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1. TEMA: EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES

2. OBJETIVOS:
2.1. GENERAL: Realizar La Extracción Y Análisis De Pigmentos Alimentarios Vegetales.
2.2. ESPECÍFICO:
 Extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta vulgaris var. Cicla)
mediante cromatografía circular y cromatografía ascendente en tira de
papel.
 Determinar antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca).
 Conocer el efecto de la cocción sobre los pigmentos vegetales de la
zanahoria (Daucus carota).
 Realizar la extracción y análisis de betaninas presentes en la remolacha
(Beta vulgaris).
 Extraer y analizar carotenoides a partir del achiote (Bixa orellana).

3. MARCO TEÓRICO:

PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES

Son sustancias naturales que brindan los colores que poseen los alimentos. Es un material que
viene incorporado en la textura misma, que refleja la luz de diferentes formas, generando a
nuestra vista, distintos colores y tonalidades. Los pigmentos además de existir en forma
natural, pueden también sintetizarse y obtenerse químicamente, para ser aplicados en la
industria tanto en alimentación, como en pinturas, barnices, cosméticos, ropa, etc.

En la alimentación natural, orgánica y macrobiótica, puede verse extracción de pigmentos de

forma artesanal, con fines medicinales o simplemente como colorante natural para
alimentación y bebidas. Existen estudios que exponen las posibilidades terapéuticas de estos
componentes vegetales, que en su mayoría aportan una cantidad de antioxidante al
organismo.

CLOROFILA

El color verde tan uniformemente presente en los

vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos
estrechamente emparentados llamados clorofila
a y clorofila b. Se encuentran prácticamente en todas las
plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden
formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de
que estos órganos estén situados por encima del suelo y
queden expuestos a la luz.

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También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se
extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia
de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. Las clorofilas se
encuentran en las membranas de los tilacoides, que en las cianobacterias son invaginaciones
de la membrana plasmática, y en los plastos de las células eucarióticas que son vesículas
distribuidas por su interior. Las clorofilas aparecen insertas en la membrana, a las que se
anclan por la cadena lateral constituida por un resto de fitol, asociadas a proteínas y otros
pigmentos, con los que forman los fotosistemas.

ANTOCIANINAS

Son pigmentos hidrosolubles que se hallan en

las vacuolas de las células vegetales y que otorgan el
color rojo, púrpura o azul a las hojas, flores y frutos.
Desde el punto de vista químico, las antocianinas
pertenecen al grupo de los flavonoides y son glicósidos de
las antocianidinas, es decir, están constituidas por una
molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se
le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. Sus
funciones en las plantas son múltiples, desde la de
protección de la radiación ultravioleta hasta la de atracción de insectos polinizadores.

BETANINAS
La Betanina, rojo remolacha es una sustancia que consiste en el extracto acuoso de la raíz de
la remolacha roja Beta vulgaris. Se extrae generalmente tras la cocción en agua, y presenta un
color rosado.
Utilización:
Estos compuestos extraídos de la remolacha son utilizados generalmente en la industria de
la alimentación como colorante para ciertos postres, como las gelatinas o el yogur de frutas
rojas.
CAROTENOIDES
Pueden obtenerse una variedad de colores del amarillo al rojo, pasando por el naranja. En esta
clasificación, se encuentra el rojo del tomate y el betacaroteno. Desde el punto de vista
químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados por unidades de
isopreno (ocho unidades, es decir, cuarenta átomos de carbono), y su biosíntesis se produce a
partir de isopentenil pirofosfato. Esto produce sus rasgos estructurales más evidentes, la
presencia de un muchos dobles enlaces conjugados y de un buen número de ramificaciones de
grupos metilo, situados en posiciones constantes. Se conocen alrededor de 600 compuestos de
esta familia, que se dividen en dos tipos básicos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las
xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de
tamaño menor, formados por ruptura de los carotenoides típicos.

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CARACTERÍSTICAS DE EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS:

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí
son solubles en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los
solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele
llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se
los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo.

En el método de extracción simple, como se desarrolla más adelante se utilizará como

extractante el alcohol etílico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes
orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus
diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos no misibles y con diferente peso específico.

