Extracción de ADN

Extracción de ADN

1. Lisis celular
2. Inactivación de nucleasas celulares
3. Separación de los ácidos nucleicos deseados de los restos celulares
 Un procedimiento de lisis ideal, debe ser lo suficientemente riguroso
para perturbar el material de partida, pero lo suficientemente suave
para preservar el ácido nucleico deseado

Un proceso de lisis incluye:

1. Desorganización mecánica (molienda, lisis hipotónica)
2. Tratamiento químico (lisis por detergentes, agentes caotrópicos)
3. Digestión enzimática (proteinasa K)

Se pueden combinar la desorganización de la membrana junto con la inactivación de las nucleasas

intracelulares
Después de la lisis y la inactivación de las nucleasas, los restos celulares
pueden ser fácilmente removidos por filtración o precipitación.

Métodos de purificación:
• Extracción/precipitación
• Cromatografía
• Centrifugación
• Separación por afinidad
Extracción/precipitación
✓Extracciones con solventes.
✓Combinación de fenol y cloroformo es frecuentemente usada para
remover proteínas.
✓Precipitación con isopropanol es generalmente usada para
concentrar los ácidos nucleicos.
✓Otros métodos incluyen, precipitación selectiva de ácidos nucleicos
usando altas concentraciones de sal “salting out” o precipitación de
proteínas usando cambios en el pH
 Extracción de ADN con TécnicaCTAB
El fundamento de esta técnica de extracción se basa en el uso de
Bromuro de Hexadecyl-trimetil-amonio (CTAB), que actúa como agente
caotrópico. Las extracciones con cloroformo retienen el material lipídico,
quedando en la interfase proteínas celulares y en la fase acuosa el
ADN, sales, etc.
Esta técnica es aplicable para la obtención de ADN a partir de sangre
anticoagulada como también a partir de material espermático (Corach,
1991; 1995). En el caso de muestras de sangre anticoagulada se puede
partir de pequeños volúmenes (0,5 a 2ml) obteniéndose material
suficiente.

Material de la Cátedra Genética Molecular-Trabajos Prácticos 2011 .

UNaM. FCQyN
http://www.pbslearningmedia.org/asset/biot09_int_extraction/

http://www.pbslearningmedia.org/asset/biot09_int_extraction/
Electroforesis en gel de agarosa/poliacrilamida
Técnica sencilla empleada para la separación de ADN,ARN y
proteínas.
Permite separar los ác. Nucleicos a lo largo de un campo
eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica.
La tinción del gel/ muestra con algún colorante, ej, Bromuro de
Etidio (sustancia fluorescente que se intercala en la molécula
de ADN), y la exposición con luz ultravioleta, permite observar
el resultado de esta migración
Los geles pueden confeccionarse de varias formas, tamaños y porosidad, y
pueden correr en un número diferente de configuraciones.
La elección de los parámetros va a depender del tamaño de los fragmentos
que se desean separar
Geles de poliacrilamida
Mayor poder resolutivo, separan fragmentos que difieren en 1pb.
Efectivos para fragmentos pequeños (5-500pb)
Se corren verticalmente.
Difíciles de prepara y manejar.
Geles de agarosa
Menor poder resolutivo. Separan fragmentos desde 200 a 500kb.
Se corren horizontalmente, en un campo eléctrico de fuerza y dirección
constante.
Fragmentos mayores (hasta 10.000kb) electroforesis campo pulsante.
Reacción en Cadena de la
Polimerasa
PCR

Polymerase Chain Reaction

Técnica empleada para la clonación in
vitro de regiones de ADN
APLICACIONES
✓ Diagnóstico de enfermedades de origen genético
✓ Detección de secuencias de ADN perteneciente a organismos
patógenos presentes en muestras clínicas
✓ Detección de Patógenos en la industria alimentica
✓ Identificación genética de muestras forenses

¿Qué otras aplicaciones piensas que puede tener el uso

de está técnica?
 Otras…

• Generación de bibliotecas de ADNc desde pequeñas cantidades de ARNm.

• Generación de grandes cantidades de ADN para secuenciación.
• Análisis de mutaciones.
• Análisis de polimorfismos poblacionales en diferentes organismos.
Inconveniente..
La relativamente alta tasa de incorporación errónea de nucleótidos. La Taq
polimerasa incorpora 2 x 10-4 nucleótidos incorrectos por ciclo de PCR.
De donde vienen las enzimas????
Precauciones

¿Porque?

Debido a que la PCR es capaz de amplificar cantidades

tan pequeñas de ADN como una sola molécula, deben
tomarse precauciones para evitar la contaminación con
trazas de ADN exógeno.
• De ser posible, manipular bajo flujo laminar equipado con luz
ultravioleta. Emplear guantes y tomar la precaución de autoclavar
todos los materiales antes de utilizarlos.
• Preparar uno mismo las soluciones de trabajo y almacenarlas en
pequeñas alícuotas.
• Para preparar los reactivos emplear material de vidrio y plástico libres
de contaminación de ADN. Luego de usar cada alícuota de reactivo,
descartar. En primer lugar, colocar en el tubo todos los reactivos que va
a emplear en la reacción antes que el templado (ADN).
¿Qué necesitamos?
1. Oligonucleótidos
2. Buffers
3. Taq ADN polimerasa
4. Desoxirribonucleótidos Trifosfato (dNTPs)
5. Templado de ADN
6. Ciclador Térmico
Etapas
• Desnaturalización: Empleada para romper los puentes de hidrógeno
que mantiene unidas las hebras del templado de ADN.
• Apareamiento o “annealing”: permite que los “primers” hibriden con
el ADN templado.
• Extensión: se efectúa una reacción de polimerización mediante la
acción de la Taq polimerasa.
¿Chequeo de los fragmentos obtenidos?

• Electroforesis

¿Qué podemos discriminar con laelectroforesis?

La electroforesis en agarosa o geles de poliacrilamida es el método
standard utilizado para la separación, identificación y purificación de
fragmentos de ADN.

LA TÉCNICA ES SIMPLE Y RÁPIDA DE REALIZAR

1. Electroforesis en geles de Agarosa
2. Electroforesis en geles de Poliacrilamida
Marcador de Peso
Molecular
Electroforesis Capilar
¿Podemos evidenciar diferencias a nivel de secuencia?
¿Podemos evidenciar diferencias a nivel de secuencia?

NO
METODOS DE SECUENCIACIÓN