I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

1.1. SITUACION PROBLEMÁTICA.

Los prebióticos son sustancias de la dieta (fundamentalmente consistentes en
polisacáridos y oligosacáridos no digeribles por enzimas humanas) que nutren a grupos
seleccionados de microorganismos que habitan en el intestino. Favorecen el crecimiento de
bacterias beneficiosas por sobre las nocivas (WGO, 2011). La inulina es un prebiótico que
está constituida por moléculas de fructosa unidas por enlaces β-(2-1) fructosilfructosa,
denominados “fructanos". Dada su configuración química, los fructanos no pueden ser
hidrolizados por las enzimas digestivas humanas, son hidrolizados y fermentados en su
totalidad por las bacterias de la parte inferior del tracto gastrointestinal (intestino grueso,
colón) [CITATION Lar11 \p 2 \l 10250 ] . Generándose una simbiosis, entre probióticos y
prebióticos, esta afecta benéficamente al huésped mejorando la supervivencia y la
implantación de suplementos dietéticos a base de microbios vivos en el aparato digestivo del
huésped [CITATION FAO06 \l 10250 ].
Los probióticos son microorganismos vivos que, incorporados en alimentos, y al ser
consumidos en cantidades adecuadas ejercen una acción benéfica sobre la salud del ser
humano. Los productos lácteos fermentados hoy en día representan un papel fundamental
en la alimentación humana e inciden de manera importante en el estilo de vida de las
personas, por lo cual la industria de alimentos ha desarrollado nuevos productos
más allá de su calidad nutricional y sabor agradable [CITATION Row02 \p 1-8 \l 10250 ].
Los probióticos de los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus y Streptococcus, siendo
los más estudiados las bacterias acido lácticas (BAL), particularmente, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus GG, además de
bacterias del genero Bifidobacterium, principalmente Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium longum, observando efecto terapéuticos
importantes, sobre todos estas últimas, debido a su potencial para prevenir y tratar
enfermedades [CITATION Váz09 \p 1 \l 10250 ].
El lactosuero es uno de los materiales más contaminantes de la industria alimentaria,
debido a su elevado contenido en materia orgánica, siendo su riqueza en lactosa la principal
responsable del mismo, por su capacidad para actuar como sustrato de fermentación

1
microbiana. Como consecuencia de su inadecuada disposición, en los suelos y aguas este
genera contaminación [CITATION Ram12 \p 70 \l 10250 ].
El lactosuero es uno de los mayores contaminantes que existe en la industria
alimentaria, ya que, cada 1,000 litros de lactosuero contiene cerca de 35 kg de demanda
bioquímica de oxígeno (DBO) y cerca de 68 kg de demanda química de oxígeno (DQO).
Esta fuerza es equivalente a las aguas negras producidas en un día por 450 personas
[CITATION Ind01 \p 35 \l 10250 ].
El rendimiento de la leche en quesos duros varía entre 8 y 12% y en quesos frescos y
blandos entre 12 y 30%. Solo un 10 a 20% de la leche llega a convertirse en queso y el 80
a 90% restante en suero. Más aún, no usar el lactosuero es un enorme desperdicio de
nutrimentos porque el lactosuero contiene, aproximadamente, 25% de proteínas de la
leche, 8% de la materia grasa y 95% de la lactosa [CITATION Rev00 \p 396 \l 10250 ].
En la fabricación de quesos, por lo menos el 50% en peso de los nutrimentos de la
leche se quedan en el lactosuero, lo que implica que1000 litros de lactosuero contienen
más de 9 kg de proteína de alto valor biológico, 50 kg de lactosa, y 3 kg de grasa de leche.
Esto es equivalente a los requerimientos diarios de proteína de cerca de 130 personas y a
los requerimientos diarios de energía de más de100 personas. Entre los usos
convencionales de lactosuero para las empresas pequeñas y medianas está el empleo como
fertilizante y complemento alimenticio para cerdos y becerros, mientras que las empresas
grandes pueden fabricar suero en polvo y jarabes edulcorantes concentrados para la
industria de bebidas refrescantes [CITATION Ind01 \p 35 \l 10250 ].
Según la bibliografía consultada la inulina (prebiótico) favorecerá el crecimiento de las
cepas probióticas que se están considerando en esta investigación, “Bifidumbacterium
bifidum o Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus” en la elaboración de una
bebida a base de lactosuero dulce, generado como sub producto de la elaboración de queso
tipo Paria, característico de la región Cusco, así como de toda la zona sur del Perú.
Evaluando el efecto de la adición de inulina en el crecimiento de las cepas de interés de esta
investigación se desea dar a conocer en qué medida la inulina favorece el crecimiento de cada
cepa estudiada durante un proceso fermentativo, considerando que el género Bifidobacterium
ha sido calificado como las bacterias probióticas por excelencia [CITATION Ful89 \l 10250 ],
además tiene metabolismo heterofermentantivo característico, la cual produce como

2
metabolitos finales ácido acético y ácido láctico, además de otros ácidos orgánicos de cadena
corta en menor proporción, como ácido propiónico y ácido fórmico [ CITATION Váz09 \l
10250 ]. Respecto al género Lactobacillus y Streptococcus son muy usados para la fabricación
de lácteos fermentados debido a las propiedades organolépticas que da al producto
terminado, debido a los metabolitos producidos durante la fermentación de lactosa. Siendo
estas bacterias homofermentativas produciendo ácido láctico como único metabolito de esa
ruta (Vázquez, 2009; Miranda, 2014).
Teniendo ambas cepas características diferentes es de interés dar a conocer el efecto
que ejerce la adición de inulina en el crecimiento de las mismas durante el proceso de
fermentación en la elaboración de una bebida a base de lactosuero dando a conocer de esta
manera que cepa es más conveniente ser utilizada como inoculo para que esta tenga
propiedades probióticas y a su vez una buena aceptación del público garantizando al
consumidor una bebida que contribuya a su salud.

