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Guia de Laboratorio de Microbiología PDF
Guia de Laboratorio de Microbiología PDF
FACULTAD DE MEDICINA
GUIA DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
2014
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DOCENTES DE LA CÁTEDRA:
MARCELA MARDONES
Lcda. Bioquímica Clínica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
LOIDA VELASQUEZ
Dra. Patóloga Clínica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….…………………… 4
PRÁCTICA N° 1
Bioseguridad……………………………………………………………………………………. 5
PRÁCTICA N° 2
Coloraciones……………………………………………………………….……….…………….11
PRACTICA No.3
Medios de cultivos……………………………………………………………………………....20
PRACTICA No. 4
Antibiograma………………………………………………………………………………….….32
PRACTICA NO. 5
Identificación de cocos Gram positivos…………………………..……………..………….38
PRACTICA No. 6
Orina……………………………………………………………………….………………………46
PRÁCTICA No. 7
Identificación bioquímica de bacilos Gram negativos…………………………….……..52
PRÁCTICA No. 9
Esputo…………………………………………………………………………………….………70
PRÁCTICA No. 10
Malaria o paludismo…………………………………………………………….………….…..76
PRÁCTICA No. 11
Infecciones de transmisión sexual…………………………………………..…………..….79
PRACTICA No. 12
Técnicas básicas de inmunología…………………………………………..……………....86
PRÁCTICA No. 13
Micosis…………………………………………………………………….…………………..….91
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………….....…96
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INTRODUCCIÓN
4
PRÁCTICA N° 1
BIOSEGURIDAD
CONTEXTUALIZACIÓN
Observa el video en el siguiente link https://www.youtube.com/watch?v=tXt7Zs5GBMw e
imagina los riesgos a los que nos exponemos cuando no cumplimos las normas de
bioseguridad.
CONCEPTUALIZACIÓN
La seguridad en el laboratorio se puede definir como:
"La situación carente de riesgo o con un riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un
conjunto de normas y prácticas para lograr este fin"
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Barreras secundarias: Localizadas en el círculo del operador, incluirán:
La higiene personal rigurosa.
La vacunación • Programas de salud laboral.
Vestimenta: usode ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugación, la sedimentación o el
derrame de cultivos líquidos.
Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lápiz a la boca.
No sufrir inoculación percutánea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos.
No colocarse o quitarse lentes de contacto.
No pipetear con la boca.
Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros
patógenos transportados por la sangre.
Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la
infección. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al
agua.
Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
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Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para
desechos contaminados.
Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
- Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
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cultivos almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo,
escalpelos y jeringas con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante
autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos métodos alternativos de tratamiento de
residuos.
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos
tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. La llama utilizada es la de
combustión completa, que es de mayor poder calorífico y no deposita hollín en el material de
trabajo de laboratorio que es expuesto a la misma.
Encendido del mechero: Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de
paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del cañón. Regular la
llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire.
No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.
Para obtener mayor temperatura, abrir más el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Estimados estudiantes, por favor subir un video a la plataforma Moodle con las
respectivas fotos sobre el cumplimiento de las normas de Bioseguridad de cada una de las
prácticas realizadas, así como también cuando estás no son cumplidas. No olvidar colocar las
reflexiones debajo de cada foto respecto al aprendizaje obtenido.
Nota: Este portafolio será entregado al finalizar las prácticas del primer parcial el cual debe
tener una duración de aproximadamente 4 a 5 minutos
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8. ¿Qué procedimientos debe tener en cuenta el personal o los estudiantes durante su
trabajo en el laboratorio?
Manual Bioseguridad OMS, tercera edición, Ginebra 2005 (Leer lás págs.
1,2,3,10,11,12) Archivo
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PRÁCTICA N° 2
COLORACIONES
OBJETIVOS
CONTEXTUALIZACIÓN
CONCEPTUALIZACIÓN
Coloración Gram
Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los
componentes químicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared
celular poco permeable y resisten la decoloración. Las Gram negativas poseen una
pared celular más permeable, se decoloran y luego adquieren la coloración de la
safranina.
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Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus
Bacilos Gram-negativos
• Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
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También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.
a. Realización de la extenslón
Producto lÍquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del
producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de
modo que la extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede
ser diluido antes ligeramente.
Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua ó solución
salina estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener
un frotis fino y homogéneo.
Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar sobre el primer
tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequeña gotita de sangre. Hacer
contactar con la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinará 45 °C.
La sangre alcanza por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia
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la parte libre del primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un
solo movimiento, sin detener ni volver atrás.
Órganos: seccionar un pequeño fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con ésta porción una
extensión o una serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se
obtengan preparaciones finas.
b. Secado
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
c. Fijación
Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de la misma es hacer adherir el
frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de
las proteínas.
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pericárdico, pleural
Oído externo Eliminar la costra con solución fisiológica estéril
Absceso superficial Limpiar la zona con solución fisiológica estéril o alcohol al
70%. Pasar el hisopo sobre los bordes de la herida
Absceso profundo Limpiar la zona con solución fisiológica estéril o alcohol al
70%. Aspirar el material de la pared o extraer tejido.
Catéteres IV, clavos, Desinfectar la piel antes de la extracción. No cultivar
válvulas prostáticas catéteres de Foley; se obtienen cultivos cuantitativos de los
catéteres IV al hacer rodar el segmento sobre el agar 4 veces
con un fórceps estéril; valores ≥ 15 colonias se asocian con
significado clínico.
Orina, chorro medio previa Mujeres: limpiar la zona con un antiséptico suave, luego
higiene enjuagar con agua; mantener separados los labios mayores y
comenzar a evacuar en el inodoro; recoger el chorro medio
después de eliminar varios ml.
Varones: limpiar el glande con un antiséptico suave, luego
enjuagar con agua; retraer la piel del glande; recoger el
chorro medio después de eliminar varios ml.
Punción suprapúbica Desinfectar la piel. Aspiración con aguja por encima de la
sínfisis pubiana, a través de la pared abdominal, hasta la
vejiga llena
Sangre o médula ósea Desinfectar el sitio de punción venosa con alcohol al 70% y
desinfectante, p. ej., betadina. Extraer sangre durante el
episodio febril; extraer dos muestras, de brazo izquierdo y
derecho; no extraer más de tres muestras en un periodo de
24 horas
Tracto genital femenino: Eliminar moco antes de recolectar la muestra. No usar
Cérvix lubricante en el espéculo; usar ,medio de transporte para
clamidias, de ser necesario; tomar muestra de la profundidad
del canal endocervical.
Tracto GI: aspirado gástrico Recolectar temprano por la mañana, antes de que el paciente
coma o salga de la cama. La mayoría de los aspirados
gástricos se obtienen de lactantes o para BAAR
Hisopado rectal Insertar el hisopo aproximadamente 2,5 cm por dentro del
esfínter anal
Cultivo de materia fecal Cultivo de rutina debe incluir Salmonella, Shiguella y
Campilobacter; especificar Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,
Yersinia, escherichia coli O157:H7, según necesidad
Vías respiratorias inferiores Esputo: Enjuagar o hacer gárgaras con agua antes de la
recolección
Vías respiratorias Insertar un hisopo flexible a través de la nariz, hasta la
superiores: nasofaringe nasofaringe posterior, y rotar durante 5 segundos; muestra
de elección para Bodertella pertussis
Faringe (fauces) Pasar el hisopo por la faringe posterior y las amígdalas;
cultivo de rutina solo para Streptococcus grupo A (S.
pyogenes)
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Coloración de Ziehl Neelsen
El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los ácidos y se
tiñe de rojo con la coloración de Ziehl Neelsen con la fucsina fenicada. No se pueden
decolorar por medio de ácidos o etanol (son bacilos alcohol-ácido resistentes o BAAR),
en tanto que casi todos los demás microorganismos se tiñen de azul.
