División de Ciencias Naturales

y Exactas.

Laboratorio de Genética.

NOMBRE DE LA
PRÀCTICA:

RECOMBINACION MEIOTICA

Equipo 3:

 Juan Ignacio Olmos Valtierra.

 Carlos Javier Hernández Ramos.
 Perla Andrea Corona Ramírez.

Descripción breve de lo que se hizo:

Desarrollo de la 1ra parte.

1. Inicialmente se observaron en el microscopio levaduras de Saccharomyces

cerevisiae, las cuales se encontraban en fases vegetativas o iniciando su reacción
sexual. De esta forma se identificó tanto su ciclo sexual como sus distintas fases
del ciclo celular mitótico.

2. Después se procedió a realizar un cruce control en YPD, para ello se sembró

una pequeña colonia de células de tipo de apareamiento a, en forma de parche
pequeño, no mayor de 1 cm2 (forma cuadrada). Y Sobre este parche de células a,
se procedió a sembrar una pequeña colonia de células α, mezclando muy bien
ambos tipos de células. (a ade X α ura, his, leu). Posteriormente se dejaron
incubando una semana a 28°C.

3. Luego se transfirió una pequeña cantidad de células de cada parche a una caja
de MM, trazando de igual forma un pequeño parche no mayor de 1 cm 2 (forma
cuadrada). Después se incubaron durante una semana.

4. Posterior a la incubación dichas células se transfirieron a un medio de pre-

esporulación y nuevamente se incubaron durante una semana a 28°C.

5. Después se transfirieron a un medio de esporulación, el cual debido a su

composición favorecerá a la formación de ascas y a la meiosis en la levadura. Y
se incubaron durante dos semanas a 28 °C.
6. Después de las dos semanas de incubación se observaron e identificaron al
microscopio las ascas formadas, producto de la meiosis. Y se liberaron las
ascosporas.

Desarrollo de la 2da parte.

1. Se tomó una porción de las células esporulantes provenientes del cruce Y1 X

Y7 utilizando un palillo estéril y se suspendieron en glusulasa diluida, (incubando)
después se le añadió agua estéril y se agito en vortex.

2. Después realizamos diluciones con agua destilada estéril 10 -1, 10-2 y 10-3, y
sembramos 100 μL de las diluciones 10 -2 y 10-3 en medio YPD. Y se incubaron por
una semana. (Rescate de auxótrofas en YPD).

3. Posteriormente de la incubación se rescataron y recolectaron por lo menos 50

colonias de color rosa o blancas, las cuales se sembraron utilizando el palillo
estéril en los medios de cultivo correspondientes (ade-, leu-, his-, ura-). Y se
incubaron durante una semana.

5. Finalmente se realizó una tabla en donde se reportó el crecimiento de cada

colonia en los distintos medios, (esto permitirá ver la segregación de los
marcadores del parental ura-, leu- e his- después del cruce con la cepa ade-), y de
esta forma determinar sus recombinantes al igual que su fenotipo y genotipo.

Resultados:

Genotipos y fenotipos de los parentales y recombinantes encontrados en el análisis de la

segregación y recombinación meiótica de Saccharomyces cerevisiae.

CEPA MM MMC MM-Ade MM-His MM-Leu MM-Ura

PARENTAL
Y1 - + + - - -
Y7 - + - + + +
Tabla 1. Recombinantes obtenidas. Equipo 3

No. MM MMC MM-Ade MM-His MM-Leu MM-Ura

Colonia
1 - + + - + -
2 - + + - + -
3 - + + - + -
4 - + + - + -
 5 - + + - + -
6 - + + + + -
7 - + + + + -
8 - + + + + -
9 - + + + + -
10 - + + + + -
11 - + + + + -
12 - + + + + -
13 - + + + + -

Equipo 3 (nosotros)

Tabla 2. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

ADE(1,2, 4), his1, LEU2, Prototrofia a ADE y LEU
1-5 R1, R2, R3, R4, R5
ura3 Auxotrofia a HIS y URA
Prototrofia a ADE, HIS y
ADE(1,2, 4) , HIS1, LEU2,
6-13 LEU. R6, R7, R8, R9, R10, R11,
ura3
Auxotrofia solo a URA R12, R13
Tabla 3. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu y
MM-Ura).

