TESIS DOCTORAL

Cultivo de microalgas en aguas residuales y

aprovechamiento energético de la biomasa algal

Jose Luis Salgueiro Fernández

2018
 AGRADECIMIENTOS
En estas líneas quiero reflejar mi eterno agradecimiento a todas aquellas personas, que de
manera directa o indirecta se han involucrado y me han ayudado a que sea posible la
presentación de mi Tesis.
Agradecer al departamento de Ingeniería Química y a la Estación de Ciencias Marinas de
Toralla (ECIMAT) toda su colaboración y facilidades prestadas.
Me gustaría expresar también mi agradecimiento a los directores de mi Tesis, Mª del Rocío
Maceiras Castro y Ángel Manuel Sánchez Bermúdez, el apoyo, críticas constructivas y
supervisión de la misma. Especialmente a Anxo por su gran calidad humana, que también
me ha brindado la oportunidad de escuchar todos sus consejos.
A mis amigos, a mis hermanas, a mis padres, a mi otra familia y a la que lamentablemente
no está, por toda su paciencia, comprensión y apoyo incondicional.
Y por último, un agradecimiento muy especial a Leti, agradecer todo lo que ha hecho por
mí, pues es una persona que ha ganado el estar en un lugar muy especial en mi vida.

…Gracias a todos…
 RESUMEN
Actualmente, existe una gran preocupación en torno a la utilización de los
combustibles fósiles, pues sus reservas son cada vez más limitadas y su utilización
contribuye a una de las mayores amenazas ambientales, el cambio climático. Esta
problemática ha motivado la búsqueda de nuevas opciones energéticas, entre las que destaca
la bioenergía. La bioenergía consiste en la obtención de combustibles a partir de la
conversión de biomasa. Entre las materias biomásicas disponibles para convertir en energía,
una de las que mayor interés ha suscitado en los últimos tiempos son las microalgas. Estos
microorganismos presentan innumerables ventajas que los hacen idóneos para la obtención
de biocombustibles como el biodiésel. A su vez, el cultivo de microalgas puede ayudar a la
depuración de aguas residuales, pues el agua residual contiene todos los elementos
necesarios para su crecimiento. Por esta razón, la presente investigación ha evaluado tanto
la utilización de cultivos microalgales para la eliminación de nutrientes tales como el fósforo
presentes en las aguas, como la factibilidad de producir biocombustibles a partir de la
biomasa algal generada.
Los diferentes experimentos realizados durante el transcurso de esta tesis doctoral
han sido llevados a cabo empleando dos de las especies algales con mayor potencial del
momento, a la vista de la cantidad de artículos de investigación que sobre ellas se están
publicando, Chorella vulgaris y Pavlova lutheri. La facilidad de cultivo, la adaptabilidad
de las especies a diferentes medios así como su elevado contenido en lípidos han motivado
su elección. Los resultados de la investigación han permitido concluir que ambas especies
son válidas para la obtención de biocombustibles líquidos, como el biodiésel, si bien el
residuo resultante tras el proceso de obtención de éste, todavía posee un gran potencial de
valorización pudiendo ser utilizado para la elaboración de uno de los biocombustibles
sólidos más demandados a día de hoy, los pellets.
Las políticas actuales obligan no sólo a la utilización de procesos
medioambientalmente sostenibles sino que también fomentan el empleo de técnicas
eficientes y económicamente viables. Para lograrlo, en esta investigación se han utilizado
las aguas residuales como un medio alternativo de cultivo de microalgas permitiendo
depurar las mismas a la par que se obtienen los biocombustibles anteriormente citados. Esta
prometedora opción se perfila como una alternativa de gran interés para la paulatina
descarbonización de sectores fuertemente influenciados por los combustibles fósiles como
es el caso del sector transporte, siendo necesario ahondar en el conocimiento y optimización
del proceso descrito en futuras investigaciones.
 ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................9
1.1. ANTECEDENTES ......................................................................................................... 11
1.1.1. Calentamiento global ............................................................................................. 13
1.1.2. Aguas residuales .................................................................................................... 14
1.2. BIOENERGÍA ............................................................................................................... 14
1.2.1. Obtención de energía sostenible a través de microalgas ........................................ 15
1.3. ESPECIES DE MICROALGAS..................................................................................... 18
1.3.1. Clasificación de las microalgas ............................................................................. 19
1.4. CULTIVO DE MICROALGAS ..................................................................................... 20
1.4.1. Medios de cultivo .................................................................................................. 20
1.4.2. Sistemas de cultivo ................................................................................................ 21
1.4.3. Modos de operación .............................................................................................. 23
1.4.4. Parámetros de cultivo ............................................................................................ 23
1.4.5. Crecimiento de las microalgas ............................................................................... 25
1.5. MÉTODOS DE SEPARACIÓN..................................................................................... 27
1.5.1. Centrifugación ....................................................................................................... 28
1.5.2. Filtración ............................................................................................................... 28
1.5.3. Sedimentación ....................................................................................................... 28
1.5.4. Flotación ................................................................................................................ 28
1.5.5. Electrofloculación.................................................................................................. 29
1.5.6. Floculación ............................................................................................................ 29
1.6. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS ........................................................................................ 30
1.6.1. Extracción con disolventes químicos..................................................................... 31
1.6.2. Homogeneización a alta presión ............................................................................ 32
1.6.3. Ultrasonidos........................................................................................................... 33
1.6.4. Molino de bolas ..................................................................................................... 33
1.6.5. Fluidos supercríticos .............................................................................................. 34
1.6.6. Autoclave............................................................................................................... 34
1.6.7. Liofilización .......................................................................................................... 34
1.6.8. Microondas ............................................................................................................ 35
1.6.9. Choque osmótico ................................................................................................... 35
1.6.10. Enzimas ................................................................................................................. 35
1.7. APROVECHAMIENTO ENERGÉTICO DE LA BIOMASA MICROALGAL ............ 37
1.7.1. Biodiésel ................................................................................................................ 38
 Tipos de transesterificación ...................................................................................................... 41

I
  Variables clave en la reacción de transesterificación ...............................................................42
1.7.2. Bioetanol ................................................................................................................ 44
 Pretratamiento...........................................................................................................................44
 Sacarificación o hidrólisis enzimática .......................................................................................47
 Fermentación.............................................................................................................................47
 Destilación y purificación..........................................................................................................48
1.7.3. Pellets ..................................................................................................................... 48
 Molido .......................................................................................................................................49
 Control de humedad ..................................................................................................................49
 Extrusión ...................................................................................................................................49
 Acondicionamiento ....................................................................................................................49
 Empacado ..................................................................................................................................50

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 51
3. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 55
3.1. SELECCIÓN DE LA ESPECIE MICROALGAL.............................................................. 57
3.2. CONDICIONES DE CULTIVO ..................................................................................... 58
3.3. MÉTODOS ANALÍTICOS ............................................................................................ 59
3.3.1. Medición del crecimiento ....................................................................................... 59
 Recuento celular ........................................................................................................................59
 Densidad óptica .........................................................................................................................60
3.3.2. Determinación de la demanda química de oxígeno ................................................ 61
3.3.3. Determinación de fosfatos por espectrofotometría................................................. 62
3.4. SEPARACIÓN DE LAS MICROALGAS DEL MEDIO................................................ 62
 Sedimentación por gravedad .....................................................................................................62
 Floculación química ..................................................................................................................63
 Centrifugado y secado ...............................................................................................................64
3.5. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS ........................................................................................ 64
 Ultrasonidos ..............................................................................................................................64
 Microondas + Ultrasonidos ......................................................................................................65
3.6. TRANSESTERIFICACIÓN ........................................................................................... 65
3.7. PRODUCCIÓN DE PELLETS ....................................................................................... 66
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 69
4.1. ESTRUCTURA DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................. 71
4.2. ARTÍCULO 1: BIOREMEDIATION OF WASTEWATER USING CHLORELLA VULGARIS
MICROALGAE: PHOSPHORUS AND ORGANIC MATTER ..................................................... 73
4.3. ARTÍCULO 2: SEMICONTINUOUS CULTURE OF CHLORELLA VULGARIS MICROALGAE FOR
WASTEWATER TREATMENT ............................................................................................. 79

II
 4.4. ARTÍCULO 3: TOTAL USE OF MICROALGAE AS FEEDSTOCK FOR BIODIESEL AND PELLET
PRODUCTION ................................................................................................................... 87
4.5. ARTÍCULO 4: TOTAL BIONERGY USE FROM PAVLOVA LUTHERI MICROALGAE .................. 95
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 103
6. ARTÍCULOS PUBLICADOS ............................................................................................. 107
6.1. ARTÍCULO 1: BIOREMEDIATION OF WASTEWATER USING CHLORELLA VULGARIS
MICROALGAE: PHOSPHORUS AND ORGANIC MATTER................................................... 109
6.2. ARTÍCULO 2: SEMICONTINUOUS CULTURE OF CHLORELLA VULGARIS MICROALGAE FOR
WASTEWATER TREATMENT .......................................................................................... 117
6.3. ARTÍCULO 3: TOTAL USE OF MICROALGAE AS FEEDSTOCK FOR BIODIESEL AND PELLET
PRODUCTION ................................................................................................................. 127
6.4. ARTÍCULO 4: BIOENERGY USE FROM PAVLOVA LUTHERI MICROALGAE ......................... 137
7. OTRAS PUBLICACIONES ................................................................................................ 149
7.1. ARTÍCULO PENDIENTE DE PUBLICACIÓN ......................................................... 151
 Artículo 5: Biotreatment of sewage using Chlorella vulgaris microalgae .............................. 153
8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 175
9. ANEXO: INDICIOS DE CALIDAD DE LAS PUBLICACIONES ................................. 185

III
Listado de Figuras
Figura 1: Evolución de la demanda energética global ........................................................ 11
Figura 2: Consumo de energía primaria mundial por combustible .................................... 12
Figura 3: Emisiones de gases de efecto invernadero por sector económico en el año 2015
............................................................................................................................................ 13
Figura 4: Posibilidades de aprovechamiento de un cultivo de microalgas ......................... 16
Figura 5: Cultivo de microalgas en sistema abierto (raceway)........................................... 22
Figura 6: Cultivo de microalgas en sistema cerrado (fotobiorreactor del tipo placa plana
y tubular) ............................................................................................................................ 22
Figura 7: Fases de crecimiento y desarrollo de las microalgas .......................................... 25
Figura 8: Cámara de Neubauer mejorada ........................................................................... 26
Figura 9: Rejilla de la cámara de Neubauer mejorada........................................................ 27
Figura 10: Sistema de extracción Soxhlet .......................................................................... 32
Figura 11: Diagrama de homogeneizador de alta presión .................................................. 33
Figura 12: Reacción general de transesterificación ............................................................ 38
Figura 13: Reacciones implicadas en el proceso de transesterificación ............................. 39
Figura 14: Proceso de transesterificación convencional frente “in situ” ............................ 41
Figura 15: Esquema de la metodología realizada ............................................................... 57
Figura 16: Fotografía de la especie Chlorella vulgaris ...................................................... 58
Figura 17: Reactores utilizados para el cultivo de las microalgas: a) matraces Erlenmeyer
y b) fotobiorreactores ......................................................................................................... 59
Figura 18: Barrido espectral entre 600 y 800 nm para la microalga C. vulgaris ............... 61
Figura 19: Extracción por ultrasonidos: a) baño de ultrasonidos y b) filtración a vacío .... 65
Figura 20: Crecimiento de la Chlorella vulgaris en términos de densidad celular ............ 75
Figura 21: Crecimiento de la Chlorella vulgaris en términos de densidad óptica a 680 nm
............................................................................................................................................ 76
Figura 22: Variación de la concentración de fosfatos y curva de crecimiento ................... 77
Figura 23: Variación de la DQO con el tiempo .................................................................. 77
Figura 24: Variación de la concentración de fosfatos con el tiempo .................................. 81
Figura 25: Variación de DQO con el tiempo en los tres tipos de agua residual ................. 83
Figura 26: Crecimiento celular de la especie Chlorella vulgaris a través de los tres tipos
de agua residual mediante cámara de Neubauer mejorada ................................................. 84
Figura 27: Crecimiento celular de la especie Chlorella vulgaris a través de los tres tipos
de agua residual mediante densidad óptica......................................................................... 84
Figura 28: Variación de pH en los diferentes tipos de agua residual utilizados ................. 85
Figura 29: Porcentaje de recuperación de biomasa algal mediante el método de
sedimentación por gravedad a diferentes intervalos: a) durante las 6 primeras horas, b) a
las 24, 48 y 72 h.................................................................................................................. 89

V
Figura 30: Eficiencia de floculación con diferentes floculantes inorgánicos: a) a lo largo
del tiempo b) después de 220 minutos ................................................................................90
Figura 31: Eficiencia de floculación con diferentes floculantes orgánicos: a) a lo largo
del tiempo b) después de 220 minutos ................................................................................91
Figura 32: Porcentaje de recuperación de biomasa mediante el método de sedimentación
por gravedad a diferentes intervalos: a) durante las 6 primeras horas, b) a las 24, 48 y
72 h .....................................................................................................................................97
Figura 33: Eficiencia de floculación para diferentes floculantes: a) floculantes orgánicos,
b) floculantes inorgánicos y c) comparación entre floculantes orgánicos e inorgánicos a
los 220 minutos...................................................................................................................98

VI
Listado de Tablas
Tabla 1: Productos y aplicaciones procedentes del uso de las microalgas ......................... 17
Tabla 2: Ventajas y desventajas de los principales métodos de separación ....................... 30
Tabla 3: Ventajas y desventajas de los principales métodos de extracción de lípidos ....... 36
Tabla 4: Composición del agua residual sintética .............................................................. 58
Tabla 5: Condiciones de cultivo ......................................................................................... 58
Tabla 6: Porcentaje de eliminación de fosfatos y DQO en los tres tipos de aguas
residuales a través de la microalga Chlorella vulgaris ....................................................... 82
Tabla 7: Porcentaje de extracción de lípidos con ultrasonidos y con ultrasonidos asistido
por microondas ................................................................................................................... 92
Tabla 8: Porcentaje de conversión de biodiésel.................................................................. 92
Tabla 9: Análisis de los pellets de Chlorella vulgaris ........................................................ 93
Tabla 10: Requerimientos energéticos para la extracción de aceite por ultrasonidos y por
ultrasonidos + microondas .................................................................................................. 99
Tabla 11: Porcentaje de conversión de biodiésel.............................................................. 100
Tabla 12: Análisis de los pellets de Pavlova lutheri ........................................................ 101
Tabla 13: Análisis de los pellets de Miscanthus + Pavlova lutheri ................................. 101

VII
1. INTRODUCCIÓN
 1.1. ANTECEDENTES
El panorama energético mundial ha venido experimentando una constante evolución en
los últimos años, en cuanto al suministro de energía se refiere. Entre los factores causantes
de dicha situación destaca principalmente el aumento de la población. Según datos
mostrados por World Energy Outlook 2017 [1], se espera, en los próximos 22 años, un
crecimiento del 3,4% por año en la población mundial, es decir, pasar desde los 7400
millones actuales hasta los 9000 millones en 2040, incremento que será especialmente
significativo en países como India o China. Ante la creciente demanda energética y,
teniendo en cuenta que la energía es un pilar fundamental para la sociedad y el desarrollo
económico (agricultura, industria y servicios), es necesario incrementar la capacidad de
suministro, y también buscar nuevas fuentes de energía, a ser posible, sostenibles.
Los datos del World Energy Outlook 2017 muestran además como la demanda
energética mundial se espera que sufra un aumento del 30% hasta el año 2040 [1]. Dicha
demanda tendrá un fuerte crecimiento en áreas geográficas en fase de industrialización y
urbanización como India, países del sudeste asiático, China o en zonas concretas de África,
América Latina y Oriente Medio (Figura 1).

Figura 1: Evolución de la demanda energética global [2]

Analizando en más detalle la expectativa de demanda de energía mundial –por fuentes

primarias– representada en la Figura 2, se puede observar como los combustibles fósiles

11
siguen teniendo un papel predominante. Tal es su importancia, que la suma de todos los
combustibles no fósiles se espera que no alcancen al carbón ni en el año 2050. El gas natural
se prevé que siga siendo la segunda fuente de energía, con un importante aumento de
consumo, con respecto al resto de fuentes de energía, en los años venideros. Sin embargo,
el petróleo seguirá siendo uno de los combustibles más demandado, liderando, con
aproximadamente el 30% de la demanda energética mundial para el año 2040. Pese a los
esfuerzos realizados por los diferentes gobiernos para promover la generación y el uso de
energías renovables serán los combustibles fósiles quienes probablemente satisfarán la
mayor parte de la nueva demanda proyectada hasta el año 2050 [3] .

Figura 2: Consumo de energía primaria mundial por combustible [3]

Al actual ritmo de consumo de combustibles fósiles, y sabiendo que las reservas totales
de petróleo llegaron a 1696,6 billones de barriles en el año 2017, se estima que dichas
reservas se agoten en aproximadamente 50,2 años [2,4]. Ante su evidente naturaleza finita,
es necesario el desarrollo de fuentes de energía alternativas que permitan combatir la actual
crisis energética. Estas fuentes debieran ser más respetuosas con el medio ambiente,
paliando los efectos negativos que ha generado el uso continuado de los combustibles fósiles
en la naturaleza, tales como el cambio climático o la acidificación de los océanos.
Lamentablemente, la sociedad actual no solo se enfrenta a problemas como el calentamiento
global, sino que el creciente aumento de la población urbana ha contribuido a la generación
de enormes cantidades de aguas residuales o residuos provocando el deterioro de los
recursos naturales.

12
 1.1.1. Calentamiento global
El calentamiento global es uno de los problemas mundiales más importantes cuyo
origen se debe principalmente a los gases de efecto invernadero que proceden, en gran
medida, de la producción de la energía y del sector transporte. Así, en el año 2015, la
producción de electricidad y generación de calor representó el 41% de las emisiones
globales [5] y el sector del transporte, aproximadamente el 24% (Figura 3). Los datos
demuestran que alrededor del 95% del transporte es impulsado mediante combustibles
fósiles, pese a que desde hace años se ha fomentado el uso de combustibles alternativos [6].

3%
6%
7% Electricidad y calor
41%
Transporte
19%
Industria
Residencial
24%
Servicios
Otros

Figura 3: Emisiones de gases de efecto invernadero por sector económico en el año 2015 [1]

Además, el último informe de la Agencia Internacional de la Energía (IEA) ha puesto

de manifiesto el incremento de las emisiones globales de dióxido de carbono (CO2), uno de
los principales gases responsables del cambio climático. Durante el año 2017 se ha
registrado un incremento del 1,4% con respecto al año anterior, es decir, un aumento de 460
millones de toneladas, lo que ha dado lugar al máximo histórico de 32,5 GtCO2 debido a
una aceleración en la demanda mundial de energía. Este panorama ha sido bastante
sorprendente puesto que las emisiones habían permanecido estancadas en los últimos 3
años. Concretamente en España, el incremento de las emisiones de CO2 ha sido de un 4,4%
en 2017 [7].

Estos datos evidencian los insuficientes esfuerzos actuales por cumplir con los objetivos
del Acuerdo de París sobre el cambio climático [8]. De modo que esta advertencia implica
la necesidad de promover el desarrollo sostenible, el análisis y la formulación de políticas
energéticas. Ha de prestarse especial atención al sector energético en el cual la energía
representa dos tercios de las emisiones totales de gases de efecto invernadero y el 80% de
CO2. Así, la única posibilidad viable pasaría por disminuir significativamente el empleo de
los combustibles fósiles a favor de las energías renovables, a la par que capturar el carbono
emitido a la atmósfera mediante tecnologías altamente eficientes.