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Cómo examinar las preparaciones
Haga un examen completo del primer portaobletos empleando el objetivo de inmersión (100x)
en aceite, con iluminación máxima y sin filtro de color.
Placa positiva: una vez que se hayan examinado 10 bacilos resistentes a los ácidos.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Experimentación
1. Durante la clase los estudiantes deben aprender a manejar el mechero de Bunsen y el
uso de las asa microbiológicas.
2. Realizarán frotis de muestras biológicas líquidas, sólidas y de esputo.
3. Efectuarán tinciones como la coloración Gram (dos placas por grupo) y BAAR (una
placa por grupo). Por favor traer mascarilla.
4. Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
RESPONDER AL CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los reactivos y tiempos empleados para la coloración Gram y BAAR?
2. ¿Porqué la Escherichia coli puede adquirir el color de la safranina?¿De qué está
compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
3. ¿Porqué el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
safranina? ¿De qué está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. ¿Porqué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno?
¿De qué está compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
5. ¿Cómo realiza una placa con frotis para coloración Gram de una muestra de orina y de
un agar sangre?
6. ¿Cómo realiza una placa con frotis para coloración BAAR de una muestra de esputo y
de orina?
7. ¿Cual es el método para observar las placas teñidas con Gram o BAAR en el
microscopio?
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8. ¿Qué debe realizar para recolectar muestras de médula ósea, pleural y de la faringe?
9. Problema: María Augusta tiene un resultado de BAAR de 1 a 9 bacilos en 100 campos.
¿Cuál es la interpretación de este resultado?
10. ¿Qué coloración adquiere el Streptoccocus pneumoniae cuando se lo tiñe con Zhiel-
Neelsen? ¿Es posible diferenciarlo de otras bacterias?
11. ¿Qué coloración adquiere el Micobacterium tuberculosis cuando se lo tiñe con Gram?
¿Es posible identificarlo mediante esta técnica?
12. ¿Qué errores observaron durante la práctica en cuanto a la realización de los frotis,
coloración y manejo del microscopio?
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PRACTICA No.3
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS:
Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano
Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo como agar sangre
Observación en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento
y realización de coloración Gram
CONTEXTUALIZACIÓN
Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriológico incluye el cultivo del producto
a examinar. El cultivo bacteriano tiene tres propósitos principales:
Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infección.
Determinar cuáles bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de
la infección y cuáles son contaminantes probables o colonizadores.
Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clínica para permitir su
identificación y caracterización.
Necesario para los estudios complementarios como los de la sensibilidad de las
bacteriuas a los distintos antibióticos.
Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofas. Las primeras comprenden las
bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la materia
inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas reguieren compuestos orgánicos más complejos
como fuente de carbono y nitrógeno, así como proteinas o sus derivados, también requieren
carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos es el más importante en
bacteriología médica.
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Proteínas. Se suministran generalmente como "peptonas', que se encuentran disponibles, en
el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas; consisten en
polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.
Factores accesorios de crecimiento. Son también requeridos por algunas bacterias. Entre
ellos están las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina). Estas
suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar. Otros factores
necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos, como el
suero, la sangre, la yema de huevo, etc.
Sales minerales. Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. también son requeridos por
algunas bacterias en su desarrollo.
Luz. La mayoría de las bacterias se desanollan mejor en ausencia de luz. La luz del sol, con
su componente ultravioleta, puede incluso ser letal.
Reacción. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2
a 7.6), pero existe también un límite de potencialidad bastante amplio. Los hongos crecen con
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facilidad en medios ácidos (pH 5) mientras que el medio especial para el crecimiento del
Vibrio cholerae debe ser marcadamente alcalino (pH 9.6)
De acuerdo a su consistencia
Líquidos: Utilizados generalmente para obtener crecimiento rápido y masivo; en estos medios
las bacterias conservan su forma original y características.
Semisólidos: Útiles para investigar movilidad y conservar las bacterias por períodos largos,
contienen de 1-1 5% de agar
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Los medios de apoyo o universales contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la
mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en
el crecimiento de un microorganismo en particular.
Los medios selectivos contienen uno o más agentes que inhiben todos los microorganismos
excepto los que son buscados. En otras palabras, estos medios seleccionan el crecimiento de
ciertas bacterias e inhiben el de otras. Los agentes inhibidores utilizados para este propósito
son colorantes, sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos. Un ejemplo es el agar con
alcohol feniletílico, que inhibe el desarrollo de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos, y permite el crecimiento de cocos Gram positivos.
Los medios diferenciales emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una
especie o tipo bacteriano exhiban ciertas características metabólicas o de cultivos que pueden
utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.
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Un ejemplo de medio de transporte es el medio de Stuart. Se utiliza en una unidad
descartable de cultivo, denominado Culturette, que consiste en un tapón estéril de poliestireno
y una ampolla del medio de Stuart. Después de recoger la muestra, se coloca en el tubo y se
aplasta la ampolla para liberar el medio alrededorr del extremo de tapón. Este tipo de medio
no es adecuado para aislar anaerobios sensibles al oxígeno.
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de amonio férrico. Los indicadores aislamiento y diferenciación
son el azul de bromotimol y la de especies de Salmonella
fucsina ácida y Shiguella de otros bacilos
entéricos gramnegativos
Agar MacConkey Base de peptona con lactosa. Los Aislamiento y diferenciación
microorganismos grampositivos son de bacilos entéricos
inhibidos por el cristal violeta y las gramnegativos
sales biliares. Rojo neutro como fermentadores y no
indicador fermentadores de la lactosa
Agar manitol salado Base de peptona, manitol y rojo Aislamiento selectivo de
fenol como indicador. La estafilococos
concentración de sal al 7,5% inhibe
la mayoría de las bacterias
Agar sangre Agar con sustrato nutritivo (extracto Cultivo de microorganismos
de levadura,peptona, hidrolizado de con requerimientos
hígado), cloruro de sodio, con 5% especiales de cultivo,
de sangre de cordero determinación de
reacciones hemolíticas
Agar Thayer-Martin Agar sangre base enriquecido con Selectivo para N.
hemoglobina y suplemento B; los gonorrhoeae y N.