Equipo 6

Tabla 4. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu y
MM-Ura).

Colonia MM-Leu MM-Ade MM-His MM-Ura MM-C MM

1 + + + + + +
2 -- - - - - -
3 + + + + + +
4 + + - + + +
5 + + + + + +
6 + + + + + +
7 + + + + + +
8 + + + + + +
9 + + + + + +
10 + + - - + -
11 + + + - + +
12 + + + + + +
 13 - + - + + +
14 + + + + + +
15 + + + + + +
16 + + + + + +
17 + + - - + +
18 + + + - + -
19 + + + + + +
20 + + + + + +
21 + + + + + +
22 + + + + + +
Tabla 5. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

1, 3, 5, 6, 7, 8, ADE (1,2, 4) Prototrofia a ADE, HIS,
9, 12, 14, 15, , HIS1, LEU2, URA3 LEU y URA. R1, R3, R5, R6, R7, R8, R9,
16, 19, 20, 21, R12, R14, R15, R16, R19, R20,
22 R21, R22
4 ADE (1,2, 4) Prototrofia a ADE, LEU y
, his1, LEU2, URA3 URA. R4
Auxotrofia solo a HIS
10 y 17 ADE (1,2, 4), his1, LEU2, Prototrofia a ADE y LEU
ura3 Auxotrofia a HIS y URA R10, R18
11 y 18 ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS Y
ura3 LEU. R11, R18
Auxotrofia solo a URA
13 ADE (1,2, 4), his1, leu2, Prototrofia a ADE y URA R13
URA3 Auxotrofia a HIS y LEU

Equipo 1

Tabla 6. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu y
MM-Ura).

N. Cepa MM MMC MM-ADE MM-LEU MM-HIS MM-URA

1 - + + - - +
3 + + + + + +

6 - + + + + -
7 - + + - - +

8 - + + + + +
9 - + + + - -

11 - + + + + -
 12 - + + + + -
13 + + + + + +
16 - + + + + +
17 - + + + + +
18 - + + - - -
19 - + + + + -
22 - + + - + +
23 - + + - - -
Tabla 7. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

1y7 ADE (1,2, 4), his1, leu2, Prototrofia a ADE y URA
URA3 Auxotrofia HIS y LEU R1, R7
3 y 13 ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS, R3, R13
URA3 LEU y URA
6, 11, 12 y 19 ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS, y
ura3 LEU. R6, R11, R12, R19
Auxotrofia solo a URA
8 y 16 ADE (1,2, 4), HIS1, Prototrofia a ADE, URA R8, R16
LEU2, URA3 Y LEU.
Auxotrofia solo a HIS
9 ADE (1,2, 4), his1, LEU2, Prototrofia a ADE y LEU R9
ura3 Auxotrofia a HIS y URA
18 y 23 ADE (1,2, 4), leu2, his1, Prototrofia solo a ADE PARENTAL a Y1
ura3 Auxotrofia a HIS, LEU y
URA.
22 ADE (1,2, 4), HIS1, Prototrofia a ADE, HIS y R22
URA3, leu2 URA.
Auxotrofia solo a LEU

Equipo 2

Tabla 8. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu y
MM-Ura).

No. cepa MM MMC MM-ADE MM-HIS MM-LEU MM-URA

1 + + + + + +
2 + + + + + +
3 + + + + - +
4 + + + - - +
5 + + + + + +
 6 + + + + + +
7 + + + + + +
8 + + + + - +
9 - + + - + +
10 - + + - - +
11 - + + - - +
12 + + + + + +
13 + + + + + +
14 - + + + + -
15 + + + + + +
16 + + + + + +
17 - + + + + +
18 + + + + + +
Tabla 9. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