13
 1.1.2. Aguas residuales
El agua es uno de los elementos más abundantes en la Tierra (más del 70% está cubierto
por agua) y además se trata de uno de los recursos naturales más importantes del planeta
puesto que es indispensable para el desarrollo de la vida y el medio ambiente. Sin embargo,
no toda el agua del planeta es apta para el consumo: alrededor del 97,5% es agua salada y,
del 2,5% restante, el 69,7% está congelada en los polos, el 30% es subterránea y el 0,3% se
encuentra en ríos y lagos [9]. Así pues, se trata de un bien escaso y necesario para el
desarrollo humano sostenible del cual se desperdicia una cantidad importante (alrededor del
80% de todas las aguas residuales que se producen son vertidas al medio ambiente sin
ningún tipo de tratamiento [10]). Estas aguas residuales proceden, en su mayoría, de las
diferentes actividades humanas como industria, agricultura, urbanización, etc. Las aguas
residuales, al ser descargadas en los sistemas fluviales sin el tratamiento apropiado, pueden
provocar un enriquecimiento nutricional del ecosistema acuático con la consecuente
aparición del fenómeno de la eutrofización [11]. Entre los principales impactos de dicho
fenómeno destaca la proliferación de algas, la disminución del oxígeno disuelto en agua, el
decrecimiento de la fauna y la aparición de cianotoxinas. Para evitar estos impactos
negativos en el medio, es necesaria la eliminación del nitrógeno y del fósforo presentes en
las aguas residuales (principales causantes). Estos nutrientes pueden ser eliminados
mediante diferentes tratamientos, siendo los más empleados los tratamientos físicos y
químicos. El elevado coste asociado ha provocado que, en la actualidad, se investiguen
alternativas más eficientes en precio y efectividad.
La solución a la escasez de reservas de combustibles fósiles, al calentamiento global y
al tratamiento de las aguas residuales podría residir en el desarrollo de tecnologías
renovables que permitan reducir las emisiones de CO2, disminuir los contaminantes de las
aguas residuales y producir energía.
1.2. BIOENERGÍA
Una de las fuentes de energía renovable más utilizadas a nivel mundial es la bioenergía.
Ésta se puede definir como la energía procedente de la biomasa o de fuentes biológicas
como son los biocombustibles, la leña, el carbón, etc. El uso de esta energía se ha ido
incrementando poco a poco para satisfacer la demanda energética de ciertos países puesto
que suponen una alternativa viable para poder alcanzar los objetivos a nivel
medioambiental.
Por tanto, en respuesta a los desafíos anteriormente planteados, se han adoptado en todo
el mundo nuevas políticas con el objetivo de estimular y promover la investigación en el
campo de la bioenergía [12]. Esta alternativa, basada en la conversión de productos de base
biológica en productos energéticos finales, podría satisfacer entre un cuarto y un tercio del
suministro global de energía primaria para el año 2050 [13]. La producción de bioenergía
contribuiría, de manera significativa, a la reducción de los gases de efecto invernadero y a
14
la seguridad energética, ya que supondría una energía alternativa sostenible. La utilización
de la biomasa como fuente de energía renovable podría suponer el reemplazo de los
combustibles fósiles utilizados en todos los mercados de la energía, es decir, en la
generación de calor, transporte y generación de electricidad a un precio competitivo. Como
resultado, la producción de biocombustibles ha aumentado de forma importante en los
últimos años. Numerosos estudios han demostrado que éstos podrían satisfacer el 30% de
la demanda global de combustibles [14], por lo que se espera que desempeñen un importante
papel en el futuro.
Entre la producción de combustibles líquidos renovables, destacan el biodiésel y el
bioetanol como los candidatos potenciales para reemplazar a sus predecesores de origen
fósil (diésel y gasolina). Estos biocombustibles son de vital importancia debido a que el
sector del transporte es el que genera mayor atención. Desde hace años se están utilizando
tecnologías relativamente simples para la fabricación de estos biocombustibles de primera
generación, comercializados y establecidos en EEUU, Brasil y la Unión Europea; sin
embargo, su uso implica la utilización de cultivos alimentarios. Se estima que entre los años
2013 y 2015, el 77% del bioetanol fue obtenido a base de maíz y el 81% del biodiésel a
partir de aceites vegetales [15].
Con el objetivo de no recurrir a cultivos alimentarios se desarrollaron los
biocombustibles de segunda generación, que se obtienen principalmente de biomasa sin
fines alimentarios. Este tipo de biocombustibles proceden principalmente de residuos
agrícolas, forestales y cultivos no destinados a la alimentación humana, mostrando un
elevado potencial para la sustitución de los combustibles de primera generación. Sin
embargo, su producción implica procesos de conversión menos rentables [16]. A fin de
mejorar la rentabilidad de los mismos, en los últimos años se han venido desarrollando los
conocidos como biocombustibles de tercera generación. Este tipo de biocarburantes son
obtenidos a partir de especies no comestibles o desechos empleando biotecnología, lo que
mejora de manera considerable la transformación de biomasa en biocombustible. Dentro de
ellos adquieren un especial protagonismo las microalgas, quienes suponen una fuente ideal
para la obtención de bioenergía. Estos microorganismos no compiten con otro tipo de
cultivos y presentan una serie de ventajas que las hace idóneas para este propósito.
Diferentes estudios han demostrado una evolución positiva en la utilización de esta materia
prima para la obtención de biocombustibles como el biodiésel, bioetanol, biohidrógeno, bio-
aceite y biogás [17].
1.2.1. Obtención de energía sostenible a través de microalgas
En la última década, la investigación de los cultivos microalgales ha aumentado
notablemente debido a su elevado potencial (rápido crecimiento, alto contenido en lípidos,
posibilidad de cultivo en diferentes hábitats, etc). Estas valiosas propiedades podrían
permitir el uso de las mismas para soluciones con fines energéticos como por ejemplo la

15
producción de biocombustibles, su uso en el tratamiento de aguas residuales o su aplicación
con fines comerciales mediante la obtención de productos de alto valor añadido tales como
productos destinados a la nutrición, salud humana, cosmética, etc. En la Figura 4 se
muestran las distintas opciones de aprovechamiento de la biomasa algal, que combinados
adecuadamente, dan como resultado sistemas altamente eficaces y sostenibles.

Figura 4: Posibilidades de aprovechamiento de un cultivo de microalgas

La enorme versatilidad mostrada por las microalgas y la variedad en las posibilidades

de cultivo y aprovechamiento de la biomasa algal, como se muestra en la (Tabla 1), ha
suscitado un gran interés entre la comunidad científica. De las diferentes posibilidades de
uso y valorización, la presente investigación se ha centrado en el cultivo de las microalgas
como sistema biológico para la depuración de aguas residuales. La utilización de estas aguas
como medio de cultivo favorece no sólo la viabilidad económica de dicho proceso, sino que
también ofrece beneficios ambientales derivados de la eliminación de nutrientes. Por otro
lado, se ha contemplado el aprovechamiento de la biomasa resultante como materia prima
para la producción de biocombustibles. La obtención de éstos a partir de microalgas,
presenta una serie de ventajas sobre los biocombustibles de primera y segunda generación

16
como son una mayor productividad por unidad de superficie, rápida reproducción,
obtención de biomasa de manera continua, etc [18].
Tabla 1: Productos y aplicaciones procedentes del uso de las microalgas [19]
COMPUESTO
Pigmentos (clorofila a y b,
luteína, astaxantina,
β-caroteno, ficobilinas,
cicocianina)
Lípidos (hidrocarburos,
triacilgliceroles, ácidos
grasos poliinsaturados)
Aminoácidos (leucina,
asparagina, glutamina,
cisteína, arginina,
aspartato, alanina, glicina,
lisina, valina, etc)
Carbohidratos (b1-3-
glucano, amilosa, almidón,
celulosa, alginatos,
laminares, etc)
Vitaminas y minerales
(vitaminas B1, B2, B6, B12,
C y E; biotina, ácido fólico,
magnesio, calcio, fosfato,
yodo, etc)
Polímeros
(polihidroxialcanoatos,
poliestireno expandido)
USO
Pigmentación, cosméticos,
alimentos y aditivos para
piensos, productos farmacéuticos Dunaliella salina
Biocombustibles, alimentos y
aditivos para piensos
Aditivos para alimentos y
piensos, suplementos para la
salud
Biocombustibles, aplicaciones
terapéuticas
Alimentos y suplementos
alimenticios
Aplicaciones médicas e
industriales
17
ESPECIES
MICROALGAS
Aphanizomenon flos-aquae
Chlorella sorokiniana
Chlorella zofingiensis
Chlorella vulgaris
Haematococcus pluvialis
Spirulina platensis
Botroycoccus braunii
Cyanophora paradoxa
Glaucocystis
nostochinearum
Nannochloropsis salina
Neochloris oleoabundans
Phaeodactylum tricornutum
Rhodomonas salina
Scenedesmus sp.
Schizochytrium mangrovei
Chlorella ellipsoidea
Euglena gracilis
Nannochloropsis oculata
Porphyridium cruentum
Rhodomonas salina
Spirulina platensis
Isochrysis galbana
Porphyridium cruentum
Spirogyra sp.
Dunaliella tertiolecta
Isochrysis galbana
Nannochloropsis oculata
Spirulina platensis
Tetraselmis suecica
Aulosira fertilissima
Anacystis nidulans
(Synechococcus)
Chlorella vulgaris
Gyrodinium impudicum
Rhodella reticulata
Nostoc muscorum
Porphyridium sp.
Scenedesmus acuminatus
Spirulina platensis
Synechocystis sp.

COMPUESTO
Fitoesteroles (crinosterol,
estigmasterol
isofucosterol, sitosterol,
fucosterol, dinosterol, etc)
Fenoles (gálico, cafeico,
salicílico, p-cumárico y
ácido ferúlico)
Toxinas (ciguatoxina, ácido
domoico, ácido ocadaico,
ácido gambierico, etc)
ESPECIES
USO
MICROALGAS
Dunaliella tertiolecta
Crypthecodinium cohnii
Complementos alimenticios,
Isochrysis galbana
aplicaciones farmacéuticas
Nannochloropis gaditana
Pavlova lutheri
Tetraselmis suecica
Chlorella sorokinia
Chlorella vulgaris
Dunaliella salina
Desmodesmus bicellularis
Productos cosméticos Desmodesmus communis
Nannochloropsis salina
Nannochloropsis limnetica,
Phaeodactylum
tricornuotom
Alexandrium lusitanicum
Aplicaciones para la salud Nitzschia pungens
Gambierdiscus toxicus

1.3. ESPECIES DE MICROALGAS

Las plantas tienen la capacidad de aprovechar la energía solar en forma de energía
química a través del proceso de fotosíntesis para que después quede almacenada en sus
estructuras biológicas. En el proceso de fotosíntesis, se capturan grandes cantidades de CO2
de la atmósfera con la consecuente producción de oxígeno. Sin embargo, las microalgas, al
poseer una estructura diferente, tienen una mayor eficiencia fotosintética, en torno a 10-50
veces superior a las plantas terrestres, por lo que ayudan a reducir de manera considerable
la concentración de CO2 de la atmósfera [20]. Asimismo, pueden colonizar diversos hábitats
(aguas marinas, dulces y residuales) y los factores de crecimiento de sus poblaciones
(iluminación, temperatura, salinidad, aireación, pH, etc) tienen un amplio rango de
variabilidad. Cabe también destacar que, en función de las condiciones ambientales y el
medio de cultivo utilizado, la composición de las microalgas (contenido de lípidos,
carbohidratos y proteínas) puede variar y, por tanto, puede ser manipulada durante el
proceso de cultivo.
El interés en el uso de las microalgas para la obtención de bioenergía ha ido aumentado
en los últimos años ya que poseen una serie de cualidades, que las hacen ideales en el
desarrollo biotecnológico, entre las que destacan:

 Elevadas tasas de crecimiento y producción de biomasa.

 No compiten en la producción del sector alimentario.
 Capacidad de absorción de CO2 de la atmósfera.
 Excelente adaptación a diferentes medios de cultivo no aptos incluso para cultivos
agrícolas.
18
  Su producción se puede realizar a lo largo de todo el año.
 Potencial para ser utilizadas en la elaboración de biocombustibles como el
bioetanol, biodiésel o biogás.
 Capacidad de depuración de aguas residuales.

1.3.1. Clasificación de las microalgas

La clasificación de las microalgas ha sufrido diferentes cambios a lo largo del tiempo y
a día de hoy aún no existe un esquema aceptado por todos los ficólogos. Se pueden clasificar
en diferentes clases, pero, principalmente, se dividen teniendo en cuenta su estructura
celular, pigmentación, ciclo de vida, naturaleza química de los compuestos de
almacenamiento y tipo de pared celular. Teniendo en cuenta estos parámetros se pueden
clasificar de la siguiente manera [21]:

 Procariotas: las microalgas procariotas o cianobacterias se caracterizan por carecer

de organelos limitados por una membrana y tener los ribosomas más pequeños. Son
organismos planctónicos sin motilidad propia, con diferencias morfológicas entre
sí y suelen presentarse en medios extremos.
 Eucariotas: las microalgas pertenecientes a esta clasificación poseen una pared
celular compuesta por una capa microfibrilar de celulosa que puede estar rodeada
de otra capa amorfa. Dentro de esta clasificación destacan las clorofitas o algas
verdes cuyo color se debe a la clorofila, los carotenoides y las xantofilas.
Sin embargo, aunque las microalgas son un grupo muy diverso de organismos
fotosintéticos unicelulares eucariotas y procariotas adaptadas a diferentes hábitats como
aguas marinas, dulces, residuales y salobres, se pueden clasificar a su vez atendiendo a su
alimentación. Dentro de esta clasificación se tienen especies que generalmente obtienen la
energía de la luz solar salvo algunas excepciones que son capaces de crecer empleando
materia orgánica como fuente de energía o de carbono. Por tanto, hay que hacer la siguiente
diferenciación en cuanto a su modo de alimentación, distinguiendo entre [22,23]:

 Fotoautótrofas: corresponde a las microalgas que obtienen la energía del sol y el

carbono de los compuestos inorgánicos.
 Fotoheterótrofas: las microalgas fotoheterótrofas obtienen la energía del sol y
emplean los compuestos orgánicos como fuente de carbono.
 Mixotróficas: se denominan microalgas mixotróficas cuando tienen un crecimiento
tanto en condiciones autótrofas como heterótrofas, es decir, la fuente energía sería
tanto la luz como la materia orgánica y el carbono es obtenido a través de los
compuestos orgánicos y del CO2. Las microalgas Spirulina platensis o la
Chlamydomonas reinhardtii mostrarían crecimiento bajo estas condiciones.
 Heterótrofas: este tipo de microalgas utilizan los compuestos orgánicos para
obtener tanto la energía como la fuente de carbono, lo que les permite desarrollarse
19
 en ausencia de luz. Un ejemplo de este tipo de comportamiento sería la especie
Chlorella protothecoides.

1.4. CULTIVO DE MICROALGAS

Aunque el cultivo de microalgas no ofrece una gran dificultad requiere una serie de
factores que deben ser tenidos en cuenta pues se trata de organismos vivos que deben ser
considerados, evaluados y determinados. La existencia de una gran variedad de especies
implica que dichos factores deben ser optimizados a la especie concreta a cultivar y de esta
manera obtener la mayor productividad posible. A continuación, se muestran algunos de los
factores más importantes a tener en consideración para el cultivo de microalgas.
1.4.1. Medios de cultivo
Uno de los mayores costes asociados a la producción de las microalgas es el medio de
cultivo. El medio de cultivo contribuye a que las microalgas se puedan desarrollar y
mantener, de manera que su selección es esencial para obtener la máxima producción con
los mínimos costes. Esto supone un problema sobre todo en aquellas zonas donde existe una
escasez de agua o donde es necesario un bombeo constante de las reservas de aguas
subterráneas.
Otra variable que debe ser considerada durante el cultivo es la composición química del
medio acuático, puesto que la asimilación de los nutrientes inorgánicos constituye la
alimentación de las microalgas y, por tanto, limitan su desarrollo. Éstos pueden ser divididos
en macronutrientes y micronutrientes. Los macronutrientes, son compuestos de nitrógeno,
fósforo, silicio y azufre, requeridos en grandes cantidades, con un papel fundamental en la
estructura celular. En cambio, los micronutrientes son requeridos en bajas concentraciones
y su función es metabólica, específica de la fisiología. En base a ello, es importante destacar
que cuando se cultivan las microalgas en un entorno artificial es necesario el aporte de los
principales nutrientes de forma constante. Sin embargo, el fósforo, uno de los nutrientes
esenciales, que también es utilizado como fertilizante en la agricultura, se encuentra
disponible en depósitos cada vez más limitados debido al agotamiento de las reservas
actuales. Su escasez y las legislaciones de descarga más restrictivas han llevado al desarrollo
de técnicas de recuperación de este elemento esencial [24].
Entre las posibles opciones para el cultivo artificial de las microalgas, la utilización de
las aguas residuales como medio de crecimiento, empieza a ser considerado como un medio
prometedor ya que estas aguas contienen todos los elementos indispensables para el
crecimiento de microalgas, en altas concentraciones, lo que permite su mejor desarrollo y
la disminución los costes de su producción, entre un 10 y 30% [25].

20
  Agua residual como medio potencial
Los grandes volúmenes de aguas residuales procedentes de la agricultura, industria y
población hacen que cada vez cobre más importancia el tratamiento de las mismas. Su
descarga en medios acuáticos puede ocasionar graves problemas de contaminación
ambiental en la flora y fauna del entorno si el tratamiento realizado no es el adecuado o
si las aguas descargadas en ellos tienen un alto contenido en materia orgánica, superior
a la que el ecosistema es capaz de absorber y neutralizar. Asimismo, se ha de tener en
cuenta que, dichas aguas son excelentes transmisores de una multitud de enfermedades
tales como cólera, diarrea, tifoidea o fiebres entéricas pudiendo provocar graves
problemas de salud.
Con el paso de los años se han incrementado el número de tratamientos físicos y
químicos desarrollados y destinados a la depuración de las aguas residuales. Entre ellos,
los procesos biológicos han resultado ser los más económicos y respetuosos con el
medio ambiente [26]. En este contexto, la biorremediación es una de las tecnologías
emergentes que mayor interés ha despertado. Concretamente destaca el uso de las
microalgas, ya que éstas poseen una alta capacidad de eliminación de nutrientes –que
son necesarios para su crecimiento– lo que se puede plantear como una alternativa
eficaz para aquellas plantas de tratamiento que utilizan técnicas convencionales. El
principio de funcionamiento es sencillo, el agua residual es utilizada como medio de
cultivo para las microalgas, las cuales captan los nutrientes presentes (principalmente
nitrógeno y fósforo), mejorando la calidad del efluente a la par que se produce una
transformación de los nutrientes en biomasa con un alto potencial de valorización en
forma de diversos productos. Por tanto, esta aplicación se podría presentar como una
posible solución a los problemas de contaminación y eutrofización anteriormente
citados.
1.4.2. Sistemas de cultivo
En base al interés biotecnológico que han despertado estos microorganismos, el primer
paso para su desarrollo es su cultivo. Hoy en día, la producción de microalgas se puede
lograr principalmente por medio de dos modelos de cultivo: los sistemas abiertos, en el que
los cultivos están expuestos a la atmósfera, y los sistemas cerrados, los cuales están aislados.
Los sistemas abiertos consisten generalmente en estanques –raceways– poco profundos
(aproximadamente de 0,25 a 0,4 m) [27], en los que la luz puede penetrar de forma más
uniforme por todo el cultivo. Estos dispositivos están provistos de agitación mecánica a
través de paletas rotatorias, lo que permiten una correcta homogenización del cultivo
además de evitar su sedimentación. Este tipo de sistemas son los más utilizados a nivel
comercial para obtener grandes cantidades de biomasa microalgal (Figura 5). Su éxito radica
en la facilidad de construcción, pudiendo emplearse materiales como hormigón, plásticos o
cerámica, en la relativa facilidad de operación y mantenimiento y en el bajo coste de
21
inversión. En cuanto a sus desventajas, se puede destacar que tienen una baja productividad
por unidad de área, casi no ofrecen control sobre el cultivo y están notablemente más
expuestos a la presencia de contaminantes.

Figura 5: Cultivo de microalgas en sistema abierto (raceway)

En contraste a los sistemas abiertos se encuentran los sistemas cerrados, como son los
fotobioreactores, cuyo diseño se ha realizado de forma que supere algunas de las principales
limitaciones de los sistemas abiertos, como por ejemplo las pérdidas por evaporación, riesgo
de contaminación o las pérdidas de CO2. Los fotobiorreactores permiten un control más
exhaustivo de las condiciones de cultivo al disponer de sistemas de regulación y control de
los parámetros más importantes de crecimiento (tasa de aireación, inyección de dióxido de
carbono, etc). Respecto a su diseño hay que destacar que existen numerosas variedades, si
bien, en la última década, han sido los fotobioreactores tubulares y de placas planas (Figura
6) los que han suscitado mayor interés ya que permiten cultivos con alta densidad celular (3
veces mayor en comparación con los sistemas abiertos) [28].

Figura 6: Cultivo de microalgas en sistema cerrado (fotobiorreactor del tipo placa plana y tubular)

22
 1.4.3. Modos de operación
A continuación, se presentan los modos de operación de los diferentes sistemas de
cultivo de microalgas:

 Semicontinuo:
La aplicación del sistema semicontinuo de cultivo permite que las microalgas
puedan crecer hasta la concentración que se desea cada cierto periodo de cultivo,
de modo que, a cada intervalo de tiempo regular, se realiza una cosecha parcial y se
devuelve la misma cantidad extraída en medio de cultivo fresco. Así, la cantidad de
biomasa algal que permanece en el reactor actúa de inóculo para la siguiente
cosecha.

 Discontinuo o “Batch”:
Este sistema se caracteriza por realizar una cosecha completa hasta la concentración
máxima, es decir, el cultivo de microalgas va atravesando las distintas fases de
crecimiento con ajuste a una función logarítmica, hasta que finalmente es recogido.
Mediante este sistema es posible estudiar en profundidad las cinéticas de
crecimiento y factores que inciden en el crecimiento microalgal.

