Tema 4 - Cromatografía 2019 PDF

métodos de separación
de muestras
tema 4:
cromatografía
ÍNDICE:
1. Nociones previas
2. Elementos del sistema cromatográfico y
principios de separación
3. Clasificación de las técnicas cromatográficas
4. Cromatografía sobre papel
5. Cromatografía de capa fina
nociones previas
Área de Bioquímica y Biología Molecular Dr. Emilio Gil Martín
Михаил Семёнович Цвет = Mijaíl Semiónovich Tsvet

Mikhail Tswett, botánico ruso (1872−1919):
En 1903, Tswett utilizó la cromatografía para separar pigmentos
de plantas.
Denominó a este novedoso procedimiento “cromatografía” (Chroma significa “color” y
Graphein “escribir”) porque el resultado del análisis quedó “escrito en colores” a lo largo
de la columna del absorbente.
TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

Tswett escribió:
“esta separación resulta virtualmente
completa si, después de la disolución
de pigmentos, se hace pasar
disolvente puro por la columna. Igual
que los rayos de luz en el espectro, los
diversos pigmentos de una mezcla son
separados en la columna de carbonato
cálcico de acuerdo con sus
propiedades y, por tanto, cabe
determinarlos cualitativa y
cuantitativamente. A esta propiedad la
he denominado cromatografía, y al
método correspondiente método
cromatográfico”.
Las cromofilas en el mundo vegetal y animal, 1908.

Mikhail Tswett inventó la

cromatografía investigando
sobre los pigmentos vegetales.
Mediante una aplicación de
cromatografía de adsorción en
columna, utilizando carbonato
cálcico como adsorbente y una
mezcla de éter de
petróleo/etanol como eluyente,
logró separar las clorofilas y
los carotenoides.
Tswett hizo énfasis en que las

substancias incoloras también
podían separarse utilizando este
mismo principio.

aDsorption aBsorption
En un sistema constituido por dos fases, se entiende por aDsorción (retención en

superficie) la tendencia de un componente del sistema a concentrarse en la interfase,
cuya composición interfacial es diferente a la de las fases que lo integran.
superficie o
interfase
Existe una diferencia nítida entre los fenómenos de aDsorción y aBsorción. En la

aBsorción se produce la penetración física de una fase en la otra. Por el contrario, si
ambos fenómenos se dan simultáneamente el resultado se denomina Sorción. En
este último caso puede ser realmente muy difícil separar los efectos de ambos
fenómenos, ya que, entre otras cosas, uno puede influir en el otro.
aDsorción aBsorción Sorción

Entre 1941 y 1944, dos químicos ingleses, Archer JP Martin y Richard LM Synge
mezclaron sílice en polvo con la mitad de su peso en agua y, con este gel hume-
decido, rellenaron columnas similares a las de Tswett, a través de las cuales,
después de colocar muestras de proteínas hidrolizadas, hicieron pasar disolven-
tes orgánicos inmiscibles con el agua (como el cloroformo).
En dichas columnas se separaban mez-

clas de aminoácidos, los cuales corrían
a diferente velocidad de acuerdo con sus
afinidades relativas por el agua y el di-
solvente orgánico, es decir, lo que los
químicos denominan coeficientes de re-
parto.
Martin y Synge fueron recompensados

con el Premio Nobel de Química por su
sencillo y brillante procedimiento, que
permitió determinar qué aminoácidos y
en qué proporción entran a formar parte
de una proteína.
Nobel Prize in Chemistry, 1952.

aplicaciones de
la cromatografía

Why Use Chromatography?

