MÓDULO DE MICROSCOPÍA

PRÁCTICA 1
La utilización de instrumentos y técnicas que nos permiten observar con
claridad estructuras diminutas ha hecho posible el rápido avance de muchas
disciplinas de la Biología.

Siglo XIII: óptica como disciplina científica (Roger Bacon)

1608: Zacharias Jansen construye un microscopio
rudimentario con dos lentes convergentes
1611 Keppler sugiere la manera de fabricar un microsco-
pio compuesto
1665: Robert Hooke, desarrolla un microscopio compuesto
1674: Leeuwenhoek observa protozoarios; nueve años
más tarde descubre las bacterias y hongos.
Los microscopios pueden clasificarse en dos categorías:

► Microscopios ópticos: poseen una combinación de lentes que

amplifican el tamaño de la imagen. Pueden llegar a desarrollar hasta
2.500 aumentos.
Se dispone de distintas modalidades de microscopios ópticos con
diferentes aplicaciones.

► Microscopios electrónicos: utilizan haces de electrones que

impactan sobre el objeto que se desea observar y posteriormente
impresionan una película fotográfica. Al microscopio no se observa la
muestra directamente, sino la fotografía obtenida mediante este
procedimiento. Se consiguen hasta 500.000 aumentos.
Se han desarrollado varios modelos de microscopio electrónico, con
distintas aplicaciones.
 MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO ( LUPA BINOCULAR)

Oculares Iluminación
episcópica
Cuerpos de
oculares
Columna

Cuerpo de
Tornillo de
Objetivos
bloqueo

Pinzas
Tornillo de
enfoque
Platina
 MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO ( LUPA BINOCULAR)
► Existen dos tipos de diseño: convergente (o de Greenough) y de objetivo común
(o Galileo).
► El convergente es el más utilizado. Consiste en usar dos microscopios idénticos
inclinados un cierto ángulo acoplados mecánicamente de forma que enfocan la
imagen en el mismo punto y con el mismo aumento.
► La visión estereoscópica o sensación de relieve se consigue porque a cada ojo
llegan imágenes distintas del objeto observado. Para conseguir una visión correcta
debe regularse la distancia interpupilar de los oculares.
► Tiene un inversor, por lo que la imagen se ve tal y como es, facilitando su
manipulación.
► Los objetos opacos se observan con iluminación episcópica. Las muestras de
contornos más tenues se observan incluidas en agua y con iluminación
diascópica.
► Las lupas más sencillas disponen de dos objetivos intercambiables. Los microsco-
pios estereoscópicos suelen estar dotados de un sistema pancrático (zoom) o un
sistema de cambiador de aumentos.
► Se utiliza para observar objetos grandes sin ningún tipo de preparación.
► Menor amplificación que un microscopio óptico convencional.
► Tiene un campo visual mucho mayor y la lente se sitúa a cierta distancia de la
muestra, que de esta forma puede ser manipulada mientras se observa.
►Es muy utilizado en Botánica y Zoología, para apreciar con detalle las características
macroscópicas de los organismos.
MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

► Sistema mecánico:
sostiene al sistema óptico y
aloja los elementos necesa-
rios para la iluminación y
enfoque de la muestra
► El sistema óptico:
comprende un conjunto de
lentes, dispuestas de tal
manera que producen el
aumento de las imágenes
que se observan a través
de ellas.
► El sistema de iluminación:
comprende las partes del
microscopio que reflejan,
transmiten y regulan la
cantidad de luz necesaria
para efectuar la observa-
ción a través del micros-
copio.
a) Sistema mecánico
► Base o soporte: en ella se sitúa la fuente de iluminación.
► Columna o brazo: sostiene el sistema óptico, la platina y los
tornillos de ajuste macro- y micrométrico.
► Platina: pieza metálica plana unida al brazo mediante un
sistema de cremallera en la que se coloca la preparación u
objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje
óptico, que permite el paso de la luz. Posee unas pinzas que
permiten sujetar la preparación. Dispone de un dispositivo
(carro móvil o desplazamiento X Y) que consta de dos
tornillos que permite deslizar la preparación hacia adelante
hacia atrás y de derecha a izquierda.
► Subplatina: sostiene al condensador y se ubica por debajo de
la platina.
► Tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o
desciende la platina. Permite un ajuste rápido del enfoque de la
preparación, válido para bajos aumentos. Con el tornillo
micrométrico se logra el enfoque exacto y nítido de la
preparación.
► Revólver: es una pieza giratoria provista en los que se
enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos colocan
en posición de trabajo.
 b) Sistema óptico