8y3 ADE (1,2, 4), HIS1, Prototrofia a ADE, HIS y R8, R3
URA3, leu2 URA.
Auxotrofia solo a LEU
9 ADE (1,2, 4), LEU2, Prototrofia a ADE, URA R9,
URA3, his1 Y LEU.
Auxotrofia solo a HIS
4, 10 Y 11 ADE (1,2, 4), URA3, his1, Prototrofia a ADE y URA R4, R10 y R11
leu2 Auxotrofia a HIS y LEU
1, 2, 5, 6, 7, ADE (1,2, 4), LEU2, HIS1, Prototrofia a ADE, LEU, R1, R2, R5, R6, R7, R12,
12, 13, 15, 16, URA3 HIS y URA. R13, R15, R16, R17, R18
17 y 18
14 ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS y R14
ura3 LEU.
Auxotrofia solo a ura

Equipo 4

Tabla 10. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu
y MM-Ura).

No. cepa MM MMC MM-ADE MM-HIS MM-LEU MM-URA

1 - + + + - -
2 + + + - + -
3 + + + - + -
4 + + + + + +
5 - + + - + -
6 + + + - - -
7 + + + + + +
8 + + + - + +
9 + + + - + +
10 + + + + + -
11 + + + + + +
 12 + + + + + -
13 + + + + + -
14 - + + - + -
15 + + + + + -
16 + + + + + -
17 - + + + - -
18 + + + + + -
19 + + + + + -
20 + + + + + +
21 - + + - + +
22 - + + - + +
23 + + + + + +
24 + + + - + -
25 + + + + - -
26 + + + + + +
27 - + + + - +
28 - + + + + -
29 - + + + - -
Tabla 11. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

1, 17, 25, 29 ADE (1,2, 4), HIS1, leu2, Prototrofia a HIS y ADE R1, R17, R25, R29
ura3 Auxotrofia a LEU y URA
2, 3, 5, 14 , 24 ADE (1,2, 4) , LEU2, his1, Prototrofia a ADE y LEU R2, R3, R5, R14 , R24
ura3 Auxotrofia a HIS y URA
6 ADE (1,2, 4), leu2, his1, Prototrofia solo a ADE PARENTAL 1 (a Y1)
ura3 Auxotrofia a HIS, URA y
LEU.
8, 9, 21, 22 ADE (1,2, 4), LEU2, Prototrofia a ADE, LEU y R8, R9, R21, R22
URA3, his1 URA.
Auxotrofia solo a HIS
10, 12, 13, 15, ADE (1,2, 4), LEU2, HIS1, Prototrofia a ADE, HIS y R10, R12, R13, R15, R16,
16, 18, 19, 23, ura3 LEU. R18, R19, R23, R26, R28
26, 28 Auxotrofia solo a URA.
11, 20, ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS, R11, R20
URA3 LEU y URA

27 ADE (1,2, 4), HIS1, Prototrofia a ADE, HIS y R27

URA3, leu2 URA.
Auxotrofia solo a LEU.

Equipo 5

Tabla 12. Crecimiento de colonias en los distintos medios (MM, MMC, MM-Ade, MM-His, MM-Leu
y MM-Ura).

No. cepa MM MMC MM-ADE MM-HIS MM-LEU MM-URA

1 - + + + + +
 2 - + + - - +
3 - + + + + +
4 - + + + + -
5 - + + - + -
6 - + + - - -
7 - + - + + +
8 - + - + + +
9 - + + + + +
10 - + + + - +
11 - + + + + -
12 - + + - + -
13 - + + + - +
14 - + + + + -
15 - + + + + -
16 - + + + + -
17 - + + + + +
18 - + + + - -
19 - + + + + +
20 - + + + - +
21 - + + - - +
22 - + + - + -
Tabla 13. Genotipo, Fenotipo y Recombinante/parental de las colonias seleccionadas.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