 Para conseguir purificar una proteína (en general, cualquier biomolécula o macromolécula)
de entre la ingente riqueza química de la célula.
Durante el pasado siglo, la cromatografía

se aupó a la cima de los procesos de
separación, identificación, purificación
y caracterización de biomoléculas. Así,
en la actualidad, la cromatografía dispone
de aplicaciones en todos los campos de
las ciencias físicas y biológicas.
Prueba de su importancia lo
testimonia el hecho de que
entre 1937 y 1972 se
otorgasen 12 Premios Nobel
por trabajos en los que la
cromatografía jugó un papel
vital.

elementos del
sistema
cromatográfico
y principios de
separación
técnicas de separación de muestra en

dos fases inmiscibles: cromatografía
La cromatografía se lleva a cabo en sistemas compuestos por dos fases*

inmiscibles (no reactivas), en las cuales se distribuyen los componentes
de la muestra.
En los sistemas bifásicos, ambas fases se encuentran en contacto y las

moléculas a separar se distribuyen entre ellas.
Una de las fases está en movimiento (se
denomina fase móvil) y es la encargada
de impulsar las moléculas a separar,
mientras que la otra está inmovilizada
(recibe el nombre de fase estacionaria) y
es la responsable de ejercer la fuerza de
oposición al movimiento anterior para
provocar el retardo de los compuestos de
la muestra a fraccionar.
La afinidad que tiene cada componente

de la muestra por cada una de las fases
*Cada una de las porciones macroscópicas (o sistemas
es lo que determina su separación. homogéneos) en una composición química heterogénea.

La IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry) define la cromatografía
como sigue:
Cromatografía es un método físico de separación en el que los
componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria (denominada fase estacionaria),
mientras que la otra (que recibe el nombre de fase móvil) se
desplaza (percola*) en una dirección definida. Por fase móvil se
entiende “un fluido que percola a través de o sobre la cama de
la fase estacionaria en una dirección definida”. Esta fase puede
ser un líquido, un gas o un líquido supercrítico, mientras que la
fase estacionaria puede tratarse de un sólido, un gel o un
líquido. Si se trata de un líquido, debe, en todo caso, estar
distribuido sobre un sólido, el cual puede contribuir o no al
proceso de separación.
*Percolación; dícese del paso lento de un fluido a través de un sólido poroso.

fase fuerzas
fuerza estacionaria o adsorbente de
retardo
de
impulso
fase móvil, disolvente, eluyente
fuerzas
de
fuerza retardo
de
impulso
fuerzas
de
fuerza retardo
de
impulso
El movimiento de la fase móvil sobre la fase estacionaria (percolación) desplaza los componentes de la muestra sobre esta última.
Las interacciones de los componentes de la muestra con la fase estacionaria conducen a un retraso de su desplazamiento, que será
diferente según la naturaleza y propiedades de cada uno de ellos. Estas interacciones específicas conducen finalmente a que los
elementos constituyentes de la muestra queden repartidos entre ambas fases según la afinidad de cada uno de ellos por dichas
fases y, eventualmente, a que la compleja mezcla inicial se resuelva en fracciones de componentes aislados y puros.

Ci (agua)
Reparto químico Ki =
Ci (aceite)
en el equilibrio
aceite reparto
(distribución,
partición) del
agua trazador i entre
las fases
Visualización del fenómeno del reparto químico. En rojo un alcohol trazador, tal
como el alcohol isopropílico (K = 6–9). En azul se representa un éster trazador,
tal como el acetato isopropílico (K = 0.1–0.5). K desciende con la temperatura.

principle of (partition) chromatography
injection
Solute dissolved
in liquid phase
coated on
surface of solid
support
flow
analyte
fraction
collection
output
solid
support
stationary
phase

Las moléculas rojas son más solubles

en el líquido (adsorbido a la fase
estacionaria) que las moléculas verdes.

El reparto de un soluto no se limita a su distribución entre dos líquidos inmiscibles,

sino que el coeficiente de reparto puede describir distribuciones del soluto entre
dos fases tales como sólido/líquido o líquido/gas y debidas a interacciones diversas
(de carga, de filtración, de afinidad, etc).