►Oculares: tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada
extremo: la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.
Su función es aumentar la imagen formada por el objetivo.Son intercambiables y sus
poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Suelen incorporar una escala
micrométrica que permite medir el tamaño del objeto observado.

► Objetivos: formado por un sistema de dos pequeñas lentes ubicadas muy próximas
entre sí (la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal).
Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos:
- Los objetivos secos: su número de objetivos varía con el tipo de
microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos más frecuentemente
utilizados son: 4X, 10X y 40X.
- El objetivo de inmersión: compuesto por un complicado
sistema de lentes. Es necesario colocar una gota de aceite de
cedro, cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio,
entre el objetivo y la preparación. Generalmente, estos
objetivos son de 100X y viene indicado expresamente con la
palabra “oil”.
Caracteristicas de los objetivos:

Escala de reproducción: es relación lineal entre el tamaño del objeto y su imagen

Poder de definición: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos
nítidos. Depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes
utilizadas. Para evitar las aberraciones geométricas se construyen los llamados
objetivos planos o planáticos; los objetivos que están corregidos para las
aberraciones cromáticas se denominan acromáticos, semiapocromáticos y
apocromáticos (los de mayor calidad)
Límite de resolución: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para
que puedan visualizarse por separado. A mayor distancia, menor poder de
resolución. Viene limitado por la longitud de onda de la radiación empleada
(microscopio óptico, el límite de resolución máximo de 0,2 décimas de micrómetro
y en el microscopio electrónico llega a 10 Ǻ).
Poder de penetración: es la propiedad de permitir la observación simultánea de
varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de
reproducción o aumento.
Distancia frontal: es la distancia de la lente frontal a la preparación cuando está
enfocado. Disminuye cuando mayor es el aumento del objetivo.
Aumento total: es el producto del aumento del objetivo y del ocular.
Campo visual: es el círculo visible que se observa a través del microscopio.
Cuanto mayor es el aumento del objetivo, menor es el campo visual.
 c) Sistema de iluminación

► Fuente de iluminación: es la lámpara ubicada en la base del sistema.

► Condensador: formado por un sistema de lentes que concentra la luz sobre el plano
de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo
del objetivo, evitando que la luz se disperse. Se sitúa debajo de la platina y su lente
superior es generalmente plano-convexa; puede deslizarse verticalmente sobre un
sistema de cremallera (se baja objetivos de poca potencia y se acerca a la prepara-
ción cuando se utilizan objetivos de gran aumento.

Diafragma: el condensador en su parte inferior está provisto de un diafragma-iris, que regula la

contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resoluc
 c) Sistema de iluminación

► Fuente de iluminación: es la lámpara ubicada en la base del sistema.

► Condensador: formado por un sistema de lentes que concentra la luz sobre el plano
de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo
del objetivo, evitando que la luz se disperse. Se sitúa debajo de la platina y su lente
superior es generalmente plano-convexa; puede deslizarse verticalmente sobre un
sistema de cremallera (se baja objetivos de poca potencia y se acerca a la prepara-
ción cuando se utilizan objetivos de gran aumento.