 Continuo:
Las microalgas cultivadas de esta forma son cosechadas en continuo, por lo que
disponen de una alimentación constante del medio nutritivo, permitiendo que el
cultivo tenga un crecimiento exponencial continuo. Esto es posible balanceando los
requerimientos que estimulan el crecimiento de las células con los que contribuyen
a la pérdida celular de forma que la concentración de biomasa microalgal en la
corriente de salida es mayor que en la de entrada.
1.4.4. Parámetros de cultivo

 Temperatura:
Durante el cultivo de las microalgas, la temperatura es un factor importante que es
necesario controlar constantemente, puesto que puede afectar a la composición
bioquímica de las células y a la cantidad de lípidos [29]. Por tanto, es necesario
establecer un intervalo de temperatura óptima, entre 16 y 27 ºC dependiendo de la
especie de microalga, para que la tasa de crecimiento sea elevada. También debe
ser tenido en cuenta que, tanto por debajo de la temperatura mínima como si se
supera la temperatura máxima, no sería posible su crecimiento, pues pueden
aparecer daños irreversibles en algunas proteínas. Dependiendo de la especie a
cultivar, este intervalo de temperatura puede ser ligeramente modificado, existiendo
especies mucho más tolerantes a este factor que otras.
23
 Iluminación
Otro de los parámetros determinantes en el crecimiento de las microalgas y que
debe ser considerado es la iluminación, tanto a nivel de intensidad lumínica, es
decir, el flujo de luz por unidad de área, como por el fotoperiodo, que
correspondería a la relación entre las horas de luz y de oscuridad durante las cuales
las microalgas son irradiadas.
Las microalgas utilizan solo la luz de un determinado intervalo conocido como
radiación fotosintética activa (PAR) y que corresponde a una longitud de onda
comprendida entre 300 y 700 nm, lo que supone el 40% de la radiación total del sol
para hacer la fotosíntesis. Su importancia radica en que el crecimiento de los
microorganismos fotosintéticos es proporcional a la intensidad de luz recibida,
siempre que se sitúe por debajo de un valor máximo, pues si se supera dicho valor,
los sistemas fotosintéticos receptores se dañarían y la fotosíntesis se inhibiría
(fotoinhibición). Este valor máximo es característico de cada especie de microalga
y en el caso de la Chlorella sus valores generalmente están comprendidos entre 85
y 400 µEm-2s-1 [30]. Respecto a los fotoperiodos, se suelen utilizar ciclos que van
desde 12:12 (horas luz/oscuridad) hasta 18:6, con unos valores para la irradiación
artificial de 14:10 [31].

 pH
El pH del medio de cultivo es un parámetro específico de cada especie de microalga,
con una influencia significativa en su metabolismo. En la mayoría de los cultivos,
el valor de pH apenas se encuentra por encima de la neutralidad, en cuyo caso, estos
microorganismos se denominan neutrófilos. Sin embargo, en determinados casos,
como en sistemas de cultivo cerrados, este factor, debido al consumo de CO2 y
nutrientes tiene una tendencia variable. En dichas circunstancias, y para evitarlo, ya
que valores de pH altos inhiben el crecimiento celular, se suele emplear
disoluciones tampón como puede ser la de fosfatos, que funcionan muy bien en el
rango de valores de pH próximos a 7 [32].

 Agitación
Mediante una adecuada aireación y agitación se logra una correcta distribución de
las microalgas, impidiendo que éstas sedimenten o se adhieran a las paredes del
reactor. A su vez, la agitación facilita la homogenización del pH y nutrientes,
eliminando gradientes térmicos, además de permitir una correcta exposición a la
fuente de luz, en vista de que con el paso del tiempo el cultivo se vuelve más denso.
Sin embargo, es necesario tener en cuenta que el grado de agitación está
significantemente relacionado con la productividad microalgal. Esto significa que
una excesiva agitación, ya sea con agitadores o con burbujeo, podría provocar un
24
 estrés hidrodinámico, lo que conllevaría a una gran disminución en la tasa de
crecimiento [29].
1.4.5. Crecimiento de las microalgas
El crecimiento y desarrollo general de las microalgas viene dado por cinco fases (Figura
7). Éstas se definen en función del número de células a lo largo del tiempo.
La primera fase corresponde a un período de adaptación del metabolismo celular a las
condiciones del cultivo y está caracterizado por bajos incrementos en la densidad celular.
Esta fase es conocida como fase de adaptación o lag (1). Una vez que las microalgas han
logrado adaptarse al medio, se produce una rápida y constante división celular en la que el
crecimiento se da de forma exponencial sin ningún tipo de factor limitante para la
multiplicación celular. Finalizada la fase exponencial (2), el crecimiento de la población
microalgal continua pero en menor proporción, ya que existe una limitada disponibilidad de
los factores que regulan el crecimiento [33] (nutrientes, pH, dióxido de carbono…) dando
lugar a una fase de declinación de la fase exponencial (3). A continuación, se produce una
fase estacionaria donde la natalidad producida es igual a la mortalidad, en consecuencia, las
densidades celulares se mantienen más o menos sin cambios relevantes (4). Finalmente, se
produce la fase muerte, en la que las microalgas comienzan a morir ante la escasez de
nutrientes, liberando sustancias inhibitorias al medio que dificultan el crecimiento (5). Con
lo cual, al incrementarse el número de células muertas y, ante las condiciones desfavorables,
se genera un colapso final del cultivo.

Figura 7: Fases de crecimiento y desarrollo de las microalgas

25
 Monitorización del crecimiento de las microalgas
La monitorización del crecimiento de las microalgas es un factor muy importante
que permite distinguir en qué punto de las diferentes fases del crecimiento
microalgal se encuentra un cultivo, así como la evaluar la incidencia de diferentes
parámetros externos en el crecimiento microalgal, lo que posibilita la optimización.
Actualmente, se utilizan básicamente dos métodos de monitorización. Por un lado,
el método espectrofotométrico, que de forma indirecta relaciona el número de
microalgas con el valor de la turbidez. Este método se basa en la estimación de la
clorofila A, dado que se trata del principal pigmento fotosintético presente en las
microalgas. Y por otro lado, de forma directa mediante un hematocitómetro o
cámara de Neubauer. Mediante ella se estima el contenido de biomasa por unidad
de volumen mediante la realización de un recuento de las microalgas presentes en
la cuadrícula de la cámara para posteriormente multiplicarlo por la profundidad de
la misma.

 Cámara de Neubauer
Para realizar el recuento celular a través de esta metodología se han creado
diferentes variantes que pueden contener un determinado volumen de muestra, para
mejorar la reproducibilidad de las determinaciones. Una de las más utilizadas en los
cultivos de microalgas es la “cámara de Neubauer mejorada” o hematocitómetro
representada en la Figura 8, la cual cuenta con 2 zonas de conteo. Se trata de una
placa de cristal de unos 4 mm de grosor, unas dimensiones de 30x70 mm y una
profundidad de 0,1 mm en forma de portaobjetos. Como muestra la Figura 9, la
cámara de Neubauer consta de una rejilla formada por 9 cuadrados de 1 mm de lado
(área total 9 mm2). A su vez, estos cuadrados se subdividen en 16 cuadrados de 0,25
mm de lado salvo en la parte central, donde se muestra una subdivisión más pequeña
con cuadrados de 0,0025 mm2.

Figura 8: Cámara de Neubauer mejorada

26
 Figura 9: Rejilla de la cámara de Neubauer mejorada

 Método espectrofotométrico
La densidad óptica es un método indirecto no invasivo que permite estimar la
concentración celular de las microalgas de una manera rápida pero menos precisa
que el conteo celular a través del microscopio. Para ello, es necesario el empleo de
un espectrofotómetro en el cual se introduce la muestra de cultivo y se registra el
cambio de intensidad de luz que incide en el mismo y la transmitida, mostrando la
lectura en el equipo como absorbancia o densidad óptica.
1.5. MÉTODOS DE SEPARACIÓN
La biomasa obtenida del cultivo algal suele contener una gran cantidad de agua que es
necesario eliminar antes de someterla a posteriores operaciones. Esta etapa es uno de los
pasos con mayor importancia, al afectar directamente a la economía del aprovechamiento
de la biomasa, teniendo unos costes asociados que oscilan entre el 20 y el 50% del coste
total de producción [34]. Esto es debido a que el bajo contenido en masa de este tipo de
cultivos requiere una gran cantidad de energía o de reactivos químicos para separar la
biomasa del medio de cultivo. Por ello, es importante seleccionar la técnica de separación
más apropiada a las características del cultivo, ya que ciertas especies son más fáciles de
cosechar que otras. La elección del método adecuado hará que el proceso sea más eficiente
y más viable económicamente [35]. Por otro lado, la efectividad de la técnica de separación
de la biomasa del medio que la contiene influye en la calidad del efluente que se obtiene
tras la separación, a efectos del cumplimiento de los límites reflejados en la directiva
91/271/CEE.
Entre las diferentes técnicas de separación existentes, basadas en procesos químicos,
eléctricos y mecánicos, destacan la centrifugación, filtración, sedimentación, flotación y
floculación.

27
 1.5.1. Centrifugación
Una de las técnicas más rápidas y eficaces que puede operar de manera continua es la
centrifugación. Ésta se basa en la fuerza centrífuga para separar los sólidos de los líquidos
–de diferente densidad– a través de una fuerza rotativa. Para llevar a cabo esta separación
es necesario una gran cantidad de energía eléctrica y como resultado, se produce la
sedimentación de sólidos, permitiendo retirar de una manera sencilla la masa sobrenadante
obtenida. Aunque esta técnica depende de la especie de microalga seleccionada, su
eficiencia a escala laboratorio ha obtenido porcentajes de recuperación de alrededor del 80-
90% en tiempos relativamente cortos (entre 2 y 5 minutos) [36]. La importancia de este
método reside en la tecnología, ya que posee un alto potencial con buenos rendimientos,
pero por el contrario presenta un alto consumo energético y una gran inversión económica.
1.5.2. Filtración
La filtración es una técnica muy sencilla que separa los sólidos en suspensión de un
medio líquido a través de un medio poroso tras la aplicación de una caída de presión para
su funcionamiento. Como técnica de separación de microalgas requiere de una membrana
la cual retiene las microalgas cuando es atravesada. Cuanto menor es el tamaño del poro de
la membrana, mayor es el incremento de energía que es necesario aplicar. Este método es
muy eficiente cuando la densidad de las microalgas es baja, dado que, con el paso del
tiempo, se van produciendo cada vez mayores depósitos en la membrana, lo que
desencadena una gran resistencia al paso del fluido y provoca que la membrana se obstruya
cada vez más [37].
1.5.3. Sedimentación
Un método común de separación sólido-líquido es la sedimentación por gravedad. Se
basa en las fuerzas de gravedad y la tasa de sedimentación que viene determinada por la
Ley de Stokes, quien estableció que la velocidad de sedimentación es proporcional al radio
de las células y a la diferencia de densidad entre las microalgas y el medio [38]. Esta técnica
de sedimentación se muestra como un método de separación eficiente y presenta un coste
de operación aceptable, además, se puede utilizar para tratar grandes volúmenes de cultivo
con bajos contenidos de biomasa. Sin embargo, en determinadas condiciones puede ser un
método de separación extremadamente lento, sobre todo cuando la diferencia de tamaño o
densidades es muy pequeña, pudiendo ocasionar la descomposición de la biomasa en
ambientes con altas temperaturas. Por tanto, este método se recomienda únicamente para
tamaños de células entre 400 y 800 µm [39].
1.5.4. Flotación
Es un método de separación desarrollado originalmente para la industria minera, pero
que ha resultado ser útil en otro tipo de aplicaciones como la cosecha de microalgas [40].
La flotación aprovecha la capacidad de adhesión de las células de las microalgas presentes
28
en el medio para unirse a una dispersión de burbujas de aire o gas, permitiendo de esta
manera formar conjuntos células-gas que son transportados hasta la superficie donde se
concentran y se recogen [41]. Para que este método sea factible, es necesario que la
adherencia entre las células y las burbujas sea mayor que la tendencia a establecer un
contacto entre las células y el medio.
1.5.5. Electrofloculación
La utilización de la energía eléctrica para la separación de las microalgas es una técnica
con muy baja difusión, sin embargo, se trata de un método bastante versátil puesto que
puede ser utilizado en una amplia variedad de especies microalgales siendo, a su vez,
respetuoso con el medio ambiente. A través del empleo de electrodos y una corriente
eléctrica, la electrofloculación permite la separación de las microalgas debido a su distinta
carga. Mediante este método se consigue el movimiento de las microalgas, las cuales están
cargadas negativamente, hacia el ánodo cargado positivamente gracias al movimiento
electroforético, de tal manera que las células son neutralizadas, dando lugar a la formación
de flóculos o agregados que pueden asentarse en el fondo o flotar en la superficie en función
de la densidad [42,43].
1.5.6. Floculación
La floculación es un proceso químico de bajo consumo energético. Esto la hace muy
adecuada para la separación de las microalgas, ya que estas poseen una carga negativa que
impide la agregación de las células en suspensión de modo que, a través de la adición de
determinados reactivos químicos conocidos como floculantes, los cuales eliminan o
neutralizan las fuerzas de repulsión entre partículas –células en este caso– favorecen la
formación de precipitados que sedimentan rápidamente [44]. En la floculación actúan
principalmente dos fuerzas: la repulsión electrostática, que causa la repulsión de células
negativas con la misma carga, y la atracción intermolecular o fuerzas de Van der Walls, que
son mucho más fuertes y actúan a una distancia menor.
Este tipo de técnica de separación puede ser inducida tanto por sales inorgánicas como
el cloruro de calcio o alúmina, como por polímeros orgánicos como el agar-agar y la goma
arábiga. Entre los factores que más afectan a esta operación de separación destacan la
concentración de floculante, la superficie celular o el pH de la matriz acuosa.
En la siguiente tabla (Tabla 2), se muestran de manera resumida las principales ventajas
y desventajas de los métodos más utilizados en la separación de microalgas.

29
 Tabla 2: Ventajas y desventajas de los principales métodos de separación

MÉTODOS DE
VENTAJAS
SEPARACIÓN
- Método rápido
- Altos porcentajes de recuperación - Posibilidad de producir daño celular
Centrifugación - Válido para la gran mayoría de
especies microalgales
- Altas eficiencias de recuperación
Filtración - Válido para la gran mayoría de
especies
- Método simple y de bajo coste
Sedimentación
- Método de bajo coste
- Bajos tiempos de operación
Flotación - Poco espacio requerido
- Posibilidad de realizar a gran
escala
- No requiere la adición de
floculantes químicos
Electrofloculación - Sistema compacto
- Fácil de automatizar
- Baja aportación de energía
Floculación - Método simple y rápido
DESVENTAJAS
- Altos consumos energéticos
- Rentable solo para productos de alto
valor añadido
- Altos costes operativos procedentes
de la obstrucción de la membrana
- Mantenimiento de la membrana
regular
- Costes regulares derivados del
reemplazo de membranas y bombeo
- Posibilidad de descomposición de la
biomasa
- Baja concentración de microalgas
- Requerimiento de altos tiempos de
operación
- No factible con microalgas marinas
- Generalmente se requiere el uso de
floculantes químicos
- Necesidad de altos consumos
energéticos para conseguir buenas
eficiencias
- Método con poca difusión
- Altos costes de equipamiento
- Los floculantes pueden ser tóxicos y
costosos
- Limitación en la reutilización del
medio de cultivo.

A la vista de las principales ventajas y desventajas mostradas por los métodos de

recuperación de biomasa, y teniendo en cuenta además que uno de los mayores cuellos de
botella para la comercialización de las microalgas es la necesidad de un aporte energético
elevado para la recuperación de la biomasa y que es necesario procesar grandes cantidades
de líquido, dicha recuperación se puede realizar en dos etapas con el fin de disminuir la
cantidad de energía y el coste. Una primera etapa, en la que se realiza la separación de la
biomasa del medio de cultivo, y una segunda etapa, en la que se concentra la biomasa.
1.6. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS
Una vez obtenida la biomasa generada durante el cultivo de las microalgas ya se puede
proceder a realizar la extracción de los lípidos contenidos. Para ello, existen diferentes
técnicas que actúan sobre la matriz celular compleja, que impide la liberación de los
productos intracelulares, rompiendo o debilitando las paredes, mejorando tanto la eficiencia
30
de recuperación de los lípidos como el contacto disolvente/lípido, a la par que disminuye la
cantidad de energía consumida. La posibilidad de combinar diferentes métodos de
extracción de lípidos permite aumentar el rendimiento del proceso. A continuación, se citan
algunos de los métodos de extracción de lípidos de las microalgas más utilizados.
1.6.1. Extracción con disolventes químicos
La extracción de los lípidos a través del uso de disolventes químicos es uno de los
métodos más utilizados y eficaces en materia primas procedentes de fuentes animales y
vegetales. En el caso de las microalgas, se pueden utilizar una gran variedad de disolventes
orgánicos tales como: benceno, ciclo-hexano, etanol, hexano o acetona. La alta solubilidad
de los lípidos en disolventes orgánicos provoca la destrucción de la pared celular y la
extracción del aceite contenido en las microalgas. Sin embargo, la selectividad relativa, en
el caso del etanol, hace que pueda aparecer en el aceite extraído trazas de azúcares,
pigmentos y aminoácidos. Asimismo, si la biomasa no está lo suficientemente seca antes de
la extracción, el agua puede interferir negativamente en el uso posterior del aceite. Dentro
de los métodos de extracción con disolventes químicos se encuentran principalmente:

 Método Folch
El método Folch es una metodología ampliamente utilizada en la extracción de
lípidos de microalgas, ya que se trata de un proceso relativamente simple. Este
método, mediante el empleo de disolventes químicos, realiza una extracción de los
lípidos tanto polares como no polares. Para que sea efectivo su uso, es necesario un
disolvente apolar en combinación con un disolvente relativamente polar, que pueda
disolver tanto los lípidos neutros como los lípidos polares presentes en la muestra
antes de la extracción [45].

 Método Bligh &Dyer

Una variante del Método Folch, es la propuesta en 1959 por Bligh & Dyer. Este
método de extracción de lípidos es más rápido, económico y respetuoso con el
medio ambiente, puesto que reduce el volumen de disolvente utilizado. En este caso,
se utiliza un sistema cloroformo-metanol (1:2) para la extracción, seguida de una
filtración y centrifugación, en la que quedan separadas las fases metanol y
cloroformo. A continuación, tras la evaporación del cloroformo de obtiene el aceite
extraído [46].

 Extracción Soxhlet
El sistema de extracción Soxhlet (Figura 10) es un método convencional utilizado
en la extracción de productos naturales de materias orgánicas a través de una
extracción sólido – líquido. Dicho sistema se basa en una operación de transferencia
de masa en la que un disolvente o mezcla de estos extrae de forma selectiva un
31
 soluto o varios del interior de la matriz sólida. Para ello se emplea el extractor
Soxhlet, que consta de un balón en el que se encuentra alojado el disolvente
orgánico que es calentado hasta la ebullición y un tubo de extracción, en cuyo
interior se encuentra alojado un cartucho de celulosa que contiene la muestra. El
extractor Soxhlet posee un condensador en el que se condensará el disolvente
evaporado para caer sobre el tubo de extracción Soxhlet y extraer el aceite contenido
en la muestra. A través de este sistema han sido evaluados diferentes disolventes
con resultados muy interesantes [47].

Figura 10: Sistema de extracción Soxhlet

1.6.2. Homogeneización a alta presión

El empleo de esta técnica se justifica principalmente en aquellas situaciones en las que
el material a manipular se encuentra en forma líquida. Se bombea la biomasa a través de un
estrecho orificio por lo que es sometida primero a alta presión (alrededor de 150 MPa), y a
continuación, a un brusco descenso de presión (Figura 11). Durante esta secuencia se
generan burbujas de vapor de agua además de otros disolventes, que colapsan y ejercen un
efecto explosivo sobre las células, destruyéndolas o alterándolas [48]. También se genera
un aumento de la temperatura que ayuda a la alteración de las paredes celulares. Esta técnica
tiene la ventaja de la escalabilidad, es decir, puede ser aplicada a sistemas industriales con
capacidades de producción que van desde 50000 L/h, a presiones moderadas, hasta 5750
L/h, a presiones elevadas [49].

