Bioquímica manual

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PROGRAMA DE INGENIERÍA EN ENERGÍAS

RENOVABLES
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
“BIOQUíMICA”
PLAN DE ESTUDIOS
IENR-2010-217
CLAVE DE LA ASIGNATURA
ERF-1004
3-2-5
Elaborado por: M. en I. García Araiza María del Carmen

La Paz, estado de México a mayo de 2018.
INDICE
Prácticas Pagina
Introducción 3
Lineamientos de uso de laboratorio 5
Práctica 1. Control de Calidad en el trabajo del laboratorio de Bioquímica 16
Práctica 2. Propiedades Iónicas de los Aminoácidos 24
Práctica 3. Cromatografía en Papel 30
Práctica 4. Reacciones de Carbohidratos 39
Práctica 5. Cuantificación de Proteínas por el Método de Biuret 49
Práctica 6. Determinación de la actividad de catalasa en una muestra de
suelo por el método de Johnson y Temple y medida del H 2O2 residual 60
mediante permanganatometría
Práctica 7. Cinética enzimática. efecto de la concentración del sustrato 68
sobre la velocidad de reacción enzimática
Práctica 8. Determinación de lípidos (extracto etéreo) 77
Práctica 9. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los
inhibidores de la cadena de transportes de electrones y de los 83
desacoplantes
Práctica 10. Respiración 90
Referencia bibliográfica 98
INTRODUCCIÓN
2
La Bioquímica es la ciencia que estudia los procesos de los seres vivos, desde el
punto de vista estructural y funcional. Mediante el primero conocemos su
configuración espacial de la materia viva, con el segundo su devenir con el tiempo.
La aproximación morfológica conduce al estudio de las formas propias del ser

vivo; la aproximación funcional estudia funciones, es decir, variaciones funcionales
que se dan en el mismo con el fin de mantener su organismo en un estado
estacionario y de reproducir en otro ser vivo su material genético.
De todas las funciones no hay una mas generalizada que el “Metabolismo”, que es
el conjunto de reacciones químicas que un organismo es capaz de llevar a cabo.
Para conocer la influencia de la Bioquímica, es preciso conocer las estructuras de

la materia viva y las estructuras completas de muchos compuestos biológicos.
Sera preciso conocer la estequiometria y los mecanismos de un gran numero de
reacciones, además del conocimiento básico de principios de Termodinámica,
para comprender de que manera los microorganismos obtienen energía de los
alimentos.
El propósito de este manual es proporcionar al alumno los recursos necesarios

para un buen desarrollo de prácticas, así como brindarle información básica que
utilizara para el desarrollo de las mismas.
La mayoría de las técnicas experimentales y conocimientos que se han adquirido

en otros cursos son muy valiosas en el laboratorio de Bioquímica. En este
laboratorio raramente se aíslan productos en gran escala, mas bien, se trabaja con
miligramos o con microgramos.
Los conocimientos metodológicos para estudiar las biomoléculas avanza a

grandes pasos y en la mayoría de las ocasiones se requieren reactivos y equipos
3
costosos, por lo que es mas que imposible abarcar la extensa gama de
conocimientos relacionados con protocolo bioquímicos.
El manual de Bioquímica se ha preparado con algunas prácticas sencillas, y

representativas, que intentan explicar algunas de las propiedades de las
biomoléculas y técnicas para estudiarlas.
Se espera que el estudiante adquiera los conocimientos necesarios para entender

cursos posteriores que pudiera tomar durante la ingeniería o bien en algún
postgrado dentro del área.
LINEAMIENTOS DE USO DE LABORATORIO
4
1. Medidas de Seguridad en el Laboratorio
Llamamos medidas de seguridad en el laboratorio a todas aquellas

recomendaciones o reglas que deben seguirse con la finalidad de evitar posibles
accidentes. Para la mayoría de los estudiantes y lectores relacionados con esta
área, resulta en ocasiones un tanto tedioso leer estas recomendaciones, sin
embargo, debemos tomar en cuenta que seguir estas reglas nos evitara
accidentes, que en un momento dado podrían ser transcendentales para nuestra
vida. Imagine usted, al no seguir una regla, succiona un acido con la boca y lo
ingiere accidentalmente, usted sufrirá quemaduras en el tracto digestivo, lo que le
impedirá comer ciertos alimentos, le provocara dolor y molestias constantes que
podrían prolongarse por un tiempo indefinido. Por otro lado, si tiene conocimiento
de las reglas podrá, en caso de un accidente, aplicar los primeros auxilios para
evitar un daño mayor.
Antes de realizar una practica es necesario que realice una investigación previa de
las propiedades, manejo, uso y peligrosidad de las sustancias que se van a
emplear en cada una de las practicas. Recuerde que todos los reactivos son
potencialmente tóxicos, irritantes, inflamables, por mencionar algunos, cuando no
son manejados de forma adecuada. Si se emplea un reactivo del cual desconozca
sus propiedades revise la etiqueta del frasco y observe si trae la información sobre
su manejo. Algunas marcas colocan en su etiqueta pictogramas que indican los
cuidados que debe tener con la sustancia. A continuación se muestran algunos de
uso común (Figura 1, 2, 3, 4, 5, 6).
5
Figura 1.
Figura 2.
6
 Color y Señalización Azul.
SIGNIFICADO- APLICACIONES
 Señales de obligación de usar equipos de protección personal.
 Información no estrictamente relacionada con aspectos concernientes a la
Seguridad, por ejemplo ubicación del teléfono, talleres, etc.
CONTRASTE
 Blanco
SIMBOLO O TEXTO
 Blanco
FORMA GEOMETRICA DE SEÑALES DE SEGURIDAD

 Circulo (Obligaciones).
 Cuadrado o Rectángulo. (Informaciones o instrucciones).
Figura 3.
7
 Color y Señalizaciones Amarillo.
SIGNIFICADO- APLICACIONES
 Advertencia y señalizaciones de riesgos, obstáculos y zonas de paso con
peligro.
CONTRASTE
 Negro
SIMBOLO O TEXTO
 Negro
FORMA GEOMETRICA DE SEÑALES DE SEGURIDAD

 Triángulo equilátero (perimetralmente una banda de color negro).
Figura 4.
 Color y Señalizaciones Rojo.
8
SIGNIFICADO-APLICACIONES
 Dispositivos de conexión de urgencia
 Señales de prohibición
 Señalización de equipos de lucha contra incendio
CONTRASTE
 Blanco
SIMBOLO O TEXTO
 Negro
FORMA GEOMÉTRICA DE SEÑALES DE SEGURIDAD

 CIRCULO- (Prohibiciones, paradas).
 RECTÁNGULO (material de lucha contra el fuego).
 Perimetralmente una banda de color amarillo.
9
Figura 5.
 Color y Señalizaciones Verde.
SIGNIFICADO- APICACIONES
Señales de información concernientes a condiciones seguras: Situación de

Seguridad o Primeros Auxilios, como pasillo y salidas de emergencia, duchas de
socorro, puestos de primeros auxilios, etc.
CONTRASTE
 Blanco
SIMBOLO O TEXTO
 Blanco
FORMA GEOMÉTRICA DE SEÑALES DE SEGURIDAD

 Cuadrado o Rectángulo
Figura 6.
10
2. Lineamientos de seguridad durante la estancia en el laboratorio.
1. En caso de manejar sustancias volátiles, recuerde que estas deben

manipularse en las campanas de extracción.
2. Procure usar lentes de seguridad para realizar toda operación en el manejo de

reactivos.
3. Debe familiarizarse con la distribución del laboratorio, esto implica conocer

donde se encuentran las salidas de emergencia, llaves y personal que puede
brindarle ayuda en caso de emergencia, llaves y lavabos de agua, regaderas y
extinguidores. A su vez debe conocer al personal que pueda brindarle ayuda
en caso de emergencia.
4. Para desarrollar cualquier trabajo experimental en el laboratorio use su bata, la

cual se recomienda sea de algodón y no de material sintético, pues este último
puede ser inflamable.
5. No consuma alimentos cuando este trabajando en el laboratorio, ya que podría

contaminarlos e ingerir sustancias toxicas.
6. No fume dentro del laboratorio, pues en él se emplean sustancias inflamables.
11
7. No inhale directamente sobre los reactivos, ya que algunos son irritantes.
8. Si quiere calentar algo para llevar a cabo una reacción, utilice de preferencia
una parrilla eléctrica, dado que lagunas sustancias son inflamables.
9. No maquillarse en el laboratorio podría infectarse con alguna sustancia que se

esté manejando en el momento.
10. La mayoría de los compuestos y soluciones líquidas de naturaleza ácida,

básica u orgánica, deben tomarse con la ayuda de una Propipeta o, en su
defecto con una jeringa con manguera. Nunca debe pipetearse los reactivos
con la boca y estos deber ser manejados en campana de extracción.
11. Las sustancias solidas deben pesarse y manejarse en recipientes adecuados:

vidrio de reloj o vaso de precipitado, y con la ayuda de espátulas.
12. En caso de que la piel tenga contacto con los reactivos, lávese de inmediato
con abundante agua. Avise enseguida a otra persona del percance, y si la
exposición es muy grave, consulte rápidamente al medico.
13. Es necesario que el profesor de laboratorio aplique las medidas de seguridad y

exhorte a los alumnos a seguirla.
3. Manejo de residuos peligrosos.
Además de conocer el manejo de sustancias químicas mientras se utilizan en el

laboratorio, debe considerarse la forma en que se manejan los residuos, ya que
estos se manipulan de modo inadecuado pueden dañar las plantas, animales,
personas, y en general al ambiente. Solo los residuos solubles en agua, pueden
ser desechados en el drenaje, como algunas sales, ácidos y bases diluidos, pero
deben diluirse hasta que el pH se encuentre en un intervalo de tres a once. Los
12
desechos de soluciones ácidas pueden mezclarse con residuos de base hasta
alcanzar un pH neutro.
Los disolventes orgánicos deben colocarse en contenedores de vidrio o metal,

solo si son corrosivos y no contienen sólidos. Todos los desechos deben
etiquetarse y separarse según el tipo de compuesto del que se trate: clorados,
hidrocarburos, etc.
4. Reglamento para el laboratorio de bioquímica.
1. Para poder realizar las prácticas de laboratorio es necesario estar inscrito en el

grupo. Por ningún motivo se aceptan “oyentes”.
2. Se toma en cuenta la puntualidad. Se dará una tolerancia de quince minutos.
3. El alumno debe traer su credencial actualizada.
4. No se permitirá la estancia en el laboratorio al alumno que no traiga bata.
5. Se prohíbe la permanencia de personas ajenas al laboratorio durante la

realización de la práctica.
6. Cada equipo debe tener una bitácora para cálculos y resultados.
7. Es obligación del alumno saber que material va a necesitar para la práctica,

entregando con anticipación la lista a los encargados de laboratorio.
8. Al momento de recibir el material este debe revisarse en presencia de la

persona que lo entrega, para ver que se encuentre en las mejores condiciones,
de no ser así deberá cambiarlo.
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9. El alumno deberá utilizar los lentes de seguridad durante la práctica.
10. Al finalizar la sesión, el material se debe entregarse limpio y seco.
11. Las mesas y los vertederos deberán quedar limpios, y se colocaran los bancos
sobre las mesas al finalizar la práctica.
12. Queda estrictamente prohibido comer o fumar en el laboratorio.

