INVESTIGACIÓN DIVERSIDAD I: MEDUSA FLUORESCENTE

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La proteína verde fluorescente ha existido durante más de 160 millones de años en los
fotoórganos de una especie de medusa, Aequorea victoria, y es en parte responsable de
su bioluminiscencia. Los organismos bioluminiscentes son capaces de emitir luz
transformando energía química en lumínica, como las luciérnagas, o bien mediante
fluorescencia, absorbiendo luz de un determinado color (longitud de onda) y liberando
la energía absorbida en forma de luz de una longitud de onda mayor. La primera
descripción de un organismo bioluminiscente data de muy antiguo y se debe a Cayo
Plinio Segundo el Viejo (23-79 DC), quien describió en su Historia Natural la
existencia de unas medusas en la bahía de Nápoles que resplandecían con una tonalidad
verdosa al ser expuestas a la luz solar. Plinio desarrolló una técnica para decorar
cerámica empleando triturados de estos animales.

La primera descripción de un ser bioluminiscente se debe a Plinio

Hay moléculas fluorescentes que emiten en todos los colores del arco iris

Unos cuantos siglos después, en el verano del 1961, el científico japonés Osamu
Shimomura se dedicó a exprimir más de 10.000 ejemplares de Aequoria para aislar la
sustancia responsable de la bioluminiscencia de esta medusa. Sus estudios,
galardonados este año con el Nobel de Química, condujeron a la identificación de la
proteína que emitía fluorescencia verde (GFP, siglas en inglés) al ser iluminada con luz
azul.

Shimomura caracterizó posteriormente la porción de la proteína (fluoróforo) que le

confiere la capacidad de absorber y emitir luz y demostró que, a diferencia de otras
proteínas bioluminiscentes, la GFP no requiere ningún aditivo para fluorescer. Esta
singular propiedad es uno de los factores que ha hecho que la GFP pasara de ser una
curiosidad científica a convertirse en una poderosa herramienta extensamente utilizada
en Biología.

Martin Chalfie (EE UU), el segundo galardonado con el Nobel, demostró que el gen de
la GFP, el fragmento de ADN del genoma de la medusa que contiene el código para su
biosíntesis, podía ser introducido en otros organismos vivos, unicelulares como la
bacteria intestinal Escherichia coli o multicelulares como el gusano Caenorhabditis
elegans, conduciendo a la expresión de una proteína que conservaba la fluorescencia.
Este descubrimiento abrió las puertas a la utilización de la GFP como marcador tanto de
células individuales como de organismos enteros.

En fechas más recientes se han generado numerosos animales transgénicos, desde

ratones a cerdos pasando por conejos, gatos y peces, que expresan proteínas
fluorescentes y que tienen aplicaciones muy diversas en investigación biomédica y
biotecnológica o incluso como exóticos animales de compañía. Así, por ejemplo, el
marcaje con proteínas fluorescentes permite visualizar de forma no invasiva la
evolución de tumores en animales de experimentación, simplemente observando la
fluorescencia que emiten las células cancerosas al iluminar los animales vivos con luz
del color adecuado.
La observación del crecimiento de bacterias patógenas, del desarrollo de circuitos
neuronales o de la enfermedad de alzhéimer, la detección de contaminación por metales
pesados o la lucha contra la malaria son ejemplos de los muchos estudios que han
visto luz verde gracias a la GFP.

El tercer laureado, Roger Y. Tsien (estadounidense), describió cómo se forma

espontáneamente el fluoróforo de la GFP y contribuyó a la determinación de su
estructura tridimensional, una curiosa forma cilíndrica semejante a una lata de refresco,
con el fluoróforo situado en su interior. Esto permitió al laboratorio de Tsien diseñar
variantes de la GFP y de otras proteínas fluorescentes, también aisladas de organismos
marinos, que brillan con mayor intensidad y que cubren una extensa gama de colores.
Su mayor contribución ha sido generar y poner a disposición de la comunidad científica
un gran número de proteínas fluorescentes que emiten luz en prácticamente todos los
colores del arco iris.

Si facilitar la observación de células individuales supone un gran logro, la utilización de

proteínas fluorescentes ha permitido a los investigadores ir mucho más allá y les ha
capacitado para analizar procesos que ocurren en el interior celular. Las reacciones
químicas que sustentan la vida están reguladas por enzimas, unas proteínas que
controlan cuándo y dónde en la célula tiene lugar una determinada reacción. Otras
proteínas tienen papeles estructurales y son responsables de la integridad y movimiento
celulares, mientras que otras son esenciales en procesos de reconocimiento molecular y
celular, los cuales permiten, por ejemplo, establecer la necesaria comunicación entre las
células que componen un órgano o la respuesta a estímulos extracelulares como
neurotransmisores u hormonas. Para entender el funcionamiento de la célula es
imprescindible conocer dónde se localizan las proteínas implicadas en estos procesos y
cómo interaccionan entre ellas.

El problema es enorme, ya que en el interior celular coexisten centenares de miles de

proteínas diferentes y su pequeño tamaño hace que la observación directa sea imposible,
ni con el microscopio más potente. Con técnicas de ADN recombinante, al alcance de
cualquier laboratorio bioquímico, se puede unir el gen de la GFP al gen de la proteína
que se desee, de tal forma que la célula que incorpore esta construcción expresará una
proteína en la que se ha añadido la GFP a su secuencia original.

La proteína marcada es ahora fácilmente distinguible, como un ciclista equipado con los
reglamentarios elementos reflectantes, y mediante la simple iluminación con la luz
adecuada se puede observar en el microscopio su localización o tráfico intracelular. Por
otro lado, la posibilidad de etiquetar a la vez proteínas diferentes con colores distintos
permite también analizar dónde, cuándo y bajo qué estímulos interaccionan. Además de
la inherente simplicidad de esta tecnología, lo que la convierte en realmente
revolucionaria es que, a diferencia de otros métodos que deben emplear células muertas,
el marcaje con proteínas fluorescentes permite realizar estos análisis a tiempo real y en
células vivas.

Cuando Shimomura inició el estudio de organismos marinos bioluminiscentes, tan sólo

pretendía entender qué es lo que les hacía emitir luz. Sin embargo, sus trabajos y los que
siguieron constituyen un ejemplo más de cómo la investigación básica puede conducir,
a veces de forma inesperada, a una verdadera revolución científica.
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LA MEDUSA Y SU PROTEÍNA VERDE