En el segundo método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona y como

separador el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los
pigmentos, y se basa en la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las
que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos
granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios
para desarrollar la técnica.

4. FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA:

EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS

Entre los distintos métodos que existen para separar y

obtener esos pigmentos se encuentra el de
la cromatografía en papel, que es una técnica que
permite la separación de las sustancias de una mezcla y
que tienen una afinidad diferente por el disolvente en
que se encuentran. De tal manera que al introducir una
tira de papel en esa mezcla el disolvente arrastra con
distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad
que tengan y los separa, permitiendo identificarlos

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perfectamente según su color.

CLOROFILAS
Existen en cuatro formas diferentes, α, β, γ y δ, siendo las dos primeras las presentes en las
plantas. Las clorofilas tienen típicamente dos picos de absorción en el espectro visible, uno en
el entorno de la luz azul (400-500 nm de longitud de onda), y otro en la zona roja del espectro
(600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media del espectro, la más nutrida y
correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta es la razón por la que las clorofilas tienen
color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen cloroplastos
activos en sus células, así como a los paisajes que forman.
Las plantas superiores tienen dos tipos de clorofila muy semejantes entre sí, denominadas a y
b, siendo la primera la mayoritaria y la que se degrada más fácilmente.(6)

ANTOCIANINAS Y BETALAÍNAS

En antocianinas el color a un PH determinado es función de los sustituyentes. Al aumentar

el número de hidróxidos en el anillo B se intensifica el color azul mientras que la presencia
de grupos metoxilo genera el color rojo. Son muy reactivas, el ion flavilio es deficiente en
electrones y reacciona rápidamente. Generalmente son reacciones de decoloración no
deseadas.
El color de las antocianinas es función del PH además de su estructura. Algunas de ellas a PH
ácido son de color rojo, a PH básico de color azul y a PH neutro son incoloras.
Al contrario de lo que sucede en el caso de las antocianinas, el color de las betalaínas no
depende del pH. Las betacianinas mantienen su color púrpura sin ningún cambio entre pH 4 y
7, y los cambios que se producen a pH tan extremos como 2 ó 9 son pequeños. La betanina,
una betalaína, es el componente principal del colorante de la remolacha roja.

CAROTENOIDES

A los carotenoides que contienen átomos de oxígeno se les conoce más específicamente como
xantofilas. Los restantes constituyen el grupo de los llamados carotenos.
Su color, que varía desde amarillo pálido, pasando por anaranjado, hasta rojo oscuro, se
encuentra directamente relacionado con su estructura: los enlaces dobles carbono-carbono
interactúan entre sí en un proceso llamado conjugación. Mientras el número de enlaces dobles
conjugados aumenta, la longitud de onda de la luz absorbida también lo hace, dando al
compuesto una apariencia más rojiza. Por ejemplo, el fitoeno que posee únicamente tres

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enlaces dobles conjugados absorbe luz en el rango ultravioleta y apareciendo por tanto
incoloro a la vista, el licopeno, compuesto que confiere su color rojo al tomate contiene 11
enlaces dobles conjugados. Existen también carotenoides de color verde (ζ-Caroteno), amarillo
(β-caroteno), y anaranjado.
Como ejemplo de estos compuestos en la naturaleza, podemos citar al carotenoide mejor
conocido, el que da al grupo su nombre, el caroteno, encontrado en zanahorias y responsable
de su color anaranjado brillante.

5.- REACCIONES:

a. ANTOCIANINAS

 Medio Acido, Básico

 Con glucosa

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 Con agua

 Al calor

Cuando se somete a altas temperaturas, en presencia de azucares no hay cambios.