1, 3, 9, 17, 19 ADE (1,2, 4), HIS1, LEU2, Prototrofia a ADE, HIS, R1, R3, R9, R17, R19
URA3, LEU y URA.
2, 21 ADE (1,2, 4), his1, leu2 Prototrofia a ADE y R2, R21
URA3 URA.
Auxotrofia a HIS y URA
5, 12, 22 ADE (1,2, 4), his1, LEU2, Prototrofia a ADE Y LEU. R5, R12, R22
ura3 Auxotrofia a HIS y URA.
4, 11, 14, 15, ADE (1,2, 4), HIS1, Prototrofia a ADE, HIS y R6, R11, R14, R15, R16
16 LEU2, ura3 LEU.
Auxotrofia solo a URA
10, 13, 20 ADE (1,2, 4), HIS1, leu2, Prototrofia a ADE, HIS y R10, R13, R20
URA3 URA.
Auxotrofia solo a URA
18 ADE (1,2, 4), HIS1, leu2, Prototrofia a ADE y HIS R18
ura3 Auxotrofia a LEU y URA
6 ADE (1,2, 4), his1, leu2, Prototrofia solo a ADE PARENTAL 1 (a Y1)
ura3 Auxotrofia a HIS, LEU y
URA
Colonias color blanco.
7, 8 ade, HIS1, LEU2, URA3 Prototrofia a HIS, LEU y PARENTAL 2 (a Y7)
URA.
Auxotrofia solo a ade
Colonias color rojo/rosa
 Resultados de todos los equipos y sus tipos de recombinantes.

Tabla 14. Genotipos, Fenotipos y parentales de la cepa Y1 y Y7.

Cepa Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

Y1 ADE (1,2, 4), his1, leu2 y Prototrofia solo a ADE PARENTAL 1
ura3 Auxotrofia a HIS, LEU y
URA.
Colonias color blanco.
Y7 Ade, HIS1, LEU2 Y URA3 Prototrofia a HIS, LEU y PARENTAL 2
URA.
Auxotrofia solo a ade.
Colonias color rojo/rosa.

Tabla 15. Genotipos, Fenotipos y tipos de Recombinantes y parentales de las colonias de todos los
equipos.

Equipo Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

2, 6, 4, 5 ADE, HIS, URA, leu Prototrofia a ADE, HIS y TIPO RECOMBINANTE 1
URA.
Auxotrofia solo a LEU
2 Ade, his, ura, LEU Prototrofia a solo LEU TIPO RECOMBINANTE 2
Auxotrofia a ADE, LEU y
URA.
2, 1, 3, 4 ADE, LEU, URA, his Prototrofia a ADE, URA TIPO RECOMBINANTE 3
Y LEU.
Auxotrofia solo a HIS
2, 1, 6, 5 ADE, URA, his, leu Prototrofia a ADE y URA TIPO RECOMBINANTE 4
Auxotrofia a HIS y LEU
1, 2, 4 ,5, 6 ADE, LEU, HIS, URA Prototrofia a ADE, LEU, TIPO RECOMBINANTE 5
HIS y URA.
2, 1, 6, 3, 4, 5 ADE, HIS, LEU, ura Prototrofia a ADE, HIS y TIPO RECOMBINANTE 6
LEU.
Auxotrofia solo a ura
1, 6, 3, 4, 5 ADE, LEU, his, ura Prototrofia a ADE y LEU TIPO RECOMBINANTE 7
Auxotrofia a HIS y URA
1, 4, 5 ADE, leu, his, ura Prototrofia solo a ADE PARENTAL a Y1
Auxotrofia a HIS, LEU y
URA.
4 Ade, leu, his, ura Auxotrofia a ADE, HIS, TIPO RECOMBINANTE 8
LEU y URA.
4, 5 ADE, HIS, leu, ura Prototrofia a HIS y ADE TIPO RECOMBINANTE 9
Auxotrofia a LEU y URA
5 Ade1 HIS1 LEU2 URA3 Prototrofia a HIS, LEU y PARENTAL a Y2
URA.
Auxotrofia solo a ade
 Tabla 16. Crecimiento en los diferentes medios.

Cruce Crecimient Crecimiento Crecimiento Formación de ascas Tipo de

o en MM en MPE en ME apareamiento

a ade X α aXα
ura, his, leu

Ilustración 1: Medio de cultivo y las 13 colonias seleccionadas.

