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Tema 1 - Microbiologia Clínica
(evolución histórica, conceptos generales, organización de laboratorio)
Microbiología - la ciencia que estudia los seres vivos no visibles al ojo desnudo (microorganismos;
aunque se incluyen metazoos parásitos no microscópicos), que atribuyen el origen de la vida sobre la
tierra y el mantenimiento del equilibrio en la biosfera (en vida libre como saprofitos o depredadores con
distinto grado de simbiosis => comensalismo, mutualismo o parasitismo), aunque también tienen efectos
negativos como producir enfermedades; Los virus y viroides => parásitos endo-celulares obligados (no
se replica en vida libre); Microbiología medica => estudia a los microorganismos que afectan al hombre
(reino procariota/ bacterias, los eucariotas del reino Fungí, los virus y viroides); Parasitología => estudia
los eucariotas microscópicas (protozoos) y macroscópicas (metazoos) de endo o ectoparásito
(los artrópodos estudiados también como vectores y reservorios de enfermedades transmisibles);
Microbiología medica:
- Microbiología general => se estudia conocimientos históricos, clasificación, estructura y fisiología de
los microorganismos.
- Microbiología especial => se estudia 4 grupos de agentes infecciosos
(bacteriología, virología, micología y parasitología) + recientemente los viroides (moleculas circulares de
ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta proteica) y los priones (proteínas codificadas por
genes celulares y actúan como señales reguladoras, responsables de algunas
enfermedades neurológicas graves - Creutzfeldt-Jacob y el Kuru)
Evolución histórica de la microbiología - como ciencia especializada no aparece hasta finales del siglo
XIX; cuatro periodos:
-1º => periodo especulativo (desde la antigüedad hasta los primeros microscopistas)
-2º => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek
en 1675 - constructor de lentes holandes que inventó el microscópio simple)
-3º => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y Koch logro cristalizar a
la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.
-4º => desde principios del siglo XX hasta ahora (se estudian fisiológica, bioquímica, genética, ecológica y
surgimiento de virología, inmunológia.
- Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el microorganismo no se genera
espontaneamente (de novo), postularon la teoría de la biogénesis (ser vivo nace de otro ser vivo).
- Pasteur (1822-1895) demostró que la fermentación era producida por microorganismos en crecimiento.
- Se dobló el interes de muchos naturalistas tras la publicación de los libros de Darwin.
- Davaine (1863-1868) encontró grandes cantidades de m.o. en la sangre de las vacas (bacteridios) y Robert
Koch (1843-1910) en 1876 aisló con sus técnicas de cultivo puro el bacilo de antrax (Bacillus anthracis);
mas tarde Koch y su colegas confirmaron que las esporas son formas diferenciadas y resistentes de
bacilos y demostraron que la enfermedad podía transmitir sucesivamente a ratones
sanos inoculándose bacilos obtenidos de cultivo puro; basados en los postulados su maestro Henle, Koch
postuló siguentes criterios:
- el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos
- el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro
- la inoculación del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparición de
sintomas específicos de la enfermedad en cuestión (cada enfermedad infecciosa esta causada por un tipo
de bacteria diferente)
- el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental.
Las 2 décadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patógenas; en Francia el Instituto
Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador y la obtención de
vacunas (vacuna antirrábica ensayada por Pasteur en 1885, contribuye al nacimiento de la inmunológia).
Conceptos generales y clasificación - al finales del siglo XIX los microorganismos se agrupan en un
nuevo reino fuera de la teoría de Darwin => Protistas para los protozoos, las algas microscópicas, los
hongos microscópicos y las bacterias como seres microscópicos; Chatton en 1932 clasifica a los seres vivos
en 4 reinos => animalia, plantae, protistas inferiores o procariotas (bacterias) y protistas superiores o
eucariotas (algas, hongos y protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae, fungi,
procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2 superreinos /dominios,
5 reinos y 2 subreinos =>
- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria (incluyendo todas las
bacterias divididas en grupos)
- Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fungí, animalia y plantae (incluyendo protozoos, hongos,
algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares eucariontes pero que no cumplen con las
características para estar en algún otro reino organismos de este tipo (p.ej. protozoos)
- célula procariótica => mas primitiva, no esta organizada y no posee verdadero núcleo (ADN no esta
rodeado de una membrana - se encuentra libre); no posee mitocondrias, sino mesosomas (repliegues de la
membrana celular donde se hallan las enzimas responsables de la respiración); tampoco hay cloroplastos,
sino cromatóforos (contienen clorofilas); los ribosomas se encuentran pegados a la
membrana citoplasmática que están protegidas por una pared celular (peptidoglicano - exclusivo de
procariotas, aunque arqueo-bacterias y micoplasmas no lo poseen); las arqueo-bacterias, las eubacterias y
los eucariotas se difieren en => la estructura de RNA polimerasa y en la composicion de los lípidos de su
membrana.
- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningún reino y se discute si son o no seres vivos;
es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un huésped que les proporcione el mecanismo
de la replicación y síntesis de macromoléculas); una vez que han conseguido esto, salen de
la célula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan a celulas animales, otros a vegetales y
otros a bacterias; un virus se define como => un bloque de material genético rodeado por una cubierta
proteica que le sirve como vehículo de transmisión; algunos pueden llevar una envoltura circundante
compuesta de lípidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes infecciosos (de menor
complejidad genética y estructural conocida) que solo afectan a plantas superiores; constituidos por 1
cadena de ARN cíclica corta que no codifica proteínas; tamaño 10 veces menor que los virus (parecen ser
una etapa primitiva de los virus); los priones (proteinceous infectious particle)
=> partículas patógenas de naturaleza proteica sin acido nucleico; identificados en 1982, aunque desde el
siglo XVIII se sospechaba de su existencia; las enfermedades "prion" en el hombre (encefalopatías
espongiformes transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree que también a los musculos.
Normas de seguridad e higiene en el trabajo - tratan de evitar el riesgo de infección al personal que
trabaja en el laboratorio así como su extensión a la comunidad (establecidas por el CDC/ centro de control
de la enfermedad) americano y del instituto nacional de salud de ese país.
Niveles de seguridad biología:
Nivel 1 => valido para laboratorios de enseñanza que trabajan con microorganismo no patógenos bien
conocidos y patógenos oportunistas:
- las puertas permanecen cerradas mientras se trabaja
- las mesas de trabajo se desinfectan al terminar el trabajo y cuando es necesario
(derrame/contaminación)
- todo material contaminado debe ser esterilizado antes de desecharlo
- no pipetear aspirando con la boca
- no comer, fumar, aplicarse cosméticos, morder los lapices, bolígrafos o tener alimentos en el laboratorio.
- lavarse las manos después de trabajar con microorganismos y al terminar la jornada (uso de guantes).
- realizar las técnicas correctamente, evitando la producción de aerosoles.
- llevar bata durante el trabajo que se quitara al salir del laboratorio.
- los materiales que no pueden ser esterilizados en el propio laboratorio, se transportaran en
contenedores cerrados para el traslado hasta su descontaminación; debe existir autoclave para
descontaminar en el mismo edificio.
- deben existir programas de desinfección y desratización
- el diseño del laboratorio debe permitir una fácil limpieza incluso entre los muebles que deben ser
impermeable, resistentes a los ácidos, álcalis y al fuego.
- cada laboratorio debe tener un lavabo.
- si las ventanas se pueden abrir, deben estar protegidas con mosquiteros
Nivel 2 => permite el trabajo con microorganismo de peligrosidad potencial moderada (hospitales o
centros de salud a nivel primario); ademas de las normas del nivel 1, comprende las siguientes:
- es obligatorio el uso de bata o pijamas que no deben usarse fuera del laboratorio, especialmente en el
comedor o cafetería o salidas fuera del edificio.
- las técnicas serologícas con Ags sin capacidad infectante pueden realizarse en las mesas de trabajo
- el acceso al laboratorio debe estar limitado.
- se deben utilizar guantes en todas las técnicas con productos potencialmente peligrosos o animales.
- en un accidente de exposición a productos contaminados (derrame, pinchazos), comunicar
inmediatamente al responsable del laboratorio.
- se toma una muestra de suero del personal cuando comienza a trabajar, se archivara como suero base.
- existirá un manual de normas de seguridad en el laboratorio que todo el mundo debe conocer y donde
se exponga lo que debe hacerse ante un accidente.
- se trabajara con cabinas de seguridad de nivel I, II o III cuando se realicen técnicas que
suponen producción de aerosoles como centrifugación, homogenización de muestras, siembra o
procesamiento de muestras en general.
Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y comprende las normas de
los niveles 1 y 2 y ademas:
- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patógenos se realizaran en
cabinas de seguridad; ningún trabajo se realizara en las mesas de trabajo.
- se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio; utilizar guantes
cuando se trabaja con material contaminado o animales que se desinfectaran antes de desecharlos; en las
habitaciones donde se tienen los animales se utilizaran mascarillas rígidas.
- en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo.
- el laboratorio debe estar aislado de la circulación general, existiendo una doble puerta de entrada con
una habitación para cambiarse de ropa y con ducha.
- las superficies y los muebles deben ser de fácil limpieza; las ventanas deben cerrar hermeticamente; las
puertas se cerraran automáticamente.
- cerca de las puerta de salida existirán lavabos que pueden accionar con el pie, codo o rodilla.
- existirá un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio
- existirá un sistema de extracción de aire con circulación del mismo de la puerta de entrada hacia el
interior del laboratorio; regulación de la entrada y salida del aire acondicionado; el aire de salida de las
cabinas de seguridad tipo III saldrá directamente al exterior; el de las cabinas tipo I y II se elimina
directamente al exterior o al sistema general del edificio pasando previamente por filtros de alta eficacia
(HEPA).
Nivel 4 => este nivel solo se establece en laboratorios de experimentación y no en laboratorios de
microbiologia clínica; se necesita este nivel cuando se manejan microorganismos de altísimo riesgo o
que son exóticos en ese país, especialmente virus.
Técnicas de descontaminación física
A. Tratamientos térmicos por calor seco y húmedo - consisten en la esterilización o desinfección de
los gérmenes por aplicación de calor seco o húmedo.
1. Descontaminación por calor seco (depende de la temperatura, se consigue o no la esterilización)
- Flameado => exponer un objeto a la llama de un mechero durante un tiempo según el material de que se
trate (p.ej. la asa de siembra)
- Incineración => se usa un horno crematorio para destruir material desechables (jeringas, catéteres)
- Horno seco => estufas de Pasteur o Poupinel (hornos metálicos de doble pared y bandejas ajustables)
mediante resistencias eléctricas, esterilizan durante 2 horas a 180º o 3horas y media a 160ºC;
tienen termómetro externo que mide la temperatura en el interior y un selector de temperatura y un
reloj;
2. Descontaminación por calor húmedo
- Ebullición => se utiliza poco porque no es fiable; introducir el material en agua hirviendo (100ºC)
durante 10 minutos como mínimo; no es un método de esterilización (no destruyen esporas)
- Autoclave => un recipiente cilíndrico que se cierra herméticamente; externamente lleva
un manómetro que registra la presión en el interior cuando esta en marcha; presenta una válvula de
seguridad que se abrirá espontáneamente cuando la presión interna supere la elegida o resulte peligrosa,
una llave de purga que permite la salida de vapor y un reloj que selecciona el tiempo deseado con alarma
que indica el final del proceso; interiormente hay una rejilla que se coloca por encima de una
resistencia eléctrica cubierta por agua destilada; es muy utilizado y se conseguirá esterilización si
sometemos el autoclave a 1 atmósfera durante 20 minutos (120ºC); en el se puede esterilizar =>
material metálico, cristal, torundas, compresas, paños, batas, plásticos y gomas reutilizables; el
inconveniente => con el tiempo los objetos metálicos se oxidan.
Técnica => con autoclave apagado y abierto, añadimos agua destilada hasta la rejilla, sin cubrirla (para
que el material que deseamos esterilizar no contacte directamente con el agua); las piezas pequeñas se
colocan en cestas/ cajas; se cierra la tapa y se ajusta a presión; se abrirá la llave de purga para que
permita la salida de vapor y se ajustara la presión deseada para la esterilización y el tiempo (1 atmósfera -
20 minutos); se pondrá en marcha el aparato y se espera hasta que salga vapor por la llave de purga; se
cerrara la llave de purga y la presión comenzara a subir hasta llegar al nivel programado; a partir
de aquí comenzara a contar el tiempo de esterilización; una vez realizada la esterilización se apagara el
interruptor del autoclave y se esperara a que el manómetro baje a 0; cuando la presión este a 0,
abriremos la llave de purga para que salga gran parte del vapor que todavía se encuentra contenido; esto
se realizara con cuidado para evitar descompresiones bruscas que podrían originar la apertura de
aquellos recipientes tapados con algodón graso; una ves comprobado la salida de vapor, se abre la tapa
del autoclave y se extrae el material.
- Tyndalización => método de esterilizaciones consecutivas (repetidas en 3-4 días hasta que se elimine el
germen contaminante); se utiliza cuando existe una contaminación de algún material o en el propio
autoclave; teóricamente no se deben alcanzar temperatura >100ºC y no se debe abrir el aparato o
recipiente que se somete a tyndalización; objetivo => destruir las esporas cuando germinan y evitar
contaminaciones por microorganismos resistentes.
- Vapor fluente => utilizar el autoclave siguiendo la técnica habitual, pero la llave de purga abierta, lo
que impedirá que se produzca presión y la temperatura nunca sea > 100ºC; es utilizado para materiales o
medios que no deban soportar temperaturas >100ºC (p.ej. medios muy azucarados, para evitar su
caramelización); es poco usado en microbiologia.
- Uperización => método muy utilizado en la industria alimentaria (tratar el medio a una temperatura de
149-150ºC durante unos instantes (1-5 segundos). No se alteran las propiedades del medio y
produce esterilización.
- Pasteurización => no es un método de esterilización y es utilizado en la industria alimentaria (calentar
el medio a temperaturas entre 62ºC (15 minutos) y 72ºC (30 minutos); no destruye las formas de
resistencia.
- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio => se utilizan en casos específicos y tienen mas resistencia
que los anteriores.
- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y menos utilizados.
- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y
sale estéril; utilizados como mecanismo de esterilización en campanas de flujo laminar, en quirófanos y
recinto que pretende crear o mantener un ambiente estéril; flujo => vertical u horizontal.
- Ultrasonidos => introducir el material en tanques de distintos tamaños con liquido desinfectante; una
vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad
originando pequeñísimas burbujas que entran en todos los recodos del material consiguiendo eliminar
los microorganismos; es poco utilizado, caro y poco practico.
Técnicas de descontaminación química
1. Metodos químicos de desinfección (desinfectantes que se aplica sobre objetos y superficies
y antisépticos que se aplica sobre la piel y mucosas); condiciones que cumplir en un
buen método de desinfección:
- matar el mayor numero de gérmenes o al menos todos los patógenos
- ser económico
- no ser corrosivo, toxico ni irritante para los tejidos
- se deberá diluir al menos en agua
- tener un olor agradable
Los mas utilizados:
- Detergentes catiónicos => diluidos al 1% para desinfección de manos; mas frecuente para limpieza
y desinfección de paredes, suelos, ropa y objetos (sin diluir)
- Clorofenoles => muy eficaces y se asocian con los detergentes catiónicos para mejorar el grado
de desinfección.
- Compuestos clorados => para desinfección de superficies, ropas, urinarios; se suelen usar diluidos en
agua (lejias /hipocloritos)
- Acido fenico => diluido al 5% para la limpiar objetos y superficies.
-Amoniaco
Los antisépticos mas utilizados:
- Alcoholes => limpiar y desinfectar la piel, las manos (etanol), el filo de instrumental y superficies
pequeñas (metanol) que no tiene contacto con la piel (p.ej. alcohol isopropilico 70%)
- Mercurio-cromo => contiene mercurio y un buen desinfectante para heridas superficiales (las mantiene
secas y protegidas)
- Derivados yodados => para preparar la piel antes de una intervención quirúrgica, en
la punción lumbar, antes de punción para hemo-cultivo, etc.; son efectivos y ejercen
su acción por oxidación (p.ej. betadine, ibetane)
Metodos químicos de esterilización - los mas empleados son "Oxido de etileno" => en forma de gas
(10ºC) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante y podría explosionar al mezclarse con O2;
presenta un gran poder de penetración y es muy efectivo y duradero; la esterilización se produce a
=> temperaturas bajas (40ºC) con humedad relativa alta (40-60%) durante un tiempo de 3-8 horas (media
de 5); se requiere cámaras o instalaciones especificas para ello, son muy caras; el oxido de etileno se
aplica a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros metodos (p.ej.
endoscopia, plásticos termo-lábiles, cauchos, material eléctrico); el material esta listo para ser utilizado a
las 48 horas después de la esterilización; deberá conservarse estéril en el interior de una bolsa
de plástico cerrada por procedimientos termoeléctricos y dura 6 meses.
Recogida de orina - el frasco estéril no debe abrirse antes de la recogida; las partes genitales se lava solo
con agua; se recoge a primera hora de mañana para estudio microbiológico, de forma aséptica, se echa el
primer chorro, se recoge la segunda mitad unos 20-30 ml.
Sondaje vesical (puncion de sonda) y puncion suprapubica - se realiza por el personal de enfermeria
Recogida de muestra de tracto genital - se utiliza un tubo con escobillón de algodón como medio de
transporte; exudado uretral => el hisopo se introduce 2 cm dentro de la uretra y se rota suavemente antes
de retirarlo (muestras separadas para el cultivo de gonococos y clamidias o ureaplasmas => se utiliza 2
escobillones, 1º para estudio de gonococos 2º para clamidias o ureaplasmas); exudado cervical => se
inserta un hisopo especial (como uretral) en el canal cervical y rotando-lo y moviendo-lo durante 30"
antes de retirar; exudado vaginal => el hisopo se sumerge en el fornix posterior de la vagina; para
aislamiento de gonococos pueden ser transportados en el medio de Stuart modificado o en el medio de
Amies con carbón en temperatura ambiente, hasta su inoculación; para aislamiento de clamidias y
micoplasmas, el medio es tampon con sacarosa y ATB; se puede refrigerar si hay demora en el proceso.
Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a los que debe
expulsarse todo el aire.
Transporte de muestras:
- Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos de plástico que llevan incorporados
diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH regulado, carece de nutrientes,
pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para prolongar la viabilidad de los microorganismos
cuando exista demora entre la recogida y su cultivo; los mas utilizados => (1) Medio de Stuart (los
exudados faríngeos, conjuntivales, nasales y heridas) que mantiene un pH favorable e impide
la deshidratación de las secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción enzimática de
los patógenos presentes (2) Medio de Cary y Blair (muestras fecales) donde las salmonellas y las shigelas
pueden recuperarse hasta 49 días después de la toma de muestras y Vibrio cholerae hasta
22 días después.
- Transporte de muestras para estudio en anaerobiosis => cuando la muestra se va a procesar dentro
de 30 minutos, puede servir como transporte una jeringa con una aguja insertada en un tapón de goma; si
la demora va a ser mayor, se usa un tubo /frasco ampolla lleno de CO2 y libre de O2 con N2/ H2 con
indicador en agar o caldo; la muestra liquido se inyecta a traves del tapón de goma después de expulsar el
aire de la jeringa y aguja; existe también un hisopo en un tubo anaerobiosis
Envió de muestras (las medidas especiales para un envió por correo a un laboratorio de referencia):
- Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una caja con
unidades comerciales refrigerantes
- La sangre no se envía entera, se separa el suero y se envía en un tubo estéril
- La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermético irrompible con espacio suficiente
entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro de otro envase para el envió; el
envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco para Agentes biológicos /Material bio-medico.
Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras para
estudio bacteriológico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse en la nevera
a excepción de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uñas para el aislamiento de hongos
pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante varios días antes de ser inoculados (protegidos
del polvo).
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en cuadrantes
(puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a la identificación de E.coli (sensible
a colistina - común en orinas); crecen bacilos Gram- => Enterobacterias y también Pseudomonas;
observaremos las características de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en la lengüeta del tubo
preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de citrato (+) => vira a azul y las que no,
permanece verde; se usa para la diferenciación de Enterobacterias (para diferenciar entre coliformes y
coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono
ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter
aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción
alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)
2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de orina; conservada a
4ºC, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en cuadrantes).
[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecerán el genero Salmonella y Shigella;
en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-), verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido
sulfidrico (+) con fondo negro, son bacilos móviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) ,
SH2 (-), bacilos inmóviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio
serán amarillas;
en SS las Salmonellas y Shigella serán el del medio (caramelo) y también con el fondo negro (Salmonellas
SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+ no son patógenas (coliformes fecales)
y no se investigan.
[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia pestis, Yersinia
enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos
Gram- e móviles, fermentador de manitol. La inhibición selectiva de organismos gram negativos y gram
positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sódico (inhibidor de
Gam+) y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de
S.epidermidis).
[c] Agar Campylosel => crecerá Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como colonias
pequeñas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni) resistente a Nalidixico el C. fetus,
en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato
C.jejuni seran (+) y C.coli (-); P. hipurato => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de
las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico que da lugar a acido
benzoico y glicina un compuesto de color morado.
[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los géneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio
inhibe la flora Gram+ y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp.
