Determinación de Pesticidas Usando Biosensores Enzimáticos Electroquímicos

25/11/2019 Determinación de pesticidas usando biosensores enzimáticos electroquímicos
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revisión
Determinación de pesticidas usando enzimática electroquímica

Biosensores
Marek Trojanowicz *
Laboratorio de Análisis de Flujo y Cromatografía, Departamento de Química, Universidad de Varsovia, Pasteura 1, 02-093 Varsovia,
Polonia; correo electrónico: trojan@chem.uw.edu.pl
Recibido: 29 de noviembre de 2001

Versión final: 15 de abril de 2002
Abstracto
En la última década, se han desarrollado numerosos métodos de biosensores para la detección de pesticidas utilizando
biosensores enzimáticos e inmunosensores. La determinación enzimática de pesticidas se basa con mayor frecuencia en la inhibición de
La actividad de enzimas seleccionadas, tales como colinesterasas, organofosfato hidrolasa, fosfatasa alcalina y ácida,
ascorbato oxidasa, acetolactato sintasa y aldehído deshidrogenasa. Los biosensores enzimáticos se desarrollaron utilizando
diversos transductores de señal electroquímica, diferentes métodos de inmovilización enzimática y diversas mediciones
metodologías Aplicación de biosensores serigrafiados de un solo uso en mediciones por lotes y análisis de inyección de flujo
con biosensores enzimáticos son los procedimientos más intensamente desarrollados. Una mejora del nivel de detectabilidad puede ser
logrado mediante el uso de mutantes enzimáticos recombinantes, mientras que las determinaciones de múltiples componentes mediante el uso de biosensor
matrices y procesamiento de datos con redes neuronales artificiales. En algunos casos, el pesticida determinado también puede ser un
sustrato de reacción enzimática. Otra área de desarrollo de biosensores para la determinación de pesticidas está en
diseño de biosensores microbianos y biosensores basados en fotosistemas con biosensores electroquímicos.
Palabras clave: pesticidas, biosensores electroquímicos, análisis de inyección de flujo, inhibición enzimática.
Dedicado al profesor Gary Christian en ocasión de su 65 ° cumpleaños
1. Introducción pretratamiento de la muestra analizada, y a pesar de la rapidez

progresar en la reducción a un formato portátil estos
Los pesticidas son un grupo de varios miles de compuestos orgánicos. instrumentos de laboratorio, no se utilizarán comúnmente en el campo
libras de estructura diferente, de las cuales su uso es mediciones realizadas por el usuario final durante mucho tiempo. Este rol,
indispensable en la agricultura contemporánea y su uso hoy en día, en la determinación de campo de la determinación de pesticidas
para este fin en las últimas décadas en todo el mundo tiene casi ción, se juega con kits de inmunoensayo fotométrico en campo
duplicado cada década [1]. Aumento rápido de pesticidas formato [5]. Instrumentación competitiva para esos dispositivos.
el consumo también se observa en aplicaciones no agrícolas pronto puede estar en aplicaciones de rutina con integrado
nciones tales como el control de la vegetación industrial (carreteras, biosensores en un diseño de un solo uso o como detectores en
ferrocarriles), salud pública o gestión de pastos. Porque instrumentos portátiles miniaturizados, que funcionan en lotes o
la gran extensión de estas diferentes aplicaciones, pesticidas procedimientos de flujo.
son una de las amenazas antropogéneas más importantes para En las etapas iniciales de desarrollo de bioanálisis analítico
aguas subterráneas y superficiales. El desarrollo y la continua sensores a principios de los años sesenta la investigación se centró solo en
mejora de los métodos analíticos para la determinación de aplicaciones clínicas. Aislado de varios organismos,
este gran grupo de compuestos, principalmente a nivel de trazas, es un la acetilcolinesterasa ya se usaba a principios de los años cincuenta
Gran desafío para los analistas y la investigación real y para la determinación de pesticidas en sistemas de medición con
asignatura de desarrollo para la química analítica contemporánea detección potenciométrica [6, 7]. A mediados de los ochenta era
[2, 3]. Los datos del informe de la Comisión Europea muestran utilizado para la construcción de los primeros biosensores integrados para
64 pesticidas utilizados en gran cantidad, que se consideran detección de pesticidas basada en la inhibición de esta enzima
contaminantes potenciales del agua subterránea [4]. [8 ± 10]. El rápido progreso en el desarrollo de biosensores fue
Métodos analíticos que se emplean más comúnmente. observado en la década reciente donde el diseño de
en traza determinación ambiental de pesticidas y son biosensores para la determinación de pesticidas con otros
también incluido en la mayoría de las regulaciones legales para análisis se han aplicado enzimas, diferentes métodos de inmovilidad
El monitoreo de contaminantes ambientales es de alto rendimiento. Se han desarrollado zation y los primeros inmunosensores
Cromatografía de líquidos ance y cromatografía de gases con También fueron descritos. Varios artículos de revisión ya están
Varios detectores. Estos métodos se pueden usar con éxito en publicado sobre los logros en este campo [11 ± 17].
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laboratorios altamente especializados, generalmente requieren un apropiado
Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20 ¹ 2002 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 1040-0397 / 02 / 1910-1311 $ 17.50 + .50 / 0
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construcción de biosensores potenciométricos con pH sensible

transistores de efecto de campo [19], electrodo de pH de vidrio [20] y en
configuración de un biosensor serigrafiado con dioctade-
capa de polímero sensible a H ‡ basada en cilmetilamina [21].
Los transistores de efecto de campo se modificaron sol-gel para formar un
matriz de sílice porosa para inmovilizar OPH y mostrar un
respuesta al paraoxon con límite de detección de 1 μM [19].
Reticulación de OPH directamente sobre la superficie del vidrio pH
electrodo permite producir biosensores con detección
límite de 2 μM para paraoxon, parathion, metil parathion y
diazinon [20], con la mayor sensibilidad para paraoxon. UNA
peor límite de detección de 5 μM pero una respuesta muy similar
fue encontrado para paraoxon, parathion, diazinon y chlorpyr-
ifos con el uso de eletrode serigrafiado, donde OPH era
inmovilizado en prepolímero de poli (carbomoil sulfonato)
en la superficie de la capa sensible a H ‡ [21] (Fig. 1).
Una mejora del límite de detección de más de uno
orden de magnitud para paraoxon y metil paratión fue
logrado cuando OPH se empleó en un amperométrico
biosensor serigrafiado [22]. La medición se basó en
La rápida señal anódica de p-nitrofenol en la OPH / Nafion
capa inmovilizada sobre la superficie de carbono impresa. OPH-
el biosensor amperométrico basado también fue hecho por enzima
modificando la pasta de carbono, que opera en un cronoam-
el modo perométrico mostró límites de detección para paraoxon y
metil paratión de 0.9 μM y 0.4 μM, respectivamente [18].
Recientemente con el mismo propósito, el organo inmovilizado
anhidrolasa ácida de fósforo (OPAA) aislada de Alter-
Fig. 1. Vista esquemática del diseño de serigrafía desechable.
biosenor tiométrico para la determinación de la ingesta de organofosforados monas sp. Se ha utilizado la cepa JD6.5 [140]. Selectivamente
secticidas mediante el uso de una hidrolasa organofosforada inmovilizada hidroliza el enlace PF de organo que contiene flúor
en electrodo sensible al pH con referencia integrada Ag / AgCl fosfatos, lo que lo hace adecuado para la detección discriminativa
electrodo [21]. A) vista en sección transversal, B) vista frontal y posterior. de organofosfatos que contienen flúor. OPH muestra
actividad para la hidrólisis de enlaces PO y PF. Dos clases de
mediciones potenciométricas con OPAA han sido
2. Biosensores enzimáticos para la detección directa de
Pesticidas llevado a cabo, con enzima inmovilizada covalentemente sobre sílice
gel y utilizado en mediciones en modo discontinuo con pH de vidrio
electrodo y un biosensor, donde la enzima era covalentemente
Se han utilizado varias enzimas diferentes en el diseño de inmovilizado a la puerta de sílice modificada porosa de un pH-
biosensores electroquímicos directos para la detección de pesticidas Sensitivie transitor de efecto de campo. Concentraciones de diisoprop
tales como la hidrolasa organofosforada (fosfo-triástera) con esto se midió el fluorofosfato de ilo hasta 20 μM
(OPH), hidrolasa de ácido organofosforado (OPAA) y biosensor, mientras que no se observó respuesta con paraoxon o
paration hidrolasa (PH). Demeton-S.
OPH es una enzima que es capaz de hidrolizar organofos- La detección amperométrica de p-nitrofenol también se basa en
plaguicidas de phorus y su aplicación en el diseño de biosensores la determinación del paratión con bioseno serigrafiado
ha sido revisado recientemente [18]. Liberación de protones durante sor con paration hidrolasa inmovilizada [22a, 23]. Detec-
Se utilizó la hidrólisis de compuestos organofosforados para La acción se basa en la reacción que se muestra en el Esquema 1.
Esquema 1.
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Tabla 1. Biosensores enzimáticos serigrafiados para la detección de pesticidas; B: medición por lotes, FIA: medición de flujo.
Enzima inmovilizada Detección Medición Autores Referencias

preparar
Organofosforas hidrolasa Maceta si G ‰ berlein (2000) [21]