32
 Figura 11: Diagrama de homogeneizador de alta presión

1.6.3. Ultrasonidos
Los ultrasonidos son sonidos de alta frecuencia indetectables a la capacidad del oído
humano. En función de la frecuencia a la que se emiten, pueden ser clasificados en: de baja
frecuencia, entre 20 y 100 kHz, y de alta frecuencia, entre 2 y 100 MHz. Su aplicación ha
sido extendida a procesos químicos como la atomización, la filtración de partículas en
suspensión, la estabilización de emulsiones de aceite, la reducción de tamaño de partícula,
etc. Pero también ha sido implementada en aplicaciones médicas, aplicaciones
medioambientales o procesamiento de alimentos entre otras, puesto que los ultrasonidos
suelen incrementar el rendimiento, la conversión, la modificación de las reacciones
químicas y biológicas, etc. [50]. Estas ventajas han llevado a que los reactores ultrasónicos
también se planteen como un sistema eficaz para mejorar el proceso de transesterificación
debido a la reducción de los tiempos de reacción. Los ultrasonidos se transmiten en forma
de ondas sónicas a una determinada frecuencia y alteran la pared celular, desintegrándola
debido a la generación de multitud de burbujas microscópicas que se expanden y se colapsan
(efecto cavitación) causando la destrucción de la superficie celular [51].
1.6.4. Molino de bolas
Los molinos de bolas han sido utilizados en la industria química generalmente para la
trituración de lacas, pinturas y minerales, pero su uso no se ha limitado a este campo, sino
que también puede ser aplicados a la desintegración de cianobacterias y microalgas,
permitiendo la liberación de los productos intracelulares, con bajos requerimientos
energéticos y en condiciones moderadas. La utilización de este tratamiento se basa en
aprovechar la energía cinética de bolas (de vidrio, cerámica, plástico o acero) para producir
colisiones entre sí y con las células microalgales a través de la agitación rotatoria a altas
velocidades. Como resultado, las paredes celulares se ven alteradas por la agitación, la
fricción, la colisión y la molienda. El diámetro óptimo de dichas bolas, para que la
disrupción de la pared celular sea eficaz, suele estar entre 0,3-0,5 mm [52]. De forma
general, se puede afirmar que su eficiencia depende de factores como la geometría del
agitador, la concentración de biomasa, la velocidad del agitador o el diámetro y tipo de bolas
seleccionadas [53].

33
 1.6.5. Fluidos supercríticos
Debido a que los métodos tradicionales de extracción utilizan grandes cantidades de
disolventes orgánicos para llevar a cabo las extracciones, se han investigado métodos
alternativos más respetuosos con el medio ambiente y la salud, que presenten una menor
toxicidad frente a los métodos habituales. La extracción con fluidos supercríticos y la
extracción con agua supercrítica son los procesos más prometedores dentro de este grupo,
y se caracterizan por presentar altas selectividades y tiempos de extracción cortos.
El CO2 es uno de los fluidos supercríticos más empleados puesto que ofrece una serie
de ventajas tales como su facilidad de eliminación después de la extracción, su baja
toxicidad y comedido coste. Sin embargo, tiene una polaridad reducida, lo que repercute su
eficacia, a la hora de extraer componentes polares. Otra de las alternativas es el empleo de
agua en estado líquido a altas temperaturas (entre 100 y 374 ºC) y presiones (entre 10 y 60
bares), de manera que en estas condiciones su constante dieléctrica disminuye en gran
medida y es comparable a la de disolventes orgánicos, como el etanol. La utilización del
agua subcrítica como disolvente extractor presenta la ventaja de ser más respetuosa con el
medio ambiente, además de ser más eficaz en extracciones de muestras sólidas [54].
1.6.6. Autoclave
El autoclave, además de ser utilizado de manera habitual para la esterilización de
instrumentos u objetos mediante el empleo de agua a alta presión y temperatura, puede ser
aplicado en la extracción de lípidos ya que, el fundamento de su empleo es similar al del
agua subcrítica. Mediante este procedimiento –someter la biomasa a la acción del vapor de
agua a elevada presión y temperatura– se puede romper o alterar la estructura de las
microalgas, provocando el cese de las funciones celulares, la desnaturalización de enzimas
o la disrupción de las paredes o membranas celulares [55]. Igualmente, acepta que la
biomasa esté húmeda, evitando, de esta forma, secados previos que podrían degradar los
lípidos presentes. Sin embargo, su empleo suele requerir una etapa adicional de extracción
con disolventes químicos, por lo que se trata más bien de una técnica de pretratamiento.
1.6.7. Liofilización
La técnica de liofilización consiste en deshidratar la biomasa de forma que se obtiene
una biomasa algal seca con la misma composición bioquímica. La ventaja de este
tratamiento radica en que mediante esta congelación se obtienen unas paredes celulares más
porosas, lo que se traduce en un aumento en la eficiencia de extracción de los productos
intracelulares. Este proceso se inicia con una congelación de la muestras para, a
continuación, someterlas a una baja presión de 1 kPa y temperaturas de -40 ºC, lo que
permite que los cristales de hielo formados sublimen [56].

34
 1.6.8. Microondas
Este tratamiento utiliza las radiaciones electromagnéticas entre un rango de 0,3 a 300
GHz de frecuencia para transformar la energía electromagnética en calor, tras fricción entre
los compuestos o los iones [57]. Esto permite realizar calentamientos de muestras sin tener
contacto, a diferencia del calentamiento convencional, cuyo consumo de energía es el doble
que el consumo de microondas. Asimismo, el calentamiento mediante microondas permite
penetrar en los biomateriales, interactuar con moléculas polares como el agua o calentar un
volumen de muestra de manera uniforme [58]. Aplicada a la extracción de lípidos que
contienen las microalgas, consiste en la rotura de las células microalgales mediante un
choque con ondas de alta frecuencia donde la oscilación de las sustancias polares que
componen la estructura provocan un aumento rápido de la temperatura, produciendo la
evaporación del agua contenida, debilitando a su vez la pared celular de forma que aumenta
la eficiencia de la extracción [59]. Por tanto, esta técnica permite disminuir tanto el tiempo
como los volúmenes de disolvente utilizados además de aumentar la eficiencia del proceso.
1.6.9. Choque osmótico
El choque osmótico es un procedimiento poco habitual basado en la utilización de una
disminución abrupta de la presión osmótica para provocar que exploten la mayoría de las
células y liberen su contenido. Aunque se trata de un método rápido y sencillo de provocar
una alteración celular, al depender de las propiedades de la pared celular, su campo de
aplicación es limitado. Esto implica que el procedimiento del choque osmótico es
dependiente de la especie microalgal seleccionada [60]. La sencillez de esta tecnología la
hace fácilmente escalable.
1.6.10. Enzimas
La extracción enzimática es una técnica poco estudiada en el caso de las microalgas,
cuyo principio se basa en la capacidad que tienen ciertas enzimas para degradar
componentes específicos de la pared celular, como por ejemplo la celulosa, hemicelulosa,
proteínas, alginatos, etc. La aplicación de diferentes enzimas degradantes, de forma
individual o colectiva, podría conducir a un aumento en la eficiencia de la extracción, puesto
que facilitaría la salida de los lípidos contenidos. Sin embargo, aunque la extracción
mediante enzimas aparenta ser una técnica muy prometedora para ser implantada a escala
industrial, actualmente existen factores económicos y ciertas incógnitas como la selección
de la enzima o enzimas adecuadas para un determinado caso, que obstaculizan su desarrollo.
Esto se debe al desconocimiento existente en torno a las paredes celulares de las microalgas,
puesto que existe una gran diversidad de especies que muestran diferentes composiciones y
características [61].
Las ventajas y desventajas de los métodos de extracción anteriormente citados se
muestran en la Tabla 3:

35
 Tabla 3: Ventajas y desventajas de los principales métodos de extracción de lípidos
MÉTODOS DE
VENTAJAS
EXTRACCIÓN
- Posibilidad de realizar varias
extracciones en paralelo
- Bajos requerimientos
técnicos
Extracción con
- Tiempos de tratamiento más
disolventes químicos cortos que otros métodos
- Alta pureza del producto
final
- Bajo calor de formación
- Bajos costes de enfriamiento
- Altas eficiencias en la
Homogeneización a disrupción celular
alta presión - Método libre de disolventes
- Rápido proceso mecánico
- Buena reproducibilidad
- Tecnología con un buen
escalonamiento
- Costes de inversión
moderados
Ultrasonidos - Bajos requerimientos
energéticos
- Tiempos de extracción cortos
- Buena reproducibilidad
- Versátil
- Sin riesgos de contaminación - Poco selectivo
Molino de bolas cruzada
- Alta eficiencia de disrupción - Los resultados pueden ser inconsistentes
- Buen control de temperatura - Desnaturalización de las proteínas
- Alta carga de biomasa
- No es necesario una etapa de
filtración
Fluidos - Sistemas automatizados
supercríticos - Los residuos generados no
son peligrosos
- Capacidad de
fraccionamiento
- Altera la estructura celular
Autoclave
- A altas temperaturas reduce
la degradación del producto
36
DESVENTAJAS
- Genera grandes cantidades de residuo
extractante
- Difícil de automatizar
- Calentamiento por gradiente de temperatura
- Los disolventes líquidos orgánicos son
peligrosos e inflamables
- Emisiones tóxicas durante la extracción
- Son necesarios disolventes de alto coste y
pureza
- Altos requerimientos energéticos
- Alto coste de instalación
- Largos tiempos de tratamiento
- Dificultad para su escalamiento
- Posible degradación de los componentes
causada por la alta presión de
homogenización
- La energía ultrasónica provoca efectos
perjudiciales en los componentes activos
- Necesidad de grandes cantidades de
disolventes
- Es necesario una etapa de filtración
- En ocasiones es necesario repetir
extracciones
- Dificultad para su escalado
- Baja calidad de producto
- Las células pueden ser dañadas con las
paredes del reactor
- Alta generación de calor
- Requiere optimizar diferentes parámetros
- Alta complejidad técnica
- Riesgo de pérdidas de volátil
- Riesgo de obstrucción del sistema
- Puede dañar los carotenoides
- Requiere una etapa adicional de extracción
- Difícil de escalar
- Necesidad de un elevado tiempo de
tratamiento
 MÉTODOS DE
VENTAJAS DESVENTAJAS
EXTRACCIÓN
- Sin efectos adversos en el
- Altos tiempo de pretratamiento
Liofilización producto
- Su escalonamiento implica altos costes de
- No requiere de una técnica
operación
de pretratamiento
- Inversión moderada
- Posibilidad de evitar la - La extracción en un solo paso excluye la
pérdida del componente adición de disolvente
volátil - Es necesario un paso adicional para la
recuperación de los lípidos
Microondas - Respetuoso con el medio - Las altas temperaturas pueden provocar la
ambiente
degradación de los lípidos
- Tiempos de extracción - Altos tiempos de enfriamiento para evitar la
reducidos pérdida de lípidos
- Técnica simple y eficaz
- Rápido tiempo de extracción
- Baja eficiencia
- Proceso simple - Genera grandes cantidades de agua residual
Choque osmótico - Material asequible
- Requiere grandes tiempos de tratamiento
- Debe realizarse a baja temperatura
- Proceso costoso
- Rápido y altamente - La eficiencia de este método depende de la
específico composición lipídica, tipo y estado de las
Enzimas - No tóxico microalgas
- Permite la extracción de
biomasa húmeda - La eficiencia del método depende de la
composición lipídica, tipo y etapa de
microalgas

1.7. APROVECHAMIENTO ENERGÉTICO DE LA BIOMASA

MICROALGAL
Dada la enorme cantidad de componentes bioquímicos que poseen las microalgas es
posible obtener prácticamente cualquier combustible líquido, gaseoso o sólido. Pero entre
las diferentes posibilidades que nos ofrece esta biomasa, la mayor parte de la atención la
atraen los biocombustibles líquidos, puesto que el 40% del consumo energético en el mundo
se realiza a partir de combustibles líquidos. El alto contenido en lípidos o ácidos grasos que
poseen la microalgas, que suele estar en torno a 30 veces superior al de los cultivos
oleaginosos [62], ha provocado que gran parte del cultivo de las microalgas se destine a la
producción de biodiésel. La solución de utilizar la biomasa algal para la producción tanto
de biodiésel a partir del aceite como la producción del mismo directamente de la biomasa,
se plantea como una solución eficiente debido a las altas tasas de crecimiento de las
microalgas y su alto contenido en lípidos transesterificables. Cabe esperar que este tipo de
biodiésel podría reemplazar a las fuentes de energía, o a gran parte de ellas, basadas en
combustibles fósiles. Sin embargo, las microalgas también ofrecen otras alternativas como
la posibilidad de producir bioetanol, cuyo consumo se espera que vaya en aumento pues es

37
destinado a la producción de ETBE, o la generación de otro tipo de combustibles sólidos
como son los pellets.
1.7.1. Biodiésel
La ASTM (American Society for Testing and Materials) define el biodiésel como una
mezcla de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga derivados de aceites
vegetales o grasas animales que se emplea en motores de combustión interna de encendido
por compresión [63]. Su empleo tanto en el sector de la automoción como en las calderas
de calefacción está regulado a través de unas especificaciones recogidas en la norma
europea UNE EN 14214:2013 V2+A1:2018 [64], garantizándose de este modo la calidad
del producto.
En cuanto a sus propiedades destaca que este biocombustible muestra una densidad y
número de cetano muy similares al del gasóleo, sin embargo, posee un punto de inflamación
superior lo que posibilita su uso mezclándolo con su precursor. Aunque también es posible
el uso de biodiésel 100% (denotado por B100 a nivel comercial) como combustible en
motores cuyas piezas han sido modificadas ligeramente, es muy habitual utilizarlo en
mezclas biodiésel-diésel con porcentajes que van desde el 2% al 20% en volumen de
biodiésel, evitando así la posibilidad de tener que realizar modificaciones a los motores.
Uno de los métodos más utilizados y estudiados en la producción de biodiésel implica
el desarrollo de la reacción de transesterificación de triglicéridos con alcoholes de bajo peso
molecular (entre los más utilizados, el etanol y el metanol, por su bajo coste y sus ventajas
físicas y químicas) para obtener ésteres monoalquílicos de ácidos grasos como producto
que, una vez purificados, pueden utilizarse como combustible. Además, se obtiene glicerol
como subproducto (Figura 12).

R1 – COO – CH2 CH2 – OH

R2 – COO – CH + 3 R´– OH 3 R – COOR´ + CH – OH

R3 – COO – CH2 CH2 – OH

TRIGLICÉRIDO ALCOHOL ÉSTER GLICERINA

Figura 12: Reacción general de transesterificación

Dicho proceso se puede describir químicamente como una serie de tres reacciones
consecutivas y reversibles en las que el triglicérido es convertido en diglicérido, a
continuación, el diglicérido en monoglicérido y finalmente el monoglicérido en glicerina
(Figura 13).

38
 Figura 13: Reacciones implicadas en el proceso de transesterificación

Para mejorar la velocidad y rendimiento de la reacción de transesterificación se emplea

un catalizador. Éste, en función de la fase en que se encuentren, puede clasificarse como
homogéneo o heterogéneo y como ácido o básico por su capacidad de actuar químicamente.

 Sistema catalítico
A continuación, se muestra una clasificación de los diferentes catalizadores existentes
y algunos ejemplos de cada uno de ellos:
Catalizadores básicos homogéneos: KOH, NaOH
Catalizadores básicos heterogéneos: MgO, CaO, Na/NaOH/Al2O3
Catalizadores ácidos homogéneos: H2SO4, HCl, H3PO4
Catalizadores ácidos heterogéneos: Zeolitas, resinas sulfónicas, SO4/ZrO2,
WO3/ZrO2.
Catalizadores enzimáticos: Lipasas, Cándida, Penicillium, Pseudomonas
En las próximas líneas se puede observar una descripción más detallada de cada uno de
los catalizadores citados.
 Catalizadores básicos homogéneos
Entre la amplia variedad de sistemas catalíticos, los catalizadores básicos como
el metanol o etanol son los más comunes a nivel industrial en la transesterificación
de aceites y grasas, ya que permiten operar en condiciones moderadas y de manera
rápida. Los catalizadores de este tipo usan bases fuertes como el KOH y el NaOH
con los correspondientes alcóxidos, puesto que son económicos, presentan elevados
porcentajes de conversión, permiten trabajar a presión y temperatura moderadas y no
producen intermedios corrosivos para el equipo. La agresividad química baja de este
tipo de catálisis permite el empleo de materiales convencionales para la construcción
de los reactores. Cabe destacar que los reactores empleados pueden ser de tamaño
reducido debido a que se requieren bajas cantidades de alcohol.

39
 Sin embargo, el empleo de este tipo de catalizadores implica la formación de
jabones, reducción de las concentraciones iniciales de catalizador y etapas
adicionales de aislamiento y purificación del biodiésel [65].
 Catalizadores básicos heterogéneos
Ante la necesidad de reducir la cantidad de residuos generados por los
catalizadores básicos homogéneos, surgen los catalizadores básicos heterogéneos.
Éstos presentan ventajas como la facilidad de separación del producto o el menor
riesgo de manipulación. En cambio, tienen un alto coste y su velocidad de reacción
es más lenta que los catalizadores básicos homogéneos. Otra limitación es que al
reutilizar el catalizador básico heterogéneo éste tiende a degradarse y perder su
actividad debido a que se produce la lixiviación del catalizador (leaching).
Actualmente este tipo de catalizador está muy poco implementado en el sector
industrial.
 Catalizadores ácidos homogéneos
A nivel industrial, la producción de biodiésel suele ser llevada a cabo por ácidos
fuertes como sería el ácido sulfúrico, permitiendo lograr rendimientos comparables o
mejores que los logrados con los catalizadores básicos homogéneos sin producir
jabón como subproducto. Como inconveniente, la reacción es más lenta (pudiéndose
incrementar añadiendo más metanol, lo que supone un aumento del coste), necesita
un mayor exceso de alcohol y requiere condiciones de presión y temperaturas más
altas [66]. Además, resulta difícil separar el catalizar ácido y tras su uso no puede ser
reutilizado. Esto supone un problema con los residuos que genera y la constante
necesidad de añadir catalizador nuevo.
 Catalizadores ácidos heterogéneos
Los catalizadores ácidos heterogéneos tienen la ventaja de ser capaces de
esterificar los ácidos grasos con gran rendimiento, siendo indiferentes a la presencia
de ácidos grasos libres. Éstos al poder reciclarse reducen la producción de residuos
pero, al igual que en la catálisis básica homogénea, puede darse la degradación del
catalizador (leaching). Desafortunadamente, puesto que necesitan tiempos de
reacción muy elevados, exhiben actividades catalíticas débiles y altas temperaturas
de reacción [67].
 Catalizadores enzimáticos
Como método alternativo en la producción de biodiésel surge la catálisis
enzimática que, como su nombre indica, utiliza enzimas como catalizador. Entre las
enzimas más utilizadas destacan las lipasas. A través de esta metodología es posible
separar los productos con una mayor facilidad y utilizar menores cantidades de
40
 disolvente, ya que las enzimas reaccionan fácilmente con el metanol. Asimismo, se
ha explorado que el catalizador no es sensible a la presencia de agua y ácidos grasos
libres lo que implica que pueden ser utilizados en materias primas de menor calidad.
Entre los mayores inconvenientes que poseen este tipo de catalizadores destacan los
costes de producción de las enzimas, especialmente si se utilizan en forma de
preparaciones enzimáticas extracelulares de alta pureza que imposibilitan su
recuperación de los productos obtenidos.

 Tipos de transesterificación
La reacción de transesterificación se puede clasificar en dos modalidades: la
transesterificación tradicional y la transesterificación in situ o directa. Mientras que en
la transesterificación tradicional es necesario la extracción previa del aceite contenido
en la biomasa microalgal para su posterior transesterificación, la transesterificación in
situ combina ambos procesos en una sola etapa. De esta manera, se evita el proceso de
extracción que necesitaría el proceso convencional logrando una reducción en los
costes, un menor consumo energético, una disminución del tiempo requerido y una
mayor simplificación del procedimiento. En la Figura 14 se representan los diferentes
pasos y procesos involucrados en cada uno de los tipos de transesterificaciones descritas
de manera visual.