1.2. FORMULACION DEL PROBLEMA.

a. PROBLEMA GENERAL
La inulina como un prebiótico favorece el crecimiento de bacterias beneficiosas por
sobre las nociva. Esta está constituida por fructanos, los cuales no pueden ser hidrolizados
por las enzimas digestivas humanas, son hidrolizados y fermentados en su totalidad por las
bacterias de la parte inferior del tracto gastrointestinal (intestino grueso, colón). Al generarse
una simbiosis, entre probióticos y prebióticos, esta afecta benéficamente al huésped
mejorando la supervivencia y la implantación de suplementos dietéticos a base de microbios
vivos en el aparato digestivo del huésped.
b. PROBLEMAS ESPECIFICOS
 ¿Qué características tendrá la composición de lactosuero?
 ¿Para qué se acondiciona cada cepa de las bacterias probióticas en este estudio?
 ¡Monitoreando el crecimiento de cada cepa con diferentes concentraciones de inulina
se determinará la cepa de mayor valor probiótico?
 ¿Se obtendrá una bebida inocua y de alto valor nutritivo?
 ¿La bebida será agradable al paladar del consumidor?

3
  ¿La bebida cumplirá no solo con ser probiótica sino también agradable al
consumidor?
 ¿La bebida probiótica fermentada con inulina se conservará a temperaturas
adecuadas y por un tiempo determinado?

1.3. JUSTIFICACIÓN
La importancia de esta investigación radica en obtener una bebida probiótica agradable
al paladar evaluando el efecto de la adición de inulina en el crecimiento de dos cepas
diferentes una simple: Bifidumbacterium bifidum (Heterofermentativa) y otra mixta
Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus (ambas homofermentativas) a base
de un recurso de alto valor nutritivo que no está siendo aprovechado y contrariamente está
generando altos niveles de contaminación ambiental por su eliminación indiscriminada al
ambiente, siendo este el lactosuero dulce generado como subproducto en la elaboración de
queso tipo Paria característico de la zona sur del Perú.

La inulina es un fructano que se considera como prebiótico debido a que esta favorecerá
el crecimiento de las cepas de interés en la elaboración de la bebida en estudio, así como
garantizará la supervivencia e implantación de los microbios vivos en el aparato digestivo
del huésped garantizando así la elaboración de una bebida beneficiosa para la salud del
consumidor.

1.4. OBJETIVOS

a. OBJETIVO GENERAL:
 Evaluar el efecto de la adición de inulina en el crecimiento de Bifidumbacterium
bifidum o Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus en la
elaboración de una bebida probiótica fermentada a base de lactosuero.
b. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
 Evaluar la composición del lactosuero dulce (Sub-producto de queso tipo Paria).

4
  Acondicionar las cepas probióticas: Bifidumbacterium bifidum
(Heterofermentativa), Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus
(Homofermentativas).
 Monitorear el crecimiento de cada cepa inoculada con la adición de inulina en
diferentes concentraciones.
 Evaluar las características fisicoquímicas, microbiológicas y sensoriales de la
bebida probiótica fermentada con inulina.
 Determinar la cepa de mayor valor probiótico y organoléptico.
 Evaluar las características fisicoquímicas, organolépticas e inocuidad microbiana
de la bebida probiótica durante su conservación.

II. MARCO TEÓRICO CONCEPTUAL.

2.1. BASES TEÓRICAS.

2.1.1. INULINA
a) Inulina: Es un polisacárido constituido principalmente de unidades de fructosil
fructosa β (2-1) y que presenta normalmente, pero no necesariamente, unidades de
glucopiranosas en los extremos reductores. La inulina es un fructano
que presenta pocas ramificaciones β (2-6) variando entre un 1-5% [CITATION Veg11 \p 11 \l
10250 ].
b) Prebióticos: Los prebióticos son ingredientes no digeribles de la dieta, que producen
efectos beneficiosos estimulando selectivamente el crecimiento y/o actividad de uno o
más tipos de bacterias en el colon, las que tienen a su vez la propiedad de elevar el
potencial de salud del hospedero. Son fundamentalmente fructo y galacto oligosacáridos.
Incluida en este concepto está la fibra dietética [CITATION Del02 \p 64 \l 10250 ] .

2.1.2. PROBIÓTICOS
2.1.2.1. Historia y Definiciones
“El término probiótico es una palabra relativamente nueva que significa “a favor de la
vida” y actualmente se utiliza para designar las bacterias que tienen efectos beneficiosos
para los seres humanos y los animales”[CITATION FAO06 \p 2 \l 10250 ]. Hace un siglo, Elie

5
Metchnikoff (un científico ruso galardonado con el premio Nobel, y profesor del Instituto
Pasteur de París) postuló que las bacterias ácido lácticas (BAL) conferían beneficios a la
salud capaces de promover la longevidad [CITATION WGO11 \p 3 \l 10250 ].

Los probióticos según [CITATION WGO11 \l 10250 ] “Son microbios vivos que pueden
agregarse a la fórmula de muchos diferentes tipos de productos, incluyendo alimentos,
medicamentos y suplementos dietéticos” (Pág. 4).
Los microorganismos que se utilizan como probióticos sobre todo, aunque no
exclusivamente según [ CITATION FAO06 \l 10250 ] son: “Bacterias de los géneros
Lactobacillus y Bifidobacterium” (Pág. 3).
2.1.2.2. Probióticos en la Salud
2.1.2.2.1. Condiciones que deben cumplir los probióticos para producir efectos
benéficos a la salud.
[ CITATION Men15 \l 10250 ] menciona “para que los probióticos lleven a cabo la mayoría
de los beneficios a la salud, es necesario que una cantidad suficiente de probióticos
viables lleguen al intestino humano, esta cantidad se conoce como “dosis mínima
terapéutica” (Pág. 30).
[ CITATION Men15 \l 10250 ] menciona que según algunos “investigadores para que cobre
importancia fisiológica el consumo de los probióticos, estos deben llegar a las personas
por encima de 106; ósea 107 UFC / g o ml” (Pág. 31).
Tanto el número mínimo de viables para cada cepa, vida de anaquel, condiciones de
almacenamiento del producto y la dosis requerida para tener un efecto benéfico a la salud
deben estar reportados y disponibles en la etiqueta del alimento donde sean usados
(FAO/WHO, 2002).
2.1.2.2.2. Efectos
Algunos de los efectos a la salud sugeridos por probióticos son: Incrementar el valor
nutricional (mejor digestibilidad, aumentan la absorción de minerales y vitaminas),
promover la digestión de lactosa, prevenir infecciones gastrointestinales, regular la
motilidad del intestino (estreñimiento, síndrome del intestino irritable), mejorar el sistema
inmune, entre otras [CITATION Men15 \p 31 \l 10250 ].

