Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Asignatura
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
TRABAJO AUTONOMO
Tema:
INMUNOHISTOQUIMICA
Elaborado por:
Sexto Semestre
Docente:
Fecha de entrega:
LUNES 06 MAYO 2019
PERIODO ACADÉMICO
OCTUBRE 2018-FEBRERO 2019
Riobamba-Ecuador
INMUNOHISTOQUÍMICA
En la Sección de Inmunohistoquímica proporcionamos información complementaria al estudio
histopatológico convencional mediante técnicas basadas en el uso de anticuerpos sobre
muestras de tejidos o citologías. Los anticuerpos se unen a determinados productos celulares o
gérmenes de forma específica gracias a reacciones antígeno-anticuerpo que se manifiestan por
señales de color visibles al microscopio.
Los datos de alta especificidad que proporciona el análisis inmunohistoquímico son de gran
importancia para el diagnóstico final. Hoy en día se utiliza para la valoración de la mayor parte
de los factores pronósticos en tumores malignos.
En la Sección disponemos de tecnología de alto nivel y actualizamos las técnicas
continuamente, por lo que somos centro de referencia para múltiples laboratorios con menor
disponibilidad tecnológica.
El análisis por hibridación fluorescente in situ (FISH) “mapea” el material genético presente en
las células de una persona. Este análisis puede servir para visualizar genes o porciones de
genes específicos. El análisis por FISH se realiza sobre tejido de cáncer de mama extirpado
durante la biopsia con el fin de determinar si las células poseen copias adicionales del
gen HER2 o no. Cuanto mayor sea la cantidad de copias del gen HER2, mayor será la cantidad
de receptores HER2 que poseen las células. Estos receptores de HER2 reciben señales que
estimulan la multiplicación de células del cáncer de mama.
Los resultados del análisis por FISH dirán si el cáncer es “positivo” o “negativo” (un resultado
que a veces se informa como “cero”) para HER2. Generalmente, el análisis por FISH no se
encuentra fácilmente disponible como el otro método de análisis para HER2 denominado
inmunohistoquímica o IHQ. Sin embargo, el análisis por FISH se considera más exacto. En
muchos casos, un centro de análisis realizará primero la prueba de IHQ y solicitará el análisis
por FISH únicamente si los resultados de IHQ no revelan claramente si las células son positivas
o negativas para HER2.
Las investigaciones han demostrado que algunos resultados de análisis de estado de HER2
pueden ser erróneos. Ello se debe probablemente a que distintos laboratorios aplican
diferentes normas para clasificar un HER2 como positivo o negativo. Además, cada patólogo
puede aplicar un criterio levemente diferente para determinar si los resultados son positivos o
negativos. En la mayoría de los casos, esto ocurre cuando los resultados de las pruebas son
ambiguos; es decir, no permiten inclinarse por un resultado HER2 positivo o negativo.
En otros casos, el tejido del tumor extirpado de un área de la mama puede revelar resultados
HER2 positivos y, en el tejido de otra área de la mama, puede presentar un resultado HER2
negativo.
La hibridación in situ (ISH) es una poderosa técnica para localizar dianas de ácido nucleico
específicas dentro de células y tejidos fijos, lo que le permite obtener información temporal y
espacial sobre la expresión génica y los loci genéticos. Si bien el flujo de trabajo básico de ISH
es similar al de las hibridaciones de transferencia (la sonda de ácido nucleico se sintetiza, se
etiqueta, se purifica y se recuece con el objetivo específico), la diferencia es la mayor cantidad
de información obtenida al visualizar los resultados dentro del tejido.
Hoy en día hay dos formas básicas de visualizar sus objetivos de ARN y ADN in situ: detección
de fluorescencia (FISH) y cromogénica (CISH). Las características inherentes a cada método de
detección (ver tabla a continuación) han hecho que FISH y CISH sean útiles para aplicaciones
muy distintas. Si bien ambos usan una sonda etiquetada, específica del objetivo que se hibrida
con la muestra, la instrumentación utilizada para visualizar las muestras es diferente para cada
método. Aquí destacamos las diferencias y las ventajas de cada método.
Más del 95% de los anticuerpos empleados de rutina en IHQ requieren HIER.
Las variables con mayor influencia en la eficiencia de la HIER son: temperatura, tiempo, tiempo
de fijación del tejido; naturaleza y PH del buffer de recuperación. La HIER se realiza
fundamentalmente mediante incubación en buffer de Citrato o EDTA con temperatura de 90-
100°C. El mayor inconveniente de esta forma de recuperación es que algunos epítopes se
dañan de forma irreversible y esto acontece más fácilmente en tejidos subfijados.
Si bien para la mayoría de los antígenos, la condición optima de recuperación podrá ser a 97ºC
durante 20 min, algunos pocos necesitaran recuperación más prolongada a menor
temperatura. Se ha sugerido que la recuperación más prolongada a 90°C permite una mejor
preservación de la morfología.
