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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502504

GUÍA No: 3.2. DETERMINACIÓN DE PROTEINA BRUTA POR EL MÉTODO DE KJELDAHL

I. EL PROBLEMA

Determinar el contenido de proteína bruta presente en muestras de harina de pescado, harina

de soya y/o harina de trigo comerciales.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Como se ha discutido, las proteínas constituyen un grupo de biomeléculas muy importante,

puesto que son las responsables de muchas funciones biológicas: Como la formación de
tejidos y la actividad enzimática.

Conocer los contenidos de proteínas presentes en los tejidos, ha sido objeto de varios estudios
y en consecuencia se han desarrollado muchas técnicas de análisis.

Existen varios métodos mediante los cuales se puede determinar el contenido de proteína
bruta, proteína real y nitrógeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen
animal.

™ MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Estos métodos son particularmente útiles en la valoración del contenido de proteína real,
puesto que se basan en la formación de complejos coloreados entre algunos aminoácidos
proteicos ó el enlace peptídico, con reactivos específicos.

Dentro de los métodos clásicos están el que emplea el reactivo del biuret, el cual se
fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y
el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino. También es de
uso frecuente el método que emplea la espectrofotometría con base en la reactivo de Folin.

En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibración con una proteína patrón,
normalmente la albúmina de huevo o la albúmina bovina estabilizada estándar, y en las
mismas condiciones de reacción se hace el desarrollo de la coloración para la muestra que se
esté analizando.

™ MÉTODOS VOLUMÉTRICOS

Dentro de estos métodos está el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversión del

nitrógeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas por
volumetría ácido base.
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El método de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestión de la muestra,
destilación con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoración ácido base de este
amoniaco.

En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son oxidados hasta dióxido de carbono
y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la acción de un
agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado
diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente oxidante, pero en todos los
casos, el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el nitrógeno proteico en
sulfato de amonio.

En la etapa siguiente, mediante la acción de una base fuerte, generalmente hidróxido de sodio
al 40%, se libera el amoníaco de la sal de amonio. Cuando la valoración se va a efectuar por
retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen
exactamente medido de un ácido estándar. Una variante utilizada comúnmente, consiste en
recibir el amoniaco (hidróxido de amonio) sobre ácido bórico aproximadamente al 4% de tal
manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente.

En la etapa final, se hace la valoración de acuerdo con el proceso empleado para la

recolección. Así por ejemplo, si el hidróxido de amonio, se recibió sobre un volumen
exactamente medido de un ácido estándar, la titulación se hace con una base valorada y en
presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el ácido que no reaccionó
con el hidróxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidróxido de amonio
producido.

En la variante de Steyemark, el hidróxido de amonio se recoge sobre ácido bórico no valorado

y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un ácido estándar.

Reacciones método Kjeldahl – Variante Steyemark

Digestión: Proteína(s) + H2SO4(c) + Catalizador(s) CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac)

∆

Liberación del NH3: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)

Arrastre con vapor: NH3(g) + H2O(g) NH4OH(ac)

Recolección: NH4OH(ac) + H3BO4(ac) NH4H2BO4 + H2O

Titulación: NH4H2BO4(ac) + HCI(ac) NH4CI(ac) + H3BO4(ac)

III. BUSQUEDA DE INFORMACIÓN

Elabore el preinforme, según lo pre-establecido desde primer semestre y que contenga los
resultados de las siguientes consultas:

™ Composición promedio en porcentaje de carbohidratos, lípidos y proteínas la harina de

trigo, harina de pescado y harina de soya.
™ Composición promedio de las diferentes fracciones proteicas que constituyen cada una
de las proteínas presentes en cada harina a analizar.
™ Composición promedio en aminoácidos esenciales de cada una de las proteínas a
analizar
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IV. MATERIAL EQUIPOS Y RECTIVOS

Material biológico:

™ Harina de trigo. 5g
™ Harina de soya 5g
™ Harina de pescado 5g

Material y equipo de laboratorio, de uso general

™ Balanza analítica
™ Equipo de digestión y destilación para Kjeldahl
Material por grupo de trabajo

™ Balón para kjeldahl 1

™ Erlenmeyer de 500 mL 1
™ Probeta de 100 mL 1
™ Probeta de 200 mL 1
™ Vidrio de reloj 1
™ Espátula 1

Reactivos

H2SO4 R. A
NaOH 40%
H3BO4 4%
HCI 0.1 N
Catalizador en pastillas (de 1 g), que contienen la siguiente mezcla catalizadora:
Mezcla catalizadora: K2SO4 97 %
CuSO 5H2O 1.5 %
Selenio 1.5 %
Ácido Bórico al 4% con indicador de Tashiro:

Preparación. A un litro de ácido bórico al 4% agregar 5 mL de indicador de Tashiro, (que se

prepara según se describe a continuación) y ajustar el pH a 4.2

Indicador de Tashiro:
Disolver 0.5 g de rojo de metilo y 1 g de verde de bromocresol, en 100 mL de etanol del 96%.