5. Material que deben traer los alumnos.
1. Una franela o toalla para secar el material.
2. Un escobillón para tubos y una fibra para lavar el material.
3. Detergente líquido bajo en fosfatos.
4. Un rollo de cinta Maskin tape
5. Un marcador indeleble para vidrio
6. Unas tijeras
7. Una espátula pequeña de metal
8. Un rollo de papel higiénico
9. Papel aluminio
14
CONTROL DE CALIDAD EN EL TRABAJO DEL LABORATORIO DE
BIOQUIMICA
PRACTICA 1
Laboratorio de: Horas:
BIOQUIMICA 3
Introducción
El control de calidad es un conjunto de reglas y procedimientos que se deben
seguir para garantizar la confiabilidad de un proceso, se fundamenta en métodos
de sondeo y en el empleo de la estadística. Cuando se realiza cualquier medición
científica es necesario considerar que se pueden cometer diferentes tipos de
“error”. Este término se utiliza para referirse a la diferencia numérica entre el valor
real y el valor medido.
Los errores pueden clasificarse en errores de sesgo o de exactitud y errores de

precisión. Los errores de sesgo o exactitud se refieren a la diferencia entre un
valor “real” y la medida de la distribución del mayor número de medidas realizadas
con el mismo método. Mientras menor sea la diferencia habrá más exactitud en las
medidas.
En el campo de la investigación científica es necesario tener un alto grado de

precisión en las determinaciones experimentales para poder afirmar que el
15
fenómeno que se esta registrando es real, y así tener una alta confiabilidad en los
resultados.
Los errores de precisión implican el grado de dispersión de los datos obtenidos. Si

un fenómeno se mide en repetidas ocasiones con el mismo método, siempre
habrá un grado de dispersión de los datos. La magnitud de esta dispersión se
puede expresar de diversas maneras, tales como la desviación estándar y el
coeficiente de variación.
En la grafica 1 se muestra la curva de una distribución normal de los datos
obtenidos en un experimento. Se puede observar que el valor de la medida () se
encuentra exactamente al centro de la curva y los valores de la desviación
estándar () se distribuyen a ambos lados de la medida, donde f es frecuencia.
El coeficiente de variación, designado por CV, es la relación entre la desviación

estándar con respecto a la medida, expresada como un porcentaje.
Desviación estándar:
16
Coeficiente de variación:
Dónde:
S = desviación estándar
CV = coeficiente de variación
Xi = valores de cada muestra
X = media
N = Número de datos
Σ = sumatoria
En el laboratorio se puede llevar a cabo el control de calidad de los resultados

obtenidos en el trabajo experimental, tanto en función del equipo como del
operador, si se utilizan los procedimientos estadísticos antes citados.
Objetivo
Determinar las posibles variables que puedan influir en el trabajo experimental en
el laboratorio.
Fundamento
Los errores mas comunes involucrados en una medición instrumental son:
1. Errores sistemáticos
2. Errores no sistemáticos o aleatorios
Son errores sistemáticos aquellos producidos por un metro mal marcado, no lo son
17
aquellos producidos por la apreciación del que mide. Los instrumentos de
medición tienen algunos errores identificados, ellos son:
1. Exactitud
Exactitud es la cercanía del valor experimental obtenido, con el valor exacto de

dicha medida. El valor exacto de una magnitud física es un concepto utópico, ya
que es imposible conocerlo sin incertidumbre alguna.
2. Precisión
La precisión de un instrumento está relacionada con el error medio (desvío

estándar.) de cada medición. Para medirlo se toma una serie de mediciones de un
mismo objeto en el mismo momento y lugar, se obtiene el promedio y su
dispersión. Esta dispersión será la magnitud de su precisión. Este es un error
aleatorio.
3. Erro de Exactitud
El error de exactitud es la diferencia entre el valor medio medido por el

instrumento y el valor exacto correspondiente a la magnitud medida. El valor
exacto se conoce por la certificación del patrón empleado. Este es un error
sistemático.
4. Repetibilidad
Es el error de un instrumento al medir un mismo objeto del mismo modo a lo largo
18
del tiempo. En forma horaria, diaria, semanal o mensualmente.
5. Reproducibilidad
Es el error de medición entre diferentes instrumentos para medir el mismo objeto.
Material requerido
Material y equipo:
 1 Matraz aforado de 25 ml
 3 gradillas
 35 tubos de ensaye de 16 x 150 mm
 7 pipetas de 1 ml
 7 pipetas de 15 ml
 1 espectrofotómetro y celdas
 Propipeta
Reactivos:
 H2SO4 concentrado (pureza 98.6 %, densidad = 1.84 g/ml)

 Dicromato de potasio en cristales
Soluciones:
 Solución de H2SO4 0.8 N

 Solución de dicromato de potasio al 10% (P/V) en H2SO4 0.8 N
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Preparación: pesar 2.5 g de dicromato de potasio y disolver en un volumen total
de 20 ml de H2SO4 0.8 N. Una vez disuelto aforar en un matraz de 25 ml con el
mismo H2SO4 0.8 N.
Desarrollo
Cada alumno deberá realizar lo siguiente:
1. Preparar de la siguiente manera una dilución de dicromato de potasio 1:50

(volumen inicial: volumen final) en agua: tomar 0.1 ml de la solución de
dicromato de potasio, colocarlo en un tubo de ensayo y agregar 4.9 ml de
agua.
2. Agitar el tubo para homogenizar la solución.
3. Realizar la misma operación (pasos 1 y 2) al menos cinco veces.
4. Ajustar el espectrofotómetro a cero de absorbancia con un blanco de agua.
5. Leer la absorbancia de cada una de las cinco repeticiones en el
espectrofotómetro, a una longitud de onda de 507 nanómetros.
Resultado a obtener
Trabajar estadísticamente los resultados obtenidos:
1. Elaborar una tabla que contenga el número de tubos y la absorbancia

correspondiente a cada tubo.
Desviación del Cuadrado de las

Absorbancia
Número de tubo valor medio desviaciones
Xi
Xi -X (Xi – X)2
1
2
3
4
5
N=5 X= Σ(Xi – X)2 =
20
2. Calcular la media.
3. Calcular la suma de los cuadrados de las desviaciones.
4. Utilizando las formulas de la desviación estándar (s) y del coeficiente de

variación (CV) que se presenta en la introducción obtener estos valores para
sus resultados.
Análisis de Resultados
1. Después de alcanzar los resultados individuales, compare el CV obtenido entre
los integrantes del equipo.
2. Discuta cual de los miembros del equipo fue el que trabajo con mayor
precisión, es decir, el que tuvo el CV mas bajo. Es importante considerar que
un CV del 10% o menor es bueno en el trabajo de laboratorio.
3. Con base en lo anterior, discuta que miembro de cada equipo es el mejor para
trabajar en el laboratorio, Por otro lado, analice cuales fueron los errores que
pueden explicar la obtención de CV mas altos.
4. Compare la media de cada uno de los equipos con el valor real proporcionado
por el profesor y discuta cual de los equipos fue el mas exacto. Examine las
razones por las que un equipo puede ser más exacto que otro al trabajar en el
laboratorio.
21
Cuestionario Previo
1. ¿Qué es un espectrofotómetro?
2. Explique la ley de Beer
3. ¿Qué es una medida de tendencia central? ¿Qué es una medida de
dispersión?
4. ¿Qué se entiende por media, desviación estándar y coeficiente de variación?
5. ¿Qué se entiende por precisión y exactitud?
6. ¿Qué tipo de errores se pueden cometer en las prácticas de laboratorio?
7. ¿Qué es el control de calidad? ¿Cuál es su utilidad?
Bibliografía
1. Castañeda, P.R. 1980. Bioestadística aplicada. Editorial Trillas, México
2. Daniel, W.W. 1991. Bioestadística. Editorial Limusa, México
3. Day, R.A. y Underwood, A. L. 1989. Química analítica cuantitativa. 5a ed.,
Prentice - Hall Hispanoamericana, México
PROPIEDADES IONICAS DE LOS AMINOACIDOS
22
PRACTICA 2
BIOQUIMICA 2
Introducción
Las propiedades de los aminoácidos, constituyentes fundamentales de las
proteínas, radican principalmente en su comportamiento ácido-básico. En efecto,
los aminoácidos presentan al menos dos grupos ionizables, como se puede
apreciar en su fórmula general (figura 1).
Figura 1. Formula general de los aminoácidos
La función () que se llama grupo carboxilo se encuentra protonada a pH ácido y

pierde un protón a pH neutro (con la aparición de una carga negativa) según la
ecuación siguiente (figura 2).
Figura 2. Funciones ácido y base conjugada de los aminoácidos
Objetivo
Determinar en forma práctica los pK de un aminoácido mediante el método de
titulación por neutralización.
23
Fundamento
Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades más pequeñas
conocidas como aminoácidos. En las proteínas se encuentran básicamente veinte
aminoácidos diferentes, los cuales contienen un grupo carboxilo y un grupo amino
unidos al mismo átomo de carbono (carbono ). Estos aminoácidos difieren unos
de otros solo por la naturaleza de sus cadenas laterales, o grupos R, que varían
en estructura, tamaño y carga eléctrica e influyen en su solubilidad en agua.
Los grupos carboxilo y amino de los aminoácidos funcionan como ácidos y bases
débiles, respectivamente, y como tales, se ionizan cuando están en solución.
Cada grupo tiene un pK, el cual corresponde al pH en el cual corresponde al pH

en el que se encuentra la misma cantidad de la forma no ionizada que de la
ionizada.
Los aminoácidos tienen al menos dos pK por lo que tienen mayor capacidad
amortiguadora, ay que presentan de tres a cuatro formas iónicas diferentes.
Cuando la forma iónica tiene carga neta de cero, se dice que se encuentran en su
punto isoeléctrico o PI. Al variar de pH, cambia la proporción de las formas iónicas
y es posible ver la capacidad amortiguadora de los aminoácidos. Cada aminoácido
tiene sus propios pK, puesto que presentan diferentes sustituyentes en sus
cadenas laterales mediante una titulación, se puede determinar los pK de un
aminoácido.
Material requerido
Material y equipo:
 2 Vasos de precipitado de 250 ml
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 1 Bureta
 1 Soporte universal
 2 Pinzas para bureta
 1 Potenciómetro
 1 Piceta
 1 Base magnética y 1 Agitador magnético
 1 Probeta de 50 ml
Reactivos:
 Hidróxido de Sodio (NaOH)

 Acido L Glutámico
Soluciones:
 Solución de Acido L Glutámico 0.06 M( en 0.05 M de HCl, pH 1.0)

 Solución de NaOH 0.3 N
 Solución amortiguadora para calibrar el potenciómetro
Desarrollo
Titulación potenciométrica del aminoácido.
1. En un vaso de precipitado de 100 ml, colocar una alícuota de 3.0 ml de la

solución del aminoácido.
2. Colocar el vaso sobre una base magnética e introducir el agitador magnético,
evitando que salpique.
3. Colocar la solución de NaOH en la bureta.
4. Calibrar el potenciómetro con las soluciones amortiguadoras según las
indicaciones.
5. Medir el pH de la solución de NaOH y anotar.
6. Colocar el electrodo dentro del vaso que contiene el aminoácido, evitando que
25
toque las paredes del vaso y cuidando que este dentro del líquido. Tener
cuidado de no golpear el electrodo con le agitador.
7. Medir el pH inicial del aminoácido y anotar.
8. Iniciar la titulación adicionando volúmenes de 0.2 ml y midiendo el pH en cada
adición.
9. En su cuaderno, tabular los valores de pH para cada volumen.
10. Adicionar tanto NaOH como sea necesario, hasta alcanzar el pH de la solución
de NaOH.
Resultado a obtener
1. Elaborar un cuadro de dos columnas donde la primera especifica que el
volumen de NaOH añadido, y la segunda, el valor de pH para cada volumen
adicionado de base. En la primera fila, en cada caso, anotar el pH del
aminoácido solo.
2. Elaborar una grafica, a partir del cuadro, colocando en el eje de las X el
volumen de NaOH añadido, y el eje de las Y el valor de pH.
3. Obtener los valores de pK para el aminoácido y comparar con la bibliografía.
4. Escribir las formas iónicas que deben existir del aminoácido antes y después
de cada pK y en el PI.
26
Nota: Recuerde poner el titulo a la grafica y todos los datos necesarios.
1. Entregar al profesor los resultados obtenidos para su recopilación grupal. El
análisis de los resultados aplicara para todos los equipos.
2. Después de alcanzar los resultados individuales; compare el CV obtenido entre

los equipos.
3. Después de elaborar la gráfica son los datos obtenidos en la titulación, observe

si se presentan zonas claras de amortiguamiento, esto es, cuando no hay
cambios bruscos en el pH a pesar de la adición de base.
4. Compare el pH de las zonas de amortiguamiento con los valores de pK de los

aminoácidos en la bibliografía y diga de que aminoácido de trata. Escriba las
formas iónicas que deben existir antes y después de cada pK y en el punto
isoeléctrico.
Cuestionario Previo
1. ¿Cuales son los grupos funcionales del aminoácido que se neutralizan en la
titulación de un aminoácido?
2. ¿Qué representa el pK de un grupo carboxilo o de un grupo amino?
3. Partiendo de la especie totalmente protonada, escriba las reacciones de
disociación que se presentan durante la titulación con una base fuerte, de los
aminoácidos tirosina y ácido glutámico.
4. Indique si los aminoácidos pueden usarse como amortiguadores y explique en
que casos.
5. ¿Cuál es el fundamento del potenciómetro?
Bibliografía
2. Harris, D.C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial
27
Iberoamericana, México
3. Segel, I.H. 1982. Cálculos de bioquímica. Como resolver problemas
matemáticos de bioquímica general. 2ª ed., Editorial Acribia, Zaragoza,
España
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
PRACTICA 3
BIOQUIMICA 3
Introducción
La cromatografía (del griego chroma, color + graphein, escribir) fue descrita en
1903 por el británico ruso Mikhail Tswett, quien separó pigmentos de hojas de
plantas mediante el uso de adsorbentes sólidos, es decir, un sólido a cuya
superficie se unen las sustancias. La cromatografía incluye una serie de métodos
analíticos de separación que tienen como característica general el estar
constituidos de una fase estacionaria y una fase móvil, entre las que se distribuyen
diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase móvil, la que arrastra a
las partículas que se van a separar, es un líquido (solvente o mezcla de solventes)
28
se denomina cromatografía de líquidos. Si la fase móvil es un gas se denomina
cromatografía de gases.
En cuanto a la fase estacionaria, ésta puede ser de composición variada. Si dicha