microorganismos contaminantes meningitidis
inhibidos por colistina, nistatina,
vancomicina y trimetoprima
Caldo para Caldo base de peptona con glucosa Medio líquido selectivo
gramnegativos (GN) y manitol. El citrato de sodio y el (enriquecimiento) para
desoxicolato de sodio actúan como patógenos entéricos
agentes inhibidores
Caldo selenito Caldo base de peptona. El selenito Enriquecimiento para el
de sodio resulta tóxico para la aislamiento de las especies
mayoría de las Enterobacteriaceae de Salmonella
Caldo tetrationato Caldo base de peptona. Las sales Selectivo para especies de
biliares y el tiosulfato de sodio Salmonella y Shigella
inhiben los microorganismos
grampositivos y Enterobacteriaceae
Caldo de tioglicolato Digerido pancreático de caseína, Favorece el crecimiento de
caldo de soja y glucosa que anaerobios, aerobios,
enriquece el desarrollo de la microaerófilos y
mayoría de los microorganismos. El microorganismos exigentes
tioglicolato y el agar reducen el
potencial rédox
Caldo tripticasa soja Caldo enriquecido con múltiples Caldo de enriquecimiento
(TSB) propósitos que puede favorecer el utilizado para el subcultivo
crecimiento de muchas bacterias de diversas bacterias de
con requerimientos especiales de cultivos primarios en placas
cultivo y sin ellos de agar
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MEDIOS USADOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO
CARACTERÍSTICAS DE LA COLONIA
Es importante destacar las características clave de una colonia bacteriana para toda
identificación bacteriana; el éxito o el fracaso de los procedimientos posteriores de
identificación a menudo dependen de la precisión de estas observaciones. Los criterios
utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano son:
Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que
se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja
petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efectúa un
pequeño inóculo en el borde, de allí se parte la primera estriación; luego de la esquina de una
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de las estrías de la primera estriación se realiza la segunda estriación y finalmente de la
esquina de una de las estrías de la segunda estriación, se realiza la tercera estriación,
procurando hacer las estrías mucho más separadas de las dos primeras, con la finalidad de
separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora,
colocándola de lado contrario al que se sembró y se la deja en las condiciones apropiadas
para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmósfera, potencial rédox, tiempo, etc.)
Debe trabajarse siempre cerca de un mechero de Bunsen al inocular, ya que la corriente
asendente de aire va por la flama, arrastra el polvo, etc.; con el aire hacia arriba, alejándole de
la placa, y cuando el aire se enfría, el polvo se precipita lejos de la placa.
A menudo se reciben torundas para cultivo; en vez de recogerse material con el asa, deben
emplearse las torundas corno material primario de inoculación a partir del cual se distribuye
con el asa en la forma descrita más adelante. Deben ser subrayados ciertos puntos de
importancia sobre el uso del método de placas; por ejemplo, las placas deben estar
preferentemente secas antes de usarse, para que los microorganismos no se extiendan,
impidiendo la formación de colonias aisladas.
Medios inclinados: Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas
aisladas, sea para identificación ulterior o para base de cultivo. Se requiere práctica y siempre
debe hacerse cerca del mechero de Bunsen; el cuello del tubo o del frasco debe ser flameado
antes de recubrirlo o de volver a colocar el tapón de algodón (método que se usará en la
práctica No. 7 Pruebas bioquímicas).
Cultivos líquidos: Al inocular un medio líquido como el agua de peptona o el caldo con
tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae el asa por frotamiento contra la pared del
tubo. Cuando éste se endereza, el material se encuentra bajo la superficie del medio.
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FACTORES DETERMINANTES EN LA PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE
CULTIVO
4. Tensión de oxígeno:
4.1. Aislamientos de aerobios: como la respiración es su única fuente de energía,
los microorganismos aerobios deben tener una provisión adecuada de oxígenó en
su ambiente, se pueden satisfacer las demandas de oxígeno de las siguientes
maneras:
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Se pueden mezclar ácido pirogálico y carbonato de sodio en una cápsula o un frasco,
que luego se coloca en un recipiente sellable más grande que contiene los frascos de
cultivo o las placas de agar. Cuando se mezclan el ácido pirogálico y el carbonato de
sodio, se absorbe oxígeno y se libera CO2, creando de este modo un ambiente
anaerobio.
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tales medios mínimos de agar y luego se sellan con cera para preservarlos a las temperaturas
de refrigeración. Una varilla de agar del cultivo se puede recubrir con parafina líquida y
almacenar durante años, se ha aplicado esta técnica para la preservación de los hongos. A
menudo se almacenan las bacterias esporuladas en suelo estéril. En primer término se seca
el suelo a la temperatura del ambiente y luego se almacena a la temperatura de refrigeración.
Congelación: La mayoría de las Bacterias pueden ser congeladas en varios tipos, de medios,
se congelan rápidamehte las muestras a temperaturas de -20 a 30°C para mantener la mayor
parte de las células en un estado viable. Se han empleado con éxito temperaturas ultrabajas
utilizando el hidrógeno líquido, a fin de almacenar y preservar una amplia variedad de células,
incluso hongos, virus, y hematíes.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN:
1. Los estudiantes procederán a realizar siembras en agar sangre cuyos resultados se
observarán en la siguiente semana.
2. Se evaluará el portafolio de coloraciones
3. Realizar el portafolio de la práctica e incluir los resultados, reflexiones y el cuestionario en el
mismo.
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7. El agar MacConkey se considera un
medio……………………………………………………..porque permite reconocer las
bacterias que fermentan o no la lactosa, también es considerado un medio selectivo ya
que contiene …………………………………………………………y violeta cristal que
inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas.
8. ¿Cómo se llama el medio de cultivo que sirve para el asilamiento selectivo de cocos
Gram positivos y bacilos anaerobios Gram negativos, inhibiendo el crecimiento de
bacilos Gram negativos?
9. Escriba el nombre de un medio de cultivo que permita el crecimiento de especies de
Neisseria (gonorrhoeae y N. meningitis).
10. Escriba el nombre de un medio de cultivo que reducen el potencial rédox favoreciendo
el crecimiento de anaerobios.
11. Mencione los criterios utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento
bacteriano.
12. Mencione los 5 factores determinantes para la preparación de un medo de cultivo.
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PRACTICA No. 4
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:
Conocer y realizar el método convencional de difusión en discos
Interpretar la sensibilidad y resistencia que presentan diferentes bacterias a los
antibióticos
CONTEXTUALIZACIÓN
Las enfermedades infecciosas siempre han sido un problema grave para el hombre, el
hallazgo de sustancias eficaces que pudieran ser utilizadas en el tratamiento de estas
enfermedades se remonta al siglo XVll en el que ya se emplearon sustancias químicas como
la quinina para la malaria.
Hacia el año de 1900, el trabajo de Paul Ehrlich marca el inicio de la quimioterapia como
ciencia pues este científico establece los principios de la toxicidad selectiva, el desarrollo de la
resistencia a los medicamentos y el uso de la terapia combinada para combatir dicha
resistencia.
Reactivos y Materiales
1. Agar de Mueller Hinton: Preparar el agar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Una vez salido del autoclave permitir que el medio alcance entre 45 y 50°C, es
recomendable para asegurarse de tener esta temperatura colocar el medio que sale del
autoclave, en un baño María a 48°C y mantenerlo ahí por un tiempo prudencial hasta
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que la temperatura interna del medio contenida en el recipiente alcance la temperatura
deseada.
Reactivos: Cloruro de Bario 0.048M (1.75%p/v), Acido Sulfúrico 0.3N (1% p/v).
Añadir 0.5 ml de Cloruro de Bario a 99.5ml de Acido Sulfúrico. La densidad óptica en un
espectrofotómetro a 625nm que debe dar 0.08 a 0,10 de absorvancia.
Técnica
Una vez sembrado y obtenido el crecimiento de los microorganismos de una muestra clínica,
“evaluar correctamente” el hallazgo antes de decidir la realización del antibiograma.