[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecerán como colonias rojas por ser
lactosas (+); no es necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen colonias de color
amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomórficos; el extracto de levadura y la peptona
proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de buey y un pH
alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayoría de las
entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los
entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es
halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es halofílica. La
sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el crecimiento. El tiosulfato
sódico es una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como indicador para detectar la producción
de ácido sulfhídrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio
Cholerae es lactosa (-).
3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra por
agotamiento en cuadrantes).
[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B (S.agalactiae),
que aparecerán como colonias pequeñas translucidas con un halo de B hemólisis alrededor de la colonia;
son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio facultativo, prueba de látex (+).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeñas grisáceas que crecen
bien por ser gérmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o V (proceden de la
degradación de la Hb); también podemos colocar discos de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco
como coco-bacilos inmóviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable.
[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que aparecerán como
colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no el
resto de los azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolíticas y al fresco
como bacilo pequeño, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de
sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya que producen ß-hemólisis
alrededor de las colonias. La ß-hemólisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia
de G.vaginalis. Los antibióticos incluidos en el medio inhiben la mayoría de los contaminantes Gram- y de
las levaduras.
[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp) y Trichomonas (protozoo
unicelular flagelado).
[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)
4. Semen - la muestra llegara en contenedor estéril/ bote de orina; se siembra por agotamiento en
cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate, Thayer Martin o New York, Roiron, y
cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los mismos gérmenes que en el caso del exudado vaginal.
5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H a 4ºC; antes de
sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta contaminada por saliva; se siembra
por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas
epiteliales sea > 2,5 (recuento en fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de
UCI o provenientes de neumonías se siembran siempre.
[a] Agar Sangre => buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae o Branhamella catharralis;
S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemólisis) y al fresco como coco Gram+, catalasa (-), sensible a la
Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blanco-grisáceas y al fresco como cocos Gram-, oxidasa (+),
catalasa (+) que no utiliza ningún azucar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/
nitratasa+ (lo que le diferencia del genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al
fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar chocolate polyvitex (contiene factor V/
NAD y factor X /hemina procedente de la degradación de Hb)
[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.
[d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium tuberculosis, bacilos
acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento; los niveles bajos de la penicilina y el
ácido nalidíxico también están presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y
Gram-, con el fin de limitar el crecimiento de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde
malaquita en el medio inhibe las floras mayoría acompañante; que se desinfecta y se solidifica mediante
un proceso de espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis.
[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram- (en realidad, se
tiñe muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los azucares, sino que utiliza los
aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias
de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico; necesita L-cisteina para crecer y también
iones férricos Fe. La inhibición del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayoría de las bacterias Gram-,
levaduras y mohos, a través de una combinación optimizada de 3 antibióticos. Las colonias que crecen en
medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de
Legionella.
6. Cepillado bronquial (la muestra vendrá en el cepillo y se conservara a 4ºC < de 24H); se siembra en los
mismos medios que en el caso anterior (esputo) añadiendo ademas: agar sangre anaerobios (ASA) o
medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivo para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides
(bacilo Gram-, anaerobio estricto).
7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en cuadrante).
[a] Agar sangre => crecera todo tipo de gérmenes (medio general enriquecido)
[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de gérmenes
[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibe los Gram-
=> para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y Staphylococcus??
[e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp.
8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La muestra ha de
llegar en tubo estéril y se conservara a 4ºC menos de 24H.
[a] Agar sangre => crecerá todo tipo de gérmenes
[b] Agar chocolate => idem
[c] Agar Mac Conkey => crecerán las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibidor Gram-
=> crecerán bien los Steptococcus B-hemolíticos.
[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque también puede utilizarse agar AKV, agar sangre
kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram- anaerobios (estrictos) y Bacteroides.
[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite el desarrollo
de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente exigentes. Además, se
observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las
anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.
RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En base a la relación de las
bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en :
1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador terminal de
electrones , puede tolerar un nivel del oxígeno equivalente o mayor de una atmósfera de aire (oxígeno del
21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo (Mycobacterium tuberculosis,
Bacillus).
2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en
la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del aire (oxígeno de 21%) =>
Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp..
3. Microaerofílico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-
dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una atmósfera
de aire (oxígeno de <21%) => Campylobacter fetus, Pseudomonas y Neisseria.
4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-dependiente y no puede
crecer en la presencia de una concentración de oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de
21% - nada de O2). (Clostridium botulinum).
5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxígeno pero su metabolismo es siempre
fermentativo (Lactobacillus)
9. Liquido cefalorraquídeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento del tubo
centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas de 1 ml de muestra. Sino,
vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si no es posible, conservarse a 37ºC.
[a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeñas colonias no hemolíticas y al fresco
se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+), fermentador de glucosa y maltosa (la fermentación
de este azucar le diferencia del gonococo; también puede crecer Streptococcus pneumoniae
(neumococo) que aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+,
catalasa (-), sensible a la optoquina.
[b] Agar chocolate => ídem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias puntiformes
translucidas, que al fresco aparecerá, como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable.
[c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecerán bien los meningococos
/N.meningitidis.
[d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios.
(f) Ademas se hará una extensión para Gram.
10. Otros líquidos estériles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento; la muestra ha
de llegar en tubo estéril y su conservación no se ha de demorar mas de 24H a 4ºC.
[a] Agar sangre => crecerán casi todo tipo de microorganismos, con características hemolíticas de
algunos de ellos.
[b] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecerán Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para Gram (+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides.
11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la técnica de Maki (rodamiento del cateter)
[a] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, y podrán crecer bien algunos exigentes como
el Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecerán bien casi todo tipo de gérmenes y podrá verse sus características hemolíticas
si las tuvieran.
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se hará un pase por Agar chocolate.
[d] También puede ponerse en una placa de agar MacConkey.
Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar gérmenes como las
bacterias, hongos y parásitos según sus necesidades nutricionales de cada uno; en función de sus
requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios de cultivo que nos sirven para diferenciar
cada tipo de microorganismo que podrá crecer en unos medios de cultivo y no en otros.
3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de muchos
microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria); Comp: agar chocolate/
sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los
Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-, anfotericina => antifúngico, trimetropinsulfametroxazol
=> antibiótico de amplio espectro).
4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayoría de bacteria y
Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) incluyendo factores
X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina dinucleótido) proporcionados por la hemoglobina y
PolyViteX.
5. Medio base Christensen (líquidos y sólidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de rojo => rosa;
gérmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory
6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energía) para la
investigación de bacilos Gram- (la diferenciación entre coliformes y coliformes fecales. Los coliformes
fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio
como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis
podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción alcalina); Comp: citrato sódico, azul de
bromotimol (indicador pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); gérmenes con
citrato permeasa => Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.
7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias mediante prueba de Voges-
Proskauer (producción de acetoína/ acetil metil carbinol => por reducción a 2,3 butanodiol o por
oxidación a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo (acidificación del medio con pH <4,5 y cambio de color a
rojo); gérmenes con VP+ => Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes; gérmenes con RM+ =>
Proteus, E.coli y Salmonella.
9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar) => investigación de
microorganismos hemolíticos (consume hematíes); es un medio general enriquecida; Comp: sangre de
cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estériles y desfibrinadas; alfa hemólisis/ neumococo
(parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la colonia; beta hemólisis/ Streptococcus B-hemolítico y
Staphylococcus aureus que causan anginas (total) => halo transparente; gamma hemólisis/ Pseudomona
causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.
10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para aislamiento de
entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto
contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y inhibidor los
Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).
11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias patógenas Gram-;
Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona,
tiosulfato sódico y citrato férrico amoniacal (indicador de la producción SH2/H2S => puntos negro), azul
de bromotimol, fuschsina ácida (indicadores de pH); en condición normal es verde => fermentacion de
lactosa/acidificación => vira a amarillo/naranja (características de fermentadora L+ Escherichia, Serratia,
Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se
acidifican primero, y después se basifican) => verde; cuando se consume azufre/ disulfurasas+ =>
precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (característica de Salmonella y Proteus vulgaris).
12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy semejante y mas
utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para la identificación de entero-
bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa,
citrato férrico amoniacal y tiosulfato sódico (componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de
pH); los gérmenes productor de SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+
=> Salmonella y Citrobacter y E.coli.
13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificación de entero-bacterias Gram-/ poco
exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+), cloruro sodico, rojo neutro,
cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter
aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella, Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria,
Haemophyllus.
14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el método de Bauer-Kirby
15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificación de la movilidad
bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina (orinitina descarboxilasa /está
dada por un color púrpura/ alcalinidad del medio y la producción de indol (al añadir reactivo de Kovacs);
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de
la línea de inoculación; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.
16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el aislamiento de
Salmonella; Comp: selenito sódico (inhibidor de flora Gram+ y Gram- excepto Salmonella); después
también se hace cultivo con agar SS.
17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patógenas importantes Salmonella y
Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato sódico y citrato de hierro (indicador de
SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+
(coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (típico de Shigella); L- y SH2+
con la precipitación de hierro => negro (típico de Salmonella).
18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y diferenciación de
bacilos entéricos Gram-, especialmente del género Salmonella y especialmente Shigella (entero-bacterias
patógenas); Comp.: xilosa (la fermentan los entéricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de
sodico (inhibe Gram+); se puede utilizar para la identificación de lactasa+, lisina descarboxilasa+ =>
Salmonella que alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sódico + citrato de hierro amoniacal).
19. Medio caldo Columbia => caldos para hemocultivos.
20. Medio Castañeda (caldo y solido) => búsqueda de gérmenes Brucella, Vibrios y Pasteurella en
sangre (hemocultivos).
22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificación de hongos micelares y levaduriformes.
23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento e identificación de Candida
(levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram- y Gram+.
24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo de anaerobios (estrictos y
facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto de levadura, la hemina y la
vitamina K3 y la adición de sangre de cordero permite el crecimiento incluso de las especies más
exigentes.
El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentración de dextrosa en el medio favorecen el crecimiento
de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.
25. Medio CPS cromogénico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y de identificación destinado a
las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento microbiano
(método de inoculación estandarizado); (2) identificación de: Escherichia coli, Enterococcus del grupo D,
KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus, Providencia,
Morganella); la concentración elevada de agar evita el crecimiento invasivo de Proteus; el medio se
inocua directamente a partir de la orina, respetando técnicas adecuadas de toma de muestras y su
transporte; permite la identificacion directa de:
a. E.coli => coloración espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de B-glucuronidasa (B-
GUR) y coloración azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa genera triptofanasa.
b. Enterococcus y KES => coloración espontanea azul-verde de las cepas que producen B-glucosidasa (B-
GLU).
c. Proteeae => coloración marrón revelada por el reactivo TDA cuando la cepa
genera triptófano desaminasa (sin reactivo es incoloro).
Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra con el asa
calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente; descargar el asa al realizar
una estría sobre un radio de la placa; realizar estrías perpendiculares muy apretadas sobre toda la
superficie de la placa; incubar en la estufa con la tapa hacia abajo a 37ºC en aerobiosis; se examinan los
cultivos después de 24 horas de incubación.
Lectura e interpretación:
Recuento - estimar la concentración bacteriana comparando la densidad de las colonias presentes sobre
la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre 1000 - 100.000 (dudoso), mas de
100.000 (positivo)
Identificación - observar las colonias
(1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a burdeos => presunción de E.coli;
confirmar mediante una detección de indol (depositar una colonia sobre un disco de papel previamente
embebido de una gota de reactivo R1 del envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloración azul (E.coli);
la ausencia de color azul (indol-) se debe proceder a la pruebas de API.
(2) Colonias de color azul-verdoso y observación de cocos Gram+ mediante examen directo =>
Enterococcus; si no cumple esta condición, se debe proceder a las pruebas de API.
(3) Colonias de color azul-verdoso y observación de bacilos Gram- mediante examen directo => grupo
KES; la identificación se debe proseguir mediante pruebas bioquímicas (ureasa+ => Klebsiella; ornitina
descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa+ => Serratia).
(4) Colonias incoloras a marrón-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas colonias idénticas,
una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar la coloración después de unos 30 segundos =>
TDA+ da una coloración marrón +/- oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia
o Morganella); ausencia de coloración azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da
una coloración amarilla y la identificación se debe proceder a las pruebas de API.
Tema 7 - Metodos de Siembra (cultivo de las cepas)
Sembrar - cultivar la muestra utilizando técnica y medios adecuados para conseguir el objetivo
(identificar el microorganismo).
Bacterias - organismos unicelulares de tamaño 0,2-2 um, relativamente sencillos, cuya material genético
no esta rodeado por una membrana nuclear especial (procariotas).
Estructura - constituidos por elementos obligados (presentes en todas las bacterias e indispensables
para su vida => pared celular, membrana plasmática, citoplasma, ribosomas y la región nuclear);
elementos facultativos (son elementos de supervivencia y virulencia que pueden estar o no presentes en
la bacteria => capsula, flagelos, pelos/pilis, endosporas e inclusiones citoplásmicas)
Pared celular - es el limite externo de la célula con estructura rígida, parecida a la pared celular de las
células vegetales; funciones => protegerse de cambios externos adversos, mantener la morfología de la
célula, proporciona la resistencia a los antibióticos, dar un paso selectivo de algunas sustancias,
proporciona la especificidad de grupo y de tipo (clasificación), implicada en la patogenicidad; dar el color
en la tinción de Gram, violeta oscuro => Gram+ y color rosa => Gram-.
Estructura y composicion de la pared celular - Gram+ => mono-estratificada y gruesa, compuesta por
mureina (peptidoglicano - mono-capa, 50% peso seco/mucha cantidad), polisacáridos, proteínas y ácidos
teicoicos; Gram- => biestratificada y fina (1ª capa es mureina en poca cantidad y 2ª capa formada por
polisacáridos proteínas, fosfolipidos y lípidos, no tiene ácidos teicoicos); las bacterias que no son sensibles
a la tinción de Gram => BAAR/ acido alcohol resistentes (micobacterias); las que sin pared celular => los de
genero mycoplasma/ patógenas; la que tienen (formas S), pero la pierden (formas L).
Membrana plasmática - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared celular, encerrando al
citoplasma; funciones => actúa como barrera selectiva, interviene en la degradación de nutrientes y
producción de energía, en algunas se encuentran pigmentos y enzimas para la fotosíntesis; estructura y
composición => fosfolípidos, proteínas y glicolípidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la
membrana plasmática, irregulares (no existen en las celulas eucarióticas), se encargan de dirigir la
duplicación del ADN bacteriano y realizar la respiración.
Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmática; función => engloba los
orgánulos celulares (región nuclear, ribosomas, inclusiones/depósitos de reserva, vacuolas); no tienen ni
aparato golgi, ni retículo endotelial plasmática, ni mitocondria; composicion => 80% de agua, enzimas,
iones y principios inmediatos.
Región nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido nucleico; funciones =>
el acido nucleico transmite la información genética de la célula sobre estructuras y funciones celulares;
estructura y composicion => es un núcleo difuso que contiene 1 molécula ADN bicatenario, formando N
cromosomas (enroscada en forma de anillo); plásmidos => estructuras que pueden existir ademas de
ADN cromosómico (formadas por moleculares de ADN extra-cromosómico bicatenario, pueden estar
libres o unidos al ADN cromosómico /episomas), se replican independientemente, se transmite por
conjugación, portan genes muy importantes que determinan la resistencia a antibióticos, tolerancia a
metales tóxicos y síntesis de enzima.
Ribosomas - son orgánulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y procariotas) dan
aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > síntesis de proteínas; estructura y composicion => en
grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de ARN mensaje (polirribosomas), cada ribosoma tiene 2
subunidades de 30 y 50 Svedberg (velocidad relativa de sedimentación), procariotas - 70S y eucariotas -
80S; comp: 60%ARNr y 40% proteínas.
Flagelos - largos apéndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es rara); funciones =>
responsable de la movilidad (elementos patogénico: facilitar la difusión de las bacterias a traves de las
membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y corpúsculo basal); tipos => monótricas (1 solo
flagelo en un extremo), lofótricas (2 o mas en un extremo), anfítricos (un grupo de flagelos en un extremo
y otro grupo en el otro extremo), perítricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);
Pelos /pilis o fimbrias - elementos rígidos constituidos por una proteína (pilina); cortos, muy numerosos,
distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que en Gram+; funciones => capacidad de
fijación a superficies (pelos comunes), proporcionan pelos comunes y sexuales (son morfológicamente
iguales), sistema de intercambio de información genética por conjugación (pelos sexuales).
Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio estricto); una forma de
resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas (deficiencia nutricional, desecación,
frio, temperaturas elevadas, agentes químicos); se forman por un proceso de esporulación /esporogénesis,
pueden permanecer latentes durante cientos de años y volver a una forma vegetativa por un proceso
germinación; localización => zona central, subterminal o terminal (depende de su tamaño, pueden o no
deformar el bacilo); la espora => célula en reposo con capacidad de resistencia a la desecación, calor y
agentes químicos; esporulación => la producción de estructuras, enzimas y metabolitos nuevos y la
desaparición de muchos componentes celulares; Morfológicamente comienza con el aislamiento del
núcleo y elementos energéticos mediante el crecimiento en vaginante de la membrana; los elementos
esenciales para la vida quedan protegidos en esa nueva estructura (endosporas); la bacteria queda en
estado latente esperando una condición externas favorables para resurgir.
Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tinción negativa (tinta china);
funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve como almacén externo de nutrientes,
defensa frente a Acs, fagos y celulas fagocíticas (elemento virulencia), protege de la desecación (contiene
agua), formación de colonias (habitualmente engloba mas de una bacteria); estructura y composición =>
polisacáridos y proteínas.
Tamaño y Morfología de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el microscopio óptico; la
morfología => información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente (viene dada
por la rigidez de la pared; formas => esférica/coco, coco-bacilo, bastoncillo/cilíndrica/bacilo,
helicoidal/espirilo, en coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella y cuadrangular /forma de hifas de hongos
(actinomyces/ streptomyces - productor de muchos ATB, ATF y inmunosupresores); agrupación de los
cocos => aislados, en parejas/diplococos (granos de cafe - típico de neisserias/meningitis), en
cadenas/estreptococos, tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae), en
racimos/estafilococos, en formas cubicas de 8 elementos/sarcinas (sarcinas ventriculi - tolerancia al medio
ácida/ estomago); agrupación de los bacilos => aislados, en parejas/diplobacilos, en
cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a cocos/cocobacilos (E.coli), en forma empalizada/letra china
(corynebacterium - algunos son saprofitos de la piel y también causante de difteria).
Aroma típicos => Pseudomonas aureginosa (olor a jabón); Haemophyllus (olor a semen/yeso); Citrobacter
(olor a fétido); Proteus (olor a amoniacal); Klebsiella y E. coli (olor a levadura de pan).
Morfología macroscópica - estudio de la forma y estructura de las colonias (masas constituidas por
muchos millones de bacterias, se aprecian a simple vista y originadas a partir de una bacteria en el medio
solido); reconocible en función de => 1. características o tipo de medio de cultivo solido donde se ha
desarrollado (un microorganismo puede dar lugar a distintos tipos de colonias) 2. tipo de microorganismo
(mayor movilidad => colonias extendidas y planas); la verificación de las colonias (siempre en medios
sólidos sembrándolo por estría) => en placa y en tubo con agar inclinado.
1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categoría se incluyen a la mayor
parte de las bacterias que provocan a la patología humana.
Espiroquetas:
- Familia Leptospiraceae (genero - Leptospira)
- Familia Spirochaetaceae (genero - Borrelia, Treponema)
Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerófilas móviles (crecen mejor a bajas presiones de oxígeno):
- Familia Campylobacteriaceae (genero - Campylobacter, Helicobacter)
Bacilos y cocos aerobios - microaerófilos (crecen mejor a bajas presiones de oxígeno):
- Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas)
- Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos
- Familia Legionellaceae (genero - Legionella)
- Familia Neisseriaceae (genero - Neisseria) => diplococos
- Familia Moraxellaceae / Familia Branhamaceae (genero - Moraxella, Branhamella) => diplococos
- Otros generos => Brucella (cocobacilos)
Bacilos anaerobios y facultativos:
- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Serratia,
Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Shigella, Yersinia/peste)
- Familia Vibrionaceae (genero - Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas)
- Familia Pasteurellaceae (genero - Haemophilus)
- Otros generos => Gardnerella
Cocos Gram- anaerobios => genero - Veillonella
- Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parásitos intercelulares obligados,
altamente pleomórficas cocos/bacilos/hilos
- Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parásitos intercelulares obligados de forma esférica.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan patologia humana (la
mayoria).
Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus
Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)
Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos irregulares no esporulados:
- Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)
Micobacterias:
- Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)
3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); dentro de este grupo, los que
provocan patología humana => genero Mycoplasma/ Mycoplasma pneumoniae y Ureaplasma.
4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan patologia
humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ termogenas)
Taxonomía => la ciencia de la clasificación que agrupa y separa los organismos de acuerdo con su
características fenotípicas, estructurales o genéticas para facilitar su estudio; la misión => construir un
esquema racional, para clasificar y nombrar los organismos; el sistema jerárquico de la taxonomía se ha
formado gradualmente a partir del sistema binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y
especie establecida por Linneo en 1758 (un botánico); la taxonomía no es una ciencia estático, goza de
gran dinamismo y esta en la relacion con los avances de los procedimientos empleada para su estudio; el
termino de sistemática se utiliza como sinónimo de taxonomía; los grupos de taxonomía van de dominio -
imperio - reino - tribu - división - clase - orden - familia - genero y especie.