fase se utiliza un papel filtro, se denomina cromatografía en papel. La
cromatografía en papel, desarrollada en 1941 por Archer Martin y Richard Synge,
es una técnica en la que se plica un pequeño volumen de la muestra cerca de uno
de los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografía es
ascendente, cuando el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se
sumerge en el solvente que se encuentra en el fondo, haciendo que éste se
mueva hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la
mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades,
dependiendo de su solubilidad en el solvente, separándose. Si los compuestos
son coloridos se puede ver fácilmente las manchas que deja sobre el papel, el
caso contrario, hay que teñirlos con algún reactivo.
La relación de migración de una sustancia (Rf), puede expresarse de acuerdo con

la siguiente fórmula:
Rf = distancia recorrida por la muestra

Distancia recorrida por la mezcla eluyente
Cada sustancia exhibe un valor de Rf característico en relación con un sistema

disolvente dado y con el empleo de un tipo determinado de soporte.
La cromatografía en papel puede aplicarse como técnica para la separación de

aminoácidos y péptidos.
Los aminoácidos proteicos son los ácidos carboxílicos portadores de funciones

amina en el carbono α, como se muestra en la siguiente figura:
29
Existen veinte diferentes tipos de aminoácidos que forman a las proteínas
(polipéptidos). De acuerdo con su grupo R, los aminoácidos se pueden clasificar
en: no polares, polares sin carga, polares con carga negativa y polar con carga
positiva.
El aspartame (L-aspartil-L-fenilalanina metiléster) es un edulcorante que se

elabora industrialmente y tiene el sabor dulce y puro del azúcar de mesa
(sacarosa), pero solo añaden cantidades mínimas de calorías. Se utiliza en una
gran variedad de alimentos dietéticos, como refrescos, yogurt, goma de mascar y
endulzantes de mesa.
Este dipéptido formado por los aminoácidos fenilalanina y ácido aspártico, tiene,
entre otros nombres comerciales, los de Nutrasweet y Canderel. En la actualidad
el uso del aspartame se ha generalizado en la elaboración de productos dietéticos,
ante el amplio número de investigaciones que el aspartame es seguro para el
consumo humano. Sin embargo, algunas investigaciones cuestionan el uso de
este producto, ya que durante su metabolismo en los organismos, el aspartame se
descompone en los aminoácidos fenilalanina y el ácido aspártico y en alcohol
metílico.
Los aminoácidos y los péptidos, entre ellos los dipéptidos como el aspartame,
puede ser separados, dependiendo de su solubilidad, en solventes polares o no
polares utilizando técnicas analíticas de separación como la cromatografía en
papel.
30
Objetivo
Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema
mediante su (Rf) y ver sus propiedades de solubilización comparándolo con los
(Rf) de los aminoácidos que lo componen.
Fundamento
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para
realizar unos análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no
requiere de ningún tipo de equipamiento.
La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel filtro. La
muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace
ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la
muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el
fondo.
Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al

extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las
sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas.
Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de
revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección
del disolvente y la del papel de filtro.
Tipos de cromatografía en papel.
Descendente: Se trata de una caja saturada de vapor de agua, atravesada por

una cajetín semicilíndrico lleno con el solvente orgánico. En el se deposita, como
muestra la figura el papel con la banda de muestra justo al salir el papel del
cajetín. Para sujetar el papel introducimos una varilla a lo largo de la caja. El
31
solvente comenzará ascendiendo por el papel por capilaridad y continuará bajando
al salir de la cajetilla, pasando por la zona de muestra y arrastrándola,
consiguiéndose así la separación.
Ascendente: El solvente se encuentra en la parte inferior de la cubeta y asciende

por el papel haciendo que se separe la muestra. La resolución de la cromatografía
en papel descentente es mayor.
Material requerido
Material y equipo:
 1 Hoja de Papel Whatman Número 2 para cromatografía

 1 Tijeras
 7 Capilares de Vidrio
 1 Cámara para Cromatografía en papel
 1 Placa de Calentamiento
 1 Probeta de 100 mL
 1 Atomizador de Vidrio de 50 o 100 mL
 1 Pliego de Cartulina
 1 Regla de 30 cm
 1 Par de guantes desechables
32
 1 Secadora de Cabello
 1 Hilo blanco y aguja
Reactivos:
 Acido aspártico
 Fenilalanina
 Ninhidrina
 Butanol
 Ácido acético
 Canderel (aspartame)
Soluciones:
 Solución de isopropanol al 10% (v/v)

 Solución de ácido aspártico 0.002M (0.026 en 100 mL de isopropanol al 10%)
 Solución de fenilalanina 0.002M (0.033g en 100 mL de isopropanol al 10%)
 Solución de Ninhidrina al 0.2% (0.2g en 100 mL de acetona).
 Solución de butanol: Ácido acético: agua, en proporción 12:3:5 (v/v)
 Canderel al 1% (1g en 100 mL de agua)
Desarrollo
1. Colocar un volumen de la mezcla butanol: acido acético: agua en la cámara
para cromatografía, tal que no sobrepase el nivel de 1 cm y taparla para que se
sature a temperatura ambiente (25ºC). Si la temperatura ambiente es baja, se
debe colocar la cámara cerca de una placa de calentamiento dentro de la
33
campana de extracción de vapores.
2. Usar guantes para cortar un fragmento de 20 x 9 centímetros de una hoja de
papel Whatman, el cual debe colocarse sobre la superficie de una cartulina
nueva. Marcar el fragmento de papel con una flecha que indique el sentido en
que correrán las muestras, el cual viene señalado en la caja de papel Whatman
(ver figura).
3. En el lado más angosto del papel Whatman, y considerando el sentido en que
correrán las muestras, trazar con lápiz una línea a un centímetro del borde.
Sobre ésta línea marcar cinco puntos equidistantes, dejando un margen de 0.5
cm en cada extremo (ver figura).
4. Tomar una alícuota de fenilalanina, utilizando un capilar de punta adelgazada,
y ponerla sobre uno de los puntos marcados en el papel. Secar la aplicación
con la secadora de cabello. Realizar cinco aplicaciones secando en cada
ocasión. Hacer lo mismo con el ácido aspártico, Canderel o Nutrasweet,
refresco normal y de dieta.
5. Cuando se hayan aplicado las alícuotas de las cinco muestras, hacer dos
perforaciones en la parte superior de la hoja y colocar dos hilos de
aproximadamente 30 cm de largo (ver figura)
6. Colocar la hoja de papel dentro de la cámara de cromatografía, sosteniéndola
mediante los hilos en una posición tal que sea humedecida en forma
homogénea por la mezcla butanol: ácido acético: agua, pero si que las
manchas de las sustancias a separar sean cubiertas por la mezcla. El papel
debe mantenerse en esta posición vertical durante todo el procedimiento.
7. Para ello se deben sujetar los hilos a las paredes externas de la cámara
cromatográfica con un trozo de cinta adhesiva. Cerrar la cámara y colocarla
dentro de la campana de extracción del laboratorio.
8. Dejar correr la cromatografía durante dos horas aproximadamente. Sacar el
papel de la cámara, marcar con un lápiz la posición donde llego el disolvente
después del tiempo y dejar secar al aire.
34
9. Para revelar la posición de las sustancias que se corrieron en la
cromatográfica, se rociará el papel con una solución de Ninhidrina contenida en
el atomizador. El rociado se realiza en forma homogénea y a una distancia de
unos 10 cm. Secar el papel en una estufa a 100ºC por diez minutos.
10. Una vez seco el papel. Marcar con un lápiz los límites de las manchas que
aparecen y tomar la distancia entre el centro de la mancha y el punto de
aplicación. A partir de estos datos y distancia a la que llego el solvente,
determinar el Rf de cada uno de los compuestos que se aplicaron en el papel,
mediante la formula mencionada en la introducción.
11. Las soluciones utilizadas en esta práctica pueden eliminarse en la tarja,
manteniendo la llave del agua abierta para diluir y al terminar lavar la tarja.
Resultado a obtener
1. Elaborar un cuadro donde mencione el Rf de cada aminoácido (fenilalanina y
ácido aspártico), así como los de la muestra de Canderel o Nutrasweet,
refresco normal y refresco de dieta.
2. Determine el Rf de cada muestra y ordene los valores en forma ascendente.
1. Entregar al profesor los resultados obtenidos para su recopilación grupal. El
análisis de los resultados aplicara para todos los equipos.
35
2. Después de alcanzar los resultados individuales; compare el CV obtenido entre
los equipos.
3. ¿Todas las muestras presentan el mismo Rf?
4. ¿De que depende el desplazamiento de cada muestra?
5. ¿El aspartame o Nutrasweet esta presente en alguno de los refrescos
probados?
6. Si tu respuesta fue afirmativa ¿Cómo llegaste a esa conclusión?
7. El Rf de los refrescos normal y de dieta ¿Es el mismo? ¿Por qué?
Cuestionario Previo
1. ¿Qué son las fases estacionarias y móviles de un sistema cromatográfico?
2. ¿Cómo se puede modificar la fase móvil en un sistema cromatográfico?
3. ¿Qué es el Rf de una sustancia?
4. Investigue las características de los aminoácidos utilizados en la práctica y
como se clasifican.
5. Investigue los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí
utilizados, anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizados para
obtenerlos.
6. Realice una investigación sobre el uso actual del aspartame. Anote los posibles
beneficios y perjuicios del uso del producto.
Bibliografía
3. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioquímica. Addison-
Wesley, España.
36
REACCIONES DE CARBOHIDRATOS
PRACTICA 4
BIOQUIMICA 3
Introducción
Los carbohidratos o glúcidos son las biomoléculas más abundantes en la
naturaleza. Cada año, el proceso de fotosíntesis de plantas y algas, convierte más
de 100 000 millones de toneladas métricas de CO 2 y H2O en la celulosa y otros
productos vegetales.
Los glúcidos pueden ser monosacáridos, oligosacáridos (disacáridos, trisacáridos,

etc.) y polisacáridos. Los monosácaridos están formados por una unidad de
polihidroxialdehído o polihidroxicetona, el más abundante es la D-glucosa que es
un azúcar de seis carbonos. Los oligosacáridos constan de cadenas cortas de
monosacáridos unidas por enlaces glucósidos. Los más abundantes son los
disacáridos (unión de monosacáridos), el más conocido es la sacarosa o azúcar
de caña, formado por los monosacáridos de seis carbonos D-glucosa y D-
fructuosa. Los polisacáridos son cadenas largas de centenares o miles de
unidades de monosacáridos. Algunos polisacáridos, como la celulosa, son
cadenas lineales, mientras que otros, como el glucógeno y el almidón, tienen
cadenas ramificadas.
37
Todos los compuestos antes mencionados desarrollan múltiples funciones en los
organismos: son fuentes de energía, componentes de estructuras celulares y
participan en la comunicación celular, entre otras.
Los disacáridos y polisacáridos se pueden hidrolizar para producir monosacáridos

que reaccionan de acuerdo con los grupos hidroxilo y carbonilo que poseen. Por
ejemplo, tienen la capacidad de reducir algunos compuestos en medio alcalino,
por lo que se han denominado azucares reductores, contienen un carbono
anomérico libre, es decir, que no forma parte del enlace glucosídico, y dan
resultados positivos con los reactivos de Benedict o Fehling.
Los carbohidratos no reductores son aquellos que no contienen un carbono

anomérico libre, y por lo tanto, no dan pruebas positivas con dichos reactivos.
Carbono
anomérico
Azúcar reductor (glucosa) con el hidroxilo del carbono anomérico libre

Qiemianetal.
Da prueba positiva con los reactivos de Fehling o Benedict.
38
Azúcar no reductor (sacarosa) sin el hidroxilo del carbono anomérico libre (acetal).
No da prueba positiva con los reactivos de Fehling o Benedict.
La solución de Benedict se utiliza en la determinación cuantitativa de glucosa en la

sangre. Esta solución, como la de Fehling, contiene un ion de cobre que se reduce
y produce una prueba positiva con los azures reductores.
En la actualidad para determinar con mayor rapidez y exactitud los niveles

cualitativos y cuantitativos de los diferentes azucares se utilizan técnicas analíticas
como la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). También se utilizan
análisis bioquímicos comerciales, ya que contienen enzimas que actúan sobre
determinados azucares mezclándose con ellos para generar reacciones coloridas
que se pueden analizar en el espectrofotómetro.
Objetivo
Realizar pruebas de óxido-reducción para la determinación de azúcares
reductores en algunos alimentos utilizando la técnica de Fehling.
Fundamento
Los carbohidratos, glúcidos o azúcares constituyen una de las más importantes
clases de moléculas constituyentes de los organismos.
Los carbohidratos son derivados aldehídicos o cetónicos de alcoholes

polioxidrilados y por lo tanto tienen las propiedades características de esos grupos
como son la formación de oxina e hidrazonas. Existen diferentes tipos de
reacciones químicas que sirven para determinar cualitativamente la presencia de
carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y polisacáridos) como son las
siguientes:
39
(a) La Prueba de Molish: Se basa en la acción deshidratante e hidrolizante del
ácido sulfúrico concentrado sobre los carbohidratos. En esta prueba el ácido fuerte
cataliza la hidrólisis de cualquier enlace glucosídico presente en la muestra, y la
deshidratación del mismo a furfural (pentosas) e hidroximetil furfural (hexosas) de
los monosacáridos resultantes. Estos furfurales se condensan con naftol y dan un
producto colorado. Esta prueba para la identificación de azúcares en general.
(b) Prueba de Lugol: Se basa en la formación de un complejo entre el ion I 3 - y la

molécula de amilosa de almidón, la cual tiene una conformación helicoidal. Al
introducirse el ion I3- dentro de la hélice se forma una solución color azul o negra
dependiendo de la concentración. La amilopectina produce un color púrpura rojizo,
y el glucógeno un color pardo rojizo.
(c) Prueba de Barford: Permite distinguir monosacáridos de disacáridos. Aquí el

Cu2+ del reactivo (acetato cúprico en ácido acético diluido), es reducido a Cu 2+
(Cu+) en solución de ácido débil, en un tiempo de 5 a 7 minutos con los
monosacáridos. Los disacáridos reducen el ion Cu 2+ en un tiempo de 7 a 12
minutos. El Cu2O es un precipitado de color rojo. Es necesario realizar esta prueba
en condiciones de pH y de calentamientos fijos y estrictos.
(d) Prueba de Bial: Es una reacción coloreada específica para pentosas y cierto
ácidos urónicos que se descomponen al calentarse con ácidos formando pentonas
bajo condiciones cuidadosamente controladas de temperatura, tiempo y
concentración de HCl, las pentosas son rápidamente convertidas a furfural,
mientras que el hidroximetil furfural se forma a partir de hexosas presentes. En
presencia del ion férrrico y orcional (5 metil resorcinol), el furfural se condensa
rápidamente para producir un complejo colorado verde.
40
(e) Prueba del ácido Múcico: Esta prueba consiste en diferenciar la galactosa de
las demás aldohexosas por formación de un ácido sacárico que es el ácido
músico. El ácido sacárico cristalino es insoluble en HNO 3 diluído. El HNO3
concentrado oxida los dos carbones terminales de las aldohexosas formando los
correspondientes ácidos sacáricos. En general, los ácidos sacáricos son solubles
en HNO3 diluido, pero el ácido músico es insoluble en ácido diluido.
(f) Prueba de Selliwanoff: Es una reacción coloreada que es específica para

cetosas. En solución de HCl concentrado, las cetosas sufren una deshidratación
para producir derivados del furfural con más rapidez que como lo hacen las
aldosas. Posteriormente los derivados del furfural forman complejos con el
resorcinol para producir color. Consecuentemente los grados relativos del color
desarrollado en una solución que contiene azúcar, HCl y resorcinol, proporciona
evidencia sobre si el azúcar es una aldohexosa o cetosa. Las cetosas
generalmente producen un color rojo. En las condiciones que se efectúa la prueba,
todas las cetosas que pueden estar unidas en enlace glucosídico quedarán en
libertad y originarán reacción positiva.
(g) Formación de osazonas: Los carbohidratos fructosa y glucosa dan las

mismas osazonas por su arreglo especial semejante. La manosa no forma
osazonas en solución acuosa, pero en su lugar forma una fenilhidrazona insoluble.
Cada osazona tiene un punto de fusión determinado, aunque no es muy útil para
su diferenciación pues varía en pocos grados. Algunos cristales presentan una
forma lo suficientemente diferenciada para identificar el carbohidrato. El tiempo de
formación es diferente para cada carbohidrato. La prueba se basa en que los
azúcares reductores se condensan con reactivos como la fenilhidracina en frío
formando una fenilhidrazona. A 100 ªC y en presencia de un exceso de
fenihidracina se lleva a cabo otro tipo de reacción en donde participan los átomos
41
de carbono número 1 en las cetosas, dando lugar a la formación de osazonas.
Material requerido
Material y equipo:
 Espatula
 Gradilla
 Vaso de precipitado de 1000 ml
 Tubos de ensayo
 Vasos de precipitado de 250 ml
 Pipetas Pasteur
 Pipetas graduadas de 5 ml
 Parrilla eléctrica
 Ligas anchas
Reactivos:
 Glucosa
 Tartrato de sodio y potasio
 CuSO4 5H2O
 NaOH
 Sobres de Canderel o de Nutrasweet
 Lata de refresco de dieta sin colorante
42
 Lata de refresco normal sin colorante
 Lata de jugo de manzana
 Azúcar de mesa
Soluciones:
 Solución de glucosa al 5% (0.5 g en 10 ml de agua)

 Solución de Canderel o Nutrasweet al 1% (0.1 g en 10 ml de agua)
 Solución de azúcar de mesa al 5% (0.5 g en 10 ml de agua)
Reactivo de Fehling preparación:
 Solución A (3.5 g de CuSO4 en agua y aforar a 50 ml)

 Solución B (17.5 g de Tartrato de sodio y potasio y 5 g de NaOH en agua y
aforar a 50 ml)
Desarrollo
A. Prueba de Fehling
1. Numerar una serie de nueve tubos por duplicado.

2. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1.
3. Calentar los tubos en baño María a ebullición durante cinco minutos.
4. La formación de un precipitado rojo y la decoloración de la solución indica
prueba positiva para azúcar reductor.
43
Tabla 1. Preparación de los tubos para la prueba de Fehling
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Solución A
1 1 1 1 1 1 1 1 1
(ml)
Solución B
1 1 1 1 1 1 1 1 1
(ml)
Glucosa
3
(gotas)
Jugo de
manzana 10
(gotas)
Refresco
normal sin
10
colorante
(gotas)
Refresco de
dieta sin
10
colorante
(gotas)
Solución de
Canderel o 10
Nutrasweet
Solución de
azúcar de 10
mesa (gotas)
44
Resultado a obtener
1. Anotar los resultados en el siguiente cuadro y describir lo que se observa en
cada tubo, color, forma de precipitado, etc.
2. Comparar los resultados y decir ¿Qué tipo de azúcares son la glucosa,
fructuosa, manosa y sacarosa?
3. ¿ Los alimentos probados contienen azucares reductores? (discutir la
respuesta)
4. ¿Las determinaciones realizadas en esta práctica son cuantitativas o
cualitativas? ¿Por qué?
Muestra Reacción de Fehling

Glucosa
Jugo de manzana
Refresco normal sin
colorante
Refresco de dieta sin
colorante
Canderel o Nutrasweet
Azúcar de mesa
1. Mencione la similitud, en su composición, que presentan el reactivo de Fehling
y el reactivo de Benedict.
2. ¿Qué efecto puede tener en el organismo, la presencia de azucares reductores
en los alimentos?
45
Cuestionario Previo
1. ¿Qué es un azúcar reductor?
2. ¿En que consisten las pruebas que nos permiten saber si un azúcar es
reductor?
3. Describa la reacción de cada una de las pruebas efectuadas en al practica.
4. Estudie y dibuje las estructuras de los principales monosacáridos.
5. Describa las reacciones de oxidación de los monosácaridos
6. ¿Qué se entiende por epímero?
Bibliografía
Wesley, España.
46
CUANTIFICACION DE PROTEINAS, METODO DE BIURET
PRACTICA 5
BIOQUIMICA 3
Introducción
Las proteínas son macromoléculas de gran importancia para los seres vivos, ya
que las encontramos formando hasta el 50% del peso seco de las células. Sus
funciones son innumerables, las hay de defensa (inmunoglobina), de transporte
(hemoglobina, albumina), de reserva (caseína, ferritina), las enzimas
(catalizadores del metabolismo), de movimiento (miosina, actina, tubulina),
estructurales (queratina), de regulación (insulina), etc.
Las proteínas se encuentran formadas por residuos de aminoácidos, donde los

grupos R de unos aminoácidos pueden interactuar con los grupos R de otros
aminoácidos de una misma cadena polipeptídica, y así dar formas helicoidales o
estructura secundaria, o bien formas globulares o estructura terciaria. La unión de
varias subunidades de configuración globular forma una proteína de estructura
cuaternaria.
Debido al papel que desempeñan las proteínas, es importante contar con una
técnica adecuada para determinar la cantidad presente en muestras biológicas.
Para ello se han desarrollado diferentes técnicas de cuantificación de proteínas en
las cuales la más utilizada es la Biuret, Lowry y Bradford.
Objetivo
Aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en
una muestra problema.
47
Fundamento
Las diferentes técnicas para la cuantificación de proteínas se utilizan en trabajos
de investigación y laboratorios clínicos y todas ellas coinciden en la utilización de
curvas patrón.
Para determinar la cantidad de una sustancia problema, es este caso proteína, es

necesario realizar una curva patrón. Esta curva se obtiene al colocar cantidades
de la sustancia pura que se va a determinar, solución patrón o estándar, y
haciéndolas reaccionar con una serie de reactivos específicos para formar
complejos coloridos, cuya absorbancia es proporcional a la cantidad de proteína
presente.
Esta curva patrón servirá de base para determinar la cantidad de proteína de una
muestra problema, a la cual se le agregan los mismos reactivos para formar el
complejo y determinar la absorbancia del mismo.
Ejemplo hipotético:
En la tabla 1 se indican los ml de la solución de albumina de 100 mg/ml que se

agregan a los tubos, así como las cantidades de proteína en mg y los valores de
absorbancia obtenidos para cada uno de ellos.
El tubo numero 1, testigo o blanco de referencia, contiene todos los reactivos que
se agregan, excepto la sustancia a medir: proteína. Este tubo nos servirá para
ajustar el colorímetro o espectrofotómetro a cero de absorbancia en ausencia de
proteína. El tubo numero 6 contienen la muestra problema, de la cual se tomaron
0.5 ml y se obtuvo una absorbancia de 0.38.
48
Con estos valores, tubos dos a cinco, se realizo la grafica 2, donde las abscisas
(x) representan la concentración en mg de proteínas y las ordenadas (y) los
valores de la absorbancia de cada concentración.
Con esta información se realizo la grafica (curva patrón), la cual debe ser una
recta cuya ecuación es y= mx + b, si los resultados no dan exactamente una recta,
esta puede normalizarse por el método de regresión lineal de mínimos cuadrados.
49
Para calcular la cantidad de proteína se interpola el valor de y= 0.38 en la grafica
2, y se obtuvo la cantidad de proteína que tiene la muestra problema
correspondiente de x= 0.75 mg, en el volumen analizado de 0.5 ml.
Se despejo el valor de x de la ecuación de la recta, y= mx + b, se sustituyo el valor

de y= 0.38 y se determino la cantidad de mg de proteína (x):
En este caso en particular se analizo un volumen de 0.5 ml, por lo tanto, el factor
de dilución es igual a dos, entonces la cantidad de proteína, en mg/ml que se
encuentra en la muestra problema es de 7.5 mg X 2 = 15 mg de proteína/ml.
La reacción de Biuret se basa en la formación de un complejo entre los iones de

cobre y varias uniones peptídicas, proceso que da como resultado un color
purpura. La cantidad de producto formado depende de la concentración de
proteína. La sensibilidad de este método se encuentra en un intervalo de 0.5 a 100
mg de proteína. Pueden interferir algunos aminoácidos o sustancias
amortiguadoras (Tris).
Material requerido
50
Material y equipo:
 2 vasos de precipitado de 500 ml

 24 tubos de ensaye de 20 X 150 mm
 1 probeta de 10 ml
 1 pipeta graduada de 10 ml
 2 pipetas graduadas de 5 ml
 4 pipetas graduadas de 1 ml
 1 mortero con pistilo
 1 gradilla
 3 vasos de precipitado de 50 ml
 1 matraz aforado de 100 ml
 1 matraz aforado de 50 ml
 1 termómetro
 1 espectrofotómetro
 1 piceta
 1 propipeta
 1 parilla de calentamiento con agitador magnético
 1 baño de temperatura regulable a 50°C
 1 liga ancha
 1 vortex
Reactivos:
 CuSO4.5H2O
 NaOH
 NaCl
 Albumina sérica bovina
 Tartrato de sodio y potasio
Soluciones:
51
 Solución de NaCl al 0.9%
 Solución de NaOH al 10%
 Solución patrón de albumina de 10 mg/ml
 Solución reactivo de Biuret
Preparación: En un vaso de precipitado de 50 ml, disolver 0.3 g de CuSO4 en 20

ml de agua. En un vaso de precipitado, disolver 0.9 g de tartrato de sodio y 0.5 de
yoduro de potasio en 25 ml de agua. En otro vaso, disolver 0.8 g de NaOH en 25
mml de agua. Agregar lentamente la solución de tartrato a la solución de sulfato de
cobre y enseguida la de NaOH, mezclar bien y aforar a 100 ml en un matraz
volumétrico.
Desarrollo
Determinación de la concentración de proteína en muestras de leche:
1. Calentar el agua del baño de temperatura regulada al inicio de la práctica.

Mientras se alcanza una temperatura de 50 a 55°C realizar los siguientes
pasos.
2. Numerar los tubos y un duplicado de ellos, de acuerdo con la tabla 2. Mantener
el orden de colocación de cada uno de los reactivos como indica en la tabla.
52
3. Colocar los volúmenes indicados de la solución patrón de proteínas (BSA) en
los tubos numero dos al seis.
4. En los tubos siete al doce, colocar los volúmenes indicados de las muestras
problema. Si la cuantificación que se va a realizar es de la proteína caseína,
obtenida en la práctica anterior, o de cualquier proteína en estado solido,
proceder a pulverizar perfectamente en el mortero y preparar una solución al
1% en agua. Para facilitar su solubilidad pueden agregarse unas gotas de
NaOH al 10%. Si la proteína a cuantificar se encuentra en solución, tomar
alícuotas de 0.25 y 0.5 ml para realizar la determinación. Si la concentración es
alta, diluir de acuerdo con sus necesidades.
53
5. Para la determinación de proteína en el sobrenadante y la leche de la practica
6, se recomienda diluir con agua 1:10 y 1:20, respectivamente, y tomar las
alícuotas de 0.25 y 0.5 ml como se indica en la tabla 2, tubos del nueve al
doce.
6. Es importante mantener el orden de adición de los reactivos y manejar los
tubos progresivamente junto con su duplicado.
7. Completar el volumen a 3.0 ml con NaCl al 0.9%.
8. Agregar 3.0 ml del reactivo de Biuret y mezclar perfectamente.
9. Calentar la mezcla colocando los tubos en un baño María a 50°C durante 10
minutos.
10. Una vez incubados por diez minutos, enfriar los tubos en el chorro de agua de
la llave.
11. Leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. Utilizar el tubo
numero uno como blanco.
12. Con los datos obtenidos para la curva patrón, elaborar una tabla de
concentración absorbancia, así como una grafica que relaciones la cantidad de
proteína (mg) y los valores de absorbancia a 540 nm. Recordar que la solución
patrón de proteína tiene una concentración de 10 mg/ml.
13. Interpolar cada uno de los datos de absorbancia de las muestras problema.
14. Realizar los cálculos necesarios para reportar la cantidad de proteína, en
mg/ml, que tienen cada muestra, o bien la cantidad total de proteína en una
muestra dada. No olvide multiplicar por el factor de dilución, en caso de que
haya diluido la muestra.
Resultado a obtener
54
1. Realice las tablas y graficas de los datos obtenidos.
2. En el caso de las tablas, indique a que corresponde cada una de las columnas
o filas, así como las unidades que se maneja.
3. En el caso de las graficas, indique el titulo, variables y unidades que se
emplean. Tenga cuidado con al escala que utiliza. Resalte los puntos más
importantes que puedan proporcionar información.
4. Indique las operaciones realizadas para la obtención de la ecuación de la recta.
5. Determine la cantidad de proteína de las muestras problema por medio de la
interpolación de su absorbancia en la curva patrón, así como realizando la
sustitución de la ecuación de la recta.
6. Realice las operaciones necesarias para reportar la cantidad de proteína de la
muestra en mg/ml y múltiple por los factores de dilución en caso de haberse
realizado.
7. Indique en una tabla los resultados finales con todos los elementos necesarios.
1. Analice si el método para la determinación de proteínas es adecuado.
2. Señale la importancia o relevancia del método.
3. ¿Recomendaría este método para la determinación de proteína en otro tipo de
muestras?¨, ¿Cuáles serian?, ¿Por qué?
4. ¿Los resultados de la cantidad de proteína total de caseína, sobrenadante y
leche son los esperados? Si, No ¿Por qué?
5. ¿La caseína obtenida en la práctica podría ser utilizada para preparar una
solución patrón? ¿En que situación esto seria posible?
Cuestionario Previo
1. Describa que es un espectrofotómetro y para que sirve.
2. Mencione que es un espectrofotómetro de absorción y las diferentes longitudes
55
de oda del espectro.
3. Defina con sus propias palabras que es una curva patrón.
4. Explique cuales son las ventajas y desventajas de emplear los reactivos de
Biuret para cuantificar proteínas.
5. Menciona cual es la razón de que en el método de Biuret, la absorbancia de la
proteína se lea a 540 nm.
6. Explique si una curva patrón puede ser empleada para cuantificar sustancias
diferentes a las proteínas y cual seria la diferencia con estas.
7. ¿Cuál es la finalidad de emplear un tubo como blanco? Mencione si siempre se
utiliza agua como blanco.
8. Realice una curva patrón con los datos de la absorbancia y proteína obtenidos
de una determinación hipotética, que se realizo con una solución entandar de
albumina 10 mg/ml. Los valores de absorbancia referidos se determinaron por
duplicado.
9. Con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determine la ecuación de la

recta que representa a la curva patrón.
10. Basándose en la curva patrón y la ecuación de la recta, determine la cantidad
de proteína en mg/ml de las siguientes muestras, cuyos valores de
absorbancia se indican.
56
11. Elabore una lista de cinco compuestos que se podrían cuantificar empelando
una curva patrón y mencione que importancia tienen determinar la cantidad de
dichos compuestos.
Bibliografía
1. Bradford, M.M. 1976. “A rapid and sensitive method for the quantification
of microgram quanties of protein – dye binding”. Anal. Biochem. 72: 248 –
254
Wesley, España.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CATALASA EN UNA MUESTRA DE

SUELO POR EL MÉTODO DE JOHNSON Y TEMPLE Y MEDIDA DEL H 2O2
RESIDUAL MEDIANTE PERMANGANATOMETRÍA
PRACTICA 6
57
BIOQUIMICA 3
Introducción
La catalasa es una enzima intracelular que se encuentra en todas las bacterias
aerobias y en la mayoría de las anaerobias facultativas, estando ausente en las
anaerobias obligadas. Por ello, esta enzima se ha venido considerando a lo largo
de los años como un exponente de la actividad microbiana del suelo y se ha
relacionado con el estado de fertilidad edáfico. Sin embargo varios autores indican
que esta actividad no muestra una buena correlación con el numero total de
microorganismos del suelo, por lo que su papel como exponente del estado
bioquímico del mismo seria limitado.
La catalasa corresponde, según la nomenclatura de la Comisión Internacional de

Enzimas, a la actividad enzimática peróxido de hidrogeno oxidoreductasa y es la
encargada de catalizar la reacción que descompone el peróxido e hidrogeno
(H2O2), liberando H2O y O2. Tiene una función detoxificante en las células ya que
elimina el H2O2 altamente toxico, que se forma durante la cadena de transporte de
electrones en la respiración aerobia y en diversas reacciones de hidroxilación y
oxigenación. Fue la primera enzima determinada en el suelo y prácticamente la
única que se estudio durante los primeros años del siglo XX.
Uno de los problemas para la determinación de la actividad de catalasa en suelo,

siempre que se haga a través de la descomposición del H 2O2 es que entre un 65%
de la actividad total que se determina puede ser debida a una catálisis no
enzimática, atribuible a compuestos inorgánicos de Fe y Mn.
Desde principios del siglo XX se ha descrito numerosos métodos para la
determinación de la actividad de catalasa en los suelos, la mayoría de los cuales
han sufrido diversas modificaciones. En todos ellos la actividad de catalasa se
determina añadiendo peróxido de hidrogeno al suelo y midiendo bien la cantidad
de O2 liberado o bien el H2O2 remanente en el suelo al cabo de un tiempo
determinado. En los métodos que se basan en la medida del H 2O2 remanente,
58
esta se determina por titulación con KMnO4 o por colorimetría.
En suelos con elevado contenido en materia orgánica la co-extracción de la misma

durante la determinación da lugar a extractos ligeramente coloreados, lo que
dificulta en gran medida la distinción del punto final de la valoración con
permanganato potásico, no solo porque enmascara el color rosa pálido, típico de
dicho punto final, sino también porque dicha materia orgánica reduce al
permanganato, subestimado la actividad enzimática. Esto hace que los extractos
correspondientes a los controles, esto es, suelo incubado sin adición de H 2O2,
tengan que ser valorados con extremo cuidado, para evitar una estimación
incorrecta de la actividad catalasa. Por otro lado, incluso en suelos con bajo
contenido de materia orgánica, el punto de viraje es muy difícil de apreciar por lo
que la valoración de muestras y controles es extremadamente subjetiva.
Objetivo
Determinar la actividad de catalasa por el método de Johnson y Temple y la
medida del H2O2 residual mediante Permanganatometría.
Fundamento
El procedimiento para que tenga lugar la reacción enzimática se basa en la adición
de una determinada cantidad de H2O2 al suelo y en la incubación de la mezcla a
20 °C durante un periodo de tiempo determinado en el que actúa la enzima,
provocando la descomposición del H2O2 en H2O y O2, según la siguiente reacción:
2H2O2 → 2H2O + O2
Posteriormente, el H2O2 residual, esto es, el peróxido de hidrogeno que

permanece inalterado después de que tuvo lugar la reacción enzimática, se mide
mediante una valoración con permanganato potásico, lo cual se basa en que el
peróxido de hidrógeno en solución acida reduce al permanganato con formación
de oxigeno, según la siguiente reacción:
5H2O2 + 2MnO4 + 6H+ → 5O2 + 2Mn++ + 8H2O

59
Material requerido
Material y equipo:
 Agitador rotatorio
 Incubadora
 6 Matraz Erlenmeyer de 250 ml
 1 Bureta
 3 Espátulas
 Balanza analítica
 3 Probetas de 50 ml
 Piceta
 3 Pipetas de 10 ml
 Papel filtro poro fino
 3 Embudos
Reactivos:
 Peróxido de hidrogeno al 30% (H2O2)

 Acido Sulfúrico 1.5 M (HCl)
 Permanganato de potasio 0.01 M (KMnO4)
Soluciones:
 Peróxido de hidrogeno (H2O2) al 1:100: Diluir 1 ml de agua oxigenada al 30%

a 100 ml con agua destilada, inmediatamente antes de su uso. Se puede hacer
directamente en un matraz.
 Acido sulfúrico al 1.5 M (HCl): Realice los cálculos pertinentes.
 Permanganato de potasio 0.01 M (KMnO4): Realice los cálculos pertinentes.
60
Mantener en un recipiente ámbar, no poner en contacto con cristal solo
plástico.
Desarrollo
1. Pesar 0.5 g de suelo húmedo (<2 mm) en un matraz Erlenmeyer y añadir 40 ml
de agua destilada y tapar.
2. Agitar por 30 minutos en agitador rotatorio (3 vueltas por minuto).
3. Añadir 5 ml de H2O2 1:100, tapar y agitar de nuevo durante 10 minutos exactos

en agitador rotatorio.
4. Preparar la reacción enzimática y estabilizar el peróxido de hidrógeno

remanente mediante la adición de 5 ml de H 2SO4 1.5 M y filtrar.
5. Para cada suelo a ensayar es necesario realizar controles, que se preparan de

la misma forma que las muestras, pero sustituyendo los 5 ml de H 2O2 por igual
volumen de agua destilada.
6. Además, también es necesario preparar un blanco sin suelo pero con H 2O2 y
cuya valoración nos dará la referencia de la cantidad máxima de H 2O2 que
puede estar presente en las muestras, ya que la cantidad de H 2O2 en el mismo
corresponde a la cantidad de H2O2 inicialmente añadida a las muestras o, lo
que es igual, a la cantidad máxima de peróxido de hidrogeno que estas podrían
poseer como remanente al final de la incubación en caso de que la actividad
catalasa fuese nula. Dicho blanco se prepara con 40 ml de agua destilada, 5 ml
H2O2 (1:100) y 5 ml de H2SO4 1.5 M obteniéndose, así una solución de H 2O2 8.8
mM.
61
7. Para determinar el agua oxigenada residual en los extractos del suelo se toma
una alícuota de 25 ml del extracto filtrado y se valora lentamente con KMnO 4
0.01 M, agitando continuamente la disolución y esperando hasta que la
disolución sea incolora antes de añadir la siguiente gota de permanganato. El
punto final de la valoración lo señala la aparición del primer color rosado
permanente. Hay que tener cuidado, porque las primes gotas de permanganato
decoloran lentamente, pero luego la reacción se hace mas rápida hasta llegar
al punto final.
8. Valorar las muestras tanto los controles. La concentración inicial del H 2O2
añadido al suelo se determina por la valoración con permanganato del blanco
sin suelo y con peróxido de hidrogeno.
Resultado a obtener
Después de sustraer a las muestras los ml gastados en la valoración de los
blancos se calcula, por diferencia con la concentración inicial de peróxido de
hidrogeno, la concentración de H2O2 consumido y, por tanto, la del O 2 desprendido
en la reacción enzimática, que seria igual a la mitad del peróxido consumido.
Cálculos:
AE = [BG – (S – B)] X N X 0.5 X V X T =

G
Dónde:
AE= Actividad catalasa (mmoles H2O2 consumido en g-1 h-1).