Paration hidrolasa Amperio si Saco (2000) [23]
Colinesterasa (hs) Amperio si Skladal (1992) [50]
AChE ‡ BChE Amperio si Skladal (1994) [51]
Dolor Amperio si Hart (1997) [53]
AChE, BChE Amperio si Nunes (1999) [54]
Dolor Amperio si Li (1999) [55]
Dolor Amperio FIA Rippeth (1997) [52]
Dolor Amperio FIA Neufeld (2000) [56]
CHO ‡ AChE (s) Amperio si Palchetti (1997) [61]
BChE, ChO, HRP Maceta si Espinosa (1999) [67]
BChE Amperio si Kulys (1991) [78]
BChE Amperio si Gogol (2000) [79]
ALD, diaforasa Amperio si Noguer (1999) [86, 87]
Dolor Amperio si Noguer (1999) [87]
Multi-AChE Amperio si Bachman (1999) [101]
Tirosinasa Amperio si Wang (1996) [93]
Dolor Amperio si Montesinos (2001) [107]
La enzima se inmovilizó en la capa de polietileno. con AChE en organismos vivos cuando la enzima está bloqueada,
neimina reticulada con glutaraldehído. Mediciones ya no puede participar en la hidrólisis de acetilco-
se llevaron a cabo en un sistema FIA y el uso de un sistema repetitivo línea. Ambos tipos de inhibidores y sustrato reaccionan covalentemente
técnica de pulso en la medición amperométrica elimi- con AChE esencialmente de la misma manera porque
nata la alteración de las reacciones de oxidación inespecíficas. la acetilación del residuo de serina en el centro catalítico es
El límite de detección para paratión se evaluó como 1 mg / L análogo a la fosforilación y la carbamilación. Carba
[23] La paratión hidrolasa también hidroliza eficazmente la dia- enzima mylated restaura su actividad catalítica más rápidamente
zinon y clorpirifos, sin embargo, estos analitos no fueron que la enzima fosforilada [24].
determinado. Una lista de enzimáticos serigrafiados informados El origen de AChE utilizado para la determinación de pesticidas.
biosensores desarrollados para la determinación de pesticidas es basado en la inhibición de la actividad de la enzima tiene un efecto esencial
se muestra en la tabla 1. en el límite de detección obtenido para analitos particulares.
En general, las colinesterasas aisladas de insectos son más
sensible para la detección de insecticidas, que los de otros
3. Biosensores basados en la inhibición de la enzima animales superiores También ya en trabajos muy tempranos con
Actividad acetilcolesterasas de varios insectos con fluorimétrico
detección de una gran diferencia en la sensibilidad hacia varios
Se utilizaron estas determinaciones enzimáticas de pesticidas. pesticidas se informó [25]. Entre varios examinados
mucho antes que la determinación enzimática directa y La especie AChE de cucarachas fue la más sensible y
su uso con varios biosensores electroquímicos es mucho carecía de especificidad. En la determinación de plaguicidas carbamatos
más avanzado. Se pueden realizar con diferentes con biosensores amperométricos serigrafiados con AChE
enzimas, pero son predominantemente procedimientos basados en de eritrocitos bovinos y humanos y anguila eléctrica, el
El uso de colina esterasas. Se emplean principalmente para inhibición más sensible se encontró para el último [26]. Esta
determinación de ésteres organofosforados y carbamatos. observación fue confirmada recientemente para varios organo-
pesticidas de fósforo en determinaciones de la FIA con foto-
detección térmica [27]. Una mejor sensibilidad que la anguila eléctrica.
3.1. Acetilcolinesterasa Se mostró AChE para AChE de la mosca de la fruta (Drosophila
Melanogaster) (dmAChE), tanto para organofosforados como
El papel de la acetilcolinesterasa (AChE) en organismos vivos pesticidas carbamatos [28, 29]. Aún más adaptado a
es la saponificación catalítica del neurotransmisor la detección de trazas de insecticidas es mutante Y408F dmAChE
acetilcolina, que se une primero al sitio activo de la [28] La sensibilidad promedio a los insecticidas calculada en base a
enzima y luego rápidamente hidrolizado. Ésteres como en datos experimentales obtenidos para 21 carbamatos y
compuestos organofosforados o derivados de carbamic compuestos organofosforados para mutantes de dmAChE
los ácidos se convierten de una manera idéntica, sin embargo, los fósforos fue mucho mayor que para otras enzimas investigadas
La AChE tardía o carbamilada se hidroliza muy lentamente. Tal (Figura 2).
atecrtaivseidsaedudteilipzeasatincaidlíatiscbam
aseandtae.enEnlainintehriabcicióonedsedaecpeteislctiocliidnaass de E
penstdiicsiedñaos dbeasbaidoossenesnolraesinehleibcitcroióqnuídmeilcaoascpeatirlacodleitneersmteirnaascaión
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la aplicación AChE se inmovilizó covalentemente en el

superficie del electrodo de carbono vidrioso cubriendo la superficie
con capa de polietilenimina, y midió una solución
contenía sustrato de acetiltiocolina y hexacianofer
tasa (III) [37]. Tiocolina liberada en reacción enzimática
fue oxidado con hexacynaoferrate (III), lo que causó una
cambio del potencial redox. Durante 10 minutos de inhibición, el
El límite de detección para diclorvos se evaluó como 0.2 μM.
La detección rápida de insecticidas anticholesterasa también fue
informado por una luz reversible potenciométrica direccionable
sensor (LAPS) con un paso enzimático adicional. LAPS
pertenecer al grupo de transistores de efecto de campo donde la detección es
basado en la diferencia potencial entre el aislante de la puerta y
solución electrolítica [129]. En LAPS, la corriente transitoria es
Fig. 2. Efecto del origen de la acetilcolinesterasa en el promedio
medido, que es inducido por un haz de luz y como un
sensibilidad a los insecticidas [28]: Ce, Caenorhabditis elegans; Ee
Anguila electrica; Be, eritrocito bovino; Tc, Torpedo californica; Dm Una característica atractiva de LAPS es la capacidad de abordar diferentes
Drosophila melanogaster; Y408F, mutante. regiones del semiconductor con luz en lugar de con
cables fijos En tales biosensores para la determinación de
pesticidas biotinilados AChE fue inmovilizado en el
transductores de señal potenciométrica o amperométrica membrana de nitrocelulosa biotinilada a través de una straptavidina
son utilizados Comúnmente, para la detección potenciométrica uno puente. Fueron utilizados para la detección de fluorofosfato
puede esperar un rango útil más amplio de dependencia de la señal (DFP) y ecotiofato [38], y también muchos otros
frente a la concentración de analito a expensas de más lento insecticidas [39]. Características importantes de LAPS para
tiempo de respuesta en comparación con los detectores amperométricos. Cuandola detección de inhibidores de AChE es velocidad (ocho muestras
la formación de señal está conectada a un paso biocatalítico, ensayado simultáneamente), precisión y reversibilidad. Un bien
sin embargo, tal situación no siempre tiene lugar. se informó sensibilidad especialmente para paraoxon y bend-
En los biosensores potenciométricos, principalmente la formación de yocarb (10 nM).
ácido acético durante la hidrólisis de acetilcolina catalizada por Un número mucho mayor de biosensores para pesticidas
AChE se utiliza: La detección basada en la inhibición de AChE se desarrolló con
detección amperométrica que con potenciométrica. En su
Dolor configuración más simple con el uso de AChE inmovilizado
À3
Acetilcolina Colina ‡ Ácido acético solo, la detección de la actividad enzimática residual después de la inhibición es
basado en la oxidación anódica de tiocolina formada durante
Por lo tanto, la enzima se inmovilizó de varias maneras en el hidrólisis enzimática del sustrato acetilcolina:
superficie de un electrodo de vidrio de pH [30 ± 32], de un metal
electrodo de antimonio [33, 34], en la puerta de archivo sensible al pH Dolor
À3
transistor de efecto [35, 36], y también en la superficie del óxido La acetilcolina ‡ H 2 O Tiocolina ‡ ácido acético
electrodos como Pd / PdO e Ir / IrO 2 [30]. AChE era
inmovilizado en la capa de polímeros reticulados [30 ± 32], 2 Thiocholine À3 Dithio-bis-choline ‡ 2 H ‡ ‡ 2e À
en capa de albúmina de suero bovino reticulado [31, 33, 35, 36]
o en varias membranas [31, 32, 34]. Con un vaso de pH Como sustrato, también se puede usar acetato de 4-aminofenilo y
electrodo y límites de detección de tiempo de inhibición de 1 h para entonces la detección amperométrica se basa en la oxidación de 4-
se evaluaron paraoxon, malatión y paratión metilo aminofenol [41, 42].
en el rango de 0.1 a 1 nM [30]. En comparación de varios Con mayor frecuencia en biosensores amperométricos, una enzima es
métodos de inmovilización de AChE como el más estable inmovilizado en la superficie de un electrodo inerte, por ejemplo, en
el sistema con el uso de membranas de red de nylon fue electrodo de platino, o puede quedar atrapado en una capa de
encontrado [31]. Para biosensor con electrodo de antimonio un muy poli (alcohol vinílico) con grupos de estiril-piridinio (PVA-
se informó una respuesta rápida (10 s) con límite de detección para SbQ) [29, 43 ± 45], en la superficie del electrodo de grafito por
triclorfan igual a 0.12 ppb (10% de inhibición con 50 min unión covalente con carbodiimida [46], o en un filtro de nylon
Tiempo de incubación). Mucho peor capacidad de detección para el mismo membrana que cubre el electrodo de disco de carbono vidrioso [41,
Sin embargo, se informó el analito para los ENFET AChE [35, 36] 42] La estabilidad de los sistemas con AChE inmovilizados en el
un límite de detección para DFP (diisopropil fluorofosfato) en capa de polímero o en membrana reticulada con BSA fue
El tiempo de inhibición de 20 min alcanzó un nivel tan bajo como 10 À12 M [36]. estimado para 3 ± 4 semanas. Para biosensor con PVA-SbQ a
Para cada medición se utilizó un biosensor recién preparado el límite de detección para paraoxon en condiciones de flujo fue
usado. determinado como 0.3ppb [44] y para clorpirifos oxon
Como transductor potenciométrico de inhibición de la actividad de 24 ppb [45]. El reemplazo de eeAChE (de eléctrico
acetilcolinesterse también se puede usar un electrodo inerte para anguila) con dmAChE en las mismas condiciones permite un menor
medición del cambio potencial redox. En reportado límite de detección de clorpirifos oxón hasta 1,3 ppb [29].
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Para el sistema con acetato de 4-aminofenilo como sustrato a