► Diafragma: el condensador en su parte inferior está provisto de un diafragma-iris,

que regula la cantidad de luz que llega al condensador. Si se desea aumentar el
contraste cuando se observan objetos casi transparentes, se cierra el diafragma
más de lo conveniente.
 El haz luminoso procedente de la
ojo humano lámpara pasa directamente a través
del diafragma al condensador.
Gracias al sistema de lentes que
lente del ocular posee el condensador, la luz es
concentrada sobre la preparación a
observar.
El haz de luz penetra en el objetivo y
lente del objetivo continúa hasta llegar al ocular, donde
es captado por el ojo del observador.

muestra

Condensador

Fuente de luz
 Manejo del microscopio
► Encendido. Debe comprobarse que la luz no es demasiado intensa.
► Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina.
► Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
► Enfoque. Se aproxima al máximo la preparación. Posteriormente se baja lentamente
(primero tornillo macrométrico y después tornillo micrométrico) hasta obtener un enfoque fino.
► Adaptación de los oculares.
► Pasar al siguiente objetivo. Si el anterior está enfocado al pasar a otro de mayor
aumento, sólo se ajusta el enfoque con el micrométrico. A mayor aumento menor campo
visual, por lo que antes de girar el revolver debe situarse en el centro del campo lo que
estamos observando.
Precaución!: objetivos de 40X y 100X pueden mancharse o dañarse.
► Empleo del objetivo de inmersión. Se baja completamente la platina y se sube el
condensador para visualizar con exactitud la zona donde habrá que echar el aceite de
cedro y se coloca una gota de tamaño mínimo. Se baja el objetivo de inmersión. Mirando
directamente, se sube muy lentamente la platina hasta que la lente toca la gota de aceite.
Mirando a través de los oculares, se enfoca con el tornillo micrométrico. Nunca debe
retirarse la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.
Debe limpiarse el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para
Óptica después de cada observación.
Precaución!: se corre el riesgo de romper la preparación y rallar el objetivo
después no puede volver a utilizarse el objetivo de 40X en esa zona
para retirar la preparación hay que bajar la platina y cambiar de objetivo
 Calibrado

Permite conocer el tamaño real de los objetos.

Se utiliza un portaobjetos en cuyo centro hay una escala graduada de 2 mm dividida

en centésimas de milímetro (micrómetro).
Uno de los oculares lleva una escala graduada en décimas de milímetro.
Se enfoca el portaobjetos hasta conseguir ver nítidas las líneas de la escala.
Se hace superponer la escala del ocular y se toma como referencia las líneas en que
ambas coincidan exactamente.
Por una simple regla de tres se puede establecer la equivalencia en micrómetros de
las divisiones de la escala del ocular.

Por ejemplo, si 10 divisiones de la escala del objetivo (es decir 0,10 mm)
equivalen a 20 divisiones de la escala del ocular, entonces cada división
del ocular corresponderá a 0,005 mm, es decir 5 μm.

Es preciso calibrar todos los objetivos del microscopio.

 Mantenimiento y precauciones

► Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento, asegurarse
de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo
apagado y desenchufado y cubierto con su funda.
Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes.
Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un
armario para protegerlo del polvo.

►Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Por mucho cuidado que se tenga, la
limpieza siempre daña las lentes.

►No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

► No forzar nunca las piezas giratorios del microscopio.

► Al cambiar el objetivo debe mirarse siempre a la preparación para prevenir el roce

de la lente.

► Mantener seca y limpia la platina del microscopio.

 Mantenimiento y precauciones

► Tras de utilizar el objetivo de inmersión hay que limpiarlo con pañuelos especiales
para óptica (se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad). Si
el aceite ha llegado a secarse hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona
7:3 o xilol.
Si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de campo claro

Para formar una imagen usa luz visible. La muestra debe ser lo suficientemente fina
como para que los haces de luz puedan atravesarla.
Puede realizarse la observación directa, pero a menudo se usan métodos de tinción
según las necesidades para observar con mayor precisión los detalles de la imagen.

Microscopio de campo obscuro

Está provisto de un condensador paraboloide o cardioide (con una o dos superficies
espejadas, respectivamente) que producen una luz muy intensa en forma de cono
hueco.
La luz incide directamente sobre la muestra pero no alcanza el objetivo (el campo de
visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz), por lo que sólo
recoge la luz reflejada por el objeto.
Las porciones claras de la preparación
aparecen con un fondo obscuro y los
objetos minúsculos se aprecian mucho
más brillantes.
Esta forma de iluminación se utiliza para
analizar muestras casi transparentes.

