por la
extensión en la que pueden discriminarse, o resolverse, los de-
talles finos de una muestra. La difracción limita la resolución
que se obtiene con un microscopio. A causa de la difracción, la
luz que emana de un punto de la muestra nunca puede verse
Fotorreceptor estimulado
Fotorreceptor no estimulado
Figura 18.4 El poder de resolución del ojo. Ilustración de la rela-
ción entre la estimulación de los fotorreceptores individuales (iz-
quierda) y la imagen que se percibiría (derecha). El diagrama ilustra
el valor de que la imagen caiga en un área lo bastante grande de la
retina.
como un punto en la imagen, sino sólo como un pequeño
disco. Si los discos producidos por dos puntos cercanos se su-
perponen, los puntos no pueden distinguirse en la imagen. Por
lo tanto, el poder de resolución de un microscopio puede defi-
nirse en términos de la capacidad para ver dos puntos vecinos
en el campo visual como dos entidades distintas; dicho poder
de resolución está limitado por la longitud de onda de la ilu-
minación de acuerdo con la ecuación
0.61 l
d
n sen a
donde d es la distancia mínima que debe separar dos puntos en
la muestra para resolverse, lambda (␭) es la longitud de onda
de la luz (527 nm para la luz blanca) y n es el índice refractivo
del medio presente entre la muestra y la lente del objetivo.
Alfa (␣) es igual a la mitad del ángulo del cono de luz que
entra a la lente del objetivo, como se muestra en la figura 18.2.
Alfa es una medida de la capacidad de reunión de luz de la
lente y mantiene una relación directa con su abertura.
El denominador de la ecuación en la columna 1 se conoce
como abertura numérica (N. A., numerical aperture). Esta úl-
tima es una constante para cada lente, una medida de sus cua-
lidades para reunir luz. La N.A. máxima posible para un obje-
tivo que se diseña para usarlo en el aire es 1.0 porque el seno
del máximo ángulo posible de ␣, 90⬚, es 1, y el índice refractivo
del aire es 1.0. Para un objetivo diseñado para sumergirse en
aceite, la N.A. máxima posible se acerca a 1.5. Como regla
general práctica, la máxima magnificación útil de un mi-
croscopio óptico varía entre 500 y 1 000 veces la abertura nu-
mérica del lente del objetivo que se use. Los intentos para
aumentar la imagen después de este punto producen magnifi-
cación vacía y la calidad de la imagen se deteriora. Una aber-
tura numérica alta se logra con lentes que tienen una distancia
focal corta, lo que permite colocar la lente muy cerca de la
muestra.
El límite de resolución del microscopio óptico se esta-
blece si se sustituye la longitud de onda mínima posible de
iluminación y la mayor abertura numérica posible en la ecua-
ción previa. Cuando se realizan tales sustituciones, se obtiene
un valor un poco menor de 0.2 ␮m (o 200 nm), que es sufi-
ciente para observar organelos celulares grandes, como los nú-
cleos y las mitocondrias. En cambio, el límite de resolución del
ojo desnudo, que tiene una abertura numérica cercana a 0.004,
se aproxima a 0.1 mm.
Además de estos factores teóricos, el poder de resolución
también depende de los defectos ópticos, o aberraciones. Exis-
ten siete aberraciones ópticas importantes y constituyen las
limitaciones que los fabricantes de lentes deben vencer para
producir lentes del objetivo cuyo poder de resolución real se
aproxime a los límites teóricos. El objetivo está hecho con una
serie compleja de lentes, en lugar de una sola lente conver-
gente, a fin de eliminar estas aberraciones. Por lo general una
unidad de lente proporciona la magnificación requerida, en
tanto que las demás compensan los errores de la primera para
brindar una imagen general corregida.
Visibilidad
En el lado más práctico de la microscopia en relación con los
límites de la resolución se encuentra el tema de la visibilidad,
que se refiere a los factores que en realidad permiten observar 735
un objeto. Esto podría parecer un asunto trivial; si el objeto
está ahí, puede verse. Considérese el caso de una cuenta de
vidrio transparente. Bajo la mayor parte de las condiciones,
contra casi todos los fondos, la cuenta se ve con claridad. Sin
embargo, si una cuenta de vidrio se deja caer en un recipiente
con aceite de inmersión con el mismo índice refractivo que el
vidrio, la cuenta desaparece de la vista porque ya no afecta la
luz de ninguna manera obvia que sea distinta al líquido de
fondo. Cualquiera que haya pasado tiempo buscando una
amiba puede apreciar el problema de la visibilidad con el mi-
croscopio óptico.
Lo que se ve a través de una ventana o por un microsco-
pio son los objetos que afectan la luz de manera distinta al
fondo. Otro término para la visibilidad en este sentido de la
palabra es el contraste, o la diferencia en la apariencia entre
las partes adyacentes de un objeto o entre un objeto y su fondo.
La necesidad del contraste puede apreciarse si se consideran
las estrellas. En tanto que el cielo claro de la noche puede estar
lleno de estrellas, el mismo cielo durante el día parece carente
de cuerpos celestes. Las estrellas desaparecieron de la vista,
pero no del cielo. Ya no son visibles contra el fondo mucho Figura 18.5 La tinción de Feulgen. Este procedimiento de tinción
es específico para el DNA, como lo indica la localización del pig-
más brillante.
mento en los cromosomas en esta célula de la punta de la raíz de ce-
En el mundo macroscópico, para examinar objetos se bolla que estaba en la metafase de la mitosis al momento que se fijó.
hace caer la luz sobre ellos y luego se observa la luz que se re- (Por Ed Reschke.)
fleja a los ojos del observador. En cambio, cuando se utiliza un
microscopio la muestra se coloca entre la fuente de luz y los
ojos, y se ve la luz que se transmite a través del objeto (o en
términos más apropiados, la que difracta el objeto). Si una Preparación de muestras para microscopia
persona toma un objeto, entra a una habitación con una fuente de luz de campo claro
de luz y sujeta el objeto entre la fuente de luz y los ojos, puede
apreciarse parte de la dificultad con tal iluminación; es necesa- Las muestras a observar en el microscopio óptico se dividen
rio que el objeto que se examina sea casi transparente, o sea, en dos categorías amplias: monturas completas y cortes. Una
translúcido. Aquí radica otro aspecto del problema: puede ser montura completa es un objeto intacto, ya sea vivo o muerto,
difícil observar objetos que son “casi transparentes”. y puede consistir en un microorganismo entero como un pro-
Una de las mejores formas para hacer que una mues- tozoario o en una pequeña parte de un organismo más grande.
tra  delgada y traslúcida sea visible al microscopio es teñirla La mayor parte de los tejidos de plantas y animales son dema-
con algún colorante, que absorba sólo ciertas longitudes de siado opacos para su análisis microscópico, a menos que éstos
onda del espectro visible. Las longitudes de onda que no se se examinen como una rebanada muy delgada, o corte. Para
absorben se transmiten al ojo, lo que hace que el objeto teñido preparar un corte, primero se matan las células mediante in-
parezca coloreado. Los distintos colorantes se unen a diferen- mersión del tejido en alguna solución química llamada fijador.
tes tipos de moléculas biológicas, por lo que estos procedi- Un buen fijador penetra rápido en la membrana celular e in-
mientos no sólo incrementan la visibilidad de la muestra, moviliza todo su material macromolecular, de modo que la es-
también indican en qué puntos de la célula o tejido se encuen- tructura de la célula se mantiene lo más similar posible a la de
tran los distintos tipos de sustancias. Un buen ejemplo es la la célula viva. Los fijadores más usuales para la microscopia
tinción de Feulgen, que es específica para el DNA; hace que óptica son soluciones de formaldehído, alcohol o ácido acético.
los cromosomas se vean coloreados al microscopio (fig. 18.5). Tras la fijación, el tejido se deshidrata por transferencia a
Un problema de los colorantes es que por lo común no se través de una serie de alcoholes y luego se impregna con para-
pueden usar en células vivas pues por lo regular son tóxicos, o fina (cera), lo que brinda soporte mecánico durante el proceso
lo es el entorno de tinción, o los colorantes no penetran la de corte. La parafina se utiliza como medio de impregnación
membrana plasmática. Por ejemplo, la tinción de Feulgen re- porque se disuelve de manera fácil con solventes orgánicos.
quiere la hidrólisis del tejido en ácido antes de aplicar el pig- Las laminillas que contienen cortes adherentes de parafina se
18.1 El microscopio óptico

mento. sumergen en tolueno, que disuelve la cera y deja una rebanada

Los diferentes tipos de microscopios ópticos usan distin-
tos tipos de iluminación. En un microscopio de campo bri-
llante (claro) el cono de luz que ilumina la muestra se observa
como fondo brillante contra el que la imagen de la muestra
debe contrastarse. La microscopia de campo brillante es ideal
para las muestras de alto contraste, como los cortes teñidos de
tejidos, pero es probable que no se obtenga la visibilidad óp-
tima para otros especímenes. En las secciones siguientes se
consideran varios medios alternativos para hacer que las
muestras sean más visibles en un microscopio óptico.
delgada de tejido unido a la laminilla, donde puede teñirse o
tratarse con enzimas, anticuerpos u otros agentes. Después de
la tinción se coloca un cubreobjetos sobre el tejido con un
medio de montaje que tenga el mismo índice refractivo que el
portaobjetos y el cubreobjetos.
Microscopia de contraste de fase
Las muestras pequeñas y no teñidas, como una célula viva,
pueden ser difíciles de observar con un microscopio de campo
736
(a)
(b)
(c)
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.6 Comparación de células vistas con diferentes tipos
de microscopios ópticos. Micrografías ópticas de un protista ciliado
tal como se observa en un campo brillante (a), con contraste de fase
(b) y con óptica de contraste por interferencia diferencial (DIC) (o
de Nomarski) (c). El organismo apenas es visible con la iluminación
de campo brillante, pero se ve con claridad en la microscopia con
contraste de fase y con DIC. (Micrografías por M.I. Walker/
Photo Researchers, Inc.)
brillante (fig. 18.6a). El microscopio de contraste de fase
hace más visibles los objetos muy transparentes (fig. 18.6b).
Pueden distinguirse diferentes partes de un objeto porque
cada uno de ellos afecta la luz de manera distinta. Una base de
estas diferencias es el índice refractivo. Los organelos celula-
res están constituidos por distintas proporciones de varias mo-
léculas: DNA, RNA, proteínas, lípidos, carbohidratos, sales y
agua. Es probable que las regiones con composición diferente
tengan índices de refracción distintos. En condiciones norma-
les el ojo humano no puede detectar tales diferencias. Sin em-
bargo, el microscopio de contraste de fase convierte las dife-
rencias del índice de refracción en diferencias de intensidad
(brillantez y oscuridad relativas) que son visibles para el ojo
humano. Los microscopios de contraste de fase logran esto:
(1) mediante la separación de la luz directa que entra a la lente
del objetivo desde la luz difractada que proviene de la muestra
y (2) al hacer que los rayos de luz de estas dos fuentes interfie-
ran unos con los otros. La brillantez u oscuridad relativas de
cada parte de la imagen reflejan la forma en que la luz de esa
parte de la muestra interfiere con la luz directa.
Los microscopios de contraste de fase son más útiles para
examinar componentes intracelulares de células vivas con una
resolución hasta cierto punto alta. Por ejemplo, la movilidad
dinámica de las mitocondrias, los cromosomas mitóticos y
las vacuolas pueden seguirse y filmarse con este sistema óptico.
La mera observación del modo en que las diminutas partículas
y vacuolas de las células se mueven de un lado a otro al azar
dentro de una célula viva causa una emoción respecto a la vida,
que no puede obtenerse si se observan células muertas y teñi-
das. El mayor beneficio aportado por la invención del micros-
copio de contraste de fase no fue el descubrimiento de nuevas
estructuras, sino su empleo diario en laboratorios de investiga-
ción y enseñanza para observar células de manera más revela-
dora.
El microscopio de contraste de fase tiene limitaciones
ópticas que producen pérdida de resolución y la imagen se
afecta por halos que interfieren y sombras producidas en sitios
donde el índice refractivo experimenta cambios súbitos; es un
tipo de microscopio de interferencia. Otros tipos de microsco-
pios de interferencia minimizan estos artefactos ópticos al lo-
grar una separación completa de los rayos directos y difracta-
dos por medio del uso de trayectos complejos de luz y prismas.
Otro tipo de sistema de interferencia, llamado contraste de in-
terferencia diferencial (DIC), o a veces interferencia de No-
marski en honor de su desarrollador, presenta una imagen que
tiene una calidad tridimensional aparente (fig. 18.6c). El con-
traste en la microscopia DIC depende de la velocidad de cam-
bio del índice refractivo en la muestra. En consecuencia los
bordes de las estructuras, donde el índice refractivo varía mu-
cho en una distancia más o menos corta, se observan con bas-
tante contraste.
Microscopia de fluorescencia (y técnicas
relacionadas basadas en la fluorescencia)
En los dos últimos decenios, el microscopio óptico se ha trans-
formado de un instrumento diseñado principalmente para exa-
minar cortes de tejidos fijos, a un instrumento capaz de mostrar
los sucesos dinámicos que ocurren a nivel molecular en las célu-
las vivas. En gran medida, estos avances en la visualización de
células vivas han sido posibles gracias a innovaciones en la mi-
croscopia de fluorescencia. Esta última permite observar la locali-
zación de determinados compuestos (llamados fluorocromos o
fluoróforos) que absorben radiación ultravioleta invisible y emi-
ten porciones de la energía en las longitudes de onda visibles,
más largas, un fenómeno que se conoce como fluorescencia. La
fuente de luz en un microscopio de este tipo produce un rayo de
luz ultravioleta que viaja por un filtro, el cual bloquea todas las
longitudes de onda excepto la que puede excitar el fluorocromo.
El rayo de luz monocromática se enfoca en la muestra que con-
tiene el fluorocromo, que se excita y emite luz de longitud de
onda visible para el observador. Como la fuente de luz produce
sólo luz ultravioleta (negra), los objetos teñidos con un fluoro-
cromo parecen tener un color brillante contra un fondo negro,
lo que brinda un gran contraste.
 En biología celular y molecular existen diversas formas de
utilizar los compuestos fluorescentes. En una de sus aplicacio-
nes más usuales, un fluorocromo (como la rodamina o la fluo-
resceína) se une en forma covalente (conjugada) con un anti-
cuerpo para producir un anticuerpo fluorescente que puede
emplearse para localizar una proteína específica dentro de la
célula. Esta técnica se denomina inmunofluorescencia y se ilus-
tra en la micrografía de la figura 9-30a. La inmunofluorescen-
cia se describe mejor en la página 783. Las proteínas con
marca fluorescente también pueden usarse para estudiar pro-
cesos dinámicos mientras ocurren en una célula viva. Por
ejemplo, un fluorocromo específico puede unirse con una pro-
teína celular, como la actina o la tubulina, y la proteína con
marca fluorescente se inyecta en una célula viva (figs. 9.4 y
9-73b). Los fluoróforos también se utilizan para situar mo-
léculas de DNA o RNA que contienen secuencias específicas
de nucleótidos, como se describen en la página 402 y se ilus-
tran en la figura 10.19. En otros ejemplos, los fluoróforos se
han usado para estudiar el tamaño de las moléculas que pasan
entre las células (ver fig. 7.33), como indicadores de potencia-
les transmembranarios (ver fig. 5.21), o como sondas para co-
nocer la concentración de calcio libre en el citosol (ver fig.
15-29). El empleo de los fluoróforos sensibles al calcio se ex-
pone en la página 649.
En todos los ejemplos señalados en el párrafo anterior, las
biomoléculas se tornaron fluorescentes al conjugarlas con un
fluoróforo orgánico sintético; sin embargo, también se cuenta
con moléculas fluorescentes naturales. Los humanos desde
hace miles de años se han preguntado porqué las medusas y
otros animales marinos emiten luz en la oscuridad. Fue apenas
en el comienzo en el decenio de 1960 cuando Osamu Shimo-
mura descubrió que algunas especies de dichos organismos
(Aequorea victoria) emiten luminosidad por la presencia de
proteínas fluorescentes como la aequorina y la proteína fluo-
rescente verde (GFP; green fluorescent protein), y las pudo pu-
rificar y analizar. En los comienzos del decenio de 1990, Dou-
glas Prasher, Martin Chalfie y colaboradores clonaron el gen
que codifica GFP y demostraron que la proteína fluorescente
podría ser incorporada genéticamente y expresada en otros
organismos. El estudio en cuestión preparó el terreno para
utilizar GFP para investigar la distribución espacial y tempo-
ral de las proteínas en células vivas. A diferencia de la mayor
parte de las otras proteínas fluorescentes, GFP no requiere un
cofactor adicional para absorber y emitir luz; en lugar de eso,
se forma un cromóforo absorbente/emisor de luz por modifi-
cación autónoma (o sea, por una reacción catalítica) de tres de
los aminoácidos que conforman la estructura primaria del po-
lipéptido GFP. En la mayoría de los estudios que usan GFP, se
construye un DNA recombinante en el que la región codifica-
dora del gen GFP está unida con la región codificadora del
gen para la proteína en estudio. Este DNA recombinante se
utiliza para transfectar a las células, que luego sintetizan una
proteína quimérica que contiene GFP fluorescente fusionada
con la proteína en estudio. El uso de GFP para estudiar la
dinámica de la membrana se describe en la página 273. En
estos diversos protocolos experimentales, las proteínas marca-
das participan en las actividades normales de la célula y su lo-
calización puede seguirse al microscopio para revelar las acti-
vidades dinámicas en las que la proteína participa (ver figs. 8.4
y 9.2).
Los estudios imagenológicos en células vivas a menudo
aportan mayor información gracias al uso simultáneo de va-
riantes de GFP que presentan diferentes propiedades espec-
trales. Las variantes de GFP que florecen con tonos de azul 737
(BFP), amarillo (YFP) y azul verdoso (ciano) (CFP) fueron
generadas por Roger Tsien en la Universidad de California,
San Diego, gracias a la mutagénesis dirigida del gen GFP.
Además de la anémona de mar se aisló una proteína tetramé-
rica de fluorescencia roja (DsRed) no emparentada directa-
mente. También se han generado en el laboratorio de Tsien,
variantes monoméricas de DsRed (p. ej., mBanana, mTange-
rine, y mOrange), que fluorescen y emiten colores perfecta-
mente identificables, gracias a experimentos de mutagénesis
dirigida. El tipo de información que puede obtenerse con esta
“paleta” de variantes de GFP se ilustra en la figura 18.7, en el
que los investigadores generaron cepas de ratones cuyas neu-
ronas contenían proteínas fluorescentes de colores distintos.
Cuando un músculo de uno de estos ratones se expuso por
medios quirúrgicos, los investigadores observaron las interac-
ciones dinámicas entre las neuronas de diversos colores y las
uniones neuromusculares inervadas (ver fig. 4.56 que presenta
un dibujo de este tipo de unión). Por ejemplo, observaron
cómo las ramas de una neurona coloreada con CFP competían
con las ramas de una neurona coloreada con YFP por estable-
cer contacto sináptico con el tejido muscular. En cada caso
encontraron que cuando dos neuronas compiten por la inerva-
ción de diferentes fibras musculares, todas las ramas “ganado-
ras” pertenecen a una de las neuronas, en tanto que todas las
ramas “perdedoras” pertenecen a la otra neurona (fig. 18.7b).
Las micrografías presentadas al inicio del capítulo constituyen
(a) (b)
Figura 18.7 Uso de variantes de GFP para seguir las interaccio-
nes dinámicas entre neuronas y sus células blanco in vivo. (a) Por-
ción de cerebro de un ratón con dos neuronas fluorescentes de
colores diferentes. Los ratones se obtienen mediante el aparea-
18.1 El microscopio óptico
miento de animales transgénicos cuyas neuronas se marcan con una
u otra proteína fluorescente. (b) Micrografía con fluorescencia de
porciones de dos neuronas, una marcada con YFP y otra marcada
con CFP. Las flechas indican dos uniones neuromusculares distintas
en dos fibras musculares diferentes en las que la rama axonal mar-
cada con YFP venció a la rama marcada con CFP. La tercera unión
está inervada con el axón marcado con CFP en ausencia de compe-
tencia. (a: Cortesía de N. Kasthuri y J. W. Lichtman, Wash-
ington University School of Medicine; b: reimpresa con
autorización de Narayanan Kasthrui y Jeff W. Lichtman,
Nature 424:429, 2003, fig. 4a.Reimpresa con autorización de
Macmillan Publishers Ltd.)
738 otro ejemplo de lo mucho que se puede aprender sobre la di-
námica espacial y temporal de fenómenos celulares por el uso
de dos o más proteínas fluorescentes espectralmente diferen-
tes. En esta situación, la estrategia de dos “marcadores” permi-
tió a los investigadores vigilar los movimientos simultáneos de
dos proteínas en tiempo real, tal como acaece dentro de los
confines de un organelo celular particular. Otro ejemplo se
describe en la “Vía experimental” del capítulo 8 (pág. 321).
Las variantes de GFP también son útiles en una técnica
llamada transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET), que se emplea para medir cambios en la distancia
entre dos partes de una proteína (o entre dos proteínas separa-
das dentro de una estructura más grande). La técnica de
FRET puede usarse para estudiar estos cambios mientras ocu-
rren in vitro o dentro de una célula viva. Esta técnica se basa
en el hecho de que la energía de excitación puede transferirse
de un grupo fluorescente (un donador) a otro grupo fluores-
cente (un receptor), siempre y cuando ambos grupos estén
muy próximos (1 a 10 nm). Dicha transferencia de energía
reduce la intensidad de la fluorescencia del donador e incre-
menta la intensidad de fluorescencia del receptor. La eficiencia
de la transferencia entre dos grupos fluorescentes unidos a si-
tios estratégicos de una proteína disminuye mucho cuando
la distancia entre los dos grupos aumenta. Como resultado la
determinación de los cambios en la fluorescencia de los grupos
donador y receptor que se producen durante algún proceso
brinda una medida de los cambios en la distancia entre ellos
en las distintas etapas del proceso. Esta técnica se ilustra en la
figura 18.8, en la que dos variantes de GFP (marcadas ECFP
y EYFP) se unieron en forma covalente con dos partes distin-
PKG
PKG
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Figura 18.8 Transferencia de energía por resonancia de fluores-
cencia (FRET). Este esquema muestra un ejemplo del uso de la
tecnología FRET para seguir el cambio en la conformación de una
proteína (PKG) después de la unión con cGMP. Las dos proteínas
pequeñas fluorescentes con forma de barril [CFP intensificada
(ECFP) y YFP intensificada (EYFP)], se muestran en su color fluo-
rescente. En ausencia de cGMP, la excitación de ECFP con luz de
440 nm produjo la emisión de luz de 480 nm de la proteína fluores-
cente. Después de la unión con cGMP, un cambio en la conforma-
ción en PKG aproxima lo suficiente las dos proteínas fluorescentes
para que la FRET ocurra. Como resultado, la excitación del donador
de ECFP con luz de 440 nm produce la transferencia de energía al
receptor de EYFP y la emisión de luz de 535 nm del receptor. Las
versiones intensificadas de estas proteínas tienen mayor intensidad
de fluorescencia y tienden a ser más estables que las moléculas pro-
teínicas originales. (Tomada de Moritoshi Sato y Yoshio Ume-
zawa, Analytical Chemistry 72:5924, 2000. © 2000 American
Chemical Society.)
tas de una proteína cinasa dependiente de cGMP (PKG). En
ausencia de un cGMP unido, los dos fluorocromos están de-
masiado separados para que haya transferencia de energía. La
unión de cGMP induce un cambio en la conformación de
la  proteína que aproxima los dos fluorocromos lo suficiente
para que la FRET ocurra. La FRET también puede em-
plearse para seguir procesos como el plegamiento de una pro-
teína o la asociación y disociación de los componentes dentro
de una membrana. La separación de las colas citoplásmicas de
subunidades de integrina después de la activación por talina
(fig. 7.14) es un ejemplo de un suceso que se ha estudiado por
FRET. La figura 15.8 señala un ejemplo temprano en el que la
técnica de FRET se utilizó para identificar los cambios de las
concentraciones de cAMP después de que un neurotransmi-
sor se uniera a un receptor de superficie.
Otra innovación de la microscopia por fluorescencia ha
sido la elaboración de programas computacionales, para gene-
rar gran numero de imágenes y calificarlas con base en diver-
sas características. Las técnicas automatizadas comentadas
han sido particularmente útiles para detectar los fenotipos de
células sometidas a una “biblioteca” de siRNA diferentes, en la
búsqueda de genes que codifiquen proteínas que intervengan
en un proceso celular particular como es el tránsito de mem-
branas (pág. 278) o la mitosis (pág. 780). Además de ser una
maniobra tediosa y lenta, el intento de analizar por técnicas
manuales galerías de imágenes como las que se muestran en la
figura 18.50, quizá introduzca errores que son consecuencia de
diferencias subjetivas inherentes y sesgos de observadores hu-
manos.
Otra innovación reciente en la microscopia por fluores-
cencia es el terreno de la microscopia multifotónica, en que los
fluoróforos presentes en el interior de células son excitados
por la llegada simultánea de dos o más fotones de longitud de
onda más larga. Cuanto más larga sea la longitud de onda del
fotón, menor será su energía (de modo que los torna menos
destructivos de las células iluminadas y para la absorción de
fluoróforos) y mayor será su capacidad de penetración. Por el
uso de microscopia multifotónica los investigadores pueden
rastrear los desplazamientos de proteínas fluorescentes que se
encuentran como mínimo a una profundidad de 200 ␮m en el
interior de tejido vivo. Un ejemplo de tal técnica se incluye en
la figura 17.11 en que las células inmunitarias marcadas por
fluorescencia son “vigiladas” conforme se desplazan en el inte-
rior de un ganglio linfático extirpado.
Microscopia con video y procesamiento
de imágenes
Así como el campo microscópico puede verse con los ojos o
filmarse con una cámara, también puede verse por medios
electrónicos y grabarse con una videocámara. Las videocáma-
ras ofrecen varias ventajas para visualizar muestras. Se cons-
truyen tipos especiales de videocámaras (llamadas dispositivo
acoplado a la carga [CCD, charge-coupled device], o cámaras
CCD) que son muy sensibles a la luz, lo que les permite obte-
ner imágenes con iluminación escasa. Esto es muy útil cuando
se observan especímenes vivos, a los que el calor de una fuente
luminosa daña con facilidad y especímenes con tinción fluo-
rescente, que se desvanece en poco tiempo con la exposición
a la luz. Además, las videocámaras pueden detectar y amplifi-
car diferencias muy pequeñas en el contraste dentro de una
muestra, de manera que los objetos muy pequeños se tornan
visibles. Por ejemplo, las fotografías de la figura 9.22a exponen
imágenes de microtúbulos individuales (diámetro 0.025 ␮m)
que están muy por debajo del límite de resolución de un mi-
croscopio óptico estándar (0.2 ␮m). Una ventaja adicional es
que las imágenes electrónicas generadas por cámaras de video
son transformadas fácilmente en imágenes digitales y estas
últimas incluyen un número discreto de elementos gráficos
(pixeles), de modo que a cada uno se ha asignado un valor
cromático y de brillo correspondiente al sitio de la imagen
original. Las imágenes digitales se almacenan como archivos
en computadoras y se someten a procesamiento para ampliar
enormemente su contenido informativo. En una técnica, el
fondo desenfocado distractor de un campo visual se almacena
en la computadora y luego se sustrae de la imagen que con-
tiene la muestra. Esto incrementa mucho la claridad de la
imagen. De igual manera las diferencias de la brillantez en
la imagen pueden convertirse en diferencias de color, lo que las
vuelve mucho más evidentes al ojo humano.
Microscopia confocal de barrido láser
El uso de videocámaras, imágenes electrónicas y procesa-
miento por computadora condujo al renacimiento de la mi-
croscopia óptica en los últimos 20 años. También contribuyó
el desarrollo de un nuevo microscopio óptico. Cuando se exa-
mina una célula completa o un corte de algún órgano con un
microscopio óptico estándar, el observador ve la muestra a
distintas profundidades si cambia la posición del objetivo me-
diante la rotación del tornillo de enfoque. Mientras lo hace,
distintas partes de la muestra entran y salen de foco. Sin em-
bargo, el hecho de que la muestra contenga diferentes enfo-
ques disminuye la capacidad para formar una imagen nítida
porque las partes de la muestra por arriba y por abajo del plano
de foco interfieren con los rayos de luz de la parte que está en
dicho plano. A finales del decenio de 1950, Marvin Minsky, 739
del Massachusetts Institute of Technology, inventó un instru-
mento revolucionario llamado microscopio confocal que pro-
duce una imagen de un plano delgado situado dentro de una
muestra mucho más gruesa. La figura 18.9a muestra un dia-
grama de los componentes ópticos y los trayectos de luz en
una versión moderna de un microscopio óptico de barrido confocal
de fluorescencia. En este tipo de microscopio la muestra se
ilumina con un rayo láser con un enfoque fino que barre rápi-
damente la muestra a una sola profundidad, con lo que sólo
ilumina un plano delgado (o “corte óptico”) dentro de la mues-
tra. Como se describe en la figura 18.9a, los microscopios con-
focales se utilizan con óptica fluorescente. Como se explicó
antes, los fluorocromos presentes en una muestra absorben la
luz incidente de longitud de onda corta y la emiten de nuevo
en una longitud de onda mayor. La luz emitida por la muestra
se enfoca en un sitio del microscopio que contiene una aber-
tura puntual. Por lo tanto, la abertura y el plano iluminado son
confocales. Los rayos de luz emitidos por el plano iluminado
de la muestra pueden pasar por la abertura, mientras que el
paso de cualquier otro rayo de luz que pudiera emanar de un
plano superior o inferior al plano determinado se impide para
que no participe en la formación de la imagen. En consecuen-
cia los puntos fuera de foco de la muestra se tornan invisibles.
A la computadora
Fotomultiplicador
Abertura puntiforme
Espejo dicroico

Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia confocal con explora- Abertura de iluminación

ción láser. (a) Los trayectos de la luz en un microscopio de fluores-
cencia confocal. La luz de longitud de onda corta (azul) proviene de
una fuente láser, pasa por una abertura diminuta y se refleja en un
espejo dicroico (un tipo de espejo que refleja ciertas longitudes de Láser
onda y transmite otras) hacia una lente del objetivo y se enfoca en
una mancha en el plano de la muestra. Los fluorocromos de la
muestra absorben la luz incidente y emiten luz de mayor longitud de
onda, la cual puede pasar por el espejo dicroico y enfocarse en un
plano que contiene una abertura puntual. Luego, la luz pasa a un
tubo fotomultiplicador que amplifica la señal y la transmite a una
computadora, la cual forma una imagen procesada digitalizada.
Cualquier rayo de luz emitido por arriba o debajo del plano óptico Lente del objetivo
de la muestra no pasa por la abertura diminuta, por lo que no contri-
buye a la formación de la imagen. Este diagrama muestra la ilumi-
nación de un solo punto en la muestra. Distintos sitios de la muestra
se iluminan mediante un proceso de barrido con láser. El diámetro
Muestra
18.1 El microscopio óptico

de la abertura puntual es ajustable. Mientras menor sea la abertura,

es más delgado el corte óptico y mayor la resolución, pero la señal es Plano focal
menos intensa. (b) Micrografías con fluorescencia confocal de tres (a)
cortes ópticos separados, cada uno de 0.3 μm de grosor, de un núcleo
de levadura teñido con dos anticuerpos con marca fluorescente dis-
tinta. El anticuerpo fluorescente rojo tiñó el DNA dentro del núcleo
y el anticuerpo fluorescente verde tiñó una proteína de unión con el
telómero que se localiza en la periferia del núcleo. (a: tomada de
Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75:543, 1993, Cell
por Cell Press. Reimpresa con autorización de Cell Press
en el formato de reproducción como libro de texto, vía co-
pyright Clearance Center.) (b)
740 La figura 18.9b presenta micrografías de un solo núcleo
celular que se tomaron en tres planos distintos de la muestra.
Es evidente que los objetos fuera del plano de enfoque tienen
poco efecto en la calidad de la imagen de cada corte. Si se
desea, las imágenes de cortes ópticos separados pueden alma-
cenarse en una computadora y fusionarse para reconstruir un
modelo tridimensional de todo el objeto.
Microscopio de fluorescencia
con súper resolución
Las innovaciones más recientes en la microscopia de fluores-
cencia caen en el campo de las tecnologías de “súper resolu-
ción”. En la página 734 se indicó que el límite de resolución
del microscopio óptico se aproxima a 200 nm por las propie-
dades de difracción de la luz. En los últimos años se desarro-
llaron varias técnicas ópticas complejas que permiten a los
investigadores localizar proteínas con marcas fluorescentes en
resoluciones en décimas de nanómetros. Muchas de estas téc-
nicas de súper resolución se basan en el descubrimiento de que
una mutación particular de polipéptido GFP transforma la
proteína en una molécula fotoactivable (PA-GFP, photoacti-
vatable molecule), y dicha GFP mutante sigue siendo no fluo-
rescente hasta que la luz violeta la activa. Estudios ulteriores
han ampliado el número de proteínas fluorescentes fotoactiva-
bles que pueden usarse y ello ha permitido crear proteínas
“fotoconmutables” cuya emisión fluorescente en una longitud
particular de onda puede activarse o desactivarse con pulsos
luminosos. Sólo se describirá en forma breve una de estas téc-
nicas, llamada STORM (stochastic optical reconstruction micros-
copy, microscopia de reconstrucción óptica estocástica), que
permite a los investigadores localizar una molécula fluores-
cente individual con una resolución menor de 20 nm. En el
caso de esta técnica, se ilumina la muestra que contiene uno o
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Clatrina
Microtúbulo
(a) (b)
Figura 18.10 Superación del límite de resolución del microsco-
pio óptico. (a) Micrografía de fluorescencia convencional de una
porción de una célula cultivada de mamífero con microtúbulos mar-
cados en verde y las vesículas cubiertas con clatrina en rojo. Con este
nivel de magnificación, la imagen se ve difusa. Además, la superposi-
ción entre las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, que
sugiere que ambas estructuras están interconectadas. (b) Micrografía
STORM de “súper resolución” de un campo similar que muestra los
más fluoróforos fotoconmutables con pulsos de luz de longi-
tud de onda adecuada, que actúa al “conmutar”, es decir, acti-
var o desactivar la fluorescencia de las moléculas marcadas.
Durante cada ciclo de iluminación, muchas de las moléculas
marcadas siguen estando oscuras, pero una pequeña fracción
de ellas es activada de manera aleatoria. Dichas moléculas
fluorescentes activadas individualmente asumen la forma de
pequeñas zonas o puntos, que dadas las propiedades de difrac-
ción de la luz, tienen algunos cientos de nanómetros de diá-
metro. El centro de cada zona o punto, que representa el sitio
real del fluoróforo particular que emite la luz, se puede cono-
cer con gran exactitud; el proceso comentado se repite varios
ciclos imagenológicos y así se genera un gran número de coor-
denadas que representan el sitio de muchos de los fluoróforos
en la muestra. El análisis de las coordenadas permite a los in-
vestigadores reconstruir una imagen de súper resolución del
campo de visión. El gran aumento en la resolución que puede
obtenerse con la técnica STORM de súper resolución en
comparación con una técnica de fluorescencia convencional
resulta evidente si se compara la imagen de la figura 18.10a
con las figuras 18.10b y c.
18.2 | Microscopia electrónica
de transmisión
Las micrografías electrónicas que se muestran en este texto
fueron tomadas con dos tipos distintos de microscopios elec-
trónicos. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM)
forman imágenes con los electrones que se transmiten a través
de una muestra, mientras que los microscopios electrónicos de
barrido (SEM) utilizan electrones que rebotan en la superficie
de la muestra. Todos los comentarios de esta sección se refie-
(c)
microtúbulos y las vesículas cubiertas con clatrina con buena resolu-
ción y separados entre sí. (c) Vista magnificada de una porción de la
imagen b. (Los comentarios de esta técnica de súper resolución y
otras más se localizan en Nature 459:638, 2009; Ann, Rev. Biochem.
78:993, 2009; Cell 143:1047, 2010; J. Cell Biol. 190:165, 2010; y
J. Cell Sci. 124: 1607, 2011.) (Tomada de Mark Bates et al.,
cortesía de Xiaowei Zhuang, Science 317:1752, 2007; © 2007.
Reimpresa con autorización de AAAS.)

(a)
Figura 18.11 Comparación entre la información obtenida en las
imágenes tomadas con un microscopio óptico y uno electrónico
con una magnificación comparable de 4 500 veces el tamaño real.
(a) Fotografía del tejido muscular esquelético que se impregnó en
plástico, se cortó a 1 μm y se fotografió con un microscopio óptico
con una lente del objetivo para aceite de inmersión. (b) Corte adya-
cente al empleado para la parte a que se cortó a 0.025 μm y se exa-
minó al microscopio electrónico con una magnificación comparable
a la imagen en a. La imagen resultante presenta un aumento de dos
ren al uso del TEM; el de barrido se describe por separado en
la página 746.
El microscopio electrónico de transmisión puede propor-
cionar mucha mayor resolución que el microscopio óptico.
Esto se ilustra con la comparación de las dos fotografías de la
figura 18.11, que muestran imágenes de cortes adyacentes del
mismo tejido con la misma magnificación, con un microsco-
pio óptico y con uno electrónico. Aunque la fotografía de la
figura 18.11a está casi al límite de la resolución del microsco-
pio óptico, la de la figura 18.11b es una micrografía electrónica
de muy baja potencia. El gran poder de resolución del micros-
copio electrónico se deriva de las propiedades de las ondas de
los electrones. Como se indica en la ecuación de la página 734,
el límite de resolución de un microscopio está en proporción
directa con la longitud de onda de la luz: mientras mayor sea
la longitud de onda, es menor la resolución. A diferencia de un
fotón de luz que tiene una longitud de onda constante, la lon-
gitud de onda de un electrón varía con la velocidad a la que la
partícula viaja, que a su vez depende del voltaje de aceleración
aplicado en el microscopio. Esta relación se define mediante la
ecuación:
l 2150/V
donde, lambda (␭) es la longitud de onda en ángstroms (Å) y
V es el voltaje de aceleración en volts. Los microscopios elec-
trónicos de transmisión estándar operan con un espectro de
voltaje de 10 000 a 100 000 V. A 60 000 V, la longitud de onda
de un electrón se aproxima a 0.05 Å. Si esta longitud y la aber-
tura numérica alcanzable con el microscopio óptico se sustitu-
yeran en la ecuación de la página 734, el límite de resolución
sería de unos 0.03 Å. En realidad la resolución alcanzable con
un microscopio electrónico de transmisión estándar es de unos
dos órdenes de magnitud menor que su límite teórico. Esto se
debe a la aberración esférica grave de las lentes que enfocan los
electrones, lo cual requiere que la abertura numérica de la
lente sea muy pequeña (casi siempre entre 0.01 y 0.001). El
741
(b)
a uno en la resolución. Nótese la diferencia en los detalles de las
miofibrillas musculares, las mitocondrias y el eritrocito contenido en
el capilar. Mientras que el microscopio óptico no puede proporcio-
nar ninguna información adicional a la de a, es posible que el mi-
croscopio electrónico brinde mucha más información; por ejemplo,
puede producir imágenes de la estructura de membranas individua-
les dentro de una pequeña porción de una de las mitocondrias
(como en la fig. 5.22). (Cortesía de Douglas E. Kelly y M. A.
Cahill.)
límite práctico de resolución de los TEM estándar se halla
entre 3 y 5 Å. Por lo general el límite real cuando se observa
una estructura celular está entre 10 y 15 Å.
Los microscopios electrónicos consisten sobre todo en
una columna alta, cilíndrica y hueca por la que pasa el rayo de
electrones, y una consola que contiene un panel con discos que
controlan la operación de la columna por medios electrónicos.
En la parte superior de la columna se encuentra el cátodo, un
filamento de alambre de tungsteno que se calienta para pro-
veer una fuente de electrones. Los electrones se extraen del
filamento caliente y se aceleran como un rayo fino mediante el
voltaje aplicado entre el cátodo y el ánodo. El aire se bombea
para sacarlo de la columna antes de la operación, lo que pro-
duce un vacío por el que los electrones viajan. Si no se extrajera
el aire, los electrones se dispersarían antes de tiempo por coli-
sión con las moléculas de gas.
Tal como un rayo de luz puede enfocarse con una lente de
vidrio pulido, un rayo de electrones con carga negativa puede
enfocarse con lentes electromagnéticas, las cuales se localizan
18.2 Microscopia electrónica de transmisión
en la pared de la columna. La fuerza de los magnetos se con-
trola mediante la corriente que se les suministra, que está de-
terminada por las posiciones de varios discos de la consola. La
figura 18.12 muestra una comparación de los sistemas de len-
tes de un microscopio óptico y uno electrónico. Las lentes del
condensador de un microscopio óptico se colocan entre la
fuente de electrones y la muestra, y enfocan el rayo de electro-
nes sobre ésta, que se sostiene en una pequeña rejilla de metal
(3 mm de diámetro) y se inserta con pinzas en el sujetador de
la misma, que a su vez se inserta en la columna del microscopio.
Como las longitudes focales de las lentes de un microsco-
pio electrónico varían según la corriente que se les aplique, una
lente del objetivo proporciona todo el espectro de magnifica-
ción que el instrumento alcanza. Como en el microscopio óp-
tico, la imagen del objetivo sirve como el objeto para un sis-
tema de lentes adicional. La imagen que se obtiene del objetivo
de un microscopio electrónico sólo tiene una magnificación de
unas 100 veces pero, a diferencia del microscopio óptico, esta
742 Pantalla de visualización
con la imagen final
Lente
del ocular
o proyector
Imagen
intermedia
Lente del
objetivo
Muestra
Condensador
Lámpara Filamento
Microscopio electrónico
Microscopio óptico
Figura 18.12 Comparación del sistema de lentes de un micros-
copio óptico y uno electrónico. (Reimpresa con autorización
de Alan W. Agar, Principles and Practice of Electron Mi-
croscope Operation, Elsevier/North-Holland, 1974. Con
autorización de Elsevier Ltd.)
imagen posee detalles suficientes para incrementarla 10 000
veces más. Al modificar la corriente que se aplica a las diversas
lentes del microscopio, las magnificaciones varían desde 1 000
hasta 250 000 veces. Los electrones que pasaron por la mues-
tra se enfocan en una pantalla fosforescente situada en la base
de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
una cubierta de cristales fluorescentes que emiten su propia
luz visible que el ojo percibe como una imagen de la muestra.
La formación de una imagen en el microscopio electró-
nico depende de la dispersión diferencial de los electrones por
las distintas partes de la muestra. Considérese un rayo de elec-
trones emitido por el filamento y enfocado en la pantalla. Si
no hubiera una muestra en la columna, el rayo de electrones
iluminaría de manera uniforme la pantalla y se produciría una
imagen brillante uniforme. Por el contrario, si se coloca la
muestra en el trayecto del rayo, algunos de los electrones gol-
pean átomos de la muestra y se dispersan. Los electrones que
rebotan de la muestra no pueden pasar por la abertura tan
pequeña en el plano focal posterior de la lente del objetivo y
por tanto no participan en la formación de la imagen.
La dispersión de los electrones por una parte de la mues-
tra es proporcional al tamaño de los núcleos de los átomos que
la componen. Como el material insoluble de las células está
compuesto por átomos que tienen un número atómico hasta
cierto punto bajo (carbono, oxígeno, nitrógeno e hidrógeno),
el material biológico tiene muy poca capacidad intrínseca para
dispersar los electrones. Los tejidos se fijan y tiñen con solu-
ciones de metales pesados (descritos más adelante) para au-
mentar la dispersión electrónica y obtener el contraste necesa-
rio. Estos metales penetran en la estructura de las células y
forman complejos selectivos con diferentes partes de los orga-
nelos. Las partes de una célula que se unen con la mayor can-
tidad de átomos metálicos permiten el paso de menor canti-
dad de electrones. Entre menos electrones se enfoquen en la
pantalla en un punto determinado, ese punto es más oscuro.
Las fotografías de la imagen se hacen al quitar la pantalla del
camino y permitir que los electrones golpeen una placa foto-
gráfica en posición por debajo de la pantalla. Como las emul-
siones fotográficas tienen una sensibilidad directa a los elec-
trones, tanto como a la luz, una imagen de la muestra se
registra directamente en la película. Como alternativa, la ima-
gen puede capturarse con una cámara de video CCD (pág.
738) empleada para vigilar el campo de visión. Aunque una
cámara de video proporciona una imagen instantánea sin la
necesidad de desarrollo químico, esta imagen carece de la alta
resolución excepcional que se obtiene con película. La imagen
analógica captada en el filme se transforma en imagen digital
por medio de digitalización.
Preparación de la muestra para la microscopia
electrónica
Como sucede con el microscopio óptico, los tejidos que se
examinarán con el microscopio electrónico deben fijarse, im-
pregnarse y cortarse. La fijación del tejido para la microscopia
electrónica (fig. 18.13) es mucho más crítica que para la mi-
croscopia óptica porque los cortes se someten a un escrutinio
más intenso. Un fijador debe suspender la vida de la célula sin
alterar mucho su estructura. Con el nivel de resolución del
microscopio electrónico, los daños relativamente menores,
como las mitocondrias hinchadas o el retículo endoplásmico
roto, se vuelven muy evidentes. Para obtener la fijación más
rápida y el menor daño celular, se fijan e impregnan fragmen-
tos muy pequeños de tejido (menos de 1.0 mm3). Los fijadores
son sustancias que desnaturalizan y a la vez precipitan las ma-
cromoléculas celulares. Las sustancias con este efecto pueden
ocasionar coagulación o precipitación de materiales que no
tenían una estructura en la célula viva, lo que conduce a la
formación de un artefacto. El mejor argumento de que una
estructura particular no es un artefacto es la demostración de
su existencia en células fijadas de diversos modos o, aún mejor,
sin fijación alguna. Para visualizar células que no se fijaron, el
tejido se congela con rapidez y se emplean técnicas especiales
para revelar su estructura (véase fijación con frío y replicación
por criofractura más adelante). Los fijadores más usuales para
la microscopia electrónica son el glutaraldehído y el tetróxido
de osmio. El glutaraldehído es un compuesto de cinco carbo-
nos con un grupo aldehído en cada extremo de la molécula.
Los grupos aldehídos reaccionan con los grupos amino de las
proteínas y establecen enlaces cruzados entre las proteínas
para formar una red insoluble. El osmio es un metal pesado
que reacciona sobre todo con los ácidos grasos, lo que permite
la preservación de las membranas celulares.
Una vez que el tejido se fija, el agua se retira mediante
deshidratación en alcohol y los espacios hísticos se llenan con
un material que soporta el corte del tejido. Las demandas de la
microscopia electrónica incluyen que los cortes sean muy del-
gados. Los cortes en cera para el examen con el microscopio
óptico rara vez son más delgados de 5 ␮m, mientras que los
cortes para la microscopia electrónica convencional son mejo-
 743
Lavado Lavado

Pequeño fragmento Tejido colocado

do en Etanol
Etanol Etanol
Etano
E ol Etanol
Etano
ol Óxido de
Ó Infiltración Tejido impregnado
de tejido (1 mm3) un segundo fijador
ador 70%
7 9
95% 100%% propileno
p en una solución en un medio plástico
colocado en fijador (p. ej., OsO4) de medio impregnador contenido
(p. ej., glutaraldehído) Deshidratación
D hid
id t ió de plástico (p. ej., resina en un recipiente
epóxica no polimerizada)

Ultramicrótomo

Bloque
de tejido

Borde
de navaja

El bloque que contiene el tejido se recorta El plástico en el recipiente se polimeriza

a fin de prepararse para el corte en un bloque sólido con el tejido
en el borde inferior del bloque
El tejido se divide en rebanadas de unos 100 nm
de espesor conforme el bloque se mueve
por el borde afilado de una navaja de vidrio o diamante.
Los cortes flotan en un espejo de agua
justo detrás del borde de la navaja

Gota de colorante
Rejilla a base de
metal pesado

Rejilla para microscopio electrónico Se tiñen los cortes

Vista en primer plano que contiene los cortes listos para teñirse
de los cortes en un listón con metales pesados, colocados
que flota en el espejo de agua en un sujetador de rejilla y examinados
en el microscopio electrónico

Figura 18.13 Preparación de una muestra para observación en el microscopio electrónico.

res cuando tienen menos de 0.1 ␮m (equivalente en grosor a casi siempre se realizan en tejidos impregnados con resinas

18.2 Microscopia electrónica de transmisión

cerca de cuatro ribosomas).
Por lo general los tejidos que van a cortarse para la mi-
croscopia electrónica se impregnan en resinas epóxicas, como
1,4-butanediol diglicidil entre otras. Las secciones se cortan
con el paso del bloque plástico sobre un borde cortante muy
afilado (fig. 18.13) hecho de vidrio o una hoja de diamante
finamente pulido. Los cortes obtenidos flotan en la superficie
de un fondo de agua que se encuentra justo detrás del borde de
la navaja. Los cortes se recogen luego con la rejilla metálica
para especímenes y se secan sobre su superficie. Para teñir el
tejido se deja que la rejilla flote sobre gotas de soluciones
de metales pesados, en especial acetato de uranilo y citrato de
plomo. Estos átomos de metales pesados se unen con las ma-
cromoléculas y brindan la densidad atómica necesaria para
dispersar el rayo electrónico. Además de las tinciones estándar,
los cortes de tejido pueden tratarse con anticuerpos marcados
con metal u otros materiales que reaccionan con moléculas
específicas en el corte de tejido. Los estudios con anticuerpos
acrílicas, que son más permeables a las grandes moléculas que
las resinas epóxicas.
Criofijación y uso de muestras congeladas Las células y
los tejidos no tienen que fijarse con sustancias químicas e im-
pregnarse con resinas plásticas para observarse con el micros-
copio electrónico. Una alternativa consiste en congelar con
rapidez las células y los tejidos. Justo como un fijador químico
detiene los procesos metabólicos y conserva la estructura bio-
lógica, lo mismo sucede con el congelamiento rápido, la crio-
fijación. Como la fijación en frío alcanza estas metas sin alterar
las macromoléculas celulares, es menos probable que se for-
men artefactos. La principal dificultad con la criofijación es la
formación de cristales de hielo, que crecen hacia fuera desde
sitios donde se forman sus núcleos. El cristal de hielo, con-
forme crece, destruye el frágil contenido de la célula en la que
se forma. La mejor manera de evitar la formación de cristales
de hielo es congelar la muestra con tanta rapidez que no haya
744 tiempo para que se formen los cristales. Es como si el agua se
congelara, pero permaneciera en su estado líquido. Se dice que
en tal estado el agua se encuentra “vitrificada”. Se usan varias
técnicas para alcanzar dichas velocidades de congelación ul-
trarrápidas. Las muestras más pequeñas casi siempre se su-
mergen en un líquido a muy baja temperatura (como propano
líquido, con punto de ebullición a ⫺42⬚C). Es mejor tratar los
especímenes más grandes con congelación a alta presión. En
esta técnica, la muestra se somete a presión hidrostática alta y
se rocía con chorros de nitrógeno líquido. La presión alta re-
duce el punto de congelación del agua, lo que disminuye la
velocidad de crecimiento de los cristales de hielo.
Podría no creerse que un bloque congelado de tejido tu-
viera mucha utilidad para un microscopista, pero pueden prac- (a)
ticarse una cantidad sorprendente de técnicas para visualizar
la estructura celular congelada en el microscopio óptico o elec-
trónico. Por ejemplo, después de la preparación adecuada, un
bloque congelado de tejido puede cortarse con un micrótomo
especial en forma similar a un bloque de tejido en parafina o
en plástico. Los cortes congelados (criosecciones) pueden pre-
pararse para su examen al microscopio óptico o al electrónico.
Los cortes congelados son muy útiles para estudios de enzi-
mas, cuya actividad tiende a desnaturalizarse con los fijadores
químicos. Como los cortes congelados pueden prepararse con
mucha mayor rapidez que los cortes en parafina o plástico, los
patólogos los usan a menudo para examinar al microscopio
óptico la estructura de tejidos extirpados durante una inter-
vención quirúrgica. Como resultado, puede establecerse si un
tumor es maligno o no mientras el paciente aún se encuentra
en la mesa de operaciones. (b)
Las células congeladas no tienen que cortarse para reve-
lar su estructura interna. La figura 1.11 muestra la imagen de Figura 18.14 Ejemplos de muestras con tinción negativa y som-
una región periférica delgada de una célula intacta que se bras metálicas. Micrografía electrónica de un virus cascabel de ta-
arrastró sobre la superficie de la rejilla del microscopio elec- baco después de la tinción negativa con fosfotungstato de potasio (a)
trónico un instante antes y se congeló rápidamente. A dife- o proyección de sombra con cromo (b). (Cortesía de M. K. Cor-
rencia de la microscopia electrónica estándar, la imagen de la bett.)
figura 1.11 tiene una calidad tridimensional porque se generó
con una computadora y no en forma directa con una cámara.
Para obtener la imagen, la computadora alinea una gran can-
tidad de imágenes digitales bidimensionales de la célula que de especímenes congelados, la replicación por criofractura y el
se capturan mientras la muestra se inclina en ángulos defini- análisis de partículas individuales.
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

dos en relación con el trayecto del haz de electrones. La re-

construcción computarizada tridimensional se llama tomo-
grama, y la técnica se denomina tomografía crioelectrónica
(crio-ET).1 Esta técnica fue desarrollada por Wolfgang Bau-
meister del Max-Planck Institute en Alemania y ha revolucio-
nado la forma en que pueden estudiarse las estructuras intra-
celulares de dimensiones nanométricas en células no fijadas,
bien hidratadas y congeladas en un momento. La crio-ET
también puede usarse para examinar la organización tridi-
mensional de las estructuras presentes in vitro, como ejempli-
fica la reconstrucción de un polisoma aislado en el acto de la
traducción que se muestra en la figura 11.52b. La crio-ET,
que puede alcanzar una resolución de unos cuantos nanóme-
tros, establece un puente importante entre los mundos celular
y molecular. En las páginas 745 y 759 se explican dos estrate-
gias más que requieren el análisis al microscopio electrónico
1
Esta técnica es similar en principio a la tomografía axial computarizada que
emplea una multitud de imágenes de rayos X tomadas en ángulos diferentes
del cuerpo para generar una imagen tridimensional. Por fortuna la maquina-
ria que se utiliza en la tomografía radiológica permite que la fuente de rayos
X y el detector roten mientras el paciente permanece quieto.
Tinción negativa El microscopio electrónico también es
adecuado para examinar partículas muy pequeñas, como virus,
ribosomas, enzimas con múltiples subunidades, elementos del
citoesqueleto y complejos proteínicos. También pueden resol-
verse las formas de proteínas individuales y ácidos nucleicos
con el microscopio, siempre y cuando tengan el contraste sufi-
ciente con los elementos que los rodean. Una de las mejores
formas para hacer visibles estas sustancias es emplear técnicas
de tinción negativa en las que los depósitos de metales pesa-
dos se acumulan en toda la rejilla de la muestra, excepto donde
hay partículas. Como resultado la muestra resalta en la panta-
lla por su brillantez relativa. Las figuras 2.39a y 18.14a pre-
sentan ejemplos de muestras con tinción negativa.
Modelo de sombra Otra técnica para visualizar partículas
aisladas consiste en hacer que los objetos proyecten sombras.
La técnica se describe en la figura 18.15. Las rejillas que con-
tienen las muestras se colocan en una cámara sellada, que
luego se evacua con una bomba de vacío. La cámara contiene
un filamento formado por un metal pesado (casi siempre pla-
tino) junto con carbono. El filamento se calienta a temperatu-
 Evaporación 745
de metal del
alambre de platino
Cámara
vacía Muestra

Muestra
Rejilla de la Freón líquido
muestra

Nitrógeno
líquido
Soporte de muestra

Cubierta de campana

Navaja fría

Muestra
Figura 18.15 Procedimiento utilizado para la proyección de
sombras por medio de contraste en el microscopio electrónico. A
menudo este procedimiento se emplea para visualizar partículas pe-
queñas, como los virus que se muestran en la figura previa. Con fre-
cuencia las moléculas de DNA y RNA se hacen visibles por una
modificación de este procedimiento que se conoce como formación Borde de navaja
de sombras rotatorias, en el que el metal se evapora en un ángulo
muy bajo mientras se gira la muestra.

ras altas, lo que hace que se evapore y deposite una cubierta

metálica sobre las superficies accesibles dentro de la cámara.
Como resultado el metal se deposita en las superficies que
quedan frente al filamento, mientras que las superficies opues- Fractura
tas de las partículas y el espacio en la rejilla que queda bajo su
sombra quedan sin cubierta. Cuando la rejilla se observa en el
microscopio electrónico, las áreas en sombra se ven brillantes
en la pantalla, en tanto que las regiones cubiertas con metal se
ven oscuras. Esta relación se invierte en la placa fotográfica, que
es el negativo de la imagen. La convención para ilustrar especí-
menes sombreados es imprimir una imagen negativa en la que
la partícula se vea iluminada por una luz blanca brillante (co-
Grabado
rrespondiente a la superficie cubierta), con una sombra oscura
proyectada por la partícula (fig. 18.14b). La técnica propor-
ciona un contraste excelente para materiales aislados y pro-
duce un efecto tridimensional.

Replicación por criofractura, y grabado por congela- 18.2 Microscopia electrónica de transmisión
miento Como ya se mencionó, varias técnicas de microsco-
pia electrónica se adaptaron para trabajar con tejidos congela-
dos. A menudo la ultraestructura de las células congeladas se Sombreado
observa con la técnica de replicación por criofractura, que se y replicación
ilustra en la figura 18.16. Se colocan pequeños fragmentos de Capa de
tejido en un disco metálico pequeño y se congelan con rapidez. carbono
Luego el disco se monta sobre una placa fría dentro de una
cámara de vacío y el bloque de tejido congelado se golpea con Capa de metal
Réplica observada
el borde de una navaja. El plano de fractura resultante se ex- en el microscopio electrónico
tiende desde el punto de contacto y divide el tejido en dos
piezas, algo similar a la manera en que una hoja de hacha se- Figura 18.16 Procedimiento para la formación de réplicas por
para en dos un trozo de madera. criofractura como se describe en el texto. El procedimiento de
Considérese lo que podría pasar cuando un plano de frac- congelación y grabado es un paso opcional en el que una capa
tura se extiende por una célula que contiene diversos organe- delgada de hielo que cubre la muestra se evapora para revelar
información adicional de la estructura de la superficie de la muestra
los con distintas composiciones. Estas estructuras tienden a
fracturada.
causar desviaciones en el plano de fractura, ya sea hacia arriba
746 o abajo, lo que produce elevaciones, depresiones y crestas en la
cara de fractura que reflejan los contornos del protoplasma
atravesado. Por consiguiente las superficies expuestas por la N
fractura contienen información respecto al contenido de la cé-
lula. El objetivo es hacer visible esta información. El proceso
de replicación se logra al usar la superficie de fractura como un N.P. N.E.
molde en el que se deposita una capa de metal pesado. El me-
tal pesado se deposita en la superficie nueva expuesta del te-
jido congelado en la misma cámara en la que se fracturó el
tejido. El metal se deposita en un ángulo para producir som-
bras que acentúen la topografía local (fig. 18.17), como se des-
cribe en la sección previa referente a proyección de sombras. G
G
Después se deposita una capa de carbono sobre la capa de
metal para cimentar los parches de metal en una superficie V
sólida. Una vez que se hizo el molde de la superficie, el tejido
que constituyó el molde puede descongelarse, retirarse y des-
echarse; la réplica de metal-carbono es la que se coloca en la C.W.
rejilla para muestra y se visualiza en el microscopio electró-
nico. Las variaciones en el grosor del metal en las distintas
partes de la réplica producen variaciones en la cantidad de
electrones penetrantes que llegan a la pantalla de visualiza-
ción, lo que produce el contraste necesario en la imagen.
Como se explica en el capítulo 4, los planos de fractura siguen
el trayecto de menor resistencia por el bloque congelado, lo Figura 18.17 Réplica de una célula de raíz de cebolla por criofra-
que a menudo los lleva por el centro de las membranas celula- tura que muestra la envoltura nuclear (N.E.) con sus poros nucleares
(N.P.), el aparato de Golgi (G), una vacuola citoplásmica (V) y la
res. Por ello, esta técnica es muy adecuada para examinar la
pared celular (C.W.). (Cortesía de Daniel Branton, Harvard
distribución de las proteínas integrales de membrana en su University.)
trayecto por la bicapa lipídica (como en las figs. 4.15, 7.30,
7.31 y 7.32). Tales estudios realizados por Daniel Branton y
otros investigadores tuvieron una parte importante en la for-
mulación de la estructura de mosaico fluido de las membranas
a principios del decenio de 1970 (pág. 124).
La replicación por criofractura por sí misma es una téc-
nica en extremo valiosa, pero puede aportar aún más informa-
ción si se incluye un paso llamado grabado por congela-
miento (fig. 18.16). En este paso, la muestra congelada y
fracturada, que aún permanece dentro de la cámara fría, se
expone al vacío a una temperatura alta por uno a unos cuantos
minutos, durante los cuales puede evaporarse (sublimarse) una
capa de hielo de la superficie expuesta. Luego de retirar parte
del hielo, la superficie de la estructura puede cubrirse con me-
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

tal pesado y carbono para crear una réplica metálica que revela
las superficies externa e interna de las membranas celulares. El
desarrollo de técnicas con grabado profundo realizado por John
Heuser, en las que se retiran mayores cantidades de hielo su-
perficial, permitieron una mirada fascinante de los organelos
celulares. Las figuras 18.18, 8.38 y 9.46 presentan ejemplos de
muestras preparadas con esta técnica en los que puede verse
que las partes individuales de la célula sobresalen en relieve
contra el fondo. La técnica brinda una resolución muy alta y
puede usarse para revelar la estructura y la distribución de los
complejos macromoleculares, como los del citoesqueleto, como
se supone que existen dentro de la célula viva.

Figura 18.18 Grabado profundo. Micrografía electrónica de axo-

18.3 | Microscopia electrónica
de barrido y microscopia
de fuerza atómica
La microscopia electrónica de transmisión (TEM) se explota
más en el examen de la estructura interna de las células. En
cambio, el microscopio electrónico de barrido (SEM) se em-
nemas ciliares del protozoario Tetrahymena. Los axonemas se fijaron,
congelaron y fracturaron, el agua congelada de la superficie del blo-
que fracturado se evaporó, lo que dejó una porción de los axonemas
en relieve, tal como se visualiza en esta réplica metálica. La flecha
indica una hilera distintiva de brazos de dineína. (Tomada de Ur-
sula W. Goodenough y John E. Heuser, J. Cell Biol. 95:800,
1982, fig. 3, fotografía de la derecha. Reimpresa con auto-
rización de the Rockefeller University Press.)