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6.- MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES:
 Vasos de precipitación
 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Balón de aforo de 100 mL
 Papel filtro
 Capilares
 Varilla de agitación
 Pipetas de 10 y 5 mL
 Mortero y pistilo
 Reverbero
 Vasos de 250 ml
 Vidrio reloj
 Embudo
 Trípode
 Espátula
 Remolacha
 Acelga
 Frutillas
 Achiote
 Zanahoria

7.-RESULTADOS:

EXTRACCION Y ANALISIS DE CLOROFILA

 Cromatografía circular:

Clorofila b color amarillo verdoso

 Cromatografía ascendente en papel:

Clorofila b color amarillo verdoso

RECORRIDO ABSORBANCIA 549

TABLA
MUESTRA Rf nm CON BARRIDO
BIBLIOGRÁFICA
(cm) INTELIGENTE
CLOROFILA A 5,6 0,62 0,65 0,016
Recorrido del solvente 9,0cm

distancia recorrida por la muestra

Rf =
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎𝑝𝑜𝑟𝑒𝑙𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
5,6
Rf = =0, 62
9,0

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 Propiedades de la clorofila

MUESTRA COLORACIÓN
Muestra Original Verde Oscuro
Muestra + ác. Oxálico 5% Verde pálido
Muestra + NaOH 0,1 N Amarillo verdoso

ANTOCIANINAS

Esta determinación se realizó con fresas, se hizo una solución y se colocó en 9 tubos para
realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados:

RESULTADO
Tubo 1 medir pH 3,43

MUESTRAS COLORACIÓN
Muestra original Rosado claro
Tubo 1 +HCl Rojo naranja
Tubo 2 + ácido acético Naranja intenso
Tubo 2 + agua Tomate
Tubo 3 + NaHCO3 Forma espuma toma un color rojo
Tubo 4 + NaOH 10% Al añadir el reactivo se forma dos fases la
superior transparente y la inferior amarrilla
Al agitar toma un color pardo y luego de un
tiempo se hace amarrillo
Tubo 2 + HCl diluido +NaOH 10% Toma un color tomate claro
Tubo 5 + 10 a 20 mg de ác. Ascórbico Primero no cambia de color
Al calentar se observa un color carne forma
una emulsión.
Tubo 6 + bisulfito de K Tomate intenso
Tubo 7 + FeCl3 Tomate claro
Tubo 8 + sln. De gelatina Color carne tipo emulsión
Tubo 9 + glucosa Rosado pálido se diluye la muestra
Alícuota en el vidrio reloj No sufre ningún cambio de color

ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIÓN SOBRE LOS PIGMENTOS

Esta determinación se realizó con zanahoria y acelga

COLORACIÓN TEXTURA
Vaso 1: agua + zanahoria Color del agua es Blanda
sin descortezar ligeramente amarillo
Vaso 2: agua + zanahoria Agua casi cristalina Semi blando
sin descortezar + ácido
Acético
Vaso 3: agua + zanahoria Agua toma un color amarillo Muy blando
sin descortezar + NaHCO3 intenso

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COLORACIÓN TEXTURA
Vaso 1: agua + acelga Agua toma color verde claro Blanda
Vaso 2: agua + acelga + ácido Agua toma un colore verde Semi blando
Acético oliva
Vaso 3: agua + acelga + Agua toma un color verde Muy blando
NaHCO3 amarrilento

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE BETANINAS

Se realizó con la remolacha se hizo una solución

RESULTADOS
Tubo 1 medir pH 6,92
Absorbancia = 400 a 540 nm 1,657

MUESTRA COLORACION
Muestra original Vino
Tubo 1 + HCl No cambia
Tubo 2 + NaOH 10% Vino pardo
Tubo 3 + ácido cítrico Rojo
Tubo 4 + NaHCO3 Vino oscuro
Muestra en cápsula al ambiente Se observó que el pigmento de la remolacha
se oscureció. Sin presentar ningún otro
cambio
Muestra en cápsula a la luz solar Se observó una separación de fases en el
pigmento. Una más densa y otra más leve
que quedaba como sobrenadante. Además se
observó cierta decoloración.