Seleccionar 4 a 5 colonias similares del microorganismo suceptible de practicar el
antibiograma y colocarlas en el caldo de cultivo.
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En las bacterias exigentes tales como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y
Streptococcus pneumoniae, obviar el paso de crecimiento en caldo y preparar un inóculo
directamente en 4 a 5 ml de solución salina y ajustarlo con el estándar MacFarland # 0,5 para
luego inocularlo en las cajas petri.
lntroducir un aplicador estéril en el caldo de crecimiento, eliminar el exceso por rotación en las
paredes del tubo luego inocular en un sentido en toda la superficie de la caja petri y repetir el
paso anterior en dos sentidos diferentes para finalizar la inoculación pasar el aplicador por la
periferia del medio de cultivo.
Permitir secar la siembra mediante el reposo por un lapso de 3 a 5 minutos y no más allá de
15 minutos.
lntroducir la pinza en el frasco de alcohol y pasarla por el mechero esperar hasta que el fuego
de la pinza se consuma. Colocar los discos de los antibióticos seleccionados con la pinza e
impregnarlos en la superficie de las placas inoculadas haciendo una ligera presión sobre ellos.
.
La selección de los agente antimicrobianos se denominan batería de antimicrobianos, las
decisiones finales con respecto al contenido de la batería deben ser tomadas por el
laboratorista, el personal médico (en particular de los especialistas en enfermedades
infecciosas) y de la farmacia.
El siguiente paso es incubar a 35°C en un ambiente de aerobiosis sin CO2 ya que puede
alterar el pH de la superficie y consecuentemente el desarrollo de los microorganismos
inoculados, excepto para Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae cuyas variaciones
de estandanzación fueron determinadas bajo ese parámetro, chequear adecuadamente la
temperatura de la incubadora ya que si sobrepasa la temperatura ideal puede afectar la
prueba.
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Luego de 16 a 18 horas de incubación se procede a la lectura de las zonas, de inhibición, para
ello se puede utilizar una regla o también se puede utilizar plantillas previamente diseñadas
para el efecto. Una vez hecha la lectura de los halos de inhibición se procede a comparar con
las tablas pertinentes para establecer la categoría con la cual será clasificado el
microorganismo para cada uno de los antibióticos.
Métodos de prueba
Métodos que miden directamente la actividad de antimicrobianos en forma directa
Las mediciones directas de la actividad antimicrobiana se hacen mediante:
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El NCCLS publica tablas actualizadas que enumeran los posibles agentes antimicrobianos a
incluir en las baterías de prueba contra determinados microorganismos o grupos de
microorganismos.
DISCOS DE ANTIBIÓTICOS USADOS PARA GÉRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM
NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Continuando con la práctica anterior, cada estudiante realizará la observación de las
colonias sembradas en agar sangre y realizará la coloración Gram de dos
colonias diferentes, observar en el microscopio y anotar los resultados de todos los del
equipo de trabajo en un cuadro para el informe pendiente.
2. Se realizará el antibiograma y su respectiva interpretación. Trabajo grupal.
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PRACTICA NO. 5
OBJETIVOS:
Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para la identificación
Realizar los diferentes métodos de identificación de las familias y géneros de cocos
Gram positivos
Reconocer algunas especies mediante las técnicas de identificación empledas
Son cocos gram positivos, aparecen solos, en pares, tetradas, paquetes de ocho y en
racimos. No mótiles, no esporulados, catalasa (+), reducen nitratos a nitritos.
Las colonias son redondas, lustrosas, blancas aunque también existen especies pigmentadas.
Forman esta familia especies Saprófitas, parásitas y patógenas que se encuentran
distribuidas ampliamente en la naturaleza
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Puede infectar cualquier parte del cuerpo humano, es la causa más común de infecciones
supurativas, en casos severos puede producir septicemias, es frecuentemente el agente
causal de la ostiomielitis.
Cepas de S. aureus cuando crecen en altas concentraciones de CO2 (30%) pueden producir
una enterotoxina termoestable, causante de envenenamiento por alimentos.
Otras cepas producen una toxina epidermolítica (exfoliativa) causante del síndrome de piel
escaldada.
Staphylococcus epidermidis:
Se lo encuentra en el aire y en la piel. Normalmente no patógeno, pero puede causar
infecciones secundarias de la piel, heridas posquirurgicas y endocarditis posoperatorias.
Staohylococcus saprofiticus:
Se lo encuentra en el aire, polvo y productos animales. Generalmente considerados no
patógenos, pero en ocasiones puede producir infecciones urinarias.
Peptococcus:
Son anaerobios estrictos se los considera los Estafilococos anaeróbicos, se los encuentra en
cultivos de heridas profundas.
39
FAMILlA Streptococcaceae
Son cocos gram positivos que se dividen en un solo plano, formando pares o cadenas,
aerobios y anaerobios facultativos. No producen esporas, no son mótiles. Son catalasa
negativa.
Este género contiene organismos patógenos para el hombre. Los más importantes
son:
40
Además las infecciones causadas por Estreptococos del grupo A pueden llevar a síndromes
post-infecciosos de fiebre reumática, cardiopatías reumáticas y glomérulo nefritis aguda.
Los estreptococos tienen hemolisinas que actúan de diferente manera en agar sangre:
Hemólisis beta: zona clara alrededor de la colonia
Hemólisis alfa: zona de hemólisis incompleta (verde).
Hemólisis gamma: ausencia de hemólisis
Streptococcus pneumoniae
Son dipldcocos gram positivos, con los extremos alargados en forma de lanza, también se
agrupan en cadenas; no forman esporas, no mótiles, poseen una cápsula formada de
polisacáridos específicos, lo que permite una tipificación con antisueros específicos.
Patógenos para el hombre, producen neumonías, meningitis, otitis y endocarditis. Crecen bien
en agar sangre y chocolate en atmósferas que contienen el 10% de CO2.
PRUEBAS DE LABORATORIO
-Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en
oxígeno y agua.El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido
de hidrógeno es letal para las células bacterianas.
41
2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
Procedimiento: En una placa portaobjetos añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%
(diluir la solución al 30% con agua destilada), transferir células del centro de una colonia bien
aislada y mezclar. La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o
efervescencia indica una reacción positiva.
42
-Novobiocina: Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma ó también en agar
sangre.
Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es. Pueden ser
sensibles o no a la novobiocina (5 µg). Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que
Staphylococcus saprophyticus no lo es.
Procedimiento: Se toma un agar Muller Hinton ó agar sangre y en un lado de la placa se
estria con el asa en forma continua la cepa del Staphylococcus coagulasa negativo, con una
pinza estéril se coloca el disco de novobiocina en el centro del estriado realizado se incuba a
35°C por 18 horas.
Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16 mm
correswponde Staphylococcus saprofiticus. Un halo de inhibición mayor de 16 mm
corresponde al Staphylococcus epidermidis (también pueden ser otros estafilococos
negativos).
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-Bilis esculina: Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde
oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
-Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y
otras especies de estreptococos a hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es
una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el
clorhidrato de etilhidrocupreína.
Procedimiento: Se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la
estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al 5 %(jarra con vela)
durante 24 hs. a 35° C.
Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera como punto
de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el
crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben
resolverse por acumulación de pruebas a favor o en contra.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Se realizarán pruebas de:
- Catalasa para diferenciar a la familia Micrococcaceae de Streptcoccoceae
-Coagulasa para identificar al Staphylococcus aureus
-Novobiocina, bacitracina, optoquina, Camp
- Diferenciar hemólisis en agar sangre
2. Realizar el portafolio de la práctica correspondiente y colocar los resultados obtenidos.
44
a. ¿Cuales serían los pasos para la identificación del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 5.1.?
c. ¿Qué antibióticos emplearía?
6. José Antonio presenta fiebre reumática, su médico solicita realizar exámenes
microbiológicos para detectar el microorganismo presente:
a. ¿Cuales serían los pasos para la identificación del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. ¿Cuál sería el microorganismo presente según los resultados del literal 6.1.?
c. ¿Qué antibióticos emplearía?
7. Utilizando una foto explique la prueba de Camp.
8. Verdadero o falso:
Es mejor sembrar al Streptococcus pneumoniae en agar chocolate que en agar sangre
(justifique su respuesta).
9. Mencione dos diferencias entre enterococos y no enterococos.
10. ¿Por qué razón especies de bacterias del género Micrococcus crecen bien en agar
sangre en una atmósfera con oxígeno?
11. ¿Cómo identificaría al Staphylococcus saprofyticus del Streptococcus pneumoniae?.
Mencione dos pruebas microbiológicas.
12. ¿Según el grado de hemólisis como puedo identificar al Streptococcus pneumoniae del
Streptococcus pyogenes?. Mencione dos pruebas microbiológicas.
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PRACTICA No. 6
ORINA
OBJETIVOS:
Conocer la forma adecuada de recolección de una muestra de orina tanto en hombres
como en mujeres
Realizar el examen elemental y microscópico de orina y Gram gota fresca
Conocer la realización de un urocultivo y los diferentes microorganismos que pueden
estar presentes
CONTEXTUALIZACIÓN
El examen general de orina de rutina ó urianálisis es una de las primeras pruebas usadas
para la identificación de patología en las vías urinarias y es parte indispensable de la patología
clínica. Puede proporcionar una estimación de la función renal, dar información sobre las
posibles causas de disfunción e incluso puede indicar enfermedad sístémica. El examen
general de orina es un estudio cuidadoso y sistemáticos de las própiedades físicas, químicas
y microscópicas de la orina. Aunque los datos que se obtienen sólo en ocasiones ayudan a
dar un diagnóstico tentativo, al mismo tiempo sirven de guía para seleccionar pruebas más
específicas para un diagnóstico definitivo.
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
-La información adecuada al paciente es esencial, deben prepararse pautas para la obtención
apropiada de la muestra en una tarjeta impresa, con el procedimiento descrito y
prefentemente ilustrado para asegurar el cumplimiento por parte del paciente.
-Debe indicarse al paciente que se lave y enjuague bien las manos
-Luego que higiniece bien el área periuretral con un antiséptico suave para evitar la
contaminación.
-Indicar al paciente que se enjuague muy bien, porque el antiséptico puede ser
bacterioestático, en las mujeres se debe hacer que escurra el agua de adelante hacia atrás.
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-Una vez completada la higiene, el paciente debe retraer los labios vaginales o el glande del
pene, empezar a orinar. En cuanto cierta cantidad de orina haya limpiado la entrada uretral
obtener una muestra de orina del chorro medio de la micción, se coloca el frasco de
recolección en posición con la mano libre, sin tocar la superficie de el borde interno de la
abertura con los dedos, es importante indicar a los varones que la punta del pene no debe
tocar ninguna de las partes del frasco recolector en ningún momento.
-Cuando la muestra esté dentro del frasco, se tapa tan pronto como sea posible para evitar la
contaminación bacteriana proveniente del aire. Es indispensable no tocar la superficie intena
de la tapa. El frasco de recolección debe ser estéril.
-Llevar de inmediato al laboratorio, cuando hay que esperar más de una hora se debe
refrigerar.
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- Microscópico: leucocitos, eritrocitos, células bajas, células altas (se reporta número por
campo en 10 campos con lentes 40x), moco, bacterias, cristales, parásitos, hongos (se
reporta por cruces en 10 campos con lentes 40x) y cilindros se reporta número por placa (con
lentes de 10x).
Los organismos que pueden encontrarse en la orina incluyen: Escherichia coli, Proteus,
Pseudomona aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, enterococos,
Mycobacterum tuberculosis, Serratia, Klebsiella y Enterobacter.
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Una vez recogida la muestra en las condiciones anteriormente descritas se debe proceder a
cultivar enseguida, no debe pasar más de una hora entre la recogida de la muestra y el
cultivo.
El cultivo de la muestra de orina comprenderá preferiblemente una técnica cuantitativa y otra
cualitativa.
Puesto que en la orina nos encontramos con organismos Gram positivos y negativos es
necesario realizar cultivos para ambos grupos.
Así se utilizará agar sangre para los Gram positivos (se puede añadir ácido nalidixico
colimicina para evitar crecimiento de Gram negativos) y Mc Conkey o EMB para los Gram
negativos.
El cultivo cuantitativo de la orina puede verificarse bien con una asa de 0.001ml, se utiliza
muestra no centrifugada.
El número total de bacterias encontradas por mililitro es el siguiente se cuenta cuantas
colonias crecieron y se multiplica por 1000.
Una bacteriuria infenor o igual a 10.000 gérmenes por ml se considera que no tiene
significación patológica, más allá de los 100,000 gérmenes por ml, la infección urinaria es
prácticamente segura.
Entre 10.000 y 100.000 gérmenes por ml, la repetición del examen y el contexto clínico son
indispensables para una correcta interpretación.
La presencia de 104 /ml de un solo tipo de bacilo Gram negativo es una indicación consistente
de infección de vias urinarias, en especial en varones. En algunas ocasiones en mujeres
jóvenes con disuria e infección de vías urinarias agudas tendrán 102 o 103 por mililitro.
Así, la interpretación de los resultados del cultivo de orina depende del método de recogida y
entrega al laboratorio, de los tipos y número de bacterias presentes y de la valoración de
estos hallazgos en relación con el cuadro clínico del paciente.
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PRUEBA DE BAAR EN ORINA
Cuando se sospecha de una infección tuberculosa del aparato urinario, deberá examinarse el
sedimento de la orina centrifugada por media hora a 3000 rpm por seis días consecutlvos. Se
recomienda la recogida de la orina matutina pero todo su volumen en recipientes estériles.
Las extensiones del sedimento se tiñen mediante la coloración de Ziehl Neelsen y se busca la
presencia de organismos ácido resistentes.
Para el reporte igual que para esputo, si se siembra esta muestra en medio de Lowenstein
Jensen se debe tratar previamente a la muestra por digestión como a la muestra de esputo.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
EXPERIMENTACIÓN
1. Cada grupo de trabajo recibirá una muestra de orina para que le realicen un EMO,
Gram gota fresca y un urocultivo. Para esta actividad los estudiantes deben revisar los
procedimientos mencionados y la manera en que se deben reportar. Se evaluará el
informe durante la clase.
51
PRÁCTICA No. 7
OBJETIVOS:
Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa
en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan
ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan,
en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El
indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil
para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo
negativo).
Procedimiento y resultado:
Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.
Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color.
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.
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2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico
un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes
del agregado de KOH.