(a)
plea sobre todo para examinar las superficies de los objetos
cuyo tamaño varía desde un virus hasta la cabeza de un animal
(fig. 18.19). La construcción y la operación del SEM son muy
diferentes a las del TEM. El objetivo de la preparación de la
muestra para el SEM es producir un objeto que tenga las mis-
mas propiedades de forma y superficie que en el estado vivo,
pero que carezca de líquido, ya que esto es necesario para ob-
servar la muestra al vacío. Como el agua constituye un porcen-
taje muy alto del peso de las células vivas y se encuentra rela-
cionada con todas las macromoléculas, su extracción puede
tener un efecto muy destructivo en la estructura celular.
Cuando las células sólo se secan al aire, la destrucción se debe
sobre todo a la tensión superficial en las interfaces agua-aire.
Las muestras que se examinarán con el SEM se fijan, se pasan
por una serie de alcoholes y luego se secan en un proceso de
secado de punto crítico. El secado de punto crítico ofrece la ven-
taja de que cada solvente tiene una temperatura y una presión
críticas en las que la densidad del vapor es igual a la densidad
del líquido. En este punto no hay tensión superficial entre el
gas y el líquido. El solvente de las células se sustituye con un
líquido de transición (por lo general dióxido de carbono), que
se vaporiza a presión para que las células no se expongan a
ninguna tensión superficial que pudiera distorsionar su confi-
guración tridimensional.
Una vez que la muestra se seca, se cubre con una capa
delgada de metal, lo que lo convierte en un blanco adecuado
para un rayo de electrones. En el microscopio electrónico de
transmisión, el rayo de electrones se enfoca mediante las lentes
del condensador para iluminar al mismo tiempo todo el
campo de visión. En el microscopio electrónico de barrido, los
747
(b)
Figura 18.19 Microscopia electrónica de barrido. Micrografías
electrónicas de barrido de (a) un bacteriófago T4 (⫻275 000) y (b)
la cabeza de un insecto (⫻40). (a: tomada de A.N. Broers, B.J.
Panessa, y J.F. Gennaro, Science 189:635, 1975; © 1975. Reim-
presa con permiso de AAAS; b: por cortesía de H.F. Howden
y L.E.C. Ling.)
18.3 Microscopia electrónica de barrido y microscopia de fuerza atómica
electrones se aceleran en un rayo fino que barre la muestra. En
el TEM, los electrones pasan por la muestra para formar una
imagen; en el SEM, ésta se forma con los electrones que se
reflejan desde la muestra (se dispersan de regreso) o con los
electrones secundarios que la muestra emite después de ser
golpeada por el rayo electrónico primario. Tales electrones
golpean un detector que se localiza cerca de la superficie de la
muestra.
La formación de la imagen en el SEM es indirecta. Ade-
más del rayo que explora la superficie de la muestra, otro rayo
electrónico explora al mismo tiempo la cara de un tubo de rayos
catódicos y produce una imagen similar a la que se observa en
una pantalla de televisión. Los electrones que rebotan de la
muestra y llegan al detector controlan la fuerza del rayo en el
tubo de rayos catódicos. Mientras más electrones se recolecten
de la muestra en un punto determinado, más fuerte es la señal
para el tubo y mayor la intensidad del rayo en la pantalla en el
punto correspondiente. El resultado es una imagen en la pan-
talla que refleja la topología superficial de la muestra porque es
su topología (grietas, colinas y orificios) lo que determina el
número de electrones reunidos de las diversas partes de la su-
perficie.
Como resulta evidente en las fotografías de la figura
18.19, un SEM puede proveer un alto grado de magnificación
(desde cerca de 15 hasta 150 000 veces la de un instrumento
estándar). El poder de resolución de un SEM depende del
diámetro del rayo electrónico. Los modelos más nuevos son
capaces de alcanzar resoluciones menores de 5 nm, que se
emplean para localizar anticuerpos marcados con oro unidos
con la superficie celular. El SEM también proporciona una
748 profundidad de enfoque notable, unas 500 veces más que el
microscopio óptico con una magnificación correspondiente.
Esta propiedad da a las imágenes del SEM su calidad tridi-
mensional. A nivel celular, el SEM permite al observador
apreciar la estructura de la superficie externa de las células y
todos los procesos, extensiones y materiales extracelulares di-
versos que interactúan con el ambiente.
Microscopia de fuerza atómica
Aunque no es electrónico, el microscopio de fuerza atómica
(AFM, atomic force microscope) es un instrumento de barrido
de alta resolución cada vez más importante en nanotecnología
y biología molecular. En el texto se presentan varias imágenes
obtenidas por AFM: las figuras 4.24a, 5.25, 7.32c, 9.7 y 9.52.
EL AFM opera mediante la exploración de la superficie de la
muestra con una punta (sonda) aguda de tamaño nanomé-
trico. En un tipo de AFM, la sonda está unida con un dimi-
nuto haz oscilante (o ménsula) cuya frecuencia de oscilaciones
cambia cuando la punta encuentra variaciones en la topografía
de la muestra. Tales cambios en la oscilación del haz pueden
convertirse en una imagen topográfica tridimensional de la
superficie de la muestra. A diferencia de otras técnicas para
determinar la estructura molecular, como la cristalografía con
rayos X y la crio-EM, que promedian la estructura de muchas
Detector de posición
Haz del AFM
de láser
Extremo y elemento
voladizo del AFM
Muestra
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Piezoactuador de dirección Z
Figura 18.20 Microscopia de fuerza atómica de alta velocidad.
El esquema señala los elementos básicos de HS-AFM. El operador
“coloca” la muestra en un componente (el piezoactuador) unido a la
platina del microscopio (no se muestra). Las señales provenientes
del actuador hacen que el segmento voladizo oscile hacia arriba y
abajo, de modo que de manera intermitente el extremo del AFM
contacta la muestra a medida que rastrea la superficie de ella. Las
fuerzas que surgen entre la muestra y el extremo del AFM originan
deflexiones del extremo, que son detectadas por un haz láser que es
reflejado fuera de la superficie trasera del extremo del AFM. Los
movimientos de la posición del rayo láser, que reflejan diferencias
topográficas en toda la superficie de la muestra, son identificados
por un detector de posición, y tal información se utiliza para “elabo-
rar” una imagen de la muestra. La sucesión de imágenes basadas en
AFM, propias del movimiento de la molécula de miosina V que se
señala en la figura 9.52 fue “filmada” a razón de 7 cuadros por se-
gundo. (Tomada de C. Veigel y C.P. Schmidt, Nature Revs.
Mol. Cell Biol. 12:166, 2011; copyright 2011. Nature Re-
views Molecular Cell Biology by Nature Publishing Group.
Reimpreso con autorización de Nature Publishing Group
en el formato de reproducción como libro de texto de co-
pyright Clearance Center.)
moléculas individuales, el AFM brinda una imagen sólo para
cada molécula individual tal como está orientada en el campo
(fig. 5.25). Otra limitación de la microscopia electrónica y de
las técnicas cristalográficas radiográficas es que pueden gene-
rar sólo imágenes estáticas o instantáneas. El AFM de alta
velocidad (HS-AFM, high-speed atomic force microscope) que se
señala esquemáticamente en la figura 18.20, permite a los in-
vestigadores obtener imágenes seriadas rápidamente de una
macromolécula, de forma que su actividad pueda ser “ras-
treada” en tiempo real. La técnica se ilustra elegantemente en
las micrografías de la figura 9.52, que muestran los pasos to-
mados por una sola molécula de miosina V en su trayectoria
por un filamento de actina. Un progreso extraordinario lo
constituye la posibilidad de contemplar la trayectoria diná-
mica de una molécula individual, en el momento de realizar
sus actividades normales, en un campo que ha sido el estudio
de la estructura de tales moléculas por más de 50 años.
La sonda de un AFM se utiliza más que como un dispo-
sitivo de vigilancia; también se usa como un “nanomanipula-
dor” para empujar o jalar la muestra en el intento por medir
varias propiedades mecánicas. Esta capacidad se ilustra en la
figura 9.7, donde se muestra que un solo filamento intermedio
puede estirarse hasta varias veces su longitud normal. En un
protocolo diferente, la punta del AFM puede cubrirse con li-
gandos para un receptor particular y pueden hacerse medicio-
nes de la afinidad de ese receptor por el ligando en cuestión.
Por sus múltiples usos potenciales, el AFM se ha denominado
“un laboratorio en una punta”.
18.4 | Uso de radioisótopos
Un rastreador es una sustancia que revela su presencia de una
forma u otra y por lo tanto, puede localizarse o vigilarse du-
rante el curso de un experimento. Según la sustancia y el tipo
de experimento, un rastreador puede marcarse con fluorescen-
cia, con giro, densidad o radiación. En cada caso un grupo
marcado permite detectar una molécula sin afectar la especifi-
cidad de sus interacciones. Por ejemplo, las moléculas radiac-
tivas participan en las mismas reacciones que las no radiacti-
vas, pero su localización puede seguirse y es posible medir la
cantidad presente.
La identidad de un átomo (ya sea de hierro, cloro o de
algún otro elemento) y sus propiedades químicas se identifi-
can mediante el número de protones que hay en su núcleo.
Todos los átomos de hidrógeno tienen un solo protón, los de
helio poseen dos, los de litio tienen tres, etc. Sin embargo, no
todos los átomos de hidrógeno, helio o litio albergan la misma
cantidad de neutrones. Se dice que los átomos con el mismo
número de protones y distinta cantidad de neutrones son
isótopos uno del otro. Aún el hidrógeno, el elemento más sim-
ple, puede existir como tres isótopos distintos, según la pre-
sencia de cero, uno o dos neutrones en el núcleo del átomo. De
estos tres isótopos de hidrógeno, sólo el que contiene dos neu-
trones es radiactivo, se trata del tritio (3H).
Los isótopos son radiactivos cuando contienen una com-
binación inestable de protones y neutrones. Los átomos que
son inestables tienden a romperse o desintegrarse, con lo cual
alcanzan una configuración más estable. Cuando un átomo se
desintegra, libera partículas o radiación electromagnética que
puede vigilarse con los instrumentos apropiados. Los isótopos
radiactivos se encuentran en toda la tabla periódica de los ele-
mentos y pueden producirse en el laboratorio a partir de ele- Cuadro 18.1 Propiedades de varios radioisótopos 749
mentos no radiactivos. Muchas moléculas biológicas pueden usados en la investigación biológica
obtenerse en estado radiactivo, o sea, con uno o más átomos
radiactivos como parte de su estructura. Símbolo y Tipo de partículas
peso atómico Vida media emitidas
La vida media (t1/2) de un radioisótopo es una medida de
3
su inestabilidad. Entre más inestable sea un isótopo particular, H 12.3 años Beta
11
mayor es la probabilidad de que un átomo determinado se C 20 min Beta
14
desintegre en un tiempo específico. Si se comienza con un C 5 700 años Beta
24
Na 15.1 h Beta, gamma
Curie2 de tritio, la mitad de esa cantidad de material radiac- 32
P 14.3 días Beta
tivo quedará después de unos 12 años (que es la vida media de 35
S 87.1 días Beta
42
este radioisótopo). Durante los primeros años de la investiga- K 12.4 h Beta, gamma
45
ción de la fotosíntesis y otras vías metabólicas el único isótopo Ca 152 días Beta
59
Fe 45 días Beta, gamma
del carbono disponible era 11C, cuya vida media es cercana a 60
Co 5.3 años Beta, gamma
20 min. Los experimentos con 11C se realizaban con mucha 64
Cu 12.8 h Beta, gamma
65
prisa para poder medir la cantidad de isótopo incorporado Zn 250 días Beta, gamma
131
antes que la sustancia desapareciera. La disponibilidad del 14C I 8.0 días Beta, gamma
en el decenio de 1950, un radioisótopo con una vida media de
5 700 años, se recibió con gran celebración. Los radioisótopos
de mayor importancia en la investigación biológica celular se
listan en el cuadro 18.1, junto con la información de su vida
media y la naturaleza de su radiación.
Los átomos liberan tres formas principales de radiación a la luz o los rayos X que activan la emulsión que cubre un
durante su desintegración. Es posible que el átomo libere una fragmento de película. Si la emulsión fotográfica se pone en
partícula alfa, que consiste en dos protones y dos neutrones, y contacto con una fuente radiactiva, las partículas emitidas por
es equivalente al núcleo de un átomo de helio; una partícula la fuente dejan granos de plata negros y diminutos en la emul-
beta, que equivale a un electrón, además puede existir radiación sión después del revelado fotográfico. La autorradiografía se
gamma, que consiste en radiación electromagnética o fotones. usa para localizar radioisótopos dentro de cortes de tejidos
Los isótopos más usuales son los emisores beta, que se vigilan que se inmovilizaron en una laminilla o una rejilla para el
mediante una de dos metodologías diferentes: espectrometría microscopio electrónico de transmisión. Los pasos de la pre-
líquida por centelleo o autorradiografía. paración de una autorradiografía microscópica óptica se
La espectrometría por centelleo líquido se usa para medir la muestran en la figura 18.21. La emulsión se aplica a los cortes
cantidad de radiactividad en una muestra dada. Esta técnica se en la laminilla o la rejilla a manera de capa muy delgada y la
basa en la propiedad de ciertas moléculas, llamadas fosforescen- muestra se coloca en un recipiente a prueba de luz para per-
tes o centelleantes, de absorber parte de la energía de una partí- mitir que la emulsión se exponga por las emisiones. La canti-
cula emitida y liberarla en la forma de luz. Al preparar una dad de granos de plata que se forman es mayor entre más
muestra para conteo por centelleo en líquido, se mezcla la tiempo permanece la muestra antes del revelado. Cuando la
muestra con una solución de la sustancia fosforescente en una laminilla o rejilla revelada se examina al microscopio, la loca-
ampolleta de centelleo de vidrio o plástico. Esto coloca el ma- lización de los granos de plata en la capa de emulsión que
terial fosforescente y el isótopo radiactivo en contacto muy cubre el tejido indica la localización de la radiactividad en las
estrecho, de modo que incluso los emisores beta más débiles células subyacentes. En la figura 8.3a se incluye una microgra-
pueden medirse de manera eficiente. Una vez hecha la mezcla, fía con microscopio electrónico.
la ampolleta se coloca en el instrumento de conteo, donde se
hace descender en un pozo cuyas paredes contienen un foto-
detector extremadamente sensible. Cuando los átomos radiac-
tivos contenidos en la ampolleta se desintegran, las partículas
18.5 | Cultivo celular
emitidas activan las moléculas fosforescentes, que emiten des- En todo este libro se ha recalcado la técnica de la biología
tellos de luz, que se detectan por una fotocelda, y la señal se celular con la que se intenta comprender procesos particulares
amplifica en un tubo fotomultiplicador dentro del contador. mediante el análisis en un sistema in vitro simplificado y con-
Después de corregir tomando en cuenta el ruido de fondo, la trolado. La misma estrategia puede aplicarse al estudio de las
cantidad de radiactividad presente en cada ampolleta se ex- células porque también pueden extraerse de las influencias a
hibe en una gráfica. las que están sujetas dentro de un organismo multicelular
La autorradiografía es una técnica muy amplia que se complejo. El aprendizaje de cómo cultivar células fuera de un
emplea para localizar los sitios que contienen un isótopo es- organismo es uno de los logros técnicos más valiosos en todo
pecífico, ya sea en una célula, un gel de poliacrilamida o un el estudio de la biología. Un vistazo a cualquier publicación de
filtro de nitrocelulosa. Los experimentos de pulso y segui- biología celular revela que la mayor parte de los artículos des-
18.5 Cultivo celular

miento que se presentan en la página 273 describen la impor-
tancia de la autorradiografía en los descubrimientos iniciales
de las actividades sintéticas de las células. La autorradiografía
aprovecha la capacidad de una partícula emitida por un átomo
radiactivo para activar una emulsión fotográfica, muy similar
2
Un Curie es la cantidad de radiactividad necesaria para causar 3.7 ⫻ 1010
desintegraciones por segundo.
cribe investigaciones realizadas en células cultivadas. Las razo-
nes de esto son muchas: las células cultivadas pueden obte-
nerse en grandes cantidades; casi todos los cultivos contienen
sólo un tipo de célula; muchas actividades celulares distintas,
como la endocitosis, el movimiento celular, la división celular,
el tráfico de membrana y la síntesis de macromoléculas, pue-
den estudiarse en un cultivo celular; las células pueden dife-
renciarse en un cultivo, y las células cultivadas responden al
750 Figura 18.21 Pasos seguidos durante la realización de una auto-
radiografía con microscopio corriente.
Lavar y fijar Células
las células deshidratadas
y embebidas en Sección
cera o plástico. plástica
Corte del Células
bloque de
cera o
Incubar las células Células Portaobjetos
plástico
en un compuesto en el fijador
radiactivo

Portaobjetos

Emulsión líquida

Corte
Vasija de inmersión

Almacenar los
Sumergir el portaobjetos
portaobjetos hasta
en emulsión sensible
que estén listos
a la radiación en
para procesar
el cuarto oscuro
Revelar

Vista superior Vista lateral

Capa de
Granos de plata
emulsión

Corte Célula
Granos de plata
Granos de plata Portaobjetos
en el fondo
sobre la célula
Portaobjetos después del procesamiento

tratamiento con fármacos, hormonas, factores de crecimiento
y otras sustancias activas.
Los primeros investigadores en cultivar células emplea-
ban medios que contenían una gran variedad de sustancias
desconocidas. El crecimiento celular se lograba con la adición
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Como son tan ricos en nutrimentos, los medios para cul-
tivo celular son un hábitat que invita al crecimiento de mi-
croorganismos. A fin de prevenir la contaminación bacteriana
de los cultivos celulares, los expertos cultivadores de tejido
deben tomar medidas muy estrictas para mantener las condi-

de líquidos obtenidos de sistemas vivos, como linfa, suero san-
guíneo, u homogeneizados de embrión. Se descubrió que las
células necesitaban una variedad considerable de nutrimentos,
hormonas, factores de crecimiento y cofactores para mante-
nerse sanas y proliferar. Aun ahora la mayor parte de los me-
dios de cultivo contiene grandes cantidades de suero. La im-
portancia del suero (o los factores de crecimiento que contiene)
en la proliferación de células cultivadas se muestra en las cur-
vas de crecimiento celular de la figura 16.4.
Uno de los principales objetivos de los cultivadores de
células es desarrollar medios definidos libres de suero que
mantengan el crecimiento de las células. Con un abordaje
pragmático en el que se prueban combinaciones de varios in-
gredientes para comprobar su capacidad para sostener el creci-
miento y la proliferación celulares, cada vez se cultivan con
éxito más células en medios “artificiales” que carecen de suero
u otros líquidos naturales. Como era de esperarse, la composi-
ción de estos medios químicos es relativamente compleja;
consisten en una mezcla de nutrimentos y vitaminas, junto
con diversas proteínas purificadas que incluyen insulina, factor
de crecimiento epidérmico y transferrina (que proporciona
hierro a la célula).
ciones estériles en su espacio de trabajo. Esto se logra con el
uso de guantes estériles y la esterilización de todos los sumi-
nistros y equipo, con el empleo de niveles bajos de antibióticos
en los medios, además de la realización de las actividades bajo
una campana estéril.
El primer paso en el cultivo celular es la obtención de
células. En la mayor parte de los casos sólo debe extraerse una
ampolleta de células congeladas cultivadas con anterioridad de
un tanque de nitrógeno líquido, descongelar la ampolleta y
transferir las células al medio de espera. Un cultivo de este tipo
se conoce como cultivo secundario porque las células provie-
nen de un cultivo previo. En un cultivo primario las células se
obtienen del organismo. Casi todos los cultivos primarios de
células animales se toman de embriones, cuyos tejidos se diso-
cian con más facilidad en células que los tejidos de los adultos.
La disociación se efectúa con la ayuda de una enzima proteo-
lítica, como la tripsina, que digiere los dominios extracelulares
de las proteínas que median la adhesión celular (cap. 7). Luego
el tejido se lava para eliminar la enzima y por lo general se
suspende en una solución salina que carece de iones Ca2⫹ y
contiene una sustancia, como tetraacetato de etilenediamina
(EDTA), que se une (quela) con los iones de calcio. Como se

(a)
Figura 18.22 Comparación de la morfología de células que cre-
cen en cultivos 2D y en cultivos 3D. (a) Fibroblasto humano que
crece en un sustrato plano cubierto con fibronectina en un cultivo
2D asume una forma muy aplanada con lamelipodios anchos. Las
adhesiones que contienen integrina se ven blancas. (b) El mismo
tipo de célula cultivada en una matriz 3D asume una conformación
explica en el capítulo 7, los iones de calcio desempeñan una
función clave en la adhesión celular y su eliminación de los
tejidos facilita mucho la separación de las células.
Las células normales (no malignas) pueden dividirse una
cantidad limitada de veces (por lo general 50 a 100) antes de
envejecer y morir (pág. 508). Por ello muchas de las células que
suelen usarse en los estudios con cultivo de tejido se someten
a modificaciones genéticas que les permiten crecer por tiempo
indefinido. Las células de este tipo se conocen como línea
celular y casi siempre crecen para formar tumores malignos
cuando se inyectan en animales de laboratorio susceptibles. La
frecuencia con la que una célula normal que crece en cultivo se
transforma de manera espontánea en una línea celular de-
pende del organismo del que proviene. Por ejemplo, las células
de ratón se transforman con una frecuencia más o menos alta;
las células humanas se transforman sólo raras veces, si es que
sucede. Las líneas celulares humanas (p. ej., células HeLa) sue-
len derivarse de tumores humanos o de células tratadas con
virus o sustancias que causan cáncer.
Varios laboratorios están dejando atrás los sistemas de
cultivo bidimensional tradicionales, en los que las células cre-
cen sobre una superficie plana o una caja de cultivo, y se están
orientando a los sistemas tridimensionales, en los que las célu-
las crecen en una matriz tridimensional consistente en mate-
riales extracelulares sintéticos, naturales o ambos. Estos mate-
riales pueden adquirirse como productos que contienen
proteínas y otros componentes derivados de membranas basa-
les naturales (fig. 7.4 y 7.8). Las células en el cuerpo no viven
en superficies planas y duras como plástico y por consiguiente,
se cree que las matrices tridimensionales brindan un ambiente
mucho más natural para las células cultivadas. Por consi-
751
(b)
fusiforme no aplanada. La matriz de fibronectina extracelular
aparece en azul. La barra equivale a 10 μm. (Tomada de Edna
Cukierman, Cell 130:603, 2007, fig. 1, reimpresa con autori-
zación de Elsevier. Por cortesía de Kenneth M. Yamada,
National Institute of Dental and Craniofacial Research,
Nih.)
guiente, la morfología y comportamiento de las células en es-
tos ambientes tridimensionales se parecen más a las células
observadas en los tejidos del cuerpo. Esto se refleja en las dife-
rencias de la organización citoesquelética, tipos de adhesiones
celulares, actividades de señalización y estados de diferencia-
ción de las células en los dos tipos de sistemas de cultivo. Ade-
más, los sistemas de cultivo 3D también son más adecuados
para estudiar las interacciones entre células porque les permi-
ten estar en contacto unas con otras en cualquier punto de su
superficie. La figura 18.22 muestra imágenes de fibroblastos
humanos cultivados en una superficie plana o en una matriz
tridimensional. La célula en la figura 18.22a está presionada
contra el sustrato, lo que crea una superficie superior (dorsal)
e inferior (ventral) muy poco natural con lamelipodios dema-
siado anchos y aplanados. En cambio, el mismo tipo de célula
en cultivo 3D (fig. 18.22b) tiene una estructura fusiforme tí-
pica sin diferenciación superficial evidente.
Muchos tipos distintos de células vegetales también pue-
den crecer en cultivo. En una técnica, las células vegetales se
tratan con la enzima celulasa, que digiere la pared celular y li-
bera la célula desnuda o protoplasto. Entonces los protoplas-
tos pueden cultivarse en un medio químico definido que pro-
mueve su crecimiento y división. En las condiciones adecuadas
18.5 Cultivo celular
las células pueden crecer en un cúmulo indiferenciado de célu-
las llamado callo, en el que es posible inducir el desarrollo de
brotes de los que la planta puede regenerarse. En una técnica
alternativa, con tratamiento hormonal puede hacerse que las
células del tejido de la hoja pierdan sus propiedades diferen-
ciadas y se transformen en material de callo. El callo puede
transferirse después a un medio líquido para iniciar un cultivo
celular.

752
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
18.6 | Fraccionamiento
del contenido de una célula
mediante centrifugación
diferencial
La mayor parte de las células contiene una variedad de orga-
nelos distintos. Si se pretende estudiar una función particular
de las mitocondrias o aislar una enzima particular del aparato
de Golgi, es conveniente aislar primero el organelo relevante
en estado purificado. El aislamiento de un organelo particular
en gran cantidad suele lograrse mediante la técnica de centri-
fugación diferencial, que depende del principio de que, en
tanto sean más densas que el medio circundante, las partículas
de diferente tamaño y forma viajan hacia el fondo de un tubo
centrifugado a distintas velocidades cuando se colocan en un
campo de centrifugación.
Para efectuar esta técnica se procede primero a la rotura
mecánica de las células con un homogeneizador mecánico. Las
células se homogeneizan en una solución amortiguada isotó-
nica (que a menudo contiene sacarosa), lo que previene la ro-
tura de las vesículas de membrana por ósmosis. El homoge-
neizado se somete a una serie de centrifugaciones secuenciales
cada vez con mayor fuerza centrífuga. Los pasos de esta téc-
nica se explican en el capítulo 8 y se ilustran en la figura 8.5.
Al principio el homogenizado se somete a fuerzas centrífugas
bajas por un periodo corto para que sólo los organelos celula-
res más grandes, como los núcleos (y cualquier célula completa
remanente), se sedimenten en una “pastilla”. Los organelos
citoplásmicos relativamente grandes (mitocondrias, cloroplas-
tos, lisosomas y peroxisomas) pueden separarse de la suspen-
sión con fuerzas centrífugas mayores (fig. 8.5). Los microso-
mas (fragmentos de membranas vacuolares y reticulares del
citosol) y los ribosomas de la suspensión se retiran en los pasos
subsiguientes. Este último paso requiere la ultracentrífuga,
que puede generar velocidades de 75 000 revoluciones por mi-
nuto que producen fuerzas equivalentes a 500 000 veces la
gravedad. Una vez que los ribosomas se retiran, el sobrena-
dante consiste en la fase soluble de la célula y las partículas
demasiado pequeñas para retirarse por sedimentación.
Puesto que los pasos iniciales de la centrifugación dife-
rencial no producen preparaciones puras de un organelo par-
Material resuspendido
de la pastilla
de 20 000 g
Lisosomas llenos
con Tritón
WR1339
Sacarosa (1.12 g/ml)
1 molar 65 000 g/2 h
Mitocondrias
Gradiente (1.18 g/ml)
de densidad
Sacarosa de sacarosa Peroxisomas
(1.23 g/ml)
2 molar
Figura 18.23 Purificación de fracciones subcelulares por centri-
fugación de equilibrio con gradiente de densidad. En este ejemplo
particular, el medio se compone de un gradiente de densidad conti-
nuo de sacarosa y los distintos organelos se sedimentan hasta que
llegan a un sitio en el tubo igual a su propia densidad, donde forman
bandas. La pastilla de 20 000 g se obtiene como se muestra en la fi-
gura 8.5.
ticular, casi siempre se requieren pasos adicionales. En muchos
casos se logra una purificación adicional mediante centrifuga-
ción de una de las fracciones a través de un gradiente de den-
sidad, como se muestra en la figura 18.23, lo que distribuye el
contenido de la muestra en varias capas de acuerdo con su
densidad. La composición de varias fracciones puede determi-
narse con el examen microscópico o la medición de las canti-
dades de proteínas particulares conocidas como específicas de
organelos particulares.
Los organelos celulares aislados por centrifugación dife-
rencial conservan un nivel notable de actividad normal, siempre
que no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el
aislamiento. Los organelos aislados con este procedimiento
pueden usarse en sistemas libres de células para estudiar una
gran variedad de actividades celulares, incluida la síntesis de
proteínas unidas a la membrana (pág. 276), formación de ve-
sículas de transporte (pág. 293), síntesis de DNA (pág. 559) y
el transporte de solutos y desarrollo de gradientes iónicos (fig.
5.23).
18.7 | Aislamiento, purificación
y fraccionamiento de proteínas
En el curso de este libro se consideran las propiedades de
muchas proteínas. La proteína debe aislarse en un estado rela-
tivamente puro antes de poder obtener información de la es-
tructura o la función de una proteína particular. Como la ma-
yor parte de las células contiene miles de proteínas diferentes,
la purificación de una sola especie puede ser todo un desafío,
en especial si la proteína se encuentra en baja concentración
en la célula. En esta sección se revisan de manera breve sólo
algunas de las técnicas empleadas para purificar las proteínas.
Por lo general la purificación de una proteína se realiza
mediante la eliminación de los contaminantes por pasos. Es
posible que dos proteínas sean muy similares en cuanto a una
propiedad, como la carga general, y muy distintas en otra,
como el tamaño o la forma moleculares. Por consiguiente, la
purificación completa de una proteína determinada suele re-
querir el uso de técnicas sucesivas que aprovechan las diferen-
tes propiedades de las proteínas que se separan. La purifica-
ción se mide como un incremento en la actividad específica,
que es el índice entre la cantidad de esa proteína y el total de
proteína presente en la muestra. Debe emplearse algún rasgo
identificable de la proteína específica como prueba para iden-
tificar la cantidad relativa de esa proteína en la muestra. Si la
proteína es una enzima, puede recurrirse a su actividad catalí-
tica como prueba para vigilar la purificación. Una alternativa
consiste en basar las pruebas en criterios inmunológicos, elec-
troforéticos, microscópicos electrónicos u otros. Las medicio-
nes de la proteína total en una muestra pueden hacerse con
varias propiedades, inclusive el nitrógeno total, que puede me-
dirse con gran precisión y es bastante constante en cerca de
16% del peso seco de todas las proteínas.
Precipitación selectiva
El primer paso en la purificación selectiva debe ser uno que
pueda realizarse en una preparación muy impura y pueda pro-
ducir un gran aumento en la actividad específica. Por lo gene-
ral el primer paso aprovecha las diferencias en la solubilidad
entre las proteínas mediante la precipitación selectiva de la
proteína deseada. Las propiedades de solubilidad de una pro-
teína dependen mucho de la distribución de cadenas laterales
hidrófilas e hidrófobas en su superficie. La solubilidad de una
proteína en una solución determinada depende de un equili-
brio relativo entre las interacciones proteína-solvente que la
mantienen en solución y de las interacciones proteína-pro-
teína que hacen que se agregue y precipite de la solución. La
sal que más se utiliza para la precipitación selectiva de proteí-
nas es el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua y tiene
una gran fuerza iónica. La purificación se logra mediante la
adición gradual de una solución saturada de sulfato de amonio
al extracto crudo de proteína. Conforme la adición de la sal
continúa, la precipitación de las proteínas contaminantes au-
menta y el precipitado puede desecharse. Al final se alcanza un
punto en el que la proteína que se busca se separa de la solu-
ción. Este punto se reconoce por la pérdida de actividad en la
fracción soluble cuando se prueba con el ensayo particular que
se utilice. Una vez que la proteína deseada se precipita, las
proteínas contaminantes se dejan en la solución, mientras que
la proteína buscada puede disolverse de nuevo.
Cromatografía líquida en columna
Cromatografía es un término que designa varias técnicas en
las que una mezcla de componentes disueltos se fracciona a su
paso por cierto tipo de matriz porosa. En las técnicas de cro-
matografía líquida, los componentes en una mezcla pueden
unirse con una de dos fases alternativas: una fase móvil, con-
sistente en un solvente en movimiento, y una fase inmóvil, que
es la matriz a través de la cual se mueve el solvente.3 La fase
inmóvil de los procedimientos cromatográficos, que se descri-
ben más adelante, consiste en materiales que se empacan en
una columna. Las proteínas que van a fraccionarse se disuel-
ven en un solvente y luego se pasan por la columna. Los ma-
teriales que conforman la fase inmóvil contienen sitios a los
que las proteínas en solución pueden unirse. Conforme las
todas las cargas individuales de sus aminoácidos componentes. 753
Como la carga de cada aminoácido depende del pH del medio
(fig. 2.27), la carga de cada proteína también depende del pH.
Cuando el pH disminuye, los grupos con carga negativa se
neutralizan y los grupos con carga positiva se vuelven más
numerosos. Lo contrario ocurre cuando el pH aumenta. Existe
un pH para cada proteína en el que el número total de cargas
negativas es igual al de cargas positivas. Este pH es el punto
isoeléctrico, en el que la proteína es neutra. El punto isoeléc-
trico de la mayor parte de las proteínas está por debajo del
pH 7.
La carga iónica se usa como base para la purificación en
diversas técnicas, incluida la cromatografía con intercambio
iónico. Ésta depende de los enlaces iónicos de proteínas con
un material matriz inerte, como la celulosa, que contiene gru-
pos con carga eléctrica unidos por enlaces covalentes. Dos de
las resinas de intercambio iónico más usuales son la dietilami-
noetilcelulosa (DEAE) y la carboximetilcelulosa (CM). La
DEAE-celulosa tiene cargas positivas, por lo que se une con
moléculas de carga negativa; es un intercambiador de aniones.
La CM-celulosa posee carga negativa y es un intercambiador
de cationes. La resina se empaca en una columna y se permite
que la solución de proteína pase por la columna en un amorti-
guador cuya composición promueve la unión de algunas o to-
das las proteínas con la resina. Las proteínas se unen con la
resina en forma reversible y pueden desplazarse por el au-
mento en la fuerza iónica del amortiguador (que agrega iones
para competir con los grupos cargados de las macromoléculas
para sitios en la resina) o por el cambio de su pH. Las proteí-
nas se extraen de la columna en orden, de la que tiene una
unión menos fuerte a la unida con mayor fuerza. La figura
18.24 muestra una representación esquemática de la separa-
ción de dos especies de proteínas mediante la extracción por
pasos de una columna de intercambio iónico.