2.1.3. Lactobacillus acidophillus

6
 [ CITATION Váz09 \l 10250 ] menciona “es una bacteria Gram positivo, catalasa
negativa, no motil, no esporulada, aerotolerante, aunque crece mejor en condiciones de
anaerobiosis” (Pág.10).

Según Garrity, (2004) taxonómicamente, está clasificada dentro del:

Phylum Firmicutes 
Clase Bacilli 
Orden Lactobacillales 
Familia Lactobacillaceae
Genero Lactobacillus
Especie Lactobacillus acidophillus 
Estando dentro del subgrupo de Lactobacillus delbruckii, según la clasificación por
el porcentaje de bases GC en su información genética (34-37%). Es una bacteria
homofermentativa produciendo ácido láctico como único metabolito de esa ruta,
degradando hexosas por la vía Embden-Meyerhof-Parnas, produciendo tanto el isómero L
como el isómero D de este compuesto en la relación 3:1, respectivamente. En el caso de
la fermentación de lactosa por esta ruta metabólica, se procede con la siguiente reacción:
Lactosa + 4H3PO4 + 4ADP 4Ácido láctico + 4ATP + 4H2O + 2(2H)
[CITATION Váz09 \p 10 \l 10250 ].

2.1.4. Streptococcus thermophiles

Son células esféricas u ovoides de 0,7-0,9 μm de diámetro, distribuidas en parejas o
formando cadenas. Son anaerobios facultativos, quimioorganotrofos con metabolismo
fermentativo. Son catalasa negativos, crecen con un 2,5% de cloruro sódico. La
temperatura mínima de crecimiento es de 19 a 21ºC, teniendo la habilidad para crecer a
52ºC [CITATION Men15 \p 13 \l 10250 ].
Su nombre procede del término griego “therme” que significa calor y del término
“philus” que significa afinidad. El conjunto de carbohidratos que puede fermentar,
distingue a Streptococcus thermophilus de muchos otros estreptococos y en la industria lo

7
emplean para la fabricación de yogur (junto con Lactobacillus delbruekii y con otros
microorganismos Lb. casei; Lb. acidophilus; Bifidobacterium) [CITATION Men15 \p 13 \l
10250 ].

2.1.5. Bifidumbacterium bifidum

Es una bacteria Gram positivo, catalasa negativo, polimórfica, no forma
esporas, no motil y no filamentosa. El contenido de GC dentro de su información genética
es del 42 – 67%, crece en un pH óptimo de 6.5 – 7, pero tiene cierta tolerancia al ácido
[CITATION Váz09 \p 9 \l 10250 ]. Taxonómicamente, está dentro del:
Phylum Actinobacteria
Clase Actinobacteria,
Subclase Actinobacteridae
Orden Bifidobacteriales
Familia Bifidobacteriaceae.
Genero Bifidumbacterium
Especie Bifidumbacterium bifidum
[CITATION Váz09 \p 9 \l 10250 ].
En colonias sembradas en medio de cultivo Man‐Rogosa‐Sharpe (agar MRS), las
bifidobacterias se observan como colonias de forma cóncava de alrededor de 1‐2 mm de
diámetro, de color blanco opaco, las cuales crecen por debajo de la superficie del agar
con una protuberancia distal [CITATION Váz09 \p 9 \l 10250 ].
Es anaerobia estricta y tiene metabolismo heterofermentantivo característico, degradando
hexosas por la ruta de fructosa‐6‐fosfato o también conocida como “bidif shunt” (Fig. 1),
la cual produce como metabolitos finales ácido acético y ácido láctico en un ratio de 3:2,
respectivamente. Este último lo produce en su forma L, el cual se metaboliza con mayor
facilidad. En el caso de la fermentación de lactosa por esta ruta, se sigue la siguiente
reacción:
Lactosa + 2H3PO4 + 2ADP 2 Ácido láctico + 3 Ácido acético + 2CO 2 + 2ATP +
2H2O + 2H

8
Figura 1: Ruta metabólica de la fructosa‐6‐fosfato “bifid shunt” para la fermentación de hexosas
[CITATION Váz09 \p 9 \l 10250 ].
2.1.6. GENERALIDADES DE QUESO
2.1.6.1. QUESO
De acuerdo a la FAO/OMS: “es el productos fresco o madurado obtenido por la
coagulación y separación de suero de la leche, nata, leche parcialmente desnatada,
mazada o por una mezcla de estos productos”.
2.1.6.2. QUESO TIPO PARIA
Según el organismo público Sierra y Selva exportadora del Ministerio de Agricultura y
Riego del Perú: Es un tipo de queso característico de la sierra, en las regiones del sur, el
queso Paria, cuyo nombre se atribuye al inicial “pariado” de leches de ganado vacuno,
ovino y/o caprino, ahora generalizado con el uso de leche de vacuno. Es un queso fresco,
prensado y oreado, que no utiliza cultivo láctico alguno y que, en algunos casos, madura
naturalmente, por períodos máximos de 20 días. Su producción se ha desarrollado con
características diferenciales, en las regiones alto andinas de Puno, Cusco y Arequipa.
Características:
 Lugar de origen: Puno, también se produce en Chuquibamba, Pampacolca y Majes.
Entre 3 000 y 4 000 msnm.
 Queso semiduro preparado con leche de vaca, propio del altiplano y la zona sur del
Perú.
 Sabor suave y de color ligeramente amarillento se usa en la preparación de comida
típica y en piqueos. Su corteza es corrugada. Es un queso fresco que, por el prensado
tradicional en moldes de paja, tiene una apariencia rugosa. De color ligeramente
amarillento debido al frío de la zona, tiene una corteza delgada y su grado de sal
depende de la zona de producción.

9
 Al contacto con el calor se ablanda, pero no se derrite y con pocos orificios.

2.1.7. LACTOSUERO
2.1.7.1. Definiciones
El lactosuero o suero de leche es un líquido claro, de color amarillo verdoso translúcido,
o incluso, a veces, un poco azulado (el color depende de la calidad y el tipo de leche
utilizada en su obtención). Es el coproducto más abundante de la industria láctea,
resultante después de la precipitación y la remoción de la caseína de leche durante la
elaboración del queso y la fabricación de caseína. Así mismo, es un excelente medio de
cultivo debido a sus propiedades y composición y por ello se utiliza en gran número de
procesos fermentativos [CITATION Ram12 \p 70-71 \l 10250 ]
2.1.7.2. Tipos de lactosuero
Existen varios tipos de lactosuero dependiendo principalmente de la eliminación de la
caseína. El primero denominado dulce, está basado en la coagulación por la renina a pH
6,5. El segundo llamado ácido resulta del proceso de fermentación o adición de ácidos
orgánicos o ácidos minerales para coagular la caseína como en la elaboración de quesos
frescos [CITATION Par09 \p 4968 \l 10250 ].

Tabla 1: Composición de lactosuero dulce y ácido

Lactosuero Lactosuero
Componente
dulce (g/L) ácido (g/L)
Sólidos totales 63.0-70.0 63.0-70.0
Lactosa 46.0-52.0 44.0-46.0
Proteína 6.0-10.0 6.0-8.0
Calcio 0.4-0.6 1.2-1.6
Fosfatos 1.0-3.0 2.0-4.5
Lactato 2.0 6.4
Cloruros 1.1 1.1

Se puede detallar la composición nutricional del lactosuero dulce y acido, observándose

que el dulce tiene mayor lactosa y mayor proteína respecto al ácido [CITATION Par09 \p
4968 \l 10250 ].
2.1.8. FERMENTACIÓN

10
2.1.8.1. Fermentación de lactosuero
La fermentación del lactosuero, uno de los procesos que ha permitido valorizar este
coproducto, es una interesante área de investigación para la industria láctea. El lactosuero
posee todos los macro y micronutrientes y elementos traza que los microorganismos
(M.O.) necesitan para realizar el proceso fermentativo. El componente más utilizado en
estos procesos es la lactosa [CITATION Cas96 \p 12 \l 10250 ].

2.2. MARCO CONCEPTUAL

PREBIOTICO: Los prebióticos son ingredientes no digeribles de la dieta, que producen
efectos beneficiosos estimulando selectivamente el crecimiento y/o actividad de uno o
más tipos de bacterias en el colon, las que tienen a su vez la propiedad de elevar el
potencial de salud del hospedero [CITATION Del02 \p 64 \l 10250 ].
PROBIOTICO: Los probióticos son aquellos microorganismos vivos que, al ser
agregados como suplemento en la dieta, afectan en forma beneficiosa al desarrollo de la
flora microbiana en el intestino [CITATION Del02 \p 65 \l 10250 ].
INULINA: La inulina es un componente natural de varias frutas y hortalizas, aunque su
obtención industrial se realiza mayoritariamente a partir de las raíces de la achicoria
mediante un proceso de extracción con agua caliente seguido de una etapa de purificación
y de otra de cristalización. La inulina nativa es una mezcla de cadenas de oligómeros y
polímeros con un número variable de moléculas de fructosa, unidas por enlaces β(2→1)
que suele incluir en su extremo, una molécula de glucosa [CITATION Vil08 \p 6 \l 10250 ].
LACTOSUERO: El lactosuero es definido como “la sustancia líquida obtenida por
separación del coágulo de leche en la elaboración de queso”. Es un líquido translúcido
verde obtenido de la leche después de la precipitación de la caseína [CITATION Par09 \p
4968 \l 10250 ].
BEBIDA FERMENTADA: El lactosuero desproteinizado o completo puede ser
fermentado para producir una gama de bebidas. La principal ventaja ofrecida por el
lactosuero como sustrato para la producción es que tienen un gran valor nutritivo,
rehidrata y son menos ácidas que los jugos de frutas [CITATION Par09 \p 4976 \l 10250 ].

2.3. ANTECEDENTES EMPIRICOS DE LA INVESTIGACION.

11
Ruiz & Ramírez, (2009) El propósito de esta investigación fue la elaboración de yogurt
firme con incorporación de cepas probióticas (Bifidobacterium spp. y Lactobacillus
acidophilus) e inulina. Se utilizó leche cruda proveniente de la estación experimental
"Santa María" –UCV y leche en polvo comercial, para obtener leche pasteurizada, inulina
(Raftiline® HP), cultivos lácticos de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y
Streptococcus salivarus subsp thermophilus y cepas probióticas de Bifidobacterium spp. y
Lactobacillus acidophilus. Se hicieron tres formulaciones de yogurt: F1 = Leche
pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas, F2 = Leche pasteurizada + Cultivo
Láctico + Cepas Probióticas + Inulina, F3 = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico
(Control). La leche cruda cumplió con los requisitos establecidos en la norma COVENIN
(903:93). Los yogures cumplieron con los requisitos microbiológicos exigidos en la
norma COVENIN (2392:01). La formulación 2 (probióticos e inulina), mostró mayor
estabilidad fisicoquímica durante el tiempo de almacenamiento y además no presentó el
fenómeno de sinéresis.
Vásquez, (2009) El objetivo de esta investigación fue formular una bebida probiótica
con sabor frutal a partir de la fermentación simple de lactosuero dulce de cabra con
Bifidobacterium bifidum o Lactobacillus acidophilus. Se realizaron fermentaciones ácido
lácticas simples (con B. bifidum o L. acidophilus), utilizando lactosuero dulce de cabra
con presencia de crema residual y lactosuero dulce descremado como sustrato

obteniendo una concentración >1 x 108 UFC/ml para cada fermentación. Los
lactosueros fermentados fueron evaluados sensorialmente mediante una prueba de
preferencia y una escala hedónica por un panel no entrenado de 30 personas. Se llegó a
determinar las formulaciones de mayor agrado sensorial mediante una prueba de
preferencia y una escala justa (escala “Just Right”). Se obtuvieron 2 formulaciones
probióticas finales: lactosuero descremado y fermentado con L. acidophilus con 20% de
concentrado de mango y 45g de sacarosa/L y lactosuero descremado y fermentado con
B. bifidum con 15% de mango con 45g de sacrosa/L. A éstas se les realizó un estudio
de vida útil a 4°C + 2 por 20 días, por 2 métodos: (1) método tradicional, determinando
las cinéticas de deterioro y (2) método predictivo, mediante un análisis de supervivencia.
Se determinó una vida útil de 20 días para ambas formulaciones por el método
tradicional y 20 días para la formulación con B. bifidum y 26 días para la formulación

