EVALUACION DEL ESTABLECIMIENTO in vitro DE UVA (Vitis vinífera) EN EL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL DE LA UFPS, SEDE CAMPOS

ELISEOS.

Margarita del Carmen Rosas Rivera 1610344 1

E-mail: margaritadelcarmenrr@ufps.edu.co

Ingeniería Biotecnológica

Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente

Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta – Norte de Santander

RESUMEN

El presente informe tiene como objetivo determinar el protocolo de desinfección y los

medios de cultivo más adecuados para el establecimiento de los explantes de uva (Vitis
vinífera); al igual, se diseñaran y aplicaran formatos de seguimiento al cultivo “in vitro”.
Es importante realizar de manera adecuada los protocolos para lograr obtener resultados
positivos en la micropropagación de la especie. Para realizar la siembra “in vitro” se deben
tener en cuenta características muy importantes como la asepsia del cuarto de siembra,
utensilios, equipos y el protocolo de desinfección que se debe realizar a los explantes
iniciales.
Palabras clave: Micropropagación, “in vitro”, “ex vitro”, explante, uva.
1. INTRODUCION
La Micropropagación es una biotecnología
que se aplica a especies vegetales con el fin de
obtener una población de plantas ‘élite’
seleccionadas por sus características de
desempeño agronómico, libres de virus y en el
menor tiempo posible. Se le conoce como una
biotecnología de «respuesta rápida», puesto que
se logran resultados que van de períodos de 3 a
6 meses hasta 18 meses (dependiendo de la
especie).Se puede decir que es además versátil
puesto que se adapta a los requerimientos de
cada especie en estudio, al aprovechar al
máximo la potencia celular, para canalizarla
hacia la propagación masiva, erradicación de
patógenos, propagación de material madre, y
producción de líneas parentales, entre otros.
(HortiCultivos, 2016)
El término “cultivo in vitro de tejidos”
significa cultivar algunas partes de las plantas
también llamados “explantes”, como segmentos
de hoja, tallo y raíces, además de otros tejidos u
órganos vegetales, dentro de un frasco de vidrio
en un ambiente artificial, en los que deben de
controlarse la asepsia, el crecimiento y el
desarrollo de estos diferentes tejidos. No deben
2
de crecer microorganismos como bacterias y
hongos, y los tejidos o plantas deben de mostrar
un óptimo desarrollo. (Garciglia, 2014)
Para lograr un cultivo in vitro de plantas,
los tejidos y órganos (incluyendo semillas)
deben ser esterilizados de manera superficial
(asepsia) y se cultivan en soluciones nutritivas
especiales, con frecuencia en medios
solidificados con agar. A estos medios de
cultivo se le incorporan combinaciones
adecuadas de auxinas y citocininas, dos de las
principales fitohormonas del crecimiento
vegetal. Con la aplicación de éstas y el cultivo
controlado como el pH, la luz y la temperatura,
es posible reproducir todos los factores que
puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de
los tejidos o de las plantas in vitro. (Garciglia,
2014)
La uva, cultivada desde el inicio mismo
de la historia, es especialmente nutritiva.
Económicamente tiene una extraordinaria
importancia. Se le ha cultivado por su valor
nutritivo, por sus propiedades curativas y sobre
todo, para la elaboración de vinos. Puede
consumirse en fresco en forma de jugosos
racimos, pero hay una potente industria que ha
crecido alrededor de este fruto. (Frías, 2012)
 Las parras pertenecen a la familia de las acumulación de calor diario para que sus
ampelidáceas. Las uvas tienen forma esférica, racimos maduren correctamente. (Frías, 2012)
son carnosas, jugosas, y se agrupan en racimos. 
Las vides pueden ser propagadas por semillas,
Se reproducen por estacas o injertos. En la
estacas, acodos o por injerto de púa o de yema.
escala comercial, lo más usado son las estacas,
Las semillas se usan principalmente para la
que son fragmentos de tallos que se separan
producción de nuevas variedades. En la escala
para obtener nuevas plantas. Se siembran a una
comercial, las más usadas son las estacas. En el
distancia de dos a tres metros. Más adelante se
caso de aquellos cultivares de difícil
podan todos los brotes excepto el más vigoroso,
enraizamiento se usan acodos. (vitis
que se recorta de modo que sólo queden dos o
vinifera,2019)
tres yemas. La planta que se obtiene forma un
El injerto de púa o de yema sobre
tallo principal fuerte, semejante a un tronco
patrones, se usa ocasionalmente para aumentar
pequeño. Cuando crece, la vid se amarra a un
la vida de las cepas, el vigor de las plantas y los
tutor o guía de dos metros de alto. Cuando
rendimientos. Donde hay organismos del suelo
aparece la fruta, se poda con cuidado para
perjudiciales como la filoxera de la vid,
reducir el número de yemas, para que los brotes
nemátodos de la agalla de la raíz y se deben
restantes formen uvas de mejor calidad. (Frías,
cultivar variedades susceptibles como Vitis
2012)
vinífera, es necesario realizar injertos de púa o
Estas plantas son muy resistentes a las de yema con las variedades deseadas sobre un
heladas invernales, pero esta resistencia se patrón resistente. (vitis vinifera, 2019)
reduce luego de la brotación, cuando aparecen
las primeras hojitas. Por eso, algunos viñedos
están equipados con dispositivos de lucha
contra las heladas, que son eficientes pero
caros. Durante el periodo vegetativo, cuando la
planta baja su actividad, la vid necesita una
2. MATERIALES Y METODOS