18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas

moléculas de proteína individual interactúan con los materia-
les de la matriz, su progreso por la columna se retrasa. Por lo – + +
tanto, mientras mayor sea la afinidad de una proteína particu- Mezcla de + – –
– + –
proteínas + – + –
lar por el material de la matriz, su paso por la columna es más + + +
– + + + + +
cargadas + + + + + – + + +
lento. Como las diferentes proteínas de la mezcla tienen dis- (⫹) y (⫺) + + + + + + + + +
tinta afinidad por la matriz, se retrasan en diferente medida. + + + + + + + + + + + +
Conforme el solvente pasa por la columna y gotea del fondo, + + + + + + + + +
se recolecta como fracciones en una serie de tubos. Las proteí- Perlas + + + + + + + + + + + +
de DEAE + + + + + + + + +
nas en la mezcla con la menor afinidad por la columna apare- celulosa + + + + + +
cen en las primeras fracciones que salen de la columna. La + –
con carga + –
resolución de muchos procedimientos cromatográficos mejoró (⫹) +
+
–
–
en los últimos años gracias al desarrollo de la cromatografía + –
líquida de alto desempeño (HPLC, high performance liquid chro-
Cantidad de proteína

matography), en la que se usan columnas largas y delgadas, y la

fase móvil se obliga a pasar por una matriz apretada no com- + –
presible compuesta por partículas muy pequeñas (p. ej., 5 ␮m
de diámetro) que está sometida a alta presión.

Cromatografía de intercambio iónico Las proteínas son

electrólitos polivalentes grandes y es improbable que muchas
1 Número de fracción
proteínas en una preparación de pureza parcial tengan la misma
carga general. La carga general de una proteína es la suma de Figura 18.24 Cromatografía por intercambio iónico. Separación
de dos proteínas mediante DEAE-celulosa. En este caso, una resina
de intercambio con carga positiva se usa para unirse con la proteína
3
La cromatografía líquida se distingue de la cromatografía gaseosa en que la con mayor carga negativa.
fase móvil está representada por un gas inerte.
754 Mezcla de
3 proteínas
Perlas
porosas
Figura 18.25 Cromatografía de filtración en gel. Separación de
tres proteínas globulares con diferente masa molecular, como se des-
cribe en el texto. Entre las proteínas con forma básica similar, las
moléculas más grandes se eliminan antes que las pequeñas.
Cromatografía de filtración en gel La filtración en gel
separa proteínas (o ácidos nucleicos) con base en su tamaño
efectivo (radio hidrodinámico). Como la cromatografía de in-
tercambio iónico, el material de separación consiste en cuentas
diminutas que se empacan en una columna a través de la cual
la solución de proteína pasa lentamente. Los materiales que se
emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos
con enlaces cruzados (dextranos o agarosa) de distinta porosi-
dad, lo que permite que las proteínas se difundan dentro y
fuera de las cuentas. La mejor forma de describir la técnica es
con un ejemplo (fig. 18.25).
Supóngase que se intenta purificar una proteína globular
con una masa molecular de 125 000 daltones. Esta proteína se
encuentra en solución con dos proteínas contaminantes con
forma similar, una mucho más grande de 250 000 daltones, y
la otra mucho más pequeña, de 75 000 daltones. Un modo en
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
que la proteína podría purificarse consiste en pasar la mezcla
por una columna de cuentas Sephadex G-150, que permite la
entrada de proteínas globulares menores de 200 kDa. Cuando
la mezcla de proteínas pasa por el lecho de la columna, la pro-
teína de 250 kDa es incapaz de entrar a las cuentas y perma-
nece disuelta en la fase solvente móvil. Como resultado la
proteína de 250 kDa se extrae en cuanto el solvente de la co-
lumna (el volumen del lecho) termina de gotear. En cambio,
las otras dos proteínas pueden difundirse a los intersticios en-
tre las cuentas y su paso por la columna se retrasa. Conforme
más solvente pasa por la columna, estas proteínas se mueven
hacia abajo y salen por el fondo, pero lo hacen a distintas velo-
cidades. Entre las proteínas que entran a las cuentas, las espe-
cies más pequeñas se retrasan más que las grandes. Por consi-
guiente la proteína de 125 kDa se extrae en estado purificado,
en tanto que la proteína de 75 kDa permanece en la columna.
Cromatografía por afinidad Las técnicas descritas hasta
ahora utilizan las propiedades gruesas de una proteína para
realizar la purificación o el fraccionamiento. Otra técnica de
purificación llamada cromatografía por afinidad aprovecha
las propiedades estructurales únicas de una proteína, lo que
Proteína a purificar
(p. ej., receptor de insulina) Ligando
(p. ej., insulina)
Perla de agarosa
(a)
Mezcla de
proteína que
se busca ( )
y
contaminante
( )
(b)
Figura 18.26 Cromatografía por afinidad. (a) Representación es-
quemática de las perlas de agarosa cubiertas con las que sólo puede
combinarse una proteína específica. (b) Pasos del procedimiento cro-
matográfico.
permite que una especie de proteína se retire de manera espe-
cífica de la solución mientras que las demás quedan en ésta
(fig. 18.26). Las proteínas interactúan con sustancias específi-
cas: enzimas con sustratos, receptores con ligandos, antígenos
con anticuerpos, etc. Cada uno de estos tipos de proteínas pue-
den retirarse de la solución si la mezcla de proteínas se pasa a
través de una columna en la que la molécula específica de inte-
racción (sustrato, ligando, anticuerpo, etc.) se une mediante
enlaces covalentes con un material inerte e inmovilizado (la
matriz). Si, por ejemplo, una preparación impura de un recep-
tor para acetilcolina se pasa por una columna que contiene
cuentas de agarosa a la que se une un análogo de acetilcolina,
el receptor se une de modo específico con las cuentas siempre
que las condiciones en la columna sean adecuadas para promo-
ver la interacción (pág. 172). Una vez que todas las proteínas
contaminantes pasaron por la columna y salieron por el fondo,
las moléculas del receptor para acetilcolina pueden desplazarse
de sus sitios de unión en la matriz mediante el cambio de la
composición iónica o el pH del solvente en la columna. Por lo
tanto, a diferencia de otros procedimientos cromatográficos
que separan proteínas con base en su tamaño o carga, la croma-
tografía por afinidad puede lograr una purificación casi total
de la molécula deseada en un solo paso.
Determinación de las interacciones proteína-pro-
teína Una de las maneras de aprender respecto a la función
de una proteína consiste en identificar las proteínas con las
que interactúa. Se cuenta con varias técnicas disponibles para
identificar qué proteínas de una célula podrían interactuar con
una proteína determinada que ya se identificó. Una de estas
 755
técnicas acaba de describirse: la cromatografía por afinidad. Dominio de activación del factor de transcripción
Otra técnica utiliza anticuerpos. Por ejemplo, considérese que Domino de unión con DNA
la proteína A, que ya se identificó y purificó, es parte de un del factor de transcripción Transcripción
complejo con otras dos proteínas en el citoplasma, las proteí-
nas B y C. Una vez que la proteína A se purifica, puede obte- Promotor Gen lacZ
nerse un anticuerpo contra esta proteína y usarse como sonda (a)
para unirse y retirar la proteína A de la solución. Si se prepara
un extracto celular que contenga el complejo proteínico A-B-
C y el extracto se incuba con el anticuerpo contra A, la unión
del anticuerpo con la proteína A suele producir la coprecipita- X Dominio de unión con DNA fusionado con proteína X
ción de otras proteínas unidas con A, en este caso las proteínas Sin transcripción
B y C, que pueden identificarse en seguida. La coprecipitación
de los fragmentos de DNA por el empleo de la técnica ChIP
(b)
se ilustró en la figura 12.41.
La técnica de uso más frecuente para buscar interacciones
proteína-proteína es el sistema de dos híbridos de levaduras
que Stanley Fields y Ok-kyu Song de la Nueva York State Uni-
Domino de activación fusionado con proteína Y
verity en Stony Brook inventaron en 1989. Esta técnica se ilus-
tra en la figura 18.27 y depende de la expresión de un gen re-
Y
portero, como la galactosidasa ␤ (lacZ), cuya actividad es fácil
de vigilar mediante una prueba que detecta un cambio de co- Sin transcripción
lor en presencia de la enzima en una población de células de
levaduras. La expresión del gen lacZ en este sistema se activa
por una proteína particular (un factor de transcripción), que (c)
contiene dos dominios, un dominio para unión con DNA y un
dominio de activación (fig. 18.27a). El dominio de unión con
DNA media la unión con el promotor y el dominio de activa- Dominio de activación
ción media la interacción con otras proteínas participantes en fusionado con proteína Y
la activación de la expresión del gen. Ambos dominios deben Dominio de unión con DNA
Y fusionado con proteína X
estar presentes para que haya transcripción. Para emplear esta X
técnica se preparan dos tipos diferentes de moléculas de DNA Transcripción
recombinante. Una molécula de DNA contiene un segmento
de DNA que codifica el dominio de unión con DNA del fac-
tor de transcripción unido con un segmento de DNA que (d)
codifica la proteína “carnada” (X). La proteína carnada es la
que se caracterizó y aquella para la que se buscan compuestos

18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas

potenciales de unión. Cuando este DNA recombinante se ex-
presa en una célula de levadura, la célula produce una proteína
híbrida como la que se muestra en la figura 18.27b. La otra
molécula de DNA contiene una porción del factor de trans-
cripción que codifica el dominio de activación unido con el
DNA que codifica una proteína desconocida (Y). Estos DNA
(o cDNA como se les conoce) se preparan de los mRNA por
acción de la transcriptasa inversa como se describe en la pá-
gina 774. Asúmase que Y es una proteína capaz de unirse con
la proteína carnada. Cuando un DNA recombinante que co-
difica Y se expresa en una célula de levadura, la célula produce
una proteína híbrida como la mostrada en la figura 18.27c.
Cuando se produce en una sola célula, ni la proteína híbrida
que contiene X ni la que contiene Y son capaces de activar la
transcripción del gen lacZ (fig. 18.27b,c). Sin embargo, si estas
dos moléculas de DNA recombinante particulares se introdu-
cen en la misma célula de levadura (como en la fig. 18.27d), las
proteínas X y Y pueden interactuar una con la otra para re-
constituir un factor de transcripción funcional, un fenómeno
que puede detectarse por la capacidad de la célula para produ-
cir galactosidasa ␤. Con esta técnica los investigadores pueden
“pescar” proteínas codificadas por genes desconocidos capaces
de interactuar con la proteína “carnada”. La metodología Y2H
es en particular idónea para la detección sistemática de un
gran número de proteínas, y su empleo en estudios proteómi-
cos a gran escala (alto rendimiento) se expone en la página 62.
Dominio de unión con DNA Dominio de activación
fusionado con proteína X fusionado con proteína Z
Z
X
Sin transcripción
(e)
Figura 18.27 Uso del sistema de dos híbridos de levaduras. Esta
prueba para la interacción entre dos proteínas depende de que una
célula sea capaz de reunir dos partes de un factor de transcripción.
(a) Las dos partes del factor de transcripción (el dominio para unión
con DNA y el dominio de activación), se ven aquí conforme el fac-
tor de transcripción se une con el promotor de un gen (lacZ) que co-
difica la galactosidasa ␤. (b) En este caso, una célula de levadura
sintetizó el dominio para unión con DNA del factor de transcrip-
ción unido con una proteína X “carnada”. Este complejo no puede
activar la transcripción. (c) En este caso, una célula de levadura sin-
tetizó el dominio de activación del factor de transcripción unido con
una proteína Y desconocida “pescada”. Este complejo no puede acti-
var la transcripción. (d) Una célula de levadura sintetizó las proteínas
X y Y, lo que reconstituye un factor de transcripción completo y per-
mite la expresión de lacZ, que es fácil de detectar. (e) Si el segundo
DNA codificó una proteína, por ejemplo, Z, que no pudo unirse con
X, la expresión del gen reportero no se habría detectado.
756 En años recientes se ha adaptado para utilizar en células de Muestra con colorante
mamíferos el procedimiento de dos híbridos, cuyos estudios rastreador cargado
en el pozo
iniciales se hicieron en levaduras. Hasta la fecha, los estu-
dios que utilizan el sistema de dos híbridos en células de ma-
míferos tienden a orientarse a las interacciones de proteínas Placa de gel de
poliacrilamida colocada
específicas y no a la detección sistemática de bibliotecas de entre dos placas de vidrio
proteínas, a gran escala.
1

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Reservorio superior con amortiguador
La electroforesis es otra técnica que se utiliza con frecuencia
para fraccionar proteínas; depende de la capacidad de molécu- Electrodo negativo
las cargadas para migrar cuando se colocan en un campo eléc- (cátodo)
trico. La separación electroforética de proteínas casi siempre
se realiza por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), El colorante de
en la que las proteínas son impulsadas por una corriente que se rastreo muestra
aplica a través de una matriz gelatinosa. La matriz se compone la extensión del
movimiento
de polímeros de una pequeña molécula orgánica (acrilamida) electroforético
que establece enlaces cruzados para formar un tamiz molecu-
Electrodo positivo
lar. Puede formarse un gel de poliacrilamida como una losa (ánodo)
delgada entre dos placas de vidrio o como un cilindro dentro
2 Reservorio inferior
de un tubo de vidrio. Una vez que el gel se polimeriza, la losa con amortiguador
(o tubo) se suspende entre dos compartimientos que contie-
nen un amortiguador en el que se sumergen electrodos opues-
tos. En un gel en forma de losa, la muestra concentrada que + _
contiene las proteínas se coloca en ranuras sobre el borde su-
perior del gel, como se muestra en el paso 1 de la figura 18.28.
La muestra de proteína se prepara en una solución que con- Fuente de poder
tiene sacarosa o glicerol, cuya densidad impide que la mezcla
se combine con el amortiguador en el compartimiento supe-
rior. Luego se aplica voltaje entre los compartimientos del
Más
amortiguador y la corriente fluye por la losa, lo que hace que grande
las proteínas se muevan hacia el electrodo con carga opuesta
(paso 2). Por lo general la separación se efectúa con amorti-
guadores alcalinos, lo que ocasiona que las proteínas tengan
una carga negativa y las obliga a migrar hacia el ánodo de
carga positiva en el extremo contrario del gel. Después de la
Más
electroforesis, la losa se retira de las placas de vidrio y se tiñe pequeña
(paso 3).
El movimiento relativo de las proteínas por un gel de
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

poliacrilamida depende de la densidad de carga (carga por uni-

dad de masa) de las moléculas. Mientras mayor sea la densidad
de carga, la proteína se impulsa con más fuerza por el gel y por
lo tanto, la migración es más rápida. No obstante, la densidad
de carga es sólo un factor importante en el fraccionamiento
por PAGE; el tamaño y la forma también influyen. La poli-
acrilamida forma un tamiz molecular con enlaces cruzados
que enreda las proteínas que pasan por el gel. Entre mayor sea
la proteína, más se enreda y migra con más lentitud. La forma
también es un factor importante, porque las proteínas globu-
lares compactas se mueven más rápido que las proteínas fibro-
sas alargadas de masa molecular similar. La concentración de
acrilamida (y el agente de los enlaces cruzados) que se emplea
para hacer el gel es otro factor importante. A menor concen-
tración de acrilamida, menos enlaces cruzados se forman en el
gel y la migración de una molécula proteínica determinada
puede ser más rápida. Un gel que contiene 5% de acrilamida
podría ser útil para separar proteínas de 60 a 250 kDa, en
tanto que el gel con 15% de acrilamida permitiría separar pro-
teínas de 10 a 50 kDa.
El progreso de la electroforesis se sigue al observar la
migración de un tinte rastreador cargado que se mueve justo
Solución de tinción en charola 3 Gel
Figura 18.28 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Las mues-
tras de proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya
densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y
luego se carga en los pozos con una pipeta fina como se muestra en
el paso 1. En el paso 2 se aplica una corriente directa al gel, lo que
ocasiona que las proteínas se muevan en la poliacrilamida en carriles
paralelos. Cuando se realiza en el detergente SDS, como casi siem-
pre sucede, las proteínas se mueven como bandas a velocidades in-
versamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que la
electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se
tiñe en una charola (paso 3).
por delante de las proteínas más rápidas (paso 2, fig. 18.28).
Después que el tinte rastreador se movió a la localización de-
seada, la corriente se corta y el gel se retira de su recipiente. Por
lo general el gel se tiñe con azul Coomassie o tinción de plata
para revelar la localización de las proteínas. Si las proteínas
tienen marca radiactiva, su localización puede reconocerse al
presionar el gel contra un fragmento de película para rayos X
a fin de producir una autorradiografía o el gel puede rebanarse
en fracciones y las proteínas individuales aislarse. Una alterna-
tiva consiste en transferir las proteínas del gel por un se-
gundo procedimiento electroforético a una membrana de ni-
trocelulosa para formar una mancha (pág. 763). Las proteínas
se absorben en la superficie de la membrana en las mismas
posiciones relativas que ocupaban en el gel. En una inmuno-
transferencia (Western blot), las proteínas en la membrana se
identifican por su interacción con anticuerpos específicos.
SDS-PAGE La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
suele llevarse a cabo en presencia del detergente con carga
negativa sulfato de dodecilo sódico (SDS), que se une en
grandes cantidades con todos los tipos de moléculas de pro-
teína (pág. 133). La repulsión electrostática entre las molécu-
las unidas de SDS hace que las proteínas se desplieguen de
manera similar a un bastón, lo que elimina las diferencias en
la forma como factor para la separación. El número de molé-
culas de SDS que se unen con una proteína es casi proporcio-
nal a la masa molecular de la misma (cerca de 1.4 g de SDS
por gramo de proteína). Por consiguiente, cada especie de
proteína, sin importar el tamaño, tiene una densidad de carga
equivalente y se impulsa por el gel con la misma fuerza. Sin
embargo, como la poliacrilamida tiene muchos enlaces cruza-
dos, las proteínas más grandes se retienen en mayor medida
que las pequeñas. Como resultado, las proteínas se separan
por SDS-PAGE con base en una sola propiedad: su masa
molecular. Además de separar las proteínas de una mezcla, la
técnica SDS-PAGE puede usarse para determinar la masa
pH
7.45 7.3 7.2 7.1 7.0 6.8 6.55 6.3 6.1 6.0 5.9
90
80
70
60
Peso molecular ⫻ 10–3
50
40
30
20
15
Figura 18.29 Electroforesis bidimensional en gel. Gel de polia-
crilamida bidimensional de proteínas cromosómicas no histonas de
la célula HeLa marcadas con [35S]metionina. Con esta técnica pue-
den resolverse más de mil proteínas diferentes. (Tomada de J. L.
Peterson y E. H. McConkey, J. Biol. Chem. 251:550, 1976. ©
1976 The american Society for Biochemistry and Molecu-
lar Biology.)
molecular de varias proteínas mediante la comparación de las 757
posiciones en las bandas con las producidas por proteínas de
tamaño conocido. En las páginas 146 y 173 se muestran ejem-
plos de SDS-PAGE.
Electroforesis bidimensional en gel En 1975 Patrick
O’Farrell, de la California University, en San Francisco, desa-
rrolló una técnica llamada electroforesis bidimensional en gel
para fraccionar mezclas complejas de proteínas con el uso de
dos propiedades diferentes de las moléculas. Primero, las pro-
teínas se separan en un gel tubular según su punto isoeléctrico
(pág. 753) mediante una técnica llamada enfoque isoeléctrico.
Tras la separación, el gel se retira y se coloca arriba de una losa
de poliacrilamida saturada con SDS para someterla a SDS-
PAGE. Las proteínas se mueven hacia el gel de la losa y se
separan de acuerdo con su masa molecular (fig. 18.29). Una
vez separadas, las proteínas individuales pueden retirarse del
gel y digerirse en fragmentos peptídicos susceptibles de anali-
zarse mediante espectrometría de masa. La resolución de esta
técnica es suficiente para distinguir la mayor parte de las pro-
teínas de una célula. Por su gran poder de resolución, la elec-
troforesis bidimensional en gel es ideal para detectar cambios
en las proteínas presentes en una célula en distintas condicio-
nes, en diferentes etapas de desarrollo o del ciclo celular o en
distintos organismos (fig. 2.48). Sin embargo, la técnica no es
adecuada para diferenciar entre proteínas que tienen una masa
molecular elevada, que son muy hidrófobas o de las que hay
muy pocas copias en la célula.
Medición y análisis de proteínas
Uno de los métodos más sencillos y usuales para identificar la
cantidad de proteína o ácido nucleico presente en una solu-
ción determinada es medir la cantidad de luz de una longitud
de onda específica que absorbe esa solución. El instrumento
empleado para efectuar esta medición es el espectrofotóme-
tro. La solución se deposita en un recipiente especial de cuarzo
18.7 Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas
con lados planos (se usa cuarzo porque, a diferencia del vidrio,
no absorbe la luz ultravioleta) llamado cubeta, que se coloca en
el haz de luz del espectrofotómetro. La cantidad de luz que
pasa por la solución sin ser absorbida (es decir, la luz transmi-
tida) se mide en fotoceldas del otro lado de la cubeta.
Dos de los 20 aminoácidos incorporados en las proteínas,
la tirosina y la fenilalanina, absorben la luz del espectro ultra-
violeta, con una absorbancia máxima cercana a 280 nm. Si las
proteínas en estudio tienen un porcentaje típico de estos ami-
noácidos, la absorbancia de la solución en esta longitud de
onda proporciona una medida de la concentración de pro-
teína. Una alternativa es emplear varias pruebas químicas,
como la técnica de Lowry o de Biuret, en las que la proteína
en solución participa en una reacción que produce un com-
puesto coloreado cuya concentración es proporcional a la con-
centración de proteína.
Espectrometría de masa Como se explica en la página 71,
el campo emergente de la proteómica depende mucho del
análisis de las proteínas mediante espectrometría de masa. Los
espectrómetros de masa son instrumentos analíticos que se
usan sobre todo para medir las masas de moléculas, determi-
nar fórmulas químicas y estructura molecular, y para identifi-
car sustancias desconocidas. Los espectrómetros de masa rea-
lizan estas tareas mediante la conversión de sustancias de una
758 muestra en iones gaseosos con cargas positivas, que se aceleran Se forman iones positivos
a través de un tubo curvo hacia una placa con carga negativa en la descarga eléctrica
(fig. 18.30). Cuando los iones pasan por el tubo, se someten a Detector Rayo de iones +
un campo magnético que los separa unos de otros de acuerdo positivos –
con su masa molecular [o, de manera más precisa, según su
proporción entre masa y carga (m/z)]. Los iones golpean un N
detector electrónico que se localiza al final del tubo. Los iones S –
más pequeños viajan más rápido y golpean el detector con más El rayo se divide
rapidez que los iones más grandes. La información del detec- en varios haces, Imán cuya
cada uno con potencia
tor se convierte en una serie de picos del índice m/z ascen- iones de la misma puede
dente (como en la fig. 2.49). masa variarse
Aunque los espectrómetros de masa han sido el instru-
mento favorito de los químicos durante muchos años, hace
apenas unos 10 años que los biólogos descubrieron sus sor- Figura 18.30 Principios de operación de un espectrómetro de
prendentes poderes analíticos. Ahora, con la espectrometría de masa. (Tomada de J. E. Brady, J. Russell y J. R. Holum, Che-
masa (MS), los bioquímicos pueden identificar a las proteínas mistry 3era. ed.; copyright © 2000, John Wiley and Sons, Inc.
que componen algún tipo de célula, organelo o complejo pro- Reimpresa con autorización de John Wiley and Sons, Inc.)
teínico en cuestión de horas. Para realizar este análisis las pro-
teínas suelen digerirse con tripsina y los péptidos resultantes
se ionizan con suavidad y se convierten en gases por uno de
dos procedimientos. El desarrollo de estas técnicas de ioniza-
ción de péptidos fue clave para adaptar la MS al estudio de las 18.8 | Identificación
proteínas. En un procedimiento, llamado desorción ionizada
asistida por matriz (MALDI, matrix-assisted laser desorption io-
de la estructura de proteínas
nization), la muestra de proteína se aplica como parte de una y complejos multisubunitarios
matriz cristalina que se irradia con un pulso de láser. La ener- La cristalografía por rayos X (o difracción de rayos X) utiliza
gía del láser excita la matriz y la energía absorbida convierte cristales de proteína que se bombardean con un fino haz de
los péptidos en iones gaseosos. En un procedimiento alterna- rayos X (fig. 18.31). La radiación que se dispersa (difracta) por
tivo, la ionización de electroaerosol (ESI, electrospray ionization), los electrones de los átomos de la proteína golpea un detector
se aplica un potencial eléctrico a una solución peptídica, lo que sensible a los electrones situado detrás del cristal. El patrón de
hace que los péptidos se ionicen y el líquido se rocíe como un difracción que el cristal produce depende de la estructura in-
fino aerosol de partículas cargadas que entran al espectróme- terna de la proteína; la gran cantidad de moléculas en el cristal
tro. Como actúa sobre las moléculas en solución, la ESI es refuerza las reflexiones y ocasiona que se comporte como si
adecuada para ionizar péptidos preparados con proteínas frac- fuera una molécula gigante. Las posiciones e intensidades de
cionadas mediante una técnica de cromatografía líquida que se los reflejos, como los de la placa fotográfica de la figura 2.33,
usa con mayor frecuencia. pueden relacionarse en forma matemática con las densidades
Una vez que las masas moleculares de los péptidos en la electrónicas dentro de la proteína porque son los electrones de
muestra se conocen, la proteína completa puede identificarse los átomos los que produjeron esas reflexiones. La resolución
mediante la búsqueda en una base de datos como se describe obtenida por la difracción de los rayos X depende de la canti-
en la página 72. Si la proteína no se identifica sin ambigüeda- dad de manchas que se analice.
des, uno o más de los péptidos generados mediante digestión
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

con tripsina4 pueden fragmentarse en un segundo paso para

someterlos a otra ronda de espectrometría de masa. La técnica
bifásica en cuestión (llamada MS en tándem o MS/MS) ge-
nera la secuencia aminoácida de los péptidos, que después po- Película fotográfica 3
drá ensamblarse en el grupo de proteínas del cual provinieron. 2
MS/MS es tan potente que es posible digerir mezclas comple-
1
jas de cientos de proteínas desconocidas, someterlas a la espec- Haz de rayos X
trometría de masas y conocer la identidad de cada una de las 0
proteínas de la mezcla. MS/MS también se ha usado para
identificar las modificaciones postraducionales específicas que Fuente –1
aparecen en una proteína particular, en un conjunto específico de rayos X Cristal
incidentes –2
de situaciones fisiológicas.
–3
Rayos X difractados