comparación de mediciones con inhibición en presencia
de sustrato y preincubación de biosensor con inhibidor
se informó, donde se encontró una mejor detectabilidad en el
último caso [41]. Durante 3 minutos de preincubación, el límite de
se encontró detección 4 y 13 nM para paraoxon y carbaryl,
respectivamente. Siguiente medición con el mismo sensor
requirió al menos 4 h de reactivación en 2-piridinaaldoxima
metioduro En mediciones con biosensores con grafito
electrodo con detección AChE inmovilizada covalentemente
valores límite 1 y 0.1 nM para triclorfón y oxofosfol
fueron reportados, respectivamente [46].
También se pueden producir biosensores con acetilcolinesterse
con electrodos compuestos epoxi. Una ftalocianina de cobalto
el compuesto epoxi de carbono modificado AChE se inmovilizó
en red de nylon [47]. Para dicho sistema, la detectabilidad de
determinación se comparó para inmovilizado y soluble Fig. 3. Gráficos de calibración para la determinación de paraoxon usando
10 minutos de preincubación con muestra obtenida con una serigrafía
enzima. Para paraoxon, carbaryl, heptenofos y malathion
biosensor amperométrico AChE ( * ) y con la misma cantidad de libre
valores límite de detección de 12 ppb a 1.8 ppm con el
enzima ( ^ ) [50].
Se obtuvieron AChE inmovilizados. La enzima puede ser también
inmovilizado con éxito en la fase compuesta y
La restauración de la actividad inicial se puede hacer puliendo su
superficie [48]. Para dicho sistema, los límites de detección informados para uno para obtener una respuesta sensible a un grupo más amplio de
carbofuran y carbaryl fueron 2.2 y 20, respectivamente, y pesticidas [51]. En la determinación de carbofurano y propox-
27 y 22 para paraoxon y diclorvos. Después de la modificación de ud. en jugos de vegetales enriquecidos sin ningún tratamiento previo
dicho biosensor mediante la adición del mediador TCNQ a la Se informaron resultados satisfactorios para el carbofurano a concentración
compuesto para reducir el potencial de detección de nivel de tración de 10 a 125 ppb con 10 minutos de incubación [26].
tiocolina y uso de AChE inmovilizado en aminado Se demostró también que los electrodos donde la capa de enzima
Particula una mejora de 10 veces del límite de detección de carbaryl habían sido serigrafiados, capaces de detectar plagas
se logró [49]. Cides en niveles de 10 À8 M en comparación con aquellos donde la enzima
Se ha prestado especial atención al diseño de capa había sido fundida a partir de la solución [53]. Pantalla impresa
biosensores amperométricos de tipo tira, como tal construcción Se utilizaron biosensores para la determinación de algunos N-
parece ser el más adecuado para la aplicación de campo como un cribado metilcarbamatos (aldicarb, carbaryl, carbofuran, methom-
prueba de presencia de analito. Primero tal desechable ilo, propoxur) en muestras enriquecidas de frutas y verduras [54],
biosensores con colinesterasas inmovilizadas han sido y también en soluciones de hexano / agua (4: 1), donde para-
producido manualmente empleando plástico cubierto de cobre El límite de detección de oxones se evaluó como 1,4 ppb [87].
hojas utilizadas comúnmente para producir circuitos electrónicos Los biosensores AChE serigrafiados también se emplearon en
[50, 51]. En los últimos años están hechos con serigrafía detectores de flujo continuo en sistemas de inyección de flujo [52, 56].
tecnología sobre soportes de polímero o cerámica [26, 52 ± 56, Del mismo modo, AChE inmovilizado en los poros reticulados.
87]. Una enzima se inmovilizó en una capa de grafito que contenía Se utilizó carbono vítreo como biorreactor en el sistema FIA [57].
ing cobalto ftalocianina [26, 50 ± 54] o TCNQ [55], o en Determinación amperométrica de pesticidas basada en
membrana de nylon que cubre el electrodo serigrafiado en un La inhibición de las colinesterasas también se puede llevar a cabo en
detector de flujo continuo [56]. Una enzima fue unida por sistemas bienzimáticos con paso enzimático adicional que implica
reticulación con glutaraldehído sin otros compuestos ing colina oxidasa. En la reacción de oxidación de colina
nents [50], o con la adición de albúmina de suero bovino [26, 51], catalizado por la colina oxidasa (ChO) se consume oxígeno
polialcohol [52] o hidroxietilcelulosa [53]. En algunos durante la reacción y se produce peróxido de hidrógeno, por lo tanto,
Fundas de una delgada membrana externa de poliuretano para evitar El cambio de concentración de una de estas especies puede ser el
se aplicó la capa de enzima que se lavaba [53]. Con Base para la respuesta bienzimática según las reacciones:
El uso de colinesterasa del suero de caballo es una ventaja de
El uso de enzimas inmovilizadas para inhibición basada Dolor
La acetilcolina ‡ H 2 O À3 Colina ‡ Ácido acético

Se demostró que la medición obtenía un rango más amplio de
respuesta [50] (Fig. 3). También acuerdo satisfactorio fue
encontrado entre la magnitud de inhibición teóricamente esperada ChO
À3
y el obtenido experimentalmente. Límites de detección para Colina ‡ 2O 2 ‡ H 2 O Betaína ‡ 2H 2 O 2
paraoxon, diclorvos y carbaryl se estimaron en 0.3, 1.2
y 11 nM, respectivamente. Las determinaciones bienzimáticas se llevan a cabo utilizando biosen-
La aplicación de acetil inmovilizado simultáneamente Sor con solo ChO inmovilizado o con ambas enzimas
la colinesterasa y la butirilcolinesterasa (BChE) permiten inmovilizado, AChE y ChO.
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En el primer caso con biosensores de colina, hidrógeno ya. Usando BChE también en una amplia gama de potenciométricos
el peróxido se puede medir con electrodo Pt en anódico y biosensores amperométricos se han desarrollado con
polarización con oxidasa inmovilizada en la membrana Diversas posibilidades de su uso práctico para la determinación
[58 ± 60] o en configuración serigrafiada inmovilizada por de pesticidas.
adsorción de solución acuosa en la superficie de En biosensores potenciométricos para la detección de ácido butírico.
carbón activado con rutenio [61]. La colina oxidasa fue formado en hidrólisis enzimática de butirilcolina:
inmovilizado en membranas de nylon [58] o comercial
membranas de Immobilon preactivadas [59, 60]. En comparación BChE
Butirilcolina ‡ H 2 O À3 Colina ‡ Ácido butírico