12
con L. acidophilus, mediante el método predictivo. En conclusión, se determinó una
buena aceptación sensorial de parte de las 2 formulaciones probióticas con una vida útil a
4°C de 20 días, promedio.

Tirado, Diego, Granados, Clemente, Acevedo, Diofanor, Marulanda, De la Hoz,

(2015) En este trabajo se elaboró una bebida láctea a base de lactosuero fermentada con
Streptococcus thermophilus y Lactobacillus casei ssp. casei. Para esto se evaluó
fisicoquímicamente el lactosuero dulce y el producto final. Se prepararon 3 lotes a
concentraciones de sólidos solubles de 13, 17 y 21%. Las muestras se sometieron a
análisis microbiológicos para demostrar la supervivencia de las cepas utilizadas, y
además se determinó la ausencia de poblaciones patógenas. Los resultados mostrados en
este trabajo demuestran que es posible la elaboración de una bebida láctea fermentada
teniendo como materia prima el lactosuero. Este podría constituir un medio de cultivo
apropiado para que las cepas Streptococcus thermophilus y Lactobacillus casei ssp Casei
prosperen, ya que permite tener poblaciones altas de UFC/ml durante un periodo de
almacenamiento relativamente corto. Existe un aumento favorable en los niveles de
lactosa, solidos solubles, proteína y densidad. Hubo ausencia total de coliformes totales y
fecales en los tres productos elaborados. A mayor contenido de sólidos solubles mayores
fueron los niveles de lactosa, sólidos solubles, proteína, densidad y acidez.

13
III. HIPOTESIS Y VARIABLES
3.1. HIPOTESIS
3.2. HIPOTESIS GENERAL
 La adición de inulina en el crecimiento de Bifidumbacterium bifidum o
Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus en la elaboración de una
bebida fermentada a base de lactosuero dulce mejora su valor probiótico y
organoléptico.
3.3. HIPOTESIS ESPECIFICAS
 La composición de lactosuero tendrá las características requeridas para que las
cepas lo fermenten.
 El acondicionamiento de cada cepa facilitara el monitoreo de crecimiento de las
bacterias probióticas en estudio.
 El valor probiótico de la bebida elaborada depende de, la concentración de inulina
 La bebida garantizara inocuidad y alto valor nutritivo.
 La aceptación sensorial depende de la sepa utilizada.
 La bebida elaborada mantendrá su calidad fisicoquímica, organoléptica y
microbiológica durante su conservación.

3.4. IDENTIFICACION DE VARIABLES E IDENTIFICADORES

Tabla 2: Variables

Variables
Independientes Dependientes
•     Composición de
•     Crecimiento microbiano de BAL.
lactosuero.
•     Características de fermentación
•     Concentraciones de
(pH, % ácido láctico, lactosa
inulina
remanente)
•     Cuantificación de microorganismos
•     Cepas probióticas
patógenos
  •     Características organolépticas.
  •     Composición fisicoquímica.
 
Elaboración propia, 2019

14
 3.5. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

Tabla 3: Operacionalización de variables

Unidad de
Variables Tipo Indicador
medida
Dosis mínima requerida de microorganismos probióticos > 108 UFC/mL
Características de fermentación    
  pH (B. bifidum) 6.2-5.53  
  pH (L. acidophillus + S. thermophillus) 6.2-4.26  
  Ácido láctico ((B. bifidum) 0.16 %
  Ácido láctico (L. acidophillus + S. thermophillus) 0.31 %
  Consumo Lactosa (B. bifidum) 0.15 g
  Consumo Lactosa (L. acidophillus + S. thermophillus) Depe 0.29 g
Microorganismos patógenos ndien    
  Coliformes te 10-102 UFC/mL
2
  Mohos 10-10 UFC/mL
2
  Levaduras 10-10 UFC/mL
Características Organolépticas    
Composición fisicoquímica:    
  Proteínas 2.0-3.0 %
  Carbohidratos totales 11.0-12.0 %
  ELN   %
Composición de lactosuero    
  pH 6.2-5.8  
  Acidez titulable < 0.2 %
  Proteínas 0.8-1 %
  Grasa 0.2-0.7 %
  Lactosa 4.5 - 5 %
Concentraciones de Inulina Indep    
  Control endie 0 %
  1 nte 3 %
  2 5 %
Parámetros de fermentación    
  Inoculo de BAL 10 %
  Temperatura 42 °C
  Tiempo 8 Horas
  Anaerobiosis    
Elaboración propia, 2019.
IV. METODOLOGIA

15
4.1. TIPO Y NIVEL DE INVESTIGACION
En cuanto a los tipos de investigación, existen muchos modelos y diversas clasificaciones. No
obstante, lo importante es precisar los criterios de clasificación. [CITATION Ari12 \p 22 \l 10250 ]

En este sentido, se identifican:

– Tipos de investigación según el nivel

– Tipos de investigación según el diseño

– Tipos de investigación según el propósito

Sin embargo, independientemente de su clasificación, todos son tipos de investigación, y al no

ser excluyentes, un estudio puede ubicarse en más de una clase.

