Cátedra de Inmunología – Facultad de Ciencias de la Alimentación, Bioquímicas y Farmacéuticas - UCC

TRABAJO PRÁCTICO:
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
FAN EN HIGADO DE RATA Y EN HEP-2

Objetivos del práctico:

 Determinación de anticuerpos anti- nucleares en suero, empleando improntas de
hígado de rata y/o arrollado y/o HEP-2.
 Evaluar ventajas y desventajas del uso de improntas de hígado de rata vs. las
improntas de HEP-2.
 Interpretación de los resultados obtenidos.

La inmunofluorescencia es una técnica de visualización primaria de la interacción Ag-Ac.

Se basa en el uso de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes, los fluorocromos:
sustancia de naturaleza orgánica en cuya estructura posee dobles enlaces alternados lo cual
le da la propiedad de absorber radiaciones y emitirlas. Ej. de fluorocromos: isotiocianato de
fluoresceína o lisamina-rodamina. Estas sustancias, al ser excitadas con longitudes de onda
de rango ultravioleta, emiten luz de mayor longitud, la que se demuestra por fluorescencia
amarillo-verdosa o anaranjado-rojiza respectivamente.
La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta:

 La inmunofluorescencia directa (IFD) es un procedimiento de un solo paso que se

utiliza para demostrar el depósito de inmunoglobulinas, complemento, en tejidos.
Para ello se obtiene una biopsia del paciente y se incuba con anticuerpos marcados
con fluoresceina y dirigidos por ejemplo, contra las inmunoglobulinas. Si estos se
han fijado podrán ser visualizados mediante un microscopio de
inmunofluorescencia.

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 La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una técnica de dos pasos que tiene

como objetivo la demostración de anticuerpos circulantes en el suero del paciente,
específicos contra diversos tejidos. Para ello se incuba un sustrato (impronta) con el
suero del paciente y posteriormente se incuba con anticuerpos marcados con
fluoresceína dirigidos contra las inmunoglobulinas humanas.

Materiales y métodos:

Impronta: puede ser una sección ultra fina de tejido o una suspensión microbiana ajustada
a una densidad óptica tal que al fijarse en la placa nos permita ver un patrón de
fluorescencia adecuado. La fijación se pude hacer por métodos químicos y físicos. La
impronta contiene los epitopes a los cuales se unirán los anticuerpos presentes en el suero
del paciente.

Suero problema: Como técnica semicuantitativa requiere hacer una serie de diluciones del
suero problema en SF, buffer o medio de cultivo celular.

Suero control Positivo: Nos permite conocer el patrón exacto de fluorescencia (en cuanto a
forma e intensidad).

Suero control negativo: Sirve como control de especificidad de la técnica, ya que si el

antígeno fijado (impronta) comparte muchos determinantes antigénicos con otros
microorganismos, será poco probable que la técnica nos dé un resultado confiable
(reacciones cruzadas). También se puede usar soluciones buffers como control negativo,
aunque en este caso no permitirá descontar la fluorescencia inespecífica.

Suero anti-gammaglobulina marcado: Este antisuero marcado se debe usar a una dilución
constante (dilución óptima que nos dé la máxima precisión y elevada sensibilidad).

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Instrumental:

-Portaobjetos con impronta

-Pipetas automáticas
-Cubreobjetos
-Cámara húmeda
-Microscopio de fluorescencia.

Procedimiento:

1. Sacar las improntas de la heladera, dejar que tomen T° ambiente.

2. Cubrirlas con los sueros problemas (diluidos correctamente).
3. Simultáneamente realizar los controles positivo y negativo.
4. Incubar los preparados durante 30 minutos a T° ambiente en cámara húmeda.
5. Enjuagar y lavar los extendidos con PBS durante 5 minutos. Realizar dos lavados.
6. Retirar los preparados, dejar escurrir sin que se sequen y cubrir con el conjugado a una
dilución apropiada durante 30 minutos. La dilución apropiada depende del conjugado
con que se trabaja.
7. Enjuagar y lavar los extendidos con PBS durante 5 minutos. Realizar dos lavados.
8. Retirar los preparados y dejar escurrir sin que se sequen.
9. Cubrir con un cubreobjetos, al que se agrega previamente una gota de solución de
montaje.
10. Observar en el microscopio de luz ultravioleta.

Algunos autoanticuerpos detectados por IFI:

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Ventajas del uso de células HEP-2:

Clasificación ENA: