Universidad del Valle de México

Ingeniería en Energía y Desarrollo Sustentable

Biocombustibles
M en C Adriana Pérez Sánchez

Práctica 2
Aislamiento y selección de levaduras nativas de mosto
fermentado

Objetivos:
Selección de microorganismos procedentes de mosto fermentado de diferentes
fuentes.
Conocer la morfología colonial de levaduras mediante la tinción de Gram.
Aislamiento de levaduras que tengan la capacidad de fermentación.
Introducción
El aislamiento y selección primaria de microorganismos de interés industrial
conjunta las técnicas usuales de aislamiento en microbiología bajo presión de
selección y algún fenómeno visible que corresponda a las características de
producción de microorganismos se logre en el menor tiempo posible.
El aislamiento y selección generalmente se inicia a partir de un hábitat natural,
pero también puede ser de un programa de selección y mejoramiento genético a
partir de cepas.
Las técnicas de aislamiento se elegirán en función de la naturaleza de la fuente,
tipo de microorganismo deseado, posible densidad o carga microbiana y
disponibilidad de recursos experimentales. Entre las técnicas más usuales se
encuentran las diluciones seriadas y estría cruzada, éstas se utilizan cuando se
considera que la carga microbiana es alta en la fuente de aislamiento. También
puede llevarse a cabo por impronta, la cual involucra la aplicación directa y
repetida de una sola muestra de la fuente sobre el medio de cultivo de tal forma
que la población microbiana se vaya diluyendo en el medio. Esta última se
considera apropiada cuando la fuente de aislamiento puede tener baja densidad
microbiana o poca densidad de microorganismos.
Cuando se intenta obtener microorganismos que degraden sustratos complejos o
de difícil asimilación, como polímeros, sustratos pocos solubles, compuestos
tóxicos o microorganismos que crecen en condiciones extremas de pH,
temperatura, fuerza iónica, etc., se parte de la premisa que estos microorganismos
se encuentran en menor abundancia en la fuente de aislamiento y se recomienda
un cultivo bajo presión de selección en el que aumente la población de
microrganismos de interés, previo al aislamiento en placa. A este cultivo se le
denomina de enriquecimiento.
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El uso de cultivo de enriquecimiento y posteriormente la técnica de aislamiento en

placa, manteniendo la presión de selección, desplazará o inhibirá el desarrollo de
las poblaciones indeseadas, permitiendo la proliferación y detección de los
microorganismos de interés.
La presión de selección implica el manejo de factores ambientales como pH,
temperatura, fuentes únicas de C o N, presencia de compuestos tóxicos, tensión
de oxígeno, etc. Para conformar el ambiente selectivo, se requiere predeterminar
el proceso al que se dirigirán los microrganismos, además de conocer las
condiciones óptimas generales de desarrollo microbiano específico.
A pesar de la aplicación de una presión de selección es posible que crezcan otros
microorganismos que no cumplan con las características de producción o
simplemente con el tipo de microorganismo de interés, por lo que se requieren
especificar los criterios de selección primaria para concluir con la primera etapa de
aislamiento y selección.
Los criterios de selección primaria son los aspectos que se pueden detectar con
facilidad, como el caso de la morfología colonial y microscópica, halos de vire del
indicador de pH, halos de hidrólisis de sustrato y en general de cualquier
alteración física o química del medio que implique el crecimiento de los
microorganismos de prueba. En ocasiones sólo el crecimiento de los
microorganismos en medios altamente selectivos o restrictivos constituyen el único
criterio de selección primaria.
Primera sesión
Materiales
 Bata, guantes de nitrilo
 Autoclave
 Campana de bioseguridad o 2 mecheros Bunsem
 Balanza analítica
 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL
 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL
 1 vasos de precipitado de 1000 ml
 1 Probeta 500 mL
 1 vasos de precipitado de 100 ml
 1 Probeta 100 ml
 Pipeta 10 ml (estéril)
 Propipeta
 Espátula
 Globo #8
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 Plancha con agitación magnética y temperatura