13 colonias seleccionadas que resultaron en solo 2 tipos de recombinantes.

Ilustración 2: Parentales Y7 y Y1 respectivamente en medio YPD

Se muestran los Parentales Y7 (roja) y Y1 (blanca) respectivamente.

Composición de los medios:

Medio Pre-esporulación. (1L)

 Extracto de levadura (8g)

 Peptona biotriptasa (3g)
 Dextrosa (10g)
 Agar bacteriológico (20g)

Medio de esporulación. (1L)

 Acetato de potasio (10g)

 Extracto de levadura (1g)
 Dextrosa (0,5g)
 Agar bacteriológico (20g)

Discusión de resultados.

POSIBLE RECOMBINANCION QUE SE LLEVO A CABO Y QUE DIERON LUGAR

A LAS COLONIAS RECOMBINANTES:

Debido a que los genes ADE (1, 2 y 4) y LEU2 se encuentran en cromosomas

diferentes siendo estos los cromosomas I, XV, XIV y III respectivamente y se llevó
a cabo una recombinación intercromosómica que se produce mediante la
distribución independiente de Mendel donde los genes transmitidos serán al azar,
mas sin embargo los genes HIS1 y URA3 se encuentran en los mismos
cromosomas.
Ilustración 2: Cromosoma V al cual pertenecen HIS1 y URA3.

Se representa brevemente la recombinación homologa por entrecruzamiento entre HIS1 y URA3.

Ahora teniendo en cuenta la distancia que hay entre estos dos genes de
aproximadamente 147922 Pb y observando la figura anterior podemos observar
que estos genes se encuentran relativamente separados cuya distancia podría
considerarse aceptable para llevarse a cabo un entrecruzamiento (recombinación
homologa o intracromosómica).

Dentro de las posibilidades tendríamos los siguientes genotipos: los 2 parentales

ura3 e his1 (recesivos) y URA3 e HIS1 (DOMINANTES O SILVESTRES), además
de estos también se tendrían recombinantes (aunque en menor proporción que los
parentales) siendo 2: URA3 e his1 y ura3 e HIS1. En este caso se tiene un
recombinante particular para estos genes que presentan las colonias 6 a 13
teniendo este genotipo ADE, HIS1, LEU2 y ura3 nótese que poseen un genotipo
recombinante en cuanto a los genes HIS1 y URA3 por lo que la recombinación por
parte de estos genes se pudo llevar a cabo por medio de entrecruzamiento
permitiendo así su segregación independiente , en cambio para las colonias 1 a 5
se tiene el siguiente genotipo ADE, his1, LEU2 y ura3 obteniendo genotipos
parentales para esos genes en particular (si son recombinantes si nos referimos al
genotipo completo con los 4 genes), así pues debido a la distancia aparente, los
sucesos de entrecruzamiento o son menores o bien no se encuentran los valores
muy alejados de un ± del 50% de entrecruzamiento lo que podría explicar porque
en las colonias 6 a 13 se obtuvieron los recombinantes con una tasa casi idéntica
en relación a las colonias 1 a 5 con solo 1 colonia de diferencia donde no se llevo
a cabo la recombinación al no ocurrir el entrecruzamiento durante la meiosis de
esa colonia.

En cuanto a la obtención de solo 2 tipos de colonias recombinantes esto podría

deberse a distintas razones: 1) Los cultivos YPD terminaron presentando
contaminación lo que redujo el espectro o rango de colonias a seleccionar, 2)
aquellas colonias seleccionadas sufrieron posiblemente una complementación al
mezclarse otras 2 colonias, 3) debido a la cercanía de las colonias es posible que
en la parte contaminada se encontraran los otros tipos de recombinantes, 4) cabe
destacar también que las colonias recuperadas o rescatadas fueron todas blancas
indicando que no se obtuvo ninguna carente de los genes ADE.