mixture of A and B free in mobile

A phase and adsorbed on the
free A adsorbed stationary phase Ki ≈ [S]2/[S]1
B adsorbed
B
stationary free – completely dissolved in the liquid or
phase particle gaseous mobile phase
adsorbed – stuck on the surface of the
liquid or gas of mobile phase solid stationary phase
dynamic equilibrium between A and B and the mobile/stationary phase
B A B
BA AB
mobile
liquid or gas A phase
containing
mixture of A A B A flow
and B A A
B A A B
B

fundamentos de la cromatografía
muestra:
tres componentes
mezclados
se dispone una mezcla

sobre una fase estacionaria
fase
estacionaria
se hace fluir una fase

móvil sobre la estacionaria
dependiendo de la afinidad
relativa por ambas fases, los
componentes de la mezcla
primitiva se separan
fase móvil
What is Chromatography?
La cromatografía opera por el mismo principio que la extracción,
pero con una fase retenida en una localización fija (estacionaria)
y otra (móvil) desplazable sobre o a través de la anterior.
Air flow

Air flow

Air flow

Air flow

Emilio finally shut up for a while!

Back in 15 minutes.

clasificación de
las técnicas
cromatográficas

clasificación de la
cromatografía según el
diseño y disposición de la
fase estacionaria

cromatografía
en placa
FASE ESTACIONARIA FASE MÓVIL

cromatografía en papel o en placa

(cromatografía en capa fina)
cromatografía en capa fina
cromatografía en papel
La fase estacionaria, unida a una matriz conveniente, es capeada finamente sobre

una lámina de vidrio, plástico o metal; la fase móvil pasa a través de la fase
estacionaria (dispuesta tanto vertical como horizontalmente) por capilaridad.
Esta modalidad tiene la ventaja de que permite el procesamiento simultáneo de más
muestras que la cromatografía en columna.
Dentro de esta modalidad se incluye la cromatografía sobre papel, una de las
primeras aplicaciones cromatográficas y que hoy cuenta ya con pocas aplicaciones en
uso.
cromatografía
en columna
La fase estacionaria, unida a una matriz (un soporte

insoluble e inerte), se empaqueta en una columna de
vidrio, plástico o metal.

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-6.html
muestra con la mezcla
de moléculas flujo de la
(proteínas, péptidos, fase móvil
etc)
flujo
de la
fase
móvil
la separación se opera con arreglo

a las diferencias en:
• peso molecular o tamaño

• carga
• hidrofobicidad
• afinidad
tiempo 1 2 3 4 5

cromatografía de baja y alta presión

La fase móvil se hace circular
bien por gravedad o bien por
bombeo (en estos dos primeros
casos se habla de cromatografía
líquida de baja presión o, simple-
mente, de cromatografía líquida)
o inyección de un líquido o un gas
a presión (cromatografía de alta
presión como la HPLC/CLAE o la
cromatografía de gases, respecti-
vamente).
cromatografía de gases cromatografía en columna

HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA
clasificación de la cromatografía
según la naturaleza física de las
fases
(el estado físico de cada fase determina el principio de
separación)
cromatografía fase estacionaria fase móvil principio de separación

adsorción sólido líquido adsorción
líquido−líquido líquido líquido solubilidad diferencial
gases líquido gas volatilidad
Las aplicaciones de las diferentes variantes cromatográficas dependen de las diferentes fases
alternativas que se pueden utilizar. Así, la cromatografía de adsorción se limita al uso de unos
pocos adsorbentes, mientras que para la cromatografía líquido‐líquido y la cromatografía de
gases puede elegirse entre un gran número de fases estacionarias. En la actualidad, la
cromatografía líquido‐líquido, en su variante de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC), es
la que ofrece la mayor flexibilidad, con una amplia gama de fases estacionarias y un número casi
ilimitado de fases móviles disponibles.

tipos de aplicaciones cromatográficas según

los procesos dominantes en la separación de
los componentes de la muestra
cromatografía de adsorción, cromatografía hidrofóbica: un equilibrio

de adsorción entre una fase estacionaria sólida y una fase móvil
líquida
cromatografía de partición, cromatografía líquida de fase reversa,
cromatografía iónica, cromatografía quiral, cromatografía gas–líquido,
cromatografía de contracorriente: un equilibrio de partición entre una
fase estacionaria líquida y una fase móvil líquida o gaseosa
cromatografía de INTERCAMBIO IÓNICO, cromatoenfoque: un
equilibrio de intercambio iónico entre un intercambiador iónico que
actúa como fase estacionaria y una fase móvil electrolítica
cromatografía de EXCLUSIÓN MOLECULAR: un equilibrio entre una
fase líquida inmovilizada en el interior de los poros de una estructura
porosa estacionaria y una fase móvil líquida
cromatografía DE AFINIDAD, cromatografía de inmunoafinidad,
cromatografía de afinidad con lectinas, cromatografía de afinidad con
metales quelantes, cromatografía con ligando marcado, cromatografía
covalente: un equilibrio entre un ligando inmovilizado y una fase móvil
líquida

En la práctica es bastante habitual que

dos o más equilibrios de distribución de
los mencionados se vean implicados
simultáneamente en la separación
cromatográfica.

cromatografía sobre
papel ascendente
dispositivo para
la cromatografía
ascendente
sobre papel
La cromatografía sobre papel, una de las
primeras en la historia de la cromatografía, ha
desempeñado un papel fundamental en el
análisis bioquímico, ya que una buena parte de
la elucidación de las rutas del metabolismo
intermediario se pudo llevar a cabo gracias a su
concurso.
El equipamiento necesario, así como el proce-

dimiento analítico son sencillísimos.

dejando huella
En España fueron bioquímicos los que introdujeron las pruebas de cribado neonatal
(prueba del talón) para la detección precoz de enfermedades metabólicas congénitas, la
mayoría irreversibles y que cursan con retraso mental. En 1968 se inauguró en Granada por
iniciativa del Prof. Federico Mayor Zaragoza el CIAMYC (Centro de Investigación de
Alteraciones Metabólicas y Cromosómicas), primer centro oficial para la detección de estas
enfermedades. El éxito que le acompañó alentó iniciativas similares en otras regiones de
España hasta llegar a generalizarse a finales de la década de los 70 a todo el país.
Mayor Zaragoza conoció estos programas

durante una estancia de investigación (1966-
7) en el grupo del professor Hans Krebs
(Nobel de Medicina en 1953).
Entre las primeras técnicas de cribado

(screening) se encontraba la cromatografía
de aminoácidos en papel o en capa fina.

cromatografía ascendente sobre papel
Las moléculas se separan a medida que ascienden sobre el papel.

La distancia que ascienden depende de su tamaño y de su solubilidad
en el solvente (fase móvil).

cromatografía ascendente
sobre papel: desarrollo

desarrollo y revelado de un cromatograma

en papel
depósito de papel seco y

la muestra avance del frente de la fase móvil revelado
sentido de flujo de la fase móvil
marcar sobre el papel la distancia migrada por el frente

a
b
c

revelado y documentación
del cromatograma
papel seco y
revelado
e a bc
sentido de flujo de la fase móvil

a
b
c
Rfa = a/e
Rfb = b/e
Rfc = c/e
distancia migrada por un componente

Rf =
distancia migrada por el frente
Rf es un parámetro adimensional cuyo valor es característico de cada molécula corrida en presencia de
una fase móvil y estacionaria determinadas.

TEMA4_DEMOS de cromatografía.ppt


desarrollo de la cromatografía en papel

eluyente
pinza varilla
de cubeta de
soporte de soporte
eluyente
papel papel
cubeta
de
vidrio
exceso
eluyente de
eluyente
ascendente descendente

cromatografía bidimensional en papel
sentido de flujo
origen del segundo
eluyente
separación si
sentido de flujo sólo se utiliza el
del primer segundo
eluyente eluyente
separación si se
utiliza ambos
eluyentes
secuencialmente
separación si
sólo se utiliza el
primer eluyente

cromatografía en capa fina

Thin-Layer Chromatography (TLC) or planar
chromatography
TLC en silicagel
soporte de vidrio, plástico (poliéster) o
lámina de aluminio con un recubrimiento
extendido uniformemente de dióxido de
silicio (silicagel o gel de sílice) de 0.25
mm de espesor y, generalmente, 20 cm
de lado
muestra (mezcla de moléculas)