Muestra en cápsula a la luz artificial No se degrado en su color si, se concentró

pues el calor evaporo el agua y además hubo
la presencia de un precipitado fucsia

Tubo 5 calentar Cambia el color a los 90 C

COMPORTAMIENTO DURANTE LA COCCIÓN

OBSERVACIONES
Vaso 1 agua + remolacha entera Agua toma un color rojo claro
Vaso 2 agua+ remolacha descortezada Agua toma un color morado
Vaso 3 agua + remolacha descortezada y Agua toma un color vino intenso
troceada
EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE CAROTENOIDES A PARTIR DE ACHIOTE

RESULTADOS
Absorbancia=471 ó 482 nm 1. 344
Contenido de bixina 0,2 %

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8.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

EXTRACCION Y ANÁLISIS DE CLOROFILA

 Se obtuvo un extracto cetónico de acelga de color verde obscuro.
Cromatografía circular
 Por falta de reactivos se aplicó como solvente la misma acetona, y luego se utilizó éter
etílico, este solvente arrastró las marcas del extracto de los puntos de aplicación a una
gran velocidad y se observó con claridad una mancha verde amarillenta lo que nos
indica que podría tratarse de la clorofila b.
Aunque según datos bibliográficos la acelga por ser una planta superior contiene los
dos tipos de clorofila y en mayor cantidad la clorofila pero tal vez en la cromatografía
no se identifica debido a que esta se degrada más fácilmente por lo que se observa la
clorofila b
Cromatografía ascendente en tira de papel
 El extracto de acelga mediante la Cromatografía ascendente en tira de papel no
presentó diferencia con la cromatografía circular ya que de igual manera se observó
una manchita verde amarilla y al comparar los Rf con los de la tabla de bibliografía nos
dio como resultados la existencia de clorofila b.
 Según estos resultados podemos decir que para la extracción de clorofila tanto la
cromatografía ascendente en tiras de papel como la circular son eficientes y eficaces
ya que se separó claramente y de forma definida la mancha correspondiente a
clorofila.
 Se midió la absorbancia a 549 nm con un barrido inteligente ya que 640-667 nm como
indica en la práctica no se observó ningún resultado.

Propiedades de la clorofila

 El extracto más ácido oxálico al 5% cambio de color verde obscuro a color verde pálido
esto se debe a que en medio ácido y con calor, la clorofilas pueden pasar a feofitinas
que sería la misma estructura pero se sustituye el átomo de magnesio presente en el
centro de anillo tetrapirrólico por un átomo de hidrógeno lo cual explica el cambio de
color.
 El extracto acetónico más NaOH 0.1 N cambio de color verde intenso a color amarillo
verdoso estos cambios notorios se debe a que la estructura química compleja de la
clorofila es fácilmente alterable por pH.
 No se pudo diferenciar mediante reacción la clorofila a y b ya que el reactivo utilizado
(KOH 2% en metanol) no se encontró en la concentración requerida (KOH 30% en
metanol).

ANTOCIANINAS

Esta determinación se realizó con fresas, se hizo una solución y se colocó en 9 tubos para
realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados:

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 Se pudo observar que los cambios de pH son factores muy importantes en

determinación de antocianinas ya que éstas son más estables en un medio ácido que
en un medio neutro o alcalino. Al añadirle ácidos como lo hicimos en la práctica la
forma predominante es la del ión flavión, el cual explica el color rojo anaranjado,
cuando se somete a ph básicos como NaHCO3 o NaOH el ión flavilio es susceptible al
ataque nucleofílico por parte del agua dando carbinol a pH 4,5 y seguido de la forma
chalcona lo cual explica el color que obtuvimos como resultado.
 Además obtuvimos el pH de la solución de fresas el cual es ácido lo cual concuerda con
lo estudiado ya que es más estable a pH ácido que básico o neutro.

ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIÓN SOBRE LOS PIGMENTOS

Esta determinación se realizó con zanahoria y acelga

 Después de haber sometido la muestra de zanahoria y acelga en agua con ác. Acético
o con bicarbonato de sodio se observa que existen cambios de color en las muestras
debido a la susceptibilidad de las mismas a la temperatura de cocción y al pH que se
los ha expuesto, ya que las antocianinas son sensibles al calor y pH por lo que se
degradan, los carotenoides son relativamente resistentes al calor y pH pero pueden
sufrir transformaciones parciales en su isomería geométrica lo cual provoca cambios y
de igual manera los la clorofila se degrada cuando existe altas temperaturas como es la
que se utiliza para la cocción de un alimento.