3
 Experimento #1 Prueba de desinfección. Ms 100% 4,43 g/l

Myo- Inositol 100 mg/l

Sacarosa 30 g/l

Ácido ascórbico 50 mg/l

6- Benzylaminopurine 1,15 mg/l

(6BAP)

Agar 8,5

Ph 6,2

Tabla 1. Composición del medio de

Evaluaciones cada 7 días por 30 días. Variables
establecimiento de uva
a evaluar: contaminación endógena, exógena,
fenolización, formación de brotes, longitud de Pasado 40 días de la siembra de uva

los brotes. (vitis vinífera) variedad Isabella se realizó un

pase al material vegetal en los medios de los
El material vegetal para el
tratamientos influencia de las hormonas.
establecimiento de uva (Vitis vinifera) variedad
Uva Isabella se recolecto del patio de la casa de
un familiar en la ciudad de Cúcuta. El material
vegetal se encontraba en buen estado
fitosanitario. Los explantes utilizados en esta
investigación fueron yemas axilares.

En esta fase se evaluaron las siguientes

variables a los 20 días:

Medio de  Contaminación endógena y

cultivo contaminación exógena: se realizó la

Componente observación de presencia de colonias

4
 bacterianas o fúngicas en el medio de Fase preparativa
cultivo y/o explante.
En esta fase, se realizó la recolección
 Número de brotes
del material vegetal. El material vegetal
 Longitud de brotes: mediante la
empleado fueron yemas axilares de uva,
medición con regla en unidades de mm
variedad Uva Isabella recolectados en el patio
 Formación de callo
de la casa de un familiar de la ciudad de
 Formación de raíz Cúcuta. Una vez recolectado el material se
 Formación de brotes: es la capacidad trasladó al laboratorio de biotecnología vegetal.
del explante de romper la fase de
Fase de establecimiento. Consistió en dos
latencia y producir nuevos brotes.
etapas: desinfección del explante y
 Fenolización: la fenolización del
establecimiento in vitro.
explante, se evaluó mediante
observación y se clasificó con valores Desinfección del explante
de grado 1 a grado 4.
En el área no estéril del laboratorio, se
 Grado 1: fenolización ligera en
escogieron los segmentos nodales separando
el explante
cada segmento con la yema axilar.
 Grado 2: fenolización media en
el explante
 Grado 3: fenolización avanzada
en el explante
 Grado 4: se presenta muerte
por fenolización en el explante.
A continuación, en el área estéril, se
 Muerte: la muerte del explante, se
desarrolló el protocolo de desinfección basado
evaluó mediante observación ya que el
en la adición de tres soluciones: A) solución
explante se encuentra totalmente
jabonosa, B) alcohol al 70% e C) hipoclorito de
necrosado.
sodio al 3%, cada una por separado, durante
Experimento #2 Influencia de las hormonas. determinado tiempo de exposición como lo