Figura 18.31 Análisis por difracción de rayos X. Diagrama de la

4
La fragmentación se logra dentro de un espectrómetro de masa mediante la
colisión de los péptidos con un gas inerte. La energía del choque rompe los
enlaces peptídicos para producir una colección aleatoria de fragmentos del
péptido original. La secuencia de aminoácidos de cada fragmento, y por lo
tanto, del péptido original, puede determinarse si se busca en una base de da-
tos que contenga las masas de los fragmentos teóricos con todas las secuen-
cias posibles de aminoácidos que pueden formarse a partir de las proteínas
codificadas por ese genoma.
difracción de rayos X por átomos de un plano de un cristal en una
placa fotográfica. La serie ordenada de los rayos dentro del cristal
produce una serie repetitiva de ondas circulares superpuestas que se
dispersan e intersectan la película. Como sucede con la difracción de
la luz visible, las ondas forman un patrón de interferencia que re-
fuerzan unas a otras en algunos puntos de la película y se cancelan
entre sí en otros puntos.
 La mioglobina fue la primera proteína cuya estructura se
identificó por difracción de rayos X. La proteína se analizó de
modo sucesivo con 6, 2 y 1.4 Å, con periodos de años entre
cada identificación completa. Si se considera que los enlaces
covalentes miden entre 1 y 1.5 Å de largo, y los enlaces no co-
valentes tienen entre 2.8 y 4 Å de longitud, la información
reunida para una proteína depende de la resolución lograda.
Esto se ilustra con una comparación de la densidad electrónica
de una pequeña molécula orgánica en cuatro niveles de resolu-
ción (fig. 18.32). En la mioglobina, una resolución de 6 Å fue
suficiente para mostrar la manera en que la cadena polipeptí-
dica se pliega y la localización de la fracción hem, pero no para
mostrar la estructura dentro de la cadena. Una resolución de
2  Å permitió separar los grupos de átomos unos de otros,
mientas que con 1.4 Å se reconocieron las posiciones de los
átomos individuales. A la fecha se han determinado las estruc-
turas de varios cientos de proteínas con resolución atómica
(⬍1.2 Å) y unas cuantas con resolución de apenas 0.66 Å.
Con los años, la tecnología de difracción de rayos X me-
joró mucho. Max Perutz tardó 22 años en resolver la estruc-
tura de la hemoglobina (fig. 2.38b), una tarea que en la actua-
lidad requeriría unas pocas semanas. En la mayor parte de los
estudios actuales: (1) se generan haces de rayos X intensos y
muy enfocados con sincrotrones (pág. 100), que son acelera-
dores de partículas de alta energía que producen rayos X como
producto intermediario y (2) las placas fotográficas se sustitu-
yeron por detectores electrónicos muy sensibles (instrumentos
unidos por carga o CCD) que proporcionan una lectura digi-
tal de los datos de la difracción. El uso de estos instrumentos
junto con computadoras cada vez más potentes permite a los
investigadores reunir y analizar datos suficientes para recono-
cer la estructura terciaria de casi todas las proteínas en cues-
tión de horas. Como resultado de estos avances la cristalogra-
fía con rayos X se aplica al análisis de estructuras moleculares
cada vez más grandes. Es probable que la mejor forma de
ilustrar esto sea con el éxito obtenido en la identificación de la
estructura del ribosoma, que se explica en el capítulo 11. En la
mayor parte de los casos, como sucedió con el estudio del ri-
bosoma, el principal desafío en este campo es obtener cristales
útiles.
Aunque la cristalografía por rayos X es ideal para identi-
ficar la estructura de proteínas solubles que se prestan a la
cristalización, puede ser muy desafiante en el estudio de es-
tructuras complejas con múltiples subunidades, como los ribo-
Resolución 6-A Resolución 2-Å
(a) (b)
Figura 18.32 Distribución de densidad electrónica de una pe-
queña molécula orgánica (dicetopiperacina) calculada con varios
niveles de resolución. Con la resolución más baja (a) sólo puede
distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolución más alta
(d) revela la densidad electrónica alrededor de cada átomo (indicada
por las líneas de contorno circular). (Modificada de D. Hodgkin.
somas o los proteasomas, o para proteínas de membrana, de las 759
que es difícil obtener los cristales tridimensionales necesarios
para el análisis. A menudo el análisis estructural de estos tipos
de muestras se realiza con una técnica alternativa que aprove-
cha la ventaja del inmenso poder de resolución del microsco-
pio electrónico y las técnicas de procesamiento de imagen
basadas en la computadora.
Existen dos métodos generales para el estudio de partícu-
las individuales al microscopio electrónico. En una estrategia,
las partículas se colocan en una rejilla de microscopio electró-
nico, se aplica tinción negativa y se secan al aire (como se ex-
plica en la página 744). En la otra técnica, que se conoce como
criomicroscopia electrónica o crio-EM, las partículas se colocan
en una rejilla y se congelan con rapidez en estado hidratado
con nitrógeno líquido sin fijación ni tinción. Para los estudios
de mayor resolución, el uso de muestras con tinción negativa
casi se sustituyó ya por partículas hidratadas congeladas, que
tienen una probabilidad mucho menor de generar artefactos y
son más adecuadas para estudiar rasgos internos de la estruc-
tura de la partícula. En ambos casos, las rejillas se colocan en
la columna del microscopio y se toman fotografías de las par-
tículas. Cada fotografía es una imagen bidimensional de una
partícula individual en la orientación que asume cuando des-
cansa en la rejilla. Cuando se promedian las imágenes bi-
dimensionales de decenas de miles de muestras distintas en
todas las orientaciones concebibles mediante un análisis com-
putarizado de alto poder puede generarse una reconstrucción
tridimensional de la partícula con una resolución cercana a 10
Å. Con esta resolución, los investigadores pueden seguir a
la cadena polipeptídica de una proteína e incluso identificar la
18.8 Identificación de la estructura de proteínas y complejos multisubunitarios
localización de las cadenas laterales voluminosas de aminoáci-
dos. En la figura 2.58 se ilustra un modelo de ribosoma euca-
riótico con base en la técnica de crio-EM; en la figura 8-40c se
incluye un modelo de vesícula cubierta con clatrina y en la fi-
gura 11.33 se señala un modelo de una partícula U1 snRNP.
La técnica anterior, conocida como reconstrucción uniparti-
culada, también es útil para captar imágenes de una estructura
como un ribosoma, en fases diferentes de un proceso diná-
mico, como la etapa de alargamiento de la síntesis proteínica.
Con esta técnica se han revelado varios de los cambios princi-
pales en la conformación que ocurren después de cada paso de
la traducción.
Además, las estructuras de resolución atómica determi-
nadas por cristalografía de rayos X pueden ajustarse en las re-
Resolución 1.5-Å Resolución 1.1-Å
(c) (d)
Reimpresa con autorización de Nature 188:445, 1960;
copyright 1960, Nature by Nature Publishing Group. Reim-
presa con autorización de Nature Publishing Group en el
formato de reproducción como libro de texto, de copyright
Clearance Center.)
760
Figura 18.33 La combinación de datos de microscopia electró-
nica y cristalografía de rayos X proporciona información sobre
interacciones entre proteínas y sobre la estructura de complejos mul-
tisubunitarios. La reconstrucción basada en micrografías electrónicas
de un filamento de actina-ADF se muestra en gris. Las estructuras
obtenidas por cristalografía de rayos X de alta resolución de monó-
meros individuales de actina (rojo) y moléculas de ADF (verde) se
ajustaron en la estructura determinada por EM, con menor resolu-
ción. (Tomada de Edward H. Egelman, University of Vir-
ginia, J. Cell Biol. 163:1059, 2003 fig. 2a. Reimpresa con
autorización de the Rockefeller University Press.)
construcciones de microscopia electrónica de menor resolu-
ción para mostrar la forma en que interactúan las moléculas
individuales que constituyen un complejo multisubunitario y
cómo podrían trabajar juntas para realizar una actividad espe-
cífica. En la figura 18.33 se muestra la estructura terciaria de
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
un filamento compuesto de actina y ADF (un miembro de la
familia de la cofilina, pág. 373). Las estructuras de las dos
proteínas se determinaron mediante estudios separados de
cristalografía de rayos X y luego se ajustaron en un modelo de
microscopia electrónica de un filamento de actina-ADF. La
reconstrucción mostrada en la figura sirvió como base para un
mecanismo propuesto, mediante el cual las proteínas de la fa-
milia de la cofilina pueden inducir el corte y la despolimeriza-
ción de un filamento de actina (pág. 378).
El análisis al microscopio electrónico de muestras conge-
ladas también es útil en el estudio de proteínas de membrana,
como el receptor nicotínico para acetilcolina (Vía experimen-
tal del cap. 4). Este tipo de análisis requiere que las proteínas
de membrana estén muy compactadas a temperaturas muy
bajas (p. ej., ⫺195⬚C) en disposiciones cristalinas bidimensio-
nales dentro del plano de la membrana. Dicha técnica ofrece
una ventaja sobre los estudios cristalográficos de rayos X
de las proteínas de membrana, ya que la proteína permanece
durante todo el proceso dentro de su membrana natural, en
lugar de extraerse en detergente y cristalizarse en un ambiente
no membranoso. Las estructuras ilustradas en la página 174
se obtuvieron de la combinación de imágenes de alta resolu-
ción de microscopia electrónica, hechas de diferentes molécu-
las proteínicas, en ángulos diversos en relación con el haz de
electrones. Esta técnica se conoce como cristalografía electró-
nica.
18.9 | Fraccionamiento
de ácidos nucleicos
Cualquier método de fraccionamiento sistemático debe ex-
plotar las diferencias entre los miembros de una mezcla con
fines de separación. Las moléculas de ácido nucleico pueden
diferir entre sí en tamaño global, composición de bases, topo-
logía y secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, los métodos de
fraccionamiento para ácidos nucleicos se basan en estas carac-
terísticas.
Separación de DNA por electroforesis
en gel
De las diversas técnicas empleadas en el fraccionamiento de
proteínas descritas antes, una de ellas, la electroforesis en gel,
también se usa mucho para separar ácidos nucleicos con masa
molecular diferente (o sea, longitud del nucleótido). Las mo-
léculas pequeñas de RNA o DNA de unos cuantos cientos de
nucleótidos o menos casi siempre se separan por electroforesis
en gel de poliacrilamida. Las moléculas más grandes tienen
problemas para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruza-
dos y por lo general se fraccionan en geles de agarosa, que son
más porosos. La agarosa es un polisacárido extraído de un alga
marina; se disuelve con un amortiguador caliente, se vierte en
un molde y se gelatiniza con el simple descenso de tempera-
tura. La separación de moléculas de DNA mayores de 25 kb
suele hacerse mediante la técnica de electroforesis en campo
con pulsos en la que la dirección del campo eléctrico en el gel
se cambia en forma periódica, lo que ocasiona que las molécu-
las de DNA se reorienten durante la migración.
Después de la electroforesis, los fragmentos de DNA en
el gel se visualizan empapando el gel en una solución de colo-
rante como bromuro de etidio. Éste se intercala en la doble
hélice y hace que las bandas de DNA presenten fluorescencia
cuando se observan con radiación ultravioleta (fig. 18.34). La
sensibilidad de la electroforesis en gel es tan alta que es posible
separar moléculas de DNA o RNA que difieren por un solo
nucleótido, una característica que dio origen a un método in-
valuable para la secuenciación del DNA (pág. 771). Dado que
la rapidez de migración por un gel también puede ser afectada
por la forma de la molécula, es posible usar la electroforesis
para separar moléculas con diferente conformación, como for-
mas circular y lineal o relajada y superenrollada (fig. 10.12).
Separación de ácidos nucleicos
por ultracentrifugación
La experiencia indica que la estabilidad de una solución (o
suspensión) depende de los componentes. La crema flota so-
bre la leche cruda, un precipitado fino se asienta en forma
gradual en el fondo del recipiente y una solución de cloruro de
sodio permanece estable por tiempo indefinido. Muchos fac-
tores determinan si un componente se asienta o no en un
medio líquido, éstos incluyen el tamaño, forma y densidad de
 fondo de un tubo de centrífuga. Las partículas más grandes se 761
sedimentan más rápido que las pequeñas de forma y densidad
Célula similares. La tendencia de las moléculas a concentrarse du-
rante la centrifugación se contrarresta por los efectos de la
difusión, que ocasiona que las moléculas se redistribuyan de
modo más uniforme (aleatorio). El desarrollo de las ultracen-
DNA
trífugas permitió generar fuerzas centrífugas de hasta 500 000
veces la fuerza de la gravedad, que son lo bastante grandes para
contrarrestar los efectos de la difusión y hacen que las macro-
Digestión por enzima
de restricción Fragmentos de DNA
moléculas se sedimenten hacia el fondo de un tubo de centrí-
fuga. La centrifugación se realiza en un ambiente casi de vacío
para minimizar la resistencia por fricción. Las moléculas de
Hendidura Dirección del movimiento DNA (y RNA) se someten a análisis extensos mediante técni-
de los fragmentos de DNA Electroforesis en gel
de mezcla cas que usan la ultracentrífuga. Para el presente propósito, se
de fragmentos durante la electroforesis
de restricción Solución amortiguadora consideran dos técnicas de centrifugación usadas en el estudio
de ácidos nucleicos, que se ilustran en la figura 18.35.

Fragmentos de DNA Sedimentación por velocidad La rapidez con que una

separados por tamaño molécula dada se mueve en respuesta a la fuerza centrífuga es
después de la
electroforesis su velocidad de sedimentación. Como esta última cambia con la
fuerza centrífuga, una molécula dada se caracteriza por un
Placa de gel Electrodo Cable coeficiente de sedimentación, que es la velocidad de sedimen-
de agarosa positivo eléctrico Suministro
de energía tación dividida entre la fuerza. En todo el libro se ha aludido
Electrodo
negativo El gel se retira del aparato de electroforesis después al valor S de diversas macromoléculas y sus complejos. La
de separar los fragmentos de DNA por tamaño unidad S (o Svedberg, en honor al inventor de la ultracentrí-
(los fragmentos más cortos migran más rápido)
fuga) equivale a un coeficiente de sedimentación de 10–13 s.
Como la velocidad con la que una partícula se mueve por una
Los fragmentos de DNA columna de líquido depende de varios factores, incluida la
se separan por tamaño
forma, la determinación de los coeficientes de sedimentación
(a) no proporciona por sí sola la masa molecular. Sin embargo,
mientras se trate del mismo tipo de molécula, el valor S pro-
porciona una buena medida del tamaño relativo. Por ejemplo,
los tres RNA ribosómicos de E. coli, a saber las moléculas de
5S, 16S y 23S, tienen longitudes de 120, 1 600 y 3 200 nucleó-
tidos, respectivamente.
En la sedimentación por velocidad (o por zona de velocidad),
las moléculas de ácido nucleico se separan según la longitud
del nucleótido (fig. 18.35a). La muestra que contiene la mez-
cla de moléculas de ácido nucleico se coloca con cuidado como
una capa sobre una solución que contiene una concentración
creciente de sacarosa (u otra sustancia adecuada). Este gra-
diente preformado aumenta la densidad (y la viscosidad)
desde la superficie al fondo. Cuando se someten a grandes
(b) fuerzas centrífugas, las moléculas se mueven por el gradiente a
una velocidad determinada por su coeficiente de sedimenta-
Figura 18.34 Separación de fragmentos de restricción de DNA ción. A mayor coeficiente de sedimentación, más lejos se 18.9 Fraccionamiento de ácidos nucleicos
por electroforesis en gel. (a) El DNA se incuba con una enzima de mueve la molécula en un periodo determinado de centrifuga-
restricción, que lo corta en fragmentos (pág. 764). La mezcla de ción. Como la densidad del medio es menor que la de las
fragmentos se introduce en una ranura o foso en una placa de aga- moléculas de ácido nucleico, aun en el fondo del tubo (alrede-
rosa y se aplica corriente eléctrica. Las moléculas de DNA con carga dor de 1.2 g/ml para la solución de sacarosa y 1.7 g/ml para el
negativa emigran hacia el electrodo positivo y se separan por ta- ácido nucleico), estas moléculas continúan su sedimentación
maño. (b) Todos los fragmentos de DNA que están presentes en un siempre que el tubo se centrifugue. En otras palabras, la cen-
gel pueden revelarse mediante la inmersión del gel en una solución trifugación nunca alcanza el equilibrio. Después de un periodo
de bromuro de etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta.
prescrito, el tubo se retira de la centrífuga, su contenido se
(B:Phillipe Plailly/Science Photo Library/Photo Resear-
chers, Inc.) fracciona (como se muestra en la fig. 18.35c) y se determinan
las posiciones relativas de las diversas moléculas. La presencia
de la sacarosa viscosa impide que el tubo se mezcle a causa de
la convección o la manipulación, lo que permite que las mo-
léculas con valor S idéntico permanezcan en su sitio en la
la sustancia, así como la densidad y viscosidad del medio. Si un forma de una banda. El valor S de los componentes descono-
componente de una solución o suspensión es más denso que el cidos puede establecerse si están presentes moléculas marca-
medio, la fuerza centrífuga determina que se concentre en el doras con un coeficiente de sedimentación conocido. Las figu-
762 Figura 18.35 Técnicas de sedimentación de ácido nucleico. (a) Solución
Separación de moléculas de DNA de diferente tamaño por la veloci- de sacarosa Muestra
dad de sedimentación. El gradiente de densidad de la sacarosa se es-
tablece dentro del tubo (paso 1) al permitir que una solución de
Sacarosa al 5%
sacarosa de concentración cada vez mayor drene por la pared del
tubo. Una vez que el gradiente se forma, la muestra se coloca con 1 2 3

cuidado en la parte alta del gradiente (pasos 2 y 3), y el tubo se so- Sacarosa al 20%
mete a centrifugación (p. ej., 50 000 rpm durante 5 h) como se ilus-
tra en el paso 4. Las moléculas de DNA se separan con base en su
Moléculas pequeñas
tamaño (paso 5). (b) Separación de las moléculas de DNA por sedi- de DNA 5 4
mentación de equilibrio con base en las diferencias en la composi-
ción. La muestra de DNA se mezcla con la solución de CsCl (paso Moléculas medianas
1) y se somete a centrifugación prolongada (p. ej., 50 000 rpm du- de DNA
rante 72 h). El gradiente de CsCl se forma durante la centrifugación Moléculas grandes
(paso 2) y las moléculas de DNA forman bandas en regiones de de DNA
densidad equivalente (paso 3). (c) El tubo del experimento b se pun- (a)
ciona y se permite que el contenido gotee a tubos sucesivos, lo que
fracciona el contenido del tubo. Se mide la absorbancia de la solu-
ción en cada fracción y se grafica como se muestra.

1 2 3

ras 11.13 y 11.17 muestran los resultados experimentales

obtenidos mediante la centrifugación con gradiente de densi- 1.65 g/ml CsCl
dad de sacarosa. Moléculas de DNA ricas en AT

Moléculas de DNA ricas en GC

Centrifugación de equilibrio En el otro tipo de técnica de
centrifugación, la centrifugación de equilibrio (o isopícnica) (fig. 1.75 g/ml CsCl
18.35b), las moléculas de ácido nucleico se separan según su (b)
densidad de flotación. Por lo general en este procedimiento se
utiliza una solución muy concentrada de la sal del metal pe-
sado cesio. El análisis se inicia con la mezcla del DNA con la
solución de cloruro de cesio o sulfato de cesio en el tubo de
la centrífuga para luego someter el tubo a centrifugación pro-
longada (p. ej., dos a tres días con fuerzas altas). Durante la 1.65 g/ml CsCl
centrifugación los iones pesados de cesio se dirigen despacio
Moléculas de DNA ricas en AT
hasta el fondo del tubo y forman un gradiente de densidad
continuo en toda la columna de líquido. Después de cierto Moléculas de DNA ricas en GC
tiempo la tendencia de los iones de cesio a concentrarse hacia
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

1.75 g/ml CsCl

el fondo del tubo se contrarresta con la tendencia contraria
para redistribuirse por difusión, y el gradiente se estabiliza.
Conforme el gradiente de cesio se forma, las moléculas indivi-
Absorbancia (O.D.) a 260 nm

duales de DNA se impulsan hacia abajo o se mueven por flo-

tación hacia arriba en el tubo, hasta que llegan a una posición
con una densidad de flotación equivalente a la propia, mo-
mento en el que ya no experimentan más movimiento. Las
moléculas con densidad equivalente forman bandas angostas
dentro del tubo (fig. 18.41). Esta técnica es lo bastante sensi-
ble para separar moléculas de DNA con diferente composi-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ción de bases (como se ilustra en la fig. 18.35b) o las que tie-
Fondo Número de fracción Arriba
nen distintos isótopos de nitrógeno (15N contra 14N, como se
(c)
muestra en la fig. 13.3b).

18.10 | Hibridación de ácido complementaria pueden formar un híbrido de doble cadena.

nucleico
La hibridación de ácido nucleico comprende varias técnicas
relacionadas basadas en la observación de que dos moléculas
de ácido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases
Considérese una situación en la que se tiene una mezcla de
cientos de fragmentos de DNA de longitud y composición
general de bases idénticas que sólo difieren unos de los otros
por su secuencia de bases. Por ejemplo, asúmase que uno de los
fragmentos de DNA constituye una porción del gen para la
globina beta y el resto contiene genes no relacionados. La
única manera de distinguir entre el fragmento que codifica el
polipéptido globina beta y todos los demás es realizar un ex-
perimento de hibridación molecular con moléculas comple-
mentarias como sondas.
En el presente ejemplo la incubación de la mezcla de
fragmentos de DNA desnaturalizados con una cantidad exce-
siva de mRNA para globina beta llevaría a los fragmentos de
globina a formar híbridos DNA-RNA bicatenarios, mientras
los demás fragmentos de DNA son monocatenarios. Los hí-
bridos DNA-RNA podrían separarse de los fragmentos de
cadenas sencillas en varias formas. Por ejemplo, la mezcla po-
dría pasarse por una columna de hidroxiapatita bajo condicio-
nes iónicas en las que los híbridos se unieran con las sales de
fosfato de calcio de la columna, mientras que las moléculas
de DNA sin hibridar pasarían sin unirse. Entonces los híbri-
dos de la columna podrían liberarse mediante el incremento
en la concentración del amortiguador de lavado.
Los experimentos que usan hibridación de ácidos nuclei-
cos requieren la incubación de dos poblaciones de ácidos nu-
cleicos complementarios de cadena sencilla en condiciones
(fuerza iónica, temperatura, etc.) que promuevan la formación
de moléculas de cadena doble. Según el tipo de experimento
realizado, las dos poblaciones de moléculas en reacción po-
drían estar presentes en solución, o una población podría in-
movilizarse, por ejemplo, por la localización dentro de un cro-
mosoma (como en la fig. 10.19).
En muchos casos una de las poblaciones de ácidos nuclei-
cos de cadena sencilla que se emplea en el experimento de
Gel electroforético
Fragmento de DNA
Peso
Placa
de vidrio
Membrana
de
nitrocelulosa
Amortiguador
de transferencia
Gel electroforético Procesamiento de manchado
que contiene segmentos (“blotting”) para transferencia
fraccionados de DNA. del DNA del gel a la
El DNA es de una sola membrana de nitrocelulosa
cadena (desnaturalizado)
por el tratamiento
con álcalis
Figura 18.36 Identificación de la localización de fragmentos de
DNA específicos en un gel por el método Southern blot. Como se
describe en la figura, los fragmentos fraccionados de DNA se desna-
turalizan y transfieren a una membrana de nitrocelulosa, que se in-
cuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva o
fluorescente. El sitio de los fragmentos hibridados se conoce auto-
hibridación se encuentra dentro de un gel. Considérese una 763
población de fragmentos de DNA que se prepararon a partir
de DNA genómico y se fraccionaron por electroforesis en gel
(fig. 18.36). Para llevar a cabo la hibridación, el gel se trata a
fin de hacer al DNA monocatenario; éste se transfiere enton-
ces del gel a una membrana de nitrocelulosa y se fija en la
membrana por calentamiento a 80⬚C en vacío. El procedi-
miento por el que se transfiere DNA a la membrana se deno-
mina transferencia (manchado). Una vez que el DNA se une, la
membrana se incuba con una sonda de DNA (o RNA) de
cadena sencilla y con marca radiactiva capaz de formar híbri-
dos con un grupo complementario de fragmentos. Luego
la radiactividad libre se elimina y la localización de la sonda
unida se determina por autorradiografía, como se muestra en
la  figura 18.36. El experimento recién descrito mostrado
en dicha figura se conoce como método Southern (en honor
de Edwin Southern, su creador). Con el método de transfe-
rencia de Southern pueden identificarse uno o unos cuantos
fragmentos de restricción de DNA que contienen una secuen-
cia particular de nucleótidos, aun si el gel contiene miles de
fragmentos no relacionados. La figura 10.18 presenta un
ejemplo de transferencia por Southern. Las moléculas de
RNA también pueden separarse por electroforesis e identifi-
carse con una sonda marcada de DNA después de transferirse
a una membrana. La figura 11.35 ilustra un ejemplo de este
procedimiento, llamado método Northernblot.
Las sondas de DNA pueden etiquetarse de varias mane-
ras. Una sonda radiactiva incorpora un isótopo radiactivo
(como 32P) en uno o más sitios de la molécula. La presencia de
Sondas marcadas de DNA o RNA
Membrana de Autorradiografía
nitrocelulosa
Pila de
tollas
de papel
Gel
electro-
forético
Esponja
18.10 Hibridación de ácido nucleico
Membrana Incubar la membrana Autorradiografía
de nitrocelulosa con sondas marcadas que muestra
con fragmentos de DNA o RNA la localización
de DNA adsorbidos para permitir la de los fragmentos
después de tratamiento hibridación, luego de DNA complementarios
con calor que fija lavar y preparar la de la sonda marcada
el DNA en la membrana autorradiografía
radiográficamente (o con microscopia si las sondas fueron marcadas
con tinción fluorescente). Durante el procedimiento de transferencia
(blotting), la acción capilar atrae el amortiguador hacia arriba a las
toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel elec-
troforético, disuelve los fragmentos de DNA y los transfiere a la su-
perficie de la membrana adyacente.
764 la sonda se detecta por autorradiografía, como se muestra en la
figura 18.36. Las sondas también pueden etiquetarse con fluo-
róforos y detectarse por fluorescencia. Otra etiqueta de uso
común es la biotina, una molécula orgánica pequeña que
puede unirse de manera covalente al esqueleto de DNA. La
biotina es detectada por la proteína avidina (o por estreptavi-
dina), que se une a ella con fuerza. La avidina misma, debe
marcarse para la detección, por ejemplo con un fluoróforo
como se muestra en las figuras 10.19 y 10.20.
La hibridación de ácido nucleico también puede propor-
cionar una medida de la similitud en la secuencia de nucleóti-
dos entre dos muestras de DNA, como podría obtenerse de
dos organismos distintos, por ejemplo. Entre más distante sea
la relación evolutiva entre las dos especies, mayor es la diver-
gencia en sus secuencias de DNA. Si los DNA purificados de
las especies A y B se mezclan juntos, se desnaturalizan y se
permite que forme hélices de nuevo, un porcentaje de las ca-
denas dobles de DNA se forman con cadenas de DNA de las
dos especies. Como contienen bases discrepantes, estas cade-
nas dobles son menos estables que las formadas con cadenas
de DNA de la misma especie y la inestabilidad se refleja en la
menor temperatura en la que se disuelven. Cuando se permite
que DNA de distintas especies, formen de nuevo hélices do-
bles en diferentes combinaciones, la temperatura de fusión
(Tm, pág. 400) de las cadenas dobles híbridas proporciona una
medida de la distancia evolutiva entre los organismos. Dos
tipos importantes más de protocolos de hibridación de ácidos
nucleicos se describen con detalle en el texto: la hibridación in
situ en la página 402 y la hibridación en microarreglos de cDNA
en la página 515.
18.11 | Síntesis química
de DNA
En el análisis de hibridación es necesario el uso de moléculas
de ácido nucleico monocatenarias como sondas. Otras técni-
cas fundamentales para la manipulación y el análisis de DNA
en el laboratorio también requieren de moléculas de ácido
nucleico monocatenarias cortas, u oligonucleótidos. La sínte-
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
sis química de DNA y RNA es, por lo tanto, una tecnología de
apoyo clave para muchos procedimientos.
El desarrollo de técnicas químicas para la síntesis de po-
linucleótidos con una secuencia de bases específica fue ini-
ciado por H. Gobind Khorana a principios del decenio de
1960 como parte de un intento de descifrar el código genético.
Khorana y col. siguieron depurando sus técnicas, y una década
después de su trabajo inicial con el código, tuvieron éxito en
sintetizar un gen de tRNA para tirosina bacteriana, incluida la
región promotora no transcrita. El gen, que totalizaba 126
pares de bases, fue ensamblado a partir de más de 20 segmen-
tos, que se sintetizaron de forma individual y luego se unieron
por medios enzimáticos. Estos genes artificiales se introduje-
ron luego en células bacterianas que portaban mutaciones para
este tRNA, y el DNA sintético fue capaz de restablecer la
función hasta entonces deficiente. El primer gen sintetizado
por medios químicos que codificaba una proteína de tamaño
promedio, el interferón humano, se ensambló en 1981, en un
esfuerzo que requirió la síntesis y el ensamblaje de 67 frag-
mentos distintos para producir un solo dúplex de 514 pares de
bases el cual contenía señales de inicio y término reconocidas
por la RNA polimerasa bacteriana.
Las reacciones químicas que unen nucleótidos se han au-
tomatizado, y en la actualidad la síntesis de oligonucleótidos se
realiza mediante máquinas controladas por computadora co-
nectadas a depósitos de reactivos. El operario teclea en la com-
putadora la secuencia de nucleótidos deseada y mantiene una
dotación de los materiales en el instrumento. El oligonucleó-
tido se ensambla un nucleótido a la vez desde el extremo 3⬘ al
5⬘ de la molécula, hasta un total de alrededor de 100 nucleóti-
dos. Es posible incorporar en las moléculas modificadores como
biotina y fluoróforos. Si se requiere una molécula de doble ca-
dena, se sintetiza como dos cadenas complementarias que pue-
den unirse entre sí por hibridación. Las moléculas sintéticas de
mayor longitud se elaboran en segmentos que se unen, como se
ilustra en el experimento señalado en la página 19.
18.12 | Tecnología de DNA
recombinante
En los últimos 30 años se realizaron grandes avances en el
análisis de los genomas eucariotas. Este progreso comenzó
cuando los biólogos moleculares aprendieron a construir mo-
léculas de DNA recombinante, que son moléculas que con-
tienen secuencias de DNA derivadas de más de una fuente. El
DNA recombinante puede usarse en diversas formas. Para
empezar se considera una de las aplicaciones más importantes:
el aislamiento del genoma de un segmento particular de DNA
que codifica un polipéptido determinado. No obstante, es ne-
cesario considerar primero una clase de enzimas cuyo descu-
brimiento y uso han hecho posible la formación de moléculas
de DNA recombinante.
Endonucleasas de restricción
Durante el decenio de 1970 se encontró que las bacterias con-
tenían nucleasas que reconocían secuencias cortas de nucleó-
tidos dentro de un DNA doble y dividían la columna central
de DNA en sitios específicos en ambas cadenas de la hélice
doble. Tales enzimas se conocen como endonucleasas de res-
tricción tipo II o sólo enzimas de restricción. Reciben este nom-
bre porque en las bacterias funcionan para destruir el DNA
viral que pudiera entrar a la célula, lo que restringe el creci-
miento de los virus. La bacteria protege su propio DNA del
ataque lítico mediante la metilación de las bases en los sitios
susceptibles, una modificación química que bloquea la acción
de la enzima.
Se han aislado enzimas de varios cientos de organismos
procariotas distintos que, en conjunto, reconocen más de 100
secuencias de nucleótidos diferentes. Las secuencias que la
mayor parte de las enzimas reconoce miden cuatro a seis nu-
cleótidos de largo y se caracterizan por un tipo particular de
simetría interna. Considérese la secuencia particular recono-
cida por la enzima EcoR1:
3′ CTTAAG 5′
5′ GAATTC 3′
Se dice que este segmento de DNA tiene simetría rotatoria
doble porque puede girarse 180⬚ sin que la secuencia de bases
cambie. Por lo tanto, si la secuencia se lee en la misma direc-
ción (3⬘ a 5⬘ o 5⬘ a 3⬘) en cualquiera de las cadenas se encuen-
tra el mismo orden de bases. Una secuencia con este tipo de
simetría se llama palíndromo. Cuando la enzima EcoR1 ataca
este palíndromo, rompe cada cadena en el mismo sitio de la
secuencia, indicado con las flechas entre los residuos A y G.
Los puntos rojos señalan las bases metiladas de esta secuencia
que protegen el DNA del hospedador contra el ataque enzi-
mático. Algunas enzimas de restricción cortan enlaces opues-
tos entre sí en ambas cadenas, lo que produce extremos romos,
mientras que otras, como EcoR1, hacen cortes escalonados.
El descubrimiento y la purificación de las enzimas de
restricción son invaluables en los avances logrados por los bió-
logos moleculares durante los últimos años. Puesto que es muy 765
frecuente que una secuencia particular de cuatro a seis nucleó-
tidos se produzca por casualidad, cualquier tipo de DNA es
susceptible a la fragmentación por estas enzimas. El uso de las
enzimas de restricción permite disecar el DNA del genoma
humano, o de cualquier otro organismo, en un conjunto bien
definido de fragmentos específicos. Una vez que el DNA de
un individuo particular se digiere con una de estas enzimas, los
fragmentos obtenidos pueden seccionarse con base en su lon-
gitud por electroforesis en gel (como en la fig. 18.37a). Las
diferentes enzimas separan la misma preparación de DNA en
conjuntos distintos de fragmentos y los sitios dentro del ge-
noma que las diversas enzimas separan pueden identificarse y