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE BETANINAS

 Pudimos observar que existen cambios de coloración en los tubos debido a

los diferentes reactivos utilizados ya que alteran la estabilidad de las
betaninas, los colores cambian cuando existe un pH muy acido bajo de 3
aquí la intensidad de la coloración decrece, cuando existe un pH básico es
color es mas intenso debido un efecto betacrómico, por lo que la
remolacha se encuentra entre un pH de 3 a 7 en donde esta es
inalterable.
 De igual forma son inestables a altas temperaturas en donde las betaninas
producen isobetatinas o betaninas descarboxiladas.
 En los vasos que contenían el alimento únicamente con agua se demoró su
cocción y la carne mantuvo su forma en cambio en los vasos con ácido
acético varió ligeramente su forma.
 Al comparar el efecto de la cocción entre los tres vasos se pudo notar que
el vaso con bicarbonato de sodio sale en el menor tiempo y un exceso de
éste hace que tanto la carne como la acelga se desmenuce y la textura sea
muy blanda.

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10.- CONCLUSIONES:

 Logramos realizar la extracción y análisis de pigmentos alimentarios vegetales.

 En la práctica se pudo extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta
vulgaris var. Cicla) mediante cromatografía circular y cromatografía ascendente en tira
de papel, no con los reactivos adecuados pero pudimos realizar la extracción y análisis
por cromatografía en papel filtro, reemplazando al papel Cromatográficos, obteniendo
buenos resultados y pudiendo distinguir el tipo de clorofila que existe en la acelga,
logrando distinguir clorofila b en el extracto de acelga tanto en cromatografía circular
como en la ascendente por papel sin embargo por no falta de metanol para la
preparación del reactivo no se pudo identificar mediante pruebas de coloración.
 Determinamos las antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca). Pudiendo obtener
resultados que se los pueden observar a la vista, y se pudo comprobar la sensibilidad
que estos compuestos presentan, siendo altamente sensibles al a luz, a medios ácidos
y alcalinos sean estos fuertes o débiles, en general en medio ácido son de color rojizo y
en el alcalino son verde oliva y el color natural que es rojo.
 Conocimos el efecto de la cocción sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria
(Daucus carota), donde conocimos el comportamiento de esta en los diferentes
reactivos en que realizamos las diferentes pruebas, conocer el efecto de la cocción
sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria y de la acelga donde al ser cocidas en
agua liberan sus pigmentos cambiando el color del agua en tanto que le dan textura
suave al alimento pues debe desnaturalizarse los componentes a la acción del calor, al
igual que sucede con el ácido acético al 10% y el NaHCO3 al 10%, con excepción en la
zanahoria no se liberan los pigmentos con ácido acético al 10%.
 Obtuvimos las betaninas presentes en la remolacha (Beta vulgaris) mediante la
extracción y análisis en la práctica.
 Determinamos y analizamos los carotenoides presentes en el achiote (Bixa orellana).

11.- BIBLIOGRAFÍA:

Pigmentos vegetales, clasificación, consultado el 2012-11-12, disponible en:

http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentos-vegetales.php

Clorofila, betalinas, carotenos, consultado el 2012-11-12, disponible en:

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm

Pigmentos alimentarios vegetales, extracción, consultado el 2012-11-12, disponible en:

http://innovaindustria.blogspot.com/2009/10/pigmentos-naturales-en-alimentacion.html

Clorofila, tipos de clorofila, cromatografía circular, papel ascendente, consultado el 2012-11-

12, disponible en: http://botikanaturista.blogspot.com/2007/01/la-clorofila.html

Fundamento de las clorofilas, carotenoides, pigmentos vegetales, consultado el 2012-11-12,

disponible en: Pigmentos alimentarios: http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol14_2_00/ali07200.htm

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Los alimentos vegetales y sus pigmentos, consultado el 2012-11-12, disponible en:

http://www.ikerlarre.e.telefonica.net/paginas/pigmentos.htm

Alimentos, consultado el 2012-11-12, disponible en:

www.kalsec.com/es/products/annatto_pg_norbixin.cfm

Alimentos naturales, consultado el 2012-11-12, disponible en:

http://bus.sld.cu/revistas/bi/vol22-1-03/ibio07103.pdf

12. ANEXOS

Pruebas con la zanahoria Pruebas con la zanahoria

Pruebas con la remolacha Pruebas con la remolacha

Determinacion de antocianinas Prueba con la remolacha

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