5
muestra la tabla 1. Una vez cumplido el tiempo
de exposición a cada desinfectante, se efectúan
tres enjuagues con agua destilada estéril con
antioxidante para eliminar residuos, y después
se procedió a la extracción y siembra de yemas
axilares.
Tabla 2. Protocolo de desinfección
Una vez adecuada el área de siembra, con las
pinzas estériles se tomó el explante cortando la
yema axilar y después se sembró en el medio de
cultivo.
Se empleó un medio basal MS al 100%
suplementado con reguladores de crecimiento
tal y como se muestran en la siguiente tabla 3.

Componente Tiempo (mn) Componente Medio de

Solución jabonosa 5 cultivo

Ms 100% 4,43 g/l

(detergente
Myo- Inositol 100 mg/l
comercial + agua)
Sacarosa 30 g/l
Alcohol al 70% 3
Ácido ascórbico 50 mg/l
Hipoclorito de 20
sodio al 3% + Agar 8,5
tween 80 (2 gotas) Ph 6,2
*En cabina de flujo laminar Tabla 3.

Siembra de explantes: la siembra se Añadir hormonas

efectuó en cabina de flujo laminar previamente
6BAP 0 5µm 15
esterilizada con luz ultravioleta por 30 mn,
µm
flujo laminar por 30 mn y limpieza de cabina
ANA 0 2 µm 4 µm
con alcohol al 70%, igualmente se ubicó en la
cámara de flujo laminar todos los instrumentos
y herramientas a utilizar (bisturí, pinza,
Tratamientos Hormona Hormona
servilletas y papel Kraft esterilizados
6BAP ANA
previamente).
1 (6 tubos) 0 0

6
 En la fotografía anterior se observa la siembra

2 (6 tubos) 5 0 del establecimiento de esta especie vegetal.

3 (6 tubos) 15 0 En esta fase se evaluarán las siguientes

4 (6 tubos) 5 2 variables a los 20 días:

5 (6 tubos) 5 4  Contaminación endógena y

6 (6 tubos) 15 2 contaminación exógena: se realizó la
7 (6 tubos) 15 4 observación de presencia de colonias

8 (6 tubos) 0 2 bacterianas o fúngicas en el medio de

cultivo y/o explante.
9 (6 tubos) 0 4
 Numero de brotes
 Longitud de brotes: mediante la
Finalizado el proceso de siembra, se medición con regla en unidades de mm
sellan los tubos con polietileno para envolver  Formación de callo
(Envoplast), se rotularon y se llevaron al cuarto  Formación de raíz
de crecimiento, a una temperatura de 20° C ±  Formación de brotes: es la capacidad
2° C y fotoperiodo de 16 horas luz/ 8 oscuridad. del explante de romper la fase de
Transcurridos 20 días de siembra se inicia la latencia y producir nuevos brotes.
evaluación semanal de los explantes.  Fenolización: la fenolización del
explante, se evaluó mediante
observación y se clasificó con valores
de grado 1 a grado 4.
 Grado 1: fenolización ligera en
el explante
 Grado 2: fenolización media en
el explante
 Grado 3: fenolización avanzada
en el explante