el solvente (fase móvil) asciende
por la fase estacionaria
Como la capa es muy fina, por lo general el movimiento de la fase móvil encuentra poca
resistencia, es rápido y las moléculas se separan a medida que ascienden sobre la placa.
A medida que la fase móvil se desplaza transporta con ella los componentes de la muestra a
una velocidad concreta, determinada por el coeficiente de distribución entre las dos fases
de cada uno de ellos.
La cromatografía en capa fina se aplica para la separación de moléculas pequeñas, como
los aminoácidos.
el gel de sílice o silicagel

El gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio hecho a partir
de silicato sódico. A pesar de su nombre es un gel sólido y duro.
La sílica es un material polimérico a base de ácido ortosilícico (SiO2 + H2O →

H2SiO3), la forma hidrosoluble del silicio, que se encuentra abundantemente en el
agua de mar. Los numerosos grupos silanol (SiOH) hacen de él un medio hidrofílico.
Estos grupos pueden derivatizarse para propósitos cromatográficos concretos. Las
matrices de sílica son estables en el intervalo de pH 3–8.
Forma habitual del gel de sílice o silicagel, la forma granular y porosa del dióxido de silicio.

Su gran porosidad, de alrededor de 800 mL/g, le convierte en un gran absorbente de agua. Por
este motivo se utiliza para reducir la humedad en espacios cerrados; normalmente puede absorber
hasta un 40% de su propio peso en agua. Es un producto que se puede regenerar una vez
saturado, si se somete a una temperatura de entre 120-180ºC. Calentándolo desprenderá la
humedad que haya absorbido por lo que puede reutilizarse una y otra vez sin que ello afecte a la
capacidad de absorción, ésta sólo se verá afectada por los contaminantes que posea el fluido
absorbido.

-
+ O OH
+
Si Si
-
O O
stationary phase: silica -
(SiO2)
OH grupo
OH silanol
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
O
Si
O
O
O Si OH
O O
O Si
Si
Si
O O O
Si O O O
Si
O
O O Si OH
O O
O O
Si
Si O
O
O O
O

-
+ O OH
+
stationary phase: silica (SiO2) Si Si
-
O O
-
Binding of analytes
to silica
Some analytes (pink)
will bind more than
Electron microscope photograph of a cross
others (blue) and
hence separation is
section through a glass plate with silica
obtained.
layer. Magnification x 500.

stationary phase: silica (SiO2) -

+ O OH
+
Si Si
Electron microscope photograph of a cross section through an -
aluminium sheet with silica layer. Magnification x 500. O O
-

MERCK TLC and MERCK HPTLC Plates

by EM Science® Merck®
For analytical TLC, high performance analytical TLC or preparative TLC.
The sorbents used on these plates are carefully standardized and controlled. Each is characterized by narrow
particle size and pore volume distribution, standardized surface area and activity, high resolution and capacity. Pre-
coated products are stable and economical. Feature uniform, hard, abrasion-resistant coating.
Plate Dimension Layer Depth Fluorescent Pore Size

Sorbent Type Application Item No. Unit Price USD
(cm) (m) Indicator (Å)
Silica Gel 60 F254 TLC 2.5 x 7.5 250 Yes 60 EM-15327-1 Pack of 100 $311.34
Silica Gel 60 F254 TLC 5 x 10 250 Yes 60 EM-5789-2 Pack of 25 $166.91
Silica Gel 60 F254 HPTLC 10 x 10 200 Yes 60 EM-5628-5 Pack of 25 $314.50
Silica Gel 60 F254 HPTLC 10 x 20 200 Yes 60 EM-5642-6 Pack of 50 $618.92
Modo de fabricación: https://www.youtube.com/watch?v=0cgqa1bby5I

En las aplicaciones de TLC de fase normal la monocapa que actúa como fase
estacionaria puede estar compuesta de otros materiales, alguno parecido a la silica,
como la alumina (Al2O3).
stationary phase: alumina (Al2O3)