Figura 14: Proceso de transesterificación convencional frente “in situ” [68]

41
 Variables clave en la reacción de transesterificación
 Cantidad y tipo de alcohol
La relación molar alcohol-triglicérido es una de las variables más importantes que
afecta a los rendimientos de los ésteres. Según la estequiometría, la
transesterificación requiere de tres moles de alcohol por cada mol de triglicérido para
producir tres moles de éster monoalquílico de ácido graso y un mol de glicerina. Pero
para que la conversión sea máxima, es necesario utilizar relaciones metanol:aceite
superiores a la estequiométrica para que de esta forma, la reacción de
transesterificación sea una reacción directa, favoreciendo la producción de ésteres.
Sin embargo, la utilización de relaciones metanol:aceite demasiado elevadas, produce
un incremento en la solubilidad que afecta a la separación de la glicerina. La presencia
de la glicerina en la disolución provoca que la reacción se revierta a la izquierda,
disminuyendo el rendimiento de los ésteres.
Por otro lado, cuando la cantidad de alcohol suministrada no es la suficiente, el
producto resultante contendría monoglicéridos y diglicéridos, los cuales pueden
causar taponamiento de los filtros por su facilidad de cristalización en el biodiésel.
 Acidez y humedad
Tanto la acidez como la humedad son parámetros que determinan la viabilidad de
un proceso de transesterificación. Altos contenidos en ácidos grasos libres (AGL) y
humedad producen jabón, lo que implica una reducción en la efectividad del
catalizador y un empeoramiento en la separación y purificación en los productos. Para
que la reacción sea completa, es necesario que la composición de los ácidos grasos
libres sea menor al 3% en masa. Una reacción con un alto grado de acidez supone una
menor conversión. En cuanto a la humedad, ésta disminuye el rendimiento puesto que
el agua reacciona con los catalizadores con la consecuente formación de jabones.
Por tanto, las materias primas utilizadas en este proceso deben cumplir ciertas
especificaciones, empezando por los triglicéridos, cuyo valor ácido debe ser bajo y los
materiales empleados deben presentar un bajo contenido de humedad. El empleo de
un catalizador, tal como el hidróxido de sodio, compensa la alta acidez, sin embargo,
produce un jabón que provoca una mayor viscosidad y la formación de geles que
influyen en la reacción y separación de la glicerina. Teniendo en cuenta estas
condiciones, se mejoran los rendimientos de la reacción de una manera sustancial.
 Tiempo de reacción
El tiempo de reacción es un parámetro importante a la hora de realizar un diseño
de experimentos de una reacción de transesterificación, sin olvidar la influencia de la
naturaleza del catalizador. En este contexto, se ha verificado, mediante numerosas
42
investigaciones, como el rendimiento aumenta con el tiempo y aunque inicialmente la
reacción es lenta, transcurrido un tiempo, la tasa de conversión de triglicéridos a
ésteres metílicos de ácidos grasos va aumentado con el incremento del tiempo hasta
que la reacción es óptima [69]. Además, cabe resaltar que tras el tiempo de reacción
óptimo se producen mecanismos inversos que dan como resultado la formación de
jabón.
 Tipo y concentración de catalizador
El tipo de catalizador utilizado está condicionado por la naturaleza de la materia
prima empleada (contenido de AGL y humedad) y del precio. En el caso de materias
con un alto contenido de AGL y agua es recomendable el empleo de una catálisis
ácida, puesto que la catálisis básica favorecería la formación de las reacciones de
saponificación. Sin embargo, el empleo de la catálisis básica se ha extendido sobre
todo en la industria al poseer unos requerimientos que la hacen muy atractiva. Entre
ellos destacan los tiempos cortos de reacción, temperaturas y relaciones molares
alcohol:aceite bajas o que producen una menor corrosión en los equipos.
En los procesos bajo catálisis alcalina es recomendable emplear concentraciones
entre el 0,5 y el 1,0% en peso del aceite, debido a que una mayor concentración
supondría una saponificación excesiva, y cantidades inferiores provocarían una
disminución en la conversión de triglicéridos. Sin embargo, estos rangos no pueden
ser aplicados a la transesterificación in situ a causa de la presencia de sólidos y a la
gran cantidad de disolvente empleado [70].
 Temperatura
La temperatura es otro de los factores clave en la reacción de transesterificación
ya que, dependiendo de la materia prima y el tipo de alcohol empleado, la alcohólisis
puede transcurrir a diferentes temperaturas. Numerosas investigaciones llevadas a
cabo para conocer el efecto de la temperatura han mostrado como la temperatura
óptima es específica de cada materia prima y ésta puede ser lograda tanta a bajas como
a altas temperaturas en función del tipo de materia prima utilizada [69]. Aunque de
forma general, con el aumento de la temperatura se incrementa el rendimiento del
proceso y se reduce el tiempo de reacción. Bajo estas condiciones, es recomendable
que la temperatura no exceda del punto de ebullición del alcohol utilizado puesto que
se producirían burbujas que limitarían la reacción entre las interfases [71].
 Agitación
La agitación es un parámetro importante, sobre todo al inicio de la reacción
cuando se forma un sistema con varias fases de manera que para obtener altos
rendimientos de FAME se requiere el uso de altas velocidades de mezcla ya que se
evitan las mezclas deficientes y se mejora el contacto entre la biomasa, el disolvente
43
 y el catalizador. Diferentes autores han mostrado como las altas tasas de mezcla
aseguran una suspensión completa de las partículas en el reactor, facilitando la
obtención de altos rendimientos [72]. Este hecho queda patente en la investigación
dirigida por Ehimen et al. [73] quienes observaron y demostraron cómo afectaba
positivamente a la conversión de FAME la aplicación de diferentes condiciones de
agitación (agitación continua, agitación durante solo 1 hora, agitación intermitente 1
hora encendida/1 hora apagada y sin agitación).
1.7.2. Bioetanol
El bioetanol es un combustible líquido con gran potencial energético y respetuoso con
el medio ambiente. Este combustible contiene cerca del 35% de oxígeno, lo que se traduce
en una eficiencia de combustión un 15% mayor que la gasolina a la vez que produce una
reducción en la emisión de partículas y óxidos de nitrógeno [74].
Como materias primas utilizadas para este biocombustible destacan el azúcar de caña o
almidón que correspondería al bioetanol de primera generación o también la biomasa
lignocelulósica y las microalgas que pertenecerían al bioetanol de segunda y tercera
generación. La conversión de estos tres tipos de materias primas a bioetanol conlleva una
serie de etapas con ciertas diferencias entre ellas. Mientras que en las materias primas de
base de azúcar solo es necesario un proceso de extracción para obtener azúcares
fermentables, las materias que contienen almidón se someten a una hidrólisis para convertir
el almidón en azúcar. Por su parte, la biomasa lignocelulósica también sería necesario
someterla a una etapa de pretratamiento antes de ser hidrolizada, con el fin de alterar la
estructura celular y permitir el acceso de las enzimas.
Ciertas especies microalgales son ricas en carbohidratos, almidón y celulosas, y al igual
que en la biomasa en base azúcar y el almidón, necesitan ser fermentadas. Por tanto, el
principal desafío en la producción de bioetanol a partir de microalgas, es liberar los azúcares
fermentables contenidos en las células microalgales. Este proceso requiere una serie de
etapas consistentes en pretratamiento, sacarificación, fermentación y destilación del
producto que son comentadas a continuación:

 Pretratamiento
El pretratamiento de la biomasa supone una de las etapas más importantes y costosas
en el proceso de obtención de bioetanol puesto que implica cerca del 33% del coste
total. Teniendo en cuenta tal coste, esta etapa todavía sigue siendo investigada. El
objetivo de aplicar un pretratamiento es descomponer la estructura de la pared celular y
modificar la estructura intracelular de los hidratos de carbono. Los diferentes tipos de
pretratamientos que existen pueden ser clasificados en función de su naturaleza en:
físico, físico-químico, químico o biológico.

44
 Pretratamientos físicos:
Trituración mecánica: Se pretende reducir el tamaño y densidad de la materia
aumentando la superficie específica y mejorando la eficiencia del proceso durante la
etapa de fermentación.
Pirólisis: Este pretratamiento transforma la biomasa en H2, CO y un residuo
carbonoso tras el sometimiento de la biomasa a temperaturas superiores a los 300 ºC
en ausencia de un medio oxidante. Este residuo se trata mediante lixiviación con agua
o un ácido diluido. La solución recuperada contendrá el suficiente carbono para
producir bioetanol, puesto que está compuesto principalmente de glucosa [75].
Microondas: La irradiación con microondas es un método simple, con cortos
periodos de reacción y eficiente. Dicho procedimiento opera en interacción directa
entre el objeto calentado y un campo electromagnético, consiguiendo una alta
eficiencia de calentamiento y facilitando dicho proceso. La aplicación de este método
mejora el acceso de las enzimas a la celulosa mediante la alteración de la
ultraestructura de la celulosa, en la que se elimina la lignina y la hemicelulosa [75].
 Pretratamientos físico-químicos:
Explosión de vapor: Es un proceso termoquímico en el que la biomasa está en
contacto con vapor presurizado durante un determinado periodo de tiempo para a
continuación despresurizarlos de manera brusca. Esto origina un efecto de auto-
hidrólisis de la hemicelulosa que da como resultado una mejor distribución de la
lignina y una mayor accesibilidad a la celulosa. De forma general, se utilizan
temperaturas entre 160 y 240 ºC y presiones que van desde los 0,7 a 4,8 MPa [76].
Agua caliente en fase líquida: Se pone en contacto la biomasa con agua caliente a
temperaturas que oscilan entre 200-230 ºC durante aproximadamente 15 minutos, con
el objetivo de hidratar la celulosa y eliminar parte de la fracción de hemicelulosa.
Aproximadamente entre el 40 y 60% de la totalidad de la biomasa se disuelve y casi
toda la hemicelulosa se elimina [76].
Explosión por vapor con amoniaco (AFEX): La materia es expuesta a altas
temperaturas (70-100 ºC) y presiones (10-30 atm) durante tiempos entre 5 y 30
minutos para a continuación realizar una rápida liberación de la presión mejorando
significativamente la sacarificación [76].
Explosión de CO2: Se basa en la hipótesis de que el CO2 (en estado supercrítico)
puede formar ácido carbónico, lo que incrementará el porcentaje de materia
pretratada.

45
 Pretratamientos químicos:
Pretratamiento ácido: Probablemente es uno de los pretratamientos químicos más
utilizados. A través de este pretratamiento se emplean los catalizadores ácidos para
transformar las cadenas de polisacáridos en sus monómeros elementales. Este tipo de
hidrólisis puede ser realizada con ácidos concentrados o con ácidos diluidos. El uso
de ácidos concentrados (10-30%), como el H2SO4 o el HCl, tiene lugar a bajas
temperaturas (170-190 ºC) y proporciona altos rendimientos. Sin embargo, el empleo
de esta técnica implica la utilización de materiales más caros y resistentes puesto que
el ácido concentrado es tóxico, corrosivo y peligroso. Por otro lado, la utilización de
ácidos diluidos (1-5%), los cuales requieren temperaturas más altas (160-240 ºC), es
uno de los tratamientos con mayor potencial para ser utilizado a gran escala y puede
ser empleado para aumentar el acceso a la celulosa o como método de sacarificación
directa [77].
Oxidación húmeda: En esta técnica la materia es sumergida en agua y puesta en
contacto con una sustancia oxidante como el oxígeno o el peróxido de hidrogeno.
Durante el proceso tienen lugar reacciones como la sustitución electrofílica,
desplazamiento de cadenas laterales, etc. Su rango de operación suele estar entre los
170 ºC y 200 ºC y presiones entre 10 y 12 bar. Es un método muy eficaz para la
solubilización de las hemicelulosas y la lignina además de incrementar la
digestibilidad de la celulosa [78].
Pretratamiento alcalino: Se lleva a cabo con bases como el hidróxido de sodio,
hidróxido de calcio (cal), hidróxido de potasio, hidróxido de amoníaco e hidróxido
de sodio en combinación con peróxido de hidrógeno u otros que aumentan la
digestibilidad de la celulosa con una efectividad que depende del contenido en
lignina. Su aplicación puede ser realizada a temperatura ambiente y su duración
difiere desde unos pocos segundos hasta incluso días [78].
Tratamiento con disolventes orgánicos: Este prometedor pretratamiento utiliza
ácidos inorgánicos como el ácido sulfúrico y el clorhídrico como catalizadores y
disolventes orgánicos como el metanol y etanol para estimular la reacción de
separación de los enlaces lignina-lignina y carbohidratos-lignina. La eliminación de
la lignina incrementa el área superficial y el volumen de la materia, facilitando el
acceso de la enzima y por tanto mejorando la eficacia del proceso [76].
 Pretratamientos biológicos
El objetivo de este proceso es la degradación de la lignina y la hemicelulosa
mediante la eliminación de las barreras que protegen la celulosa, lo que la hace más
accesible al ataque de las enzimas. Este proceso es realizado a través de la acción de
determinados microorganismos como son los hongos de putrefacción. Resulta un

46
 método seguro y respetuoso con el medio ambiente al no utilizar productos químicos,
además de no exigir altos requerimientos energéticos. A pesar de todas estas ventajas,
al ser un proceso lento, necesita grandes periodos de tiempo y un control continuo
del crecimiento de los microrganismos, haciendo difícil su implantación en las
producciones comerciales [79].

 Sacarificación o hidrólisis enzimática

Tras la etapa de pretratamiento de la materia prima es necesario someterla a una
hidrólisis enzimática con el fin de liberar los azúcares monoméricos potencialmente
fermentables. Se trata de una de las etapas más importantes a lo hora de obtener azúcares
esenciales como la glucosa y manosa [80]. Este proceso, al ser realizado bajo
condiciones suaves (pH entre 4,5-5,0 y temperaturas entre 40-50 ºC), presenta un
consumo moderado, no mostrando problemas de corrosión y los hidrolizados
producidos cuentan con una baja toxicidad. La utilización de enzimas, a diferencia de
otros catalizadores, presentan una alta selectividad y su uso reduce la generación de
productos no deseables. Las enzimas como las celulasas, las cuales son altamente
específicas, producen la degradación de la celulosa con el producto resultante de los
azúcares reductores.

 Fermentación
La fermentación alcohólica es un proceso biológico en el que los principales azúcares
liberados durante la etapa de hidrólisis enzimática (glucosa, xilosa, manosa, galactosa
y arabinosa) son transformados en etanol y dióxido de carbono a través de la acción de
determinados microorganismos. Entre los microorganismos con más éxito en la
producción de bioetanol destaca la Saccharomyces cerevisae. Esta especie de levadura
es una de las más utilizadas a nivel industrial puesto que ofrece una alta productividad
de etanol, es tolerante a altas concentraciones de etanol y compuestos inhibidores [81].
La etapa de hidrolisis y fermentación pueden ser realizada bajo diferentes estrategias,
destacando entre ellas la hidrólisis y fermentación separadas (SHF) y la sacarificación
y fermentación simultánea (SSF).
Cuando se aplica SHF, éstas se realizan en reactores diferentes. De esta forma es posible
alcanzar el punto óptimo de operación de cada reactor. Además, los reactivos químicos
utilizados son económicos, necesita un corto periodo de residencia y no muestra una
gran complejidad [82]. Por otro lado, cuando el proceso es realizado mediante SSF,
ambas etapas son realizadas en un mismo reactor de manera simultánea lo que se
traduce en un menor coste. Esta estrategia permite conseguir unas mayores tasas de
producción [59].

47
  Destilación y purificación
La destilación es la última etapa del proceso en la que el etanol es obtenido
conjuntamente con una mezcla de la que es necesario separarlo. Este medio final está
compuesto por agua y metanol (5-12% en peso) [76]. Simplemente se hierve esta
mezcla etanol-agua y como el etanol posee una mayor volatilidad, se evaporará antes
que el agua. Como se realizan destilaciones repetidas, en cada destilación el vapor
obtenido es cada vez más rico en el componente más volátil (etanol). Cuando la mezcla
alcanza el punto azeótropo es necesario romperlo mediante la adición de una sustancia
que cambia la volatilidad de la mezcla. Para lograrlo se puede utilizar como tercer
componente el benceno, pentano, ciclohexano, hexano, acetona y éter dietílico [79].
1.7.3. Pellets
Con la biomasa algal, rica en carbohidratos, es posible generar también otro tipo de
subproducto como son los pellets, éstos pueden ser obtenidos directamente de la biomasa o
utilizando el residuo generado durante la síntesis del biodiésel.
La tecnología de pelletización puede ser una de las mejores alternativas de
aprovechamiento energético de biomasa al permitir emplear los residuos generados durante
el proceso de extracción de lípidos o los resultantes de la transesterificación in situ, para a
continuación destinarlos principalmente, a la generación de calor mediante su combustión
en forma de pellets en calderas de biomasa. Esta tecnología consiste en la compactación de
la biomasa mediante un prensado sobre una matriz perforada, de modo que a medida que la
biomasa atraviesa la matriz adquiere la forma de los orificios. Normalmente, los pellets
generados toman una forma cilíndrica con una dimensión de diámetro entre 7 y 22 mm y
una longitud de 35 a 65 mm [83]. Los pellets elaborados con el fin de ser utilizados en
calderas de biomasa deben cumplir unos requisitos mínimos en materia de calidad para
conseguir un funcionamiento óptimo en los equipos donde sean utilizados.
En los últimos tiempos, la tecnología de pelletización ha cobrado más importancia al
suponer una forma de valorizar y reducir la biomasa que es generada como residuo en
diferentes procesos industriales. Tal es así que entre las ventajas de aprovechamiento
destaca la disminución de los costes de transporte asociados, pues los pellets reducen
considerablemente el volumen de los residuos. Por otro lado, la creciente demanda de
biomasa ha obligado a la sociedad a diversificar las materias primas utilizadas para la
obtención de este biocombustible sólido [84], pudiendo ser la biomasa algal residual, una
materia prima con alto potencial para su elaboración.
Para llevar a cabo la pelletización de cualquier tipo de biomasa es necesario someter la
materia prima a una serie de etapas tales como molienda del material de partida, extrusión,
enfriado del material y envasado. Cuando la madera usada para la elaboración de pellets es
de calidad, el proceso de extrusionado da como resultado una masa compacta y sólida, sin

48
embargo, el empleo de otro tipo de biomasas residuales o no valorizadas puede requerir el
empleo de aditivos que actúen como ligantes evitando que el pellet elaborado se disgregue
y cumpla los estándares de calidad exigidos. A continuación, se presenta una breve
descripción de las diferentes etapas a las que son sometidas las biomasas en el proceso de
pelletización.

 Molido
Los pellets suelen ser elaborados con biomasa cuyo tamaño de partícula no debe
exceder los 3 mm. Para ello, es necesario someter al material de partida a una trituración
y/o molienda. En el caso de biomasas densas y grandes como es el caso de la madera,
ésta debe ser previamente triturada y después debe someterse a un proceso de molienda
para alcanzar el tamaño deseado. Por el contrario, cuando se trata de biomasas menos
densas, como es el caso de la paja, únicamente será necesario el proceso de molido.

 Control de humedad
La elaboración de un pellet de calidad requiere contenidos en humedad que no deben
superar el 10% [85]. La eliminación de humedad suele realizarse mediante procesos de
secado o insuflado de aire caliente de manera que su contenido se reduzca hasta los
valores indicados en la normativa en vigor y que garantizan la buena combustión del
biocombustible sólido.
Ha de tenerse en cuenta que el poder calorífico de los pellets elaborados depende en
gran medida del tipo de biomasa elegida, si bien el bajo contenido en humedad y el
grado de compactación son factores que pueden alterar, de manera considerable, el valor
de este parámetro.

 Extrusión
Una vez la biomasa a emplear posee el tamaño adecuado para la elaboración de pellets
ésta es introducida en un extrusionador en el cual la biomasa es comprimida y forzada
a pasar por una boquilla agujereada o troquel dando como resultado una masa sólida en
forma de cilindro (pellet) que es cortado mediante una cuchilla.

 Acondicionamiento
Tras pasar por el extrusionador, los pellets pueden encontrarse a alta temperatura
(llegando alcanzar incluso los 150 ºC) y por ello son bastante blandos por lo que es
necesario dejarlos enfriar antes de poder envasarlos. Dependiendo de la capacidad de la
pelletizadora, los pellets pueden enfriarse mediante una corriente de aire a medida que
éstos llegan a una bandeja receptora o pueden dejarse enfriar al aire.

49
 Empacado
Por último, una vez se han dejado enfriar, los pellets pueden ser envasados en bolsas de
diferente capacidad, siendo lo más habitual sacos con capacidad para 15 kg o pueden
almacenarse, en condiciones adecuadas de humedad, para ser vendidos a granel.
Los principales consumos energéticos derivados del proceso de pelletización están
asociados a los procesos de compresión y extrusionado [86]. Además, diferentes
estudios han demostrado que el consumo energético de pellet de biomasa pura es
inversamente proporcional al contenido en hemicelulosa. Así, la hemicelulosa puede
introducir un efecto viscoso entre la fibra de celulosa y la lignina, pudiendo reducir la
elasticidad de la partícula y consecuentemente, aumentar la plasticidad [87,88].
En aquellos casos en los que los que es necesaria la aditivación de los pellet, bien para
reducir la emisión de partículas bien para reducir la formación de escorias o para que
actúe como ligante, el precio de elaboración de los mismos se incrementará con respecto
a un pellet sin aditivar. Por otro lado, si se desea que los pellets elaborados cuenten con
certificaciones tipo EN Plus éstos deben ser caracterizados y cumplir los estándares
marcados por cada una de las certificaciones. Las certificaciones garantizan que el
biocombustible sólido es de buena calidad asegurando una buena combustión y
favoreciendo su venta.

50
2. OBJETIVOS
 Objetivo general

El objetivo principal de esta línea de investigación consiste en estudiar las posibilidades

de implantar, dentro de un sistema de tratamiento de aguas residuales urbanas, industriales
o agrícolas, tecnologías de tratamiento más sostenibles mediante el cultivo de microalgas.
Este nuevo planteamiento ofrece la posibilidad de aprovechar la biomasa microalgal como
biomasa de alto valor energético para la obtención de biocombustibles líquidos y sólidos
como el biodiésel, los pellets u otro uso que pueda ser considerado viable desde un punto
de vista técnico, económico y medioambiental. La investigación realizada ha tenido lugar a
pequeña escala evaluando la posibilidad de escalado en futuros trabajos.
Objetivos específicos

 Evaluación bibliográfica de la especie de microalga más idónea para llevar a cabo la

tratabilidad del agua residual.
 Determinación de las condiciones de cultivo óptimas de la especie de microalga
Chlorella Vulgaris en aguas residuales y evaluación de sus capacidades de depuración.
 Evaluación del crecimiento de la microalga seleccionada en fotobiorreactores.
 Estudio de la capacidad de eliminación de nutrientes de las aguas residuales mediante
tecnología con microalgas.
 Valorización energética de la biomasa algal producida como materia prima.