En tejidos sobrefijados la obtención de buenos resultados puede requerir mayor temperatura
y/o tiempo (más de 40 minutos) de HIER.
Es muy importante tener en cuenta que la HIER es un evento transitorio por lo cual la
incubación con el anticuerpo primario debe efectuarse inmediatamente después.
La HIER puede realizarse en microondas, baño térmico, olla a presión, cámara de presión
Pascal y platinas (inmunotinción automatizada) con ajuste adecuado para cada uno de ellos de
la temperatura y tiempo de recuperación
Para el 90-95% de los epítopes la HIER con Buffer pH 8-9 es preferible a la HIER con Buffer pH6.
La HIER con buffers de PH alto en relación a la HIER con buffers de PH bajo permite en muchos
casos disminuir el tiempo de incubación y/ o aumentar la dilución del anticuerpo primario.
Buenos resultados se han descripto con el empleo de buffers modificados pH 6 (Ej. Dako) con
algunos anticuerpos que típicamente requieren digestión enzimática como CD5 (Leu1), CD7
(CBC3.7); CD30 (D6/B5); EP-CAM (EP-4 o MOC-31 o VU-1D9); CD21 (1F8); CD35 (Ver- MAC-
DRC);
GP200 (SPM 314 o 66.4C2); CD61 (Y2/51); NGFR (MRQ-21). Mandatoria para los primeros 3.
La condición optima de HIER no es universal sino que varía según el anticuerpo, clones y
sistema de detección utilizados. Se sugiere realizar una nueva puesta a punto toda vez que se
incorpore un nuevo anticuerpo, un nuevo clon de un anticuerpo ya conocido o un nuevo
sistema de detección.
A tal fin se podrá testear primero el pH utilizando en un caso citrato pH6 y en otro EDTA a pH 8
(en ambos casos la temperatura será de 100°C). Una vez seleccionado el mejor PH optimizar la
temperatura y el tiempo.
B. DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
de manera que el tiempo de digestión deberá ajustarse en cada caso, esto en la rutina puede
ser difícil de lograr considerando que las muestras de tejido inevitablemente muestran una
gran variación en el tiempo de fijación. Los tejidos fijados en forma prolongada van a requerir
digestiones más prolongadas.
Los inconvenientes de este método son que favorece el mayor desprendimiento del tejido y
resulta con mayor “fondo”.
Muy poco usada, la digestión puede hacerse antes o después de la RA por calor. Requiere
una cuidadosa calibración. Entre los anticuerpos que se benefician con el tratamiento
combinado se encuentran WT1 (6H-F5 y EP122), PAX8 (ZR1), PMS2 (EP51) y proteínas de la
matriz extracelular como COLL-3 (polyclonal), COLL-4 (CIV-22), Tenascin (T2H5), LAM5 (γ)
(D4B5).
Bibliografía
1) Veronique M Neumeister, Fabio Parisi , Allison M England , Summar Siddiqui, et al. A tissue
quality index: an intrinsic control for measurement of effects of preanalytical variables on
FFPE tissue. Laboratory Investigation (2014) 94, 467–474.
2) Shi SR, Liu C, Taylor CR. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-
embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: From experiments to
hypothesis. J Histochem Cytochem 2007; 55:105-9.
3) Ran Xie, Joon-Yong Chung, Kris Ylaya, Reginald L. Williams, Natalie Guerrero, Nathan Nakatsuka,
Cortessia Badie, and Stephen M. Hewitt. Factors Influencing the Degradation of Archival Formalin-
Fixed Paraffin- Embedded Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 59(4)
356–365
4) Isil Z Yildiz-Aktas, David J Dabbs and Rohit Bhargava. The effect of cold ischemic time on the
immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2
expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology (2012) 25, 1098–1105.
5) Boenisch, Thomas M.S. Diluent Buffer Ions and pH: Their Influence on the Performance of
Monoclonal Antibodies in Immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry & Molecular
Morphology. 1999; 7(4): 300.
6) Martina Mirlacher, Marlis Kasper, Martina Storz, Yvonne Knecht, Ursula Du¨rmu¨ ller,
Ronald Simon, Michael J Mihatsch and Guido Sauter. Influence of slide aging on results of
translational research studies using immunohistochemistry. Modern Pathology 2004; 17:
1414–1420.
7) Kelly B. Engel; Helen M. Moore. Effects of Preanalytical Variables on the Detection of
Proteins by Immunohistochemistry in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. (Arch Pathol Lab
Med. 2011; 135:537– 543.
8) Engel KB, Moore HM. Effects of preanalytical variables on the detection of proteins by
immunohistochemistry in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol Lab Med 2011;
135:537-43.