isón a sistemas con dos enzimas inmovilizadas, un sistema
con AChE en solución proporciona límites de detección más bajos,
aunque la determinación lleva más tiempo [58]. En Se utilizan diferentes electrodos sensibles a los cambios de pH. Con un
determinación de paraoxon y aldicarb el límite de detección El electrodo de vidrio de pH BChE se inmovilizó en un metacrilato.
fue de 2 ppb. En tal sistema también el uso de AChE y BChE polímero [69], por reticulación en membrana de nylon [69], en
se comparó, proporcionando esa menor especificidad de BChE membrana preactivada comercial Pdy Biodyne [69, 70],
da como resultado una mayor inhibición enzimática [59]. En el mismo trabajo uny también en un papel de calco blanco [71]. Comparación de
Se informó una recuperación satisfactoria para mediciones con diferentes métodos de inmovilización no han demostrado ser significativos
BChE para agua de río enriquecida con paraoxón a 1.5ppb No hay diferencias en la sensibilidad de respuesta y detección
nivel de concentración Un biosensor impreso en pantalla, para el cual Se encontraron límites para pesticidas en el rango de 0.2 a
El límite de detección de carbofurano se evaluó como 2 ppb ha 10 ppm [69]. Una pérdida relativamente rápida de actividad de la enzima fue
ha sido empleado para ensayos de detección rápida de pesticidas y observado para membranas de poliamida preactivadas. Un desarrollo
verduras [61]. El biosensor opeh BChE fue empleado para pruebas preliminares
Numerosas configuraciones diferentes de biosensores tienen de contaminación total de desechos municipales e industriales [71]. UNA
se ha informado cuando dos enzimas están inmovilizadas. Ellos El biosensor BChE también se preparó mediante la formación de un
fueron atrapados en la capa de PVA-SbQ en la superficie de un membrana enzimática mediante el recubrimiento de un poliur hidrófilo delgado
ultramicroelectrodo de fibra de carbono [62], en una celulosa película de etano mezclada con enzima sobre un poliuretano H ‡ -
membrana de triacetato de un sensor de oxígeno [63], en un membrana sensible [72]. La respuesta al paraoxon fue
electrodo de Pt que cubre la membrana para la detección de hidrógeno reportado en el rango de 10nM a 10 μM. Respuesta a
peróxido [64], en pasta de grafito con adición de tetratia- el sustrato butirilcolina depende esencialmente del componente
mediador de fulvaleno [65], y también en un lípido con soporte de metal La posición del poliuretano utilizada para la preparación de la enzima.
bicapa de conjugados de enzimas avidina y biotinilados capa. Biosensor que exhibe un límite de detección para paraoxon de
fosfolípidos [66]. No todos estos sistemas bienzimáticos fueron También se prepararon 2 μM cubriendo un cultivo térmico
examinado para la detección inhibitoria de pesticidas. En el electrodo de óxido de iridio con una capa de BChE en celulosa
sistema con un sensor de oxígeno, una comparación de AChE y acetato [73]. El límite de detección de 1 μM para triclorfón fue
Se informó BChE, ambos con colinesterasas en solución reportado para BChE ENFET, donde en la puerta de efecto de campo
e inmovilizado en la membrana. El mejor límite de detección. transistor una capa de enzima en PVA-SbQ fue formada por
Se informaron valores (10 ± 150 ppb) para el sistema con fotocurado en luz ultravioleta [74].
BChE en solución [63]. En tal sistema para el malatión un muy Casi siete órdenes de magnitud límite de detección inferior
se obtuvo una recuperación satisfactoria en la concentración para los mismos pesticidas se informó para un potenciométrico
rango 75 ± 600 ppb para la determinación en extractos enriquecidos de biosensor con transductor redox, donde en la superficie de la
suelo y agua del lago. En la forma serigrafiada de tales electrodo compuesto de carbono-polietilenimina BChE,
sistema bienzimático además de AChE y ChO también caballo- ChO y HRP fueron exitosamente entrecruzados con gluta-
la peroxidasa de rábano (HRP) se inmovilizó proporcionando raldehído [75]. El límite de detección se evaluó después de
límites de detección de plaguicidas organofosforados en submuros 15 minutos de tiempo de incubación y para mediciones con BChE en
rango cromolar de concentración con un tiempo de ensayo global solución como 1 nM, entonces, fue de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud
de 20min, aunque los límites de detección para varios peor que para la enzima inmovilizada. Para un similar
los pesticidas organofosforados pueden diferir en 3 órdenes de sistema, donde en papel de calco una capa de carbono teflonada
magnitud [67]. se formó, en el que HRP se sorbió físicamente, y luego
ChO y BChE se entrecruzaron con glutaraldehído,
El límite de detección estimado para el triclorfón fue de solo 5 nM
(1,3 ppb) a los 20 min período de incubación [76].
3.2. Butirilcolinesterasa
Determinaciones amperométricas con biosenores con im-
BChE se emplea casi con la misma frecuencia para el diseño de Los BChE movilizados se basan en la detección anódica de tioco-
biosensores para la detección inhibitoria de pesticidas como AChE. En línea formada por hidrólisis enzimática de butirotioco-
El control de la exposición de los humanos a la colinesterasa línea, por lo tanto, en este caso, una configuración similar de biosensores
inhibidores como biomarcadores mediciones de AChE en eritrocitos está diseñado como para AChE. Para la oftalcianina de cobalto
Se han desarrollado rocitos y BChE en plasma [68]. electrodo compuesto de epoxi de carbono modificado y enzima en
Informes sobre la comparación de ambas esterasas para la detección de la membrana de nylon, límites de detección para paraoxon y
los plaguicidas se han mencionado anteriormente en varios casos, heptenophos fueron 1,5 y 8,4 ppb, respectivamente [47]. Similar
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biosensor con electrodo compuesto sin mediador fue con acetolactato sintasa para la determinación de sulfonilur-
utilizado en la determinación del flujo por inyección de diazinón [76a]. los ea herbicidas [83] por atrapamiento de ALS en la membrana
uso de BChE en lugar de AChE en lo mencionado anteriormente con el uso de un polímero fotocurado PVA-SbQ y el uso de este
biosensor con TCNQ y colinesterasa en sílice aminada membrana en un electrodo de oxígeno amperométrico [84].
partículas en el compuesto epoxi de grafito mejora la La inhibición de la actividad oxigenasa de ALS por pesticidas es
límite de detección para paraoxon en aproximadamente un orden de medido en base a la reacción:
magnitud [49]. Se mostró anteriormente también que en lugar de
ALS
compuesto de grafito epoxi en el biosensor con BChE a Piruvato ‡ O 2 À3 Peracetato ‡ CO 2
electrodo de pasta de grafito con ftalocianina de cobalto y
BChE en la membrana se puede utilizar con éxito [77]. En determiantion de herbicidas sulfometuron metil y
BChE también se ha empleado en amperios serigrafiados clorsulfon el límite de detección durante 30 minutos de tiempo de inhibición
biosensores métricos. En los primeros trabajos con tales biosensores se evaluó como 1 μM. También se demostró que ALS
con colinesterasas fue una pasta de grafito con mediador atrapado en PVA-SbQ es mucho más estable en el tiempo que
utilizado, y el rango de detección de fenilmetilsulfonil- enzima libre [83], aunque la potencia de inhibición de
el fluoruro y el diisopropil fluorofosfato se evaluaron como sulfonilurea e imidazolinonas con enzima atrapada es
0,06 a 8 ppm [78]. BChE fue inmovilizado cubriendo el ligeramente más pequeño que el observado con la enzima libre.
electrodo de trabajo con la enzima del tampón
solución que contiene glutaraldehído. En otro biosensor
la construcción BChE fue inmovilizada en una capa de Nafion por
3.4. Aldehído deshidrogenasa
reticulación con vapores de glutaraldehído [79]. Recientemente un
biosensor serigrafiado se informó con un grafito Los fungicidas de ditiocarbamato inhiben aldehído deshidrógeno
compuesto epoxi y BChE inmovilizado por reticulación ase (ADH). Para producir un biosensor amperométrico
con glutaraldehído [141]. Para un tiempo de inhibición de 15 min. con esta enzima también se diseñó un sistema bienzimático
Se han reportado límites de detección de 0.047 ppb y 0.165 ppb con diaforasa que opera de acuerdo con las reacciones:
para carbofurano y paraoxon, respectivamente. Buenas recuperaciones
ADH
‡
para la determinación de paraoxon y carbofurano en el grifo claveteado À3
Propionaldehído ‡ NAD Ácido propiónico
el agua y el jugo de naranja también se han reportado para esto
‡ NADH ‡ H ‡
biosensor.
Análogamente a AChE, los biosensores bienzimáticos de BChE fueron Diaforasa
diseñado, donde para la detección de colina la colina oxidasa era NADH ‡ 2Fe CN ... † 3À À3 NAD ‡ ‡ 2Fe CN... † 4À
6‡ H ‡
66
usado. En este sistema mencionado anteriormente con una membrana
biosensor de colina y BChE es la solución, límites de detección para
varios compuestos organofosforados estaban en el nivel de Los cambios en la concentración de hexacianoferrato (II) son
varios ppb [59]. Valores similares de límite de detección ± 2 ppb para monitoreado amperométricamente con un electrodo Pt [83], o
paraoxon y 6 ppb para malatión ± se informaron para un biamperometricamente con dos electrodos de platino [85]. UNA
biosensor donde un electrodo de Pt estaba cubierto con un nylon biosensor biamperométrico también se desarrolló en una pantalla
membrana con BChE inmovilizado y ChO [80]. Para esto configuración impresa con pasta de carbono pulverizada con Pt [86,
biosensor se obtuvieron buenos resultados de recuperación para 87]. En todos estos biosensores, ambas enzimas han sido
determinación de malatión en concentración de 2 ± 6 ppm inmovilizado en una capa de PVA-SbQ. Detección reportada
nivelar en extractos claveteados de suelos y aguas. Para un similar los límites fueron para maneb 50 ppb [83] y 1.5 ppb [85], y para
biosensor con enzimas inmovilizadas en triacetato de celulosa sensores serigrafiados desechables de 8 ppb para nabam [86] y
se informaron límites de detección de membrana para aldicarb 9 ppb para zineb [87].
(50ppb) y paraoxon (3ppb) [81]. Inmovilización de
BChE y ChO en gel de carragenano kappa en diálisis
membrana del electrodo de oxígeno permitida para la determinación
3.5. Fosfatasa ácida
de pesticidas en una mezcla de cloroformo / n-hexano (1: 1) [81,
82] Los límites de detección para varios pesticidas examinados estaban en Hidrólisis biocatalítica de glucosa-6-fosfato en el
el rango de 0.5 a 4.8ppb [82]. Determinaciones de la presencia de fosfatasa ácida (AP) se inhibe reversiblemente
carbaryl y paraoxon en extractos de aguas naturales enriquecidas en por plaguicidas organofosforados y carbamatos. Ampero
El nivel de 1 ± 30 ppb dio recuperaciones del 89 al 118% [81]. La detección métrica de esta inhibición requiere un bienzimático
sistema con glucosa oxidasa (GOD) según reacciones:
AP
3.3. Acetolactate Synthase GlucoseÀ6Àphosphate ‡ H 2 O À3 Glucosa
Las sulfonilureas y las imidazolinonas son inhibidores reversibles ‡ fosfato inorgánico
de acetolactato sintasa (ALS), una enzima esencial para
DIOS
biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada. Temprano À3
Glucosa ‡ O 2 Gluconolactona ‡ H 2 O 2
los estudios indicaron la posibilidad de preparar un biosensor
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1318 M. Trojanowicz
y medición final de peróxido de hidrógeno. Ambas enzimas los autores de los artículos informaron estudios sobre el efecto de la
fueron inmovilizados en membranas dialíticas separadas usando el presencia de componentes químicos particulares en determina-
prepolímero de poliazetidina como reactivo inmovilizante [88]. ción de pesticidas basada en la inhibición de la actividad de
En el biosensor en un electrodo Pt para la determinación de colinesterasas
peróxido de hidrógeno una membrana de acetato de celulosa, luego dos En la determinación de pesticidas organofosforados con un
membranas enzimáticas y una membrana de diálisis fueron biosensor amperométrico con butirilcolinas inmovilizadas
metido. Durante 20 minutos de inhibición, el límite de detección para terase y colina oxidasa el efecto de varios inorgánicos
malathion, paration metil y paraoxon fueron 3, 0.5 y iones y compuestos orgánicos fueron examinados [80]. los
5 ppb, respectivamente, mientras que para aldicarb 40 ppb. Se observó una respuesta evidente de un biosensor para la nicotina
Esta enzima se empleó en un biosensor potenciométrico. (desde 2 μM), plomo (desde 10 μM) y fluoruro (desde 5 μM).
con electrodo de pH interno en la matriz de biosensores para Las dos últimas especies pueden interferir en algunas muestras reales.
cribado de plaguicidas y metales pesados [89]. En la investigación de AChE, la inhibición por los tensioactivos
dodecilbencilsulfonato (12.5 ppm) y dodecilsodio
sulfato (50 ppm), y también por cromo (VI) a 25 ppm fueron
informado [96]. Sin embargo, estos niveles son muy altos y
3.6. Tirosinasa
puede ocurrir solo en desechos muy contaminados. Una fuerte inhibición
La tirosinasa (polifenol oxidasa) cataliza la oxidación de de AChE también se encontró para As (III), pero no para As (V) [97].
monofenoles a o-difenoles y luego a o-quinonas: También se demostró que esta observación puede ser explotada para
especiación de As (III) en el rango de concentración de 0.2 nM
Tirosinasa a 1 μM. En estas determinaciones, AChE se inmovilizó en
Monofenol ‡ O 2 À3 Quinona ‡ H 2 O
La superficie de un electrodo de grafito.
También se informó la inhibición de AChE en caso de cobre.
El progreso de la reacción puede seguirse amperométricamente. (10 a 20% a 3 ppm de Cu) e iones de zinc (10% a 5 ppm de Zn)
por reducción de quinona. En varios artículos publicados fue [98] Sin embargo, también se demostró que la comovilización de
demostrado, que la inhibición reversible de la tirosinasa puede ser tanto la albúmina como la enzima en el biosensor pueden reducir estos
utilizado para la determinación de varios pesticidas de diferentes efectos
estructura. Inhibición por atrazina y cloroisopropil fen-
El nilcarbamato (ClPC) a nivel micromolar se mostró con
El uso de un biosensor amperométrico con carbono vítreo 5. Determinaciones multicomponentes de plaguicidas
electrodo y un monómero-tirosinasa anfifílica de pirrol Basado en la inhibición de la enzima
revestimiento [90]. Como sustratos de catecol para ClPC y dopamina
para atrazina fueron empleados. Otros tres carbamatos Una ventaja importante de cada método analítico es el
los pesticidas inhibieron la tirosinasa en un bioseno amperométrico posibilidad de determinación simultánea de varios análisis
sor en un medio de micelas invertidas [91]. Con fenol como prueba en la misma carrera. De ahí el predominio en lo moderno
sustrato para dietilditiocarbamato de ziram, diram y zinc análisis de técnicas cromatográficas, ICP-AES o ICP-
Los límites de detección se evaluaron como 0.074, 1.3 y 1.7 μM. SRA. Aunque se demostró, que los resultados de un diferente
Se informaron buenos resultados de recuperación para ziram en púas mecanismo de respuesta de inhibición de un biosensor AChE a
Muestras de manzana. La tirosinasa también es inhibida por organofos- Los pesticidas organofosforados y carbamatos no son simplemente
pesticidas para el fósforo, que se mostró para el diazinón y aditivo [99], varios intentos de desarrollar multicomponente
diclorvos en mediciones cronoamperométricas con un Se han informado mediciones simultáneas con el
electrodo de carbono vidrioso con tirosonasa reticulada en el uso de varios biosensores para obtener más información
superficie [92]. Límites de detección en el nivel micromolar de sobre muestra analizada. Usando quimiometría apropiada
las concentraciones se informaron en determinaciones de 2,4-D procesamiento de datos, se puede obtener más información sobre una muestra
y dietilditiocarbamato a través de la inhibición de la tirosinasa esperado con un mayor número de usos simultáneos
incorporado en pasta de grafito en una serigrafía biosensores de diferente sensibilidad a diversos analitos. por
biosensor amperométrico [93]. detección simultánea de pesticidas y metales pesados
mediciones con biosensores con AChE, alcalinos y
fosfatasa ácida se han llevado a cabo [89, 100]. por
4. Interferencias en los métodos de pesticidas determinación simultánea de paraoxon y carbofurano a
Determinación basada en la inhibición biosensor multielectrodo impreso en pantalla con cuatro tipos de
se aplicó AChEs nativo o recombinante [101]. Multi-
En el análisis de muestras naturales con matrices complejas varias biosensor de serigrafía de electrodos con variantes de ingeniería
diferentes factores pueden afectar el resultado de la determinación de Drosophila melanogaster AChEs se utilizó para múltiples
dependiendo de la enzima utilizada y el método de su detección de analitos de organofosforados y carbamatos [102].
inmovilización como el pH de la solución de muestra, fuerza iónica En el sistema con tres biosensores potenciométricos con
o contenido de oxígeno disuelto. Debido a la complejidad de electrodo de pH interno y AChE inmovilizado y fos-
procesa biocatalítica numerosas especies adicionales además fatasa la inhibición relativa de once organofosfo-
los analitos pueden inhibir la enzima utilizada [94, 95]. En varios se determinaron los pesticidas rus y carbamatos [89]. los
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Fig. 4. Efecto del disolvente orgánico sobre la inhibición de AChE inmovilizado después de 30 minutos de incubación con paraoxón 10 μM usando 1,25 mM
sustrato de cloruro de acetiltiocolina a 308 ° C [104]. AChE inmovilizado en una capa PVA-SbQ unida por fotocross en el electrodo Pt.
grado de inhibición por biosensores de los pesticidas examinados exhiben suficiente nivel de límite de detección para su directo
y se midieron varios iones metálicos. El llevado a cabo utilizar para pruebas de detección en muestras de aguas naturales o suelo
los estudios proporcionaron un esquema de detección en el que basarse en extractos Por lo general, una medida de biosenor tiene que ser
mediciones con 3 biosensores se pueden evaluar mejor precedido de preconcentración a solvente no acuoso.
El tipo de analitos presentes en la muestra. Por el uso de Por lo tanto, en numerosos estudios se presta una gran atención al