Para la asignación de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el código internacional de
nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por el Int´l Journal of Systematic
Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que
incluyen sus números; una especie bacteriana, viene definida por un nombre genérico de un nombre
especifico latinizado o helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra
mayúsculas y el de especie con minúsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra
cursiva/ italica o en su defecto, subrayado; en la denominación de un especie, la palabra que define
genero puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las
bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej. Staphilococcus aureus
(cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de
Koch, también puede dar referencia a un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico es único;
para referirse a un especie o varios especies no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las
categorías taxonomia superiores, se forman añadiendo las palabras que las asignan distintas
terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categorías
taxonomía se expresa en cursiva o itálica.
FLORAS BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la población de microorganismos comensales que normalmente
coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la piel y las mucosas colonizadas
por microorganismos dinámicos => cambios cualitativos y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de microorganismos (comensales
y oportunistas) en una zona definida (si se producen alteraciones, suelen ser temporales); permanecen
intactas; encuentran condiciones fisiológicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es
normalmente beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorción de nutrientes y
impide la colonización de microorganismos potencialmente patógenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patógenos o potencialmente patógenos, que colonizan
la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca importancia, pero si la flora residente se
altera, la flora transitoria puede multiplicarse y producir infecciones.
La supresión de FR => vació ecológico => ocupación de microorganismos ambientales o de otras zonas de
cuerpo => infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estériles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si alcanza el torrente
sanguíneo => si válvula cardíaca dañada => posible endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible peritonitis o
bacteriémia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cáncer, leucemias, linfomas, SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estéril (o no habitual) a traves de uretra => infección urinaria
Las causas de las interpretaciones erróneas => no se toma en cuenta al microorganismo como
patógeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisión o inclusión de una especie en una de las
categorías no implica que no pueda ser aislada en otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales,
pueda producir enfermedad.
Fundamento – Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el angulo visual, se
podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes - produce una imagen aumentada
de una muestra diminuta. El objetivo - pequeña lente de proyección que aumenta y proyecta la imagen
primaria del objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio (imagen aérea). El ocular (lupa) -
aumentando la imagen aérea. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo
percibe la imagen final en el plano virtual).
Aumento – es el numero de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real. En el
microscopio óptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el
aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100. Aumento óptico ocular - x5, x10
Resolución – la capacidad del microscopio para mostrar los detalles más finos de un objeto. Poder de
resolución (limite de resolución o distancia resoluble) – la distancia minima entre dos puntos que permite
distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque están
muy próximos entre si).
Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolución = aumentar la apertura numérica
(AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ángulo alpha en el espacio objeto =
aumentar el índice de refracción (IR) en el espacio objeto (rellenar el espacio existente entre la muestra y
el objetivo con una sustancia de mayor índice de refracción, como aceite).
Numero de campo – diámetro de la imagen observada a través del ocular (en mm).
Profundidad de foco – el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo >< aumento y
AN (apertura numérica) de la lente.
El contraste – para mejorarlo, disminuye el cono de iluminación (se controla mediante el diafragma de
apertura) procedente del condensador.
Tipos de microscopios:
Microscopio de campo oscuro – si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un indice de
refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden
ser visualizados; permite la observación de seres microscópicos transparentes y no teñidos (Treponema
pallidum – preparación en fresco).
Microscopio de fluorescencia – consta de una fuente de luz muy intensa (lámpara de Hg a alta presión),
emite una radiación que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar un condensador de
campo oscuro (iluminación transmitida); se emplea un tipo especial de liquido de inmersión (glicerina);
Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria - fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-
tiamina, vitamina B-riboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina
(demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar Gardnerella
vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijación del
fluorocromo (colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado).
Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz fluorescente
de exitacion (UV) Observador
Microscopio electrónico de barrido (MEB) – no tiene tanto poder de resolución como el de transmisión,
pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera unas imágenes que
producen una gran sensación de tri dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3º modelo que une las
caracteristicas de los 2 anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los
MEB.
Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la movilidad y la disposición
bacteriana en una muestra se debe observar los gérmenes vivos a partir de cultivos jovenes (lleva pocas
horas), que permiten visualizar mejor su movilidad y su preparación en fresco.
Técnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre portaobjetos y
cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y con tinción vital.
Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF colocandolo en un
portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su morfología (cocos o bacilos),
disposición/agrupación y motilidad; Material => portaobjetos, microscopio, portaobjetos excavado,
cubreobjetos, asa de siembra, mechero Bunsen o de alcohol (para flamear el asa de siembra), muestra de
microorganismo problema, agua destilada estéril, vaselina (opcional).
Técnica - Método de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:
- preparar portaobjetos y cubreobjetos limpios y desengrasados
- depositar una gota de agua estéril en el portaobjetos (50ul/lambdas)
- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del microorganismo y
suspenderla en la gota.
- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensión un cubreobjetos, evitando que se
formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensión.
- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.
Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se producen cuando se
desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha corriente en dicha dirección; el sellado
con vaselina evita este problema.
Coloración vital - es una técnica intermedia entre los exámenes en fresco y las técnicas de tinción
después de fijación previa???; consiste en teñir las muestras bacterianas con colorantes muy diluidos,
permite al microorganismo acumular parcialmente dichos colorantes; la dilución debe ser muy altas para
que no resulten toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales gérmenes; material => microscopio,
asa de siembra estéril, portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de filtro, una suspensión de muestra
problema,
aceite de inmersión, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro en solución
acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solución acuosa al 1:1.000 o 1:500).
Técnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos limpio y desengrasado
una gota de suspensión muestra junto con otra gota del colorante diluido utilizado; mezclar bien ambas
gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos con cuidado para evitar que se formen burbujas de
aire; observar al microscopio con objetivo de inmersión; resultados => los microorganismos se
visualizaran vivos y ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo
neutro o de color azul si se utiliza el azul de metileno.
La morfología bacteriana (es incolora) puede ser estudiada por visualización de los microorganismos =>
vivos sin teñir (observar su posible movilidad) y teñidos mediante colorantes con una concentración que
matan la bacteria y no permiten observar su movilidad, pero mejora notablemente la visualización de su
morfología y estructuras.
Principales técnicas de coloración - clasificación de colorantes => [1] según su origen (naturales y
artificiales) [2] según su comportamiento químico (ácidos, básicos y neutros).
Colorantes naturales - extraído de plantas como la hematoxilina (del tronco de una planta que por
oxidación produce hemateína; el azul de índigo (de una leguminosa); extraído de animales como el
carmin (de una cochinilla)
Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrán de hulla (colorantes anilina
ácidos, básicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, acido
pícrico, azul de metileno, etc.
Colorantes según su comportamiento químico - se unirá de forma mas estable a la estructura que tiñe,
dependiendo de su estructura físico-química; constituido por un anillo bencénico que unen distintos
radicales => radical cromóforo; a+ numero de radicales => +poder colorante de la solución;
[1] colorantes ácidos o aniónicos: la carga del radical colorante es (-) => colorantes citoplasmáticos que
son básicos (los componentes citoplasmáticos captan muy bien los colorantes ácidos) => las eosinas, las
auraminas.
[2] colorantes básicos o catiónicos: la carga del ion cromóforo es (+) => colorantes de la zona nuclear
que son ácidas o ligeramente ácidas => fucsina básica, cristal violeta o violeta de genciana, azul de
toloudina, azul de metileno o las tioninas.
[3] colorantes neutros: es una sal compuesta de un colorante acido y un colorante básico => el eosina
azul de metileno; es hidro-solubles (posee las propiedades de colorantes ácidos y básicos).
[4] colorantes indiferentes: insolubles en agua y solubles en alcohol, no predomina ni la carga+ ni (-),
pero tampoco es de carácter neutro => colorantes de los lípidos como Sudan III, Negro Sudan, etc.
En bacteriología es frecuente la utilización de => fucsina fenicada, violeta de genciana, azul de metileno
(son colorantes básicos) y de añadir un mordiente que ayude a fijar dicho colorante; los colorantes ácidos
se utiliza como un contraste y los colorante neutros e indiferente como coloraciones particulares; el
proceso de tinción => reacción de intercambio de iones entre colorante y sitios activos de la superficie o
del interior de la célula (los iones teñidos/colorantes reemplazan iones de los componentes celulares) y
esto permite contrastar mucho mas el germen con respecto al medio que le rodea.
Preparación de un frotis - realizar una extensión y fijar la muestra problema para posterior coloración y
visualización al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves de un asa de siembra una cantidad de
microorganismo problema suspendido en medio liquido estéril, extendiéndolo adecuadamente hasta
formar una fina película homogénea que posteriormente se fijara generalmente con calor cuando sea
requerido, según el método de tinción que se utilizara posteriormente; material => portaobjetos, asa de
siembra o platino, agua estéril, muestra problema; técnica => pequeña cantidad de la muestra liquida se
deposita y se extiende homogéneamente en el centro del portaobjetos con el asa de siembra para tener
una capa fina (según la viscosidad, se puede diluir con unas gotas de agua estéril); si la muestra es solida
(una colonia), se deposita primero una gota de agua estéril y se añade con el asa de siembra una pequeña
cantidad de la colonia, se extiende homogéneamente; dejar secar al aire; se fija mediante el flameado (en
algunos casos se podrá hacer con alcohol) para coagular las proteínas y los gérmenes quedan adheridos al
portaobjetos.
(2) Tinción negativa => es un tinción simple (1 solo colorante => tinta china o solución acuosa de
nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijación previa (no mata las bacterias), permite observar
características estructurales de la bacteria ademas de su morfología sobre un fondo oscuro, como es la
presencia de capsulas p.ej. los neumococos; se basa en => colorante acido cargado negativamente, los
microorganismos no se tiñen (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teñido oscuro); para obtener
una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y evitar a formarse grietas al secarse el
colorante) se puede hacer una extensión con el borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las
capsulas (si las tienen) en forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.
(3) Tinciones diferenciales => fijación previa (en general por calor), se utiliza 2 colorantes (el ultimo es
de contraste), permite visualizar su morfología y características estructurales (composicion de la pared
bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida (t.Gram y t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijación previa (en general por calor), se utiliza al menos 2 colorantes, nos
permite observar su morfología y características estructurales como esporas, flagelos, cilios, capsulas,
corpúsculos metacromáticos (utiliza 1 solo colorante???).
Tinción diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando trabajaba con material
de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tinción diferencial; es mas empleado en bacteriología, para
clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-); distinto comportamiento debido a la distinta composicion de
la pared de las celulas bacterianas; se emplea como el primer colorante básico (cristal violeta o violeta de
genciana) que teñirá de color azul violeta todas las bacterias, posteriormente un mordiente el lugol que
aumenta la afinidad del primer colorante a las celulas (lo fijara), finalmente un agente decolorante que
decolora solamente un tipo de bacterias (Gram-) que serán teñidas con el colorante de contraste o
segundo colorante (la safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color azul violeta serán Gram+.
Material de la tinción Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra, mechero de Bunsen,
pipeta Pasteur, asa de tinción (punte), frasco lavador, muestra problema, aceite de inmersión, colorantes
para la tinción de Gram.
Técnica:
- realizar la preparación de frotis => extender 1 gota de agua destilada estéril + una colonia de la bacteria
problema por la superficie de la portaobjeto
- fijación por el calor, pero no quemar las bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2 minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- añadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solución iodoiodura de potasio con OH de 96º o con
acetona a 5/1 o con OH 50%)
- vuelve a lavar con agua el exceso
- decolorar con solución decolorante (alcohol 90º)
- lavar abundantemente con agua
- cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto
- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire
- observar con objetivo de inmersión (100x).
B. Método de Kin Youw modificado (coloración en frió) Reactivos => 1º colorante: fucsina fenicada (con
fenol) de KinYouw, decoloración a 3%, 2º colorante: azul de metileno fenicado (con fenol); técnica =>
idéntica, salvo para la fucsina de KY, dejamos actuar 5 minutos sin calentamiento; existen otras técnicas
de tinción de los BAAR => tinción de auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia.
Enzima - catalizadores biológicos (proteínas); cada enzima afecta solo a un sustrato especifico.
Reducción => captan electro nes.
1º vía glucolítico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto por Pasteur => se obtiene 2
moleculas de ATP mediante fosforilación por cada molécula de glucosa que se oxida; este proceso se
puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la formación de acido pirúvico, las bacterias que usan
esta vía, normalmente utilizan la vía fermentativa para acabar transformando este acido pirúvico en
ácidos mixtos; degradación/ hidrólisis de glucosa (6C) => acido pirúvico + 2 ATP (fosforilación) => ácidos
mixtos (fermentacion); son 9-10 reacciones químicas con un enzima diferente en cada una; utilizados por
las bacterias fermentadoras que poseen deshidrogenasas (Clostridium, Enterobacter, Salmonella)
2º vía de las pentosas fosfato /vía fosfoglucónica (vía HMP) - es una ruta mixta y vía alternativa; este
ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas y también glucosa, mediante sucesivas reacciones y
produce => pentosas intermedias (precursores de síntesis de ácidos nucleicos y ciertos aminoácidos) de
gran utilidad para las celulas; ademas de la glucólisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP como una
vía alternativa para la oxidación de la glucosa => produce acido láctico o acido mixto + 1ATP (p.ej.
Enterobacterias/ E.coli); esta vía es un híbrido de la vía ED y la EMP, ya que en las primeras etapas, la
oxidación de la glucosa es similar a la via ED y en las etapas posteriores es similar a la vía EMP, es decir:
proporcionan a las bacterias no oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirúvico puro, porque
no tienen las enzimas necesarios para comenzar la vía EMP, apareciendo en los sistemas analíticos como
fermentadoras.
3º vía de Entner-Doudoroff (vía ED/ vía aerobia => requiere O2) - es otra vía por la cual la glucosa se
oxida a acido pirúvico; por cada molécula de glucosa se producen 1 molécula de ATP para ser utilizada
por la célula en reacciones bio-sintéticas; esta vía requiere enzimas específicos y solo los
microorganismos que las poseen pueden utilizarla sin seguir la vía de las pentosas fosfato ni la glucólisis;
los microorganismos que la utilizan son Pseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las
deshidrogenasas necesarias para oxidar el acido pirúvico al acido láctico u otros ácidos; los hidrogeniones
se transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidación de glucosa => acido pirúvico +
1ATP (no producen acido láctico ni acido mixto)
Respiración anaeróbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una sustancia inorgánica distinta
del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4, carbonatos CO2-3. (Pseudomonas y Bacillus)
Fermentación - proceso que se inicia a partir de acido pirúvico formado en la glucólisis de EMP /HMP, en
cual el aceptor final de los electrones es un compuesto orgánico y no requiere O2; características
principales => (1) no precisa O2, pero se puede ocurrir en su presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs
ni cadena transportadora de electrones, (3) utiliza 1 molécula orgánica como aceptor final de electrones,
(4) libera energía a partir de azucares y otras moleculas orgánicas (aminoácidos, ácidos orgánicos,
purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2 moleculas de ATP por cada molécula del sustrato inicial, (6)
los productos finales pueden ser acido láctico, etanol y CO2, acido propiónico, acido acético, CO2 y agua,
acido butírico, etc. (compuesto orgánico); cuando el aceptor final de electrones es el lactato, se producirá
acido láctico y en general cuando el aceptor final sean otras sales orgánicas, se formaran ácidos mixtos
p.ej. acido succínico, que son responsables de la caída de pH en las pruebas empleadas, para la
identificación bacteriana; ademas, las bacterias que tienen la dotación enzimática apropiada, pueden
seguir degradando estos ácidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgánicos; es útil el análisis de los
productos finales para identificar así los microorganismos; la mayor parte de la energía producida en la
fermentación queda almacenada en los productos finales; las fermentadoras => Streptococcus,
Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella, Enterobacter.
Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de
fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa Permeasa (esta en la membrana celular y es capaz de
transportar la lactosa a traves de ella) y B-D-Galactosidasa (esta en el interior de la célula y es capaz de
desdobla la lactosa en glucosa y galactosa).
Principal productor de energía => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de proteinas y lípidos
(estan relacionados entre si); la hidrólisis de proteínas/ proteína+agua (mediante enzimas proteolíticos
extracelulares, secretadas por ciertas bacterias que sirve para su tipificación/tipación) => polipéptidos y
aminoácidos; las pruebas bioquímicas investigan fundamentalmente la capacidad de un microorganismo
de producir la hidrólisis de la gelatina; catabolismo de proteínas/ proteólisis se realiza mediante
proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminación) para obtener => ion amonio NH4+ (+) acido orgánico;
acido orgánico entrar al ciclo de Krebs y ion amonio NH4+ es secretado de la célula.
Producción de acido sulfhídrico - técnica con indicador incorporado al tubo/a la placa => algunos
microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos azufrados (cistina, cisteina) y liberan
azufre en forma de gas acido sulfhídrico SH2; el gas es detectado a traves del medio que contiene fuente
de hidrógeno (azucar) fuente de azufre (tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de
hierro /citrato férrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberación del gas SH2 por
algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de la glucosa =>
acidifica/produce ácidos/baja el pH) que actúan sobre los aminoácidos azufrados; la temperatura de
incubación (estufa) tiene que oscilar entre 35-36ºC (superior a 37º se inhibiría la producción de SH2).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas de siembra, estufa
de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen y SS);
Técnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara una muestra
con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en cuadrante (Hektoen o SS);
incubar durante 18-24 horas; si la técnica se realiza con Brucella (microaerofila), se debe incubar con una
atmósfera de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de inoculación
ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se ennegrece el medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de azucar) + indicador de pH/sales de Fe
+ fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro insoluble/ puntos negros (FeS)
Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actúan sobre el grupo carbóxilo de los aminoácidos Lisina,
Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende CO2 (el proceso se realiza en
anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba (API - buscar el código en el libro); estas
pruebas se aplican para la identificación de Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinización del medio
inicialmente de color purpura, se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del
enzima investigado supondrá la alcalinización del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada
pocillo contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada
descarboxilasa actúa sobre un aminoácido especifico; en cada reacción se desprende CO2 y se alcaliniza
el medio:
- L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2
- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2
- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilación) => Putrescina +CO2
Pruebas oxidasa - esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo oxidasa que
participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxigeno; oxidasa => enzima
que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos
obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a partir de
un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de
electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la
especie microbiana; los citocromos son hemo-proteínas que contiene Fe y actúan como ultimo eslabón de
la
cadena respiratoria aerobio, transferiéndo H+ al O2 con formación de H2O; este sistema se encuentra en
los organismos aerobios y anaerobios facultativos, carenciandolo de ello los anaerobios estrictos; se
observara el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando esta reducido (p-fenilendiamina=>
formar indofenol de color violeta oscuro) y coloreado cuando se oxida;
Aplicación => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa; diferenciar entre
Enterobacteriaceas (oxi-) de Pseudomonadacea (oxid+); diferencia entre géneros Moraxella (oxi+),
Neisseria (oxi+) de Acinetobacter (oxi-).
Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plástico, papel de filtro, porta,
reactivo oxidasa de Kovacs.
Técnica => mezclar una pequeña muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se sitúa por
encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de color; otra manera: se
añade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y
también en otro medio; si son oxidasa positivo toman un color marrón y en seguida pasan a negro
parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a los 10-60" se
considera oxidasa retardado positivo, después de 60" es negativo; oxidasa- no se produce color.
Pruebas de catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que actúa sobre el peróxido de
hidrógeno /H2O2 (es un producto final de la degradación aerobica oxidativa de los hidratos de carbono);
si se acumula H2O2, estos gérmenes morirían; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa
y se pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O + O2; aplicación => diferenciación de
Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);
Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plástico (las de platino catalizará la reacción)
Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema
Técnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto, simultáneamente, con una
asa se añade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-24 horas, homogeneizar y observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen burbujas; se
podrán observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangre o otros que lleven hematíes
(los hematíes contiene catalasa).
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo, microorganismo; el medio no
debe contener azufre ya que si el microorganismo es productor de H2S (acido sulfhídrico) este impide la
formación de color; técnica => hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas,
inoculamos el medio; incubar a 37ºC durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,
observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rápido, ya que el color puede
desaparecer); si no se forma color, se añade al tubo un poco de polvo de Zinc; resultados => hay 2
posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color
rojo o rosado fuerte al añadir el reactivo A y B que indica la reducción de nitratos a nitritos; [2] al añadir
polvo de zink no se desarrolla color indica formación de otros productos nitrogenados; Nitratasa- =>
cuando se forma color rojo o rosado al añadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.
Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la ureasa en los
microorganismos cuando se observa la alcalinización de un medio liquido; la ureasa cataliza la hidrólisis
de la urea => carbonato amónico, que sube el pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicación =>
diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o baño maría.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color ámbar) y microorganismo de problema
Técnica => con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas; inoculamos el
microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37ºC; la reacción se produce entre 1-4 horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color ámbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de reacción (1-4
horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Brucella, requieren 6
días de incubación.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) - observar la
coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitación al ponerse en contacto el microorganismo
con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la coagulasa es un enzima producido por
microorganismos capaz de coagular en plasma; aplicación => diferenciar Staphylococcus aureus (coco
Gram+, catalasa+, beta hemolítico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el
germen es coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico +; técnica => (usando el kit comercial /prueba de látex)
seguir la instrucción de la casa comercial que hacen el reactivo; resultados => coagulasa+ se observa en
forma de grumos (si se utiliza un plasma como reactivo => se observara la formación de un hilo de fibrina
en la reacción) y en coagulasa- no se forma grumos.