Acidic: —Al–OH O OH OH OH OH
Neutral: —Al–OH + —Al–O–
Al Al Al Al Al
Basic: —Al–O–
O O O O O O
También son frecuentes las fases estacionarias de celulosa o derivados de ésta,

como el DEAE-celulosa (dietilaminoetil celulosa) o la PEI-celulosa (polietilenimina
celulosa) empleados en las aplicaciones de intercambio iónico. Para las aplicaciones
de fase reversa, el SiO2 se derivatiza con cadenas hidrocarbonadas.

equilibrado y marcación de la
cubeta cromatográfica
se opera igual que la cromatografía en papel ascendente
glass TLC inner walls of

chamber the chamber
mobile phase (running solution) layered with
filter paper*
solvent front
(drawn lightly in pencil)
watch glass
filter paper
starting line,
baseline, origin
*The filter paper should leave a

strip of the chamber wall
exposed, to continue the
chromatographic process without
1 – 1.5 cm 2 – 2.5 cm
uncovering the camera

TLC vertical development: effect of gravity
in pre-saturated
chamber
migration distance
in non-saturated
chamber
analysis time
Pre-saturation of the layer is often preferable Effect of pre-equilibrium of a TLC plate

Solvent front migrates more rapidly, and better separations
can be achieved.
A menos que se cumpla el requisito de mantener saturada la cubeta en fase móvil o tampón
de desarrollo, pueden producirse irregularidades en el tránsito ascensional del líquido de
desarrollo una vez iniciado el proceso, lo cual puede desembocar en separaciones de baja
calidad.

aplicación de muestras en TLC y HPTLC

cámaras de desarrollo
en TLC

cámaras de desarrollo
en TLC y HPTLC
desarrollo vertical (TLC)

TLC horizontal development:

better performances
cámaras de desarrollo en HPTLC
No effect of gravity.
Migration speed is constant.
Better control of the operating conditions (saturation, evaporation).
Better resolutions can be achieved.
Possibility to develop both sides of the plate (twice more samples per run).
La resolución de las separaciones por TLC se puede mejorar significativamente, al igual que
ocurre con las aplicaciones en columna, utilizando fases estacionarias con partículas
uniformes de pequeño diámetro (en torno a 5 m). Las separaciones conseguidas en
estos medios son de alta resolución.

scanning electron pictures of the cross-sections of TLC and HPTLC plates
Classical silica TLC plates High performance silica HPTLC plate HPTLC LiCrospher® plate
(the world’s first TLC plates based on
spherical silica particles)

revelado del cromatograma
La mayoría de los compuestos analizados por TLC no son identificados en base a su color característico,
sino que la detección de los analitos resueltos se lleva a cabo de maneras diversas en función de las ca-
racterísticas propias de la muestra.
El examen de placa bajo luz ultravioleta permite detectar la presencia de componentes fluorescentes o
que absorban luz ultravioleta. Alternativamente, puede añadirse un compuesto fluorescente indicador a la
fase estacionaria, que emite fluorescencia al excitarse con una lámpara de 260 nm. La presencia de los
componentes de la muestra sobre la placa (que o bien absorben la luz de 260 nm o bien producen un
quenching inespecífico de ella) se revela como manchas azules, verdosas u obscuras sobre el fondo de
la placa que produce una emisión de fluorescencia verde.
También se puede someter la placa a rociado con yodo para
detectar compuestos insaturados, o a rociado con agentes de
desarrollo de color específicos de ciertas moléculas. Es el caso,
por ejemplo, de la ninhidrina, que permite la identificación de
aminoácidos y péptidos.
Si los compuestos son isotópicos, la técnica de elección para el
revelado de la placa es la autorradiografía.
Una técnica general, y no específica, es el rociado de la placa
con ácido sulfúrico al 50% (v/v) o ácido sulfúrico en etanol al
25% (v/v) y posterior calentamiento a 110ºC, lo que resulta, para
la mayoría de las moléculas, en la carbonización y en la
aparición de manchas parduzcas sobre la placa,
correspondientes a los distintos analitos separados.