Otro factor que se debe tomar en cuenta es la cantidad de muestra que se sembró
pudo no ser la suficiente y debido a eso no creció la colonia debidamente o bien
se atravesó el medio de cultivo con el palillo estéril dificultando su crecimiento.

Conclusión.

Al analizar el crecimiento de recombinantes entre Y1 y Y7 en distintos medios a lo

largo de un proceso en el cual se tenían inicialmente los parentales y se logró una
recombinación, se obtuvo como resultado que hubo crecimiento nulo de colonias
rosas, por lo cual, solo se presentaron colonias blancas, además estas no crecían
en todos los medios. De las colonias que se lograron rescatar, se observó que de
las colonias 1 a 5 presentaban prototrofia a ADE y LEU, auxotrofia a HIS y URA;
de las colonias 6 a 13 presentaban prototrofia a ADE, HIS y LEU, auxotrofia solo a
URA.

Con esta información se pudo hacer una comparación con los demás equipos,
obteniendo los recombinantes de cada uno de ellos.

En conclusión se ha logrado llevar a cabo el análisis de la recombinación y

segregación meiótica a partir de las dos cepas parentales Y1 y Y7, conociendo el
fundamento de los fenómenos genéticos ocurridos siendo aquellos de
recombinación genética/ meiótica, homologa, entrecruzamiento, segregación
independiente, complementación y sin falta meiosis, a su vez que se identificaron
la formación de ascas y ascosporas resultado de la meiosis y los procesos o
técnica que fueron necesarias para su obtención, observación y rescate en los
medios de cultivo correspondientes para cada uno de los pasos desde el
“apareamiento” e inducción de meiosis hasta su final rescate en medios YPD para
apreciar las colonias segregantes o recombinantes obtenidas identificando el
fenómeno de recombinación que sufrieron y la razón de ello.

Cuestionario:

1. ¿Qué harías para demostrar si cada una de ellas heredó una

tercera o cuarta mutación ura- leu- y/o his- . Por ejemplo, ¿cómo
saber que las cepas ade- y ura- solo llevan estas dos mutaciones
o también son leu- y/o his-?

R: Se tendría que seguir un procedimiento como en el caso de esta

práctica, simplemente sembrando en medios de cultivo MM-X donde la
“X” se refiere a algún aminoácido que falta o está ausente en ese
medio, asi aquellos que no crezcan en MM-ADE, MM-LEU, MM-HIS y MM-
URA tienen un total de 4 mutaciones que impiden la síntesis de esos
aminoácidos de crecer solo en MM-ADE y MM-LEU solo tendrían dos
mutaciones.

En el caso que sean dos mutaciones o más para un aminoácido en

común pueden probarse otros fenotipos característicos como la
coloración roja que indica ausencia de los genes ADE1 y ADE2 ambos
necesarios para la síntesis de adenina pero que se caracterizan al estar
mutadas por la acumulación de pigmento rojo, o bien incluso puede que
haya un gen que se sobreexpresa debido a que otro gen que es
regulador esta mutado, lo que ocasiona dicha sobre expresión puede
llevar al aumento de cantidad de cierto metabolito en la cepa en
cuestión.

2. ¿Cuál de las combinaciones de la tabla es la más abundante?

¿y que
explicación genética le dan?

R: Las recombinantes 6-13, cuya explicación se puntualiza en el

apartado Discusión de Resultados.

Colonias Genotipo Fenotipo Recombinante/Parental

Prototrofia a ADE, HIS y
ADE(1,2, 4) , HIS1, LEU2,
6-13 LEU. R6, R7, R8, R9, R10, R11,
ura3
Auxotrofia solo a URA R12, R13

Aplicación en el área de QFB:

Construcción de plásmidos de alto rendimiento utilizando recombinación

homóloga en Levadura: sus mecanismos y su aplicación a la producción de
proteínas por rayos X; cristalografía.