Prueba de Triptófano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de
desaminar el triptófano por la acción de TDA, produciendo => acido indol pirúvico que reacciona con
citrato férrico amoniacal y el cloruro férrico que lleva el medio produciendo un color marrón (determina
la presencia de la enzima TDA); técnica => en un medio liquido de TDA (color ámbar); se puede utilizar el
reactivo urea-indol; añadimos 1 sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo TDA del API, incubar
a 37ºC entre 18-24 horas, y leer; resultado => el color marrón/café indica la presencia de TDA+ y sera
negativo si no hay cambio de color; los géneros que tienen TDA+ => Proteus, Providencia y Morganella.
Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentación solo de la glucosa => K/A zona superficial roja
(reacción alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccion ácida); después de la fermentación
de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es amarillo entero, pero posteriormente la parte del pico se
alcalina/rojo (había poca cantidad de glucosa) por la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos (que
forman la peptona) que se produce mejor en aerobiosis; la fermentación de glucosa en el pico es
inicialmente mediante la vía EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio
clave (acido pirúvico), que a su vez el acido pirúvico es degradado mediante el ciclo de Krebs por los
aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio, en el fondo, el acido pirúvico es
degradado hacia acido láctico y acido mixtos que mantiene el pH acido de manera estable.; son
características de Morganella, Providencia y
Shigella; también P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.
[b] en la fermentación de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son amarillas
(características de E.coli y K.pneumoniae);
[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de color rojo (si se trata
de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de color naranja (se alcalina mas la zona
con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo (gérmenes
inertes).
Producción de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio del fondo del
tubo, debido a la formación de hidrógeno y de anhídrido carbónico (CO2)
Producción de acido sulfhídrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa profunda o un anillo
negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un precipitado negro en la capa profunda (que
puede enmascarar la acidificación del medio => fermentación de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+
=> Proteus y Salmonella.
Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clínica (E.coli, Proteus
mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Sighella, Vibrio) son anaerobios
facultativos, que para tener energía para sus reacciones metabólicas, utilizan la fermentación acido-mixta
de los hidratos de carbono produciéndose => acido succínico, acido acético, alcohol etílico (ácidos mixtos);
en RM positivo, aparecen un color rojo fuerte en la superficie y en RM negativo, no hay cambio en la
superficie del medio.
Material => igual que anterior
Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solución de rojo de metilo y
microorganismo
Técnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema (b) actualmente
se utiliza la modificación de Barry que es poner un inoculo abundante en 0,5 ml de reactivo de Clark y
Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le añaden unas 5 gotas de indicador rojo de
metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la superficie del medio
Micro-técnicas
1. Sistema en Tiras (API - Biomerieux)
El material y reactivos necesarios para la realización de estas pruebas se encuentran comercializados en
kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se re-hidratan mediante una suspensión de
5 ml de agua estéril con 1 colonia bacteriana y se incuban; el proceso metabolismo del microorganismo,
genera cambios del color en el medio de cultivo o al añadir reactivos y esos cambios se interpretan
mediante tablas de lectura o ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del
fabricante); principalmente se utiliza para la detección de Enterobacteriaceas, bacterias aerobios no-
fermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; después de utilizar todo debe ser incinerado o
descontaminado en autoclave o sumergido en un germicida.
2. Sistemas en Tubos (entero-Tube BBL)
Se utiliza para identificación de Enterobacteriaceas y otras aplicaciones; fundamento => un tubo en
forma de lápiz con numerosos compartimentos (normalmente son 8 con diferentes medios, donde pueden
leer hasta 11 características); este tubo se inocula (con 1 colonia del medio y alambre de la inoculación
atraviesa todas las cámaras) y se incuba, produce cambios de color en cada compartimento; mediante un
código numérico o colorimétrico, se puede identificar al microorganismo.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentración máxima de ATB que se puede localizar
en el lugar de la infección no es suficiente para eliminar el germen, es decir, la concentración de ATB
necesario para destruir el germen no se puede elevar mas por efectos tóxicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de ATB dadas a
intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infección sin llegar a dosis que produzcan
efectos tóxicos, puede eliminar el germen.
Casos clínicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a casi todos los
ATB, se dará una dosis toxico o una combinación de ATB por vía endovenosa.
Normas básicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patológico, ni tampoco
utilizar mezclas de gérmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento en placa), excepto para
muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infección mono-microbiana); para elegir un ATB se
deberá ensayar aquellos que son útiles clínicamente y se encuentran disponibles en el mercado
farmacéutico.
Factores a tener en cuenta => (1) características tintoriales del germen (Gram+o-) (2) lugar de la
infección (especialmente las vías urinarias y meningitis); es importante porque es necesario que la CMI
sea alcanzable en los líquidos corporales para que sea efectivo (3) bacteria investigada.
La selección de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad
Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de
sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad para un ATB
cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus pyogenes.
1. Betalactámicos => todo el grupo tiene en común que presenta un anilla betalactámico y el mecanismo
de acción consiste en inhibir la formación de peptidoglicano de la pared celular; son bactericidas.
a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro.
* Penicilina G sodica - la forma oral es P V
* Amoxicilina - infección del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crónica, neumonías
bacterianas y bronconeumonía, producidas por estreptococo, estafilococo sensible, neumococo y
H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis,
bacteriuria, gonorrea, aborto séptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infección de
herida quirúrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli.
* Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactámasas producida por algunas
bacterias)
2. Derivados de betalactámicos:
* Aztreonam - se utiliza comúnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa,
pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como p.ej. Klebsiella,
Haemophilus, Citrobacter y Proteus.
6. Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen español de un amplio espectro que actúa sobre la pared celular (se
usa en infección urinaria)
* Acido fucsidico - actúa sobre la síntesis proteica y destaca su acción sobre Staphylococcus aureus.
9. Macrolidos y similares - inhiben la síntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando es alérgica a
penicilina; son bacteriostáticos y bactericidas en alta dosis.
a. Eritromicina (un buen ATB frente neumónia atípica, legionelosis, difteria, tos ferina)
b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la bronquitis;
neumonía; enfermedades de transmisión sexual (ETS); y las infecciones en los oídos, pulmones, piel y
garganta; no tienen ningún efecto sobre los resfriados, la gripe y otras infecciones virales.
c. Claritomicina - interfiere la síntesis de proteínas en las bacterias sensibles; faringitis, amigdalitis,
sinusitis, bronquitis aguda, reagudización de bronquitis crónica, neumonía bacteriana (adquirida en la
comunidad), infección de piel y tejidos blandos leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infección
localizada o diseminada por Mycobacterium avium o M.intracellulare, infección localizada por M.chelonae,
M. fortuitum y M.kansaii. Prevención de infección diseminada por M.avium complex en pacientes con VIH
de alto riesgo
b. Pruebas de elución en disco (disolver) => se realiza introduciendo discos de un ATB en tubos con
caldo nutritivo; el ATB se disuelve en el caldo alcanzando una concentración final conocida,
posteriormente se inocula un volumen de una suspensión microbiana y se sigue la misma metodología
descrita antes obteniéndose resultados cuantitativos o cualitativos en base a sensibilidad, sensibilidad
intermedia o resistencia (no se utilizan habitualmente).
d. Prueba de difusión en medio solido (antibiograma clásico) => estandarizado desde los años 50 (se
hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos sus pasos y es mas utilizado
actualmente en forma manual; fundamento => depositar discos impregnados de ATB sobre cultivos de
microorganismos en placa; la difusión del ATB a traves del medio produce un halo de inhibición del
crecimiento cuyo diámetro sera proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de
resistencia, sensibilidad o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas
metálicas estériles o dispensador automático, pie de rey o regla milimetrada, medio Mueller-Hinton,
discos de ATB, suspensión microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10 elevado 8 u.f.c./ml; escala Mc Farland
=> el 0,5 se prepara añadiendo 0,5 ml de Cl2Ba 0,04 M a 99,5 ml de acido sulfúrico 0,36M); una placa llena
=> mas de 10 elevado 6.
Técnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la siembra utilizada
preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobillón en el inoculo preparado al 0,5 Mc
Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja aproximadamente 4 minutos la placa semi-
abierta e invertida antes de colocar los discos; (b) la de Barry: se hace una inoculación previa al vertido
de las placas, se añaden 0,1 ml del inoculo a 25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa
(no se usa mas)
Elección de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en los casos donde
existan diferencias significativas en los espectros de actividad o resistencia; los aspectos importantes que
prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las características tintoriales del germen (Gram+o-), el
lugar de la infección (orina, meningitis) y la bacteria investigada.
Concentración de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada siguéndose las normas de la
Federación de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar entre 65% y 150% y de la OMS
=> entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control para controlar la actividad de los discos; en
general, se escogen discos con una concentración que producen un halo de inhibición entre 20 y 30 mm
para organismos tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes.
Implantación de los discos (papel de filtro grueso de un diámetro 6mm que van impregnados con una
concentración determinada de ATB); Manual => se saca el disco de ATB con unas pinzas estériles y se
deposita en la placa, la distancia mínima entre los discos es de 24 mm para evitar la superposición de los
halos, deben estar situados a 15 mm del borde como mínimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el
disco se presiona ligeramente con la punta de pinzas; Automática => se utilizan dispensadores
automáticos que son unos dispositivos de plástico del tamaño de una placa de Petri con unos orificios guía
que permiten la colocación simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con una pinza se
presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir la placa no se caigan los discos.
Incubación => 18-24 horas a 35-37ºC (máximo 48 horas)
Lectura e interpretación del antibiograma => los resultados se expresan según el halo de inhibición
que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o pie de rey midiendo los
diámetros, y según cual sea clasificaremos al germen como sensible (la dosis habituales es eficaz),
intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es
totalmente ineficaz);
Observación al método:
1. preservar la estandarización en todos sus pasos
2. puesto que la difusión del ATB es casi instantánea no debe moverse ningún disco una vez que se ha
puesto en contacto con la superficie del agar
3. los discos se tienen que conservar en la nevera
4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitándose el exceso de incubación
5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos como AS
(estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para gérmenes exigentes
6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad
7. cuando el germen sea anaerobio el método es diferente
El sistema Microscan utiliza un sistema semejante al de dilución en caldo pero en miniatura utilizando
paneles con caldo de Mueller-Hinton deshidratado (como API); tras la inoculación y re-hidratación con
una suspensión estandarizada del microorganismo y su incubación a 35ºC por un mínimo de 16 horas, la
CIM o una sensibilidad cualitativa (sensible, intermedio o resistente) para el organismo en prueba se
determina observando la menor concentración ATB, que muestre inhibición de crecimiento; esta
detección puede hacerse manualmente mediante un visualizador de micro-dilución o mediante un lector
conectado a un ordenador; viene en tripletes de un ATB con diferentes concentraciones.
Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram- => Cefuroxima, Cefotaxima, Colistina,
Tobramicina, ; frente a Gram+ => Eritromicina, Tetraciclina, Vancomicina, Meticilina, Clindamicina,
Doxicilina; frente a ambos Gram+ y - => Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Cotrimoxazol,
Cloranfenicol, Imipenem, Amoxicilina+acido clavulonico.
El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red vascular;
filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia); se filtra agua, urea,
creatinina, aminoácidos, ácido úrico, glucosa, proteínas de bajo pm.
La red tubular - el filtrado por el glomerulo es recogido en la capsula de Bowman y se dirige hacia la red
tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorción selectiva => reabsorber agua, ciertos
elementos útiles para el organismo y que deben ser recuperadas (glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio,
bicarbonato, urea, aminoácidos, proteina) y permite la secreción de otras que, por su toxicidad, deben ser
posteriormente eliminadas mediante la micción (amonio, urea, hidrogeniones/H+); se elimina 1 ml de
orina por minuto (1500 ml diarios); la red tubular esta formada por => túbulo contorneado proximal, asa
de Henle, túbulo contorneado distal y túbulo colector.
Mecanismo de la función renal:
- Filtración glomerular => filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la capsula de
Bowman.
- Reabsorción tubular => el producto de la filtración glomerular se modifica su composicion al atravesar la
red tubular.
- Secreción tubular => transporte de sustancias, desde la red capilar hacia los túbulos renales; destaca
la secreción activa de iones H+, que permite la regulación del equilibrio acido-base en el organismo.
Examen físico - macroscópico
Es orientativo => para diagnosticar una patología, hay que confirmar con otros análisis complementarios;
hay que tener en cuenta situaciones fisiológicas (menstruación, grado de hidratación, etc.) que pueden
alterar las características de la muestra;
1)- Cantidad / diuresis normal 1200-2000 ml/24H; alteración => oliguria/inferior, poliuria/superior,
anuria/falta de eliminación (<300 ml/24H)
2)- Aspecto / turbidez; recién emitida: clara y transparente; almacenada: sedimento blanco/fosfatos y
carbonatos, sedimento rojizo (uratos desaparecer al calentar la orina a 60ºC);
3)- Color amarillo / ámbar (en función de la concentración)
4)- Olor aromático, ligeramente amoniacal
5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante tiras reactivas);
6)- pH normal 5,5-6 (ligeramente ácida); pH alcalino => posible contenido de gérmenes con ureasa.
Pruebas bioquímicas cuantitativas
Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido); normoglucemia =>
6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de la concentración de glucosa en orina por
encima de los VN, causada por (1) aumento de la glucemia por encima de umbral renal
(2) alteración renal (tubulopatía)
Estructuras organizadas
- Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran numero indica infección,
traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-2/campo o como
una contaminación menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de
oxalato cálcico monohidratado; con tinción Gram se diferenciar => los hematíes son teñidos de rojo,
levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir entre macro-hematuria (se ve en el
sedimento de color rojizo) y micro-hematuria (únicamente se detecta al microscopio), también si el color
rojo observado macroscópicamente procede de hematíes o Hb (al centrifugar el sedimento, el color rojizo
de Hb permanece).
- Leucocitos (neutrófilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de ellos se lisan al
permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de 1-2/campo (varón) y 1-
3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria (>5 leucocitos/campo indica
=> infección renal en cualquier nivel);
- Espermatozoides: formados por 2 partes cabeza y cola; frecuente en un sedimento
del varón (eyaculaciones recientes, poluciones nocturnas, etc.), y en mujer después de haber mantenido
relaciones sexuales.
Celulas epiteliales: el árbol urinario esta revestido por 3 tipos de epitelio => (1) columnar /tubular
/renales /cuboideo (capsula de Bowman, túbulos distal, proximal y colector) (2) transicional o urotelio
(pelvis renal, uréteres, vejiga y uretra) y (3) escamoso (uretra y vejiga); una escasa descamación es
normal, pero se puede aumentar por causas => microorganismos, productos químicos, cuerpos extraños,
procesos degenerativos, procesos invasivos-destructivos.
- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamaño 1/3 mayores que los leucocitos; su forma normal
es redonda con núcleo grande y céntrico; un sedimento normal 0-1/campo; aumentado en pielonefritis y
glomerulonefritis.
- Celulas del epitelio escamoso: son planas y tienen abundante citoplasma con nucleo centrico y
pequeño; a veces sus bordes aparecen doblados, replegados; un sedimento normal 0-1/campo.
- Cilindros granulosos: predomina la estructura granular y desaparece el aspecto hialino; 2 tipos =>
cilindros granulosos finos (semejante a los hialinos en tamaño y forma; tienen mayor refringencia debido
a la masiva pequeños gránulos de inclusión) y cilindros granulosos gruesos (estructura totalmente
diferente a los hialinos; son de mayor tamaño, aspecto rígido y mayor refringencia; sus borden son
contrastados y angulados; en orina normal 0-1/campo; el aumento de su presencia indica una nefropatía.
- Cilindros céreos: son muy refringentes, rígidos, de apariencia dura, superficie rugosa y brillante (como
la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran tamaño; su presencia es
un síntoma claro de una alteración renal importante; suelen estar inmersos en una cilindruria (presencia
de la mayoría de los diversos tipos de cilindros).
Estructuras no organizadas
Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas cristalinas según la
condiciones físico-químicas de la orina (la pH sobretodo, densidad, temperatura, etc.) y se excretan a nivel
urinario; se diferencian en 3 grupos:
(1) Cristales endogénos normales - no corresponden a alteraciones metabólicas ni funcionales, muy
frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recién emitidas.
(2) Cristales endogénos patológicos - reflejan trastornos metabólicos o afectación grave de algún órgano o
sistema y muy raras veces aparecen en orina.
(3) Cristales exógenos - aparecen en la orina tras la introducción en el organismo (vía enteral o
parenteral) diversas sustancias (contrastes radiológicos/ contraste radiopaco vía endovenosa y
medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)
- Cristales de acido úrico: en orinas ácidas; son birrefringentes; de formas variadas (p.ej. agujas); color
entre marrón rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica una situación patológica o concentraciones
elevadas de acido úrico; un sedimento normal 0-2/campo.
- Uratos amorfos: en orinas ácidas; se presentan como un precipitado amorfo, coloreado debido a la
presencia de pigmentos urinarios de color amarillo-naranja (color ladrillo); no tiene mucha
importancia clínica.
- Cistina: en orinas ácidas; tiene significación clínica por si solos => aparecen como consecuencia de
cistinuria; aspecto incoloro con forma de placas hexagonales, regulares finas y transparentes; es
imprescindible una vez observados en el sedimento, confirmar la concentración de cistina en la orina.
- Leucina y tirosina: en orinas ácidas; raramente se observan; son productos finales del metabolismo
proteico y suelen aparecer juntos en situaciones clínicas graves => destrucción o necrosis tisular
importante, fundamentalmente de tejido hepático (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina forman
manojos de agujas finas y los de leucina son como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas, de
aspecto oleoso o graso y muy refringentes; ambas son de color amarillo o marrón.
- Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color blanquecino.
Examen citológico:
- celulas hematológicas => se redactan con números y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C = no.leucocitos por
campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acúmulos.
- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) - abundante (6-8) -
intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las de transición; las celulas escamosas
(de las vías bajas), se informan cuando son abundantes.
- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el informe el tipo
de cilindro.
Examen químico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el informe):
- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis".
- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos
Examen microbiológico:
- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su movilidad
- levaduras => se informa con adjetivos.
Análisis de microbiológico (urinocultivo)
1. Preparación de un "inoculo"
2. Sembrar en medio Cled (la ausencia de electrolitos, impide la invasión por proteus); McConkey (un
medio selectivo y diferencia para m.o. Gram-); agar Cetrimide (eficaz para la búsqueda de pseudomonas)
3. Incubar a la temperatura optima de crecimiento de los m.o. buscados (generalmente a 37ºC)
4. Realizar el recuento tras la incubación (presumible-mente han crecido los causantes de la infección) =>
menos de 10.000 mo/ml de orina es negativo; mas de 100.000 mo/ml hay infección urinaria; entre 10.000 y
100.000 mo/ml el diagnostico es incierto; puede haberse infección no detectada por causas => un
tratamiento ATB instaurado, una obstrucción a nivel de las vías renales o la muestra recogida por
una punción supra-púbica (sin pasar por la uretra, donde esta la infección).
5. Una vez determinada la infección, hay que resembrar en medios selectivos, para proceder
la identificación (tipación) del germen causal de la misma.
Tema 18 - Cocos aerobios y anaerobios facultativos (patología e identificación)
Staphylococcus => cocos Gram+ inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamaño +/- 1 um; en forma
de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas azucares (via EMP); no
capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios con alto contenido de NaCl (halófilo);
resistentes a agentes externos, distribuidas ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y
la piel, causante de la intoxicaciones alimentarias, heridas, etc.
La acción patogena directa => procesos inflamatorios, forunculos, supurativos y de necrosación (en
heridas y quemaduras); indirecta => afecta al tubo digestivo por la entero-toxina (gastroenteritis con
nauseas, vómitos y diarreas, duración 1-2 días, se trata con sueros orales o anti-diarreicos); la bacteria no
llega al intestino (solo su toxina), por eso no se encuentra en las heces; crece muy bien con la temperatura
veraniega y en las cremas; infección generalizada (septicemia) => formación de coágulos o trombos
intravenosos, artritis, pleuritis, endocarditis, osteomielitis o meningitis en los debilitados (periodo
de incubación 1-6 horas).
Streptococcus => cocos Gram+, tamaño pequeño, capsulados, anaerobios facultativos, se agrupan en
cadenas, fermentador de glucosa, son saprofitos, oportunistas y algunos patógenos; poseen Ags
(polisacárido C - según sus características, se clasifican en grupos A-V de Lancefield; proteína M
antifagocitarias, la posee el grupo A)
Clasificacion
A. según el tipo de hemolisis (capacidad de romper hematíes - produce hemólisis alrededor de sus
colonias en AS) => gamma hemolítico, alfa hemolíticos/ hemólisis parcial (decoloración parda verdosa -
S.viridans); beta hemolíticos/ hemólisis total (halos de transparencia grandes entorno a su colonia) -
grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolíticos - grupo D, S.viridans y
S.pneumoniae (alfa y gamma)
Acción patógena e Interés clínico:
(1) Streptococcus del grupo A (S.pyogenes) => causan 90% de las infecciones estreptocócicas; muy
sensibles a los agentes externos; son floras de la mucosa nasal y faríngea; poseen polisacárido C
(proporciona la especificidad de grupo) y proteína M (facilita la adherencia a las células invadidas
y protección a la fagocitosis); son Beta-hemolíticas, sensibles a la bacitracina y variable a optoquina
- Poseen hemolisinas estreptocócicas/ estreptolisinas (O y S); estreptolisina S (poco antigénico) =>
holoproteína toxica responsable de hemólisis en medio AS; estreptolisina O (muy antigénico) => hetero-
proteína exotóxica muy activa de efecto hemolítico frente a glóbulos rojos y leucocitos (pmn y macrófagos
=> alterando la estructura celular); induce a la formación de Acs ASLO.