Los objetivos enmarcados dentro de la presente tesis doctoral dan continuidad a una de
las líneas de investigación seguidas por el grupo de investigación de Ingeniería Química,
Energética y Ambiental (EQEA) de la Universidad de Vigo, centrada en el estudio del
aprovechamiento energético de la biomasa algal. Si bien hasta la fecha los investigadores
involucrados habían centrado sus esfuerzos en la obtención de biocombustibles líquidos y
sólidos elaborados a partir de microalgas, con este estudio se pretende dar un salto más y
utilizar las aguas residuales, como fuente de nutrientes y medio de cultivo para estos
microorganismos, logrando un doble objetivo, la purificación de las aguas y el crecimiento
de una biomasa con un elevado potencial para la producción de biodiésel y pellets.

53
3. METODOLOGÍA
 La metodología seguida en la presente Tesis Doctoral se recoge en la Figura 15. En ella
se exponen, de manera secuencial, las diferentes etapas abordadas, así como las distintas
técnicas empleadas o parámetros analizados. Por otro lado, también aparecen representados
los principales productos de valor obtenidos: aceite, biodiésel y pellets.

Figura 15: Esquema de la metodología realizada

3.1. SELECCIÓN DE LA ESPECIE MICROALGAL

Para seleccionar la cepa más adecuada para esta experimentación, se ha llevado a cabo
una revisión bibliográfica de las especies de microalgas predominantes en el tratamiento de
aguas residuales. A su vez, se ha prestado especial atención a aquellas especies con mayor
tolerancia a cargas orgánicas elevadas a la par que presentan un alto contenido en lípidos
para su aprovechamiento en la producción de biocombustibles líquidos u otro tipo de
aplicación energética. La cepa usada en esta tesis doctoral es la Chlorella vulgaris (Figura
16), obtenida de la colección de microalgas de la Estación de Ciencias Marinas de Toralla
(ECIMAT), Centro de Investigación de la Universidad de Vigo. Esta cepa fue mantenida en
unas condiciones de temperatura de 20±1 ºC e iluminación artificial mediante lámparas
fluorescentes con fotoperiodos de 14 horas de luz y 10 de oscuridad, en un medio de
nutrientes cuya composición fue la siguiente: NaNO3, KH2PO4, MgSO4·7H2O, Na2CO3,
MgCl2·6H2O, CaCl2·2H2O, H3BO3, MnCl2·4H2O, ZnCl2, FeCl3·6H2O, CoSO4·7H2O,
Na2MoO4·2H2O, CuSO4·5H2O and Na2EDTA·2H2O.
57
 Figura 16: Fotografía de la especie Chlorella vulgaris

3.2. CONDICIONES DE CULTIVO

Con el fin de evaluar la capacidad de eliminación de nutrientes de un agua residual
mediante la microalga Chlorella vulgaris, se ha utilizado agua residual sintética (para
garantizar la misma composición en todos los experimentos) como medio, cuya
composición química es la que se describe en la Tabla 4.
Tabla 4: Composición del agua residual sintética

Concentración
Componente
(mg/L)
Glucosa 1000
NH4Cl 95,5
Urea 56,3
KH2PO4 22,6
FeSO4·7H2O 12,6
NaHCO3 309
Extracto de levadura 35

Dicho medio, antes de ser introducido en los reactores, fue esterilizado en un autoclave
a 120 ºC durante 30 minutos. El cultivo de las microalgas fue llevado a cabo bajo las
siguientes condiciones (Tabla 5):
Tabla 5: Condiciones de cultivo

Parámetros Condiciones
Temperatura 26±2 ºC
Iluminación 2 fluorescentes 36 W daylight
Espectro de emisión 400-700 nm
Fotoperiodos 14h luz/10h oscuridad
Bomba de aire atmosférico
Agitación/Aireación
filtrado a 0,20 µm

Los diferentes ensayos fueron realizados en matraces Erlenmeyer de 1000 mL de

capacidad (Figura 17 a)) y en fotobiorreactores cilíndricos elaborados en metacrilato de 3

58
mm de espesor, 11,5 cm de diámetro, 24,5 cm de alto y con un volumen de trabajo de 2 L
(Figura 17 b)), construidos específicamente para la realización de la parte experimental de
esta tesis, con el objetivo de reproducir lo más fielmente posible un diseño real de
fotobiorreactor a pequeña escala. En ambos tipos de reactores fue introducida el agua
residual y un 10% en volumen, respecto el volumen del medio, de la cepa C. vulgaris. Las
variables de crecimiento celular, pH, demanda química de oxígeno y fosfatos fueron
analizadas en cada reactor. Los montajes fueron provistos de agitación mediante un agitador
magnético tras detectar pequeños depósitos de biomasa en el fondo de los matraces y
fotobiorreactores.

a) b)
Figura 17: Reactores utilizados para el cultivo de las microalgas: a) matraces Erlenmeyer y b)
fotobiorreactores

3.3. MÉTODOS ANALÍTICOS

3.3.1. Medición del crecimiento
El crecimiento celular puede ser estimado a partir de diferentes métodos entre los que
destacan la cámara de Neubauer mejorada, que es utilizada en combinación con un
microscopio, o la determinación de los cambios en la densidad óptica por
espectrofotometría. En esta investigación se han aplicados los dos métodos de forma
simultánea para obtener unos resultados lo más precisos posible.

 Recuento celular
Para realizar el conteo se toma una muestra de cultivo de aproximadamente 10 µL, que
se deposita sobre la cámara para, a continuación, colocar sobre ella el cubreobjetos,
teniendo cuidado que el volumen depositado sea el suficiente. Este montaje se introduce
en el microscopio y se enfoca con un objetivo de, en este caso al tratarse de células
pequeñas, 40x. Entre las diferentes posibilidades existentes para realizar el recuento
59
celular por medio de la Cámara de Neubauer mejorada se ha seleccionado aquel más
ampliamente utilizado por la comunidad científica. Dicho método de conteo consiste en
contar el número de células presentes en los cuadrados que forman las diagonales del
área central de la cámara. La fórmula a utilizar para determinar la concentración de
microalgas ha sido la siguiente:
(número de células)x25000
Concentración (cel/mL) = número de cuadrados
(Ec. 1)

Dicha fórmula tiene en cuenta las dimensiones y la profundidad de la cámara de

Neubauer mejorada empleada. A partir de la concentración celular, se puede
determinar el crecimiento específico del cultivo mediante la siguiente ecuación:

 = (lnX2 – lnX1)/(t2-t1) (Ec. 2)

Donde X1 y X2 representan la concentración celular al tiempo t1 y tiempo t2.

 Densidad óptica
La determinación de la concentración celular puede ser estimada directamente a través
de la densidad óptica en base a la ley de Beer-Lambert, que permite relacionar una
concentración con una determinada absorbancia. Para ello, es necesario realizar
previamente un barrido espectral de una muestra del cultivo microalgal con el objetivo
de alcanzar el pico de absorción de la clorofila, tal y como se muestra en la Figura 18.
Esto reduce el error de medida cuando la lectura se realiza a bajas concentraciones.
Una vez seleccionada la longitud de onda adecuada, en este caso 680 nm, se puede
proceder a realizar mediciones de densidad óptima. Para ello, se toman muestras
directamente del cultivo en una cubeta anotando el valor de absorbancia
correspondiente, de forma que el valor de la tasa de crecimiento se obtiene por
diferencia entre la densidad óptica del cultivo y un blanco que, en este caso, sería una
cubeta con el medio utilizado (agua residual sintética).
Además, esta medida puede ser correlacionada tanto con la concentración celular
(cel/mL), determinada en el apartado anterior, como con la biomasa celular (g/L) por
análisis gravimétrico. Este análisis gravimétrico consiste en la determinación de la
cantidad de biomasa existente tras un proceso de centrifugado (15 minutos a 4000 rpm)
y posterior secado en estufa a una temperatura de 60 ºC hasta que la muestra alcance
peso constante, eliminando toda el agua presente.

60
 1.400

1.350

Absorbancia 1.300

1.250

680 nm
1.200

1.150
600 631 661 692 722 753 784
Longitud de onda (nm)

Figura 18: Barrido espectral entre 600 y 800 nm para la microalga C.

vulgaris

3.3.2. Determinación de la demanda química de oxígeno

La demanda química de oxígeno (DQO) se define como la cantidad de oxígeno
necesario o equivalente para oxidar químicamente la materia orgánica susceptible de
oxidación. Este parámetro es muy utilizado a la hora de controlar el grado de calidad de las
aguas residuales. Es decir, la DQO indica la cantidad de contaminante que presenta el agua
residual y que puede ser oxidado químicamente.
El método tradicional para obtener el valor de DQO se fundamenta en la reacción de
una muestra de agua residual con un agente oxidante como es el dicromato potásico
(K2Cr2O7) en un medio ácido con sulfato de plata (Ag2SO4) como catalizador y sulfato de
mercurio (HgSO4) para eliminar las interferencias de los cloruros. Este ensayo se realiza a
una temperatura de 150 ºC durante 2 horas, tiempo durante el cual el dicromato utilizado
oxida la materia orgánica e inorgánica de la muestra, pero también se reduce de Cr6+ a Cr+3.
Finalmente, el exceso de dicromato utilizado se valora con sal de Mohr y ferroína como
indicador. Esta metodología (5220 C) aparece recogida en el APHA Standard Methods [89].
Cálculos:
Los consumos de los reactivos utilizados tienen una relación directa con el contenido
de sustancias orgánicas presentes en las aguas residuales, por lo que también se pueden
referir como la cantidad correspondiente de oxígeno y expresarse como mgO2/L. La
demanda química de oxígeno es calculada de acuerdo a la ecuación 3.

61
 DQO (mg O2/L)= ((A-B) * M * 8000) / mL muestra (Ec. 3)

Donde:
A: mL de sal de Mohr necesarios para el blanco
B: mL de sal de Mohr necesarios para valorar la muestra
M: molaridad de la sal de Mohr
3.3.3. Determinación de fosfatos por espectrofotometría
El fósforo es uno de los principales contaminantes presente en las aguas residuales y
que contribuye, de manera notable, al aumento de la eutrofización en lagos y aguas
naturales. Normalmente la presencia de este nutriente se encuentra en forma de fosfatos, los
cuales de clasifican en ortofosfatos, fosfatos condensados (piro-, meta- y otros polifosfatos)
y fosfatos orgánicos.
La determinación de este parámetro se ha realizado de acuerdo al método 4500 P
recogido en el APHA Standard Methods [89], el cual se basa en la reacción del ion fosfato
con el molibdato amónico ((NH4)6Mo7O24) para formar un complejo inorgánico, ácido
fosfomolíbdico (H3PMo12O40). A continuación, la acción reductora del cloruro estañoso
(SnCl2) reduce el molibdeno al estado de oxidación Cr 3+, generando una coloración de un
color azul característico. Finalmente se mide la absorbancia de la muestra a una longitud de
onda de 690 nm con un espectrofotómetro.
Antes de la medición de cualquier muestra es necesario la preparación de distintas
disoluciones de concentraciones conocidas de forma que permitan el trazado de una recta
de calibrado.

3.4. SEPARACIÓN DE LAS MICROALGAS DEL MEDIO

En esta investigación la separación de las microalgas del medio que las contiene se ha
llevado a cabo en dos etapas. En la primera de ellas, se ha realizado la concentración de la
biomasa mediante sedimentación o floculación, técnicas escogidas por el bajo coste
asociado, mientras que, en la segunda, que lleva asociados unos mayores consumos
energéticos, se ha utilizado la centrifugación y secado como medidas de deshidratación de
la biomasa.

 Sedimentación por gravedad

A través de la sedimentación por gravedad se pueden separar las microalgas del medio
de una manera relativamente sencilla. Para ello, los experimentos conducidos en la tesis
se han desarrollado a dos temperaturas diferentes (4 ºC y 25 ºC), las cuales eran
reguladas de forma uniforme y constante, para evitar movimientos de líquidos o
62
corrientes que dificulten el proceso y así poder evaluar la influencia real de este
parámetro en la sedimentación. El inicio de estos ensayos comenzaba una vez que la
muestra se había homogenizado para a continuación, proceder a la sedimentación de las
microalgas de modo que, a medida que transcurría el tiempo, se iban produciendo
apilamientos de biomasa cada vez mayores en el fondo del recipiente.
Medición:
Para medir la eficiencia de este proceso se usó un espectrofotómetro de forma que se
extraían muestras a intervalos regulares de tiempo para, a continuación, proceder a la
medición de la absorbancia a la longitud de onda de 680 nm.
A través de la siguiente expresión (Ec. 4), la eficiencia de separación de la biomasa es
evaluada:
Porcentaje de separación = [(ODi – ODs) / ODi] *100 (Ec. 4)

Donde:
ODi: Densidad óptica inicial del medio de cultivo
ODs: Densidad óptica de la muestra

 Floculación química
Mediante la aplicación de este método de separación se consigue que las células de
microalgas se agreguen y formen tamaños efectivos más grandes, reduciendo el tiempo
de sedimentación. Para optimizar el proceso de floculación, de forma que se consiga
una rápida y buena sedimentación, es necesario evaluar tanto el tipo de floculante
(orgánico e inorgánico) como las dosis óptimas del mismo.
A partir de una muestra homogénea representativa (500 mL) de cultivo, se evaluó el
efecto de diferentes floculantes y de las dosis de los mismos (50 mg/L, 100 mg/L y 200
mg/L). Una vez añadida la dosis de floculante a la muestra, la mezcla se sometía a
agitación rápida durante 1 minuto a 200 rpm, con el objetivo de distribuir
homogéneamente el floculante en el medio de cultivo mediante el empleo de un agitador
magnético y, seguidamente, la muestra se sometía a agitación lenta, 50 rpm durante 3
minutos, para permitir la formación de flóculos.
Medición:
Se tomaron muestras de la parte superior (zona clarificada) del recipiente de cultivo a
los siguientes intervalos de tiempo: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 80, 100, 120,
160, 190 y 220 minutos y fueron evaluadas a través de un espectrofotómetro utilizando
la siguiente expresión de la Ecuación 4.

63
  Centrifugado y secado
Una vez que la biomasa microalgal había sedimentado, a través de los métodos de
sedimentación por gravedad o floculación química, ésta fue sometida al proceso de
centrifugación, en el cual, por acción de la aceleración centrifuga, fue obtenida una
pasta de algas sin prácticamente agua en el espacio intercelular. Para ello, la biomasa
resultante de las operaciones de sedimentación o floculación fue centrifugada durante
20 minutos a 4000 rpm. Finalizada la centrifugación, con el objetivo de eliminar
cualquier presencia de agua, la muestra fue introducida en una estufa, a una temperatura
constante de 105 ºC hasta alcanzar un peso constante lo que permitió conocer el
porcentaje de humedad de la muestra.
3.5. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS
En el presente estudio, con el fin de optimizar la extracción de lípidos de las microalgas,
se han utilizado métodos que permiten mejorar tanto los tiempos de extracción como la
eficiencia de liberación de lípidos. En concreto, se han evaluado dos técnicas diferentes.

 Ultrasonidos
En los experimentos realizados se han utilizado 10 g de biomasa de Chlorella vulgaris
seca con una mezcla de dos disolventes polares, metanol y cloroformo, en una
proporción 2:1 respectivamente, empleando 5 mL de metanol por cada gramo de
biomasa seca. La muestra fue alojada en el interior de un balón de 3 bocas con capacidad
para 500 mL e introducida en un baño de ultrasonidos a 37 kHz (Elmasonic Model S
300) durante 60 minutos (Figura 19 a)). A continuación, la fase líquida que contenía los
lípidos extraídos y el disolvente, fue separada de la biomasa sólida mediante una
filtración a vacío (Figura 19 b)). El disolvente contenido en la fase líquida es separado
de la fracción lipídica mediante evaporación del mismo a una temperatura de 60 ºC.

64
 a) b)

Figura 19: Extracción por ultrasonidos: a) baño de ultrasonidos y b) filtración a vacío

 Microondas + Ultrasonidos
Se ha estudiado el empleo de disrupción previa mediante microondas para aumentar la
capacidad de extracción de lípidos logrados utilizando únicamente, la técnica de
extracción por ultrasonidos. Para ello, la biomasa microalgal fue depositada en el
interior de un matraz junto una mezcla cloroformo/metanol e introducida en un
microondas durante 10 minutos a una potencia de 140 W a presión atmosférica.
Completado el pretratamiento, la mezcla se sometió a una extracción mediante
ultrasonidos, tal y como se describió en el apartado anterior.
El porcentaje de lípidos extraídos fue determinado de acuerdo a la ecuación que sigue:
% Lípidos extraídos = [(W – W0) * 100] / DWB (Ec. 5)
Donde:
W: Peso del recipiente con los lípidos extraídos expresado en g
W0: Peso del recipiente vacío expresado en g
DBW: peso de la biomasa algal seca expresada en g
3.6. TRANSESTERIFICACIÓN
En la presente tesis doctoral se ha estudiado la transesterificación alcalina in situ o
directa, proceso en el cual la extracción de lípidos y la transesterificación de los mismos se
realizan en una sola etapa. El menor consumo energético derivado de la posibilidad de usar
biomasa húmeda (no es necesario un secado o deshidratación previa), así como la
65
eliminación de la etapa de extracción lipídica permite no sólo reducir los costes sino también
el tiempo necesario para llevar a cabo el proceso, en comparación con métodos
tradicionales. Por otro lado, se ha evaluado el efecto de la incubación previa sobre el proceso
de transesterificación, para lo cual se han realizado experiencias con y sin incubación.
En los casos en los que se estudió la transesterificación de la biomasa en ausencia de
incubación, la experimentación fue iniciada con un concentrado de biomasa microalgal
húmeda (humedades en torno al 75-80%), al que le fue añadida una solución de metóxido
de sodio (2 % en peso de NaOH) y un ratio masa de microalga (g):volumen de metóxido
(mL) 1:12. A continuación, para llevar a cabo la transesterificación, se introdujo la mezcla
en un agitador orbital con incubador que permitió llevar a cabo la reacción a una temperatura
constante de 60 ºC y una agitación de 160 rpm, dejando que la reacción tuviese lugar durante
4 horas.
En aquellas pruebas en las que se utilizó una incubación previa para tratar de mejorar
los rendimientos obtenidos en el caso anterior, lo que se hizo fue mezclar la biomasa algal
húmeda con la mitad del volumen de metanol utilizado acorde al ratio anteriormente citado,
1:12. Esta mezcla fue incubada a una temperatura de 40 ºC, con agitación continua a 160
rpm, durante 18 horas. Una vez transcurrido este tiempo, la reacción de transesterificación
propiamente dicha tuvo lugar mediante la adición del metanol restante y del catalizador
(NaOH) de acuerdo a las proporciones y tiempos anteriormente descritos.
Finalizada la reacción de transesterificación, la muestra fue centrifugada con objeto de
eliminar los residuos de biomasa y posteriormente decantada en un embudo decantador para
alcanzar la separación de fases. Transcurrido un tiempo y, debido a la diferencia de
densidades, se formó glicerina en la parte inferior del embudo y biodiésel en la parte
superior. El biodiésel así obtenido contenía trazas de catalizador y metanol por lo que fue
necesario someterlo a un lavado para purificarlo. La composición de los ésteres metílicos
de ácidos grasos (FAMES) fue determinada mediante cromatografía de gases siguiendo la
UNE-EN ISO 12966-2:2011 [90] (normativa vigente en el momento de realización del
análisis, actualmente ha sido anulada por UNE-EN ISO 12966-2:2017 [91]).
3.7. PRODUCCIÓN DE PELLETS
El residuo de biomasa microalgal, que queda tras la producción de biodiésel, aún posee
un alto potencial de aprovechamiento energético, por lo que puede ser utilizado para la
fabricación de pellets. Para ello, es necesario eliminar cualquier presencia de humedad por
lo que la biomasa fue secado en una estufa a la temperatura de 105 ºC durante 24 h.
Una vez el residuo estaba seco, se procedió a la elaboración de pellets con unas
dimensiones de 12 mm de diámetro y 15 mm de longitud mediante una pelletizadora.
Diferentes parámetros como el contenido de cenizas, contenido de volátiles, contenido en
humedad o poder calorífico han sido determinados según la normativa UNE 14775:2010

66
[92], UNE 15148:2010 [93], UNE 14774-3:2010 [94] y UNE 14918:2011 [95] para
verificar que se cumplen los requerimientos establecidos por la norma UNE EN ISO 17225-
1:2014 [96] que regula que los pellet elaborados puedan ser utilizados en calderas de
biomasa. Cuando alguno de estos parámetros no ha cumplido con el valor establecido en la
normativa en vigor, se ha contemplado la mezcla del residuo microalgal con otros materiales
(biomasas) de manera que se cumpliesen los estándares y se pudiesen utilizar como
combustible sólido en calderas.