Procedimiento y resultados:
3.PRUEBA DE LA UREA
Principio
La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2
moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de
la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una
actividad característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de
Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de
Yersinia pestis (-)
Procedimiento y resultados
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Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías
que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día por día.
Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
Procedimiento y resultados
Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM.
Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el reactivo.
Si el ensayo es negativo no hay cambio ded c o hay un color amarillo en la
interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
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5. AGAR KLIGLER (TSI)
Principio
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que
no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos
alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un
ennegrecimiento del medio.
Resultados
Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa (E.
coli)
Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
(Shigella spp.)
Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa)
Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp)
Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.)
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6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)
Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilación de
lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se
debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos
etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0),
apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la
decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el
pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
Procedimiento y resultados:
Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos
Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
Incubar a 37ºC
Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día
Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)
Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado
para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como
única fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con
56
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es
negativo se mantiene verde.
Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C
durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría,
acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli
8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido
carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido fenilpirúvico que
con Fe3Cl en solución ácida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es
negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
7. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, de esta manera se puede observar si se utiliza al
malonato como fuente de carbono.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
1. Efectuar la siembra en los medios de cultivo para la identificación de bacilos Gram
negativos, partiendo de un medio Mac conkey en donde un microorganismo "x" se ha
desarrollado. Trabajo grupal, venir estudiando la práctica, se evaluará durante la
clase.
2. Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
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PRÁCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)
COPROLÓGICO Y COPROPARASITARIO
Objetivos:
-Realizar el examen coproparasitario utilizando soluciones apropiadas
-Identificar diversos parásito causantes de infecciones
-Muestras frescas deben ser examinadas o procesadas dentro de los 30 minutos posteriores a
la recolección pues es más probable que en estas se encuentren trofozoitos mótiles. Las
muestras blandas pueden ser examinadas hasta después de 2 horas.
-Guardar a temperatura ambiente máximo por 1 a 2 horas. En refrigeración hasta por 48 horas
si no dispone de preservantes.
- Preserve las muestras tan pronto como sea posible. La muestra debe ser dividida y
guardadas en dos diferentes preservantes: formalina al 40% y PVA.
-Asegúrese de que la muestra se mezcle bien con el preservante (heces formadas necesitan
ser bien desarmadas).
-Asegúrese de que el recipiente esté bien sellado. Refuerce con parafilm y otro material.
Guarde el recipiente en una funda plástica.
Observaciones:
- Ciertas drogas y compuestos pueden provocar que la muestra sea insatisfactoria para la
examinación. Las muestras deben recolectarse antes de que estas sustancias sean
administradas o después de que los efectos hayan pasado. Tales sustancias incluyen:
antiácidos, caolín, aceite mineral y otras sustancias que contengan aceites, antidiarreicos no
absorbibles, bario o bismuto (se necesitan 7 a 10 días para superar estos efectos), agentes
antimicrobianos (2 a 3 semanas) y pigmentos biliares (3 semanas).
58
2. Examen corpológico y coproprasitario
a. Macroscópico:
Examine macroscópicamente usando un aplicador para detectar la presencia o ausencia de:
proglótides, escólex o gusanos adultos. Puede encontrar proglótides mótiles de tenias entre o
sobre las heces. Ocasionalmente puede encontrar en la superficie de las heces gusanos de
Ascaris y Enterobius.
La consistencia de las heces nos puede dar una idea del estado de vida del parásito que
buscamos, así para protozoarios intestinales: las formas quísticas serán posiblemente más
observadas en heces formadas o semiformadas, pastosas; mientras que los trofozoitos se
hallarán en heces semilíquidas y líquidas.
En el caso de los helmintos intestinales, huevos, larvas se pueden encontrar en heces fecales
de cualquier consistencia. Se puede sospechar de infección amebiana cuando las heces
fecales están Iíquidas y gaseosas.
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MOCO: su aparición suele ser reconocida macroscópicamente. Si está mezclado con las
heces, dando un aspecto brillante, procede del intestino delgado. Moco en colon distal, moco
opaco, mezclado con células epiteliales, sangre o pus es indicativo de un proceso inflamatorio
(enteritis o colitis).
El moco también está presente en heces fecales de pacientes con infección donde se hallarán
trofozoitos.
b. Microscópico:
Para el examen microscópico se necesita de las siguientes soluciones:
Solución de lugol:
- Hace más notable la estructura interna de los parásitos intestinales.
Los quistes se tiñen rnuy bien con el lugol haciendo posible la identificación correcta de la
especie: se puede observar el número y estructura del nucleo, la cromatina toma un color café
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oscuro, el citoplasma un color amarillo o naranja, las masas de glucógeno se tiñen de café
rojizo. Los cuerpos cromatoides son menos visibles que en solución salina
- Destruye la motilidad de los trofozoitos.
- Se observan mejor las caracterfsticas morfológicas de huevos y larvas de helmintos
intestinales.
-Facilita también la observación de los siguientes elementos:
CÉLULAS:
- La presencia de células epiteliales es indicativo de irritación gastrointestinal.
- Los eritrocitos no deben ser observados en condiciones normales. Su presencia evidencia
sangrado en la parte baja del apararato digestivo.
- Los leucocitos normalmente no se observan o son escasos. Números elevados aparecen
en las inflamaciones gastrointestinales; indican principalmente infección bacteriana. Se
pueden observar macrófagos y leucocitos en los casos de disentería amebiana crónica con
invasión bacteriana secundaria. Los eosinófilos son numerosos en la amebiasis
especialmente en la fase aguda.
- Los PMN (polimorfonucleares) pueden ser identificados por presentar forma redonda o
irregular, de 10 a 20 µ, citoplasma claro, refringente, granuloso y el núcleo escasamente
notable. Se los puede observar mejor si se añade una gota de ácido acético al 10% a la
emulsión de heces. Se debe informar en que cantidad se encuentran por campo. Si se
observan más de 10 leucocitos por campo, se hace una lámina y se colorea con Wright, se
hace el recuento diferencial y si hay mayor cantidad de neutrófilos (polimorfonucleares) la
infección es causada por bacterias, si hay mayor cantidad de mononucleares la infección es
de tipo viral.
CRISTALES:
- Oxalato de calcio, y fosfato triple: son encontrados con frecuencia y carecen de
significado clínico al igual que escasos cristales de ácidos grasos.
- Cristales de hematoidina: son agujas amarillas que se presentan en grupo o haces
después de hemorragia intestinal.
- Cristales de Charcot-Leyden: tienen forma de rombos alargados, normalmente se
encuentran en el citoplasma de los eosinófilos. Se observan ocasionalmente en las
infecciones parasitarias, especialmente en amebiasis invasora.
ALIMENTOS NO DIGERIDOS:
- Sustancias vegetales: las células vegetales se observan en varias etapas de
descomposición. Los pelos vegetales son de tamaño variable (50-300µ), truncos en un
extremo y delgados en el otro, curvos, de color amarillo pálido o transparentes.
En su interior se observa un conducto central estrecho, vacío, entre dos capas transparentes
que refractan la luz. Los pelos vegetales se asemejan a las larvas de Strongyloides.