Por ejemplo, una investigación puede ser explicativa y de campo al mismo tiempo. Así como
también, cualquier otra investigación pudiera clasificarse como documental de nivel
exploratorio-descriptivo. [CITATION Ari12 \p 23 \l 10250 ]

4.1.1. Nivel y Diseño de Investigación

El nivel de investigación se refiere al grado de profundidad con que se aborda un fenómeno u

objeto de estudio. [CITATION Ari12 \p 23 \l 10250 ]

El diseño de investigación es la estrategia general que adopta el investigador para responder al

problema planteado. En atención al diseño, la investigación se clasifica en: documental, de
campo y experimental. [CITATION Ari12 \p 27 \l 10250 ]

Según lo citado, la presente investigación se clasifica en el siguiente nivel y diseño de

investigación:

Investigación Explicativa: La investigación explicativa se encarga de buscar el porqué de los

hechos mediante el establecimiento de relaciones causa-efecto. En este sentido, los estudios
explicativos pueden ocuparse tanto de la determinación de las causas (investigación post
facto), como de los efectos (investigación experimental), mediante la prueba de hipótesis. Sus
resultados y conclusiones constituyen el nivel más profundo de conocimientos. [CITATION
Ari12 \p 26 \l 10250 ]

16
Diseño experimental: La investigación experimental es un proceso que consiste en
someter a un objeto o grupo de individuos, a determinadas condiciones, estímulos o
tratamiento (variable independiente), para observar los efectos o reacciones que se producen
(variable dependiente).[CITATION Ari12 \p 34 \l 10250 ]

En cuanto al nivel, la investigación experimental es netamente explicativa, por cuanto su

propósito es demostrar que los cambios en la variable dependiente fueron causados por la
variable independiente. Es decir, se pretende establecer con precisión una relación causa-
efecto. [CITATION Ari12 \p 34 \l 10250 ]

En este sentido, la presente investigación es de nivel explicativa y de diseño experimental ya

que trata de comprobar o refutar una hipótesis en forma matemática y cuyos resultados van a
enriquecer el conocimiento teórico científico y practico determinando el efecto de la adición
de inulina en el crecimiento de Bifidumbacterium bifidum o Lactobacillus acidophilus y
Streptococcus thermophilus. Para la elaboración de una bebida probiótica a base de
lactosuero.

4.2. TECNICAS DE RECOLECCION DE INFORMACION

4.2.1. MATERIALES DE ESTUDIO
 Lactosuero dulce descremado pasteurizado procedente de queso tipo Paria (LS).
 Cepas probióticas: Cepa1(Simple-Heterofermentativa): Bifidobacterium bifidum,
Cepa2(Mixta-Homofermentativas): Lactobacillus acidophilus y Streptococcus
thermophilus.
 Inulina comercial.
4.2.2. MÉTODOS DE RECOLECCION DE DATOS
4.2.2.1. Caracterización del lactosuero
4.2.2.1.1. Determinación de pH: La medición de pH se realizará con un potenciómetro.
4.2.2.1.2. Determinación de acidez titulable: La determinación se realizará siguiendo el
método 947.05 de la AOAC (1990).
4.2.2.1.3. Determinación de proteína: Se determinó mediante el método Kjeldhal, método
930.29 de la AOAC (1990).

17
4.2.2.1.4. Determinación de grasa: Se realizará por el método Gerber, método 16032
AOAC (1990).
4.2.2.1.5. Determinación de Lactosa: Se realizará por el método consiste en una valoración
indirecta redox.
4.2.2.2. Descremado: El descremado de lactosuero (LSD) se llevará a cabo en una
descremadora, en el Laboratorio de química de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco. El proceso de descremado se llevará a
cabo en 2 etapas, (a) una etapa de precalentamiento y (b) etapa de descremado, por una
centrífuga de discos [ CITATION Váz09 \l 10250 ].
4.2.2.3. Pasteurizado del lactosuero: El LSD será pasteurizado en un pasteurizador de acero
inoxidable en el laboratorio de química de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco.
4.2.2.4. Acondicionamiento de Cepas Probióticas: Cada cepa será acondicionada para
accionar el metabolismo de las mismas. El acondicionamiento se realizará por triplicado. El
procedimiento se realizará en el laboratorio de microbiología de alimentos de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco.
Se tomarán tres viales de 1mL y se colocaran a baño maría a 37ºC + 1 hasta el descongelado
de los mismos, se transferirá el contenido de cada vial a tubos de centrífuga de 15mL con
9mL de medio Man Rogosa Sharpe (MRS) para obtener un volumen total de 10mL. La
incubación se realizará a 37ºC + 2 en condiciones de anaerobiosis.
Durante la incubación se registrará los cambios en la densidad óptica (DO) a 660nm respecto
al tiempo en un espectrofotómetro. Al iniciar la fase logarítmica, se realizarán recambios
sucesivos de los cultivos, traspasando 10% (1mL) del cultivo a 9mL de medio MRS nuevo y
estéril, hasta lograr una disminución de la fase de latencia (fase lag), hasta obtener un tiempo
de duplicación (td) y una velocidad específica de crecimiento (µ) constante (Ec. 1 y 2). La
importancia de hacer esto se debe a que los cultivos más activos son los caracterizados por
una fase de latencia breve, de lo contrario una fase de latencia larga incrementa el tiempo de
procesado, lo cual disminuye su rendimiento a nivel industrial [CITATION Váz09 \p 36 \l
10250 ].
ln 2 0.6931
td= td = Ec.1
µ µ

18
Dónde:
td = tiempo de duplicación (h)
µ = velocidad específica de crecimiento (h-1).
( log10 DO final – log10 DO inicial)2.303
µ= Ec.2
t final – t inicial
Dónde:
µ = velocidad específica de crecimiento (h-1).
DO = densidad óptica.
t = tiempo (h).
Fuente: [CITATION Váz09 \p 37 \l 10250 ].