BG= Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración del blanco sin
suelo y con H2O2.
S= Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración de las muestras.
62
B= Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración del control
correspondiente a cada muestra de suelo.
N= Normalidad exacta del permanganato potásico.
0.5= Valor constante que procede del calculo para conocer los mg de H 2O2 que
reaccionan con el permanganato [peso molecular del H 2O2 (34) divido por la
valencia (2)] y de cálculo para obtener la cantidad de H 2O2 en mmoles (1/peso
molecular del H2O2).
V= Factor de dilución en este caso seria 50 ml/25 ml.
G= Factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado en este caso 0.5 gramos
de suelo húmedo.
T= Factor de tiempo; en este caso serie 6, ya que la incubación dura 10 minutos.
1. De los resultados obtenidos indique cuales son uno de los principales
problemas asociados a la determinación de la actividad de catalasa en suelos.
2. Cree usted en base a sus resultados que seria buena opción usar soluciones
tampón para tener mejor resultado de la medición de la actividad de la catalasa
como Fosfato 0.3 M a pH 6.8.
3. Analice si la cantidad de suelo utilizada es la adecuada para la determinación
así como también el tiempo de incubación.
4. Comente si la temperatura de incubación de 20 °C será adecuada para medir
la actividad de catalasa.
5. Utilice la siguiente tabla y dependiendo del tipo de suelo ensayado si sus
resultados son satisfactorios comparados con los asentados en la tabla.
63
Tipo de suelo Rango de actividad Referencia
Suelos agrícolas
0.60 a 1.50 Johnson y Temple, 1964
diversos
Suelos semiencharcados
0.50 a 0.60 Radalescu et al, 1984
lacustres
Förnas, Suelos
1.04 a 1.93 Pantos – Derimova, 1998
forestales
Horizontes suelos
0.24 a 0.61 Pantos – Derimova, 1998
forestales
García – Álvarez e
Suelos agrícolas 2.20 a 1.62
Ibáñez, 1994
Trasar – Cepeda et al,
Suelos forestales 0.24 a 3.28
1999
Cuestionario Previo
1. ¿Es posible separar la proporción de la descomposición del peróxido de
hidrogeno debida a la catalasa de la debida acción de la parte no enzimática?
2. ¿Qué importancia tienen las soluciones tampón en la determinación de la
actividad de la catalasa?
3. ¿La cantidad de suelo de 0.5 g y el tiempo de incubación empleado tendrán
influencia en la actividad de la catalasa?
4. ¿Cuál es el papel del Peróxido de hidrogeno añadido al suelo durante la
actividad de catalasa?
5. ¿Cuál será el efecto de catalasa si se añade mayor cantidad de peróxido de
hidrogeno a la misma concentración y a diferentes concentración?
6. Indique si su resultado obtenido corresponde a algún rango de la tabla
asentada en los análisis de resultados y explique porque razón si fue así, y por
qué razón si no fue así.
64
Bibliografía
1. García Carlos, Gil Fernando, Hernández Teresa, Trase Carmen, “TECNICAS
DE ANALISIS DE PARAMETROS BIOQUIMICOS EN SUELOS, MEDIDA DE
ACTIVIDAD ENZIMATICA Y BIOMASA MICROBIANA”, Edición 2003,
Editorial Mundi Prensa, México DF
CINÉTICA ENZIMÁTICA. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA
PRACTICA 7
BIOQUIMICA 2
Introducción
Las enzimas son las proteínas más notables de la naturaleza; sin ellas, la vida
como la conocemos no sería posible. Las enzimas son catalizadores, esto es,
aceleran la velocidad de las reacciones sobre las que actúan sin consumirse en el
proceso. El poder catalítico de las enzimas es mucho mayor que el de los
catalizadores inorgánicos, algunas de ellas están limitadas solo por la velocidad
con que colisionan con sus sustratos; son catalizadores perfectos.
Aunque las reacciones que ocurren en la célula son termodinámicamente
favorables, la velocidad a la cual transcurren la mayoría de ellas es
65
extremadamente lenta; sin la presencia de las enzimas, las reacciones necesarias
para sostener la vida ocurrirían a una velocidad incompatible con ésta. Además de
su enorme poder catalítico, las enzimas son altamente específicas por sus
sustratos y tienen la capacidad de regular su velocidad en respuesta a las
concentraciones de sustrato y la presencia de inhibidores, activadores,
reguladores alostéricos, etc. Así pues, las enzimas desempeñan un papel central
en los procesos biológicos, son las responsables de degradar y sintetizar las
moléculas que nos forman y de extraer, transformar y utilizar toda la energía
relacionada con estos procesos. Por último, las enzimas son las responsables de
regular y coordinar todas las reacciones que ocurren en un organismo para lograr
el delicado balance que representa la vida.
El primer modelo matemático que explicó de manera general la cinética de las

enzimas no alostéricas, donde la velocidad de la reacción se incrementa
hiperbólicamente conforme aumenta la concentración de sustrato, fue propuesto
en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten a partir de los trabajos previos de
Victor Henri y Archibald Hill. Este modelo postula la idea central de que la enzima
y el sustrato libres establecen un equilibrio rápido con el complejo enzima-sustrato;
en un segundo paso más lento, este complejo se rompe liberando el producto y
regenerando la enzima libre. La ecuación de Michelis-Menten explica la relación
entre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima y la concentración de
sustrato a través de los dos parámetros de la ecuación, Vmax y Km. La ecuación
de Michaelis-Menten puede ser re-arreglada matemáticamente para obtener su
forma lineal, permitiendo determinar de manera sencilla los parámetros cinéticos
de una enzima a través del grafico de Lineweaver-Burk. Este mismo gráfico
permite inspeccionar rápida y visualmente las diferentes formas de inhibición
enzimática.
El estudio de las enzimas es de suma importancia dentro de las ciencias médicas;
66
las enzimas están implicadas en el origen, diagnóstico y tratamiento de una gran
cantidad de patologías y es claro que en el futuro, su preponderancia será cada
vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de algunas enzimas, como las proteasas de
la coagulación en la hemofilia, es causa de enfermedades hereditarias. La
presencia anormal de algunas enzimas en el torrente sanguíneo ayuda a
diagnosticar el daño específico de tejidos, este es el caso de la amilasa y lipasa en
las patologías pancreáticas y las transaminasas en las enfermedades hepáticas.
Las enzimas son también el blanco de varios fármacos: la aspirina inhibe a la
ciclooxigenasa, el omeprazol a la ATPasa de protones y el captopril a la enzima
convertidora de angiotensina; estas inhibiciones redundan en un efecto
terapéutico. La capacidad de producir enzimas recombinantes abrió la posibilidad
de utilizarlas rutinariamente con fines terapéuticos, tal es el caso de la
estreptocinasa para la terapia fibrinolítica en el infarto agudo al miocardio. Es claro
que todas estas aplicaciones no serían posibles sin la previa y profunda
comprensión de la estructura y función de estas fascinantes moléculas.
Objetivo
Explicará el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una
reacción enzimática, mediante el cálculo de métodos gráficos de la máxima
velocidad y la constante Michaelis, así como explicara los diferentes inhibidores
que existen y su efecto sobre la Km y Vmax.
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la glucosa, en presencia del oxígeno del
aire y con la participación de la glucosa oxidasa, se oxida hasta ácido glucónico. El
peróxido de hidrógeno que se forma en el curso del proceso se descompone
mediante la peroxidasa. El oxígeno atómico que se desprende en esta última
reacción se combina con un cromógeno que se colorea al oxidarse. La intensidad
de la coloración del cromógeno oxidado es proporcional a la concentración de
glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno óxidorreductasa, tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma dimérica y contiene dos moles de FAD
como grupo prostético por mol de enzima. La glucosa oxidasa es altamente
67
específica, hecho que ha permitido su empleo para el análisis cuantitativo de
glucosa. La reacción consiste de dos pasos:
La δ4-gluconolactona se hidrata espontáneamente dando ácido glucónico. La

reacción global se expresa:
Glucosa oxidasa
La reacción global se expresa:
La peroxidasa cataliza la transferencia de oxígeno del peróxido a un aceptor que

es cromógeno como la ortotoluidina, la ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3-
etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-amino-antipirina (y fenol) que se colorean al
oxidarse. La reacción se expresa:
Material requerido
Material y equipo:
 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una
68
 1 Pipeta de 5 ml
 2 Pipetas de 1 ml
 Fotocolorímetro con filtro azul
 Gotero con HCl
Reactivos:
 Glucosa
 Glucosa peroxidasa
 Peroxidasa
 Ortodianisidina
 Azida de sodio
Soluciones:
 Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una dilución 1:10 de ésta para los
tubos 2, 3 y 4.
 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml –1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1
de peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l.
 Solución de azida de sodio 400 mmol/l como inhibidor.
Desarrollo
Método I (con azida de sodio)
1. Preincubar 20 minutos la solución de enzimas con 0.3 ml del inhibidor.

2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
3. Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar la enzima.
4. Agitar cada tubo e incubar 5 minutos a temperatura ambiente y de inmediato
detener la reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado. Considerar un
intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar el HCl.
Método II (sin inhibidor)
1. Preparar nuevamente una serie de tubos como lo indica la tabla 1.
69
2. Repetir los pasos 3 y 4 del Método I
3. Leer ambas series de tubos en el fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo 1
Solución de Solución de
Numero de tubo H2O (ml)
glucosa (ml) enzimas (ml)
1 1 3
2 1:10 0.9 3
3 1:10 0.75 3
4 1:10 0.5 3
5 0.9 3
6 0.75 3
7 0.5 3
8 0 3
Instrucciones para la operación del fotocolorímetro Klett- Summerson
1. Antes de encender el fotocolorímetro cerciórese que el filtro (F) está en su sitio.