ORIGEN ORIGEN Figura 18.37 Construcción de un

mapa de restricción del genoma circu-
lar pequeño del virus tumoral de
DNA del polioma. (a) Autorradiogra-
fías de fragmentos de DNA marcados
Hpall - 1 con 32P que se sometieron a electrofo-
Hpall - 2 resis en gel. El gel del lado izquierdo
muestra el patrón de los fragmentos de
Hpall - 3 DNA obtenidos después de la diges-
Hpall - 4 tión completa del genoma de polioma
con la enzima HpaII. Para determinar
B cómo se reúnen estos ocho fragmentos
A para conformar el genoma intacto es
Hpall - 5 necesario tratar el DNA de tal manera
C que se genere superposición de frag-
Hpall - 6
mentos que puede producirse me-
D diante el tratamiento del genoma
Hpall - 7 intacto con una segunda enzima que
Hpall - 1+F
E divide la molécula en sitios diferentes
Hpall - 1+G o por el tratamiento del genoma con la
H
I misma enzima en condiciones distin-
Hpall - 2 K tas en las que el DNA no se digiera
por completo como sucedió en el gel
Hpall - 3 J de la izquierda. Las dos muestras de la
Hpall - 8 derecha representan ejemplos de di-
gestiones parciales del genoma del po-
Hpall - 4 lioma con HpaII. El gel central
muestra los fragmentos generados por
AZUL la digestión parcial del DNA circular
súper helicoidal y el gel de la derecha
muestra los fragmentos HpaII forma-
dos después que el genoma circular se 18.12 Tecnología de DNA recombinante
convierte en una molécula lineal por
(a)
acción de EcoR1 (una enzima que sólo
hace un corte en el círculo). (b) Mapa
EcoR I 25 50 75 de restricción del genoma de polioma
alineado con base en la división hecha
HpaII HpaII HpaII con HpaII. Se ilustran los ocho frag-
HpaII –2 –6 HpaII –1 HpaII –3 –5 HpaII –4 –8 –7 mentos de la digestión completa junto
con el DNA en la parte superior. Los
C L fragmentos superpuestos de la diges-
D I M tión parcial se muestran en su disposi-
F H ción ordenada por debajo del mapa.
B J (Los fragmentos L y M migran al
fondo del gel en la parte a, lado dere-
A A
cho.) (Tomada de Beverly E.
E E
Griffin, Mike Fried y Allison
G G
Cowie, Proc. Nat´l. Acad. Sci.
U.S.A. 71:2078, 1974.)
(b)
766 ordenarse en un mapa de restricción, como el que se muestra
en la figura 18.37b.
Formación de DNA recombinante
Los DNA recombinantes pueden formarse de varias maneras.
En el método que se muestra en la figura 18.38 las moléculas
de DNA de dos fuentes distintas se tratan con una enzima de
restricción que hace cortes escalonados en la cadena doble
de  DNA. Los cortes escalonados dejan colas cortas de una
sola cadena que actúan como “extremos adherentes” que pue-
den unirse con una cola complementaria de una cadena en
otra molécula de DNA para restaurar una molécula de cadena
doble. Uno de los fragmentos de DNA que formarán la mo-
Plásmido Cromosoma
bacteriano humano
La misma enzima de restricción
corta ambos tipos de DNA
A AATT
A A
TT A A
A
TT
TT
El fragmento de DNA humano se une con el plásmido
por los extremos adherentes; las muescas
se sellan por acción enzimática
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Plásmido
Figura 18.38 Formación de una molécula de DNA recombi-
nante. En este ejemplo una preparación de plásmidos bacterianos se
trata con una enzima de restricción que hace un solo corte dentro de
cada plásmido bacteriano. Dicha enzima se utiliza para fragmentar
una preparación de DNA genómico humano en pequeños fragmen-
tos. Como se trataron con la misma enzima de restricción, el DNA
del plásmido dividido y los fragmentos de DNA humano tienen ex-
tremos adherentes. Cuando estas dos poblaciones se incuban juntas,
las dos moléculas de DNA se unen en forma covalente entre sí y
luego se sellan también en forma covalente con la ligasa de DNA,
para formar una molécula de DNA recombinante.
lécula recombinante es un plásmido bacteriano como es el
caso mostrado en la figura 18.38. Los plásmidos son pequeñas
moléculas circulares de DNA de cadena doble que se separan
del cromosoma bacteriano principal. El otro fragmento de
DNA de la figura 18.38 se obtiene de células humanas des-
pués del tratamiento con la misma enzima de restricción em-
pleada para abrir el plásmido. Cuando los fragmentos de
DNA humano y el plásmido tratado se incuban juntos en
presencia de DNA ligasa, los dos tipos de DNA se unen entre
sí mediante enlaces de hidrógeno por sus extremos adherentes
y luego se ligan para formar recombinantes de DNA circulares,
como en la figura 18.38. Paul Berg, Herbert Boyer, Annie
Chang y Stanley Cohen, de la Stanford University y de la Ca-
lifornia University, en San Francisco, formaron las primeras
moléculas de DNA recombinante con este método básico en
1973, con lo que marcaron el nacimiento de la ingeniería ge-
nética moderna.
Con el procedimiento recién descrito se produce una gran
cantidad de moléculas recombinantes distintas, cada una de
las cuales contiene un plásmido bacteriano con un DNA hu-
mano incorporado en su estructura circular (fig. 18.39). Su-
póngase que se tiene interés en aislar un solo gen del genoma
humano, por ejemplo, el que codifica la insulina. Como el
objetivo es obtener una preparación purificada del tipo de
DNA recombinante que contiene el fragmento que codifica la
insulina, dicho fragmento debe separarse de todos los demás.
Esto se hace mediante un proceso llamado clonación de DNA.
Se regresará a la investigación del gen de la insulina después
de describir la metodología que permite la clonación de DNA.
Clonación de DNA
La clonación de DNA es una técnica que produce grandes
cantidades de un segmento de DNA específico. El segmento
de DNA que se clona se une primero con un DNA vector, que
es un vehículo para transportar el DNA extraño a una célula
hospedadora adecuada, como la bacteria E. coli. El vector con-
tiene secuencias que le permiten replicarse dentro de la célula
hospedadora. A menudo se utilizan dos tipos de vectores para
clonar DNA dentro de hospedadores bacterianos. En una de
las técnicas el segmento de DNA que va a clonarse se intro-
duce en la célula bacteriana mediante la unión de éste con un
plásmido, como se describió antes, para luego inducir a la cé-
lula bacteriana a captar el plásmido del medio. En una técnica
alternativa el segmento de DNA se une con una porción del
genoma del virus bacteriano lambda (␭), que luego se permite
que infecte un cultivo de células bacterianas para producir
gran cantidad de virus, cada uno de los cuales contiene el seg-
mento ajeno de DNA. De cualquier manera una vez que el
segmento de DNA está dentro de una bacteria, se replica
junto con el DNA bacteriano (o viral) y se reparte en las célu-
las hijas (o partículas virales producidas). Por lo tanto, el nú-
mero de moléculas de DNA recombinante aumenta en pro-
porción con el número de células bacterianas (o progenie viral)
que se forman. De un solo plásmido recombinante o genoma
viral dentro de una sola célula bacteriana pueden formarse
millones de copias del DNA en un periodo corto. Una vez que
la cantidad de DNA se amplificó lo suficiente, el DNA re-
combinante puede purificarse y usarse en otros procedimien-
tos. Además de proporcionar un medio para amplificar la can-
tidad de una secuencia de DNA particular, la clonación
también es útil para aislar una forma pura de cualquier seg-
mento de DNA en una población grande y heterogénea de 767
moléculas de DNA. Se comenzará con la descripción de la
clonación de DNA en plásmidos bacterianos.
Cromosoma
de E. coli
Clonación de DNA eucariota en plásmidos bacteria-
Plásmido
nos El DNA ajeno que va a clonarse se inserta primero en el
plásmido para formar una molécula de DNA recombinante.
Los plásmidos que se utilizan para la clonación de DNA son Gen de resistencia
a antibiótico
versiones modificadas de los que se encuentran en las células
bacterianas. Como sus contrapartes naturales de las que pro-
vienen, estos plásmidos contienen un origen de replicación y
uno o más genes que convierten a la célula receptora resistente
a uno o más antibióticos. La resistencia a los antibióticos per- Purificar Purificar DNA
mite a los investigadores seleccionar las células que contienen DNA humano del plásmido
el plásmido recombinante.
Como lo demostraron Avery, Macleod y McCarty por
primera vez (pág. 422), las células bacterianas pueden captar
DNA de su medio. Este fenómeno establece la base para la
clonación de plásmidos en las células bacterianas (fig. 18.39).
En la técnica más usual los plásmidos recombinantes se agre- Tratar con EcoR1
para cortar el DNA
gan a un cultivo bacteriano que se trató antes con iones de humano y el bacteriano
calcio. Cuando se someten a un breve choque de calor, tales en fragmentos
bacterias se estimulan para que capten DNA del medio. Por lo
general sólo un pequeño porcentaje de células es competente
para captar y retener una de las moléculas de plásmido recom-
binantes. Una vez que se capta, el plásmido se replica en forma
autónoma en la célula receptora y se pasa a la progenie durante Unir fragmentos
en DNA
la división celular. Las bacterias que contienen un plásmido recombinantes
recombinante pueden seleccionarse de entre otras mediante el con DNA ligasa
crecimiento de las células en presencia del antibiótico al que es
resistente el gen en el plásmido.
Esta descripción se inició con el objetivo de aislar un pe- Población de plásmidos
que contienen segmentos
queño fragmento de DNA que contiene la secuencia para el diferentes de DNA humano
gen de la insulina. Hasta este punto se ha formado una pobla- Incubar células de E. coli
ción de bacterias que contienen muchos plásmidos recombi- bajo condiciones
nantes distintos, muy pocos de los cuales albergan el gen que en las que capten los
se busca (como en la fig. 18.39). Uno de los mayores beneficios plásmidos del medio.
Cultivar células en un medio
de la clonación del DNA consiste en que, además de producir E. coli sin plásmido
que seleccione las
grandes cantidades de moléculas particulares de DNA, per- que contienen un
mite separar los diferentes DNA de una mezcla. Antes se plásmido recombinante
mencionó que las bacterias que contienen plásmidos pueden
seleccionarse entre aquellas sin plásmidos mediante el trata-
miento con antibióticos. Una vez que esto se realiza, las células
que tienen el plásmido pueden crecer a bajas densidades en
cajas de Petri de manera que la progenie de cada célula (un
clon de células) permanece separada de la progenie de otras 18.12 Tecnología de DNA recombinante
células. Como una gran cantidad de plásmidos recombinantes
diferentes estaban al principio en el medio, las distintas células
colocadas en la caja contienen diferentes fragmentos de DNA Gen de insulina ? ? ? Gen de RNA ?
ajenos. Una vez que las células que contienen varios plásmidos ribosómico
crecen en colonias separadas, el investigador puede buscar en Figura 18.39 Ejemplo de clonación de DNA con plásmidos
las colonias las pocas que contienen el gen que busca, en este bacterianos. El DNA se extrae de células humanas, se fragmenta
caso el gen de insulina. con EcoR1 y los fragmentos se insertan en una población de
Las cajas de cultivo que contienen colonias bacterianas (o plásmidos bacterianos. Se cuenta con técnicas para prevenir la
placas de fagos) se revisan para detectar la presencia de una formación de plásmidos que carecen del inserto de DNA ajeno. Una
secuencia de DNA particular con técnicas combinadas de cha- vez que la célula bacteriana captó un plásmido recombinante del
pado de réplica e hibridación in situ. Como se ilustra en la figura medio, la célula da origen a una colonia de células que contienen la
18.40a, el chapado de la réplica permite preparar muchas cajas molécula de DNA recombinante. En este ejemplo la mayor parte de
con representantes de las mismas colonias bacterianas en el las bacterias contiene DNA de eucariotas con función desconocida
(marcados como ?), mientras que uno contiene una porción del
mismo sitio preciso de cada caja. Una de las placas réplica se
DNA que codifica RNA ribosómico y otro contiene DNA que
usa luego para localizar la secuencia de DNA que se busca (fig. codifica insulina.
18.40b), un procedimiento que requiere que las células se des-
768

Figura 18.40 Localización de una colonia bacteriana que con-

tiene una secuencia deseada de DNA por réplica en placa e hibri-
dación in situ. (a) Una vez que las células bacterianas se colocaron
en placas en medios de cultivo y que proliferaron, la caja se invierte
sobre un trozo de papel filtro y se permite que algunas de las células
de cada colonia se adsorban al papel. Se inoculan placas de cultivo
vacías al presionarlas contra el papel filtro a fin de reproducir répli-
Papel filtro
estéril o “terciopelo” cas de las placas. (b) procedimiento para revisar las células de una
placa de cultivo en busca de las colonias que contengan el DNA re-
combinante de interés. Los cultivos se pueden “rastrear” con sondas
marcadas con elementos radiactivos o fluorescentes. Una vez que las
colonias relevantes se identifican, las células pueden retirarse de la
placa original y cultivarse por separado para obtener grandes canti-
(a) dades de los fragmentos buscados de DNA.

Caja de cultivo con colonias

bacterianas (o placas de fagos) Posición del
que contienen DNA recombinante híbrido marcado

Transferir células Destruir células Incubar con

Colonia bacteriana representativas a Colonia y tratar para DNA desnaturalizado sonda marcada
la membrana bacteriana desnaturalizar el DNA adherido a con elementos
de nitrocelulosa y hacer que el DNA la membrana radiactivos
mediante técnica monocatenario se adhiera o fluorescentes
(b) de réplica en placa al filtro en su sitio

truyan y el DNA se fije en la superficie de una membrana de

nylon o nitrocelulosa. Una vez que el DNA se fija, se desnatu-
raliza como preparación para la hibridación in situ, durante la
cual la membrana se incuba con una sonda de DNA de cadena
sencilla marcada que contiene la secuencia complementaria de
la que se busca. Después de la incubación, la sonda que no
formó híbridos se lava de la membrana y la localización de los
híbridos marcados se identifica mediante autorradiografía.
Los representantes vivos de los clones identificados pueden
encontrarse en sitios correspondientes en las placas origina-
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

les y es posible cultivar estas células para obtener colonias más

Figura 18.41 Separación del DNA del plásmido del cromosoma
bacteriano principal mediante centrifugación de equilibrio con
CsCl. Puede verse que este tubo de centrifugación contiene dos
bandas, una de DNA del plásmido que tiene un segmento de DNA
ajeno que se clonó dentro de las bacterias y la otra contiene DNA
cromosómico de estas mismas bacterias. Los dos tipos de DNA se
separaron durante la centrifugación (fig. 18.35b). El investigador
retira el DNA del tubo con aguja y jeringa. El DNA del tubo se
hace visible con el compuesto de unión al DNA bromuro de etidio,
que produce fluorescencia bajo luz ultravioleta. (Ted Speigel/©
Corbis.)
grandes, lo que sirve para amplificar el plásmido de DNA re-
combinante.
Tras alcanzar la amplificación deseada, se cosechan las
células, se extrae el DNA y el DNA de plásmido recombi-
nante se separa con facilidad del cromosoma mucho más
grande por medio de varias técnicas, entre ellas la centrifuga-
ción de equilibrio (fig. 18.41). Los plásmidos recombinantes
aislados pueden tratarse luego con la misma enzima de restric-
ción que se empleó en su formación, lo que libera los segmen-
tos clonados de DNA del resto del DNA que sirvió como
vector. Entonces el DNA clonado puede separarse del plás-
mido por centrifugación.
Clonación de DNA eucariota en genomas de fagos Otro
vector de clonación importante es el bacteriófago lambda, que
se muestra en la figura 18.42. El genoma de lambda es una
molécula lineal de DNA de cadena doble de unas 50 kb de
largo. La cepa modificada que se utiliza en la mayor parte
de los experimentos de clonación contiene dos sitios de divi-
sión para la enzima EcoR1, la cual fragmenta el genoma en
tres segmentos grandes. De manera conveniente toda la infor-
 bacteriano en el sitio de infección. Cada placa contiene millo- 769
Mutante
cuyo DNA
nes de partículas de fago, cada una con una sola copia del
contiene dos mismo fragmento de DNA eucariota.
sitios EcoR1 El fragmento lambda es atractivo como vector de clona-
ción por muchas razones: (1) el DNA se empaca bien en una
Extraer DNA, forma en la que es fácil de almacenar y extraer, (2) todo fago
tratar con que contenga un DNA recombinante es capaz de infectar una
EcoR1 célula bacteriana y (3) una sola caja de Petri puede contener
más de 100 000 placas diferentes. Luego que las placas de fa-
gos se forman, el fragmento particular de DNA que se busca
se identifica mediante un proceso similar de réplica en placa e
1 2 3
hibridación in situ descrito en la figura 18.40 para la clonación
de los plásmidos recombinantes. La clonación en bacteria
Separar (como BAC) o en levadura (como YAC) de DNA de mayor
fragmentos,
descartar el
tamaño se explica en la página 774.
segmento
intermedio
18.13 | Amplificación enzimática
1 3
de DNA por reacción
Intercalar con
fragmentos en cadena de la polimerasa
de eucariota
En 1983 Kary Mullis de Cetus Corporation concibió una nueva
( )
técnica que ahora se emplea mucho para amplificar fragmen-
tos específicos de DNA sin la necesidad de células bacterianas.
DNA recombinante Esta reacción se conoce como reacción en cadena de la poli-
merasa (PCR, polymerase chain reaction). Muchos protocolos
Empaque de DNA
recombinante
diferentes de PCR se usan para una multitud de aplicaciones
en una cabeza en las que es posible amplificar desde uno hasta una gran po-

18.13 Amplificación enzimática de DNA por reacción en cadena de la polimerasa

de fago
Infectar bacteria
hospedadora
Prado Placa de clara
bacteriano de fagos
Caja de cultivo
Figura 18.42 Protocolo para la clonación de fragmentos de
DNA eucariota en un fago lambda. Los pasos se describen en el
texto.
mación esencial para la infección y la lisis celular está conte-
nida en los dos segmentos exteriores, por lo que el fragmento
dispensable del centro puede reponerse con un fragmento de
DNA de hasta unas 25 kb. Las moléculas de DNA recombi-
nante pueden empacarse en cabezas de fagos in vitro y estas
partículas de fago creadas por ingeniería genética pueden
usarse para infectar bacterias hospedadoras. (Las moléculas de
DNA de fago que carecen del inserto son demasiado cortas
para empacarse.) Una vez en la bacteria, el DNA eucariota se
amplifica junto con el DNA viral y luego se empaca en una
nueva generación de partículas virales que se liberan cuando la
célula se destruye. Las partículas liberadas infectan nuevas cé-
lulas y pronto se ve una mancha clara (o placa) en el “prado”
blación de DNA relacionados. La amplificación por PCR es
fácil de adaptar a los moldes de RNA si primero se les con-
vierte en DNA complementarios, con transcriptasa inversa.
La figura 18.43 muestra el procedimiento básico que se
utiliza en la PCR. La técnica emplea una polimerasa de DNA
termoestable llamada polimerasa Taq, que al principio se aisló
de Thermus aquaticus, una bacteria que vive en manantiales
calientes a temperaturas mayores de 90⬚C. En el protocolo
más sencillo, una muestra de DNA se mezcla con una alícuota
de polimerasa Taq y los cuatro desoxirribonucleótidos, junto
con un gran exceso de dos fragmentos sintéticos cortos de
DNA (oligonucleótidos) que son complementarios de las se-
cuencias de DNA en los extremos 3⬘ de la región del DNA
que va a amplificarse. Los oligonucleótidos sirven como ceba-
dores (iniciadores) (pág. 550) a los que se agregan los nucleó-
tidos durante los pasos siguientes de replicación. Luego la
mezcla se calienta a unos 95⬚C, que es lo bastante caliente
para hacer que las moléculas de DNA de la muestra se separen
en sus dos cadenas componentes. A continuación la mezcla se
enfría a unos 60⬚C para permitir que los cebadores se unan
con las cadenas del DNA blanco y la temperatura se eleva de
nuevo a 72⬚C para que la polimerasa termofílica agregue nu-
cleótidos al extremo 3⬘ de los cebadores. Conforme la polime-
rasa extiende el cebador, copia de manera selectiva el DNA
blanco y forma nuevas cadenas de DNA complementario. La
temperatura se eleva de nuevo, lo que hace que las cadenas de
DNA recién formadas y las originales se separen. En seguida
se enfría la muestra para permitir que los cebadores sintéticos
de la muestra se unan de nuevo con el DNA blanco, que ahora
está presente en una cantidad dos veces mayor que la original.
Este ciclo se repite una y otra vez, y en cada ronda se duplica
la cantidad de la región específica del DNA que está flan-
queado por los cebadores unidos. Pueden generarse billones
de copias de esta región específica en unas cuantas horas con
770
La mezcla de reacción contiene DNA blanco
la secuencia de DNA blanco
que va a amplificarse, dos 1 copia
cebadores (P1 y P2) y P1 P2
polimerasa resistente al calor
Polimerasa resistente al calor
La mezcla de reacción se
calienta para separar cadenas
de DNA blanco. El enfriamiento
posterior permite que los
cebadores se unan con las
Primer ciclo

secuencias complementarias Nueva cadena de DNA

de DNA blanco

La polimerasa extiende las cadenas

complementarias a partir
de los cebadores

2 copias
idénticas
El primer ciclo de síntesis
produce dos copias de
la secuencia de DNA blanco

Las cadenas separadas de DNA

se unen con cebadores
Segundo ciclo

Cadenas nuevas
de DNA extendidas
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

4 copias
El segundo ciclo de síntesis idénticas
produce cuatro copias de
la secuencia de DNA blanco

Figura 18.43 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se explica en el texto, el procedimiento emplea la poli-
16
merasa de DNA resistente al calor, cuya actividad no se elimina cuando la temperatura se eleva para separar dos cadenas de
la doble hélice. Con cada ciclo de duplicación, las cadenas se separan, los segmentos de flanqueo (cebadores) se unen con los
extremos de la región seleccionada y la polimerasa copia el segmento intermedio. etc.

un generador de ciclos térmicos que cambia la temperatura de la
mezcla de reacción en forma automática para permitir que
ocurra cada paso del ciclo.
Aplicaciones de la PCR
Amplificación de DNA para clonación o análisis Desde su in-
vención, la PCR ha encontrado muchos usos. Puede generar
muchas copias de un fragmento de DNA específico antes de
clonarlo, lo que constituye un método eficiente si la secuencia
objetivo se conoce con suficiente detalle para que sea posible
especificar la secuencia de nucleótidos de dos cebadores com-
plementarios. Esto reviste especial utilidad en casos en que el
DNA original es muy escaso, dado que la PCR puede generar
grandes cantidades de DNA a partir de muestras diminutas,
como la que hay en una sola célula. La PCR se ha usado en
investigaciones criminales para generar cantidades de DNA a
partir de una mancha de sangre seca en la ropa de un sospe-
choso o aún del DNA presente en parte de un solo folículo
piloso dejado en la escena de un crimen. Con este fin se selec-
cionan regiones del genoma para amplificar que sean muy po-
limórficas (esto es, que varíen con gran frecuencia en la pobla-
ción), de modo que no haya dos individuos que tengan los
mismos fragmentos de DNA valorados (como en la figura
10.18). Este mismo procedimiento puede usarse para estudiar
fragmentos de DNA de fósiles bien conservados que pueden
tener millones de años de antigüedad. La actividad de la poli-
merasa de DNA en la PCR también se emplea en la secuen-
ciación de DNA (sección 18.14).
Pruebas para la presencia de secuencias de DNA específicas Su-
póngase que se desea determinar si una muestra de tejido con-
tiene o no un virus dado. Podría responderse a esto mediante
una hibridación Southern (pág. 763) o mediante la PCR. En
este último caso, se aísla ácido nucleico de la muestra y se
añaden cebadores PCR complementarios al DNA viral, junto
con los otros reactivos de la PCR. Entonces se permite que
proceda la reacción. Si el genoma viral está presente en la
muestra, los cebadores PCR se hibridarán con él y la PCR
generará un producto. Si el virus no está presente, los cebado-
res PCR no se hibridarán y no se generará producto. Así, en
esta aplicación, la PCR misma sirve como el sistema de detec-
ción.
Comparación de moléculas de DNA Si dos moléculas de DNA
tienen la misma secuencia de bases, generarán los mismos
productos de PCR en reacciones con cebadores idénticos.
Ésta es la premisa para ensayos rápidos en que se compara la
similitud de dos muestras de DNA, por ejemplo DNA genó-
mico de aislados bacterianos. La PCR se realiza en las mues-
tras usando varios cebadores, que pueden estar diseñados en
forma específica o generarse al azar. Los productos se separan
por electroforesis en gel y se comparan. Cuanto más similares
las secuencias de los genomas bacterianos, más similares serán
sus productos PCR.
Cuantificación de plantillas de DNA o RNA La PCR también
puede usarse para determinar cuánto de una secuencia especí-
fica de nucleótidos (DNA o RNA) está presente en una
muestra mixta. En un método para esta PCR cuantitativa se
usa la unión de un colorante específico para DNA bicatenario
a fin de cuantificar la cantidad de producto bicatenario que se
genera. La rapidez de acumulación de producto es proporcio-
nal a la cantidad de plantilla presente en la muestra.
Otro método utilizado se denomina “faros moleculares”.
Se trata de oligonucleótidos indicadores cortos con un fluoro-
cromo unido a un extremo y una molécula supresora al otro y
que se hibridan a la mitad de la secuencia blanco por amplifi-
car. Mientras el oligonucleótido corto está intacto, el fluoro-
cromo y el supresor están lo suficientemente cerca para que la
fluorescencia se suprima. Cuando la polimerasa de DNA sin-
tetiza una nueva cadena de DNA complementaria a la planti-
lla, su actividad de exonucleasa (pág. 557) degrada el oligonu-
cleótido indicador. Por lo tanto, el fluorocromo se separa del
supresor y emite fluorescencia. La cantidad de fluorocromo
que se libera en un ciclo de PCR dado es directamente pro-
porcional al número de moléculas de plantilla que la polime-
rasa copia.
18.14 | Secuenciación de DNA 771
Para 1970 ya estaba identificada la secuencia de una larga lista
de proteínas, aunque aún no se lograba progreso alguno en la
secuenciación de nucleótidos en el DNA. Varias razones ex-
plicaban este estado de las cosas. A diferencia de las moléculas
de DNA, los polipéptidos tienen longitudes definidas y mane-
jables; una especie determinada de polipéptido podía purifi-
carse con facilidad; se disponía de varias técnicas para dividir
el polipéptido en varios sitios a fin de producir fragmentos
superpuestos, y la presencia de 20 aminoácidos diferentes con
propiedades muy diversas hacía que la separación y la identifi-
cación de la secuencia de los péptidos pequeños fuera una ta-
rea simple. A mediados del decenio de 1970 se produjo una
revolución en la tecnología para la secuenciación del DNA.
Para 1977 se publicó la secuencia completa de nucleótidos de
un genoma viral completo, el de ␾X174, de 5 375 nucleótidos
de largo. Este hito en la biología molecular se produjo en el
laboratorio de Frederick Sanger, quien identificó la primera
secuencia de aminoácidos de un polipéptido (insulina) 25
años antes. Para 2001 se publicó el borrador de la secuencia
del genoma humano (que equivalió a unos tres mil millones de
pares de bases) que fue el producto de años de investigación
de cientos de científicos.
Dichos avances en la secuenciación de DNA fueron po-
sibles gracias a desarrollos en varias áreas: métodos molecula-
res para la secuenciación de DNA, instrumentación suscepti-
ble de automatizarse, computadoras más potentes y fáciles de
adquirir, y software para análisis de datos. La clave inicial fue
el desarrollo de métodos para determinar la secuencia de frag-
mentos de DNA. Este avance en sí fue posible por el descu-
brimiento de enzimas de restricción y el desarrollo de tecnolo-
gías de clonación, que aportaron los medios necesarios para
crear un fragmento de DNA definido en cantidades suficien-
tes para ejecutar los procedimientos bioquímicos necesarios.
Cerca de 1980 tuvo una enorme aceptación como el mé-
todo más indicado, el de secuenciación de DNA creado por
Sanger y A.R. Coulson, del Medical Research Council de Cam-
bridge, Inglaterra. Una vez que se contó con PCR, la secuen-
ciación de Sanger-Coulson y PCR se fusionaron en una téc-
nica de secuenciación, que combina los aspectos bioquímicos
del primer método con los ciclos repetitivos del segundo; tal
método recibió el método de secuenciación cíclica, y se utilizó
ampliamente en la secuenciación del genoma; sus fases básicas
se señalan en la figura 18.44. No se usa ya la secuenciación de
Sanger-Coulson en los principales proyectos de este tipo con
DNA, pero su importancia histórica como técnica utilizada en
todos los estudios primeros de secuenciación del genoma in-
cluido el Proyecto del Genoma Humano y la elegancia de su
metodología bioquímica, hacen de él un instrumento útil para
18.14 Secuenciación de DNA
el aprendizaje en la biología molecular.
Este procedimiento inicia con una población de molécu-
las plantilla idénticas, ya sea un producto PCR o un fragmento
de DNA clonado. El DNA plantilla se mezcla con un cebador
que es complementario al extremo 3⬘ de una cadena de la re-
gión por secuenciar. La mezcla de reacción también contiene
la polimerasa de DNA termoestable Taq, los cuatro precurso-
res trifosfato de desoxirribonucleósido (dNTP) y una baja
concentración de precursores modificados llamados trifosfatos
de didesoxirribonucleósido (ddNTP). Cada ddNTP (ddATP,
ddGTP, ddCTP y ddTTP) se modificó por la adición de un
colorante fluorescente de distinto color a su extremo 3⬘.
772 Figura 18.44 Secuenciación de DNA.
5' G G ACATG AG CT 3' (a) Pasos básicos en la identificación de la
secuencia de un pequeño fragmento hi-
3' CCTG TACTCG A 5'
potético mediante la técnica de Sanger-
1 DNA desnaturalizado Coulson (didesoxi), como se describen en
el texto. (b) Carriles de gel en que las mo-
3' CCTG TACTCG A 5'
léculas hijas con marca fluorescente se se-
pararon. El color de la banda se
Oligonucleótido GGA cebador determina por la identidad del didesoxi-
+ DNA polimerasa
nucleótido en el extremo 3’ de la cadena
+ dATP, dGTP, dCTP, dTTP
2 + Cuatro ddNTP, cada uno de DNA. (c) La secuencia de nucleótidos
marcado con un colorante en la cadena plantilla se interpreta en una
fluorescente distinto computadora que “lee” de abajo hacia
3' CCTG TACTCG A 5' arriba en el gel, usando como entrada la
3 intensidad y la longitud de onda de la luz
5' G G
GAA 3'
fluorescente. La computadora genera un
ddGTP d d AT P ddCTP d d TTP “electroferograma” que muestra la intensi-
dad y el color de la fluorescencia detec-
4
tada, junto con la interpretación de la
GGAC ATG G G ACA G G AC G G ACAT secuencia de DNA. (b,c: tomada de Le-
GGAC A T GAG GG ACATGA G G ACATG AGC G G A CATG A G CT roy Hood y David Galas, Nature
421:445, 2003, fig. 1c y 1d. reimpresas
con autorización de Macmillan Pu-
blishers Ltd.)
5
CATG AG CT
(b)
CATG AGC
CATG AG
CATGA
CATG
CAT
CA
C
(a) (c)