7
  Grado 4: se presenta muerte
por fenolización en el explante.
 Muerte: la muerte del explante, se
evaluó mediante observación ya que el
explante se encuentra totalmente
necrosado.
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Establecimiento “in vitro” de Uva ( Vitis
vinifera) variedad Isabella. Experimento #1
Prueba de desinfección
En la fase inicial del establecimiento se
observó un 10% de contaminación endógena,
en el protocolo de desinfección de 5 minutos lo
cual nos demuestra que no fue tan eficaz a
comparación del protocolo de desinfección de
15 y 20 minutos que alcanzó el 100%. En la
fenolización predominan los grados 0 - 1. Cero
indicando que no hay fenolización y 1
fenolización ligera.
8
En el establecimiento “in vitro” de uva no
se presentó muerte de los explantes a causa de
la fenolización u oxidación. Generalmente se
considera que los tejidos de las plantas intactas
y sanas son asépticos internamente y que la
principal tarea de limpieza de material para
explantes está limitada a la esterilización
superficial (Roca & Mroginski, 1993), lo cual
permite deducir que el protocolo empleado fue
efectivo.
A los 20 días de siembra se logró evaluar
el porcentaje de brotación de los explantes en
cada tratamiento observándose que el
tratamiento T2, y T3 alcanzan el 100% y el
promedio de longitud de los brotes en el
tratamiento T3 muestra un mayor crecimiento a
comparación del T1 y T2 que se observa menor
el crecimiento y más lento.
Después de 40 días de la siembra en el medio
Ms al 100% y la adición de citoquininas (6-
bencilaminopurina promovió un buen
desarrollo del explante, se realizó el pase del
material vegetal a los medios realizados en el
experimento #2 influencia de las hormonas. A
los 20 días del pase de la siembra se realizó la
lectura.
A los 20 días se realizó la lectura donde se
observó un grado de fenolización 1-2,
predominando más el grado 2 observándose
una fenolización media del explante, el
crecimiento de los explantes siempre se vio
avanzado en el tratamiento 3 (T3 20 MIN)
mostrándose a los 60 días de siembra la
aparición de las hojas, no se presentó
contaminación exógena y muestra que el
promedio de longitud de la planta fue mayor en
el tratamiento de los 20min del protocolo de
desinfección.
9
El éxito de los sistemas de propagación
de plantas por biotecnología depende en gran
medida del control y la prevención de la
contaminación microbiana. Existen varias
estrategias para controlar y manejar la
contaminación, que incluyen la prevención
mediante la selección y el tratamiento de la
planta madre, la desinfección superficial del
explante y la identificación de los
microorganismos contaminantes, el control de
la contaminación a través del uso de sustancias
antimicrobianas y el cultivo de meristemos.
(Niedz & Bausher, 2002). El estado fisiológico
de la planta madre influye en su capacidad
morfogénica, ya que la totipontencialidad
disminuye con la edad, por lo tanto, mientras el
tejido sea más joven y menos diferenciado
(meristemos, explantes jóvenes no leñosos en
estado vegetativo y de mayor tamaño), será
mejorada la respuesta in vitro, también se debe
tomar en cuenta otros factores como que el
material experimental sea sano, puesto que esto
repercute sobre el porcentaje de infección
después del aislamiento. (Coba, 2009)
Establecimiento “in vitro” de Uva
(Vitis vinifera) variedad Isabella.
Experimento #2 Influencia de las hormonas
 encuentra dentro del rango permitido. El
porcentaje de brotación de los explantes en los
tratamientos T3, T5, T7 supera el 50 por ciento
demostrándose que la adición de las hormonas
reguladoras de crecimiento (6BAP y ANA) al
medio MS al 100% ayuda al desarrollo del
Tratamientos Hormona Hormona explante.
6BAP ANA
En cuanto a la brotación de los explantes
1 (6 tubos) 0 0
podemos ver claramente la influencia de las
2 (6 tubos) 5 0 hormonas vegetales en el proceso de brotación.
3 (6 tubos) 15 0 Se observa que los tratamientos que no