diferentes métodos quimiométricos multivariados con modelo efecto de solventes orgánicos en determinaciones basadas en
mezclas de dos pesticidas y mercurio se demostró inhibición de enzimas y a la posibilidad de realizar
que los efectos de mezcla aditiva, antagónica o sinérgica pueden mediciones en una fase orgánica.
estar registrado como ocurriendo en el medio ambiente [100]. El efecto de los solventes orgánicos depende de su polaridad.
Las redes neuronales artificiales (ANN) ya han sido y en la forma de la enzima utilizada. Relativamente tal
demostrado ser útil para la interpretación de datos experimentales en Se llevaron a cabo investigaciones para colinesterasas, la mayoría
Análisis de mezclas de compuestos fenólicos con el uso de Frecuentemente utilizado para la determinación inhibitoria de pesticidas.
Varios biosensores exhiben diversas respuestas a diferentes La actividad de AChE, disuelta en solución e inmovilizada
analitos [103]. En la determinación, con el uso de un en PVA-SbQ, se examinó en presencia de diferentes
biosensor multielectrodo desechable con cuatro diferentes solventes que muestran mejor resistencia a la inactivación en
AChEs, de mezclas sintéticas compuestas de hasta 20 ppb de miscible con agua solventes orgánicos de los inmovilizados
se informaron resultados satisfactorios de paraoxon y carbofurano enzima [104]. El contacto con disolventes orgánicos no polares.
que se obtuvieron mediante el procesamiento de datos ANN con una media Parecía tener poco efecto sobre la estructura de la enzima. los
error de 0.9 y 1.4 ppb para paraoxon y carobofuran, Se descubrió que AChE inmovilizado era catalíticamente activo después de
respectivamente [101]. Usando este procedimiento para el análisis de incubación en disolventes como ACN o butanol, que
muestras de aguas residuales enriquecidas con capacitación de la red con desnaturalizar e inactivar la enzima libre. Excepto por
los 50 conjuntos de datos la recuperación obtenida fue del 67% para tetracloroetano y cloroformo la inhibición de libre
paraoxon y 118% para carbofurano. Solicitud en más tarde AChE por pesticidas organofosforados y carbamatos es
trabajo dmAChE mutantes e inmovilización de enzimas en mantenido para pesticidas en solventes orgánicos. Para inmovil
PVA-SbQ afectó positivamente los resultados del análisis de dos enzima lizada, excepto acetato de butilo y éter, el inhibidor
mezclas de componentes de paraoxon y carbofurano [102]. por La tasa de acción por insecticidas en varios solventes orgánicos fue alta
Ensayo de 40 min con un límite inferior de detección de 0.5 ppb para (Fig. 4) [104]. Como procedimiento más apropiado fue
analito se obtuvo una discriminación con errores de propuesto primero para incubar con el pesticida en orgánico
predicción de 0.4 y 0.5 ppb para paraoxon y carbofuran, disolvente seguido de detección en solución tamponada. Cierto
respectivamente. El sistema optimizado fue em- mejora de la resistencia de AChE a miscible con agua
ployed para la determinación de la mezcla de parfaoxon y Los disolventes, especialmente el dioxano, se pueden lograr modificando
malaoxon Nuevamente, las determinaciones se llevaron a cabo con el ción de la enzima por unión covalente de metoxipoli-
uso de 50 conjuntos de datos para entrenar la red neuronal. etilenglicol [105]. Resultados informados anteriormente para anguila eléctrica
AChE también se confirmó para dmAChE que muestra que el
La presencia de etanol (hasta 20%) causa una reducción dramática
6. Mediciones en disolventes no acuosos de la afinidad de AChE al sustrato de acetiltiocolina y
inhibidores de pesticidas [106]. El efecto del acetonitrilo, etanol
Un número muy limitado de electroquímicos desarrollados. y DMSO también se probó en el rango 0 ± 30% para
biosensores enzimáticos para la determinación de pesticidas determinación de clorpirifos-etil-oxon con tamiz-
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1320 M. Trojanowicz
biosensor AChE impreso con TCNQ en la capa de carbono y Aplicación exitosa en un sistema FIA con espectrofoto-
AChE en PVA-SbQ [107]. Niveles de hasta 5% de acetonitirilo y detecciones métricas [110] y conductividad [114] para el mismo
Señal de mejora de etanol al 10% para el sustrato AChE. El propósito también se informó para 1,1'-trimetilen-bis (4-
Adición de polietilenimina a la enzima antes de la bromuro de formilpiridinio) dioxima, mientras que en el sistema
la inmovilización le permite tolerar el contenido de acetonitrilo con detección amperométrica para la regeneración de fósforos
a 15%, y debido a una mejora de señal de aproximadamente 75% colinesterasa 1,1'-trimetilen-bis [4- (hidroxiimi-
Las determinaciones se llevaron a cabo con acetonitrilo al 5%. Medida se utilizó bromuro de no-metil) piridinio [76]. Regenera-
Se realizaron urements por incubación del electrodo en ción con 2-PAM se basa en la reacción de la fosforilada
la solución tampón-solvente-pesticida y la medición de enzima con oxima para formar oxima fosforilada [104]. Como
La corriente de salida residual después de la adición de sustrato. por se mostró recientemente para un biosensor con AChE y ChO
10 minutos de tiempo de incubación, un límite de detección de 0.25 nM (0.11 pprbe)ticulado con albúmina en la superficie del platino
se logró para clorpirifos-etil-oxon [107]. electrodo, en el caso de una enzima débilmente inhibida su
Un límite de detección muy bajo 1.4ppb para paraoxon fue La regeneración puede tener lugar en la solución del sustrato,
reportado en determinaciones con AChE serigrafiado o incluso en la solución tampón [111]. Esto se observó para
biosensor amperométrico en una mezcla de hexano y agua inhibición por baja concentración de pesticida o inhibición por
(4: 1) [87]. mayor concentración pero a un tiempo de inhibición más lento. los
La influencia de varios solventes orgánicos miscibles en agua La optimización de un procedimiento de regeneración es de particular importancia.
también se examinó en la determinación de carbofurano con importancia en mediciones de flujo rápido.
sensor amperométrico serigrafiado con ChO inmovilizado
y AChE en solución. Tampón de borato que contiene 1%
el acetonitrilo exhibió la menor influencia en la actividad enzimática 8. Determinaciones de inyección de flujo basadas en
[61] Inhibición de enzimas
Otro sistema interesante para mencionar es la inhibición de
peroxidasa de rábano picante (HRP) por etilentiourea, que En los últimos 20 años, el análisis de inyección de flujo (FIA) ha sido
es un producto metabólico y de degradación primario del etileno el método de mecanización más comúnmente aceptado y
pesticidas bisditiocarbamato [108]. Para un carbón vidrioso automatización de determinaciones en análisis húmedo [112]. Uno de
electrodo con HRP atrapado en la película de polímero Eastman AQ sus tendencias en desarrollo es la miniaturización del conjunto
y 1,1-dimetilferroceno como transferencia de electrones soluble sistema de medición que aprovecha los logros modernos de
mediador se observó una disminución en el rendimiento del sensor microelectrónica y micromecánica, y también hacia
con aumento de la hidrofilia del disolvente (metanol> ACN> desarrollo de instrumentación de campo portátil [113]. los
acetona). Esto se atribuyó a la capacidad de hidrófila uso en tales sistemas de biosensores enzimáticos para determinar
disolventes para desorber agua del sitio activo de la enzima, que nación de pesticidas puede proporcionar un dispositivo competitivo para
disminuye la velocidad de la reacción enzimática. kits manuales de inmunoensayo o bioseno desechable de un solo uso
Los estudios sobre el efecto de los disolventes orgánicos han dado como resulstaodrso, debido a la mecanización que conduce a más objetivos
Desarrollo de métodos para la determinación enzimática de mediciones y eliminación de operaciones de transferencia de
pesticidas en una fase orgánica. En uno de esos sistemas BChE soluciones y sus medidas volumétricas.
y ChO se inmovilizan en gel de carragenano kappa, que es Hay tres tipos básicos de sistemas FIA diseñados para
intercalado entre la membrana permeable a los gases y la determinación de pesticidas con detección electroquímica
membrana de diálisis en sensor de oxígeno [81,82]. Determinación de enzimas inhibidas:
Se llevaron a cabo acciones de pesticidas en cloroformo-n-hexano
± sistemas de flujo con reactor enzimático de flujo continuo o
mezcla (50%, v / v).
enzima inmovilizada en partículas magnéticas y separada
detector electroquímico,
± sistemas con flujo enzimático electroquímico
7. Regeneración de enzimas inhibidas irreversiblemente
detector de diseño particular,
± sistemas con biosensor electroquímico integrado
Comprensión de los mecanismos de inhibición y regeneración.
colocado en la celda de detección de flujo continuo.
La acción de las enzimas es un problema general de gran importancia.
para bioquímica y biotecnología, especialmente para inmovili- Sistema de flujo con un reactor enzimático con AChE encendido
enzimas lizadas [109]. La regeneración de una enzima inhibida es cuentas de vidrio poroso controlado y detección de conductividad de
Un problema crucial a resolver para el uso múltiple de biosensores el ácido acético formado se informó para semicuantitativo
que son irreversiblemente inhibidos por el analito determinado. determinación de paraoxon con un límite de detección de
Entre las enzimas utilizadas para la determinación inhibitoria de 10 mM y una velocidad de muestreo de 10 muestras / h [114]. en un
pesticidas solo la actividad de los acetolac- menos utilizados sistema similar con detección potenciométrica con polímero
se inhibe la tate sintasa, la fosfatasa ácida y la tirosinasa Electrodo sensible a H ‡ , el tiempo de determinación individual y
reversiblemente Muchos autores prestaron mucha atención al La regeneración de la enzima en el reactor fue mucho más larga, pero
regeneración de la actividad de las colinesterasas. Más amenudo el límite de detección para paraoxon se evaluó como 0.1 μM
Se lleva a cabo la regeneración de AChE y BChE inhibidos. [115] El mismo sistema también se utilizó para determinar
utilizando el metocloruro de 2-piridina aldoxima (2-PAM) [30]. carbarilo y carbofurano [116]. Un sistema FIA más complejo.
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Fig. 5. La ilustración de la discriminación entre carbamatos y pesticidas organofosforados [99]. El efecto inhibidor de la mezcla.
que contiene diferentes concentraciones de carbofurano (CF) en presencia de paraoxón (PX) 10 μM en biosenor basado en AChE / ChO en FIA
configuración con y sin tratamiento con organofosfato hidrolasa [99].
con tres reactores enzimáticos, detector de pH de flujo continuo ‡ 0.25 V con Meldola blue como mediador en solución. En
y se desarrolló un detector amperométrico de oxígeno para otro detector de flujo continuo de carbón serigrafiado
discriminación entre organofosforados y carbamatos electrodo fue utilizado con un enzima adjunto por separado
pesticidas [99]. El sistema informado contenía reactores con membrana de nylon con AChE inmovilizado en la celda de flujo
AChE, ChO y organofosfato hidrolasa (OPH) [56] En la detección de pesticidas organofosforados DDVP
inmovilizado en gel de sílice activado. Porque OPH especifica tiocolina formada en reacción química reducida hexacy-
hidroliza calcáreos pesticidas organofosforados que pueden ser nanoferrato (III) presente en solución.
eliminado de la mezcla con pesticidas carbamatos antes Sistema de inyección de flujo que no requiere la regeneración de
a la inhibición de AChE. Las investigaciones reportadas han demostrado enzima en el sistema de medición se basó en el uso de
que la inhibición con dos tipos de pesticidas no es aditiva, AChE inmovilizado en partículas magnéticas [124]. Detección
y sorprendentemente la inhibición por el carbofurano solo fue de tiocolina se realizó amperometricamente a ‡ 0.6 V
mayor que por la mezcla con paraoxon (Fig. 5). FIA con el uso de celda de flujo con electrodos de platino producidos por
sistema con un reactor enzimático de cadena de un solo cordón y tecnología serigrafiada. En 40 minutos, el proceso de medición
detector de pH potenciométrico fue empleado para la detección de durante los límites de detección obtenidos para carbofurano, para-
varios pesticidas organofosforados y carbofurano oxon etil y metheyl y también malaoxon estaban en el rango
y carbarilo donde los valores límite de detección obtenidos estaban en de 3 a 7 ppm utilizando eritrocitos AChE. Buena recuperación
el rango de 0.3 a 275 [31]. Se informaron pruebas de agua potable y de arroyo.
El sistema FIA también se puede diseñar con un flujo continuo Se ha desarrollado la mayor cantidad de sistemas FIA
detector enzimático, donde la enzima se inmoviliza en con aplicación de biosensores integrados completos que
material compuesto poroso que consiste en vítreo reticulado fueron utilizados en varias celdas de flujo continuo. Para simplificar
cparbaoxonycaognarAoC
sahsEupinem
rpoovriolsizaa[d5o7]e.l Plíamraitleaddeedteectceicócniódnefue el denisfeoñqouedeesuninamcoevldilaizdaer fllauejonzniemceasdairrieacltoam
meánsteveenntalajossuoperficie
reportado como 1.4 ppm. Las determinaciones se llevaron a cabo en de electrodo. Tal sistema, por ejemplo, fue diseñado con
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1322 M. Trojanowicz
Fig. 6. El ejemplo de registro de la señal de inyección de flujo obtenida en la determinación de clorpirifos oxon (CPO) con AChE amperométrico
biosensor [29]. 1 ± 3: inyecciones de sustrato; 4: inyección de 7.8 nM CPO; 5, 6: inyecciones de sustrato; 7 ± 9: inyecciones de sustrato después
3 minutos de reactivación con solución de 2-PAM; 10: inyección de 16 nM CPO; 11, 12: inyecciones de sustrato; 13 ± 15: inyecciones de sustrato después
reactivación con 2-PAM; 16: inyección de 65 nM CPO; 17, 18: inyección de sustrato.
detección potenciométrica con AChE cova inmovilizada usando un tiempo de incubación de 10 min y el mismo tiempo para
con lentitud en electrodo de carbono vítreo recubierto de polietilenimina regeneración con 1,1'-trimetilenbis [4- (hidroxiimino-
y hexacianoferrato (III) en solución [37]. Diclorvos fue bromuro de metil) piridinio] (TMB-4). Esto permitió el 90%
determinado en este sistema con un límite de detección de 1 μM con regeneración y el uso de la misma membrana con BChE
un tiempo de reactivación necesario con 2-PAM de aproximadamente 35 min. para 20 determinaciones. Aplicación de BChE inmovilizada en
Varios sistemas diferentes de la FIA para la determinación de organo- la membrana de nylon proporciona un peor límite de detección (4 nM)
Los pesticidas de fósforo se desarrollaron con el uso de AChE y en forma disuelta 5 nM. Se estimó que usando la FIA
inmovilizado en la superficie del electrodo de platino en la capa mediciones en lugar de procedimientos de bach reducen el
de PVA-SbQ curado con UV [29, 43 ± 45]. En una computadora tiempo de medición en 3 ± 4 veces [76a].
sistema controlado el tiempo de incubación utilizado fue de 1 a Se notificó una baja detectabilidad especialmente sobresaliente para
16 min y varios minutos de regeneración con 2-PAM [45]. UNA un sistema FIA con la construcción de una celda de flujo, que
Se empleó un sistema con anguila eléctrica ACHE para determinar alberga un biosensor serigrafiado con AChE inmovilizado
nación de clorpirifos y sus metabolitos obteniendo una [52] Por 20 minutos de tiempo de incubación y 1 unidad de carga enzimática
límite de detección de 24 ppb. El uso en el mismo sistema de los límites de detección para diclorvos y paraoxon fueron 6 y
dmAChE inmovilizado permite mejorar la detección 0,04 nM, respectivamente. Se hicieron algunas evaluaciones iniciales.
límite para clorpirifos oxón hasta 1.1 ppb. En el mismo para muestras de agua de río.
sistema paraoxon y malaoxon fueron determinados, también Lista de sistemas de la FIA para la determinación de pesticidas con
las determinaciones de 3 analitos en las aguas del río con picos fueron La detección electroquímica se muestra en la Tabla 2.
llevado a cabo. Un ejemplo de grabación de señal para medir
En este tipo de sistema se muestra en la Figura 6. Todo
ciclo de medición para una sola muestra analizada con 3 9. Validación de determinaciones basadas en enzimas
inyecciones de sustrato antes de la inhibición y 2 después Inhibición
La inhibición, la incubación y la reactivación duran aproximadamente 40 minutos.
En sistemas FIA biosensores con colinesterasas inmovilizadas La validación adecuada de un nuevo método analítico es
Se utilizaron láminas sobre membranas. Paraoxon y carbaryl fueron siempre la etapa más crucial de su desarrollo, donde un
determinado con un límite de detección de 0.1 μM con 4-amino- prueba crítica de su fiabilidad se lleva a cabo por dificultades naturales
acetato de fenilo como sustrato [42]. Para la detección de un comercial matrices Es especialmente desafiante cuando el contenido de un
Celda de flujo Metrohm con un electrodo de carbono vidrioso el analito determinado está cerca de su límite de detección.
se utilizó. En dicho sistema, las determinaciones en extractos de El protocolo más valioso generalmente se basa en la comparación
Se llevaron a cabo kiwis tratados anteriormente con carbaryl. por ison del método desarrollado en la misma muestra con un
Contenido de 3 ppm de analito en el extracto inyectado al sistema método diferente que se usa comúnmente en el análisis de rutina
Se obtuvo un buen acuerdo con las determinaciones UV. o aceptado como método de referencia para un analito dado y
En celda de flujo de capa delgada con electrodo de epoxi-carbono matriz. Otro procedimiento ampliamente utilizado para la validación es el
ylím
buitteirdilecodleinteecscteióransdaeinmmeomvbilriaznaadapaerna nlaitrdaetoterdm
e icnealcuilóonsade diazinón de dMeateterm
riainleasciqóune duetlilaiznaanliteol en
métroefe
dorednecsiaarrcoelrltaidfioc.aN
dao muchos articulos
1,5 nM se informó [76a]. Se llevaron a cabo determinaciones se han dedicado, hasta ahora, a la validación de la enzima
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Tabla 2. Sistemas de la FIA para la determinación de pesticidas.
Biosensor Enzimático Detección Analito Limite de Referencias