Fundamento.
La recombinación homóloga es un sistema para reparar los genomas rotos de
organismos vivos mediante la conexión de dos cadenas de ADN en sus
secuencias homólogas. Este sistema se llama recombinación homóloga, y se
emplea para la recombinación genética durante la meiosis. En los últimos años, la
recombinación homóloga en levaduras se ha utilizado para la construcción de
plásmidos (como la inserción de un gen diana en un plásmido) y el aislamiento de
genes (como la clonación por recombinación asociada a la transformación para
capturar directamente los loci genómicos de Saccharomyces cerevisiae). A
diferencia de los métodos tradicionales que utilizan Enzimas de restricción y
ligasas, el método para la construcción de plásmidos usando recombinación
homóloga puede insertar un fragmento de ADN en una posición apropiada y
favorable de un plásmido. Las regiones de homología utilizadas para la
recombinación no necesitan estar en los extremos del plásmido linealizado.
Recientemente se descubrió que la recombinación homóloga se podría usar para
construir un plásmido en la levadura Pichia pastoris, que utiliza metanol. Para las
proteínas secretoras, también se lograron la preparación a gran escala y la
cristalografía de rayos X de la misma.

Actualmente la cristalografía de rayos X se ha convertido en una de las técnicas

más importantes en biociencia. Utilizada para la determinación de las estructuras
cristalinas de las proteínas secretoras de eucariotas (microorganismos y
animales), como la β-1,4-mannasa de un gasterópodo (la liebre marina común,
Aplysia kurodai), la bilirrubina oxidasa de un hongo (Myrothecium verrucaria), y
lisozima y transferrina de pollo (Gallus gallus), y en este caso la proteína objetivo
fue la transferrina, que es una proteína que se une al hierro y que transporta
hierro. La molécula de transferrina se pliega en dos lóbulos homólogos, y cada
lóbulo se divide en dos dominios de tamaño similar. Un sitio de unión a hierro está
contenido dentro de una hendidura interdominio, y se produce un movimiento de
dominio a gran escala durante la captación y liberación de un hierro. La
transferrina puede unir otros iones metálicos, incluidos los tóxicos, y se considera
que desempeña un papel importante en su transporte. Por lo que se desarrolló la
construcción de un sistema de expresión de P. pastoris de transferrina sérica
humana y transferrina de pollo mediante un método tradicional.

Mecanismo de recombinación homóloga

Cuando una cadena doble de ADN en un organismo vivo se rompe por factores
externos, como la radiación, es necesario que el organismo repare la cadena de
ADN dañada. Uno de los métodos para dicha reparación es la recombinación
homóloga, que es una reacción para conectar dos cadenas de ADN en la misma
secuencia (o secuencias muy similares). Los organismos vivos pueden usar otro
conjunto de cadenas de ADN para reparar una cadena de ADN quebrada en las
fases S y G2 del ciclo celular cuando está presente una cromátida hermana; la
recombinación homóloga puede reparar el ADN roto con mayor precisión que la
simple conexión de cadenas rotas (vía de unión de extremos no homóloga, como
se muestra a continuación). Se sabe que la recombinación homóloga en fase G1
puede ocurrir en células diploides de S. cerevisiae.

Durante la meiosis homóloga, la recombinación se utiliza para intercambiar partes

de cromosomas pareados para aumentar la diversidad genómica del gameto
haploide. Se sabe que puede ocurrir una recombinación homóloga entre el
genoma y una cadena de ADN introducida externamente. Por lo tanto, la
recombinación homóloga se utiliza para la transformación de células cultivadas y
células de levadura. Aunque los métodos de transformación que usan virus y
plásmidos autónomos se usan a menudo para células cultivadas y levaduras,
respectivamente; La recombinación homóloga ahora se ha convertido en otra
opción válida para la integración estable del ADN externo en el genoma.
La recombinación homóloga se produce entre el ADN plasmídico y una cadena de
ADN con una región homóloga (homóloga al plásmido), y esta técnica se ha
utilizado para la construcción de plásmidos y la preparación del sistema de
expresión de proteínas.
Ilustración 3: Proceso de formación del plásmido.

Metodología.

Construcción del plásmido de expresión utilizando recombinación homóloga

en levadura S. cerevisiae.