4 (6 tubos) 5 2 incorporan la citoquinina 6 BAP tienen los

resultados más bajos (T1, T8 y T9) con valores
5 (6 tubos) 5 4
entre 0 y 16,6 %, mientras que aquellos que la
6 (6 tubos) 15 2
incorporan, ya sea sola o combinada con la
7 (6 tubos) 15 4
auxina ANA, arrojan los mejores resultados con
8 (6 tubos) 0 2 valores de 50 a 66,6 %.
9 (6 tubos) 0 4
Cavazos et al, 2018, encontraron que la
Influencia de las hormonas. aplicación del medio de cultivo MS adicionado

Se realizó su respectiva lectura a los 20 con el regulador de crecimiento BAP, en

días de siembra, como se puede observar su diferentes concentraciones, permitía obtener

grado de fenolizacion está en el rango de 2-3 de mejores resultados en la etapa de inducción de

los explantes donde se presenta más el grado 3 brotes y multiplicación para conservar in

siendo una fenolizacion avanzada del explante. vitro los cultivares de vid Cabernet Sauvignon

La contaminación exógena en el tratamiento T4 y Merlot. (Cavazos-Galindo, 2018)

y T8 fue de un porcentaje del 33,3; y el T6 se

presentó el 16,6 % de contaminación la cual se

10
 (6BAP) 6-Benzylaminopurine es un
regulador de crecimiento de plantas de amplio
espectro. Puede acelerar el crecimiento de la
célula. Cuando se usa con giberelinas, la forma
de la fruta puede mejorarse. La 6-
bencilaminopurina estimula los siguientes
efectos: división celular; Brote lateral de
emergencia (manzanas, naranjas); Formación
de brotes basales (rosas, orquídeas); floración
(ciclamen, cactus); Conjunto de frutas (uvas,
naranjas, melones). (Delong química CO.,
2009)
El efecto de la composición mineral del
medio de cultivo en el cultivo in vitro de la vid
ha sido informado por diferentes autores [14],
[16]. (Pedro, 2016)
[14], Según Fotini G. Skiada1, en el
estudio de Micropropagación de Vitis vinifera
L.cv. "Malagouzia" y "Xinomavro" realizaron
los experimentos sobre el efecto de BA, el
número de nuevos brotes, así como la tasa de
proliferación de ambos cultivares aumentaron
en paralelo con el regulador del crecimiento,
mientras que la longitud de las plántulas, raíces
y los entrenudos disminuyen en relación con los
medios del control.
11
Las combinaciones de BA y NAA
revelaron que en "Malagouzia" dos medios
parecían ser más apropiados, los de 0.5 μM BA
combinados con 0.1 o 0.3 μM NAA. De estos,
el segundo fue considerado para ser más
adecuado porque la primera combinación causó
grandes callos para desarrollar en el tallo basal.
Apareció hiperhidricidad en plántulas
cultivadas en otras combinaciones,
especialmente cuando la alta concentración de
la citoquinina se utilizó para ‘Xinomavro’, la
suplementación de medios con 0.1 μM BA y
0.03 μM NAA parecía favorecer la
proliferación produciendo Plantones vigorosos
con hojas verdes en forma completa sin Callo.
(Skiada1, 2010)
[16], En la investigación realizada por
Dev Rahul; que tuvo como título
Multiplicación comparativa in vitro de algunos
genotipos de uva (Vitis vinifera) la aplicación
de un medio MS que contiene reguladores de
crecimiento BAP (2 mg / l) + NAA (0.2 mg / l)
e IBA (2 mg / l) + AC (200 mg / l) mejor
encontrado para el inicio del cultivo y la
multiplicación rápida, respectivamente.
Para mejorar la supervivencia del
explante, dos citoquininas (BAP y Kinetina) y
auxina (NAA) se probaron en diferentes crecimiento de las yemas axilares sin mucho
Combinaciones en genotipos de uva. El papel efecto de mortalidad. (DEV, 2015)
beneficioso de BAP en la iniciación del cultivo
fue Más notable cuando se usó junto con un
bajo nivel de NAA. Entre el regulador del
crecimiento en los tratamientos, 2.0 mg / l BAP
+ 0.2 mg / l NAA dieron los primeros
Brotación de brotes (11.6 días). Anteriormente
Mhatre et al. (2000) informó que NAA 0.09 mg
/ l era esencial en el cultivo medio de iniciación
para tres cultivares de V. vinifera. Ibáñez y En la fotografía anterior nos muestra que los
Alabama. (2005) constataron que la presencia tratamientos T3, T5, T7 hay un crecimiento
de BA en el medio de cultivo fue un factor avanzado del explante; en la siguiente tabla
decisivo en el crecimiento de las yemas muestra que cantidad de hormonas contiene
axilares, alargamiento. En medios que cada tratamiento.
contienen 1 o 2 mg / l de BA, la media Número
4. CONCLUSIONES
de brotes y brotes axilares desarrollados por
El protocolo de desinfección de 20
explantes.
minutos fue el escogido por la eficiencia en
Fueron significativamente mayores que cuanto a la desinfección y por el óptimo
en su ausencia. Benciladenina (BA) se ha desarrollo de los explantes para pasar a la
informado de que es eficaz para mejorar la siguiente etapa en el establecimiento de uva
axilar la proliferación de yemas en varias (Vitis vinífera).
especies de Euvitis (Harris y Stevenson 1982,
La hormona 6BAP es fundamental en la
Gray y Fisher 1985, Heloir et al. 1997, Dzazio
adición del medio MS al 100%, para obtener
et al. 2002, Ayman et al. 2011). Heloir et al.
altos porcentajes de brotación de las yemas del
(1997) y Mhatre et al. (2000) encontraron que
cultivo de uva (Vitis vinífera).
mayores concentraciones de BA estimuló el