- Sustancias animales: las fibras de carne digerida tiene un tamaño de 100-200µ, de forma
oval, rectangular, redondeada, De color amarillo o trasparente, sin gránulos ni estriaciones en
su interior. Poseen estriaciones longitudinales y transversales cuando no han sido digeridas
adecuadamente,
61
- Gránulos de almidón: pueden estar bien, parcial o no digeridos. Su tamaño va de 50-100µ,
de forma redonda u oval y contorno irregular. El almidón no digerido se torna azul, violeta o
negro si se añade lugol. En solución salina aparecen blancos o amarillo grisáceos.
- Grasas: glóbulos de grasa neutra aparecen de tamaño variable, perfectamente redondos,
contomo bien definido, uno o varios anillos que refractan la Iuz intensamente. En lugol se los
ve de color naranja, amarillo o rojo. Los ácidos grasos se observan como agujas incoloras. Se
puede usar también una tinción Sudán para su identificación.
FLORA INTESTINAL
- Levaduras: Cándida es un habitante normal del intestino humano. Aparecen de forma
redonda u oval, a menudo con brotes, de 5-8µ, conteniendo de 3 a 6 gránulos en posición
excéntrica. En solución salina se las ve con paredes gruesas y bastante refráctiles. Con lugol
aparecen de color pardo. Raras veces se observa pseudohifas o pseudomicelios. También
puede aparecer en heces fecales artrosporas, que, son otra clase de hongos, tienen forma
rectangular y citoplasma claro; éstas deben ser reportadas. Cándida puede producir
candidiasis o moniliasis intestinal especialmente después de tratamientos prolongados con
antibióticos o en pacientes inmunodeprimidos. Un número significativo de micelios, hifas o
cualquier otra clase de esporas deben ser reportados.
-Bacterias: la flora bacteriana normal constituye un tercio del peso de las heces secas.
Predominan en el adulto la flora gramnegativa especialmente el colibacilo. En los lactantes
predomina la flora grampositiva. Tanto en lugol como en solución salina solo se aprecia si se
trata de cocos y/o bacilos.
Técnicas:
- Flotación
- Sedimentación
Principio:
Se basan en la diferencia de peso especlfico de los parásitos y el medio de suspención
empleado.
La flotacipn debe permitir que los organismos floten.
La sedimentación debe favorecer el asentamiento
62
PARÁSITOS
a. Nemátodos: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos que miden aprox. 45-75 x 30-50
micras, presenta una célula rodeada por tres capas, producen una patología de
dolor de estómago y desnutrición.
63
Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 micras tiene una membrana
interna y una externa, también puede causar trastornos nerviosos.
c. Protozoarios: Amebas
Entamoeba histolítica: Se observan quistes que miden aprox. 20 micras, se
observa con uno a cuatro núcleos. Pueden causar lesión de la mucosa intestinal.
Entamoeba coli: Son quistes más grandes que los de histolítica, tiene más de
cuatro núcleos. Es considerada como no patógena.
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Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simétricamente lateral, con un
extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro núcleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vómito.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
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PRÁCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)
OBJETIVOS:
-Conocer y poner en práctica diversas pruebas químicas en heces fecalesque ayudan a
diagnosticar enfermedades de origen gastrointestinal
-Realizar siembras y coloraciones en heces fecales sospechosas de microorganimos
bacterianos infecciosos
ANALISIS QUÍMICOS
Reacción química, pH: Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas, pero esto
depende de múltiples factores: dietéticos, endógenos, etc. por lo que las variaciones tanto en
la salud como en la enfermedad son irregulares y de escaso valor clínico. Para su medición
se emplea una tira de papel indicador universal. Sobre el cual se aplica una pequeña cantidad
de material fecal. Se espera unos minutros y se compara con la escala de colores.
Se realiza tinciones con Sudán lll o lV para cualificarlas. También se realiza dosificación de
grasas. Se considera patológica la materia fecal que contiene una cantidad total de grasas por
encima del 30%.
66
Rotavirus: Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en
niños de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada año en los países
en desarrollo y son causa de más de 800.000 fallecimientos anuales. Las infecciones
humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con
otras características epidemiológicas, por los grupos B y C.
Sangre oculta: el examen químico de sangre en las deposiciones tiene interés cuando se
sospecha de la existencia de hemorragias digestivas subclínicas, es decir, sin que se avisen
visiblemente en forma de melenas, las causas pueden ser neoplásicas o inflamatorias. Por
ejemplo en la parasitosis por anquilostoma o tenias.
La pérdia de 50 - 75 ml sangre (tubo gastrointestinal superior) provoca una coloración roja
oscura, negra de las heces (melena). Una hemorragia de 2 a 3 días ocasiona pérdidas de más
de 1000 ml de sangre. La sangre oculta puede persistir hasta 5 a 12 días. Heces de un color
rojizo brillante se presentan por pérdidas más leves (tubo gastrointestinal bajo). Se debe
además descartar una coloración anormal de las heces causada por colorantes de alimentos.
Resultado:
Indicadores oxidado (compuesto de quinona) de color azul ( en el caso dei
guayaco); o en función del reactivo.
67
Causas para el aparecimiento de falsos positivos y falsos negativos son:
Leucocitos fecales suelen encontrarse en las infecciones bacterianas del intestino provocadas
por microorganismos como:
- Salmonella spp.
- Shigella spp.
- Yersinia spp.
- Escherichia coli invasiva
Así como por procesos inflamatorios no bacterianos como:
- Colitis ulcerosa
- Colitis asociada a antibióticos
En las heces de la diarrea secundaria a virus, bacterias toxínicas y parásitos no suelen
encontrarse leucocitos fecales.
Observación:
- Realice una observación sistemática de varios campos hasta obtener 100 células
- Mientras cuenta las 100 células debe diferenciar las clases de células blancas.
Resultados:
La morfología y propiedades de tincilón de los PMN en esta muestra son los mismos que los
estudiados en Hematología, la diferencia es que se los observa más pequeños.
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Reporte:
- Si hay variedad de leucocitos se reporta como % de PMN (diferencial)
lnterpretación:
Mayor cantidad de neutrófilos: infección bacteriana
Mayor cantidad de mononucleares: infección viral
PMN Neutrófilos
Mononucleares Linfocitos y Monocitos
COPROCULTIVO
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
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PRÁCTICA No. 9
ESPUTO
OBJETIVOS:
-Obtener muestras de esputo válidas que provengan del sistema respiratorio inferior
-Detectar diferentes microorganismos que pueden causar infecciones en las vías respiratorias
bajas mediante el análisis del esputo utilizando diversas técnicas microbiológicas
CONTEXTUALIZACIÓN
Material necesario:
- Frasco estéril de boca ancha y hermético.
- Suero fisiológico estéril y nebulizador.
Técnica:
-Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina.
-Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal.
-De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones
de suero fisiológico estéril (15 ml durante 10 minutos), siendo útil además realizar un drenaje
postural o fisioterapia respiratoria.
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-Volumen de muestra requerido: de 2 a 10 Ml
Transporte y conservación:
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si esto no es posible, conservar en
frigorífico a 4°C.
Observaciones:
- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.
- No es útil para anaerobios.
- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia
- La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (más de 25
leucocitos polimorfonucleares y menos de 10 células epiteliales por campo 10x).
EXAMENES
a) Examen macroscópico:
La descripción del esputo o de las secreciones producidas con la tos debe comprender
el color, la consistencia, aspecto, el olor entre otros, así:
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Aspecto normal: el esputo es de aspecto claro y acuoso y cualquier opacidad procede
de material celular en suspensión.