- Produce toxina eritrogénica responsable del exantema de la fiebre escarlatina;
- Enzimas estreptoquinasas (activador de plasminógeno => plasmina en fibrinolisis); induce a
la formación Acs; se utiliza en el hospital en procesos trombo-génicos.
- Enzima desoxirribonucleasa estreptocócica (despolimeriza ADN); son antigénicas y se distingue en 4
grupos (A-B-C-D).
- Enzima Hialuronidasa (hidroliza el acido hialurónico del tejido conjuntivo); facilita su invasión.
- Proteinasa estreptocócica (origina procesos inflamatorios y necrosación)
Patogenicidad de S.pyogenes (grupo A) => Infecciones en la piel o mucosas (+frecuentes -
anginas/faringitis sobre todo a niños/contacto directo, otitis y sinusitis) 95% de infecciones naso-faringeas
son producidas por estreptococos del grupo A; infecciones NO supuradas/ inmunológica =>
fiebres reumáticas (complicaciones de tto no adecuados), glomerulonefritis, endocarditis, meningitis,
sepsis.
(2) Streptococcus del grupo B (S.agalactiae) => saprofito del hombre en rino-faringe, uro-genital,
vaginal e intestinal; produce infecciones oportunistas; hipurato+ (degrada el hipurato sódico) es lo que le
diferencia del grupo A; posee factor CAMP (potenciar la acción hemolítica de S.aureus); puede origina
meningitis e infecciones pulmonares en el neonato, infecciones del tracto respiratorio, mucosas, piel, etc;
son Beta-hemoliticos, resistente a la bacitracina;
(3) Streptococcus del grupo C => es el mas proximo al grupo A; son Beta hemolíticos (también alfa y
gamma) y muy sensible a los agentes externos; resistente a la bacitracina; crecen en medios salinos (NaCl
6,5%); posee enzima hialuronidasa; saprofito del hombre en la rinofaringe; puede producir mastitis en
vacas, muermo en caballos y sepsis ??? en el hombre.
(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolíticos; resistentes a agentes externos y
ATB;
- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen bien en NaCl
6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina; son alfa-beta-gamma hemolíticos;
resistente a la bacitracina; puede producir infección urinaria e herida.
- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y caballos); hidrolizan la bilis
esculina; resistente a la bacitracina;
(5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e intestino en el
hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a la bacitracina; son alfa y
beta-hemolíticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%)
(6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen alfa y gamma
hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries); resistente a la optoquina;
(7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos, Gram+ y son
capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y gamma hemolíticos; sensibles a optoquina;
crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%); saprofito en aparato respiratorio; puede producir
neumonias, inflamaciones sinusitis, otitis y meningitis (mas frecuente en adultos);
Aislamiento:
- toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estéril, una muestra del pus (si hubiera);
se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos);
- un frotis para la tinción de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza una tinción negativa con tinta
china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula); se produce una reacción de Quellung
cuando un Acs tipo específico se une al polisacárido capsular del neumococo y causa un cambio en el
índice refractivo de la cápsula haciéndola aparecer “hinchada” y más visible.
- la siembra en AS-CNA (posibles hemólisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que inhibe el
crecimiento de otros gérmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis o sepsis; las colonias
son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeños; medios selectivo y diferencial con NaCl 6,5% =>
permite el crecimiento de enterococos del grupo D.
Pruebas bioquímicas:
- pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina; hidrolisis de
hipurato (positivo en el grupo B), utilización de bilis esculina.
- identificar los grupos antigénicos según el tipo de sustancia polisacárido C (clasificación de Lancefield)
por metodo serológicos => prueba de látex (romper la capsula para sacar la sustancia; reacción inmuno-
complejo Ag-Ac).
- los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+, catalasa- que no son
estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina).
Pruebas serologícas / inmunologicas:
- la búsqueda en el suero (dilución seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas de
estreptococos (sobre todo grupo A) => títulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para saber si
la infección es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumáticas con títulos de ASLO negativos, se
determinan los títulos de Acs antiestreptoquinasas (ASK), antihialuronidasas (ASH); pruebas de
hinchamiento capsular con suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para
determinar S.pneumonia => se añaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinación es signo de que esta
estreptococo.
Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de café), aerobios; son saprofitos de mucosas
(genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los animales; citocromo-oxidasa y catalasa+;
utilizan azucares con metabolismo oxidativa y fermentativa; producen
pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a medios externos.
Acción patógena e interés clínico
Neisseria meningitidis (meningococo) => diplococos /granos de café; coloniza las mucosas
y vías respiratorias (sobre todo superiores); 5-30% son portadores sanos en rino-faríngeo; afectan a niños
de 6 meses hasta 5 años (causas mas importantes de mortalidad infantil); también afectan niños mayores
y adultos jóvenes de 6 hasta 25 años; estructura antigénica => componentes de su capsula
(polisacárido), las fimbrias (facilitar la adherencia y la invasión) y proteínas de la membrana (toxica
sobre las celulas invadidas);
Cuadro clínico - comienza con una rino-faringitis de sintomatología leve (sobre todo en niños - en
adultos se forman Acs anti meningococo) evoluciona a forma severa, se complica con bronquitis; si el
meningococo pasa a la sangre, originara micro-focos en la piel con erupciones petequiales (1-2mm) en el
tronco e extremidades inferiores, cefaleas, fiebres altas, artralgias; puede pasar a LCR con fiebres muy
altas, cefaleas fuertes, rigidez de nuca, vómitos, diarreas, etc.; se agravan hasta la muerte sin tto efectivo
y rápido; el examen LCR es turbio, purulento con abundantes meningococos (debido a acumulación de
pmn con meningococo dentro (celulas CLUE); tto con penicilina (G) - el tto del portador es rifampicina.
N.gonorrhoeae - toma de muestra a partir de la uretra (hombre), recto en homosexuales y uretra, cuello
de útero y recto (mujer), se realizan en el laboratorio (sensibilidad a medio externo), por la mañana antes
de la primera micción (al ser posible); se procede de inmediato al estudio directo y la siembra en
medios específicos o se transporta en medio TM modificado.
- se realiza la tinción (Gram- en forma de granos de café); en el frotis se ven los pmn con diplococos
dentro; la siembra se hará en AS, agar chocolate, Thayer-Martin (con factores de crecimiento y ATB
vancomicina, anfotericina, colistina y trimetropin que inhibe el crecimiento de otros gérmenes); en TM
los gonococo son colonias pequeñas de color gris y los meningococo son blanquecinas se incuba a 35-37ºC
y atmósfera enriquecida de CO2 5-10%;
- Pruebas bioquímicas => utilización de azucares por vía oxidación (glucosa+, lactosa, maltosa+ para
meningococo, y sacarosa); oxidasa y catalasa son positivos, nitratasa-.
- Pruebas serologícas => hemo-aglutinación, inmunofluorescencia indirecta, ELISA (mas utilizadas)
- Sistema de identificación multiprueba para Neisseria y Haemophylus.
Neisseria saprofitos (Neisseriaceas) - normalmente son flora de oro-faringe/ naso-faringe; son especies
de bajo patogenicidad, aunque a veces implicadas en meningitis y otros; no requieren medios especiales
para su crecimiento.
- Branhamella catharralis / Moraxella catharralis => hoy en día la clasificación es confusa (la
tendencia - dentro de la familia moraxellacea), otros autores tienden a diferenciarla y la clasifican como
familia Branhamellaceae; es Gram-, oxidasa+, catalasa+, nitratasa+ (reducen nitratos a nitritos), no
fermentan azucares, crecen bien en medios generales (AS, agar chocolate y Thayer Martin), son aerobias
o 5% de CO2; flora normal de naso-faringe, pero a veces se aísla como agente causal en septicemias
e infecciones otorrinolaringológicas (sinusitis, otitis).
- Acinetobacter => anteriormente clasificada dentro de la familia Gram- no fermentadoras (pero oxidasa-
=> bacteria inerte) junto con Pseudomonas; actualmente esta incluido dentro de la familia Moraxellaceae;
son microorganismos que pueblan fundamentalmente suelos y aguas y presentes en medios hospitalarios
(infección nosocomial); la especie mas importante => A.calcoaceticus (causan neumonías, infecciones
urinarias y sepsis); crecen en Mac, AS y otros; en AS producen colonias grises con halos de hemólisis,
oxidasa-, catalasa+, son cocobacilos Gram- (se pueden confundir con Neisserias por su tamaño).
- Moraxella => coco-bacilo, Gram-, no fermentador, inmóvil, oxidasa+, catalasa+, difícil de distinguir con
Neisseria; en general los no fermentadores son muy difíciles de distinguir y requiere numerosas
pruebas bioquímicas para etiquetarlos.
Características antigénicas:
- Ag somático / Ag O => es lipo-polisacárido, termo-estables, se encuentra en la pared bacteriana, es
una endo-toxina (la parte polisacárido es muy antigénico y la parte lipídica es inactiva bioquímica-
mente).
- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacárido, es anti-
fagocitarías (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella thyphi).
- Ag flagelar /Ag H => es característico de las cepas móviles, es proteico y responsable de
la acción patógena de la bacteria.
Acción patógena e interés clínico
- Ag somático O, Ag flagelar H y Ag capsular VI (en S.typhi - Ag termolábil con poder protector frente a
los ácidos /ácida gástrica, resistencia y anti-fagocitarías)
- endo-toxina y enterotoxina (efecto irritante y citotóxico sobre el tracto intestinal)
Cuadros clínicos
1. Infecciones entéricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-tifoideas); Las fiebres
tifoideas son transmitidas al hombre vía oral (alimentos crudos, poco hechos, mal conservados y aguas
contaminadas), llega al estomago, resiste la acidez gástrica, pasa al intestino delgado (íleon), penetra por
endocitosis destruyendo parte de las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas son
fagocitadas por macrófagos y transportadas por diferentes vías y provoca bacteriémia => todo sucede en
el periodo de incubación (8-15 días); comienzo brusco de signos y sintomas => los macrófagos les
transportan hacia el bazo, higado y MO, produciendo multiplicación de nuevas salmonellas, volver al
intestino generando placas ulceradas, necrosación de placas de Peyer y en casos mas graves
originar perforación y hemorragias.
Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubación de entre 7-10 dias
con bacteriémia y estado febril que dura varias semanas; no hay perforación intestinal ni hemorragias
ni invasión de salmonellas a otros órganos; cuadros clínicos => dolores de cabeza, fiebres altas,
anorexia, astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 días.
Acción patógena e interés clínico - se debe a la producción de sustancias toxicas, Ags O y
K, plásmidos (facilita la invasión), adhesinas (adherencia a las celulas que invaden), exotoxina con
propiedades cito-toxicas (tipo A - origina necrosis celular, ulceras, hemorragias y perforación), neuro-
toxicas y entero-invasivas (tipo B - adherencia a las celulas del epitelio gastrointestinal); al llegar al
intestino del hombre vía oral (puede resistir el acido gástrico, por la alta cantidad ingerido
y también protegido por los alimentos), ejerce su acción toxica, pasar al colon originando necrosis con
signos y sintomas características (las toxinas de S.disenteriae no suelen pasar a la sangre); cuadros
diarreicos van acompañados de dolor cólico, nausea, vómitos, malestar general y fiebres muy altas
con deposiciones sanguinolentas con moco y pus.
Acción patógena e interés clínico - los cuadros clínicos son variables según el tipo de toxina
que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitarías y resistencia a bactericidas y ATB
(alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de cuadros febriles y diarreicos; otras
cepas tienen un mecanismo de acción análogo al de Shigella con menor gravedad; a veces la entero-
toxina que producen es parecida a la de Vibrio cholerae que causa perdida masiva de agua y electrolitos.
- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotóxica parecida a Shigella => cuadros diarreicos en
brotes epidémicos que afectan a niños y lactantes (E.coli entero-patógena)
- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en niños,
adultos, originándose esporádica-mente brotes epidémicos (diarrea del viajero - E.coli entero-toxígena)
- si forma una entero-toxina citotóxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos graves, hemorragico
esporádicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica)
- si presenta ciertos plásmidos que incrementan su capacidad de invasión => cuadros diarreicos graves
que afectan a niños, adultos con brotes epidémicos en casos aislados (E.coli entero-invasiva)
Las cepas de E.coli se distingue con sueros antigénicos; E.coli también puede provocar infecciones
urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges (meningitis en neonatos).
Yersinia - entero-bacterias muy patógenas para el hombre (Y.pestis - causante la peste bubónica); son
coco-bacilos Gram-, móviles a 25ºC con flagelación perítrica e inmóviles a 37ºC, fermentadores de glucosa
(ONPG variable), capsuladas (Y.pestis) y oxidasa-.
Especies mas importantes - Y.pestis (agente etiológico de la peste bubónica en el hombre) trasmitida a
traves de ratas y pulgas, originando enfermedad grave febril, epidémico de alta mortalidad;
Y.pseudotuberculosis afecta animales y excepcionalmente al hombre; Y.enterocolitica (sacarosa+ en
medio TSI); los 2 últimos afectan mas a animales que al hombre (niños) => originando estados febriles y
diarreicos.
2. Enterobacter => fermentadora rápida de lactosa, produce CO2, produce acetoína de la glucosa (VP+),
citrato+, móvil, ornitina-descarboxilasa+, son comensales de flora intestinal; puede provocar a individuos
debilitados diarreas, infecciones del tracto respiratorio, heridas, etc; especies importantes: E.aerogenes y
E.cloacae.
3. Serratia => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+) y la glucosa, produce acetoína (VP+), móviles,
citrato+, ADNasa+, ornitina-descarboxilasa+, saprofitas del hombre y también en el medio ambiente (agua
y otros líquidos), resistentes a ATB y desinfectantes; provoca infecciones urinarias y sepsis a personas
debilitadas.
4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), móvil, fermenta la glucosa y
VP- RM+, citrato+; son comensales del tubo digestivo del hombre y puede provocar infecciones urinaria,
respiratoria, sepsis, bacteriémias, meningitis a los individuos debilitados; especies importante =>
C.freundii.
5. Klebsiella => inmóviles, fermentadoras tardía de lactosa, utiliza glucosa y produce acetoína (VP+),
citrato+, ureasa+; son comensales del tracto gastrointestinal y vías respiratorias superiores; puede
provocar neumonías, rinitis, infecciones urinarias; especies importante => K.pneumoniae (sub especies
VP+ y VP-) y K.oxytoca (indol+).
6. Hafnia => móviles a 22ºC y inmóviles a 37ºC, fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), citrato+, utiliza
glucosa y produce acetoína (VP+); provoca infecciones hospitalarias.
7. Proteus, Morganella y Providencia => NO fermentan la lactosa, pero si glucosa y produce CO2,
RM+; móviles, TDA+ (diferenciar del resto entero-bacterias), pueblan aguas residuales, el suelo,
materia orgánica y son comensales en la flora intestinal del hombre; pueden provocar infecciones
hospitalarias; especies importantes:
- Proteus mirabilis (indol-, ureasa+, TDA+, SH2+), P.vulgaris (indol+, ureasa+, TDA+)
- M.morganii (ureasa+, indol+, TDA+)
- Providencia rettgeri (ureasa-, indol+, TDA+)
P.mirabilis puede provocar infección urinaria, descompone la urea de la orina que
genera precipitación de sales cálcicas => formación de cálculos renales; también puede provocar
infecciones gastrointestinales, toxinfecciones alimentarias, heridas, etc.
Acción patógena e interés clínico - si el huésped se encuentra debilitado (postoperatorio, tratamiento
inmunosupresores) los saprofitos podrían ser patógenos; las infecciones mas frecuentes =>
- tipo urinario (40% de las infecciones hospitalarias - pacientes sondados, encamados,
intervencionados quirúrgica-mente) provocado por E.coli, P.mirabilis, P.vulgaris, Klebsiella y
Enterobacter, provocando cistitis (de las vías bajas) y pielonefritis (de las vías altas); son infecciones
agudas con fiebre, dolor lumbar, polaquiuria o anuria y disuria; es frecuente en los análisis de orina
piuria, bacteriuria y proteinuria;
- tipo abdominal son poco frecuente => abscesos y peritonitis debido a perforación intestinal.
- tipo respiratorio (20% de las infecciones hospitalarias) afectando vías respiratorias altas, neumonías y
bronco-neumonías (pacientes con afecciones crónicas)
Acción patógena e interés clínico:
- Ag somático O (polisacáridos) se utiliza para su tipación
- Ag flagelar H (no tiene valor para su tipación - común a todas las cepas)
- Exotoxina / entero-toxina proteica (el principal efecto patógeno del cólera - provoca diarrea masiva)
- Adhesina (proteína que tiene afinidad por los azucares) que permite adherirse a la pared intestinal
Para formar cuadros graves es necesario su penetración por vía oral (agua o alimentos contaminados con
el bacilo, p.ej. productos marinos crudos), eludir el medio acido del estomago (sucede cuando se ingieren
>100 millones de gérmenes - en el caso de epidemias donde se encuentra 1 millón/ ml de agua).
Aeromonas - bacilo Gram- no fermentadoras de la misma familia; el especie mas importante Aeromonas
hydrophila; catalasa+ y oxidasa+, VP+, lactosa-, ureasa-, indol+, SH2-, móviles; no son halófilo (a diferencia
de Vibrio) implicadas en procesos diarreicos.
Brucella - bacilos pequeños (coco-bacilos) Gram- inmóviles, aerobios estrictos, algunas crecen mejor
en atmósferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+, oxidasa+, nitratasa+, ureasa+,
sensibles a medios ácidos y se destruyen fácilmente a temperatura de pasteurización.
Acción patógena e interés clínico (Haemophilus influenzae):
- Es capsulada (su capsula esta formada por polisacáridos distintos de A-F) en España es mas frecuente la
del tipo B.
- Posee endo-toxina que es responsable de lesiones en la traquea y bronquios en procesos neumónicos
- Suelen afectar a las vías respiratorias originando neumonías, bronquitis aguda en ancianos y adultos
debilitados.
- Puede producir meningitis en niños de corta edad; se transmite por vía aérea y mas frecuente en
invierno y primavera; comienza como infección de las vías respiratorias altas y posteriormente se
extiende via sangre hasta el sistema nervioso produciendo meningitis purulenta con mortalidad alta sin
tratamiento a tiempo.
- Existe vacuna para H.influenzae tipo B.
Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella pneumophila (el
agente etiológico de la legionelosis / neumónia atípica por Legionella); un coco-bacilo o bacilo Gram-,
aerobio estricto, requiere medios muy específicos para crecer (agar legionella), catalasa+, oxidasa+, en
ocasiones puede presentarse de forma filamentosa; en general son móviles, pero algunas cepas
son inmóviles.
Acción patógena e interés clínico - se transmite vía aérea a partir de aerosoles procedentes de aguas
contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores contaminados con Legionella; tras el
periodo de incubación (+/- 1 semana) se produce fiebres altas, astenia, malestar generalizado, tos,
anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un cuadro típico de una neumónia atípica); se conoce como la
enfermedad de los legionarios; el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque
con el tratamiento preciso suele remitir sin problema.
Bacillus - de la familia Bacillaceae; el genero Bacillus son bacilos esporulados aerobios o anaerobios
facultativos con tamaño entre 1-7 micras Gram+ y en su mayoría móviles; otro genero de la misma familia
es Clostridium son bacilos esporulados y anaerobios estrictos, que origina en su mayoría potentes
exotoxinas responsables de cuadros clínicos graves.
Acción patógena e interés clínico de Corinebacterium diphteriae - el bacilo diftérico llega al hombre
por vía respiratoria a traves de gotitas de saliva (pflugge) u objetos recientemente contaminados
invadiendo la oro-faringe y las amígdalas; desde aquí se extiende, liberando toxinas y enzimas inhibiendo
la síntesis proteica celular, originando necrosis en las celulas epiteliales que invade; este epitelio
necrosado junto con leucocitos y fibrina formara una pseudomembrana que cubre las amígdalas, que
puede llegar a provocar una obstrucción respiratoria si se extiende por la naso-faringe y laringe; tal
pseudomembrana se encuentra fuertemente adherida a las mucosas, de forma que si se intenta arrancar,
originaria al paciente una fuerte hemorragia; en general los signos y sintomas de la difteria suelen ser de
tipo respiratorio; en casos excepcionales, por vía linfática podría pasar a la sangre difundiéndose al resto
del organismo.
La familia Mycobacteriaceae engloba un solo genero Mycobacterium; son pequeños bacilos finos rectos
y a veces incurvados, excepcionalmente pueden encontrarse algo filamentosos; son inmóviles con una
pared típica y característica no encontrada en ninguna otra familia excepto Nocardia (altamente
enriquecida con ácidos micólicos y componentes céreos que se tiñe muy difícilmente - responde a Gram+),
se necesitan colorantes con alta capacidad tintorial para su penetración; una vez teñidos son altamente
resistentes a la decoloración ácida (AAR+ o acido alcohol resistencia positivo) lo que les diferencia del
resto de microorganismos; son muy distribuidos en la naturaleza, pueden ser saprofitos del agua y suelo y
puede provocar infecciones graves al hombre y en ocasiones crónicas como la lepra; necesita gran
cantidad de oxigeno para sobrevivir (aerobias estrictas).