La luz sin el filtro puede dañar la fotocelda.
2. Asegúrese que la aguja indicadora (C) está en cero. En caso contrario,
ajústese a cero con la perilla (D) que sólo debe usarse cuando la lámpara del
colorímetro esté apagada.
3. Encienda el foco con el interruptor de la derecha y deje que el instrumento se
caliente hasta que se equilibre su operación. Cinco minutos son suficientes.
4. Ajuste la escala del potenciómetro (B) a cero usando la perilla (A).
5. Ponga una cubeta limpia llena con el blanco de reactivos en el hueco del
instrumento en tal forma que la marca del tubo (ej. Pyrex) se sitúe directamente
70
al frente. Es una buena práctica limpiar la superficie externa de la cubeta con
un pañuelo desechable antes de cada lectura. Sólo deben usarse tubos
seleccionados como "cubetas" para las determinaciones.
6. Por medio de la perilla (G) ajuste la lectura del galvanómetro a cero; esto es, la
aguja (C) debe coincidir con el trazo central y, al mismo tiempo, con la escala
(B) en cero.
7. Para leer las soluciones problema retire el “blanco” y ponga en el hueco del
instrumento la cubeta con la solución problema. La aguja (C) se desviará de su
posición en la línea de cero; por medio de la perilla (A) gírese la escala (B)
hasta que la aguja (C) sea llevada exactamente a cero. La lectura de la escala
(B) se anota y corresponde a la lectura del problema; léase únicamente hasta
la marca más próxima. Cualquier intento de apreciar mayor exactitud es
innecesario, pues la construcción del instrumento no proporciona una precisión
mayor.
8. Continúe con la lectura de otros problemas y, de vez en cuando, compruebe el
cero con el “blanco.”
71
Resultados
1. Calcular la concentración inicial de sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que
la solución de glucosa contiene 40 μmolas ml –1.
2. La velocidad será igual a las unidades Klett por 5 min -1 de incubación.
3. Con los datos obtenidos completar el cuadro anterior y hacer las dos gráficas
en papel milimétrico.
4. Hacer una segunda gráfica con los valores de 1/v vs 1/ [S].
5. Calcular el valor de la velocidad máxima (Vmáx) y de la constante de Michaelis
(Km) con y sin inhibidor.
6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo con las gráficas del punto anterior.
7. Analizar si los resultados obtenidos están de acuerdo con la hipótesis
planteada.
En base a los resultados obtenidos y los gráficos realizadas sobre la cinética
enzimática e inhibidores realizar los análisis de los resultados pertinentes.
Describir si el comportamiento representa la teoría de Michaelis Mente y si no
cumpliera especificar cuál es el comportamiento presentado.
Cuestionario Previo
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis (Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V máx) de una reacción?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la determinación de la actividad de algunas
enzimas?
5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación tiene valor diagnóstico?
72
Bibliografía
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona:
Ediciones Omega; 2005.
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill
Interamericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley
and Sons; 1999.
73
DETERMINACION DE LIPIDOS (EXTRACTO ETEREO)
PRACTICA 8
BIOQUIMICA 3
Introducción
Las grasas y aceites ocupan un lugar muy importante dentro de la alimentación
humana, debido a que muchos de estos son una parte integral en casi todos los
alimentos que se consumen a diario, como por ejemplo proporcionando suavidad a
la corteza de pastelería, galletas, aceites de frituras y horneados, aderezos, etc.
Algunas de las grasas utilizadas en la preparación de alimentos se obtienen de
animales y en especial de varios suministros vegetales o principalmente de sus
semillas, conocidas como semillas oleaginosas. Para su obtención existen
diversos métodos de extracción los cuales son por presión, por solvente y sistema
combinado. La grasa cruda o el aceite así obtenido, se somete a una serie de
procesos de manufactura antes de ponerse a la venta, se debe de tener en cuenta
que este proceso será la operación base para seguir con los demás procesos
además de estar relacionada con la cantidad de aceite que se pude producir
dentro al final y así mantener el mejor rendimiento del mismo. Estos procesos
incluyen, tratamientos con álcali para remover ciertas impurezas y pigmentos por
absorción, desodorizarían mediante destilación mediante destilación por vapor,
hidrogenación si se desea una grasa plástica o plastificación para dar una
consistencia cremosa.
Objetivo
Que el alumno determine el porcentaje de lípidos en una muestra (cereal FROOT
LOOPS) sólida y seca utilizando equipo Soxhlet a través del método de extracto
74
etéreo.
Fundamento
Los cuerpos grasos o lípidos son mezclas de esteres resultantes de la
combinación de glicerina con los ácidos grasos superiores, principalmente el
palmítico, oleico y esteárico. Son pocos los cuerpos grasos en cuya composición
intervienen, en cantidad considerable, los ácidos grasos inferiores (mantequilla,
por ejemplo).
Los lípidos son insolubles en el agua y menos densos que ella. Se disuelven bien
en disolventes no polares, tales como el éter sulfúrico, sulfuro de carbono,
benceno, cloroformo y en los derivados líquidos del petróleo. Se encuentran
lípidos, tanto en vegetales como en los animales. Muchos vegetales acumulan
considerables cantidades de lípidos en los frutos y semillas.
Los animales tienen grasa en las diferentes partes de su cuerpo, especialmente

entre la piel y los músculos, en la médula de los huesos y alrededor de las
vísceras.
Hay lípidos sólidos, denominados grasas, y líquidos denominados aceites. El

término grasa se emplea para aquellas mezclas que son sólidas o semisólidas a
temperatura ambiente, en tanto que el término aceite se aplica a mezclas que son
líquidas a temperatura ambiente. Existen diferentes familias o clases de lípidos,
pero las propiedades distintivas de todos ellos derivan de la naturaleza
hidrocarbonada de la porción principal de su estructura.
Los lípidos desempeñan diversas funciones biológicas importantes, actuando:
1. Como componentes estructurales de las membranas.

2. Como formas de transporte y almacenamiento del combustible catabólico.
3. Como cubierta protectora sobre la superficie de muchos organismos.
75
4. Como componentes de la superficie celular relacionados con el reconocimiento
de las células, la especificidad de especie y la inmunidad de los tejidos.
Algunas sustancias clasificadas entre los lípidos poseen una intensa actividad
biológica: se encuentran entre ellas algunas de las vitaminas y hormonas. Aunque
los lípidos constituyen una clase bien definida de biomoléculas, veremos que con
frecuencia se encuentran combinados covalentemente o mediante enlaces débiles,
con miembros de otras clases de biomoléculas, constituyendo moléculas híbridas
tales como los glucolípidos, que contienen lípidos y glúcidos, y las lipoproteínas
que contienen lípidos y proteínas. En estas biomoléculas las propiedades químicas
y físicas características de sus componentes están fusionadas para cumplir
funciones biológicas especializadas.La cantidad de lípidos (y tipo) varía mucho
según el tipo de alimento.
La determinación de lípidos, sobre todo en la industria, esta dirigida a tres

objetivos diferentes:
• Contenido total en lípidos

• Composición de la materia grasa
• Control de calidad.
En cada tipo de muestra es más importante alguno de los aspectos anteriores (y

raramente los tres). Se considera grasa al extracto etéreo que se obtiene cuando
la muestra es sometida a extracción con éter etílico. El término extracto etéreo se
refiere al conjunto de las sustancias extraídas que incluyen, además de los esteres
de los ácidos grasos con el glicerol, a los fosfolípidos, las lecitinas, los esteroles,
las ceras, los ácidos grasos libres, los carotenos, las clorofilas y otros pigmentos.
El extractor utilizado en el siguiente método es el Soxhlet. Es un extractor

intermitente, muy eficaz, pero tiene la dificultad de usar cantidades considerables
de disolvente. El equipo de extracción consiste en tres partes:
76
1. El refrigerante.
2. El extractor propiamente dicho, que posee un sifón que se acciona
automáticamente e intermitente.
3. El recipiente colector, donde se recibe o deposita la grasa.
Al calentarse el solvente que se encuentra en el recipiente colector, se evapora

ascendiendo los vapores por el tubo lateral, se condensan en el refrigerante y caen
sobre la muestra que se encuentra en la cámara de extracción en un dedal o
paquetito. El disolvente se va acumulando hasta que su nivel sobrepase el tubo
sifón, el cual se acciona y transfiere el solvente cargado de materia grasa al
recipiente colector. Nuevamente el solvente vuelve a calentarse y evaporarse,
ascendiendo por el tubo lateral, quedando depositado el extracto etéreo en el
recipiente colector. El proceso se repite durante el tiempo que dure la extracción
en forma automática e intermitente y así la muestra es sometida constantemente a
la acción del solvente.
Material requerido
Realizado por el alumno.
Desarrollo
1. Pesar 2 a 5 g de muestra y colocarla en un cartucho de papel filtro.
2. Montar equipo Soxhlet.
3. Añadir éter por el condensador una cantidad suficiente.
4. Hacer circular el agua por el condensador e iniciar calentamiento.
5. Efectuar extracción de 4 a 5 horas.
6. Desacoplar el equipo.
7. Evaporar el éter (recuperándolo) en el equipo rotavapor.
8. Introducir el matraz balón a la estufa durante 30 min.
9. Atemperar y pesarlo hasta peso constante.
10. Anotar los resultados
77
Resultados
Cálculos y resultados:
Considerar lo siguiente:
Peso del Matraz Balón (P1):

Peso del Matraz Balón más muestra (P2):
% De extracto etéreo: P2 – P1 X 100

M
P1= Peso en gramos del matraz sin grasa.
P2 =Peso en gramos del matraz con grasa.
M = peso en gramos de la muestra.
En base a los resultados obtenidos evaluar la eficiencia del método durante la
técnica del extracto etéreo. Comentar si los reflujos del equipo que se llevan a
cabo durante la técnica son los suficientes para el lavado de la muestra.
Cuestionario Previo
1. ¿Qué es una grasa, aceite, un lípido y un triglicérido?
2. ¿Cuál es el solvente más adecuado para extraer grasas y aceites?
3. ¿Cuál es la diferencia entre una grasa y un aceite?
4. Mencione un tipo de método diferente para la extracción de grasas y aceites
5. ¿Cuánto tiempo es el necesario para extraer las grasas y aceites?
Bibliografía
78
1. González., S. Elvira, Bucio., O. Leticia, et al, “MANUAL DE BIOQUIMICA”,
División de Ciencias Biológicas de la Salud, Universidad Autónoma
Metropolitana, Plantel Iztapalapa, Primera edición 2007, México D.F
ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS; EFECTO DE LOS
79
INHIBIDORES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE
LOS DESACOPLANTES
PRACTICA 9
BIOQUIMICA 2
Introducción
Las levaduras consumen glucosa, y durante este consumo se observa una
disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo con el tiempo
así como cambios en el pH extracelular.
Objetivo
Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las
levaduras, mediante las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH,
interpretando los efectos de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de
protones.
Fundamento
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se
dividen por gemación. En común con otras células eucariontes, las levaduras
tienen un núcleo en donde reside la información genética de la célula,
mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y un retículo
endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas cuya
localización final es la membrana plasmática o el exterior.
A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H + que
acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula.
Esta proteína es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la
ATPasa de Na+/K+ de las células animales y, al igual que la bomba de
sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato.
Como resultado de la actividad de la ATPasa de H + en la levadura, se genera un
gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de
nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte
80
llamados simportadores o uniportadores. Para darse una idea de la importancia de
esta enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular,
basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza
en la célula.
Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen

otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP
sintasa, que se encarga e la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de
membrana plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la
síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la
oligomicina.
Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en
la levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP
sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H + lo hidroliza para
bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un
flujo de protones a través de la membrana. Figura 1.
Figura 1.
Material requerido
Material y equipo:
Tres vasos de precipitado de 100 ml
81
Pipetas de 5 y 10 ml
Potenciómetro
Piceta para enjuagar el electrodo del potenciómetro
Reactivos:
Agua destilada
Glucosa
Dinitrofenol
Etanol
Azida de sodio
Soluciones:
Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml

Solución de glucosa (10%) para una concentración final de 1%1%.
Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol
Solución de azida de sodio 400 mmol/l
Desarrollo
Experimento 1 (control).
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.

2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con
82
intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10
minutos 2 veces más.
Experimento 2 (dinitrofenol).

2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40
mmol/l, concentración final de 200 μmol/l.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
Experimento 3 (azida).

2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio
400 mmol/l, concentración final de 5 mmol/l. Agitar con cuidado.
4. Esperar 5 minutos. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
5. Registrar sus datos en la siguiente tabla.
pH
Tiempo (min)
Glucosa Dinitrofenol Azida de sodio
0
5
10
15
20
30
83
40
Resultado a obtener
En base a los experimentos realizados del 1 al 3 llenar la tabla del punto anterior y
analizar porque la obtención de estos y las posibles diferencias o similitudes entre
cada resultado obtenido. Ayudarse de las gráficas a realizar.
Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizar los valores de las
lecturas de pH contra tiempo.
Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con
dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio.
Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que
las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que
se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la
membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de Na +/K+ en las células
de los mamíferos, ver figura 1.
Cuestionario Previo
1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?
2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?
3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa?
4. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las
levaduras?
5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III?
Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP.
6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan la
fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de O 2 y la síntesis
84
del ATP.
Bibliografía
1. Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem
Biophys. 1975; 167:397-409.
2. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la membrana plasmática de los hongos.
Mensaje Bioquímico.
RESPIRACION
PRACTICA 10
BIOQUIMICA 2
Introducción
La respiración aerobia es realizada a nivel celular, por aquéllos organismos que
pueden utilizar el oxígeno atmosférico en la combustión de moléculas como la
glucosa, para la obtención de la energía que requieren las células. La energía que
se obtiene de la respiración es "administrada" por una molécula conocida como
85
ATP.
La respiración celular tiene lugar en tres etapas (glucólisis, ciclo de Krebs y

cadena respiratoria), y se lleva a cabo con la intervención de una estructura celular
especializada: la mitocondria.
Las dos primeras etapas de degradación de la molécula de glucosa (glucólisis y

ciclo de Krebs) se llevan a cabo sin la intervención del oxígeno. Es hasta la tercera
etapa (cadena respiratoria) donde interviene el oxígeno.
Durante la glucólisis la célula hace reaccionar a la glucosa con la presencia de dos

moléculas de adenosín trifosfato (ATP) formando un azúcar difosfatado y liberando
dos moléculas de ADP (adenosín difosfato, que han dejado dos ácidos fosfóricos
en el azúcar). Esta molécula difosfatada se rompe por la acción de enzimas y
forma dos moléculas de 3 carbonos. Cada molécula de 3 carbonos reacciona
incorporando un fósforo inorgánico, formándose así dos moléculas de 3 carbonos,
difosfatadas.
Si consideramos la degradación total de la molécula de glucosa y descontamos los