La reacción de secuenciación da comienzo, como la PCR,
cuando la mezcla se calienta a una temperatura que hace que
las dos cadenas plantilla se desnaturalicen (fig. 18.44a, paso 1).
Después, la reacción se enfría de modo que el cebador pueda
hibridarse con el DNA plantilla (paso 2). Debe hacerse notar
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
tesis y desnaturalización se repite muchas veces, generando
una gran población de cadenas de DNA hijas que hasta ahora
incluye moléculas en las cuales se incorporó un ddNTP en
cada posición. Por ejemplo, por cada A en la cadena plantilla
habrá una cadena hija que termine en un ddTTP en esa posi-

que, en comparación con lo que ocurre en la PCR, sólo está
presente un cebador, así que sólo una de las dos cadenas de
DNA plantilla puede hibridarse con un cebador. En el paso 3,
la polimerasa Taq agrega al extremo del cebador el dNTP
complementario a la molécula plantilla, lo cual hace que se
sintetice una nueva cadena de DNA complementaria. De vez
en cuando, la polimerasa inserta un ddNTP en vez de un
dNTP. Los didesoxirribonucleótidos carecen del grupo hi-
droxilo en sus posiciones 2⬘ y 3⬘. Una vez que estos nucleóti-
dos se incorporan al extremo de una cadena creciente, la falta
de OH 3⬘ imposibilita a la polimerasa para que agregue otro
nucleótido, lo que causa la terminación de la cadena (fig.
18.44, paso 4). Como el ddNTP está presente en una concen-
tración menor en la mezcla de reacción que el dNTP corres-
pondiente, la incorporación del ddNTP es infrecuente y alea-
toria; puede incorporarse cerca del principio de una cadena,
cerca de la parte intermedia de otra o hasta el final de la ter-
cera cadena. En cualquier caso, cuando el ddNTP se incor-
pora, el crecimiento de la cadena cesa en ese punto.
Una vez que se completa la fase de extensión de la cadena,
la temperatura vuelve a elevarse para desnaturalizar las nuevas
moléculas de DNA bicatenarias. El ciclo de hibridación, sín-
ción. Cuando todos los ciclos se completan, los productos de
reacción se separan por electroforesis en gel en capilares muy
finos (fig. 18.44, paso 5).
La electroforesis de alta resolución en gel separa frag-
mentos cuya diferencia reside sólo en un nucleótido de largo,
de modo que cada banda sucesiva en el gel contiene moléculas
que rebasan por un nucleótido la de la banda previa. Cada
ddNTP fue marcado con un colorante fluorescente particular,
razón por la cual el color de la banda (tal como la capta un
detector de láser automatizado) revela la identidad del nucleó-
tido terminal de cada molécula hija (fig. 18.44b). Por esa ra-
zón, el orden de los colores corresponde a la secuencia de bases
de la molécula que sirve de plantilla (fig. 18.44c).
Desde 2005, aproximadamente, se ha producido una re-
volución en la tecnología de secuenciación del DNA, orien-
tada a lograr la secuenciación de genomas humanos y de otros
seres, en forma rápida y barata. Los costos de la secuenciación
de cantidades masivas de DNA han caído mucho en los últi-
mos años y para 2012 ya era posible obtener la secuencia de
una persona determinada por un costo cercano a 5 000 dóla-
res, varios órdenes de magnitud menor al costo algunos años
antes.
 Este progreso fue posible por el desarrollo de estrategias
totalmente nuevas para la secuenciación del DNA. Se conoció
a la primera de las nuevas estrategias como secuenciación para-
lela masiva (o secuenciación de la segunda generación) y ha
predominado en los intentos de secuenciación genómicos en
los últimos años. A diferencia de las fases de secuenciación del
proyecto original del Genoma Humano, las tecnologías de
secuenciación paralela masiva no necesitan clonar los segmen-
tos del genoma en levaduras o bacterias. En vez de ello se
preparan directamente los fragmentos a partir del genoma en
su totalidad y cada uno es amplificado más adelante hasta
formar una población abundantísima. A semejanza de la téc-
nica de Sanger-Coulson, las técnicas de secuenciación paralela
masiva se basan en la síntesis de DNA dependiente de poli-
merasa, pero no utiliza la terminación prematura de la cadena
ni necesita separación de cadenas por medio de electroforesis,
lo cual limita el número de muestras que pueden ser estudia-
das simultáneamente. En vez de ello, logran la identificación
directa de nucleótidos individuales a medida que son incorpo-
rados por las polimerasas, en tiempo real. Se cuenta con diver-
sos instrumentos y cada uno realiza una variante de la secuen-
ciación de DNA automatizada rápida. En todos los casos
comentados, se inmoviliza un número extraordinariamente
grande de moléculas de DNA (incluso 109 en promedio) en una
superficie, para ser incubados con la DNA polimerasa en pre-
sencia de los 4 NTP diferentes. Se utilizan diversas estrategias
para identificar los nucleótidos que son incorporados de ma-
nera secuencial en cada una de las cadenas complementarias,
conforme son sintetizadas en un número masivo “de plantillas
paralelas” de DNA.
Las cadenas sintetizadas en todas estas plataformas son
relativamente cortas (longitud menor de 100 bases), en com-
paración con los secuenciadores originales que utilizaban mé-
todos electroforéticos (longitud aproximada 800 bases). Los
secuenciadores nuevos también más fácilmente caen en erro-
res en comparación con los instrumentos utilizados en la pri-
mera generación de intentos. Sin embargo, un enorme número
de copias de cada cadena de DNA es “leída” simultáneamente,
al grado que se alcanza enorme precisión al conocer la secuen-
cia más abundante generada. Los segmentos cortos sintetiza-
dos (llamados “lecturas”) constituyen un problema cuando los
investigadores intentan conocer la secuencia genómica de
DNA de una nueva especie, porque puede ser muy difícil en-
samblar un gran número de lecturas breves en moléculas de
DNA larguísimas que aparecen en un cromosoma eucariótico.
En consecuencia, estas tecnologías de secuenciación de DNA
son más idóneas para estudiar genomas individuales de una
especie como la humana, en la que los investigadores tienen ya
un genoma de referencia, en el cual pueden colocar un frag-
mento particular de DNA. A pesar de tales obstáculos, se ha
logrado ensamblar con los instrumentos mencionados geno-
mas de especies nuevas como los de los pandas. Otro pro-
blema con el empleo de secuenciadores paralelos masivos es
que los datos no pueden ser separados en genomas haploides
maternos y paternos o sus haplotipos (pág. 419); ello puede
limitar su utilidad en aplicaciones de la medicina genómica.
En los últimos años, se han introducido en el mercado
instrumentos nuevos de secuenciación de DNA, conocidos a
menudo como los de la tercera generación. En forma de grupo,
tales instrumentos utilizan estrategias mecanísticas muy dis-
tintas para conocer las secuencias de nucleótidos, aunque mu-
chos de ellos actúan en moléculas únicas de DNA (que eli-
mina la necesidad de amplificación del DNA), generan
lecturas largas (1 000 nucleótidos) y operan con menor costo 773
y mayor rapidez que los instrumentos de la segunda genera-
ción. Nos ocuparemos brevemente de un par de tales estrate-
gias de secuenciación. En un caso, la secuenciación se logra al
“tirar” de cada molécula de DNA de modo que atraviese un
orificio pequeñísimo o “nanoporo” e identifique cada nucleó-
tido, uno cada vez, al pasar por el orificio. La identificación de
nucleótidos se basa en las diferencias de propiedades iónicas
de los cuatro nucleótidos que se detectan, conforme cada uno
pasa, uno tras otro a través del nanoporo. Con el gran número
de nanoporos que operan simultáneamente es posible la se-
cuenciación muy rápida. Otros secuenciadores de la tercera
generación actúan por la técnica de “secuenciación por sínte-
sis”. Con el instrumento en cuestión, un sistema de detección
basado en laser identifica nucleótidos marcados con fluores-
cencia a medida que son incorporados por una sola DNA
polimerasa que se desplaza a lo largo de la cadena de DNA. Se
hace una vigilancia simultánea de cientos de miles o más de
tales reacciones en cadenas de DNA diferentes y por ello se
generan cantidades impresionantes de datos durante lapsos
breves de incubación (“corridas”).
Una vez determinada la secuencia de nucleótidos de un
segmento de DNA, es posible emplear diversas herramientas
de software para analizarla. Por ejemplo, la secuencia de ami-
noácidos codificada por el DNA puede determinarse y com-
pararse con otras secuencias de aminoácidos conocidas para
obtener información acerca de la posible función del polipép-
tido. La secuencia de aminoácidos también aporta indicios
respecto a la estructura terciaria de la proteína, en particular
las partes del polipéptido que podrían actuar como segmentos
que cruzan la membrana de proteínas integrales de mem-
brana. La secuencia de nucleótidos misma también puede
compararse con otras conocidas. Tales comparaciones son úti-
les para evaluar la relación o historia evolutiva de las secuen-
cias de DNA, para identificar el fragmento de DNA que
acaba de secuenciarse, o para comparar las características ge-
nómicas de diversos organismos o individuos.
18.15 | Genotecas de DNA
A menudo la clonación de DNA se usa para producir genote-
cas de DNA, que son colecciones de fragmentos de DNA
clonados. Pueden crearse dos tipos básicos de genotecas de
DNA: genotecas genómicas y genotecas de cDNA. Las primeras se
producen de un DNA total extraído de núcleos y contienen
todas las secuencias de DNA de la especie. Una vez que dispo-
nen de una genoteca genómica de una especie, los investiga-
dores pueden utilizar esta colección para aislar secuencias es-
pecíficas de DNA, como las que contienen el gen para la
insulina humana. Por otro lado, las genotecas de cDNA provie-
18.15 Genotecas de DNA
nen de copias de DNA de una población de RNA. Por lo ge-
neral las genotecas de cDNA se producen a partir de RNA
mensajeros presentes en una célula particular, por lo que co-
rresponden a los genes que están activos en ese tipo de célula.
Genotecas genómicas
Primero se examinará la producción de una biblioteca genó-
mica (catálogo genómico o genoteca). En una técnica, el DNA
genómico se trata con una o dos enzimas de restricción que
774 reconocen secuencias de nucleótidos muy cortas en condicio-
nes de baja concentración enzimática, de manera que sólo un
pequeño porcentaje de los sitios susceptibles se divida. Dos
enzimas usuales que reconocen secuencias de cuatro nucleóti-
dos son HaeIII (reconoce GGCC) y Sau3A (reconoce GATC).
Se esperaría que hubiera un determinado tetranucleótido por
casualidad con una frecuencia tal que cualquier segmento de
DNA de tamaño considerable sea sensible a la fragmentación.
Una vez que el DNA se digiere en forma parcial, el material
digerido se fracciona por electroforesis en gel o centrifugación
con gradiente de densidad y los fragmentos de tamaño ade-
cuado (p. ej., 20 kb de largo) se incorporan en las partículas de
fago lambda. Estos fagos se emplean para generar el millón de
placas necesarias para asegurar la representación de cada seg-
mento individual de un genoma de mamífero.
Como el DNA se trata con enzimas en condiciones en las
que la mayor parte de los sitios susceptibles no se dividen, para
fines prácticos el DNA se fragmenta al azar. Una vez que los
fagos recombinantes se producen, pueden almacenarse para
usarlos más adelante y, como tal, constituyen una colección
permanente de todas las secuencias de DNA presentes en el
genoma de la especie. Siempre que un investigador desee ais-
lar una secuencia particular de la genoteca, las partículas de
fago pueden cultivarse en bacterias y las diversas placas (cada
una originada por la infección de un solo fago recombinante)
revisarse para detectar la secuencia mediante hibridación in
situ.
El uso de DNA dividido al azar tiene una ventaja en la
construcción de una genoteca porque genera fragmentos su-
perpuestos que pueden ser útiles en el análisis de regiones del
cromosoma que se extienden en ambas direcciones de una
secuencia particular, una técnica conocida como marcha de cro-
mosomas. Por ejemplo, si se aísla un fragmento que contiene la
región codificadora de un gen para globina, ese fragmento
particular puede marcarse y usarse como sonda para buscar en
la genoteca genómica fragmentos con los que se superponga.
El proceso se repite luego con nuevos fragmentos como son-
das marcadas en pasos de detección sucesivos, mientras se aísla
en forma gradual una parte cada vez más larga de la molécula
de DNA original. Esta técnica permite estudiar la organiza-
ción de secuencias vinculadas en una región extensa de un
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
cromosoma.
Clonación de fragmentos más largos de DNA en vecto-
res de clonación especializados Ni los vectores plásmi-
dos ni los fagos lambda son adecuados para la clonación de
DNA mayores de 20 a 25 kb de largo. Se han desarrollado
varios vectores que permiten a los investigadores clonar seg-
mentos mucho más grandes de DNA; uno de los más impor-
tantes es el cromosoma artificial de levadura (YAC, yeast ar-
tificial chromosome), que puede aceptar segmentos de DNA
ajeno de hasta 1 000 kb (un millón de pares de bases). Como
su nombre lo indica, los YAC son versiones artificiales de un
cromosoma normal de levadura. Contienen todos los elemen-
tos de un cromosoma de levadura que se requieren para repli-
car la estructura durante la fase S y separarla entre las células
hijas durante la mitosis, inclusive uno o más orígenes de repli-
cación, telómeros en los extremos de los cromosomas y un
centrómero al que las fibras del huso pueden unirse durante la
separación del cromosoma. Además de estos elementos, los
YAC se construyen para que contengan: (1) un gen cuyo pro-
ducto codificado permita a las células que contienen el YAC
seleccionarse entre las que carecen de tal elemento y (2) el
fragmento de DNA a clonar. Como otras células, las levaduras
pueden captar DNA de su medio, lo que proporciona el medio
para introducir los YAC a las células.
En los últimos años los laboratorios participantes en la
identificación de la secuencia de los genomas dependen mu-
cho de un vector alternativo de clonación, el cromosoma arti-
ficial bacteriano (BAC, bacterial artificial chromosome), que
también puede aceptar grandes fragmentos de DNA (de hasta
500 kb). Los BAC son plásmidos bacterianos especializados
(factores F) que contienen un origen bacteriano de replicación
y los genes necesarios para regular su propia replicación. Los
BAC tienen ventaja sobre los YAC en proyectos para identifi-
car secuencias a alta velocidad porque pueden clonarse en E.
coli, que capta con facilidad el DNA exógeno, tiene un tiempo
de generación extremadamente corto, pueden cultivarse en
grandes densidades en medios simples y no “corrompen” el
DNA clonado por recombinación.
Los fragmentos de DNA clonados en YAC y BAC casi
siempre son mayores de 100 kb de largo. Los fragmentos tan
grandes suelen producirse mediante tratamiento de DNA con
enzimas de restricción que reconocen secuencias de nucleóti-
dos muy largos (siete a ocho nucleótidos) que contienen dinu-
cleótidos CG. Como se señala en la página 531, los dinucleó-
tidos CG tienen funciones especiales en el genoma de los
mamíferos, y se supone que por eso no aparecen tan a menudo
como se esperaría que sucediera por casualidad. Por ejemplo,
la enzima de restricción Not1 que reconoce la secuencia de
ocho nucleótidos GCGGCCGC, por lo general divide el
DNA de mamíferos en fragmentos con varios cientos de miles
de pares de bases de largo. Los fragmentos de esta longitud
pueden incorporarse en YAC o BAC y clonarse dentro de le-
vaduras o bacterias hospedadoras.
Genotecas de cDNA
Hasta este punto la descripción se limitó a la clonación de
fragmentos de DNA aislados del DNA extraído, es decir, frag-
mentos genómicos. Cuando se trabaja con DNA genómico,
por lo general se busca aislar un gen o una familia de genes
particulares entre cientos de miles de secuencias no relaciona-
das. Además el aislamiento de los fragmentos genómicos per-
mite estudiar diversos temas, entre ellos: (1) secuencias regu-
ladoras que flanquean la porción codificadora del gen, (2)
secuencias intermedias no codificadoras, (3) varios miembros
de una familia de múltiples genes que a menudo están muy
cercanos en el genoma, (4) la evolución de las secuencias de
DNA, inclusive su duplicación y recombinación como se ve en
comparaciones del DNA de diferentes especies y (5) el inter-
calado de elementos genéticos transferibles.
A diferencia del DNA genómico, la clonación de cDNA
también es importante en el análisis de la expresión genética y
el corte y empalme alterno. Para producir genotecas de cDNA
se aísla una población de RNA mensajeros y se utiliza como
plantilla para que la transcriptasa inversa forme una población
de híbridos DNA-RNA, como se muestra en la figura 18.45a.
Los híbridos DNA-RNA se convierten en una población de
cDNA bicatenario mediante cortes en el RNA con la RNAasa
H y la sustitución con DNA por efecto de la DNA polimerasa
I. El cDNA bicatenario se combina después con el vector de-
seado (en este caso un plásmido) y se clona como se muestra
en la figura 18.45b. Aunque las poblaciones de RNA mensa-
 Figura 18.45 Síntesis de cDNA para clonación en un plásmido. 775
Poli(A)
(a) En este método de formación de cDNA, un cebador corto
5' 3' poli(dT) se une con el poli(A) de cada mRNA que se transcribe por
acción de la transcriptasa inversa (que necesita el cebador para ini-
mRNA
Recombinar ciar la síntesis de DNA). Una vez que el híbrido DNA-RNA se
el cebador poli(dT) forma, se producen muescas en el RNA mediante la RNAasa H y se
con la cola poli(A) agrega la DNA polimerasa I para digerir el RNA y sustituir el
del mRNA DNA, justo como ocurre durante la replicación de DNA en una cé-
lula bacteriana (pág. 557). (b) Para preparar cDNA de extremos ro-
mos para la clonación se agregan un pequeño fragmento de poli(G)
Hacer copia
de DNA con Cebador a los extremos 3⬘ del cDNA y un segmento complementario de
transcriptasa inversa poli(C) a los extremos 3⬘ del DNA plásmido. Los dos DNA
se mezclan y se permite que formen recombinantes, que se sellan
y usan para transformar las células bacterianas en las que
DNA se clonan.

Tratar el híbrido con RNAasa H,

que hace una muesca en el RNA
y deja grupos 3'-OH libres
jero suelen contener miles de mensajes diferentes, puede haber
3'-OH 3'-OH especies individuales en cantidades (abundancia) muy distin-
tas. Como resultado una genoteca de cDNA debe contener
DNA alrededor de 1 millón de clones diferentes de cDNA para ase-
gurar la representación de los mRNA raros. Además la trans-
Agregar DNA polimerasa I, criptasa inversa no es una enzima muy eficiente y tiende a
que usa los fragmentos caerse del RNA plantilla antes de terminar el copiado. En
de RNA como cebadores consecuencia a veces resulta difícil obtener una población de
y sustituye el RNA con DNA
cDNA de longitud completa. Como sucede con los experi-
mentos que emplean fragmentos de DNA genómico, los clo-
nes deben identificarse para aislar una secuencia particular de
una población heterogénea de moléculas recombinantes.
cDNA bicatenario El análisis de cDNA clonado tiene varias funciones. Por
(a) lo general es más fácil estudiar una población diversa de

18.16 Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones de mamífero

cDNA que la población correspondiente de mRNA, de ma-
nera que las moléculas de cDNA pueden usarse para aprender
acerca de la diversidad y abundancia de mRNA presentes en la
célula, el porcentaje de mRNA que dos tipos distintos de cé-
lulas comparten o la variedad de mRNA sujetos a empalme
+ alterno generados a partir de una transcripción primaria espe-
cífica. Una sola molécula de cDNA clonada y amplificada
cDNA DNA de plásmido también es muy útil. En tareas más prácticas es posible identi-
Agregar la enzima ficar la secuencia del cDNA con facilidad para tomar un atajo
dGTP desoxinucleotidil transferasa dCTP en la determinación de la secuencia de aminoácidos de un
en presencia
de dGTP o dCTP
polipéptido; los cDNA marcados se usan como sondas para
detectar secuencias complementarias entre clones recombi-
nantes, y como carecen de intrones, los cDNA tienen ventaja
GGGG CCCC sobre los fragmentos genómicos cuando se pretende sintetizar
GGGG CCCC proteínas eucariotas en cultivos de células bacterianas.

Mezclar, permitir 18.16 | Transferencia de DNA

que se forme DNA
recombinante, ligar a células eucariotas
y embriones de mamífero
En las secciones previas se explicó la forma en que los genes
eucariotas pueden aislarse, modificarse y amplificarse. En esta
sección se consideran algunas de las formas en que los genes
pueden introducirse a las células eucariotas, donde casi siem-
pre se transcriben y traducen. Una de las estrategias más usua-
les para alcanzar este objetivo es incorporar el DNA en el ge-
noma de un virus que no está en replicación y permitir que el
Bacteria en la que puede
clonarse el DNA virus infecte una célula. La transferencia de genes mediada
(b) por virus se conoce como transducción. Según el tipo de virus
776 que se utilice, el gen de interés puede expresarse en forma
transitoria durante un periodo de horas o días, o integrarse de
modo estable en el genoma de la célula hospedadora. La inte-
gración estable suele realizarse por medio de retrovirus modi-
ficados, que contienen un genoma de RNA que se transcribe a
la inversa en DNA dentro de la célula. La copia del DNA se
inserta después en el DNA de los cromosomas del hospe-
dador. Los retrovirus se utilizan en muchos de los intentos
recientes de terapéutica génica para transferir un gen a las cé-
lulas de un paciente que carece de ese gen. En general estas
pruebas clínicas no tienen mucho éxito a causa de la baja efi-
ciencia de infección de los vectores virales actuales.
Se cuenta con varios procedimientos para introducir
DNA desnudo en células cultivadas, un proceso llamado
transfección. Lo más frecuente es que las células se traten con
fosfato de calcio o DEAE-dextrano, ya que ambos forman un
complejo con el DNA agregado que promueve su adherencia
con la superficie celular. Se estima que sólo una de cada 105
células capta el DNA y lo incorpora de manera estable a los
cromosomas. Aunque no se sabe por qué este pequeño por-
centaje de células de la población es competente para transfec-
tarse, las que se transfectan casi siempre captan varios frag-
mentos. Una manera de seleccionar las células que captaron el
DNA ajeno es incluir un gen que permita a las células trans-
fectadas crecer en un medio determinado en el que las células
no transfectadas no sobreviven. Como las células transfectadas
suelen captar más de un fragmento, es necesario que el gen
que se emplea para la selección no se localice en el mismo
fragmento de DNA que el gen cuya función se está investi-
gando (denominado transgén).
La electroporación y la lipofección son dos procedimien-
tos más para transfectar células. En la electroporación, las célu-
las se incuban con DNA en ampolletas especiales que contie-
nen electrodos que aplican un pulso eléctrico breve. La
aplicación de corriente ocasiona que la membrana plasmática
se vuelva permeable por cierto tiempo a las moléculas de
DNA, algunas de las cuales llegan hasta el núcleo y se integran
en los cromosomas. En la lipofección, las células se tratan con
DNA que se une con lípidos de carga positiva (liposomas ca-
tiónicos) capaces de fusionarse con la bicapa lipídica de la
membrana celular y llevar el DNA al citoplasma.
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
Una de las formas más directas de introducir genes ajenos
a una célula es la microinyección directa de DNA en el núcleo
celular. Los núcleos de los oocitos y huevos son muy adecua-
dos para esta técnica. Por ejemplo, los oocitos de Xenopus se
usan desde hace mucho para estudiar la expresión de genes
ajenos. El núcleo del oocito contiene toda la maquinaria nece-
saria para la síntesis de RNA; cuando se inyecta DNA ajeno
en el núcleo, se transcribe con facilidad. Además las moléculas
de RNA sintetizadas a partir de las plantillas inyectadas se
procesan en forma normal y se transportan al citoplasma,
donde se traducen en proteínas que pueden detectarse por
medios inmunológicos o en virtud de su actividad específica.
Otro blanco favorito para el DNA inyectado es el núcleo
de un embrión de ratón (fig. 18.46). El objetivo de estos expe-
rimentos no es vigilar la expresión del gen en la célula inyec-
tada, sino vigilar que el DNA se integre en los cromosomas
del huevo a fin de que pase a todas las células del embrión y
subsecuentemente al adulto. Los animales que se modificaron
mediante ingeniería genética para que sus cromosomas con-
tengan genes extraños se llaman animales transgénicos y son
un medio para vigilar cuándo y dónde se expresan los genes
particulares en el embrión (como en la figura 12.34), además
Figura 18.46 Microinyección de DNA en el núcleo de un huevo
de ratón recién fertilizado. El huevo se mantiene en su sitio con
una pipeta de succión que se muestra a la derecha, mientras que la
pipeta de inyección que penetra el huevo se muestra a la izquierda.
(Tomada de Thomas E. Wagner, et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci.
U.S.A. 78:6377, 1981.)
de identificar el impacto de las copias adicionales de genes
particulares en el desarrollo y la vida del animal.
Animales y plantas transgénicos En 1981 Ralph Brins-
ter, de la Pennsilvania University, y Richard Palmiter, de la
Washington University tuvieron éxito en la introducción de un
gen para la hormona de crecimiento de la rata en los huevos
fertilizados de ratón. El DNA inyectado se construyó para que
tuviera la porción codificadora del gen para la hormona de
crecimiento de la rata en una posición justo siguiente a la re-
gión promotora del gen de ratón para la metalotioneína. En
condiciones normales la síntesis de metalotioneína se intensi-
fica mucho después de la administración de metales, como el
cadmio o el cinc, o bien de hormonas glucocorticoides. El gen
de la metalotioneína tiene un promotor potente y se esperaba
que la colocación del gen de la hormona de crecimiento en
dirección 3⬘ de éste, permitiera la expresión del gen después
del tratamiento del ratón transgénico con metales o glucocor-
ticoides. Como se ilustra en la figura 18.47, esta expectativa se
cumplió del todo. En el aspecto práctico los animales transgé-
nicos constituyen un mecanismo para crear modelos animales,
que son animales de laboratorio que expresan una enfermedad
humana particular a la que en condiciones normales no esta-
rían sujetos. Esta estrategia se ilustra con los ratones transgé-
nicos con un gen que codifica una versión mutante de la pro-
teína precursora amiloide humana (APP). Como se explica en
la página 68, estos ratones desarrollan síntomas neurológicos y
de comportamiento que recuerdan los de la enfermedad de
Alzheimer y son un recurso importante en el desarrollo de tra-
tamientos para esta terrible enfermedad. Los animales trans-
génicos también se desarrollan como parte de la biotecnología
agrícola. Por ejemplo, los cerdos que nacen con genes ajenos
para la hormona del crecimiento incorporados en sus cromo-
somas crecen con mucho menos grasa que los animales testigo
que carecen de los genes. La carne de animales transgénicos
tiene menos grasa porque el exceso de hormona de creci-
miento estimula la conversión de nutrimentos en proteína en
lugar de grasa.
 Semillas 777

Plásmido Ti

Caja de cultivo

+ Permitir que las

DNA ajeno semillas germinen

Brote

Punta de brote

Plásmido Ti
recombinante Cortar punta de brote
con meristemo
Figura 18.47 Ratones transgénicos. Esta fotografía muestra un
par de hermanos de la misma camada a las 10 semanas de edad. El
ratón más grande se desarrolló de un huevo inyectado con DNA que
contenía el gen de la hormona de crecimiento de la rata, que se co-
locó en dirección 3⬘ del promotor de metalotioneína. El ratón más
Introducir en bacteria
grande pesa 44 g; el más pequeño, el testigo no inyectado, pesa 29 g. Punta del brote
Agrobacterium tumefaciens
El gen GH de rata se transmitió a los descendientes que también
crecieron más que los testigos. (Cortesía de Ralph L. Brinster, Transformar
de un trabajo publicado en R. D. Palmiter, et al., Nature, las puntas
300:611, 1982. Reimpresa con autorización de Macmillan de los brotes
Publishers Ltd.) +