La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent
Protein) es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite
bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta proteína
ha sido clonado y se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador. Los
descubrimientos relacionados a la GFP merecieron el Premio Nobel de Química 2008,
en conjunto a los tres investigadores, Dres Shimomura, Chalfie y Tsien. El Dr.
Shimomura descubrió y estudió las propiedades de GFP, el Dr. Chalfie usando técnicas
de biología molecular logró introducir el gen que codificaba para la GFP en el ADN del
gusano transparente C. elegans, e inició la era de GFP como marcador de procesos en
células y organismos. Finalmente el Dr. Tsien modificó la estructura de la proteína para
producir moléculas que emiten luz a distintas longitudes de onda, extendiendo la
paleta de colores de las proteínas. Las proteínas fluorescentes, entre las cuales se
encuentra la GFP, son muy versátiles y se utilizan en diversos campos como la
microbiología, ingeniería genética, fisiología, e ingeniería ambiental. Permiten ver
procesos previamente invisibles, como el desarrollo de neuronas, cómo se diseminan
las células cancerosas, o la contaminación de agua con arsénico, por mencionar
algunos usos. Con la obtención de proteínas de muchos colores complejas redes
biológicas pueden ser marcadas diferencialmente, lo que permite visualizar la biología
celular en acción.
Usos
Las proteínas fluorescentes se utilizan en diversos campos como ingeniería genética y
fisiología. Estudiar procesos químicos en células vivas es hoy en día un método
estándar en la biología y la investigación médica. Con esta técnica, los científicos han
podido estudiar procesos importantes como la propagación de células cancerígenas en
organismos vivos o la forma en que trabajan las células nerviosas en el cerebro, el
desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, el crecimiento de bacterias patogénicas, la
proliferación del virus del SIDA, entre otros.
Por ejemplo, células cancerosas que expresan DsRED pueden implantarse en ratones
salvajes, o transgénicos con expresión de GFP en todas las células. Cuando los ratones
son iluminados con luz azul las células cancerosas pueden ser fácilmente detectadas y
seguidas (en los ratones verdes o normales) permitiendo la localización de las
metástasis y el fenómeno de angiogénesis en tumores en proliferación. Por otro lado,
el modelo permite seguir la evolución comparativa de las metástasis en presencia o
ausencia de distintos fármacos.
Por medio de la tecnología de ADN, es posible fusionar la GFP con otras proteínas
presentes en células vivas, lo cual permite observar en el microscopio óptico la
posición, el movimiento y las interacciones de estas proteínas, las cuales son
normalmente "invisibles" para el ojo humano. De entre las aproximadamente 20.000
proteínas que hay en una célula, es posible marcar justamente la que se desea
estudiar. De esta manera se puede investigar una gran variedad de procesos biológicos
fundamentales, tales como la expresión genética, la división celular o la replicación
cromosómica.
La GFP también tiene una importancia especial en la biología del desarrollo: si se
introduce en un estadio temprano de un embrión, se puede seguir la evolución de las
primeras células, estructuras y órganos.
Por otro lado, la GFP y proteínas similares tienen aplicaciones biotecnológicas,
incluyendo la detección de arsénico en los pozos de agua. Por ejemplo, en partes del
sudeste asiático el arsénico presente naturalmente en el agua está envenenando a
miles de personas. Los investigadores han modificado genéticamente bacterias
resistentes al arsénico que fluorescen en presencia de arsénico. También se han
modificado organismos que fluorescen en presencia de trinitrotolueno o metales
pesados como el cadmio y zinc.
Ya se han generado monos, gusanos, algas, Escherichia coli, y cerdos con GFP en su
genoma, que fluorescen. Y hasta se han fabricado juguetes con GFP que brillan en la
oscuridad.
Los organismos bioluminiscentes son capaces de emitir luz transformando energía
química en lumínica, como las luciérnagas, o bien mediante fluorescencia, absorbiendo
luz de un determinado color (longitud de onda) y liberando la energía absorbida en
forma de luz de una longitud de onda mayor. La primera descripción de un organismo
bioluminiscente data de muy antiguo y se debe a Cayo Plinio Segundo el Viejo (23-79
DC), quien describió en su Historia Natural la existencia de unas medusas en la bahía
de Nápoles que resplandecían con una tonalidad verdosa al ser expuestas a la luz solar.
Plinio desarrolló una técnica para decorar cerámica empleando triturados de estos
animales.
El descubrimiento
La medusa Aequorea victoria se asemeja a un paraguas transparente y posee puntos
verdes relucientes alrededor de su cuerpo, Shimomura (quien trabajaba en aquella
época en la Universidad de Princeton) quería averigüar de dónde procedía ésta
bioluminiscencia. Con el fin de conseguir una respuesta a esta pregunta, el científico
japonés (quien hoy ya tiene 80 años de edad) decidió pasar cada una de sus vacaciones
de verano en Friday Harbor, un pueblo ubicado en la costa noroccidental de Estados
Unidos. Allí se dedicó a recoger medusas junto con su esposa y sus dos hijos. Cada
verano, la familia lograba recopilar alrededor de 50.000 ejemplares—y ésto durante
diecinueve años.
En 1961, Shimomura logró aislar por primera vez una proteína de la medusa Aequorea
victoria. Sin embargo, ésta proteína no emitía luz verde, tal como él lo esperaba,
sino azul. El científico la llamó "Aequorina" y descubrió que eran necesarios iones de
calcio (posiblemente procedentes del agua de mar) para hacerla brillar. Un año
más tarde, el investigador japonés publicó éstos resultados en el Journal of Cellular
and Comparative Physiology, donde además reportó la presenciade una segunda
proteína, la cual brillaba con un colorverde muy intenso al ser irradiada con luz
ultravioleta.
Ésta misma proteína emitía una luz verde opaca enpresencia de la luz del día y
mostraba una apariencia másbien amarillenta al ser sometida a luz artificial.
Shimomura había descubierto la GFP En la década de los setenta, él logró explicar que
el comportamiento característico de la nueva proteína se debía a la presencia de un
determinado cromóforo fluorescente (o fluorocromo) (Fig. 4b)
Después de muchos años fue posible descubrir finalmente de dónde provenía la
bioluminiscencia en la medusa Aequorea.
Lo que ocurre es una transferencia no radiativade energía desde el estado excitado de
la aequorina (enpresencia de iones de calcio) hacia la GFP (éste proceso se llama FRET,
por las siglas en inglés "fluorescence resonanceenergy transfer", y juega un papel muy
importante en muchas de las aplicaciones de la GFP).
El fluorocromo de la proteína verde fluorescente absorbe ésta energía y la convierte
finalmente en luz verde.