Micrasterias en campo claro y en campo oscuro

 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de contraste de fases

Posibilita la observación de muestras sin colorear, por lo que resulta útil para estudiar
especímenes y tejidos vivos.
La preparación se ilumina con un cono hueco de luz muy estrecho y entra en el campo
de visión del objetivo; el condensador contiene un dispositivo en forma de anillo que
reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de ¼ de la longitud de onda.
Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de
las muestras transparentes haciéndolas visibles.

El microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial son modifi-

caciones del microscopio de contraste de fases.

Paramecio
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de interferencia
Permite la cuantificación de masa en los tejidos.
El observador puede seleccionar el contraste más adecuado para cada observación
Con la iluminación directa, los cambios de fase se ponen de manifiesto mediante
contraste de color que permite también obtener resultados semicuantitativos.
Empleando el microscopio de interferencia se aprecian los cambios que se producen
en la masa seca de los cultivos celulares durante los procesos de crecimiento y división.

Microscopio de contraste de interferencia diferencial o microscopio de

Normansky
Combina la tecnica de polarizacion con la utilización de unos prismas especiales birre-
fringentes (prismas de Wollaston). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes
combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado.
Suministra una imagen aparentemente tridimensional. En la microscopia CID, el
contraste depende de la tasa de cambio del
índice de refracción a través de la muestra.
Los bordes de la estructura, donde el índice
de refracción varía en una distancia pequeña,
se observan satisfactoriamente con contraste.
Se emplea principalmente en microbiología
y en técnicas de fecundacion asistida.
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de luz ultravioleta

En lugar de luz visible utilizan luz ultravioleta, con lo que se consigue aumentar la
resolución (su longitud de onda es menor), o mejoran el detalle.
Las lentes y todos los elementos ópticos están hechos con cuarzo o fluorita o sistemas
de espejos aluminizados porque el vidrio no transmite las longitudes de onda más
cortas del espectro ultravioleta.
La radiación ultravioleta es invisible y daña la retina; las imágenes obtenidas se
registran fotográficamente, con un escáner electrónico o se muestran con
fosforescencia.

El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados
aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede
obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada
célula.
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de fluorescencia
Se basa en que los cuerpos fluorescentes tienen la propiedad de absorber la luz
ultravioleta y emitir en forma de luz visible, lo que permite verlos con una mayor nitidez
e intensidad de luz.
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en
el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.
Sólo el condensador tiene que ser de cuarzo y no necesita cámara fotográfica.
La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética dentro del
espectro visible reemitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria.
Para detectar sólo la emisión secundaria deseada se colocan filtros adecuados debajo
del condensador y encima del objetivo.

Permite la observación de estructuras fluorescentes, ya

sea naturales o artificiales. El tratamiento del material
biológico con fluorocromos facilita su observación al
microscopio.
En estudios de inmunología; se usan anticuerpos
fluorescentes contra una proteína específica para
determinar su localización exacta en los tejidos.

Intestino de ratón
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de luz polarizada

Es una modificación del microscopio de campo claro.
Cuenta con un prisma de Nicol u otro dispositivo, situado entre el condensador y la
muestra, para polarizar la luz que pasa a través de la preparación examinada.
Otro prisma de Nicol o analizador determina la polarización de la luz que ha pasado
a través de la muestra.
Estos dispositivos dejan pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz
polarizada); esta luz produce en el campo del microscopio claridad u obscuridad,
según los dos prismas de Nicol estén paralelos o cruzados.