reactor detección
± CPG / AChE Cond. Paraoxon 10 nM [114]

± CPG / AChE Maceta. Paraoxon 0.1 μM [115]
± CPG / AChE Maceta. Carbaril 0.1 nM [116]
Carbofurano 0,01 nM
± AChE, ChO, OPH Maceta. ‡ Amp. Paraoxon ± [99]
Carbofurano ±
± Dolor Maceta. OP, Carbamato 0.5 ± 275 ppb [31]
± Partículas magnéticas / AChE Amperio. Carbofurano 3 ppm [124]
Paraoxon etil 3 ppm
Paraoxon metil 7 ppm
Malaoxon 7 ppm
Cache ± Amperio. Paraoxon 1,4 ppm [57]
Cache ± Amperio. DDVP ± [56]
Pt / AChE ± Amperio. Clorpirifos 1.1 ppb [45]
Oxón clorpiriforme 25 ppb
Metilclorpirifos 10 μM
Pt / AChE ± Amperio. Clorpirifos oxon 1.1 ppb [29]
Paraoxon 30 ppb
Malaoxon 25 ppb
GC / AChE ± Amperio. Paraoxon 0.1 μM [42]
Carbaril
C-epoxi / BChE ± Amperio. Diazinón 1,5 nM [76]
SP / AChE ± Amperio. Dicloro 6 nM [52]
Paraoxon 0,04 nM
determinación de pesticidas basada en comparación real con del 89 al 118% [81]. En este último caso, las determinaciones fueron
resultados obtenidos usando un método diferente. Los resultados de realizado directamente en extractos orgánicos. Luego en la FIA
Determinaciones por HPLC de varios pesticidas con matriz de diodos determinaciones con biosensor dmAChE las recuperaciones de
detección espectrofotométrica en dos muestras de agua tienen el clorpirifos oxón en las aguas del río (en el nivel 20 a 41 nM) fueron
comparado con la determinación amperomérica de la FIA con en el rango de 44 a 89%, para paraoxon (en concentración
un biosensor AChE [43]. Se evaluó como resultados positivos, nivel de 0.5 a 0.8 μM) de 46 a 105% y para malaoxon
que con ambos métodos en la misma muestra el nivel de (a nivel de concentración 0.6 a 1.2 μM) de 145 a 193%. En
los pesticidas encontrados fueron varias veces más bajos que en otra muestra En todos estos casos, el nivel de pesticidas con púas añadido a los naturales
sin determinación del nivel de concentración de analitos. las muestras excedieron las regulaciones ambientales para el nivel de
Resultados de la determinación enzimática en el sistema FIA con pesticidas en aguas naturales.
biosensores serigrafiados en muestras de agua de río también fueron Buenos resultados obtenidos para las determinaciones enzimáticas.
en comparación con los resultados de GC / MS [52]. Para una muestra examinaddae carbofurano en jugos de papa y zanahoria con amperomet-
Ambos métodos muestran la ausencia de pesticidas. Por otro Ric AChE biosensor [26] ya se mencionaron anteriormente.
muestra con 1.3 nM de contenido total de pesticidas obtenidos con Sin embargo, los resultados paralelos para propoxur fueron menos satisfactorios.
GC / MS, la determinación enzimática basada en la inhibición dio conservador. A determinaciones similares en muestras enriquecidas fueron
aproximadamente 0.1 nM o 10 nM dependiendo del pesticida que se usó en comparación con HPLC con buenas correlaciones para carbofurano
para la calibración de la determinación enzimática, paraoxon o diclorvos y pobre acuerdo para propoxur [117]. En determinación de
Sin embargo, se informaron resultados más positivos para pesticidas de carbarilo en muestras de frutas y verduras enriquecidas
procedimientos de validación basados en la determinación de la las recuperaciones obtenidas con HPLC estuvieron en el rango de 64 a
recuperación en diferentes muestras naturales enriquecidas con varios 109%, mientras que para el biosensor amperométrico AChE de 60
analitos Se llevaron a cabo tanto para aguas naturales como para al 125%, mostrando así un rendimiento muy similar.
Matrices de plantas. Varios de ellos ya fueron mencionados
arriba, como por ejemplo, se obtuvo un buen acuerdo para UV y
determinaciones enzimáticas de carbarilo en muestras enriquecidas de 10. Biosensores de células y tejidos enteros
kiwis [42]. Uso de biosensor amperométrico con BChE
y ChO en estudio de recuperación sobre malatión en aguas de ríos y Células o tejidos enteros inmovilizados de diversos organismos.
extractos del suelo, se informaron valores del 95 al 105% para el a menudo se utilizan alternativamente a enzimas aisladas en diseño
de biosenores electroquímicos. Funcionan como renovables
niveles de analito de 2 a 5 ppm [80]. Las mismas medidas fuente de enzima específica para el proceso biocatalítico objetivo,
para carbaryl y paraoxon agregados a aguas naturales desde 1.6 que además opera en un entorno biológico natural
a 8 ppb y 10 a 28 ppb, respectivamente, proporcionó recuperaciones ing (célula o tejido) que a menudo puede proporcionar el óptimo
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1324 M. Trojanowicz
condiciones para su estabilidad a largo plazo. Para este grupo de ed. En el primer caso la fotoproducción de H 2 O 2 era
Los biosensores también pertenecen a sistemas donde la inhibición de la medido con electrodo de trabajo Pt en una celda iluminada a través de
Se utiliza el transporte de electrones fotosintéticos por pesticidas. una guía de fibra óptica de vidrio [122]. La inhibición de la
En el diseño de estos biosensores, ambas células se hidrolizan la fotocorriente inducida por la adición de herbicidas fue
directamente se emplean pesticidas organofosforados también más fuerte en el caso de membranas tilacoides atrapadas
como tejidos ricos en enzimas que pueden ser inhibidos por pesticidas. en comparación con los tilacoides nativos. Una foto relativamente alta
Células de Escherichi coli que expresan hidrogeno organofosforado se generó corriente (3 μA) sin electrones artificiales
Lase (OPH) fueron atrapados en el polímero PVA que resultó en se encontraron aceptadores y límites de detección de 20 a 200 nM para
la producción de esferas de gel utilizadas en un reactor por lotes o flujo diuron y atrazina, respectivamente.
a través del reactor [118] o unido con un policarbonato Para el biosensor basado en cianobacterias diaminodureno
membrana directamente a la superficie de un electrodo de vidrio de pH fue empleado para mediar la fotocorriente en las células [123].
[119] En ambos casos, la detección de pH se utilizó como OPH La suspensión de células se aplicó directamente sobre la superficie.
genera protones a través de una reacción en la que PÀO, PÀF, de un electrodo de trabajo de carbono vidrioso y cubierto con
Los enlaces PÀS y PÀCN se dividen. En la detección de paraoxon membrana de diálisis La iluminación se realizó con un
la sensibilidad en el rango de 0.25 a 250ppm fue lámpara halógena en combinación con un filtro UV colocado
obtenido con un tiempo de respuesta de 10 minutos para el modo por lotes y debajo de la celda electroquímica. Un ejemplo de tipico
20 min en el sistema de flujo continuo [118]. La detección de 2 μM La respuesta se muestra en la Figura 7 [123]. La inhibición reversible
límite para paraoxon, parathion metil y diazinon fue
obtenido en el sistema con E. coli unida al vidrio de pH
superficie del electrodo [119]. E. coli también puede metabolizar una variedad
de azúcares para producir productos ácidos, pero se demostró que
su exceso de 125 veces no interfiere [119]. Uno de los principales
ventajas del uso de células crioimmovilizadas con PVA fue la
Mayor estabilidad durante el uso y almacenamiento hasta 60 días.
[118] La misma estabilidad a largo plazo se informó para el
electrodo microbiano potenciométrico [119].
El biosensor híbrido de fosfatasa ácida (AP) fue desarrollado
oped usando una capa delgada de tejido de papa unida al
biosensor amperométrico basado en DIOS basado en interno
detección de H 2 O 2 [88]. La inhibición reversible de AP fue
utilizado para la determinación de malatión, paraoxon metilo,
paraoxon y aldicarb con límites de detección de 0.5 ppb
para paraoxon metil a 40 ppb para aldicarb. El tejido basado
El biosensor exhibió una vida útil más larga y una mejor confiabilidad
de los resultados amperométricos que el sensor bienzimático
con AP purificado y DIOS. Un biosensor similar también fue
desarrollado usando una capa de papa con un tipo Clark disuelto
electrodo de oxígeno [120].
Para el mismo propósito, también fue un tejido de pepino
intercalado entre membranas de teflón y nylon en el
superficie de un electrodo de oxígeno [121]. Amperométrico
La detección de paraoxon etil se basa en la inhibición de
actividad de la ascorbato oxidasa (AOD), que catalizó la
reacción:
AOD
Ascorbato ‡ O 2 À3 deshidroascorbato ‡ H 2 O
El límite de detección en dicha determinación durante 10 minutos