12
 La hormona ANA (ácido naftaleno
acético) a 4 micro molar debe ser combinada
con una citoquinina 6BAP en el medio MS al
100%, de lo contrario esta auxina no funciona.
Se logró el establecimiento in vitro de
Vitis vinifera, sin presencia de contaminación,
con una duración de 35 días utilizando el medio
Ms 100% y la adición de citoquinina (6BAP)
promovió un buen desarrollo del explante.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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PROPAGACIÓN CLONAL DE DOS
CULTIVARES ADULTOS DE VID
(Vitis vinifera) PARA
CONSERVACION in
Polibotánica, Núm. 45:
Obtenido
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Delong química CO., L. (2009). D PLANT
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DEV, R. (11 de julio de 2015). Comparative in
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vinifera) genotypes. Indian Agricultural
Research Institute. Obtenido de
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_K_Verma2/publication/284392572_Co
mparative_in_vitro_multiplication_of_s
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nks/5652a60608aeafc2aabac1ab.pdf
Frías, J. C. (26 de Noviembre de 2012). Revista
Vinculando. Obtenido de Propagación y
técnicas de cultivo de la Uva fruta (Vitis
vinifera):
2018). http://vinculando.org/mercado/agroindu
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de-la-uva-fruta-vitis-vinifera.html
SU
vitro. Garciglia, R. S. (AGOSTO de 2014).
181-190. Universidad Michoacana de San
de Nicolas de Hidalgo. Obtenido de
file:///C:/Users/PERSONAL/Downloads
/la-propagacion-de-plantas-in-vitro-un-
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HortiCultivos. (30 de Junio de 2016). La
Micropropagación. (Editorial Agro
Cultivos S.C. de R.L. de C.V.)
Recuperado el 2018, de
https://www.horticultivos.com/agricultu
13
 ra-protegida/plantulas/la-
micropropagacion/

vitis vinifera, p. (2019). Sistema Nacional

Argentino de Vigilancia y Monitoreo de
Plagas. Obtenido de Buenos Aires,
Argentina:
https://www.sinavimo.gov.ar/cultivo/vit
is-vinifera

14