Los micobacterias también se pueden clasificar en función de la producción de pigmentos, de
las morfologías de las colonias y de la velocidad del crecimiento.
Acción patógena e interés clínico
Mycobacterium tuberculosis - responsables de tuberculosis en el hombre
Muy rica en componentes lipídicos en su pared celular dotándole un carácter tintorial especifico AAR+
que servirá para su identificación y clasificación; contiene proteínas que provocan la formacion de Acs
(reacción de la tuberculina /test de Mantoux); es capaz de crecer en el interior de las celulas que
constituyen el sistema retículo endotelial, se multiplican dentro de ellas sin ser destruida; en el frotis de
baciloscopia se puede observar forma cordones microscópicos.
Llega al hombre por inhalación (excepcionalmente por ingestión de alimentos contaminados con
Mycobacterium o a traves de las heridas de la piel); produce una lesión primaria en el pulmón y mas
concretamente a nivel de los alvéolos pulmonares, provocando una intensa reacción inflamatoria que da
lugar a exudación; estos bacilos pueden llegar hasta los vasos linfáticos y de aquí a los ganglios,
retornando a la circulación venosa y originando focos metástasis en distintos órganos; sin tratamiento se
va desarrollando evolucionando hacia una necrosis "caseosa" (parecida a queso de caverna); después de 6
semanas o mas va evolucionando hacia una destrucción y desintegración de las celulas pulmonares con
la formación de una masa solida, homogénea, parecida al queso (caverna tuberculosa); provocara fiebres
mas o menos variables, sudoración por la tarde, adelgazamiento progresivo, tos débil o intensa (a veces
con esputos muco-purulentos) y en fases mas avanzada, hemoptisis; en general cualquier parte del
organismo podría verse afectada a causa de diseminación (gastrointestinales, genito-urinarias,
pericárdicas, etc.)
La vía de entrada es a traves de lesiones en la piel, se propagan a los nervios superficiales próximos,
concretamente a las celulas de Schwam; de aquí propagarse via linfática al sistema venoso y disemina a
otros órganos (lepra lepromatosa); se multiplica mejor en las partes mas frías del organismo (la cara,
extremidades) invadiendo los nervios mas superficiales; el bacilo se multiplica en el interior de
los macrófagos de la piel y las celulas de Schwam, originando inflamación y perdida de sensibilidad; en
estado grave también aparece en órganos mas profundos y su pronostico es mas complicado; su periodo
de incubación es muy difícil de determinar, puede durar muchos años; su periodo de invasión es muy
insidioso, sintomas raros y no asociables a lepra (picor, hormigueo y perdida de sensibilidad en las
manos/pies; a partir de aquí, de forma lenta y progresiva aparecen lesiones cutáneas (maculas
prominentes en extremidades y cara); su periodo durara toda la vida y su evolución mas o menos
grave dependerá del grado de inmunidad del huésped; tto => ATB sistemico.
Actualmente en grandes laboratorios, se utilizan medios de cultivos radiométrico (Bactec TB) de deteccion
mas rapida que contiene liquido de soporte (agar Middlebrook) con ATB para inhibir los
demas gérmenes y el sustrato marcado con un isótopo del carbono C14; las micobacterias al crecer
metabolizan el sustrato y liberan gas CO2 marcado radioactivamente que es
detectada automáticamente por el Bactec y una vez que se ha detectado crecimiento en alguno de los
medios, se realiza la tinción de Ziehl-Neelsen para ver si lo que ha crecido son BAAR o no.
Acción patógena e interés clínico
Gran parte de nocardiosis son infecciones de carácter oportunista; no produce toxinas, pero contiene en
su pared bacteriana alta proporción de lípidos que le confiere una resistencia a los sistemas de defensa
(macrófagos, linfocitos, etc.); tiene capacidad de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos
(macrófagos) como parásito intracelular y solo crece cuando las defensas del individuo se encuentran
bajas; las manifestaciones clínicas mas frecuentes son:
A. Nocardiosis pulmonar - causada sobretodo por Nocardia asteroides que produce lesiones pulmonares
con abscesos, inflamación diseminada semejante a la tuberculosis; pueden surgir áreas de necrosis y
diseminarse por sangre a otros órganos provocando septicemia.
B. Micetomas (lesiones granulomatosas) de carácter crónico originadas en el tejido subcutáneo donde se
producen tumefacción, abscesos y pústulas y/o nódulos que al abrirse presentan exudados sero-
sanguinolentos; generalmente causados por Nocardia brasiliensis y es frecuente en las extremidades
inferiores y superiores; presenta periodos de remisión y es característico de climas tropicales;
Anaerobias - todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con O2 a la
presion atmosférica; presentan un metabolismo anoxibiótico => incapaz de utilizar O2 de
la atmósfera como aceptor final de electrones; en su lugar utilizan sustratos orgánicos como aceptores
finales de electrones (respiración anaeróbica /fermentacion); la presencia de O2 puede ser (1)
bactericida /toxica /letal directa o bacteriostático (crecerán de nuevo cuando las condiciones son
favorables); (2) inhibir ciertos sistemas enzimáticos o la función reguladora primordial del metabolismo
celular; (3) generan producto tóxicos al interaccionar sus componentes propios con O2; los anaerobios
son las bacterias predominantes en la flora normal humana y en algunas partes p.ej. boca o
intestino están en proporción de 1000:1 con respecto a la flora aerobia, por tanto, la mayoría de
la infección que provoca los anaerobios son endógenas; dentro de los anaerobios se distingue =>
anaerobios estrictos y anaerobios aero-tolerantes /microaerofílicos (puede crecer a 2-8% de O2).
Genero Clostridium - bacterias anaerobias esporuladas; son bacilos Gram+, anaerobios estrictos, forman
esporas a nivel terminal o subterminal, presentan flagelación perítrica, móviles, no presentan capsulas
excepto Clostridium perfringes; ampliamente distribuidas en el suelo, agua, etc. y altamente resistente a
medios externos; responsable de infecciones e intoxicaciones muy graves (tétanos, botulismo, gangrena
gaseosa, etc.); las especies mas patógenos actúan mediante la formación de toxina con poder toxico sobre
el huésped; algunos podrían formar parte de la flora normal del hombre y animales.
Acción patógena e interés clínico
A. Clostridium que ejercen acción neuro-toxica sobre las personas (C.tetanii y C.botulinum)
Clostridium tetanii - es un bacilo Gram+ pequeño, formadora de esporas (aspecto de tambor o cerilla),
habitan la tierra y el intestino del hombre y animales; produce 3 toxinas responsables del
cuadro típico del tétanos que son transportadas vía sanguínea o humoral hasta SNC bloqueando
la liberación de neurotransmisores, originan hiperactividad de las neuronas motoras que da lugar a
convulsiones y parálisis espástica o espasmo muscular a nivel periférico; se ve alterado el sistema
muscular variando el ciclo de contracción-relajación de forma que este entra en fase de contracción y no
se recupera (rigidez tetánica / epistótonos).
Para que se produzca el tétanos es necesario una serie de condiciones tales como que el microorganismo
germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida profunda (cortante, punzante,
mordeduras, arañazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras por decubito) o herida superficiales
(rozaduras) se pueden infectar y formar costra que facilita la infección anaerobia; en las condiciones
favorables de anaerobiosis, las esporas de Clostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan
y tras un periodo de incubación (5-7 días), se origina su acción patógena; es rara que se produzca de
forma local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es importante
la detección precoz y medidas profilácticas (vacunación se renueva cada 10 años).
Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, móviles por su flagelación y
presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes sobre las personas que
originan parálisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas ampliamente en el aire, suelo, ciertos
alimentos (conservas, pescados, etc.); si las condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran;
su accion patógena sobre el organismo sera neuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10
nanogramos) de su toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora),
que solo se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30ºC, pH neutro
o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son de carácter proteico y termolábiles
(se destruyen a temperatura 100ºC durante 5 minutos o 70ºC de 30-60 minutos).
El mecanismo de acción de las toxinas botulínicas => a traves de los alimentos contaminados llega esta
neuro-toxina al tubo digestivo del hombre y producirá toxinfección alimentaria inicialmente;
de aquí via sanguínea y linfática llega hasta sistema nervioso periférico donde actúa en las terminaciones
nerviosas, originando parálisis en el musculo esquelético y otras
manifestaciones neurológicas como visión borrosa, fotofobia, sequedad de boca, lengua y faringe,
disfagia, disartria (dificultad al hablar), debilidad de los musculos (flacidez) incluyendo los respiratorios
que puede llegar mortal por fallo respiratorio y arritmias cardíacas (depende de la cantidad de toxina o
del germen); su periodo de incubación en torno 18-36 horas después de la ingestión del alimento
contaminado y los cuadros mas graves se originan en un periodo de incubación inferior a 24 horas.
El mecanismo de acción => tras la vía de entrada (heridas) en condición anaerobiosis adecuadas,
germinan las esporas y proliferan; es frecuente que se contaminen con otro tipo de bacterias aerobias que
consiguen agotar el oxigeno aumentando las condiciones de anaerobiosis, se disminuye el pH
aumentando el acido láctico y facilitando la liberación de las enzimas proteolíticas y sustancias toxicas;
se producirán los efectos lesivos y graves sobre los tejidos extendiéndose a los vecinos, se romperán las
estructuras celulares a nivel de sus membranas, se destruirán las celulas hemáticas, las celulas
endoteliales, las membranas de las celulas musculares originando procesos de dermo-necrosis con daño
tisular (gangrena).
Ademas de provocar la gangrena gaseosa a traves de heridas infectadas, C.perfringes es también el
agente etiológico de una toxo-infección alimentaria producida por la ingestión de carne contaminada
provocando cuadros diarreicos y dolor abdominal leve; existen otros casos mas excepcionales y graves
que da lugar a cuadros diarreicos muy acuosos y sanguinolentos, vómitos y estado de shock producido
por C.difficile.
Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico
- Toma de muestra representativa, adecuada y estéril en medios específicos de transporte anaerobiosis
con sustancias reductoras (bolsas generadoras de CO2) que crean atmósferas sin O2 o en una jeringa sin
aire (tapando la aguja).
- Se hará un examen directo (tinción de Gram) donde se pueden apreciar las formas de esporas (palillos
de tambor); también se puede realizar tinción de esporas.
- Se cultivaran en medios de cultivos específicos como ASA (agar sangre anaerobio); incubación a 37ºC en
48 horas en condición anaerobisis, utilizando una campana con un sobre generador de gas CO2, da lugar
a la liberación de H y CO2; el O2 que existe en el anterior de la campana, se une al H, forman H2O que se
depositan en forma de gotitas en las paredes, también hay que introducir un indicador de anaerobiosis
(una tira reactiva).
- Pruebas bioquímicas => cuando existe crecimiento en el medio anaerobio, se monta directamente el API
en un recipiente/ una caja, también anaerobio.
Bacterias anaerobias no formadoras de esporas - crecen en ambientes de bajo potencial oxido reductor
o ambientes microaerófilos; son ampliamente distribuidos en la naturaleza y muy pocas capaces de
producir cuadros patógenos graves al hombre; gran parte de ellos forman parte de la flora
gastrointestinal, vaginal o bucal del hombre, no ejerciendo efecto patógeno alguno.
Acción patógena e interés clínico
Salvo excepciones, no son relacionados con procesos patógenos y la patogenicidad que pudiera
desencadenar alguno de ellos depende sobre todo de las circunstancias del huésped (oportunistas);
pueden producir infecciones post-quirúrgicas, complicaciones de escaras o ulceras por decubito,
complicaciones de herida en general.
La familia Espiroquetaceas (con interés clínico para el hombre) - Treponema, Borrelia y Leptospira;
corresponden a especies bacterianas cuya morfología es filamentosa, helicoidal o espiral con filamentos
axiales relacionados con su movilidad; presenta una pared celular fina y flexible de lipo-polisacárido y
lipo-proteica donde se encuentran la mayoría de Ags específicos de estas; son Gram- (difícilmente se
tiñe), también se pueden visualizar por el microscopio de contraste de fases; presentan un metabolismo
oxidativo y/o fermentativo (aerobias o anaerobias facultativas); difundidas en las aguas, el suelo y como
agentes comensales en las mucosas del hombre y animales.
Treponema pallidum es la especie mas importante por su difusión cosmopolitana; es el agente causal
de sífilis; no son capaces de vivir fuera del organismo humano, ya que mueren por desecación;
su transmisión es por contacto directo (vía sexual) y si no se detecta a tiempo puede durar toda la vida;
mecanismo de acción:
- Periodo primario de la sífilis => comienza tras un primer contacto con lesiones ricas en treponemas
presentes en las mucosas; periodo de incubación 10-90 días (termino medio de 21 días) aparece en la zona
genital un chancro primario con abundantes treponemas, se van diseminando vía hemática y linfática a
otras localizaciones convirtiendo-se en una enfermedad sistémica; es frecuente su multiplicación en
ganglios próximos a la zona genital originando pequeñas tumoraciones (adenopatias); transcurrido un
tiempo corto de 2-6 semanas estos signos desaparecen espontáneamente y entra en una fase silente.
- Periodo secundario o sífilis florida => surge después de un tiempo entre 2 meses y 2 años de la fase
silente; de forma súbita se produce una espiroquetemia en general muy florida por las manchas en la piel
y en las mucosas, muy ricas en treponemas y altamente infecciosas; también puede surgir
excepcionalmente una forma eruptiva como lesiones en otros órganos, fiebre en
ocasiones, pústulas o pápulas muy ricas en treponemas; este cuadro clínico de carácter sistémico remite a
las pocas semanas (2-6 semanas), volviendo a entrar en una nueva fase de latencia.
- Periodo terciario o sífilis terciaria => surge tras la fase de latencia entre 3-30 años, una forma muy
grave con mal pronostico; el numero de treponemas en sangre es muy escaso y muy abundante en
ganglios, bazo, huesos, sistema nervioso (neuro-sífilis) y aparato cardiovascular; es frecuente
la formación de granulomas, necrosis, gomas, parálisis general progresiva, aneurisma aórtico, etc.
Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamaño con espiras mas amplias e irregulares con
extremos afilados y son móviles; las especies patógenas para el hombre y los animales, originan fiebres
recurrentes endémicas y epidémicas; es microaerofílica con un metabolismo fermentativo; se tiñen con
facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro, pero requiere medios muy específicos; las especies mas
importantes del genero Borrelia, se transmiten por piojos y por garrapatas.
Acción patógena e interés clínico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy cosmopolita, en
ocasiones endémica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura del vector, ya sea garrapata o
piojo, pasan las borrelias a la sangre del huésped, ayudadas por el rascado que provoca el aplastamiento
del piojo /garrapata, que dará lugar a micro-traumas en la piel y facilitan el paso de dichas
borrelias; después de unos 7 días de incubación se originan fiebres, dolores musculares, cefalea,
etc; clínica que dura unos 10 días y luego desaparecer, produciendo posteriormente recurrencias; no es
una enfermedad grave y es fácil de tratar, especialmente con tetraciclinas.
Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y apretadas, con
sus extremos ligeramente incurvados y móviles; se tiñen débilmente con Gram, también se pueden teñir
con Giemsa; su metabolismo es oxidativo (crecimiento aerobio); existe en la naturaleza leptospiras
saprofitas y parásitas; puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el
reservorio son animales, consideradas como zoonosis.
Genero Rickettsia - son parásitos celulares estrictos (porque su dotación enzimática es muy escasa) de
los artrópodos (crecen muy bien en el citoplasma); son coco-bacilos Gram-; producen en el hombre
enfermedades transmitidas por piojos, garrapatas, pulgas y ácaros.
Especies mas importantes de la familia Rickettsiaceae - hay 3 géneros importantes => Rickettsia,
Rochalimaea y Coxiella (Coxiella burnetti es coco-bacilo Gram+ que origina la fiebre Q).
Acción patógena e interés clínico:
(1) Tifus exantemático epidémico - producido por R.prowazekii; mediante la picadura de piojo; tras el
periodo de incubación de 1-2 semanas, aparecen escalofríos, fiebres altas (40ºC), cefaleas, dolores
generalizados, nódulos inflamatorio de los capilares, arteriolas, vénulas, la piel y musculos (dificulta la
corriente sanguínea y en casos graves puede provocar gangrena en las extremidades); es frecuente
la formación de maculas rosadas y posteriormente pápulas y petequiales.
(2) Tifus murino o endémico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga, garrapatas
y ácaros; tras el periodo de incubación de 4-15 días, se produce fiebres altas, cefaleas, artralgias y mialgias
generalizadas con un cuadro clínico leve sin complicaciones ni recidivas como el tifus exantemático.
(3) Fiebres manchadas de las montañas rocosas - producida por R.rickettsii trasmitidas por las
garrapatas; tras el periodo de incubación de 3-6 días, aparecen fiebres altas, mialgias generalizadas y una
mancha negra en la zona de la picadura; en España la especie mas extendidas es R.conorii, el agente de
la fiebre botonosa o exantemática mediterránea, transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del
perro); tras el periodo de incubación de 2-6 días provoca una mancha negra a modo de botón en el lugar
de la picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se suelen
complicar y responden bien al tratamiento.
(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalación de esta u otras (presencia
de artrópodos), la vía de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el periodo de incubación de 3
semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas y cuadro clínico leve.
Genero Chlamydia - se consideran mas próximos a virus que a bacterias; son parásitos intracelulares
estrictos (carecen de mecanismo biosintético auto-suficiente) del hombre y animales; son cocos pequeños
de Gram-, inmóviles; poseen ADN y ARN y su multiplicación es por división binaria (a diferencia de
virus); es capaz de vivir en medios intracelulares durante mucho tiempo sin presentar
una sintomatología clara lo que facilita la cronificación de procesos infecciosos.
Acción patógena e interés clínico - se multiplican en el citoplasma de la célula que parásita,
presentando un ciclo con 2 tipos celulares diferentes:
- En 1er periodo formara una célula densa o corpúsculo elemental con gran resistencia a la sequedad, lo
que permitirá la dispersión de Chlamydia; es la forma infectiva.
- En 2nd periodo formara una célula mas grande de menor densidad o corpúsculo reticulado, que es
responsable de la división binaria y por tanto de crecimiento clamidias.
El proceso del ciclo => la forma infectiva (corpúsculo elemental) penetra en la célula que va a parasitar
ayudado por los Ags específicos, se produce infección celular, se forma una vesícula citoplasmática que
bloqueara los mecanismos de defensa de la propia célula; a partir de aquí este corpúsculo elemental
aumenta su tamaño, su pared se hace mas fina y permeable permitiendo el paso de
complejos enzimáticos, ATP y otras sustancias que van a necesitar de la célula que parasitan; el
citoplasma de la clamidia se hace mas denso y esponjoso y aparece la segunda forma, donde comienza a
multiplicarse por división binaria.
Genero Micoplasma - es uno de los microorganismos mas pequeños existentes en bacteriología y se
caracteriza por no contener pared celular => sensible a la presión omotica del medio (se lisan facilmente),
su morfología es pleomorfismo y resistente a ciertos antibióticos cuya mecanismo de acción se establece
en la pared bacteriana; se dividen por división binaria y vivir de forma independiente y crece bien in
vitro a partir de medios artificiales enriquecidos; se encuentra extendidos en la naturaleza; son
comensales de la mucosa del hombre; existe especies patógenas como Micoplasma pneumoniae que
afecta al aparato respiratorio.
Especies mas importantes - dentro de la familia Micoplasmataceae están los géneros Micoplasma y
Ureaplasma; solo unas 10 especies pueden producir algún efecto patógeno en las membranas celulares
de las mucosas oro-faríngeas y uro-genitales; la mas importante para el hombre es Micoplasma
pneumoniae (produce neumonías); el Ureaplasma urealyticum es otra especie patógeno que se asocia a
ETS junto con el Micoplasma hominis.
Acción patógena e interés clínico
- Su infectividad se relaciona con su adherencia (debido a una glicoproteína especifica) a los epitelios de
las mucosas; su pleomorfismo puede adoptar formas filamentosas y alargadas que aumenta la superficie
de contacto a las estructuras epiteliales a las que se une; una vez adherida, los cilios de las celulas
epiteliales que tapizan la mucosa se paralizan y provoca alteraciones metabólicas en dichas celulas
epiteliales.
- Cuadros clínicos => cuadro pulmonares y mas raramente cuadros genitales o uro-genitales, siendo
Micoplasma pneumonia es mas importante como el agente causal mas frecuente de
las neumonías atípicas.
- En casos excepcionales se han podido aislar Micoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum en procesos
uretrales y genitales como salpingitis, vaginitis, prostatitis, cervicitis, etc. (son casos muy raros)
Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de gaviota (en
cultivos jóvenes); son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar; no fermentan los
carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de muchos animales; en el hombre
se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez
en mayor grado a infecciones extra-intestinales (meningitis, endocarditis, artritis séptica), especialmente
en pacientes con SIDA.
Identificación - los campylobacter termofílicos dan lugar a colonias grises, incoloras, mucosa y
no hemolíticas; se les hace una tinción Gram (bacilos Gram- con forma de S en cultivo joven y en cultivo
viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para observar la movilidad; son oxidasa y
catalasa positivos; para diferenciar entre las especies se puede montar un API o se realizan varias
pruebas => (1) crecimiento a distintas temperaturas, (2) sensibilidad al acido nalidixico y a la cefalotina
(3) hidrólisis del hipurato (se introduce una tableta dentro de un tubo inoculado, dará + si cambia a color
amarillo).