2 ATP que entraron a ella al inicio de la glucólisis, la célula obtiene un total de 38
ATP.
Objetivo
Medir el consumo de oxígeno (velocidad de respiración) durante la respiración de
semillas de fríjol y lombrices empleando para ello un dispositivo llamado
respirómetro y reconocer que todos los seres vivos necesitan consumir oxígeno
para liberar energía, diferenciando si la respiración es similar ente plantas y
animales.
Fundamento
Creemos que las semillas germinadas sin hervir respirarán más debido a que se
encuentran en desarrollo y tienen una mayor actividad porque necesitan llevar a
cabo la reproducción de sus células para crecer.
La Fosforilación es una reacción impulsada por la luz. Los organismos
fotosintéticos atrapan la luz solar formando ATP y NADH que utilizan como fuente
86
de energía para fabricar glúcidos y otros componentes orgánicos a partir de CO 2 y
H2O de forma simultánea liberan O2 a la atmosfera.
Los heterótrofos aeróbicos utilizan O 2 para degradar productos orgánicos ricos en
energía de la fotosíntesis a CO2 y H2O, generando ATP para sus actividades. El
CO2 formado en la respiración de los heterótrofos regresa a la atmosfera para
poder ser utilizado otra vez por los organismos fotosintéticos.
En la Fosforilación también los electrones fluyen a través de una serie de
transportadores ligados a la membrana entre los que están los citocromos,
quinonas y proteínas ferrosulfuradas, al mismo tiempo hay bombeo de protones
para la membrana para crear un potencial electroquímico. Este potencial es la
fuerza motriz para la síntesis de ATP.
La fotosíntesis abarca 2 procesos:
1. Las reacciones luminosas: solo tienen lugar en la luz donde absorbe energía
luminosa por la clorofila y otros pigmentos de las células fotosintéticas
conservándola en forma química mediante ATP, NADPH eliminando O 2 a la
atmosfera.
2. Reacción de fijación de Carbono: llamada reacción oscura que tiene lugar tanto
en la luz como en la oscuridad. Se utiliza para fijar el carbono, ATP, NADPH
para reducir el CO2 formando glucosa y otros productos orgánicos.
En las células eucariotas fotosintéticas se lleva a cabo la fijación de carbono en el

cloroplasto.
Dentro de estas células en el cloroplasto se encuentran los tilacoides que son muy
importantes ya que dentro de ellos se incrustan los pigmentos fotosintéticos para
las reacciones lumínicas.
El estroma contiene la mayoría de las enzimas requeridas para las reacciones de
fijación de carbono, en las que se reduce el CO 2 a triosas fosfato a partir de ellas
se forma glucosa.
La fotosíntesis se lleva a cabo mediante la absorción de la luz en las plantas ya
87
que la luz excita las moléculas. La energía de la región infrarrojo y microondas es
muy pequeña para ser usada en el proceso de fotosíntesis.
La luz UV y los Rayos X tienen mucha energía y pueden dañar a las proteínas.
Todos los organismos fotosintéticos llevan a cabo los procesos de fotosíntesis a
través de la absorción de luz del espectro visible.
El proceso de transducción se lleva a cabo a través de fotosistemas denominados
I, II, el I tiene un centro de reacción denominado P700 y el II P680. Todas las
células fotosintéticas que desprenden O 2, las plantas superiores, algas y
cianobacterias tienen fotosistemas I y II y las que no desprenden O 2 solo el
fotosistema I.
El flujo de electrones puede ser cíclico o no cíclico. El flujo cíclico va del H 2O al
NADP e interviene el fotosistema I y II y el no cíclico solo el I.
Al igual que en la Fosforilación oxidativa la Fotofosforilación también cuenta con el
sistema ATP Sintasa que lleva a cabo la síntesis de ATP y tienen dos
componentes funcionales CF0 y CF1 donde la C representa al cloroplasto.
CF0 es un protón poroso compuesto por proteínas integrales.
CF1 es una proteína periferia de membrana.
88
Material requerido
89
Material y equipo:
 Matraces Erlenmeyer de 250 ml
 3 Trozos de tubo de vidrio doblado en un ángulo de 90° (en forma de L)
 3 Tapones para matraz del No. 6 con una perforación del tamaño del tubo
de vidrio
 1 Pipeta Pasteur
 1 Regla milimétrica de plástico
 1 Pinzas de disección
 1 Probeta de 50 ml
 1 Gasa
 1 Paquete de algodón chico
 Cera de Campeche
 1 Hoja blanca
 Diurex
 Hilo
SSustancias:
 Solución de rojo congo al 1%
 100 ml de NaOH 0.25 N
Reactivos:
 Rojo congo
 NaOH
 Lombrices de tierra
 Semillas de frijol
Desarrollo
90
A) Para medir el consumo de oxígeno en la respiración de las semillas de
fríjol:
1. Cinco días antes de la actividad experimental coloca 50 semillas de fríjol a

remojar durante toda una noche, desecha el agua y colócalas sobre una toalla
de papel húmedo. Mantenlas en un lugar fresco y con luz.
2. Pesa dos porciones de 30 gramos de semillas de fríjol germinadas. Coloca una
de estas porciones en un vaso de precipitados de 400 ml. y ponla a hervir
durante 5 minutos en una parrilla con agitador magnético. Después de este
tiempo retira las semillas del agua y déjalas que se enfríen.
3. Toma los tapones de hule perforados y con cuidado introduce en estas
perforaciones los tubos de vidrio en forma de L. Utiliza jabón o aceite para que
sea más fácil el desplazamiento de los tubos, sosteniendo el tubo lo más cerca
al tapón.
4. Toma dos matraces Erlenmeyer de 250 ml y coloca en el fondo de cada uno,
una base de algodón que tendrás que humedecer con 20 ml de NaOH 0.25 N.
Después coloca sobre esta capa humedecida otra capa algodón de
aproximadamente 3 cm de espesor y agrega en cada matraz las porciones de
semillas que pesaste anteriormente. Tapa rápidamente los matraces con los
tapones de hule que tienen insertados los tubos de vidrio, para evitar que haya
fugas coloca alrededor del tapón cera de Campeche. Al matraz que contenga
la porción de semillas hervidas rotúlalo con la leyenda “control”.
NOTA: Evita que las semillas tengan contacto.
91
5. Con la solución de NaOH, esta sustancia absorberá el CO 2 que produzcan las
semillas durante la respiración. Los cambios de presión que se den en el
interior del matraz serán ocasionados por el oxígeno que se está consumiendo.
6. En un pedazo de hoja blanca marca una longitud de 15 cm, centímetro a
centímetro. Recórtala y pégala sobre la parte libre del tubo de vidrio (deberás
hacer esto para los dos matraces). Observa en el esquema como debe quedar
montado el respirómetro.
7. Con la pipeta Pasteur coloca con cuidado una gota de rojo congo en el extremo
de la parte libre del tubo de vidrio en forma de L. Espera dos minutos y observa
el desplazamiento de la gota del colorante a través del tubo de vidrio, con la
graduación que pegaste en él podrás medir este desplazamiento.
8. Durante los siguientes 20 minutos registra la distancia del desplazamiento del
colorante en intervalos de 2 minutos. Si el movimiento del colorante es muy
rápido deberás iniciar nuevamente las lecturas en intervalos de tiempo más
cortos.
9. Utiliza una tabla como la siguiente para registrar tus datos:
B) Para medir el consumo de oxígeno en la respiración de las lombrices.
1. Coloca las lombrices dentro de un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

2. Humedece un pedazo de algodón con NaOH 0.25 N, envuélvelo en una gasa
ajustándolo ligeramente con hilo dejando un pedazo de aproximadamente 10
cm.
3. Prepara el tapón para matraz con el tubo de vidrio en forma de L como se
explicó anteriormente. Mete el algodón con NaOH y suspéndelo del pedazo de
hilo, evita que el algodón tenga contacto con las lombrices. Sujeta el algodón
con el hilo y coloca rápidamente el tapón. Sella con cera de Campeche para
evitar posibles fugas (observa el esquema).
92
4. En un pedazo de hoja blanca marca una longitud de 15 cm, centímetro a
centímetro. Recórtala y pégala sobre la parte libre del tubo de vidrio. En el
extremo de esta parte coloca con la pipeta Pasteur 1 o 2 gotas de rojo congo,
espera dos minutos y registra el avance del colorante a través del tubo de
vidrio en intervalos de 5 min durante 1 hora. Anota tus datos en la siguiente
tabla:
Tiempo Lombrices Germen s/h Germen c/h
Resultados
Con los datos obtenidos elabora una gráfica del consumo de oxígeno tanto
de las semillas de fríjol control como experimental en las lombrices. Anota
en el eje de la “Y” el tiempo en minutos y en el de la “X” el desplazamiento
de la gota de colorante en cm.
Discute con tu equipo las siguientes preguntas y anota para cada una la
conclusión a la que llegaron.
1. ¿Para qué se pusieron a germinar las semillas antes de la práctica?
2. ¿Por qué crees que deban estar muertas las semillas que colocaste en el
respirómetro control?
3. ¿Hacia dónde se mueve la gota del colorante? ¿Por qué crees que lo haga en
ese sentido?
4. ¿Bajo qué circunstancias podrá moverse en sentido contrario?
5. ¿Por qué crees que transcurra más tiempo en desplazarse la gota de colorante
en el respirómetro que contiene las lombrices?
6. ¿Las plantas y los animales consumen el mismo gas durante la respiración?
7. ¿La respiración de plantas y animales es semejante?
Cuestionario Previo
93
1. ¿Las plantas respiran?
2. ¿La respiración en las plantas es similar a la que realizan los animales?
3. ¿Qué partes de las plantas respiran?
4. ¿Explique el proceso de respiración de las plantas y ciclo en el cual se
interconecta con el del ácido cítrico?
5. ¿Explique el proceso de fijación de CO2?
Bibliografía
1. http://www.enciclopediaespana.com/Respir%C3%B3metro.html
2. http://www.genomasur.com/lecturas/Guia09.htm
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
94
1. García Carlos, Gil Fernando, Hernández Teresa, Trase Carmen, “TECNICAS
DE ANALISIS DE PARAMETROS BIOQUIMICOS EN SUELOS, MEDIDA DE
ACTIVIDAD ENZIMATICA Y BIOMASA MICROBIANA”, Edición 2003,
Editorial Mundi Prensa, México DF
2. González., S. Elvira, Bucio., O. Leticia, et al, “MANUAL DE BIOQUIMICA”,

División de Ciencias Biológicas de la Salud, Universidad Autónoma
Metropolitana, Plantel Iztapalapa, Primera edición 2007, México D.F
3. Munchausen L.L. y Corken W.H. 1991. “THE COLOR OF SAFETY JOURNAL

OF CHEMICAL EDUCATION”. 68:101A.
4. Vega, A. y Konisberg. F. 2001. “LA TEORÍA Y LA PRÁCTICA EN EL

LABORATORIO DE QUÍMICA GENERAL PARA CIENCIAS BIOLÓGICAS Y
DE LA SALUD”. UAM Iztapalapa, México
95

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FORMA GEOMÉTRICA DE SEÑALES DE SEGURIDAD

1. En caso de manejar sustancias volátiles, recuerde que estas deben

2. Procure usar lentes de seguridad para realizar toda operación en el manejo de

3. Debe familiarizarse con la distribución del laboratorio, esto implica conocer

4. Para desarrollar cualquier trabajo experimental en el laboratorio use su bata, la

5. No consuma alimentos cuando este trabajando en el laboratorio, ya que podría

6. No fume dentro del laboratorio, pues en él se emplean sustancias inflamables.

9. No maquillarse en el laboratorio podría infectarse con alguna sustancia que se

10. La mayoría de los compuestos y soluciones líquidas de naturaleza ácida,

11. Las sustancias solidas deben pesarse y manejarse en recipientes adecuados:

13. Es necesario que el profesor de laboratorio aplique las medidas de seguridad y

3. Manejo de residuos peligrosos.

Además de conocer el manejo de sustancias químicas mientras se utilizan en el

Los disolventes orgánicos deben colocarse en contenedores de vidrio o metal,

4. Reglamento para el laboratorio de bioquímica.

1. Para poder realizar las prácticas de laboratorio es necesario estar inscrito en el

2. Se toma en cuenta la puntualidad. Se dará una tolerancia de quince minutos.

3. El alumno debe traer su credencial actualizada.

4. No se permitirá la estancia en el laboratorio al alumno que no traiga bata.

5. Se prohíbe la permanencia de personas ajenas al laboratorio durante la

6. Cada equipo debe tener una bitácora para cálculos y resultados.

7. Es obligación del alumno saber que material va a necesitar para la práctica,

8. Al momento de recibir el material este debe revisarse en presencia de la

10. Al finalizar la sesión, el material se debe entregarse limpio y seco.

12. Queda estrictamente prohibido comer o fumar en el laboratorio.

1. Una franela o toalla para secar el material.

2. Un escobillón para tubos y una fibra para lavar el material.

3. Detergente líquido bajo en fosfatos.

4. Un rollo de cinta Maskin tape

5. Un marcador indeleble para vidrio

7. Una espátula pequeña de metal

8. Un rollo de papel higiénico

Laboratorio de: Horas:

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