*Nota: cabe citar que la normativa anteriormente expuesta se encontraba en vigor en el

momento de la realización de los ensayos, así como cuando se efectuó las correspondientes
publicaciones, sin embargo, en la actualidad ésta se encuentra derogada por la siguiente
normativa:

Biocombustibles sólidos. Determinación del contenido de ceniza

 UNE 14775:2010, derogada por UNE-EN ISO 18122:2016 [97]
Biocombustibles sólidos. Determinación del contenido en materias volátiles
 UNE 15148:2010, derogada por UNE-EN ISO 18123:2016 [98]
Biocombustibles sólidos. Determinación del contenido de humedad. Método de
secado en estufa. Parte 3. Humedad de la muestra para análisis general.
 UNE 14774-3:2010, derogada por UNE-EN ISO 18134-3:2016 [99]

67
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 4.1. ESTRUCTURA DE LA INVESTIGACIÓN
La presente Tesis Doctoral está centrada en determinar la capacidad que poseen las
microalgas para disminuir los niveles de contaminación existentes en las aguas residuales,
así como en estudiar las posibilidades de aprovechamiento de la biomasa microalgal
generada durante el tratamiento de las mismas para producir biocombustibles. A
continuación y de forma esquemática aparece representada la línea de trabajo seguida junto
con las publicaciones obtenidas.

Línea de investigación Artículos

Microalgas

Selección de especie
Sistema de cultivo
Parámetros de cultivo
Monitorización del cultivo

Art. 1 Bioremediation of
Wastewater using Chlorella
vulgaris Microalgae: Phosphorus
Tratamiento de
and Organic Matter
aguas residuales
Art. 2 Semicontinuous Culture of
Chlorella vulgaris Microalgae for
Separación de microalgas Wastewater Treatment

Obtención de
biomasa
microalgal Art. 3 Total Use of Microalgae as
Feedstock for Biodiesel and Pellet
Production
Extracción de lípidos
Transesterificación Art. 4 Bioenergy use from
Pavlova lutheri Microalgae

Obtención
biocombustibles

71
4.2. Artículo 1: Bioremediation of Wastewater using
Chlorella vulgaris Microalgae: Phosphorus and
Organic Matter
 ARTÍCULO 1: Bioremediation of Wastewater using Chlorella vulgaris
Microalgae: Phosphorus and Organic Matter
Los actuales métodos de depuración de aguas residuales presentan una serie de
limitaciones técnicas y económicas. La aplicación de nuevas técnicas basadas en la
fitorremediación se presenta como una alternativa que podría solventar dichas limitaciones.
A este respecto, el presente artículo demuestra la viabilidad de utilizar un cultivo microalgal
como método de depuración de aguas residuales.
Como punto de partida fue necesario la selección de una especie microalgal. La elección
se realizó en base a criterios como: elevada capacidad de eliminación de nutrientes, facilidad
de adaptación a diferentes medios y rápido crecimiento. En base a ello, se eligió la especie
Chlorella vulgaris. Por otro lado, y con objeto de utilizar un agua residual cuyas
características fueran idénticas en los todos los experimentos, se elaboró un agua residual
sintética normalizada.
La adaptación de la citada especie al medio residual es mostrada a través de dos métodos
de monitorización: recuento celular mediante cámara de Neubauer mejorada (Figura 20) y
densidad óptica (Figura 21). Tal y como se puede apreciar en las gráficas, si se comparan
ambas curvas se pueden observar grados de ajuste similares. Las diferentes exactitudes de
los métodos de monitorización empleados justifican los pequeños desfases existentes.

30000

25000
Densidad celular (cel/mL)

20000

15000

10000

5000

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)

Figura 20: Crecimiento de la Chlorella vulgaris en términos de densidad celular

75
 2.50

Densidad óptica a 680 nm 2.00

1.50

1.00

0.50

0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (días)
Figura 21: Crecimiento de la Chlorella vulgaris en términos de densidad óptica a 680 nm

Finalizada esta fase, las células comienzan a multiplicarse de forma exponencial

alcanzando una tasa de crecimiento específico de 0,411 días-1 correspondiente a la fase
exponencial (día 2 – día 6). A continuación, debido a la limitada disponibilidad de nutrientes
y al valor del pH, factores transcendentes en el crecimiento de las microalgas, se
desencadena la fase de declinación exponencial (día 6 – día 8). Los datos obtenidos en estas
gráficas sugieren que la composición del medio estimulaba el crecimiento de la microalga.
Uno de los principales nutrientes necesario en el crecimiento de la microalga y que a su
vez es desencadenante de la eutrofización, es el fósforo. La Figura 22 muestra tanto la curva
de crecimiento anteriormente comentada como la capacidad de eliminación de fósforo del
medio residual que presentó la microalga Chlorella vulgaris. Partiendo de una
concentración inicial de 2,51 mg/L de fosfatos (PO4-P), se observa que con el paso de los
días va disminuyendo hasta la eliminación prácticamente total de esta forma de nutriente
(0,02 mg/L), lo que se traduce en una eficiencia de eliminación del 99,2%, demostrando
que esta especie es una candidata idónea para la eliminación de fósforo de las aguas
residuales.

76
 3.00 30000

Densidad celular (cel/mL)

2.50 25000

2.00 20000
PO4 - P (mg/L)

1.50 15000

1.00 10000

0.50 5000

0.00 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)

PO4-P (mg/L) Densidad

Cellular celular
Density

Figura 22: Variación de la concentración de fosfatos y curva de crecimiento

Esta gráfica también expone cómo la absorción gradual de los fosfatos tiene un impacto
directo en el crecimiento de las microalgas. De tal modo que, disminuye el crecimiento de
la especie a medida que se reduce la presencia de este nutriente en el medio de cultivo.

1400

1200

1000
DQO (mg O2/L)

800

600

400

200

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)

Figura 23: Variación de la DQO con el tiempo

77
 Otro de los parámetros indicadores de la calidad de un agua es la demanda química de
oxígeno (DQO), puesto que indica la presencia de materia orgánica en dicha agua. En la
Figura 23 se puede observar una importante disminución de DQO a lo largo de los 9 días
de cultivo. La curva muestra una reducción de la DQO, sobre todo en los primeros días,
desde los 960 ± 1,5 mg O2/L hasta los 277,3 ± 48,9 mg O2/L. Esto se significa una eficiencia
de eliminación del 71,1%, lo que indica la capacidad de la especie C. vulgaris para asimilar
ciertos componentes orgánicos.
A la vista de los resultados expuestos en el presente artículo se puede concluir que la
microalga Chlorella vulgaris, además de ser capaz de adaptarse y crecer en un agua residual,
es un recurso efectivo para mejorar considerablemente la calidad del agua. Esto significa
que esta especie ofrece una nueva posibilidad en el tratamiento terciario de aguas residuales
y podría, además, ser utilizada con el propósito de producir biomasa microalgal para fines
energéticos.

78
4.3. Artículo 2: Semicontinuous Culture of Chlorella
vulgaris Microalgae for Wastewater Treatment
 ARTÍCULO 2: Semicontinuous Culture of Chlorella vulgaris Microalgae for
Wastewater Treatment
Las aguas residuales poseen elevadas cantidades de nutrientes y materia orgánica que
deben ser disminuidas hasta niveles satisfactorios establecidos en la normativa vigente antes
de proceder a su vertido en el cauce público. Estas normativas, cada vez más estrictas, hacen
necesaria la aplicación de técnicas de depuración más eficientes y sostenibles. Para dar
cumplimiento a los imperativos legales, los experimentos planteados se han realizado
teniendo en cuenta las fluctuaciones de la carga contaminante presente en las aguas
residuales a lo largo del año.
Para este artículo, donde el cultivo de la microalga Chlorella vulgaris ha sido utilizada
como técnica de depuración de aguas residuales, se han tenido en cuenta las consideraciones
mencionadas con el objetivo de que el proceso se asemeje lo máximo posible a un ciclo real.
Para ello, se han utilizado tres concentraciones diferentes de agua residual sintética
denotadas con las siguientes nomenclaturas: X1/2, X1 y X2. Estas tres concentraciones
tienen la misma composición química, pero difieren en la concentración de cada uno de los
elementos. El agua residual X1/2 sería la menos concentrada y representaría las estaciones
más lluviosas, X1 contiene el doble de concentración de X1/2, típica de estaciones como la
primavera u el otoño y finalmente X2, sería la más concentrada y simularía la estación más
seca del año. Además, teniendo en cuenta que las plantas de tratamiento operan en continuo,
durante 15 días se han realizado diferentes ratios de renovación (25, 50, 75, 90 y 90%) del
medio tratado para ser sustituido por un nuevo aporte de agua residual sintética sin tratar,
evaluando la capacidad de adaptación de las microalgas así como el crecimiento de la
biomasa algal y su capacidad de depuración.
% Renovación agua residual
25% 50% 75% 90% 90%
5.00
4.50
4.00
3.50
PO4-P (mg/L)

3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (días)
X1/2 X1 X2
Figura 24: Variación de la concentración de fosfatos con el tiempo
81
 Bajo las condiciones anteriormente descritas, la Figura 24 muestra la capacidad de
asimilación de fosfatos por parte de la especie Chlorella vulgaris en forma de biomasa
durante un periodo de 15 días. Observando la gráfica en detalle se puede observar que en
los primeros 4 días de cultivo, el contenido en fosfatos ha sido eliminado casi por completo
para los tres tipos de agua residual, mostrando eficiencias de eliminación que superan el
98% (Tabla 6). A continuación, con la incorporación de los ciclos de renovación de agua
residual, la adaptación de la microalga al medio ha permitido disminuir los niveles de
fosfatos tras cada renovación. Como se puede observar en dicha figura, el primer ciclo de
renovación (25%), ha sido liderado por el agua residual tipo X1 con un porcentaje de
eliminación del 66,7%, mientras que en el siguiente ciclo (50%) el mejor resultado ha sido
obtenido en el agua residual tipo X2 con un porcentaje del 61%. Sin embargo, en las tres
últimas renovaciones y mostrando porcentajes superiores al 96%, ha destacado el agua tipo
X1/2, la cual exhibe la menor carga contaminante. Es importante destacar que, en cualquiera
de los casos analizados, la cantidad de fosfatos presente en el agua tras la depuración con la
especie de microalga señalada sería inferior al límite máximo establecido en la Directiva
Europea 98/15/CE sobre depuración de aguas residuales, lo que significa que dicha agua
podría ser devuelta al cauce público.
Tabla 6: Porcentaje de eliminación de fosfatos y DQO en los tres tipos de aguas residuales a través de la
microalga Chlorella vulgaris

PO4 -P DQO
Ciclo Tipo de
Entrada Salida % Entrada Salida %
(% agua agua
(mg/L) (mg/L) Eliminación (mgO2/L) (mgO2/L) Eliminación
renovada) residual
X1/2 1,5 0 100,0 720 512 28,9
Inicial X1 2,63 0,03 98,9 1360 640 52,9
X2 4,53 0,06 98,7 2240 700 68,8
X1/2 0,12 0,05 58,3 608 240 60,5
1 (25%) X1 0,09 0,03 66,7 800 400 50,0
X2 0,12 0,06 50,0 1160 760 34,5
X1/2 0,06 0,04 33,3 560 320 42,9
2 (50%) X1 0,08 0,07 12,5 880 384 56,4
X2 0,59 0,23 61,0 1680 600 64,3
X1/2 0,5 0,02 96,0 816 208 74,5
3 (75%) X1 0,55 0,09 83,6 1120 336 70,0
X2 1 0,32 68,0 1680 640 61,9
X1/2 0,35 0 100,0 512 160 68,8
4 (90%) X1 1,37 0,14 89,8 1160 480 58,6
X2 2 0,38 81,0 2160 640 70,4
X1/2 0,82 0,02 97,6 480 96 80,0
5 (90%) X1 1,15 0,23 80,0 1200 360 70,0
X2 2,73 0,38 86,1 2160 760 64,8

82
 Paralelamente a la eliminación del contenido en fosfatos, tal y como se indica en la
Figura 25, la evolución de la demanda química de oxígeno también fue considerada.
Durante los 4 primeros días se pudo observar que cuanto más concentrada era el agua
residual de partida mayor era la capacidad de eliminación de DQO. Tras efectuar
renovaciones de parte del agua residual presente, las microalgas que quedaban en el cultivo
eran capaces de alcanzar tasas de eliminación considerables, oscilando entre el 35% (en el
caso más desfavorable) hasta el 80% (en el caso más favorable). Estos porcentajes de
eliminación fueron obtenidos en el plazo de 1 a 3 días. De esta manera, los datos presentados
demuestran que las microalgas son microorganismos capaces de asimilar el carbono
presente en la materia orgánica disminuyendo el contenido de ésta en un corto periodo de
tiempo.
% Renovación agua residual
25% 50% 75% 90% 90%
2500

2000
DQO (mgO2/L)

1500

1000

500

0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (días)

X1/2 X1 X2

Figura 25: Variación de DQO con el tiempo en los tres tipos de agua residual

Además de analizar la capacidad de eliminación de fosfatos y DQO, también es

importante evaluar el crecimiento de la especie seleccionada puesto que, al variar
parámetros de cultivo como el medio de crecimiento y las tasas de renovación, éstos pueden
tener un efecto negativo, comprometiendo la viabilidad del tratamiento. Para ello, al igual
que en el artículo anterior, se ha llevado a cabo el análisis del crecimiento de la especie
escogida bajo los diferentes regímenes de renovación a través de dos métodos, recuento
celular mediante cámara de Neubauer mejorada (Figura 26) y densidad óptica (Figura 27).
En ambas figuras se puede observar un desarrollo diferente de la microalga a pesar de
que el inóculo inicial haya sido el mismo en los tres tipos de agua residual. Durante los
primeros días, en los tres medios se puede apreciar una primera etapa de adaptación de las
microalgas (fase adaptación) seguida de un aumento exponencial (fase exponencial) con
ciertas diferencias en cuanto a densidad celular. Las mayores disponibilidades de nutrientes
83
presentes en cada uno de los medios podrían justificar las diferentes velocidades de
crecimiento. Después del cuarto día, debido a los bajos niveles de nutrientes, se realizó la
renovación de la cuarta parte del medio de manera que las microalgas experimentaron un
considerable crecimiento. Este mismo comportamiento fue observado en cada nuevo ciclo
de renovación. Es importante destacar que las renovaciones de medio fueron realizadas
cuando los niveles de fosfatos se encontraban por debajo de los límites establecidos por la
Directiva de la Comisión Europea (98/15 / EEC).

% Renovación agua residual

25% 50% 75% 90% 90%
18000
16000
Densidad celular (cel/mL)

14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (días)
X1/2 X1 X2

Figura 26: Crecimiento celular de la especie Chlorella vulgaris a través de los tres tipos de agua residual
mediante cámara de Neubauer mejorada

% Renovación agua residual

25% 50% 75% 90% 90%
2.00
1.80
Densidad óptica (680 nm)

1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (días)
X1/2 X1 X2

Figura 27: Crecimiento celular de la especie Chlorella vulgaris a través de los tres tipos de agua residual
mediante densidad óptica

84
 Las densidades celulares más altas fueron manifestadas tras la renovación del 50% del
medio, obteniéndose un crecimiento máximo de 15805,56±432 células/mL en el caso del
agua residual X2. Sin embargo, las menores concentraciones celulares fueron obtenidas en
los últimos ciclos debido a las mayores tasas de renovación que eliminaron gran parte de
los microorganismos presentes en el cultivo.
Durante el periodo de cultivo, la variación de pH también fue monitorizada (Figura
28). Los datos obtenidos mostraron valores de pH que oscilaban entre 7,60±0,04 y 9,7±0,01.
Los valores más altos se daban con altas concentraciones de microalgas, alcanzando un
valor de pH de 9,4±0,08 para X2.

% Renovación agua residual

25% 50% 75% 90% 90%
10

9
pH

6
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (días)
X1/2 X1 X2

Figura 28: Variación de pH en los diferentes tipos de agua residual utilizados

Esta investigación demuestra que la especie Chlorella vulgaris puede crecer de manera
adecuada en aguas residuales con diferentes concentraciones de nutrientes mostrando
elevadas tasas de eliminación de nutrientes en forma de fosfatos, así como la eliminación
de materia orgánica. Todo ello permite concluir que el cultivo de esta especie de microalga
podría constituir un sistema alternativo de tratamiento de aguas residuales.

85
4.4. Artículo 3: Total Use of Microalgae as Feedstock
for Biodiesel and Pellet Production
 ARTÍCULO 3: Total Use of Microalgae as Feedstock for Biodiesel and Pellet
Production
Las microalgas suponen una materia prima con un alto potencial para la producción de
biocombustibles. Sin embargo, la tecnología para producirlos conlleva una serie de etapas
clave que necesitan ser estudiadas y optimizadas tanto técnica como económicamente. En
el presente artículo, se analiza el proceso de obtención del biodiésel, así como el
aprovechamiento del residuo sólido generado en dicho proceso empleando como materia
prima la especie de microalga Chlorella vulgaris.
La primera etapa, necesaria para la obtención de la biomasa microalgal, es la separación
de las microalgas del medio de cultivo. Entre las diferentes técnicas existentes (filtración,
flotación, sedimentación,...) la sedimentación por gravedad y la floculación química han
sido las técnicas seleccionadas para su estudio.
La sedimentación por gravedad fue evaluada a dos temperaturas diferentes, 4 ºC
(muestra conservada en nevera) y 25 ºC (temperatura ambiente). En la Figura 29 a) y b) se
muestran las variaciones de los porcentajes de recuperación de biomasa durante las 6
primeras horas y a las 24, 48 y 72 horas, respectivamente. En base a las gráficas, se observa
como el porcentaje de recuperación de biomasa apenas se ve influenciado por la
temperatura. El mejor resultado fue obtenido a las 72 horas con un porcentaje de
recuperación aproximado del 99%. En contraposición, los peores resultados fueron
obtenidos las 6 primeras horas, donde no se llegó a alcanzar un 25% de separación de
biomasa algal. Por tanto, esta técnica permite evidenciar que la capacidad de recuperación
de biomasa tiene una relación directa con el tiempo (a mayor tiempo, mayor separación).

a) b)

Figura 29: Porcentaje de recuperación de biomasa algal mediante el método de sedimentación por gravedad
a diferentes intervalos: a) durante las 6 primeras horas, b) a las 24, 48 y 72 h

89
 Aunque, tal y como se ha demostrado, la sedimentación por gravedad conseguía altas
separaciones de biomasa a bajo coste (no es necesario ningún tipo de reactivo o equipo
especial) se requería un tiempo muy prolongado para lograr resultados satisfactorios. Con
objeto de reducir los tiempos de recuperación de biomasa, se realizaron experimentos
utilizando como técnica de separación la floculación química orgánica e inorgánica. En
primer lugar, se llevó a cabo la separación de las microalgas C. vulgaris empleando cuatro
tipos de floculantes inorgánicos (Cu2SO4, KI, CaCl2 y AlCl3.6H2O) a tres diferentes
concentraciones (50, 100 and 200 mg/L). La eficiencia de floculación mostrada por los
mismos se presenta en la Figura 30.

100%
Eficiencia de floculación

80%

60%

40%

20%

0%
0 5 10 15 20 25 30 35 40 50 60 80 100 120 160 190 220
Tiempo (h)
CuSO4 [50 mg/L] CuSO4 [100 mg/L] CuSO4 [200 mg/L]
CaCl2 [50 mg/L] CaCl2 [100 mg/L] CaCl2 [200 mg/L]
KI [50 mg/L] KI [100 mg/L] KI [200 mg/L]
AlCl3 [50 mg/L] AlCl3 [100 mg/L] AlCl3 [200 mg/L]

a)

100%
Eficiencia de floculación

80%

60%

40%

20%

0%
CuSO4 [50 mg/L] CuSO4 [100 mg/L] CuSO4 [200 mg/L] CaCl2 [50 mg/L]
CaCl2 [100 mg/L] CaCl2 [200 mg/L] KI [50 mg/L] KI [100 mg/L]
KI [200 mg/L] AlCl3 [50 mg/L] AlCl3 [100mg/L] AlCl3 [200mg/L]

b)
Figura 30: Eficiencia de floculación con diferentes floculantes inorgánicos: a) a lo largo del tiempo b)
después de 220 minutos
90
 Tal y como se puede comprobar, la utilización de los floculantes inorgánicos citados
daba lugar a elevados porcentajes de recuperación de biomasa, entre el 72 y 99%, en todos
los casos de estudio. Concretamente, los mejores resultados se obtuvieron con el cloruro de
aluminio (AlCl3.6H2O), alcanzando eficiencias entre el 70 y 80% al cabo de 5 minutos. Dado
que los floculantes orgánicos presentan ciertas ventajas sobre los floculantes inorgánicos,
entre las que destaca la ausencia de contaminación, en la investigación conducida en el
tercer artículo de la tesis se consideró de interés estudiar el proceso de floculación mediante
el empleo de dos floculantes orgánicos: agar-agar y goma arábica (véase Figura 31).