Algunos compuestos inorgánicos (las substancias anisótropas) tienen un alto grado

de orientación molecular, y eso influye en la luz que los atraviesa.
Debido al fenómeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y
moléculas fibrosas (como el citoesqueleto, substancias amiloides, colágeno, cristales
de uratos, sílice, queratina, etc.
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio de barrido confocal

Se usa para estudiar la estructura de sustancias biológicas.
Combina partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un
sistema de barrido que emplea un rayo láser.
A través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a
una imagen tridimensional.
 OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Microscopio óptico invertido

Pilar de Lámpara
iluminación
Puerto para cámara

Platina

Oculares
Objetivos

Tornillos
macro- y
Base
micrométricos

Tiene una disposición inversa de sus componentes. La fuente de luz y el condensador están
sobre la platina, apuntando hacia abajo, y los objetivos están debajo apuntando hacia arriba.
Permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa.
La observación se realiza a través de las bases de diferentes recipientes con espesores y
características ópticas variables
Una desventaja del microscopio invertido es su limitada magnificación
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO

La muestra se observan directamente, sin modificar o a lo sumo más diluída o

concentrada.

Presenta ventajas evidentes:

► Muchos organismos, tipos celulares, cristales, etc., se observan sin dificultades en
fresco utilizando un microscopio de campo claro o de contraste de fases.
► Permiten observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en
ocasiones tiene interés analítico.
► Las preparaciones se elaboran de forma rápida, simple y económica.
► Son adecuadas para la observación de determinados fenómenos microscópicos,
tales como división celular (células animales, levaduras, etc.) o formación de
esporas.

Desgraciadamente muchos organismos no son observables con nitidez utilizando estas

técnicas y muchas características pasan desapercibidas.
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO

Montaje de las preparaciones

a) Montaje húmedo o técnica de la cámara húmeda

► Consiste en verter una gota de la muestra líquida que contiene los microorganismos
en el centro de un portaobjetos y cubrirlo después con un cubreobjetos, sin apretar
demasiado para no adelgazar excesivamente la lámina de líquido incluida entre
porta y cubreobjetos.
► Las muestras sólidas o semilíquidas pueden diluirse para ser observadas.
► Cuando el agua se evapora se destruye la preparación; puede utilizarse durante más
tiempo sellando los bordes del cubreobjetos.
► No son adecuadas para observarlas con el objetivo de inmersión.
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO

Montaje de las preparaciones

b) Técnica de la gota pendiente

► Se utilizan unos portas especiales con una o dos excavaciones que permiten
colocar un cubreobjetos invertido del que pende una pequeña gota de la
suspensión bacteriana que vamos a observar.
El volumen de líquido que mantiene el porta es mayor y la preparación se
mantiene durante más tiempo.
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO

Montaje de las preparaciones

c) Preparación para examen en fresco ligeramente modificadas

Se añaden substancias que facilitan o mejoran la observación de los microorganismos.
Se trata de montajes húmedos tratados con un solo colorante o reactivo.

c.1) Tinción vital o coloración supravital

► Resalta detalles estructurales o de movilidad que no es posible observar en
fresco ni una vez que han sido fijados.
► Antes de cubrir la muestra con el cubreobjetos se agrega una gota de un
colorante muy diluídos (diluciones de 1/10.000) que no mate los microorganis-
mos; de esta forma más la luz y aparecerán coloreados más intensamente.

c. 2) Preparación con KOH al 10 %

Se utiliza mucho en Micología y Liquenología.
La potasa digiere parcialmente las proteínas presentes pero no actúa sobre los
polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
Se agrega una gota de KOH al 10 %, se homogeniza, se cubre con un cubreob-
jetos. La preparación puede observarse después de esperar varios (3-10)
minutos a temperatura ambiente.
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO

Montaje de las preparaciones

d) Realización de cortes semifinos para su observación directa

► Las muestras deben ser lo suficientemente finas para que la luz las atraviese.
► La observación microscópica de organismos de mayor tamaño requiere la
realización de secciones muy finas (el microtomo garantiza excelentes resultados).
► En muchos casos, las características que interesan pueden observarse en cortes
más groseros que se obtienen directamente cortando el material utilizando
cuchillas afiladas.
► Sobre las secciones obtenidas de esta manera se pueden aplicar reactivos o
colorantes que realcen las estructuras que queremos poner de manifiesto.

gota de
agua