El tiempo de incubación se ha estimado en 1 ppm.
Determinaciones basadas en sistemas fotosintéticos con Fig. 7. Inhibición mediada de herbicidas en electrones fotosintéticos.
la detección electroquímica implicó atrapamiento de tilacoides transporte [123]. Foto anódica mediada por diaminodureno (DAD)
membranas aisladas de hojas de espinaca en PVA-SbQ actual, generada por células de Synechoccus sp. inmovilizado en un
electrodo de carbono Comienzo y terminación de la iluminación.
polímero [122] y células fotosintéticas inmovilizadas de
ción indicada por las flechas: a) oxidación DAD registrada a 0.2 V
cianobacterias Synechoccus sp. en una matriz de alginato de calcio
(vs. SCE) i) en ausencia de herbicida, ii) en presencia de
[123] En ambos casos la inhibición por dos herbicidas atrazina y 0.1 ppm de atrazina, y iii) en presencia de 1 ppm de atrazina.
diuron de transferencia de electrones fotosintéticos a nivel de Expansión de la fotocorriente residual en presencia de b)
la proteína de unión a plastoquinona del fotosistema II fue explotada 1 ppm de atrazina yc) 1 ppm de diurón.
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El proceso de ition con iluminador de pulso permite determinar inmovilizado en una matriz que conserva sus propiedades fisiológicas
atrazina con límite de detección de 1 ppb e incluso más fuerte funciona tan bien como la interacción con los polímeros impresos,
se encontró afinidad de unión por el diurón. La acción de la que puede servir como un sustituto sintético artificial de
diferentes cinéticas de inhibición y afinidades claras y oscuras anticuerpos
Permitir también la distinción entre los diferentes En el primer caso descrito como Reconocimiento Bioeléctrico
herbicidas Ensayo (BERA) [125], respuesta celular al herbicida
el gluposato se evaluó midiendo la electricidad celular
potencial. Se observan cambios rápidos de este potencial.
11. Otros métodos relacionados de electroquímica a los pocos minutos de la unión específica del ligando a la transmembrana
Determinación de plaguicidas receptores Para fines analíticos, se utilizó un biosensor
desarrollado con un material sensorial celular inmovilizado
A los métodos electroquímicos de determinación de pesticidas. eso también fue un transductor. Como material sensorial para
también se pueden incluir procedimientos basados en interacciones específicas determinación del gluposato de los protoplastos de dos juan-
acción de pesticidas con un grupo de células y componentes celulares Se utilizaron biotipos songrass inmovilizados en gel de agarosa. En
Tabla 3. Los valores más bajos de los límites de detección informados para la determinación de pesticidas con biosensores electroquímicos enzimáticos.
AChE: acetilcolinesterasa; ADH: aldehído deshidrogenasa; ALS: acetolactato sintasa; AP: fosfatasa ácida; BChE: butirilco-
lineterase; OPH: organofosforado hidrolasa; TYR: tirosinasa. (a): detección amperométrica; (p): detecciones potenciométricas.
Pesticida Límite de detección Enzima utilizada Referencias
Aldicarb 2 ppb AChE (a) [58]