Campylobacter jejuni => crecimiento a 42ºC, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina
Campylobacter coli => crecimiento a 42ºC, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina
Campylobacter fetus => no crecen a 42ºC, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a Cefalotina
Campylobacter laridis => crecimiento a 42ºC, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y Cefalotina
Patogenia y patologia - C.jejuni es la especie con mayor frecuencia se asocia a infeccion en el hombre
(gastroenteritis con eliminación de sangre en heces), se adquiere por via oral (comida y bebidas
contaminadas) o por contacto con animales infectados; sensible a pH gástrico (debe ingerirse
una concentración elevada de ellos para que se produzca infeccion); se multiplica en el intestino delgado,
invade el epitelio y produce inflamación; en ocasiones puede pasar al torrente circulatorio y desarrollarse
un cuadro de fiebre entérica; la diarrea acompañada de dolor abdominal agudo, dolor de cabeza y fiebre;
la infección es autolimitada resolviendose en una semana sin necesidad de ATB; los casos graves se trata
con eritromicina.
Helicobacter Pylori - se aislaron por 1ª vez (1982) del estomago de pacientes con lesiones gástricas y
ulcera péptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran actividad ureasa; se les denomino
Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a Campylobacter pylori y cuando demostraron
que difería morfologicamente del genero Campylobacter, se propuso la creación de un nuevo genero
Helicobacter que se incluyo la especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente
descubrimiento, implicada en procesos de infección gástrica.
Metodos indirectos:
- Prueba de la urea rápida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio con
alta concentración de urea y un indicador de pH.
- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de tiempo se mide
el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se detecta con
un espectrofotómetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un contador de centelleo
(un método diagnostico rápido y no invasivo, pero requiere un equipo especial par al lectura).
- Prueba serología => para detectar Acs utilizando la técnica de ELISA.
Patología - existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en diversas patologías gástricas, pero se
cuestiona como la causa de dichas infección; parece claro que es agente etiológico de gastritis aguda; se
piensa que también pueda tener un papel en la gastritis crónica activa; en las ulceras
pépticas se aísla 100% de pacientes con ulcera duodenal y 77% de ulcera gástrica; parece ser que su
presencia no es suficiente para desarrollar la ulcera; no esta claro el papel que desempeña en la dispepsia
no ulcerosa, en el reflujo gastro-esofágico y en el carcinoma gástrico; hasta 50% de la población adulta de
>60 años es portadora de este microorganismo; se desconoce su modo de transmisión; se ha propuesto
una posible adquisición del mismo por contacto con animales, región periodontal y transmisión persona-
persona (ninguno están demostrados)
Estructura y morfología de los virus - son de tamaño entre 20-25 nm hasta 200-300 nm;
su observación requiere un microscopio electrónico.
- Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayoría de virus ARN tienen
genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los virus ADN suelen
ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core o núcleo) pueden ser moleculas
lineales o circulares únicas o segmentadas en varios fragmentos.
- Estructura de la cápside => su función es de proteger el genoma del medio extracelular y facilitar la
entrada al interior de la célula; están compuestas de subunidades proteicas repetidas (capsómeros) que a
su vez están compuestas de moleculas proteicas (protómeros); según la disposición que adopten
los capsómeros /la cápside, se clasifican en virus de simetría helicoidal (normalmente son virus ARN),
icosaedrica (20 caras triangulares y 12 vértices) y compleja.
- Estructura de la envoltura => los lípidos de la envoltura es lipoprotéica y procede de la
membrana célula infectada, pero las proteínas suelen ser virales desplazados a las proteínas celulares
originales; en algunos casos, las proteínas incluyen una matriz (proteína M) que contacta/ engancha con
la nucleocápside; los virus envueltos tienen estructuras glucoprotéicas (espículas) importantes para los
procesos de adsorción y penetración al interior de la célula.
Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicación varían dependiendo de la estructura del virus y de
su material genómico, pero en general conlleva pasos de => adsorción/ adherirse - penetración -
decapsidación - replicación - ensamblaje - liberación.
- Adsorción => la unión de la partícula viral a la superficie de la célula; no requiere energía y no depende
de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la superficie del virión (proteínas de unión)
y proteínas de la superficie de la membrana de la célula diana (proteínas receptoras); en los virus
envueltos, la proteína de adherencia viral son las espículas de la capa externa de la envoltura.
- Penetración => tras ser adherido, se penetra el virión completo o solo el genoma y las polimerasas
entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3 mecanismos: penetración directa, endocitosis
o fusión; penetración directa => la membrana solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus
sin envuelta p.ej. fagos); endocitosis => los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la
membrana citoplasmática de la célula huésped formándose una vesícula endosómica (mecanismo mas
utilizados de los virus sin envuelta); fusión => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras
de fusión: en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la membrana citoplasmática directamente y
la nucleocápside se libera al interior del citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura viral se
fusiona con la membrana celular formándose una vesícula endosómica que posteriormente libera
la partícula viral hacia el citoplasma.
- Decapsidación => se degrada la cápside viral para que el genoma viral pueda liberarse e iniciar
la transcripción y la traducción; en la mayoría la penetración y la decapsidación se produce a la vez.
- Replicación => es la fase donde se produce la síntesis de todas las macro-moleculas virales;
la célula huésped debe proporcionar la energía y los medios suficientes que a veces puede afectar su
propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es esencial que los ARNm transcriban
la información viral y la replicación de la información genética y que posteriormente mediante los
componentes celulares se traducen para fabricar proteínas que se necesitan.
a. Replicación de virus ADN bicatenario => tras la adsorción y la penetración, el ADN viral es liberado y
penetra en el núcleo + ARN polimerasas celulares => ARNm transcrito y traducido para la síntesis ADN
viral; para el proceso de traducción => ARNm emigra al citoplasma celular y es traducido para formar
las proteínas de la cápside => que posteriormente son transportadas al núcleo para ensamblar
el virión completo que serán liberados por lisis celular; la excepción dará al virus ADN poxvirus (grande y
de simetría compleja) que realiza el proceso de transcripción y traducción en el citoplasma celular
utilizando su propia ARN polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden utilizar ARN de
la célula huésped que se localiza en el núcleo.
c. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN viral penetrado en el citoplasma
de la célula huésped es reconocida de inmediato como ARNm por los ribosomas, los cuales la captan e
inician su traducción a proteínas virales y también un enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA
polimerasa producida + ARN viral (se utiliza como molde) => replicación del ARN viral (todo ocurre en el
citoplasma independientes del ADN del huésped).
d. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-) complementa
el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas sintetizara el ARNm
que después le servirá de molde para la síntesis de nuevo ARN de polaridad (-) y también para
la traducción de sus proteínas utilizando la maquinaria celular.
e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+) que poseen un enzima
transcriptasa de reversión (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa); su genoma ARN + retro-
transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma) retrotranscriptasa => origina ADN bicatenario
que se integran al ADN celular y permanece alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN
integrado se reactiva y es transcrito a ARNm vírico por la polimerasa del huésped y entonces, se completa
el ciclo replicativo.
- Ensamblaje y liberación => se puede producir tanto en el núcleo como en el citoplasma, tras
la replicación del genoma viral y la transcripción de las proteínas virales, los viriones se ensambla y se
libera de la célula huésped; consiste en la unión ordenada del acido nucleico y de las proteínas para
formar la nucleocápside, dando lugar a un virión viable; la liberación de los virus sin envuelta (desnudos)
se produce por lisis celular; en caso de virus envueltos, salen al exterior por gemación de una zona de la
membrana nuclear o citoplasmática (depende si son virus ADN o ARN); la zona de la membrana por
donde se producirá la gemación, adquiere primero las espículas y las proteína de la matriz (codificadas
por el virus), que atrae a la nucleocápside, fusionándose a la membrana, formándose la envuelta
y liberándose el virión al exterior; en caso de poxvirus (mas grandes y complejos), estos pueden sintetizar
sus propias envueltas; en caso de retrovirus, el virus no se libera de la célula sino que se integra en su
genoma y permanecer así largo tiempo o de por vida; el proceso de ensamblaje y liberación es a veces
ineficaz, formándose partículas no infectivas.
Taxonomía vírica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y según su forma del genoma,
tamaño, forma, estructura, sintomatología clínica que producen, tropismo celular, etc; según el tipo de
genoma que contienen y su estructura => se clasifica en virus ARN y virus ADN.
Virus ARN
1. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+) que utiliza su
propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la célula huésped ya que no se
necesita transcribir ARNm) con la excepción de Reoviridae (bicatenarios) que utilizan su propia ARN
polimerasa para transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y son
resistentes al éter.
- Familia Reo-viridae => tamaño intermedio (60-80 nm de diámetro), los únicos bicatenarios; el mas
importante para el hombre es el Rotavirus (provoca problemas diarreicos), tiene forma redonda.
- Familia Calici-viridae => son pequeños (35-39 nm), tienen poca importancia en microbiología clínica; el
mas importante /patógeno para el hombre es el virus de Norwalk (productor de gastroenteritis) y el
virus de Hepatitis E (su inclusión no es definitiva)
- Familia Picorna-viridae => son pequeños (20-30 nm); los géneros mas importantes son los Enterovirus
(>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el virus de la hepatitis A) y los
Rhinovirus (>100 rhinovirus).
3. De simetría helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza su propia
transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en el citoplasma y son
sensibles al éter.
- Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastón; el diámetro del cilindro +/- 70nm con longitud de
175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmática; el genero mas importante es virus de la
rabia.
Virus ADN
a. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - su genoma es ADN bicatenario con excepción de
Parvo-viridae (mono-catenario); todos se ensamblan en el núcleo y son resistentes al éter
- Familia Adeno-viridae => de tamaño mediano 70-90nm; se conocen 34 tipos que afectan al hombre y
mucho de ellos afectan el tracto respiratorio.
- Familia Parvo-viridae => de tamaño muy pequeño 18-26nm con genoma ADN mono-catenario;
la mayoría no tienen importancia clínica, excepto parvovirus B19, pertenece al genero Parvovirus que
causa eritema infeccioso.
- Familia Papova-viridae => son de tamaño pequeños 45-55nm con ADN de tira circular; el genero mas
importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos de papilomavirus humanos (PVH);
los Papovavirus en general producen enfermedades latentes y crónicas y algunos son oncogénicos.
- Familia Irido-viridae => de tamaño grande 130-300nm, sensibles al éter, adquieren su envoltura en la
membrana citoplasmática y también se ensamblan en el citoplasma (a diferencia de otros); no tienen
importancia clínica para el hombre, pero si en veterinaria como el virus de la fiebre porcina africana.
c. De simetría compleja
- Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o ovoide; se
caracteriza como la única familia de virus ADN que se replica y ensambla en el citoplasma, pues
contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina nuclear), de hecho
su replicación es posible en celulas a-nucleadas (sin núcleo); son resistentes al éter y poseen una doble
envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la otra en la membrana citoplasmática; los mas
importante son virus de la viruela, virus de la vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.
1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeños 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta - de polaridad+) -
es una familia importante y una de las que mayor numero de virus presenta, destacando
2 géneros Enterovirus y Rhinovirus.
- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo).
Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de faringe no
indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clínico, y deben descartarse otras causas; por el
contrario si se trata de LCR.
Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 años; consta la
importancia como agente causal de malformaciones congénitas desde la epidemia de 1940 en Australia
(un oftalmólogo australiano constato un elevado numero de cataratas congénitas y ceguera asociados a
esta enfermedad); la infección suele ser benigna y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios
superiores leves, erupción eritematosa y linfadenopatía sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se
puede complicar con artritis transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o
purpura trombocitopénica; muy importante la infección en gestantes por posibles aparición de sordera
neuro-sensitiva, alteraciones cardíacas, cataratas, retraso del crecimiento y sintomas encefalíticos;
la incubación dura 14-21 días; diagnostico por método serológico (técnica de ELISA) para detectar IgG y
sobre todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo indica inmunización frente al virus;
actualmente es poco frecuente debido a la vacuna obligatoria que se incluye en la
triple vírica (paperas, sarampión y rubeola) que se pone a los niños de15 meses (suele dar inmunidad
permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 años (solo las niñas); a los 11 años solo se dan vacuna de
varicela.
Clínica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un eritema maculo
papuloso); es menos llamativo que de la sarampión; dura +/- 3 días y puede haber enantema palatino.
1.5. Familia Retro-viridae (de tamaño grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de polaridad+ - se
ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retro-transcriptasa; a esta familia
pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIH que se estudia aparte.
1.6. Familia Orthomyxo-viridae (de tamaño 80-120nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se
ensamblan en el citoplasma) - en1918 tras la Guerra Mundial, mato mas personas que la propia guerra;
esta compuesta por los distintos tipos de virus influenza/ Gripe (tipo A, B y C).
Virus Influenza /la gripe española (empezó en España) - causan gripe, infección respiratoria aguda
epidémica normalmente durante mes de noviembre-abril; la vía de transmisión es aérea, periodo
de incubación 1-4 días, seguido de clínicas tipo respiratorias superior, mas grave en los ancianos; se
realizan campañas de vacunación todos los años (sobre todo a los ancianos y pacientes bronco-
pulmonares), ya que presentan gran variabilidad antigénica segun el serotipo que causa la epidemia
(tiene gran poder mutagénico); existe 3 tipos => A, B y C (A y B causan epidemias de importancia); los
influenza A se subdividen según la diferente composicion antigénica (en la envoltura) de la
hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico es clínico; recientemente se introduce metodos de
diagnostico de muestras clínicas de antígenos virales; el de mayor importancia clínica es virus
respiratorio sincitial (VRS); para el diagnostico rápido se usa la inmuno-fluerescencia directa en aspirados
naso-faringeos, esputos o biopsia de pulmón; existe un kit con Ags virales para detectarlos.
1.7. Familia Paramyxo-viridae (de tamaño grande 150-300nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y
se ensamblan en el citoplasma) => morfológicamente parecida al de anterior/ Orthomyxoviridae; todos
ellos son causas importantes de enfermedad respiratoria en los niños; se incluyen
3 géneros Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas y parainfluenza), Morbilivirus (virus
del sarampión), Pneumovirus (virus sincitial respiratorio)
Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen infecciones del
tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-traqueobronquitis, el 3 de
bronquiolitis y neumónia en niños (segundo agente después del VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas
suaves; el diagnostico es clínico.
Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante
de neumónia y bronquiolitis en niños y recién nacidos; produce un amplio espectro de infecciones, siendo
la mas frecuente es el resfriado común con abundante rinorrea; VRS es muy contagioso y se manifiesta en
forma de brotes invernales; la inmunidad no es completa por lo que se dan las re-infecciones (mas
suaves); Es importante que la excreción de virus se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los
inmunodeprimidos), por lo que al ingresar un niño en el hospital durante 1 o 2 semanas, puede ser
contagioso todavía (es el agente mas frecuente de infección nosocomial en pediatría); las infecciones
graves se trata con la ribavirina (inhibe la síntesis del ARN viral); el diagnostico rápido es la
inmunofluorescencia en secreciones respiratorias.
Virus del Sarampión - causa una enfermedad aguda, febril, exantemática, de gravedad variable que
afecta a niños de 5-9 años, se contagia por vía respiratoria y conjuntival; sintomas clínico => los
primeros días como un catarro naso-oculo-faringo-laringeo, luego aparece fiebre, cara
rubicunda, congestión de mucosa y a los 3-4 días aparece "manchas Koplik" (manchas blanquecinas
diminutas delante del 1º y 2º molar) dura un par de días; empieza aparecer exantema, primero retro-
auricularmente, despues se extiende a todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en
zonas distales, sube a la fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 días mejora
bruscamente y desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento (dará inmunidad permanente); el
diagnostico es por metodos serológicos.
1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamaño grande en forma de bastón, diámetro 70nm y longitud 175nm -
helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => característica típica de
su morfología es forma de "bala"; el mas importante es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta
con el agua).
Virus de la rabia - causa enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importancia histórica por los
trabajos de Pasteur; existe la obligación de vacunar todos los años a perros y gatos, ya que es una zoonosis
en la que el hombre es un eslabón irrelevante; existen 2 formas epidemiológicas => urbana (lo
adquieren perros y gatos no inmunizados) y salvática (los zorros); normalmente el virus esta presente en
la saliva de animales rabiosos, transmitiéndose por mordeduras (son fuentes de infección humana); el
diagnostico solía realizarse postmortem, mediante la observación de los cuerpos de Negri
(cerebro); también se pueden cultivar en laboratorio; clínica de animales => cambian de carácter, se
vuelven caprichosos, pierden apetito, ingerir objetos no engullibles autllan con ronca, irritabilidad
creciente y muerden a personas y animales; mueren en 2 semanas; clínica de humanos =>
la incubación 1-3 meses depende del lugar de la mordedura; el virus se propaga por los nervios a una
velocidad 1mm/hora; comienza con la alteración del sueño, dolor de la mordedura, también parestesias/
hormigueos de la zona, trastornos respiratorios (en la voz), posteriormente aparece
espasmos faríngeos tras la ingestión de líquidos o solo de verlo (hidrofobia), salivación espumosa y
espasmos en las extremidades (basta con pequeños estímulos de luz o ruidos, para provocar lo); las
personas suelen morir por parálisis en pocas horas tras la afectación de bulbo-raquídeo; el cuadro normal
es de 3-6 días, después mueren.
1.9. Familia Corona-viridae (de tamaño 80-130nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se
ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con proyecciones a modo de pétalos/ corona
solar) en las membranas intra-citoplasmáticas; escasa importancia en patología, únicamente causan el
resfriado común y pueden estar involucrados en cuadros de gastroenteritis.
Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema infeccioso en 1983; es
benigna y afecta niños en edad escolar; presentan una erupción eritematosa en las mejillas (cara
enbofetada) y un exantema en extremidades y tronco (respeta a las palmas, las plantas y los labios); los
adultos son propensos a artropatía asociada, que se resuelve en 2-4 semanas; diagnostico
por método serológico y metodos de ELISA.
2.2. Familia Papova-viridae (de tamaño pequeño 45-55nm - ADN de tira circular - icosaedrico - sin
envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => son unos viruses oncogénicos
(efecto cancerígeno), producen enfermedades latentes y crónicas, causantes verrugas genitales o
condilomas (se asocian a carcinoma de cérvix) y papilomas (Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el
diagnostico es de tipo clínico y serológico; prevención => se vacunan a las niñas de < 14 años.
2.3. Familia Adeno-viridae (de tamaño mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en
el núcleo - resistente al éter) => producen principalmente patología al tracto respiratorio, ocular y
gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en niños <6 años; el diagnostico se
realiza mediante clínicas y técnicas serologícas.
2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamaño pequeño 40-50nm - ADN parcialmente bicatenario -
icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el núcleo - resistentes al éter) => su envuelta se adquiere en la
membrana citoplasmática y se ensamblan en el núcleo; en esta familia se encuentra virus hepatitis B que
se estudiara a parte.
2.5. Familia Herpes-viridae (de tamaño medio +/-100nm - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en
el núcleo - sensibles al éter) => adquiere su envuelta de la membrana nuclear y se ensamblan en
el núcleo; destaca 3 subfamilias => Alphaherpesviridae (VHS 1y2, virus Varicella-Zooster),
Betaherpesviridae (CMV y Roseolovirus), Gammaherpesvirus (VEB/Limphocriptovirus); todos los virus
producen infecciones latentes, capaces de reactivarse.
Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin lesiones que sirven
de fuente de infección para individuos susceptibles (los virus de Herpes no se cura, solo se acantona y se
puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por lesiones por encima de la cintura y suele ser
leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en los genitales, transmitiéndose por vía venérea); cada
individuo tiene un tropismo estable; suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesículas,
costra y desaparece en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secreción oral, infección a nivel peri-
oral, también otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente daran infección genital y se contrae
por vía sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venérea mas frecuente; en mujer
gestante se puede transmitir al bebe vía placenta o canal de parto o en los primeros días de vida; en
general estos virus tienen capacidad oncogénicos como VEB (virus Epstein-Barr), puede
producir cáncer cervical; el diagnostico se realiza mediante la tinción de Giemsa de celulas raspadas de
lesiones herpéticas, para observar las características de las celulas gigantes multi-nucleadas; también se
cultivan en SHELL-VIAL.
Herpesvirus Humano 7 - se descubrió en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos T, provocando
exantema súbito; se investiga si tiene relacion con síndrome de fatiga crónica (que lo padecen sobre todo
mujeres mayores).
2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamaño grande 230-400nm, con
forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el citoplasma; el mas importante es el virus
de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y virus de la Vaccinia;
- Viruela se contagia por inhalación y tras 15 días aparece fiebre, mialgias y erupción pápula vesicular
dura y luego evoluciona a pústulas y a la curación; a veces puede provocar muerte por exantema
hemorragica o una sobre infección bacteriana.
- Virus de la Vaccinia es muy próximo al virus de la viruela; en individuos inmunodeprimidos puede
provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes es auto-limitado; es importante en los
principios de la vacunación (Jennen); últimamente se investiga su utilización como vector para actuar
como vacuna contra virus de Hepatitis B, Herpes simple y VIH, ya que su genoma es susceptible de poder
insertarle secuencias de genes que codifiquen proteínas de otros virus y que
se expresarían posteriormente cuando el virus se replique, con lo cual tendríamos Acs contra estos virus.
Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospechó mucho antes; virus ARN de la familia
Picornaviridae (de pequeño tamaño 20-30nm, icosaédrica, sin envuelta, polaridad+) dentro del género
Enterovirus, el tipo 72; la mayoría de infecciones son aguda sin cronificarse (<1% fulminante); se
encuentra en las heces durante el periodo de incubación (hasta 2 semanas).
Transmisión - se disemina por la ruta fecal-oral (estrecho contacto persona-persona) con la implicación
de agua y alimentos que pueden causar brotes epidémicos; la mayor excreción del virus en heces se da en
las semanas previas a la aparición de la ictericia, sobre todo en la fase tardía de la incubación; otras vías
de transmisión del virus son posibles pero poco probables; existe casos durante todo el año, con un pico
en otoño.
Sintomatología clínica – suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infección es
asintomática y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubación 20-45 días, a continuación
suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o dolor en epigastrio y aumento
de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia.
Diagnostico – requiere la confirmación del laboratorio; se observó el virus por la primera vez por
Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serología basada en la respuesta inmunitaria; el
método más utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su fase aguda; también se pueden detectar Ags
virales en heces (detectar Acs total de IgG y IgM no tiene utilidad clínicamente); IgM suele durar 6 meses;
IgG confiere inmunidad y la mayor parte de nuestra población de >40 años los tienen; hasta la fecha no se
han descrito casos de cronicidad.
Prevención – las medidas más importantes son la higiene personal, lavado y desinfección de manos y
objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente mientras se mantiene las
medidas de desinfección-esterilización, cloración y nivel higiénico-sanitarias; inmunización pasiva => se
dispone una inmunoglobulina eficaz tanto para profilaxis pre-exposición (se estudia la relación coste-
eficacia antes de utilizarla/ solo si viajan a zonas endémicas) como post-exposición; inmunización activa
=> existe una vacuna con buenos resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al año (3x).
Estructura – se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores serológicos:
-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el gen S) que induce
a la formación de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad.
-Ag del core o nucleo-cápside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en sangre pero si su
HBcAc (marcador epidemiológico que se mantiene de por vida); IgM-HBcAc se detecta como marcador
más fiable de hepatitis B aguda.
-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronóstico de la enfermedad, ya que
se correlacionan con el nivel de replicación del virus; HBeAc es un marcador de buena evolución).
-Además se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.
- El virión completo se denomina partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en sangre (como
p.ej. HBsAg).
Infección por VHB – la mayoría son sub-clínicas/ asintomática (50-80%) y solo se detectan en controles
serológicos; la mayoría de las infecciones sintomáticas son auto limitadas y se resuelven en menos de 6
meses (Hep.aguda); la lesión hepática puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (> de 6
meses se pueden cronificar); la sintomatología clínica es similar a la de Hepatitis A; un periodo de
incubación es de 1-6 meses; entre 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por
vida (como portador asintomático o sintomático); en la mayoría de ocasiones la función hepática y la
histología son normales, pero en otras ocasiones dan lugar a síndromes hepatitis crónica persistentes
(HCP) y hepatitis crónica activa (HCA); HCP es menos progresiva que HCA (puede ser más grave y
desembocar en cirrosis).
Epidemiologia – existen áreas hiper-endémicas, endemia media y baja (España está en baja); el único
reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto íntimo (vía sexual, parenteral y
vertical-perinatal) y mediante objetos personales o materiales de hospitales (familiares y personal
sanitario corre un mayor riesgo); la existencia de HCP presenta un reservorio estable para el virus y
asegura su supervivencia indefinida que se detecta en líquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis,
lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordón);
Prevención – es la medida más eficaz para combatir la infección; es un virus muy contagioso cuando hay
exposición parenteral; existe inmunización pasiva (gammaglobulina hiper-inmune eficaz en situaciones
de pre y post-exposición ) y inmunización activa (vacuna de HBsAg que se administra universalmente a 0-
1-6 meses que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).
Virus de la Hepatitis D (VHD) – descubierto en 1977; es un virus ARN incompleto /defectivo que
requiere HBsAg para su replicación (adquieren su envuelta del virus B y si no hay infección de por VHB
no la hay por VHD).
Tipos de infección:
1-Coinfección => infección simultáneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso natural de VHB no se
modifica; al resolverse la infección de VHB, re resuelve también la de VHD; clínicamente la hepatitis es
más grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor (hasta 20%).
2-Sobreinfección => cuando el VHD sobre infecta a portadores crónicos de VHB; aquí si se modifica el
curso natural de VHB y la mayoría de las sobreinfecciones (70%) desembocan en hepatitis crónica y
acaban en cirrosis entre 15-20 años.
El pronóstico de VHD depende de marcadores de replicación del virus (anti-HBe) => puede acabar en
hepatitis crónica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicación => puede evolucionar a la curación.
Virus de la Hepatitis C (VHC) – es de reciente descubierto (1988 - aunque se sospechó desde hace mucho
tiempo) del que quedan aún muchos interrogantes por resolver; en actualidad se sabe que VHC es
responsable del 80-90% de los casos de hepatitis post-transfusional y del 20-50% de los hepatitis
esporádica; es un virus del tamaño medio dentro de la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica
pequeño de tamaño 40-50nm con envuelta, de polaridad+ y sensibles al éter); se distingue regiones para la
envoltura (E), el core (C) y otras no estructurales (NS).
Infección por VHC – se diseminan fundamentalmente por la vía parenteral; es la causa más frecuente de
hepatitis post-transfusional, hepatitis esporádica y ampliamente distribuido entre ADVP (adicto a la droga
de vía parenteral), pacientes en diálisis y hemofílicos; se puede transmitir por contacto sexual o
convivencia con portadores (menor importancia que Hep.B); la clínica es similar a la de la hepatitis B;
25% cursan con ictericia y la tasa de mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado; el inicio no es
muy brusco, es frecuente las recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 20-25% acaban desarrollando
cirrosis.
Prevención – tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todavía no se dispone
inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece, porque la sensibilidad de
las técnicas más utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un accidente en el laboratorio o en la práctica
clínica con sangre anti-VHC+, se debe realizar un protocolo de seguimiento serológico de la persona;
existen evidencias de que VHC puede estar implicada en cáncer hepático.
Virus de la Hepatitis E (VHE) – se descubrió en 1983 y es responsable de la epidemias por transmisión
fecal-oral en India, Paquistán, África del Norte y Méjico (países de baja salubridad); el curso es corto y
parece ser que se puede transmitir parenteralmente, pero no transfusional-mente; el virus todavía no
está catalogado, se parece más a los calcivirus da la familia Calciviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño
pequeño 35-40nm sin envuelta, de polaridad+); clínica => aunque no se cronifica al igual que VHA, tiene
un pronóstico peor (la mortalidad 1-2%), más grave en gestantes del 3º trimestre del embarazo
(mortalidad de 20%); la habitual vía de transmisión es a través del agua de bebida.
Virus de la Hepatitis G (VHG) – se transmite por vía parenteral; esta relacionado con virus de la familia
Flaviviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 40-50nm, con envuelta de polaridad+); provoca
aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una coinfección con el VHB y VHC con mayor tendencia
a la cronicidad.
Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis A – la mayoría de infecciones son aguda sin
cronificarse (<1% se fulmina); se encuentra en las heces durante el periodo de incubación (hasta 2
semanas); su detección con fines diagnósticos no se emplea rutinariamente.
-Ac Anti-VHA IgM => siempre es positivo en el inicio de la sintomatología clínica (hasta 3-6 meses); se usa
como marcador de infección aguda; en Ag viral es detectado solamente en el hígado y no se utiliza para el
diagnóstico.
-Ac Anti-VHA IgG => su presencia demuestra un contacto previo con el virus (se mantiene durante largos
periodos de tiempo).
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):
VHA => anti-VHA IgM
VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM
VHC => anti-VHC (totales)
VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)
Criterios de interpretación en pacientes ADVP – las tasas de seropositividad para VHB (anti-HBc total)
y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los ADVP crónicamente infectados por VHB
(positivos para HBsAg), la seropositividad para VHD (anti-VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es
frecuente que los ADVP se hallen crónicamente infectados por uno o más de dichos agentes en un
episodio de hepatitis aguda, resultando imposible precisar su etiología.
B-Hepatitis Crónica
Marcadores de rutina:
VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)
VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)
VHC => anti-VHC
Criterios de interpretación:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica => es diagnostica de hepatitis B
crónica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infección crónica por ambos VHB y
VHD.
-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crónica => es altamente indicativa de hepatitis C crónica,
aunque no es un diagnostico seguro; la detección de ARN viral en suero mediante PCR ayuda a establecer
el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo descarta, ya que la viremia es intermitente en
muchos casos; dado el alto costo de métodos de confirmación de anti-VHC, se considera que una re
comprobación del resultado positivo mediante un segundo método de cribado (método screening con
técnica de ELISA) que utilice Ags obtenidos por tecnología diferente, es suficiente para establecer la
presencia de anti-VHC en pacientes con hepatitis crónica.
VIH o SIDA
Descubrimiento del virus – se sospechó desde 1981 en 5 casos de neumonía por Pneumocystis carinii en
varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el número de casos y se fue asociando esta
inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de Kaposi; en junio de 1982 se contabilizaron 439 casos y en
EEUU se emite un informe para definir los casos de SIDA; en febrero del mismo año Montagnier expone la
hipótesis de un retrovirus linfotropico pudiera ser el agente causante del síndrome; en Mayo de 1983 se
aislo por primera vez el virus por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linfático de un paciente
con linfadenopatia persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA (HTLV-III).
El virus – es un virus ARN de la familia Retroviridae, subfamilia Lentiviridae (=incubación lenta >10
años) con tipos 1 y 2; esta familia de virus se caracteriza por sintetizar ADN a partir de ARN viral,
mediante una retro-transcriptasa; consta de nucleo-cápside y envoltura; es muy sensible a los agentes
químicos y calor; sus principales genes son:
a) Estructurales:
-Gen GAG (Core) => proteínas 24
-ENV (Envoltura) => glicoproteínas 41, 120 y 160
-POL (Polimerasa) => es importante
b) Reguladores => genes que regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no está completamente
dilucidado
Patogenia – en la infección aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4 gracias a gp41 y
gp120; por lo tanto, sus células diana fundamentalmente son los linfocitos T4 (aunque también se unirá a
los linfocitos B que tiene CD4, a los macrófagos, a las células cerebral, y a los precursores de hematíes);
este episodio se manifiesta como un cuadro pseudogripal; es importante saber que la respuesta
inmunitaria en forma de Acs frente al virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3
semanas); a continuación el ARN se copia a ADN por acción de la transcriptasa inversa, se pone en
circulación y se integra en el ADN de la célula (periodo de latencia); latencia o crecimiento es clave de la
patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga durante periodos largos de
tiempo (2-8 años incluso más), pero en un momento dado puede progresar la enfermedad con un
progresivo deterioro de la inmunidad hasta desarrollar el SIDA; el ciclo biológico se resumen =>
Entrada de virus – transcripción de ARN al ADN – integración en la genoma de T4 – formación de nuevos
viriones tras periodo de latencia (al salir, el virión tomara en su salida parte de la membrana celular para
utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye los T4, se paraliza el sistema inmunológica y acaba
provocando el SIDA.
Epidemiologia – las vías de transmisión del virus => por sangre, sexual y vertical-perinatal; en España la
tasa de transmisión por sangre es importante (el principal grupo afectado son los UDVP/ ADVP y
homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los mas afectados son homosexuales; en cuanto a las
tasas de transmisión madre-hijo oscilan 15-50%, cobrando una especial importancia en África; la
transmisión al personal sanitario o similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido
corporal infeccioso (o también de líquidos donde se haya cultivado al virus).
Sintomatología clínica de SIDA – desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle la
enfermedad, suele transcurrir 6-10 años; el estudio de la evolución de SIDA puede realizarse por las
manifestaciones clínico que van apareciendo o por marcadores bioquímicos (el descenso de la cifra de
linfocitos T4); a partir del 1996 la determinación de la cantidad de virus circulante en la sangre de la
persona infectada (carga viral) se ha convertido en principal marcador de la evolución de la enfermedad.
Fases de la enfermedad
(1) fase de la infección aguda => la mayoría de los pacientes experimentan al cabo de unas 3 semanas de
haber infectado con el virus una serie de síntomas pseudogripales como fiebre, cefalea, eritema,
adenopatías y sensación de mal estar, desaparecen después de 1-2 semanas; durante esta fase, el VIH se
multiplica a gran velocidad; en un primer momento se produce un descenso de la cifra de linfocitos
(total), pero dentro de poco alcanzan las cifras normales en respuesta de una activación del sistema
inmunológico; los individuos son altamente contagiosos durante esta fase;
(2) fase asintomática que puede durar 10 años o incluso mas; durante este periodo, el virus continua
replicándose, causando destrucción progresiva del sistema inmune; durante esta fase, el recuento de los
linfocitos es normal;
(3) fase sintomática precoz, se suele iniciar el desarrollo del síntoma clínico característica de la
enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carácter leve p.ej. de tipo viral => CMV, Herpes
zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestación de parásitos => Pneumocystis carinii,
Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus y Cándida;
(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA (sarcoma de Kaposi)
que además, puede complicarse con un cuadro neurológico (demencia del SIDA) con alteraciones motoras
y del área cognitiva, debido a la acción directa del virus sobre SNC; la supervivencia media de los
pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser 18-125 semanas, dependiendo del tipo de infección que
tenga; en ningún caso habrá supervivencia cuando están en esta fase.
Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH – en España fundamentalmente serológico, por la
importancia y las implicaciones que conlleva; se realiza mediante técnicas de ELISA en primera instancia
(técnica de cribado), aplicando a los positivos, métodos de confirmación => Western Blot (WB),
inmunofluorescencia (IFI) o radioinmuno-precipitacion (RIPA).
**) El Western Blot es más utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas proteínas del virus;
tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados (OMS, CDC, Cruz Roja) y los resultados se
clasifiquen en:
-Positivos => lo más aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y además bandas del
core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.
-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del virus (solo
algunas proteínas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide).
-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas personas se hace un
seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos negativos).
La técnica de WB consiste básicamente en la incubación de unas tiras de nitrocelulosa en los que sean
transferido las proteínas de los virus, básicamente las estructuras con el suero del problema durante un
tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela la presencia de Acs frente a diferente
proteínas del virus mediante diferentes técnicas inmuno-enzimáticas dependiendo del fabricante; el
resultado será la aparición de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira
donde están situadas las proteínas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la
lectura puede hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera
automatizada por densitometría; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500 linfocitos/m3 de
sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3 de sangre; cuando la cifra de CD4
disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de sangre, será indicativo de SIDA.
*) Los métodos de cribado (ELISA) son más sensibles y más específicos, siendo lo más novedoso los de 3ª
generación con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo de ventana.
*) También existen métodos rápidos, aplicables en situación de urgencia como la aglutinación con
partículas de látex o los que utilicen Ags fijados a soportes solidos o membranas (se llama Dot-Blot).
*) Las técnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una técnica con mucho futuro que
presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no están al alcance de la mayor parte de los
laboratorios; una importancia aplicación de estas técnicas es el diagnostico de hijos y madres portadoras
del VIH.
*) De todos modos, el que más se utiliza para un diagnóstico de SIDA es el recuento celular de los
linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN VIROLOGÍA CLÍNICA
b) Microscópia => con la Microscópia óptica solo se puede identificar los cambios celulares (efecto
citopático) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscópia electrónica se puede visualizar el virus
(en laboratorios de experimentación).
c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por ello debemos
preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in vitro mediante
siguientes técnicas:
- cultivo de órganos => las secciones de algunos órganos pueden ser viables varias semanas y nos
permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante secciones de tejido
respiratorio.
- cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensión (cultivar adenovirus en un tejido adenoideo)
- cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociación mecánica y con enzimas proteolíticas a
partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un frasco de cristal o de plástico; las
celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren con medios nutritivos para mantenerlas viables;
en condiciones optimas, las celulas se multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua
de crecimiento sobre las que se podrán replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares:
*) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo vivo; las
celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero de cromosomas, tienen
un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad de virus (p.ej. celulas del riñon de
conejo y mono, embrión de pollo).
*) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somáticas) que se pueden cultivar durante un tiempo
limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de que se mantiene durante mas tiempo
que cultivo primario.
*) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo heteroploide
(numero menor que las celulas somáticas); se originan de tejido maligno o por mutación de
una célula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen presentar aberraciones en el
numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a -70ºC o -90ºC indefinidamente (p.ej. lineas
celulares Hep-2 y Vero).
*) Shell-vial => es una técnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los últimos años y que permite
obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto periodo de tiempo (24-48
horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml de medio de crecimiento, y sobre ello se
coloca 0,2 ml de la muestra problema; el método se basa en la centrifugación (suave) de la muestra sobre
la mono capa, y tras un corto periodo de incubación se pone de manifiesto la expresión de los Ags virales
en la mono capa mediante tinción inmunológica; la ventaja => la rapidez de obtención de resultados en
24-48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infección; tiene una sensibilidad superior
al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de muestra en un área mas pequeña y
mas fácil la observación al microscopio de fluorescencia.
Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no después de los 3-7
primeros días del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4ºC durante 24 horas y si no, se deben
congelar a -70ºC porque muchos virus son lábiles a -20ºC; las muestras que se utilizan con mayor
frecuencia son secreciones nasales, frotis faríngeo, exudado conjuntival, líquidos vesiculares, raspados de
piel, heces, orina, LCR, etc.
d) Detección de los componentes estructurales virales - las técnicas mas usadas que permiten detectar
Ags en suero y líquidos orgánicos (cuando existe una alta concentración viral, sera fácil detectarlos) son:
- Aglutinación en látex => a las moleculas de látex se les une varias moléculas de Acs conocidos y cuando
se pone en contacto con una solución que contiene el Ag (la muestra problema) se origina
una aglutinación que puede visualizarse; es una técnica sencilla, sensible, re-producible y barata. Su
sensibilidad dependerá de la pureza del Ac utilizado.
- Contra-inmunoelectroforesis => esta basada en el principio de que los Ags virales (o bacterianos en su
caso) suelen tener carga (-) y los Acs (+), en medio alcalino; con este fundamento se colocan las soluciones
de Acs conocidos y del Ag problema en unas cavidades realizadas en un gel de agarosa de tal manera que
puedan difundir libremente; se colocan unas mechas en los extremos de la capa de agarosa, que conectan
con unas cubetas que contienen un buffer con una composicion diferente dependiendo del sistema Ag-Ac;
cuando se aplica una corriente eléctrica, las moléculas de Ags con carga (-) migran hacia el ánodo que esta
en el extremo opuesto de la placa; los Acs son arrastrados por el buffer levemente alcalino y, en el punto
en que ambas lineas se encuentran, se forma una banda de precipitación visible; es una técnica de alta
sensibilidad pero laboriosa, que precisa una alta concentración de Ag y Ac.
- Enzimoinmunoensayo => se basa en la detección de Ags mediante el empleo de un Ac unido a una
enzima, que mantiene la capacidad de canalizar la reacción Ag-Ac; el enzima utilizado puede ser
peoxidasa de rabano, Beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina; la presencia del inmuno-complejo es
detectada por una reacción coloreada que se produce al añadir el sustrato; el empleo de enzimas tiene
una serie de ventajas:
*) el enzima se une al Ac pero deja libre los lugares de unión al Ag
*) el enzima no se modifica con la reacción Ag-Ac y queda unido al inmuno-complejo junto con el sustrato
amplificando la reacción y aumentando la posibilidad de detección
*) los conjugados con enzimas son muy estables
*) la lectura de la reacción se realiza en un espectrofotómetro y la cantidad de sustrato liberado es
directamente proporcional a la cantidad de Ag fijado en la reacción
*) la lectura también puede hacerse cualitativamente de forma manual, "de visu".
La reacción tiene lugar en 2 fases => en la 1ª- en unos pocillos sobre los que se ha fijado un Ac especifico;
al agregarle la muestra que puede contener los Ags, se unen formando el complejo Ag-Ac; posteriormente
se hace un lavado para eliminar el resto de Ags no unidos a los Acs de la placa y otras partículas que
pudieran interferir, en la 2ª- se agrega un Ac marcado con un enzima que se une a los sitios de unión del
Ag y al añadirse un sustrato, da lugar a una reacción coloreada, que procederemos a medir en
un espectrofotómetro; es una técnica que necesita varias horas para su realización.
- Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir un enzima al Ac,
se le une un radioisótopo, y lo que se mide en ultima instancia es
la radiactividad que estará en proporción directa a la cantidad de Ag que había en la muestra problema;
es una técnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas costosa y se necesita trabajar con
material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto al personal y las instalaciones; esta técnica se
utilizo por primera vez para detectar el Ag de superficie del virus de la hepatitis B.
- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un portaobjetos, se pone
en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej. isocianato de fluoresceina, rodamina,
europio, etc.); tras un periodo de incubación, se lava para eliminar el exceso de Acs y se observa al
microscopio de luz ultravioleta; esta técnica nos permite demostrar no solo la reacción Ag-Ac,
sino también la localización exacta donde se produce (superficie celular, citoplasma, núcleo...).
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