visualización por densitometría

de precisión
Generalmente, los resultados de las separaciones por TLC se evalúan cualitativa o semicuantita-
tivamente. No obstante, es posible la cuantificación del material presente en una determinada
mancha, la cual puede realizarse de varias formas. Una es mediante un radiocromatógrafo de
barrido, siempre que las muestras sean radioisotópicas. Más generalmente, se suele utilizar un
densitómetro de precisión, con el que se puede cuantificar la absorción en el ultravioleta o en
el visible de un determinado componente separado, o bien obtener un barrido de absorción para
llevar a cabo la identificación de un componente separado del que se desconoce la identidad.
escáner fotodensitograma
fotodensitométrico

documentación del
cromatograma TLC
Aunque la identificación de los analitos suele hacer midiendo su Rf, como este
parámetro no siempre es reproducible, se suele echar mano de patrones, que
se incorporan a la placa y actúan como estándares.
carotina reading the TLC

feofitina
clorofila a
clorofila b
luteína
vidaxantina
neoxantina d solute
Rf 
d solvent

Two-Dimensional Development
Spotting the plate 1st elution 90° rotation 2nd elution
Different mobile phases

= different principles of separation
More complete separation of sample components can be achieved by two-dimensional

development. In this process, the plate is developed normally and following complete
drying, it is turned 90o and the development of the plate is continued. This second
development is performed using a different mobile phase with very different selectivity
(otherwise little further separation would result).

Two-Dimensional Development
For example, plant phospholipids and glycolipids can be separated by first
developing the plate in chloroform-methanol-water (75:25:2.5, by volume) in
the first direction. After allowing sufficient time for drying, the plate is
developed, at right angles to the first development, in chloroform-methanol-
acetic acid-water (80:9:12:2, by volume).
Schematic representation of two-dimensional TLC separation of complex lipids from A. thaliana. Abbreviations,
MGDG, monogalactosyldiacylglycerols; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol;
DPG, diphosphatidylglycerol; PG, phosphatidylglycerol; PE, phosphatidylethanolamine; PI, phosphatidylinositol;
PS, phosphatidylserine; and PC, phosphatidylcholine

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métodos de separación

Михаил Семёнович Цвет = Mijaíl Semiónovich Tsvet

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

Las cromofilas en el mundo vegetal y animal, 1908.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

Mikhail Tswett inventó la

Tswett hizo énfasis en que las

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

En un sistema constituido por dos fases, se entiende por aDsorción (retención en

Existe una diferencia nítida entre los fenómenos de aDsorción y aBsorción. En la

aDsorción aBsorción Sorción

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

En dichas columnas se separaban mez-

Martin y Synge fueron recompensados

Nobel Prize in Chemistry, 1952.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

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Why Use Chromatography?

Durante el pasado siglo, la cromatografía

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técnicas de separación de muestra en

La cromatografía se lleva a cabo en sistemas compuestos por dos fases*

En los sistemas bifásicos, ambas fases se encuentran en contacto y las

La afinidad que tiene cada componente

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

La IUPAC (International Union of Pure and

*Percolación; dícese del paso lento de un fluido a través de un sólido poroso.

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

principle of (partition) chromatography

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

Las moléculas rojas son más solubles

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

El reparto de un soluto no se limita a su distribución entre dos líquidos inmiscibles,

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mixture of A and B free in mobile

dynamic equilibrium between A and B and the mobile/stationary phase

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

se dispone una mezcla

se hace fluir una fase

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FASE ESTACIONARIA FASE MÓVIL

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

cromatografía en papel o en placa

cromatografía en capa fina

La fase estacionaria, unida a una matriz conveniente, es capeada finamente sobre

La fase estacionaria, unida a una matriz (un soporte

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

la separación se opera con arreglo

• peso molecular o tamaño

TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: MÓDULO DE BIOQUÍMICA

cromatografía de baja y alta presión

cromatografía de gases cromatografía en columna

cromatografía fase estacionaria fase móvil principio de separación

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