4.2.2.5. Cultivo madre: Se obtendrá dos cultivos madre, uno para cada cepa, mediante la
inoculación del lactosuero dulce descremado pasteurizado. El procedimiento se realizará
preservando las condiciones de esterilidad. Según la bibliografía consultada el porcentaje de
inóculo a utilizar será de 10% v/v (10mL de medio MRS inoculado/90mL de SLC
pasteurizado). [CITATION Váz09 \p 37 \l 10250 ]
El inóculo será tomado de los matraces de 250mL con 100mL de medio MRS inoculado;
transfiriendo 10mL de medio MRS inoculado a 90mL de SLC pasteurizado para obtener un
volumen final de 100mL, se incubó a 37ºC + 2 bajo condiciones de anaerobiosis, durante el
tiempo que alcanza el microorganismo la fase log de crecimiento. Ambos cultivos madres se
resguardarán en condiciones de refrigeración a 4°C + 2 en un refrigerador marca.
4.2.2.5.1. Cuenta en placa de unidades formadoras de colonias del cultivo madre: Se
realizará conteo de unidades formadoras de colonias (UFC), siguiendo los procedimientos
descritos en la NOM‐110‐SSA1‐1994 (Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos
para su Análisis Microbiológico).
Se vertiera un 1mL de cultivo madre y se agregará a 9mL de agua peptonada, mezclando
hasta homogeneizar la muestra, obteniendo la dilución 1:10; se proseguirá así hasta obtener
la dilución 1:10‐10. Como medio de cultivo se utilizará agar Man Rogosa Sharpe (MRS). Se
tomará 1mL de muestra de cada dilución en cajas Petri estériles, se añadirá el agar MRS y se
mezclará, dejándolo reposar por 10 minutos hasta solidificar. Las cajas Petri se incubarán a
37°C±2 por 48 horas bajo las condiciones de anaerobiosis. Se leerán las placas que

19
contengan de 25‐250 colonias y se les multiplicaron por la dilución correspondiente. Al
mismo tiempo, se prepararán frotis de las colonias de microorganismos por la técnica de
tinción de Gram, la cual es una técnica básica para la visualización de bacterias, ya que tiñe
de color violeta o rojo la pared celular de la célula bacteriana, según sus características
morfológicas. Realizados los frotis, se observarán al microscopio, con el objetivo 40X y
100X para la identificación visual de los microorganismos. [CITATION Váz09 \p 38 \l 10250 ]
4.2.2.5.2. Inóculos de trabajo: El inoculo de trabajo, es la fracción del cultivo madre con el
cual se siembra el tanque de fermentación, debe contener un número de células viables
conocido y estar libre de contaminantes. Después de realizar la cuenta en placa de los
cultivos madre, se comprobará que la cantidad de unidades formadoras de colonia por
mililitro (UFC/mL) presente sea >1 x 108 UFC/mL., por lo tanto, los cultivos madre se
preservaran en matraces Erlenmeyer estériles de 100mL almacenados a 4°C±2. El volumen
de inóculo para cada fermentación será de 10% v/v. [CITATION Váz09 \p 38 \l 10250 ].

4.3. TECNICAS DE ANALISIS E INTERPRETACION DE INFORMACION

4.3.1. Fermentaciones Acido Lácticas:
Según la bibliografía de referencia se vertieran 450 mL de LSD pasteurizado a matraces
Erlenmeyer de 500mL de capacidad, y se les inoculara con 50mL del cultivo madre,
obteniendo un volumen final de 500mL, incubándolo a 42°C ± 2 durante 8h bajo condiciones
de anaerobiosis. Este procedimiento se realizará para ambos cultivos microbiológicos.
[CITATION Váz09 \p 38 \l 10250 ]
Para llegar a los objetivos de esta investigación y según la bibliografía consultada durante el
tiempo de incubación, se medirán las cinéticas de pH, producción de ácido láctico, lactosa
remanente y crecimiento bacteria en cuatro tiempos: T l = 0 Horas, T2 = 2 Horas, T3 = 4 Horas
y al término de las 8 Horas como T 4 de fermentación, los LSD fermentados se almacenarán a
4°C ± 1 en un refrigerador. [CITATION Váz09 \p 38 \l 10250 ].
4.3.1.1. Determinación de pH: Se procederá como en apartado 4.2.2.1.1.
4.3.1.2. Determinación de ácido láctico y lactosa remanente: Las cinéticas de ácido láctico
y lactosa se medirán por cromatografía de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo, con
un detector de índice de refracción. Se muestrearán las fermentaciones de lactosuero
tomando alícuotas de 5mL de LSD fermentado en los 4 tiempos mencionados, durante un

20
lapso de 8h, todo en condiciones de esterilización. Posteriormente, las muestras serán
centrifugadas a 4000 rpm durante 10 min para estar libres de células y otros compuestos en
suspensión. Paso siguiente, se inyectarán 20µL de la muestra a analizar en una columna
Aminex, con una fase móvil de ácido sulfúrico a 5mM, a un flujo de 0.6mL/min, a una
temperatura de detector de 50°C y de 60°C en el horno. Los analítos se calcularán utilizando
las curvas de calibración de cada compuesto, las cuales se tomarán según la bibliografía de
referencia. [CITATION Váz09 \p 38-39 \l 10250 ]
A la par, la determinación de ácido láctico se realizará siguiendo el método mencionado en el
apartado 4.2.2.1.2.
4.3.1.3. Cuenta de células viables del cultivo probiótico en lactosueros fermentados: Se
procederá según el método descrito en el apartado 4.2.2.5.1.
4.3.2. Análisis Sensorial del efecto de la adición de inulina a los LSD fermentados
Para el análisis sensorial del efecto de la adición de inulina en el sabor a los lactosueros dulce
descremado fermentado se utilizará el método de Comparación por pares.
4.3.2.1. Método de Comparación por Pares: El objetivo de este método es de determinar si
existe diferencia perceptible entre dos muestras, esta diferencia se obtiene comparando dos
muestras (un par) entre sí. Se pretende saber si una muestra presenta un cierto atributo
sensorial en mayor intensidad que la otra muestra. [CITATION Esp03 \p 77 \l 10250 ]
La formulación se realizará tal como se detalla a continuación:

Tabla 4: Formulación de lactosuero descremado fermentado con dos cepas diferentes

con adición de 2 concentraciones de inulina.