Los plásmidos autónomos se usan ampliamente para la transformación y

preparación de sistemas de expresión de proteínas en S. cerevisiae, y la
construcción del plásmido se puede hacer por recombinación homóloga en S.
cerevisiae. Por lo que se desarrolló un plásmido (pDDGFP-2) con una GFP en la
región aguas abajo del promotor GAL1 de S. cerevisiae que es inducido por
galactosa, y estableció un método para la preparación de un sistema de expresión
de proteínas de membrana mediante recombinación homóloga en levadura S.
cerevisiae. Este es un método de construcción de sistema de expresión de alto
rendimiento que utiliza recombinación homóloga; El tratamiento de transformación
común (método PEG-Li) que utiliza un plásmido linealizado al cortar en el sitio de
la enzima de restricción SmaI (entre el promotor y GFP) y el gen diana con una
secuencia homóloga (homóloga a los extremos del plásmido linealizado) en
ambos lados puede permite la construcción de un plásmido de expresión, y por lo
tanto puede usarse para preparar un sistema de expresión de S. cerevisiae. Para
las células de levadura transformadas, la expresión de la fusión de proteína de
membrana-GFP puede inducirse por galactosa, y el nivel de expresión de la fusión
puede estimarse mediante fluorescencia de GFP.

Construcción de un sistema de expresión utilizando recombinación

homóloga en la levadura metilotrófica P. pastoris

Debido a que el P. pastoris, que utiliza metanol, se puede usar para el cultivo de
alta densidad celular y tiene el promotor fuerte AOX1 (inducido por el metanol), se
sabe que es un excelente huésped de expresión para proteínas secretoras
eucariotas y proteínas de membrana. En general, la construcción de un sistema de
expresión usando P. pastoris consume mucho tiempo; el plásmido de expresión
generalmente se construye utilizando el método tradicional (manipulación con
enzimas y amplificación en E. coli), y luego el plásmido construido se inserta en el
genoma de P. pastoris. Por lo que Cregg desarrolló el primer sistema de expresión
de P. pastoris utilizando plásmidos autónomos con PARS1 o PARS2 (secuencia
de replicación derivada del genoma de P. pastoris). Los plásmidos autónomos no
se habían usado ampliamente debido a su estabilidad relativamente baja en un
medio no selectivo, mientras que los plásmidos no autónomos para la inserción en
el genoma por recombinación homóloga, como pPIC3.5, pPIC3.5K, pPIC9 y
pPIC9K, todos disponibles de Life Technologies, había sido ampliamente utilizado.
Por lo que se dedujo que la construcción de un sistema de expresión por
recombinación homóloga entre el plásmido autónomo y el fragmento de ADN en
las células de P. pastoris. Desarrollando plásmidos autónomos (pPrAGS-DDGFP)
que contienen el gen GFP y los genes de proteína de membrana insertada entre el
promotor y GFP mediante recombinación homóloga en P. pastoris, usando el
método de construcción del sistema de expresión P. pastoris de alto rendimiento.
 Ilustración 4: Métodos para conectar fragmentos de DNA por recombinación homologa.

ANEXO: GENES Y SU UBICACIÓN EN EL CROMOSOMA

ADE1: Cromosoma I localización a 169375..170295 Pb, la longitud del gen es de 921 Pb y

una posición genética de 4 cM.
ADE2: Cromosoma XV localización en 564476..566191 Pb, la longitud del gen es de 1716
Pb y una posición genética de 64 cM.

ADE4: Cromosoma XIII, localización en 865559..867091 Pb, la longitud del gen es de

1533 Pb y una posición genética de 213 cM.

HIS1: Cromosoma V, localización en 264892..265785 Pb, la longitud del gen es de 894 Pb

y una posición genética de 49 cM.
LEU2: Cromosoma III, localización en 91324..92418 Pb, la longitud del gen es de 1095 Pb
y una posición genética en -5 cM.

URA3: Cromosoma V, localización en 116167..116970 Pb, la longitud del gen es de 804

Pb y una posición genética en -7cM.

Bibliografía:

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