18.16 Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones de mamífero

Brotes transformados

Las plantas también son una opción ideal para la ingenie-

ría genética. En la página 229 se indicó que pueden cultivarse
plantas completas a partir de células vegetales individuales en
Transferir las puntas de los brotes
cultivo. Esto brinda la oportunidad de modificar su composi-
a un medio para enraizar
ción genética mediante la introducción de DNA en los cro-
mosomas de células cultivadas que después pueden crecer
hasta plantas maduras. Una forma de introducir genes ajenos
consiste en incorporarlos en el plásmido Ti de la bacteria Agro-
bacterium tumefaciens. Fuera del laboratorio, esta bacteria vive
en relación con plantas dicotiledóneas, donde induce la for-
mación de masas tumorales llamadas agallas. Durante una
infección, una sección del plásmido Ti llamada región T-DNA Transferir a la tierra
pasa de la bacteria a la célula vegetal. Esta parte del plásmido
se incorpora en los cromosomas de la célula vegetal e induce a
la célula a proliferar y proveer nutrimentos a la bacteria.
El plásmido Ti puede aislarse de bacterias y unirse con
genes ajenos para producir un plásmido recombinante que las
células vegetales dicotiledóneas no diferenciadas en cultivo
captan, inclusive las células de zanahorias y tabaco. La figura
18.48 muestra el uso de los plásmidos Ti recombinantes para
introducir DNA extraño en las células del meristemo en la
punta de los brotes nuevos. Luego los brotes pueden enrai- Figura 18.48 Formación de plantas transgénicas con el plásmido
zarse y crecer hasta formar plantas maduras. Dicha técnica, Ti. El transgén se incluye en el DNA del plásmido Ti, que se rein-
llamada transformación T-DNA, se utiliza para transformar troduce en la bacteria hospedadora. Las bacterias que contienen el
células vegetales con genes derivados de bacterias que codifi- plásmido recombinante se usan luego para transformar células vege-
can toxinas para matar insectos, lo que protege las plantas de tales, en este caso las células del meristemo en el extremo superior
de una punta disectada de la raíz. Los brotes transformados se trans-
los insectos depredadores.
fieren a un medio de selección, donde desarrollan raíces. Las plantas
Se dispone de otros procedimientos para introducir genes enraizadas pueden transferirse a tierra.
ajenos en las células de las plantas monocotiledóneas. En una
778 de las estrategias más exóticas, las células vegetales pueden
servir como blancos para pelotillas microscópicas de tungs-
teno cubiertas con DNA que se disparan con una “pistola de
genes”. Esta técnica se emplea para modificar el material ge-
nético de varios tipos distintos de células vegetales.
Las dos actividades más importantes que los genetistas
botánicos podrían mejorar con la ingeniería genética son la
fotosíntesis y la fijación de nitrógeno, ambas funciones
bioenergéticas vitales. Cualquier mejoría significativa en la
eficiencia fotosintética implicaría grandes aumentos en la pro-
ducción de cosechas. Se espera que sea posible diseñar una
versión modificada de la enzima fijadora de CO2 menos sus-
ceptible a la fotorrespiración (pág. 229). La fijación de nitró-
geno es una actividad que realizan ciertos géneros de bacterias
(p. ej., Rhizobium) que viven en relación simbiótica con ciertas
plantas (p. ej., soya, cacahuate, trébol, alfalfa y chícharos). Las
bacterias se encuentran en protuberancias o nódulos legumino-
sos, localizados en las raíces, donde retiran N2 de la atmósfera,
lo reducen hasta amoniaco y entregan el producto a las células
de la planta. Los genetistas buscan una forma de aislar los
genes bacterianos que participan en esta actividad e introdu-
cirlos en los cromosomas de las plantas no leguminosas que en
la actualidad dependen mucho del fertilizante agregado para
obtener sus compuestos de nitrógeno reducido. Una alterna-
tiva sería alterar el genoma de la planta o la bacteria para que
puedan desarrollarse nuevos tipos de relaciones simbióticas.
18.17 | Determinación de la
función de los genes eucariotas
por eliminación o desactivación
(silenciamiento) génica
Hasta hace muy poco los investigadores descubrieron nuevos
genes y aprendieron acerca de su función mediante la detec-
ción de mutantes que presentaban fenotipos anormales (véase
pág. 277 respecto al estudio de la secreción de proteínas). La
existencia de los genes se evidenció sólo a través del proceso de
mutación. Este proceso de aprendizaje de los genotipos me-
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
diante el estudio del fenotipo mutante se conoce como gené-
tica de avanzada. A partir del desarrollo de técnicas para la
clonación de genes y la identificación de la secuencia del DNA
los investigadores han podido identificar y estudiar los genes
en forma directa sin conocer nada acerca de la función de su
proteína codificada. Esta condición se ha vuelto muy usual en
los últimos años con la identificación de la secuencia de geno-
mas enteros y la identificación de miles de genes cuya función
aún se desconoce. En los dos últimos decenios los investigado-
res desarrollaron la genética inversa, que es un proceso para
determinar el fenotipo (o sea la función) con base en el cono-
cimiento del genotipo. El enfoque básico de la genética in-
versa es eliminar la función de un gen específico y luego deter-
minar el efecto de la eliminación en el fenotipo. Primero se
considera cómo introducen los investigadores mutaciones es-
pecíficas en genes in vitro, y luego se exponen dos técnicas
ampliamente usadas para eliminar la función génica in vivo.
Mutagénesis in vitro
Como resulta evidente en todo este libro, el aislamiento de
mutantes naturales tiene una participación de gran importan-
cia en el descubrimiento de la función de los genes y sus pro-
ductos. Sin embargo, las mutaciones naturales son fenómenos
raros y no es factible usar estas mutaciones para estudiar
la participación de residuos de aminoácidos particulares en la
función de una proteína determinada. En lugar de esperar a
que aparezca un organismo con un fenotipo inusual para iden-
tificar la mutación causante, los investigadores pueden mutar
el gen (o sus regiones reguladoras relacionadas) en la forma
deseada y observar el cambio fenotípico resultante. Tales téc-
nicas, denominadas colectivamente mutagénesis in vitro, re-
quieren que el gen (o al menos el segmento génico) por mutar
se haya clonado.
Un procedimiento desarrollado por Michael Smith, de la
University of British Columbia, se denomina mutagénesis di-
rigida (SDM, site-directed mutagenesis) y permite a los inves-
tigadores hacer cambios específicos muy pequeños en una se-
cuencia de DNA, como la sustitución de una base por otra, o
la deleción o inserción de una cantidad muy pequeña de bases.
Por lo general la SDM inicia con la síntesis de un oligonucleó-
tido de DNA que contiene el cambio deseado, se permite que
este oligonucleótido se hibride con un preparado monocate-
nario de DNA normal, y luego el oligonucleótido se utiliza
como cebador para la DNA polimerasa. La polimerasa alarga
el cebador mediante la adición de nucleótidos complementa-
rios del DNA normal. El DNA modificado puede clonarse
entonces y determinar el efecto de la alteración genética intro-
duciendo el DNA en una célula hospedadora adecuada. Los
científicos suelen usar SDM para responder a interrogantes
muy puntuales acerca de la función de un gen o una proteína.
Por ejemplo, podrían cambiar un aminoácido por otro para
obtener indicios acerca del cometido de ese sitio específico en
el funcionamiento global de una proteína. De manera alterna-
tiva, podrían introducir cambios en la región reguladora de un
gen y determinar el efecto en la expresión génica. Si el objetivo
de la mutagénesis dirigida a un sitio es simplemente suprimir
el funcionamiento de un gen, pueden usarse métodos menos
específicos. Por ejemplo, si se corta una secuencia génica en un
sitio de restricción, se usa DNA polimerasa para convertir las
regiones monocatenarias de los extremos adherentes en DNA
bicatenario y se vuelven a ligar esos extremos, es posible des-
truir el marco de lectura de una proteína. En otros casos po-
dría eliminarse del gen un fragmento de restricción completo.
Crear una mutación in vitro es sólo un aspecto de la ge-
nética inversa. Para estudiar el efecto de una mutación artifi-
cial en un fenotipo, es necesario sustituir el gen normal por el
alelo mutado en el organismo en cuestión. El desarrollo de
una técnica para introducir mutaciones en el genoma murino
abrió la puerta para los estudios de genética inversa en mamí-
feros, y literalmente revolucionó el estudio del funcionamiento
génico de este grupo taxonómico.
Ratones con inactivación génica
En muchas partes de este libro ya se describieron los fenotipos
de ratones que carecen de una copia funcional de un gen par-
ticular. Por ejemplo, se indicó que los ratones que carecen de
una copia funcional del gen p53 siempre desarrollan tumores
malignos (pág. 677). Estos animales, llamados ratones con
inactivación (bloqueo) génica, pueden aportar información
única de la base genética de la enfermedad humana, así como
un mecanismo para estudiar las diversas actividades celulares
en las que el producto de un gen particular pudiera participar.
 Masa celular Células del trofoectodermo Monocapa de células En el decenio de 1980, Mario Capecchi, de la Utah Uni- 779
interna en reposo versity, Oliver Smithies, de la Wisconsin University, y Martin
(contiene
células ES) Evans, de la Cambridge University, desarrollaron los diversos
procedimientos empleados para generar ratones con inactiva-
ción génica. El primer paso es aislar un tipo inusual de célula
Se disocian células que tenga virtualmente poderes ilimitados para diferenciarse.
del blastocisto
y se cultivan células ES Estas células, denominadas células madre ambrionarias (pág.
Blastocisto 21), se encuentran en el blastocisto de los mamíferos, que es
Células ES
una etapa temprana del desarrollo embrionario comparable a
la etapa de blástula de otros animales. El blastocisto de un
mamífero (fig. 18.49) se compone de dos partes distintas. La
Transfección de células capa externa constituye el trofectodermo, que da origen a la
con DNA que contiene mayor parte de las membranas extraembrionarias característi-
el gen mutante X
cas de un embrión de mamífero. La superficie interna del tro-

Células ES transfectadas
(heterocigotas para
el gen mutante X)
Cultivo de células
en medio selectivo
Inyección de células ES
transfectadas con X⫹/⫺
en el blastocisto hospedador
Ratón quimérico con pelaje pigmentado
de negro (a/a) y pardo (A/a) Blastocisto quimérico que contiene
una masa celular interna
con ambos tipos de células
Para determinar si las células
germinativas provienen de
células ES inyectadas, se
aparea el ratón quimérico
con un miembro de la cepa negra
18.17 Determinación de la función de los genes eucariotas por eliminación o desactivación (silenciamiento) génica
fectodermo está en contacto con un cúmulo de células llamado
masa celular interna que se proyecta hacia la cavidad espaciosa
Células ES (blastocele). La masa celular interna da origen a las células que
El hospedador es
forman el embrión. La masa celular interna contiene las célu-
homocigoto recesivo las madre ambrionarias, que se diferencian en todos los tejidos
para el color de pelaje diversos de que se compone el mamífero.
negro (a/a)
Las células primordiales primarias pueden aislarse de
blastocistos y cultivarse in vitro bajo condiciones en las que las
células crecen y proliferan; se transfectan después con un frag-
mento de DNA que contenga un alelo mutante no funcional
del gen que va a eliminarse, así como genes de resistencia a
antibiótico que pueden usarse para seleccionar las células que
incorporaron el DNA alterado en su genoma. De las células
que captan el DNA, alrededor de una por cada 104 experi-
mentan un proceso de recombinación homóloga en la que el
DNA sustituye a la secuencia DNA homóloga.5 Mediante
este procedimiento se producen y seleccionan las células ma-
dre ambrionarias que son heterocigóticas para el gen en cues-
tión con base en su resistencia antibiótica. En el siguiente paso
varias de estas células donadoras se inyectan en el blastocele de
un embrión de ratón receptor. En el protocolo descrito en la
figura 18.49, el embrión receptor se obtiene de una cepa negra.
El embrión inyectado se implanta en el oviducto de una hem-
bra que se preparó con hormonas para llevar el embrión a
término. Mientras el embrión se desarrolla en su madre susti-
tuta, las células madre ambrionarias inyectadas se unen con
la masa celular interna propia del embrión y contribuyen a la
formación de tejidos embrionarios, inclusive las células germi-

Ratón no quimérico con pelaje pardo (A/a), heterocigoto
para el gen X (X⫹/⫺). Se producen ratones con inactivación génica
apareando dos de estos heterocigotos, y seleccionando homocigotos X–/–.
Figura 18.49 Formación de ratones con inactivación génica. Los
pasos se describen en el texto.
Los ratones con inactivación génica son resultado de una serie
de procedimientos experimentales que se muestran en la fi-
gura 18.49.
5
En fecha reciente se ha utilizado otra técnica para la eliminación génica,
para así obtener ratas con genes inactivados. En este caso, se actuó en un gen
específico del genoma de la rata por medio de la inyección, en el cigoto del
animal (embrión de una etapa) de mRNA que codificaba un tipo de enzima
llamada nucleasa de dedos de cinc (ZFN; zinc-finger nuclease). Las ZFN son
enzimas restrictivas artificiales producidas en el laboratorio por la fusión de
un gen que codifica un dominio de unión de DNA de dedo de cinc (pág.
520) con un dominio de corte de DNA. ZFN secciona las dos cadenas de
DNA en una secuencia específica de nucleótidos que se conoce por medio de
una secuencia de aminoácidos de la enzima, con bioingeniería genética. Las
proteínas pueden ser “adaptadas” de modo que ataquen un conjunto grande
de secuencias específicas, y de este modo se pueden utilizar para la inactiva-
ción de prácticamente cualquier gen del genoma. La misma secuencia de
DNA “blanco” aparece en los alelos materno y paterno, razón por la cual la
inyección de un preparado con una de estas enzimas al interior de la célula,
“borra” ambas copias del gen “blanco” y así genera inactivación homocigota
sin tener que recurrir a un intermediario heterocigoto como ocurre con el uso
de la recombinación homóloga que se muestra en la figura 18.49. En fecha
reciente, una clase de proteínas artificiales llamadas nucleasas efectoras de
TAL (o TALEN, TAL effector nucleases) se obtuvieron como endonucleasas
que pueden ser biomodificadas genéticamente para actuar en cualquier se-
cuencia de DNA específica. Es muy pronto para saber si las nucleasas men-
cionadas tendrán o no uso amplio en la formación de inactivaciones, pero ya
se han convertido en importantes instrumentos de “edición” génica.
780 nales de las gónadas. Estos ratones quiméricos pueden reco-
nocerse porque su pelaje tiene características de las cepas do-
nadora y receptora. Los ratones quiméricos se aparean con un
miembro de una cepa endogámica negra para saber si las célu-
las germinales contienen la mutación de eliminación génica.
La descendencia será heterocigótica para el gen en todas sus
células si las células germinales contienen la mutación por eli-
minación. Los heterocigóticos pueden reconocerse por la co-
loración parda de su pelaje. Después estos heterocigóticos se
aparean entre sí para producir descendientes homocigóticos
para el alelo mutante. Estos son los ratones con inactivación
génica que carecen de una copia funcional del gen. Cualquier
gen del genoma, o cualquier secuencia de DNA para el caso,
puede modificarse de cualquier manera que se desee usando
este método experimental.
En algunos casos la deleción de un gen particular puede
conducir a la ausencia de un proceso particular, lo que propor-
ciona evidencia convincente de que el gen es esencial para ese
proceso. Sin embargo, a menudo la deleción de un gen que se
cree participa en un proceso esencial causa poca o ninguna
alteración en el fenotipo del animal. Tales resultados pueden
ser difíciles de interpretar. Por ejemplo, es posible que el gen
no participe en el proceso que se estudia o, como casi siempre
sucede, que la ausencia del producto del gen se compense con
el producto de un gen distinto. La compensación de un gen
por otro puede verificarse con la producción de ratones que
carecen de los dos genes en cuestión (es decir, doble inactiva-
ción génica).
En otros casos, la ausencia del gen conduce a la muerte
del ratón en etapas tempranas del desarrollo, lo que también
hace difícil identificar la participación del gen en la función
celular. Los investigadores a menudo pueden salvar este pro-
blema mediante una técnica que permite la anulación de un
gen particular en sólo uno o varios tejidos deseados, mientras
que el gen se expresa en el resto del animal. Estas inactivacio-
nes condicionales, como se les llama, permiten a los investigado-
res estudiar la participación del gen en el desarrollo o función
del tejido afectado. Un objetivo actual del International Knoc-
kout Mouse Consortium es generar inactivaciones condicionales
de todos los genes del genoma murino.
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular
RNA de interferencia
Los ratones con inactivación génica representan una estrategia
invaluable para aprender sobre la función génica, pero la gene-
ración de estos animales es laboriosa y costosa. En los años
recientes, una nueva técnica del campo de la genética inversa
alcanzó un uso difundido. Como se explica en la página 457,
el RNA interferente (RNAi) es un proceso en el que se de-
grada un mRNA específico por la presencia de un pequeño
siRNA bicatenario cuya secuencia está contenida dentro de la
secuencia del mRNA. Es posible estudiar las funciones de
genes en una planta, nematodo o mosca de la fruta mediante
la simple introducción de un siRNA en uno de estos organis-
mos por varios medios para examinar el fenotipo del orga-
nismo que resulta de la deficiencia del mRNA correspon-
diente. La identificación de las funciones de los genes al nivel
celular, en lugar de al nivel del organismo, puede hacerse me-
diante el estudio de los efectos de estos mismos siRNA en las
actividades de las células cultivadas. Con estas estrategias, los
investigadores pueden reunir información sobre las funciones
de grandes cantidades de genes en un periodo relativamente
corto. Como se explica en la página 457, el RNAi es útil para
estudiar la función génica en células de mamíferos mediante la
incubación de las células con pequeños dsRNA encapsulados
en lípidos o mediante la modificación genética de las células
para que produzcan los siRNA ellas mismas. Una vez dentro
de la célula, el siRNA guía la degradación del mRNA blanco
y deja a la célula incapaz de producir proteína adicional codi-
ficada por ese gen. Cualquier deficiencia del fenotipo de la
célula puede atribuirse a una disminución marcada en la can-
tidad de proteína que se investiga. Como ocurre con las elimi-
naciones génicas, la ausencia de un fenotipo después del trata-
miento con un siRNA no siempre significa que el gen en
cuestión no participa en un proceso particular, ya que otro gen
podría compensar la ausencia de la expresión del gen blanco.
También existen bibliotecas que contienen miles de siRNA,
o vectores con DNA que codifica estos RNA, para el estudio
de la función génica en diversos organismos modelos y en se-
res humanos. Los investigadores que usan estas bibliotecas
pueden estudiar los efectos de la eliminación de la expresión
de un gen en cualquier proceso celular. Por ejemplo, debe ser
posible identificar a los genes que participan en el ensamble
del huso mitótico mediante el tratamiento de las células con
un conjunto de siRNA de todo el genoma para luego revisar a
todas las células tratadas al momento de la división celular y
detectar la presencia de un huso mitótico anormal. La figura
18.50 muestra una galería de imágenes de células cultivadas de
Drosophila en la metafase de la mitosis. Cada una de las células
mostradas en esta galería fue tratada con un siRNA dirigido
contra un gen diferente en el genoma de Drosophila. En este
estudio se valoraron más de 14 000 siRNA distintos, de los
cuales cerca de 200 hicieron que las células tratadas tuvieran
un huso anormal en metafase. Más de la mitad de los siRNA
que afectaron el ensamble del huso mitótico se dirigían contra
genes cuya participación en la formación de esta estructura se
desconocía hasta el momento, lo que aportó nueva informa-
ción sobre las funciones de estos genes. Las imágenes de la
figura 18.51 muestran los efectos de un solo siRNA que se
dirige contra un gen con participación conocida en el ensam-
ble del huso mitótico y otras actividades durante la mitosis. En
este caso, las células de mamífero cultivadas que se observan a
la derecha fueron transfectadas con un siRNA dirigido contra
los mRNA que codifican la cinasa Aurora B (pág. 596). La
eliminación consecuente de esta enzima alteró mucho la se-
gregación cromosómica.
18.18 | Uso de anticuerpos
Como se explica en el capítulo 17, los anticuerpos (o inmuno-
globulinas) son proteínas que se producen en los tejidos linfoi-
des como respuesta a la presencia de materiales extraños, o
antígenos. Una de las propiedades más atractivas de los anti-
cuerpos y que los hace tan útiles para los investigadores en
biología es su especificidad notable. Una célula puede conte-
ner miles de proteínas diferentes y aun así una preparación de
anticuerpos se une sólo con las moléculas seleccionadas dentro
de la célula que tienen una pequeña parte que se adapta a los
sitios para unión de antígeno de las moléculas de anticuerpo.
A menudo pueden obtenerse anticuerpos que distinguen entre
dos polipéptidos que difieren sólo en un aminoácido o en una
sola modificación posterior a la traducción (como en la página
527).

Figura 18.50 Determinación de la función génica por RNA in-
terferente. La figura muestra una galería de imágenes por inmuno-
fluorescencia de células cultivadas de Drosophila que se incubaron
con varios siRNA de cadena doble. Las células mostradas se acumu-
laron en metafase por un tratamiento separado que bloqueó el
avance hacia la anafase. Durante el estudio se examinaron más de 4
millones de células. Fue posible someter a detección a una gran can-
tidad de células mediante la selección computarizada de las imá-
genes de células que estuvieran en metafase para luego elegir y
ensamblar las imágenes en paneles como el que se muestra en esta
fotografía. Así, podía buscarse la presencia de husos mitóticos anor-
males, ya fuera por observadores humanos o por análisis compu-
tarizado con programas diseñados para detectar características
específicas de un huso anormal. (Un estudio de mayor tamaño del
mismo tipo se publicó en Nature 464:721, 2010.) (Por Cortesía
de Gohta Goshima y Ronald D. Vale.)
Desde hace mucho tiempo los biólogos aprovechan los
anticuerpos y desarrollan una gran variedad de técnicas que
los utilizan. En general se cuenta con dos estrategias distintas
para la preparación de moléculas de anticuerpo que interac-
túan con un antígeno determinado. En la estrategia tradicio-
nal, un animal (por lo general un conejo o una cabra) se in-
yecta varias veces con el antígeno y tras un periodo de varias
semanas se extrae sangre que contiene los anticuerpos desea-
dos. La sangre entera se trata para eliminar las células y los
factores de coagulación a fin de producir un antisuero, que
puede someterse a prueba para cuantificar su título de anti-
cuerpos y del que pueden purificarse las inmunoglobulinas.
781
Tubulina DNA
Figura 18.51 Determinación de la función génica por interfe-
rencia del RNA. (Izquierda) Una célula de mamífero cultivada no
tratada en la metafase de la mitosis. (Derecha) El mismo tipo de cé-
lula se trató con un dsRNA de 21 nucleótidos diseñado para inducir
la destrucción de los mRNA que codifican la cinasa Aurora B, una
proteína participante en el punto de comprobación del huso en me-
tafase. Los cromosomas de esta célula se encuentran adyacentes al
huso mitótico, lo que sugiere la ausencia de interacciones entre el ci-
netocoro y el microtúbulo. (Tomada de Claire Ditchfield et
al., J. Cell Biol. 161:276, 2003, fig. 8d. Reimpresa con autori-
zación de the Rockefeller University Press.)
Aunque este método para producir anticuerpos aún está en
uso, tiene ciertas desventajas inherentes. A causa del meca-
nismo de síntesis de anticuerpos, un animal siempre produce
diversas especies de distintas inmunoglobulinas, es decir, in-
munoglobulinas con diferentes regiones V en sus cadenas po-
lipeptídicas, aun cuando se enfrentan con una preparación
purificada del antígeno. Se dice que un antisuero que contiene
varias inmunoglobulinas que se unen con el mismo antígeno
es policlonal. Como las inmunoglobulinas tienen estructuras
demasiado similares para fraccionarse, resulta imposible obte-
ner una preparación de una sola especie purificada de anti-
cuerpo con esta técnica.
En 1975 Cesar Milstein y Georges Köhler, del Medical
Research Council, en Cambridge, Inglaterra, realizaron un con-
junto trascendental de experimentos que condujo a la prepara-
ción de anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos.
Para comprender su trabajo es necesario divagar un poco.
Dado un clon determinado de células productoras de anti-
cuerpos (que provienen de un solo linfocito B), se sintetizan
anticuerpos con sitios idénticos para combinación con antíge-
nos. La heterogeneidad de los anticuerpos producidos cuando
se inyecta un solo antígeno purificado a un animal se debe al
hecho de que se activan muchos linfocitos B distintos, cada
uno con anticuerpos unidos con la membrana con afinidad
por una parte diferente del antígeno. Surgió una pregunta im-
portante: ¿era posible resolver este problema y obtener una
18.18 Uso de anticuerpos
sola especie de molécula de anticuerpo? Considérense por
un momento los resultados de un procedimiento en el que un
animal recibe una inyección de un antígeno purificado, se es-
pera un periodo de varias semanas para que los anticuerpos
se produzcan, se extraen el bazo u otros órganos linfoides, se
prepara una suspensión de células únicas, se aíslan las células
que producen el anticuerpo deseado y esas células particulares
se cultivan como colonias separadas para obtener grandes can-
tidades de esta inmunoglobulina particular. Si se siguiera este
procedimiento, se obtendría una preparación de moléculas de
anticuerpo producidas por una sola colonia (o clon) de células,
782 que se conoce como anticuerpo monoclonal. Sin embargo,
como las células productoras del anticuerpo no crecen ni se
dividen en cultivo, fue necesario introducir alguna manipula-
ción adicional para obtener anticuerpos monoclonales.
Las células de mieloma maligno son un tipo de célula
cancerosa que crece con rapidez en cultivo y produce grandes 1 Ratón inmunizado
con el antígeno Células de mieloma en cultivo.
cantidades de anticuerpos. No obstante, las células de mie- Las células son mutantes
loma son poco útiles como herramientas analíticas porque no HGPRT e incapaces de
Se extrae el bazo crecer en medio HAT
se forman como respuesta a un antígeno particular. En lugar
de eso se desarrollan a partir de una conversión aleatoria de un
linfocito normal al estado maligno y, por lo tanto, producen el
anticuerpo que el linfocito particular sintetizaba antes de vol- 2

verse maligno.
Milstein y Köhler combinaron las propiedades de estos Suspensión
dos tipos de células: el linfocito normal productor de anticuer- de células
esplénicas
pos y la célula de mieloma inmortal. Lograron esta hazaña
mediante la fusión de los dos tipos de células para producir
3
células híbridas, denominadas hibridomas, que crecen y pro-
liferan de manera indefinida, y también producen grandes
Fusión de células
cantidades de un solo anticuerpo (monoclonal). El anticuerpo en polietilenglicol
producido es el que el linfocito normal sintetizaba antes de
fusionarse con la célula de mieloma. Agregar células al medio
El procedimiento para la producción de anticuerpos mo- de selección HAT
noclonales se ilustra en la figura 18.52. El antígeno (ya sea en
forma soluble o como parte de una célula) se inyecta en el ra-
tón para inducir la proliferación de células específicas forma- 4

doras de anticuerpo (paso 1, figura 18.52). Tras un periodo de

varias semanas, el bazo se extrae y se separa en células indivi- Las células híbridas (hibridomas)
duales (paso 2), y los linfocitos productores de anticuerpo se crecen, en tanto que las células
no fusionadas mueren
fusionan luego con una población de células de mieloma ma-
ligno (paso 3), lo que hace las células híbridas inmortales, ca- 5
paces de una división celular ilimitada. Para seleccionar las
células híbridas (hibridomas) entre las células no fusionadas se Probar sobrenadante en el que crecen
coloca la mezcla celular en un medio en el que sólo puedan las células en busca del anticuerpo
sobrevivir los híbridos (paso 4). Después los hibridomas cre- deseado. Luego cultivar células que
producen este anticuerpo
cen como clones en pozos separados (paso 5) y se revisan en
forma individual para detectar la producción de anticuerpo
contra el antígeno en estudio. Las células híbridas que contie-
nen el anticuerpo apropiado (paso 6) pueden clonarse in vitro 6
o in vivo (como células tumorales en un animal receptor), de
modo que sea posible preparar cantidades ilimitadas del anti-
Capítulo 18 Técnicas en biología celular y molecular

cuerpo monoclonal. Una vez que los hibridomas se producen,
pueden almacenarse por tiempo indefinido congelados y man-
tenerse alícuotas disponibles para los investigadores en todo el
mundo. Una de las características más importantes de esta
metodología es que no se comienza con un antígeno purifi-
cado para obtener un anticuerpo. De hecho, el antígeno para el
que se busca el anticuerpo monoclonal puede ser un compo-
nente menor de toda la mezcla. Cuando se tiene la prepara-
ción de moléculas de anticuerpo, obtenidas ya sea por técnicas
inmunológicas convencionales o mediante la formación de
hibridomas, pueden usarse como sondas muy específicas en
varias técnicas analíticas. Por ejemplo, los anticuerpos son úti-
les en la purificación de proteínas. Cuando se agrega un anti-
cuerpo purificado a una mezcla cruda de proteínas, la proteína
específica que se busca, se combina de manera selectiva con el
anticuerpo y se precipita de la solución. Los anticuerpos tam-
bién pueden emplearse en conjunto con varios tipos de proce-
dimientos de fraccionamiento para identificar una proteína
particular (antígeno) entre una mezcla de proteínas. Por ejem-
plo, en una prueba con el método Western blot primero se frac-
ciona una mezcla de proteínas por electroforesis bidimensio-
nal (como en la fig. 18.29). Luego las proteínas fraccionadas se
Cultivar clonas de células que producen
anticuerpo contra el antígeno inyectado
Figura 18.52 Formación de anticuerpos monoclonales. Los pa-
sos se describen en el texto. El medio HAT se llama así porque con-
tiene hipoxantina, aminopterina y timidina. Este medio permite el
crecimiento de las células con una fosforribosilo transferasa de hi-
poxantina-guanina (HGPRT), pero no apoya el crecimiento de cé-
lulas que carecen de esta enzima, como las células de mieloma
múltiple sin fusionar que se usaron en este procedimiento.
transfieren a una hoja de filtro de nitrocelulosa, que se incuba
con una preparación de anticuerpos marcados con radiactivi-
dad o fluorescencia. La localización en el filtro de la proteína
específica unida con el anticuerpo se establece mediante la
localización de la radiactividad o la fluorescencia.
Además de su empleo en investigación, los anticuerpos
monoclonales son de gran utilidad en la medicina diagnóstica
en estudios para conocer la concentración de proteínas especí-
ficas en la sangre y la orina. En un ejemplo, los anticuerpos
mencionados constituyen la base de algunas pruebas de emba-
razo para practicar en el hogar, que identifican la presencia de
una proteína (gonadotropina coriónica) que aparece en la
orina unos cuantos días después de la concepción. Los anti-
cuerpos monoclonales también son muy útiles como agentes
terapéuticos en seres humanos (pág. 688). Los esfuerzos por
desarrollar hibridomas humanos que produzcan anticuerpos
monoclonales no han tenido éxito hasta ahora. Para sortear
este problema los ratones se pueden modificar mediante inge-
niería genética para que los anticuerpos que producen sean
más parecidos a los humanos en cuanto a la secuencia de ami-
noácidos. Ya se aprobaron varios de estos anticuerpos mono-
clonales humanizados para el tratamiento de diversas enfer-
medades. En fechas recientes se han modificado a los ratones
con ingeniería genética para que su sistema inmunitario sea de
naturaleza “humana”. Estos animales producen anticuerpos
con estructura humana por completo.
El primer anticuerpo totalmente humano (adalimimab),
aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide (pág.
726), fue producido por una técnica muy distinta; se utilizan
bacteriófagos en vez de hibridomas como base para la produc-
ción de anticuerpos monoclonales. Esta técnica se conoce
como exhibición bacteriófaga (en fago); aquí, se generan miles
de millones de partículas fágicas distintas, cada una porta un
gen que codifica una molécula de anticuerpo humano que
posee una región variable única (pág. 712). Diferentes fagos de
esta vasta biblioteca codifican diferentes anticuerpos, esto es,
anticuerpos con diferentes regiones variables. En cada caso, el
gen para anticuerpo se fusiona con un gen que codifica una de
las proteínas de la cubierta viral, de modo que cuando el fago
se ensambla dentro de una célula hospedadora, la molécula de
anticuerpo se exhibe en la superficie de la partícula viral. Su-
póngase que se tiene una proteína (antígeno) que se piensa
podría ser un buen blanco para un anticuerpo terapéutico
dado. El antígeno se purifica y se permite que interactúe con
una muestra de cada una de las partículas fágicas que consti-
tuyen la biblioteca fágica. Aquellos fagos que se unen al antí-
geno con alta afinidad pueden identificarse, y se les permite
que se multipliquen dentro de una célula hospedadora apro-
piada. Una vez que se ha amplificado de este modo, el DNA
que codifica el gen de anticuerpo puede aislarse y usarse para
transfectar una célula de mamífero apropiada. Las células mo-
dificadas por ingeniería genética entonces se multiplican en
grandes cultivos para producir cantidades terapéuticas del an- 783
ticuerpo. La producción de anticuerpos en células de mamí-
fero cultivadas es una empresa costosa, y se está intentando
con la alternativa de las “fábricas vivas”. Entre las posibilidades
para esta finalidad se encuentran cabras, conejos y células de la
planta del tabaco.
Una revisión rápida de esta obra revela muchas microgra-
fías que muestran la localización inmunitaria de una proteína
particular dentro de una célula tal como se observa en el mi-
croscopio óptico o el electrónico. La localización inmunitaria
de proteínas dentro de una célula depende del uso de anticuer-
pos que se prepararon de manera específica contra esa pro-
teína particular. Una vez preparadas, las moléculas de anti-
cuerpo se unen (conjugan) con una sustancia que las hace
visibles al microscopio, pero no interfiere con la especificidad
de sus interacciones. Para usar el microscopio óptico, los anti-
cuerpos casi siempre se unen en complejos con pequeñas mo-
léculas fluorescentes, como la fluoresceína o rodamina, para
generar derivados que se incuban luego con células o secciones
de células. Los sitios de unión se visualizan con el microscopio
de fluorescencia. Esta técnica se denomina inmunofluores-
cencia directa. A menudo es preferible realizar la localización
de antígenos con una variación de esta técnica llamada inmu-
nofluorescencia indirecta. En ésta, las células se incuban con
un anticuerpo no marcado y se permite que formen complejos
con el antígeno correspondiente. La localización de la pareja
antígeno-anticuerpo se revela en un segundo paso con una
preparación de anticuerpos con marca fluorescente cuyos si-
tios de combinación están dirigidos contra las moléculas de
anticuerpos empleadas en el primer paso. La inmunofluores-
cencia indirecta produce una imagen más brillante porque
muchas moléculas del anticuerpo secundario pueden unirse
con un solo anticuerpo primario. La inmunofluorescencia in-
directa también tiene una ventaja práctica: el anticuerpo con-
jugado (fluorescente) es fácil de obtener en el mercado. La
inmunofluorescencia proporciona una claridad notable debido
a que las proteínas unidas con el anticuerpo se revelan a la
vista; todos los materiales no marcados permanecen invisibles.
La localización de los antígenos con el uso del microscopio
electrónico se logra con anticuerpos que se marcaron con ma-
teriales electrodensos, como la proteína con hierro ferritina o
partículas de oro. La figura 8.23c,d muestra un ejemplo de esta
técnica.
18.18 Uso de anticuerpos