EFECTO DE LA ADICION DE INULINA A LOS LSD FERMENTADOS EN EL SABOR

N° PRUEBA FORMULACION % INULINA N° CEPA BACTERIAS ACIDO LACTICAS

1 3 1 Bifidumbacterium bifidum
1
2 3 2 Lactobacillus acidophillus y Streptococcus thermophiles
3 5 1 Bifidumbacterium bifidum
2
4 5 2 Lactobacillus acidophillus y Streptococcus thermophiles

Elaboración propia, 2019

21
 Tabla 5: Ficha de respuestas

FICHA N°: 01
PRUEBA DE COMPARACIONES POR PARES - DIFERENCIA

NOMBRE:

FECHA:

Pruebe cada para de izquierda a derecha, haga un circulo en la muestra con sabor mas
agradable. No se trague las muestras y enjuaguese la boca entre cada muestra.

PAR NUMERO DE LAS MUESTRAS

Comentarios:

Elaboración propia, 2019

PRESUPUESTO

COSTO
CANTIDA TOTA
DETALLE UNITARI
D L (S/.)
O
A. Personal      
Apoyo especializado 1 3000 3000
Apoyo secretarial 1 1000 1500
B. Bienes      
Material de escritorio     500
Materia prima      
Lactosuero 10 Litros 5 50
Cepa: 1 280 280
Bifidumbacterium

22
 bifidum
Cepa: Lactobacillus
1 280 280
acidophillus
Cepa: Streptococcus
1 280 280
thermophillus
Inulina 1 100 100
Otros     500
Equipos para el proceso      
Material de laboratorio 20 200 800
Cooler 1 450 150
Gel packs 6 40 240
Otros     500
Reactivos     1000
Libros 2 250 500
C. Servicios      
Movilidad y viáticos     2000
Servicios de impresión     500
Servicios de computación     300
Servicios de análisis –
    4500
laboratorio
Otros     500
TOTAL S/. 17,480.00
Elaboración propia, 2019

CRONOGRAMA DE ELABORACION DE TESIS

23
 MESES (2019-2020)
N° ACTIVIDADES
E-01 F-01 M-01 A-01 M-01 J-01 J-01 A-01 S-01 O -01 N-01 D-01 E-01 F-01 M-01 A-01

1 Elaboración y aprobación del proyecto

2 Organización e implementación

3 Ejecución

a. Reajuste

b. Adquisicion de instrumentos y
equipos

c. Análisis de la materia prima

d. Proceso de fermentacion

e. Procesamiento de datos

4 Análisis y interpretación

5 Control y evaluación

6 Informe final

Elaboración propia, 2019

24
 BIBLIOGRAFÍA

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25
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Importancia en alimentos y sus efectos en la salud. Fuente.

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WGO. (Octubre de 2011). Guía Práctica de la Organización Mundial de Gastroenterología:

Probióticos y Prebióticos. WGO.

26
 ANEXOS

ANEXO 01: MATRIZ DE CONSISTENCIA

Problemas Objetivos Hipótesis Variables

General General General Dependientes
La inulina como un Evaluar el efecto de Al evaluar el efecto •    Crecimiento
prebiótico favorece el la adición de inulina de la adición de microbiano de BAL.
crecimiento de en el crecimiento de inulina en el •    Características de
bacterias beneficiosas Bifidumbacterium crecimiento de fermentación (pH, %
por sobre las nociva. bifidum o Bifidumbacterium ácido láctico, lactosa
Esta está constituida Lactobacillus bifidum o remanente)
por fructanos, los acidophilus y Lactobacillus •    Cuantificación de
cuales no pueden ser Streptococcus acidophilus y microorganismos
hidrolizados por las thermophilus en la Streptococcus patógenos
enzimas digestivas elaboración de una thermophilus en la •    Características
humanas, son bebida probiótica elaboración de una organolépticas.
hidrolizados y fermentada a base de bebida fermentada a •    Composición
fermentados en su lactosuero agradable base de lactosuero fisicoquímica.
totalidad por las al consumidor dulce se conocerá cuál
bacterias de la parte de estas cepas dará
inferior del tracto mayor valor
gastrointestinal probiótico y
(intestino grueso, organoléptico.
colón). Al generarse
una simbiosis, entre
probióticos y
prebióticos, esta afecta  
benéficamente al
huésped mejorando la
supervivencia y la
implantación de
suplementos dietéticos
a base de microbios
vivos en el aparato
digestivo del huésped.
Específicos Específicos Específicos Independientes
·     Que características ·      Evaluar la ·      La composición
tendrá la composición composición del de lactosuero tendrá
de lactosuero? lactosuero dulce las características •     Composición de
(Sub-producto de requeridas para que lactosuero.
queso tipo Paria). las cepas lo
fermenten.
·      Para que se ·      Acondicionar ·      El
•     Concentraciones de
acondiciona cada cepa las cepas acondicionamiento de
inulina
de las bacterias probióticas: cada cepa facilitara el
27
probióticas en este Bifidumbacterium monitoreo de
estudio?. bifidum crecimiento de las
(Heterofermentativa) bacterias probióticas
, Lactobacillus en estudio.
acidophilus y
Streptococcus
thermophilus
(Homofermentativa).
·      Monitoreando el ·      Monitorear el ·      Monitoreando el
crecimiento de cada crecimiento de cada crecimiento de cada
cepa con diferentes cepa inoculada con cepa durante el
concentraciones de la adición de inulina proceso fermentativo
inulina se determinará en diferentes con adición de
la cepa de mayor valor concentraciones. diferentes •     Cepas probióticas
probiótico. concentraciones de
inulina se determinará
cuál de ellas da mayor
valor probiótico a la
bebida elaborada.
·      Se obtendrá una ·      Determinar las ·      La bebida será
bebida inocua y de características inocuo y de alto valor
alto valor nutritivo. fisicoquímicas y nutritivo.
microbiológicas de
la bebida probiótica
fermentada con
inulina.
·      La bebida será ·      Evaluar la ·      Evaluando la
agradable al paladar aceptación sensorial aceptabilidad
del consumidor? de la bebida sensorial se  
probiótica determinará que sepa
fermentada con da mayor valor
inulina. organoléptico.
·      La bebida ·      Determinar la ·      Con todo lo
cumplirá no solo con cepa de mayor valor evaluado se podrá
ser probiótica sino probiótico y determinar la cepa de
también agradable al organoléptico. mayor valor
consumidor? probiótico y
organoléptico.

28
29