V. PROCEDIMIENTO

Revisión del equipo

™ VERIFICAR EL BUEN FUNCIONAMIENTO DE TODO EL EQUIPO KJELDAHL,

DIGESTOR, EXTRACTOR Y DESTILADOR.
™ LAVAR CON AGUA DESTILADA LOS REFRIGERANTES Y LOS EXTREMOS DE
RECOLECCIÓN DEL DESTILADO
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Digestión

™ Pesar con precisión de centésima de gramo, la cantidad de muestra según la siguiente

tabla:

MUESTRA CANTIDAD EN GRAMOS

HARINA DE PESCADO 0.30

HARINA DE SOYA 0.40
HARINA DE TRIGO 0.50
SACAROSA (BLANCO DE REACTIVOS) 0.40

™ Transferir cada una de las muestras pesadas a sendos balones Kjeldahl previamente
marcados.
™ Agregar a cada balón que contiene la correspondiente muestra, 20 mL de H2SO4 R. A
™ Agregar a cada balón2 pastillas de catalizador
™ Colocar los balones que contienen la mezcla de la muestra, el ácido sulfúrico y el
catalizador sobre las resistencias del digestor Kjeldahl.
™ Encender las resistencias de calentamiento y el extractor del equipo Kjeldahl ractor.
™ Permitir que transcurra la digestión, vigilando que no haya escape de gases y rotando
el balón esporádicamente para facilitar la digestión del material que salta a las paredes,
hasta que la mezcla sea transparente. (se toma entre 45 minutos y una hora)
™ Una vez la mezcla este transparente, apagar las resistencias, SIN APAGAR EL
EXTRACTOR, y dejar enfriar por 15 minutos en el equipo.
™ Retirar los balones del digestor, y terminar de enfriar cuidadosamente por enfriamiento
exterior del balón al chorro de agua.

Destilación

™ Una vez frío el contenido del balón, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO

GAFAS Y GUANTES, 200 mL, medidos con probeta, de agua destilada, a cada uno de
los balones.
™ Dejar enfriar el balón a temperatura ambiente por 15 minutos.
™ Mientras transcurre este tiempo de enfriamiento, colocar en el extremo de cada
destilador, un erlenmeyer de 500 mL de capacidad, al que se le han agregado 100 mL
de ácido bórico que contiene el indicador de Tashiro (solución de color rojo vino)
™ Encender las resistencias del destilador Kjeldahl y el sistema de refrigeración
™ Terminar el enfriamiento del balón exteriormente al chorro de agua.
™ Agregar a cada balón, de 10 a 15 perlas para controlar la ebullición
™ Una vez frío el contenido del balón, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO
GAFAS Y GUANTES, 80 mL, medidos con probeta, de solución de NaOH al 40 %
™ Instalar cada balón en una hornilla del destilador, ajustar y agitar.
™ Dejar que transcurra la destilación hasta recoger aproximadamente entre 150 y 200 mL
de destilado en erlenmeyer de recolección, cuyo contenido cambia de color a azúl
verdoso a medida que se recoge el amoniaco. (se toma aproximadamente de 10 a 15
minutos)
™ Recogido el volumen de destilado mencionado anteriormente, retirar los erlenmeyers
colectores.
™ Apagar las resistencias de calentamiento, SIN APAGAR EL SISTEMA DE
REFRIGERACIÓNEXTRACTOR.

Titulación.

™ Colocar en un erlenemeyer aproximadamente 150 mL de ácido bórico con indicador,

que se utilizará como referencia para el color del punto final de la titulación.
™ Titular el contenido de cada destilado con HCl 0.1 N, hasta que el color azul verdoso
cambie nuevamente a rojo vino igual al del el erlenmeyer de referencia.
™ Leer y anotar el volumen de HCl gastado en cada titulación.
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VI. TABLAS DE DATOS

El estudiante debe elaborar la(s) tabla(s) de datos con base en el (los) procedimiento(s) e
incluirla(s) en el preinforme correspondiente.

VII. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRÁCTICA.

™ Calcular el contenido de proteína, de cada muestra según la siguiente ecuación:

% Proteina = VHCl mL x NHClm.e.q x 14 mg de N x 6.25 100 .

mL x 1 m.e.q x (Peso muestra en mg)

™ Consultar de donde sale el valor 6.25, de la ecuación, que es un factor de conversión

de porcentaje de nitrógeno a proteína
™ Consultar otros factores de conversión, de donde salen y cuando se aplican
™ Analizar los resultados obtenidos, por comparación con los niveles promedio de
proteína consultados para el preinforme. y evaluar, desde el punto de vista de
contenido de proteínas, la calidad nutricional de las muestras analizadas,
complementar el análisis con la consulta hecha en el preinforme sobre composición en
aminoácidos esenciales

™ Consultar por qué, el valor de proteína, determinado por este método, es de proteína
bruta y no de proteína real.
™ Complementar según las instrucciones adicionales del docente.

VII. BIBLIOGRAFÍA.

- Bernal de Ramírez,I. 1993. Análisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias

exactas, físicas y naturales Colección Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogotá.
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