 10 placas Petri estériles (nuevas)
Reactivos y soluciones
 Medio líquido de crecimiento de levaduras YPD (Broth)
Medio extracto de levadura, peptona y dextrosa (YPD): 10 g/l de extracto de
levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de dextrosa.
Criterio de selección: producción de CO2.
 Medio líquido de crecimiento de levaduras YPD (Agar)
Medio extracto de levadura, peptona y dextrosa (YPD): 10 g/l de extracto de
levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de dextrosa, 15 g/l de agar.
Criterio de selección: morfología colonial y microscópica.
En el caso de no contar con el medio preparado, se preparará medio Papa
Dextrosa (PDB o PDA) casero, según sea el caso, de la siguiente manera: para
500 ml
100 g de papa,10 g azúcar, 7.5 g agar (si es necesario). Preparación: cortar la
papa en pedazos pequeños, en un vaso de precipitado añadir la papa y 500 ml de
agua destilada, hervir por 10 min, filtrar con gasa, agregar azúcar y agar, disolver,
esterilizar.
Desarrollo experimental
1. Preparar 100 ml de medio de cultivo YPD (caldo)
2. Preparar 250 ml de medio de cultivo YPD (agar)
3. Esterilizar 15 min 15 psi, enfriar.
4. Añadir 10 ml de mosto al matraz en condiciones de esterilidad.
5. Poner el globo en la boquilla del matraz
6. Permitir crecimiento por 48h y revisar si hubo producción de CO 2.
7. Por otro lado, vaciar en placa el YPD (agar) en 10 placas Petri.
Segunda sesión
Introducción
El aislamiento y obtención de cultivos puros posiblemente hayan sido las bases
más importantes en el desarrollo de la Microbiología. Un cultivo puro es aquel que
contiene una sola clase de microorganismo. Para obtenerlo es necesario recurrir a
las técnicas de aislamiento.
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El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo

(célula) inmovilizada sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto
de individuos presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de
crecimiento adecuadas dará lugar a una descendencia (clon) que resultará
macroscópicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene millones
o miles de millones de células idénticas y con el mismo origen y propiedades. Se
puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una sola célula o de
un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello
lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos
al origen de una colonia. El cultivo descendiente de una misma colonia es un
cultivo puro.
Materiales
 Bata, guantes de nitrilo
 Autoclave
 Campana de bioseguridad o 2 mecheros Bunsen
 Microscopio
 Porta objetos
 Asa bacteriológica
 Pinzas de disersión
Reactivos y soluciones
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol/acetona
 Safranina
 Agua destilada
Desarrollo experimental
1. Preparar los reactivos en frascos goteros
2. Hacer un frotis en un porta objetos, con tres asadas del medio de
enriquecimiento previo. Fijar la muestra con calor.
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3. Realizar una tinción de Gram

Colocar cristal violeta hasta que cubra la muestra. Esperar 30 seg – 1 min
Enjuagar con agua
Colocar lugol hasta que cubra la muestra, Esperar 30 seg - 1 min
Enjuagar el exceso con agua
Colocar la mezcla alcohol acetona lentamente por el vértice del porta
objetos, hasta que deje de salir color.
Enjuagar con agua
Colocar la safranina hasta que cubra la muestra, esperar 30 seg – 1 min
Enjuagar el exceso con agua.
Dejar secar
4. Observar la muestra en el microscopio.
5. Sembrar en placa por estría cruzada, incubar por 5 días a temperatura
ambiente.

Tercera sesión
Materiales
 Bata, guantes de nitrilo
 Asa bacteriológica
 Cubre objetos
 Microscopio
 Agua destilada
 Material para tinción de Gram
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Desarrollo experimental
Conocer el un número de unidades formadoras de colonias.
Revisar morfología colonial y microscópica (pureza) de las colonias desarrolladas.
Resembrar en placa por estría cruzada, las colonias aisladas e identificadas como
puras. Incubar por 48 h a temperatura ambiente.
Bibliografía
1. Demian AL (1986). Manual of Microbiology and Biotechnology. Ed. ASM
Washinton.
2. Steel DB, Stowers MD (1991). Techniques for selection of industrially
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Rhem and Reer (Eds.). Verlag Chemie. 1:355-410.
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5. Panchal CJ (1990). Yeast strain selection. Ed. Marcel, NY.
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Pergamon Press. Oxford NY. 26-70.