90%
Eficiencia de floculación

80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0 5 10 15 20 25 30 35 40 50 60 80 100 120 160 190 220
Tiempo (min)

Agar-Agar [50 mg/L] Agar-Agar [100mg/L] Agar-Agar [200 mg/L]

Arabic gum [50mg/L] Arabic gum [100mg/L] Arabic gum [200mg/L]

a)

100%
90%
Eficiencia de floculación

80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%

Agar - Agar [50mg/L] Agar- Agar [100mg/L] Agar - Agar [200mg/L]

Arabic Gum [50mg/L] Arabic Gum [100mg/L] Arabic Gum [200mg/L]

b)
Figura 31: Eficiencia de floculación con diferentes floculantes orgánicos: a) a lo largo del tiempo b) después
de 220 minutos
91
 En este caso, la aplicación de floculantes orgánicos obtuvo rendimientos algo inferiores
a los alcanzados en el caso anterior, consiguiendo recuperaciones de biomasa del orden del
64 al 85%. Como cabía esperar, la eficiencia del proceso aumentaba con el tiempo y con la
dosis de floculante empleada. Así, la máxima recuperación se alcanzó al cabo de 220
minutos, empleando 200 mg/L del floculante natural agar-agar.
Por tanto, analizando los datos expuestos, se concluye que la eficiencia de floculación
era tanto mayor cuanto mayor era la concentración de floculante empleado,
independientemente del tipo del mismo. De acuerdo a los datos presentados, los mejores
resultados fueron obtenidos con floculantes inorgánicos, sin embargo y pese a obtener
eficiencias algo inferiores, los floculantes de naturaleza orgánica lograron separaciones de
biomasa considerables.
Finalizada la separación de las microalgas del medio, la biomasa obtenida fue sometida
a un proceso de centrifugación con el objetivo de retirar parte de la humedad presente y
obtener así una pasta húmeda. Esta pasta fue introducida en una estufa a 105 ºC para
eliminar cualquier presencia de agua y poder determinar el porcentaje de humedad. La
biomasa seca obtenida, fue utilizada en dos procesos diferentes: extracción de lípidos y
transesterificación in situ.
La extracción de lípidos se realizó a través de dos procedimientos diferentes. Por un
lado, se llevó a cabo una extracción con ultrasonidos y, por otro lado, con objeto de mejorar
su eficiencia, se estudió una extracción ultrasónica asistida con microondas.
Tabla 7: Porcentaje de extracción de lípidos con ultrasonidos y con ultrasonidos asistido por microondas

Aceite Aceite extraído

Pretratamiento Peso seco (g)
extraído (g) (%)
No 2,00 0,15 7,50

Microondas 4,90 0,83 16,94

Como muestra la Tabla 7, la extracción de lípidos por ultrasonidos asistida por

microondas obtuvo un rendimiento aproximado del 17% frente al 7,5% alcanzado cuando
se utilizaba solamente la extracción por ultrasonidos. La aplicación simultánea de ambas
tecnologías mejoraba la cantidad de aceite liberado, evidenciando el efecto positivo de las
microondas. Este efecto puede deberse al proceso de irradiación causado por las
microondas, que incrementa la temperatura y presión de las celdas, lo que debilita las
paredes celulares, facilitando la liberación del aceite contenido en el interior de las células.

Por otro lado, se estudió el proceso de obtención de biodiésel mediante

transesterificación in situ, con y sin incubación previa. El efecto de dicha incubación se
muestra en la Tabla 8.
92
 Tabla 8: Porcentaje de conversión de biodiésel

Ácidos grasos FAME Conversión

Pretratamiento
Aceite (%) Biodiésel (%) Biodiésel (%)
Con incubación 33 9 27,27

Sin incubación 33 4 12,12

El empleo de una incubación de la biomasa algal en metanol previamente a la

transesterificación in situ consiguió unos resultados más satisfactorios que los que se
obtenían sin la aplicación de este tratamiento previo. Su uso se traduce en un aumento de la
conversión de un 15%, probablemente debido a que se favorece el contacto prolongado
entre la biomasa y el disolvente, lo que provoca una interacción entre ambos componentes
que aumenta el rendimiento.
La biomasa que se genera tras el proceso de conversión de la biomasa algal en biodiésel
fue analizada para evaluar su uso como combustible en calderas de pellets. Los parámetros
físicos y químicos analizados se muestran en Tabla 9. Se compararon con la norma UNE-
EN ISO 17225-6:2014 [96] que indicaba los requerimientos marcados por la normativa en
vigor sobre los biocombustibles sólidos de origen no leñoso.
Tabla 9: Análisis de los pellets de Chlorella vulgaris

Pellet de Chlorella vulgaris

Parámetro Unidades Valor norma Valor muestra

P.C.S kJ/kg ≥14500 20681

Cenizas % ≤ 10 9,78

Humedad % < 15 0,0

P.C.I kJ/kg - 19358

Carbono fijo % - 16,87

Volátiles % - 73,35

El análisis de los pellets elaborados con la biomasa residual revela que, para los tres
parámetros exigidos por la normativa, es decir, poder calorífico superior (P.C.S), contenido
en cenizas y contenido en humedad, los resultados obtenidos fueron muy positivos. Por
tanto, el uso de esta biomasa como biocombustible sólido para calderas de pellets es factible.

93
4.5. Artículo 4: Total Bionergy Use from Pavlova
lutheri microalgae
 ARTÍCULO 4: Total Bionergy Use from Pavlova lutheri microalgae
Tras los resultados obtenidos en el anterior artículo y comprobar que los procedimientos
descritos en dicha investigación podrían ser prometedores en el campo de las microalgas,
se decidió llevar a cabo estudios similares con otra de las especies de mayor potencial
teórico según la comunidad investigadora, la especie microalgal Pavlova lutheri.
En primer lugar, e igual que en el caso anterior, se abordó la separación de la biomasa
algal. Etapa de gran relevancia puesto que supone entre el 20 y el 30% de los costes totales
de producción de biomasa [37]. En vista a lo anterior, se estudió una técnica de separación
de bajo coste como es la sedimentación por gravedad, y otra, altamente efectiva en muchos
de los casos, como es la floculación química. Tal y como se comentó anteriormente, ambas
técnicas funcionaron satisfactoriamente.

a) b)

Figura 32: Porcentaje de recuperación de biomasa mediante el método de sedimentación por gravedad a
diferentes intervalos: a) durante las 6 primeras horas, b) a las 24, 48 y 72 h

Los resultados de la Figura 32 a) y b), demuestran que el proceso de separación por

sedimentación por gravedad muestra una baja velocidad de separación durante las 6
primeras horas. Además, se observa que, para los tiempos estudiados, una temperatura de 4
ºC ralentizaba el proceso de separación. El mejor resultado fue obtenido con una muestra a
temperatura ambiente a las 72 horas de iniciado el proceso, consiguiendo una efectividad
del 97%. Al igual que en el caso anterior, y aunque la sedimentación por gravedad resultaba
efectiva, de nuevo se necesitaban grandes periodos de tiempo para obtener resultados
aceptables. Por tanto, con el objetivo de acortar estos tiempos, se estudió la floculación
química por medio de dos floculantes orgánicos (agar-agar y goma arábiga) y cuatro
floculantes inorgánicos (CuSO4, CaCl2, KI, and AlCl3.6H2O) a las siguientes dosis: 50, 100
y 200 mg/L.

97
 Figura 33: Eficiencia de floculación para diferentes floculantes: a) floculantes orgánicos, b) floculantes
inorgánicos y c) comparación entre floculantes orgánicos e inorgánicos a los 220 minutos. La sedimentación
a temperatura ambiente es mostrada como “Control”

En la Figura 33 se muestran las eficiencias para los floculantes objeto de estudio. En

base a estos resultados, todos los floculantes empleados presentaron un incremento de la
velocidad de separación a medida que su concentración aumentaba. Las eficiencias más
altas logradas por los floculantes orgánicos tan solo obtuvieron rendimientos del 13% en el
caso del agar-agar y del 34% la goma arábiga, y tiempos de respuesta a partir de los 60
98
minutos. Los floculantes inorgánicos alcanzaron rendimientos de separación máximos del
88% y 96%, para el CuSO4 y el AlCl3, respectivamente. Además de la diferencia de
efectividad, los floculantes inorgánicos, mostraron una separación sustancial a los pocos
minutos de comenzar el ensayo. La Figura 33 c) pone de manifiesto la efectividad de todos
los compuestos empleados en comparación con la sedimentación por gravedad a
temperatura ambiente (control). Los resultados obtenidos mediante floculación química
confirman la efectividad de los floculantes inorgánicos en la separación de la especie de
microalga Pavlova lutheri.
Posteriormente, las muestras fueron introducidas en una centrifugadora para concentrar
la biomasa y llevar a cabo la determinación de su contenido en humedad. A continuación,
dicha biomasa se sometió a una extracción de lípidos y a una transesterificación in situ.
Los procedimientos empleados para la extracción de aceite fueron los mismos que en
el artículo 3. Primeramente, se evaluó la extracción con ultrasonidos únicamente y
seguidamente se estudió la extracción con ultrasonidos tras un tratamiento previo con
microondas. En ambos casos, se utilizó una mezcla metanol-cloroformo 2:1 (vol/vol) en
una proporción de 5 mL metanol/g de biomasa seca. En el caso de la especie Pavlova lutheri,
se obtuvo un porcentaje de aceite extraído del 11,74% cuando solo se utilizó la extracción
con ultrasonidos, mientras que con el tratamiento previo de microondas la extracción mejoró
notablemente, aumentado en más del doble el resultado anterior (25%). Estos datos
corroboran que el tratamiento con microondas facilita la rotura de la pareces celulares y la
liberación del aceite contenido, mejorando el rendimiento global del método de extracción.
Otro de los factores a considerar en el proceso de extracción son los requerimientos
energéticos. En la Tabla 10 se muestra la cantidad de energía necesaria para realizar la
extracción de aceite por los dos métodos analizados.
Tabla 10: Requerimientos energéticos para la extracción de aceite por ultrasonidos y por ultrasonidos +
microondas

Ultrasonidos
Método Ultrasonidos
+ Microondas
Energía especifica consumida
40,75 43,92
(MJ/kg biomasa húmeda)
Energía especifica consumida total (MJ/kg
177,17 190,96
biomasa seca)

Energía consumida total

1509,11 770,93
(MJ/kg aceite producido)
Aceite extraído (%) 11,74 24,77

99
 Tal y como se puede comprobar, sólo se consumen 3,17 MJ más por kg de biomasa
húmeda cuando se emplean de manera conjunta, las técnicas de microondas y ultrasonidos.
Si se tuviese en consideración el aceite extraído por cada uno de los métodos, se observaría
que la aplicación combinada de ambas técnicas resulta mucho más eficiente que el uso
únicamente de ultrasonidos. De manera que la disrupción previa con microondas supone
aproximadamente la mitad de energía consumida.
Por otro lado, se analizó el proceso de transesterificación directa (in situ) teniendo en
consideración el efecto de la incubación previa. Los resultados de aplicar dicho método son
mostrados en la Tabla 11. Observando los datos de la tabla, al igual que se describió en el
artículo 3, una exposición previa al disolvente seleccionado mejoraba el proceso de
conversión, aumentando la cantidad de ácidos grasos que eran transformados en sus
correspondientes ésteres metílicos. Además, el exceso de disolvente presente favorecía la
conversión de los productos. En este caso, la efectividad se tradujo en un aumento de
conversión del 50% al 67%.
Tabla 11: Porcentaje de conversión de biodiésel

Ácidos grasos FAME Conversión

Pretratamiento
Aceite (%) Biodiésel (%) Biodiésel (%)

Con incubación 12 6 50,00

Sin incubación 12 8 66,66

Tras el proceso de transesterificación in situ, la biomasa resultante se procesaba y

densificaba en forma de pellets. Su uso como combustible para calderas de biomasa se
verificó con la norma UNE-EN ISO 17225-6:2014 [85]. Los datos analizados y comparados
con la normativa son recogidos en la Tabla 12.1

100
 Tabla 12: Análisis de los pellets de Pavlova lutheri

Pellets de Pavlova lutheri

Parámetro Unidades Valor norma Valor muestra

P.C.S kJ/kg ≥14500 15664

Cenizas % ≤ 10 34,5

Humedad % < 15 0.0

P.C.I kJ/kg - 14342

Carbono fijo % - 10,39

Volátiles % - 55,11

En base a los resultados de la tabla, y aunque el poder calorífico superior y la

humedad cumplían la norma, el alto contenido en cenizas la incumplía y, por tanto, no sería
posible su empleo directo como combustible en calderas de pellets. Este hecho no descarta
que esa biomasa microalgal no se pueda usar como materia prima para la elaboración de
biocombustibles sólidos, simplemente obliga a mezclarla con otras biomasas con el fin de
cumplir los requisitos de la citada norma. Así, en esta investigación se ha contemplado la
incorporación de la biomasa procedente de una planta con un gran potencial energético,
como es el Miscanthus, a la biomasa residual resultante.
Tabla 13: Análisis de los pellets de Miscanthus + Pavlova lutheri

Pellets de Miscanthus + Pavlova lutheri

Parámetro Unidades Valor norma Valor muestra

P.C.S kJ/kg ≥14500 17310

Cenizas % ≤ 10 8,49

Humedad % < 15 12,75

Los resultados del análisis de los pellets elaborados con biomasas de diferentes
tipologías, en una proporción máxima del 15% de Pavlova lutheri y un 85% de Miscanthus,
son expuestos en la Tabla 13. Los datos obtenidos muestran como la incorporación del
Miscanhtus elevaba los valores de P.C.S de 15664 kJ/kg a 17310 kJ/kg y de humedad del
0% al 12,75%, pero a su vez también disminuía considerablemente el contenido de cenizas,
permitiendo cumplir con las exigencias establecidas y consiguiendo un pellet sólido apto
para su combustión en calderas de biomasa.
101
5. CONCLUSIONES
 Como solución prometedora a la actual situación energética, esta investigación se
ha centrado en el estudio de la producción de biocombustibles a partir de microalgas
cultivadas en aguas residuales, dando así solución a otra de las grandes problemáticas
que azota nuestra sociedad, el tratamiento de las grandes cantidades de aguas residuales
producidas. A continuación, se destacan las conclusiones y resultados más importantes
que se pueden extraer de esta investigación.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo han demostrado que la utilización
de aguas residuales como medio de cultivo de microalgas es factible, dando como
resultado una disminución significativa de los niveles de contaminantes (DQO y
fósforo, entre otros) presentes y la obtención de una biomasa algal con un alto potencial
de aprovechamiento.
La aplicación de este método supone, además, una alternativa que reduce los costes
de producción de microalgas y también los de depuración de aguas residuales. Si bien
ha de destacarse, también, que el cultivo de este tipo de microorganismos fotosintéticos
contribuye de manera activa a la disminución de las emisiones de CO2, estando en
concordancia con las actuales políticas ambientales.
Se ha analizado el aprovechamiento íntegro de la biomasa algal producida. La
elaboración de biocombustibles líquidos tales como el biodiésel y el aprovechamiento
del residuo resultante para la fabricación de otro biocombustible, en este caso sólido,
pellets, lo que ha resultado ser una opción muy atractiva y con elevadas posibilidades
de éxito.
Por lo tanto, aunque todavía es necesario ahondar y optimizar las diferentes etapas
involucradas en los procesos de obtención de los citados biocombustibles con el fin de
disminuir los costes asociados y aumentar su rendimiento, el cultivo de microalgas en
aguas residuales podría adoptarse como una posible solución para resolver gran parte
de los problemas energéticos y ambientales existentes en la actualidad.

105
6. ARTÍCULOS PUBLICADOS
6.1. Artículo 1: Bioremediation of Wastewater using
Chlorella vulgaris Microalgae: Phosphorus and
Organic Matter
111
112
113
114
115
116
6.2. Artículo 2: Semicontinuous Culture of Chlorella
vulgaris Microalgae for Wastewater Treatment
119
120
121
122
123
124
125
126
6.3. Artículo 3: Total Use of Microalgae as Feedstock
for Biodiesel and Pellet Production
129
130
131
132
133
134
135
136
6.4. Artículo 4: Bioenergy use from Pavlova lutheri
Microalgae
139
140
141
142
143
144
145
146
147
7. OTRAS PUBLICACIONES
 7.1. ARTÍCULO PENDIENTE DE PUBLICACIÓN
Además de los artículos ya presentados y publicados, con los datos obtenidos en la
presente investigación también se ha escrito otro artículo de relevancia que ha sido enviado
a una revista indexada y que actualmente se encuentra en proceso de revisión. Por ello, esta
publicación ha sido incluida en el cuerpo de tesis para que los lectores puedan comprender
el alcance de la misma y en qué aspectos se ha hecho más énfasis, si bien no se comenta por
no estar aceptada para publicación a fecha de presentación de la misma.

Línea de investigación Artículos

Microalgas

Selección de especie Art. 1 Bioremediation of

Sistema de cultivo Wastewater using Chlorella
Parámetros de cultivo vulgaris Microalgae: Phosphorus
Monitorización del cultivo and Organic Matter

Art. 2 Semicontinuous Culture of

Tratamiento de Chlorella vulgaris Microalgae for
aguas residuales Wastewater Treatment

Art. 5 Biotreatment of sewage

Separación de microalgas using Chlorella vulgaris microalgae

Obtención de
biomasa
microalgal
Art. 3 Total Use of Microalgae as
Feedstock for Biodiesel and Pellet
Extracción de lípidos Production
Transesterificación
Art. 4 Bioenergy use from
Pavlova lutheri Microalgae

Obtención
biocombustibles

151
 Artículo 5: Biotreatment of sewage using Chlorella
vulgaris microalgae
155
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170
171
172
173
174
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vegetal. Cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos. Parte 2:
Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos, (2017).
[92] AENOR, Norma UNE-EN 14775:2010. Biocombustibles sólidos. Método para la
determinación del contenido en cenizas, (2010).
[93] AENOR, Norma UNE-EN 15148:2010. Biocombustibles sólidos. Determinación
del contenido en materias volátiles, (2009).
[94] AENOR, Norma UNE-EN 14774-3:2010. Biocombustibles sólidos. Determinación
del contenido de humedad. Método de secado en estufa. Parte 3. Humedad de la
muestra para análisis general, (2010).
[95] AENOR, Norma. UNE-EN 14918:2011. Biocombustibles sólidos. Determinación
del poder calorífico, (2011).
[96] AENOR, Norma UNE-EN ISO 17225-1:2014. Biocombustibles sólidos.
Especificaciones y clases de combustibles. Parte 1: Requisitos generales, (2014).
[97] AENOR, Norma UNE-EN ISO 18122:2016. Biocombustibles sólidos.
Determinación del contenido de ceniza, (2016).
[98] AENOR, Norma UNE-EN ISO 18123:2016. Biocombustibles sólidos.
Determinación del contenido en materia volátil, (2016).
[99] AENOR, Norma UNE-EN ISO 18134-3:2016. Biocombustibles sólidos.
Determinación del contenido de humedad. Método de secado en estufa. Parte 3.
Humedad de la muestra para análisis general, (2016).

184
9. ANEXO: INDICIOS DE
CALIDAD DE LAS
PUBLICACIONES
 Journal Profile: International Journal of Environmental Research

ISSN: 1735-6865
UNIV TEHRAN
GRADUATE FAC ENV, NO 20 GHODS ST, ENGHELAB AVE, PO BOX 14155-6135, TEHRAN 00000, IRAN
Titles
ISO: Int. J. Environ. Res.
JCR Abbrev: INT J ENVIRON RES
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ENVIRONMENTAL SCIENCES - SCIE
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ENGLISH

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%
Factor
Journal 5-Year Citing Article Articles avgJifP
Total without Immediacy Citable Cited Eigenfactor
Year Impact Impact Half- Influence in ercentil
Cites Journal Index Items Half-Life Score
Factor Factor life Score Citable e
Self
Items
Cites
Not 2.1470
2008 23 0.271 0.187 0.271 0.175 57 Available >10.0 4.0E-5 0.040 100.00 0
Not 17.403
2009 87 0.781 0.276 0.790 0.054 74 Available 9.7 7.0E-5 0.031 100.00 00
53.109
2010 371 1.626 0.595 1.754 0.577 97 2.2 9.6 4.2E-4 0.122 98.97 00
45.610
2011 423 1.462 0.549 1.460 0.170 112 2.5 9.4 7.0E-4 0.137 99.11 00
29.372
2014 680 1.100 0.809 1.129 0.158 139 3.6 9.2 0.00176 0.220 100.00 00
51.667
2012 731 1.818 0.631 1.466 1.393 112 1.8 9.6 9.6E-4 0.141 100.00 00
22.000
2015 850 0.992 0.886 1.114 0.287 150 3.9 10.0 0.00185 0.215 100.00 00
17.249
2016 1,035 0.927 0.899 1.105 0.102 59 4.6 8.7 0.00176 0.197 100.00 00
JCR Impact Factor Category Box Plot

187
ESI Total Citations

Journal Relationships

188