Atrazina 4 μM TYR (a) [90]
Bendiocarb 10 nM AChE (p) [39]
Bisfluorofosfato 38 ppb BChE (a) [63]
Carbaril 0.5 ppb AChE (a) [82, 117]
Carbofurano 0,047 ppb BChE (a) [141]
Clorpirifos 5 μM OPH (p) [21]
Clorpirifos oxon 1.3 ppb AChE (a) [29]
Clorsulfuron 1 μM ELA (a) [84]
CIPC (cloroisopropil-fenilcarbamato) 2 μM TYR (a) [90]
Coral 20 ppb AChE (p) [34]
Coumaphos 0.15 μM BChE (a) [79]
2,4-D 7 μM TYR (a) [93]
DDUP 0.5 ppm BChE (p) [71]
DFP (diisopropilfluorofosfato) 1 pM AChE (p) [36]
Diazinón 3 ppb BChE (p) [71]
Diclorvos 1,2 nM AChE (a) [50]
Diram 1.3 μM TYR (a) [91]
Echothiophate 1 ppm AChE (p) [38]
Eserine 0,37 μM AChE (a) [66]
Fenitrotion 21 ppm BChE (p) [70]
Heptonofos 0,65 ppm BChE (p) [70]
Hostaquick 0.3 ppm BChE (a) [77]
Imazaquin 1 μM ELA (a) [84]
Malatión 0.1 nM AChE (p) [30]
Maneb 1,5 ppb ADH (a) [85]
Metomilo 0.1 ppb AChE (a) [117]
Mevinfos 1,4 ppm BChE (p) [70]
Nabam 8 ppb ADH (a) [86]
Oxofosfol 0.1 nM AChE (a) [46]
Paraoxon 0,04 nM AChE (a) [52]
Paraoxon metil 1 μM AChE (p) [36]
Paratión 0.5 ppb BChE (a) [82]
Paratión metilo 0.5 ppb AP (a) [88]
Feniletilsulfonil-fluoruro 60 ppb BChE (a) [78]
Propoxur 0,75 ppb AChE (a) [117]
Seedox 80 ppm BChE (a) [77]
Sulfometuron metil 1 μM ELA (a) [84]
Thifensulfuron metil 1 μM ELA (a) [84]
Triclorfón 0.2 pM BChE (p) [75]
Dietilditiocarbamato de zinc 1,7 μM TYR (a) [91
Zineb 9 ppb ADH (a) [87]
Ziram 74 nM TYR (a) [91]
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1326 M. Trojanowicz
Tabla 4. Pesticidas usados en grandes cantidades en Europa occidental respuesta a desmetryn y casi lo mismo a metribuzine,
países [2]. El nombre en cuadrado indica pesticida para el cual pero solo una pequeña respuesta a la atrazina y al tyerbumeton en el
Se ha desarrollado un biosensor enzimático.
Rango de concentración de ppm.
> 2 000 toneladas / año 1 000 ± 2 000 toneladas / año 500 ± 1 000 toneladas /
año
12. Conclusiones
Atrazina Alacloro Azinfos-etilo
1,3-dicloropropeno Clortolurona Azinfos-metilo
Glifosato Clormequat Bentazone Los biosensores electroquímicos enzimáticos han tenido éxito.
Isoproturon Clorotalonil Captan Completamente y ampliamente implementado en el análisis clínico de rutina.
Mancozeb 2,4-D Carbetamida Esto se debió principalmente a la simplicidad y la facilidad para
Maneb Diclorprop Carbendazim
miniaturizar instrumentación electrónica y sensores y el
MCCP (Mecoprop) 1,2-dicloropropano Cloridazon
tecnologías disponibles para su producción en masa. Lo mismo
MCPA Dimetoato Metazacloro
Metam-sodio Ioxinil Metolacloro ventajas son esenciales para aplicaciones ambientales de
Malatión Molinato biosensores enzimáticos. Pesticidas, además de orgánicos volátiles.
Metamitron Paraquat compuestos, hidrocarburos poliaromáticos y numerosos
Methabenzthiazuron Ptorato compuestos inorgánicos pertenecen a los contaminantes de
Bromuro de metilo Pendimetalina preocupación identificada con mayor frecuencia en las evaluaciones de salud pública
Paratión Propanil
y avisos [130]. En busca de nuevos instrumentos portátiles
Procloraz Propiconazol
Ácido tricloroacético Propineb
Menticación y métodos rentables, los biosensores son un
Trifluralina Simazina alternativa potencial para el cromatográfico ampliamente utilizado
Tri-allato métodos Los biosensores con transductores apropiados todavía son
Tridemorfo dispositivos de uso más simple, sus versiones desechables pueden tener un costo
Zineb eficaces, no requieren personal altamente educado,
Ziram
y existen numerosos métodos para extender su largo tiempo
estabilidad (p. ej., [131]).
La principal deficiencia en la etapa actual de desarrollo
este trabajo preliminar una respuesta lineal en potenciométrica La mentoría de biosensores electroquímicos sigue siendo su
las mediciones se obtuvieron dentro de 0.1 a 1 mM de glupho- detectabilidad limitada, y en el caso de métodos basados en
saciar. inhibición de la actividad enzimática, una selectividad limitada y a menudo
Impresión molecular o polimerización de plantilla en sensibilidad muy diferente a varios pesticidas. En GC / MS
Los últimos años se reconocen como una valiosa alternativa a determinaciones mejoradas, por ejemplo, con fase sólida
producir receptores artificiales como alternativa a los biológicos microextracción, para numerosos plaguicidas la detección
receptor utilizado en inmunoensayos e inmunosensores [126, los límites pueden alcanzar incluso el nivel de fracciones de ppt [132], mientras que
127]. Permiten a uno evitar numerosas limitaciones de para biosensores electroquímicos, los límites de detección rara vez alcanzan
anticuerpos como baja estabilidad o dificultad en su nivel de fracción de ppb (Tabla 3). Para el medio ambiente
preparación para analitos de molécula pequeña. Poligrafía impresa El desarrollo de los métodos de detección es necesario para
Los meros generalmente se producen en dos pasos por radicales Cerca de 700 pesticidas registrados para su uso en todo el mundo. UNA
polimerización de monómeros funcionales en presencia de nueva técnica GC / MS conocida como bloqueo del tiempo de retención
analito objetivo y eliminación de las moléculas de plantilla, y permite analizar casi 600 pesticidas individuales,
propiedades de reconocimiento formadas hacia el resultado del analito mientras que los métodos de biosensores se han desarrollado solo para un
de una combinación de encuadernación reversible y una forma pequeña fracción de estos compuestos. Entre 39 prioridad
complementariedad Sensores electroquímicos basados en el uso. pesticidas utilizados en la Unión Europea [3], solo 9 electro-
de polímero impreso se han desarrollado para determinar Los biosensores químicos se han desarrollado, hasta ahora. Tabla 4
ción de atrazina [128]. Las membranas impresas para un muestra pesticidas usados en grandes cantidades en el oeste de Europa
sensor conductométrico se obtuvieron por polímero radical- países de maní [2], y tan marcados para aquellos que enzimáticos
ización de dietil aminoetil metacrilato y etileno Se han desarrollado biosensores.
dimetacrilato de glicol en presencia de atrazina. Esta Una amplia aplicación de rutina de bioseno electroquímico.
El sensor se puede utilizar para la determinación de atrazina en el rango sors requiere mucha más investigación que hacer principalmente para
0.01 a 0.5ppm sin pérdida de sensibilidad por al menos mejora de sus límites de detección. Más estudios son
4 meses y un tiempo de respuesta del orden de 30 min. Necesario sobre el efecto de los disolventes orgánicos para diseñar
En el otro caso informado, la polimerización por injerto procedimientos de separación más efectivos con biosensores
técnica en la superficie de membranas de polipropileno o detección. Se deben dedicar más estudios a la mejora.
Se utilizó un electrodo de oro recubierto con mercaptohexadecano [129]. de estabilidad a largo plazo de enzimas e inversiones inmovilizadas
Se empleó una monocapa autoensamblada para obtener un Tigración de la aditividad de la respuesta a varios grupos de
superficie hidrofóbica en electrodo de oro, en el que N, N'- pesticidas en procedimientos basados en inhibición. Mas atencion
metilendiacrilamida en presencia de desmetrina y 2- debe pagarse también al diseño de biosensores quirales
el ácido acrilamido-2-metil-1-propano sulfónico fue polímero- sensible a formas enantioméricas activas particulares de pesti-
ized El electrodo obtenido muestra capacitiva selectiva cides.
Página 17
13. Agradecimientos [28] F. Villatte, V. Marcel, S. Estrada-Mondaca, D. Fournier,

Biosens Bioelectron. 1998, 13, 157.
[29] G. Jeanty, A. Wojciechowska, JL Marty, M. Trojanowicz,
Este trabajo fue apoyado financieramente por francés-polaco
en prensa.
esquema de colaboración científica POLONIUM No: 2991.I / [30] Tran-Minh, PC Pandey, S. Kumaran, Biosens. Bioelectron.
2000 (A) y Proyecto de la Comisión Europea dentro del 5to. 1990, 5, 461.
Contrato marco no: IC15-CT98-0119. Autor gracias [31] Tran-Minh, anal. Proc. 1993, 30, 73.
para valiosas discusiones el Prof. Jean-Louis Marty y Mr [32] K. Stein, G. Schwedt, anal. Chim. Acta 1993, 272, 73.
Gerard Jeanty de la Universidad de Perpignan, Perpignan, [33] RE Gyurcsanyi, Z. Vagfoldi, K. Toth, G. Nagy, Electro-
análisis 1999, 11, 1.
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Determinación de Pesticidas Usando Biosensores Enzimáticos Electroquímicos

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25/11/2019 Determinación de pesticidas usando biosensores enzimáticos electroquímicos

Determinación de pesticidas usando enzimática electroquímica

Recibido: 29 de noviembre de 2001

Dedicado al profesor Gary Christian en ocasión de su 65 ° cumpleaños

1. Introducción pretratamiento de la muestra analizada, y a pesar de la rapidez

construcción de biosensores potenciométricos con pH sensible

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Enzima inmovilizada Detección Medición Autores Referencias

Organofosforas hidrolasa Maceta si G ‰ berlein (2000) [21]

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

la aplicación AChE se inmovilizó covalentemente en el

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Para el sistema con acetato de 4-aminofenilo como sustrato a

La acetilcolina ‡ H 2 O À3 Colina ‡ Ácido acético

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Butirilcolina ‡ H 2 O À3 Colina ‡ Ácido butírico

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Tabla 2. Sistemas de la FIA para la determinación de pesticidas.

Biosensor Enzimático Detección Analito Limite de Referencias

± CPG / AChE Cond. Paraoxon 10 nM [114]

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

El límite de detección en dicha determinación durante 10 minutos

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

Pesticida Límite de detección Enzima utilizada Referencias

Aldicarb 2 ppb AChE (a) [58]

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

13. Agradecimientos [28] F. Villatte, V. Marcel, S. Estrada-Mondaca, D. Fournier,

Electroanálisis 2002, 14, No. 19 ± 20

Electroanálisis 2002, 14, No.19 ± 20

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