El gen apropiado
El estadounidense Martin Chalfie, profesor de biología en la Universidad de Columbia,
estaba trabajando ya en aquella época con el gusano nemátodo transparente
Caenorhabditis elegans y se imaginó que la GFP podría ser un recurso prometedor para
estudiar mejor su sistema.
El biólogo quería introducir la proteína fluorescente en las células del gusano donde
funcionaría como una especie de "señal verde luminosa". Sin embargo, para poder
materializar ésta idea, era necesario conseguir primero el gen apropiado de la GFP
dentro del genoma (o material genético) de la Aequorea victoria.
Ya en esa época el biólogo molecular norteamericano Douglas Prasher se había
dedicado a averiguar ésto, pues él también estaba convencido del gran potencial de
aplicación de la GFP. Al lograr (en 1992) aislar y clonar el gen de la GFP — y determinar
la secuencia exacta de los 238 aminoácidos que lo componen — Prasher estableció
el fundamento para el uso actual de la GFP en los estudios celulares. Aunque su
nombre no aparezca en la lista de los galardonados con el Premio Nobel (éste premio
solo puede ser otorgado a un máximo de tres personas), su trabajo en ésta área fue
esencial.
Un resultado inesperado
Ésta fase comenzó en 1994 cuando Chalfie y la estudiante de postgrado Ghia
Euskirchen lograron expresar el gen de la GFP en la bacteria intestinal Escherichia coli.
Este resultado fue totalmente inesperado, ya que se pensaba que eran necesarias
algunas enzimas especiales para poder generar el fluorocromo de la GFP. El trabajo de
Chalfie demostró lo contrario. A diferencia de lo que se había observado hasta ese
entonces para otras proteínas bioluminiscentes conocidas, la GFP no requería ni de
enzimas ni de ningún otro tipo de moléculas para emitir luz. Gracias a ésta propiedad
no es necesario introducir ningún tipo de sustancias químicas adicionales en las células
para poder realizar estudios en organismos vivos.
Debido a que el fluorocromo de la GFP se forma espontáneamente, esta proteína
puede ser utilizada como marcador para prácticamente cualquier proteína en
cualquier organismo vivo. Chalfie y sus colegas la utilizaron por primera vez en 1994
para iluminar seis neuronas sensoriales en el gusano
La proteína luminosa es importante, dice Chalfie, "porque proporciona una etiqueta
hereditaria que permite el estudio no invasivo de las actividades celulares entejidos y
organismos vivos". Sin embargo, la tecnologíaGFP también tiene una desventaja:
Puesto que la célula es inducida a producir la proteína ella misma al ofrecérsele el
ácido ribonucléico mensajero (mARN) de la proteína de fusión, ella lo hará aún cuando
normalmente no necesite de ésta proteína [el mARN es un mensajero que se encarga
de transportar la información acerca de la secuencia de aminoácidos de la proteína
desde el ADN ("sala de control") hasta el ribosoma ("fábrica de proteínas")].

Un mundo lleno de colores

Durante un tiempo no se sabía exactamente cuál era el mecanismo de formación del
fluorocromo de la GFP, hasta que Roger Y. Tsien y sus colegas de la Universidad de
California en San Diego consiguieron una respuesta a ésta pregunta, ellos demostraron
que el grupo químico fluorescente se forma autocatalíticamente a partir de la
secuencia de aminoácidos Ser 65-Tyr66-Gly67de la cadena peptídica de la GFP. Lo
único que se necesita para que ésto ocurra es la presencia de oxígeno molecular.
Además, por medio de la ingeniería de proteínas, los científicos lograron producir una
gran cantidad de proteínas mutantes tipo GFP con propiedades mejoradas. De esta
manera, ellos pudieron ampliar la gama de colores de la proteína y producir variantes
más estables e intensas en tonos como amarillo, violeta o azul—una contribución muy
importante que representa la base para el estudio simultáneo de diversas proteínas en
una célula, lo cual se logra marcándolas con distintos colores. Sin embargo,
inicialmente no fue posible producir variantes fluorescentes en los colores rojo o
anaranjado, los cuales son particularmente útiles para obtener imágenes en tejidos
vivos. Ésto sólo pudo lograrse a través del sorprendente descubrimiento de los grupos
de investigación de Jörg Wiedenmann incluyendo el rojo. El descubrimiento de la
proteína roja fluorescente en el coral Discosoma (DsRed) ha sido un resultado clave,
dice Lukyanov, "porque la luz roja puede penetrar más profundamente en los tejidos
orgánicos que la luz verde". Además, las proteínas verdes fluorescentes requieren de
luz altamente energética, por ejemplo, luz azul o luz ultravioleta, para ser excitadas, lo
cual puede causarle daños a las células. Por el contrario, las variantes fluorescentes
rojas pueden ser excitadas con luz menos energética—como luz verde o anaranjada—
lo cual representa una clara ventaja para estudios in vivo. Sin embargo, el uso de la
proteína DsRed en su forma naturales bastante limitado, sobre todo debido a la
formación de agregados y tetrámeros.

Gracias a este interesante trabajo, irradian hoy en día las proteínas sucesoras de la
GFP y la DsRed en casi todos los colores del arco iris. Tsien demostró también que es
posible utilizar proteínas fluorescentes para el desarrollo de biosensores, por ejemplo,
para medir concentraciones intracelulares de calcio.