Color: el color del esputo está determinado por las sustancias que contiene y con
frecuencia puede indicar el proceso patológico.
Este análisis nos ayuda a tener un diagnóstico previo de lo que podría tener el paciente,
por ejemplo, los esputos muy abundantes y purulentos sugieren un absceso pulmonar o
una bronquiectasia; los esputos sanguinolentos, sangrado (hemoptisis); los esputos
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espumosos y teñidos de sangre, edema pulmonar; los esputos abundantes y mucinosos,
carcinoma de células alveolares.
b) Examen microscópico:
Tómense porciones de moco, pus, material caseoso. Examínese en forma de preparación
húmeda y frotis coloreado.
Enfermedades
Bronquitis: Es una inflamación de las vías aéreas bajas. Sucede cuando la tráquea y los
bronquios, situados entre los pulmones, se inflama a causa de una infección o por alguna
otra causa. La bronquitis aguda generalmente sigue a una infección respiratoria viral. La
bronquitis crónica es una afección prolongada. Las personas tienen tos que produce moco
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excesivo.
Tuberculosis pulmonar: Es una enfermedad infecciosa, causada por Mycobacterium
tuberculosis. Infecciones ocasionadas por micobacterias atípicas (bacilos tuberculoides)
tales como: M. Kansasii, M. marinum, M. flavescens, M. gordonae, M. obuense.
Neumonía bacteriana: Pulmonía o neumonitis es una enfermedad inflamatoria de los
pulmones. La neumonía puede afectar a un lóbulo pulmonar completo (neumonía lobular), a
un segmento de lóbulo, a los alvéolos próximos a los bronquios (bronconeumonía) o al tejido
intersticial (neumonía intersticial). La neumonía bacteriana es una infección de los pulmones
causada por bacterias. El Streptococcus pneumoniae, un organismo Gram positivo que a
menudo coloniza la garganta, es la bacteria que con más frecuencia causa neumonía en
todos los grupos de edad excepto en recién nacidos. Otra causa importante de neumonía por
bacterias Gram positivas es la causada por el Staphylococcus aureus. También ocasionan
neumonía bacterias del género Pseudomonas (bacilos Gram negativos), Klebsiella (bacilos
Gram negativos), Haemophilus influenza (cocobacilo Gram negativo).
Neumonía viral: Es una inflamación (irritación e hinchazón) de los pulmones causada por
una infección con un virus que puede ser influenza, parainfluenza, adenovirus, rinovirus,
virus del herpes simple, virus sincicial respiratorio, hantavirus y citomegalovirus.
Neumonía atípica: Se refiere a la neumonía causada por ciertas bacterias a saber:
Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Chamydophila pneumoniae.
Enfermedades pulmonares parasitarias: Se producen más comúnmente por un nemátodo
como el Strongyloides stercoralis o el Ascaris lumbricoides. También están enfermedades
pulmonares causadas por parásitos trematodos como el Paragonimus westermani.
Fibrosis quística (FQ): Es una enfermedad hereditaria frecuente que afecta al organismo
en forma generalizada, causando discapacidad progresiva y muerte prematura.
Neoplasias pulmonares: Tumores o cánceres del pulmón. Se atribuye al hábito de fumar,
asbesto, derivados del carbón, radiaciones ionizantes, óxido de hierro, gas mostaza, níquel,
petróleo, uranio y cloruro de vinilo.
Asma bronquial: Es una enfermedad en la que se inflaman los bronquios, lo que produce
obstrucción de las vías aéreas, marcada por ataques recurrentes de disnea paroxística, con
producción de silbido debido a la contracción espasmódica de los bronquios.
Esputo: mucoide viscoso generalmente presenta eosinofilia.
Neumoconiosis: Condición caracterizada por la deposición permanente de cantidades
sustanciales de partículas de materia en los pulmones, generalmente de origen ocupacional
o ambiental, y por la reacción tisular a su presencia. Como por ejemplo al inhalar polvo de
piedras, arenas o pedernales que contienen bióxido de silicio, con formación de cambios
fibróticos nodulares generalizados en ambos pulmones.
Neumonía por hongos: Infecciones con hongos del género Aspergillus, Pneumocistis,
Blastoyces dermatitidis, Coccidioides immitis (generalmente se presenta en pacientes con
SIDA), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum. La infección ocasionada por el
Histoplasma capsulatum, está considerada una de las principales micosis endémicas del
continente americano.
Neumonía por aspiración: Tipo de neumonía que se produce por la aspiración de
alimentos, de líquidos, o del contenido gástrico en el tracto respiratorio superior.
Absceso pulmonar: Es la inflamación de los pulmones y de las vías respiratorias que llevan
a ellos (bronquios) debido a la inhalación de materiales extraños.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN:
- Se realizará el examen macroscópico de la muestra y se observará una preparación
húmeda para rechazar o aceptar la muestra de esputo.
- Examen microscópico: Montaje húmedo directo y con KOH (para visualizar hongos),
GRAM y BAAR .
- Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma.
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PRÁCTICA No. 10
MALARIA O PALUDISMO
CONTEXTUALIZACIÓN
Los parásitos causantes de la malaria o paludismo son protozoarios esporózoarios del género
Plasmodium. Las dos especies que existen en el Ecuador, en las zonas tropicales y
subtropicales son Plasmodium vivax y Plasmodium falciplarum.
Se transmiten por la picadura de un vector, el mosquito del género Anopheles.
Gota gruesa
Es más eficaz que el extendido, pues permite visualizar mayor numero de parásitos, por la
mayor cantidad de sangre que se estudia en cada campo microscópico. Es necesario lisar los
eritrocitos para permitir la visualización de los parásitos.
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Frotis extendido
Facilita la observación del detalle mor'fológico de los parásitos y su relación con los entrocitos,
por lo tanto permite confirmar la especie con mayor certeza.
MUESTRAS
Se puede utilizar sangre totalobtenida en un tubo que contenga EDTA. Muchas veces resulta
conveniente también tornar una muestra capilar para realizar los frotis. No se recomienda usar
sangre con heparina o con citrato de sodio.
COLORACION DE GIEMSA
Fundamento: Los parásitos causantes der patudismo se encuentran en la sangre; una parte
de su evotución ocurre en el interior de los glóbulos rojos. Estos parásitos se detectan en
extensiones sanguíneas teñidas con los colorantes de Giemsa.
Preparación de las extensiones sanguíneas
-Cuando se debe obtener la muestra.- Por lo general los parásitos son más numerosos en la
sngre al final de un ataque de fiebre. La recolección de sangre se debe hacer invariablemente
antes de que se administren medicamentos antipalúdicos.
- Preparar un frotis sanguíneo para un examen minucioso por especies
- Preparar una gota gruesa para detección de los parásitos
- No se recomienda conservar los frotis sin tinción durante más de 4 días.
Tinción
Antes de teñirlas fijense las extensiones solo con metanol (2 a 3 minutos). Evítese que este
alcohol toque las gotas gruesas.
1. Haga una dilución delcolorante de giemsa 1:10 con agua amortiguada,
2. Coloque los portaobjetos en una bandeja de tinción y cúbralos con el colorante diluido.
3. Deje reposar por 30 minutos.
4. Lave la tinción con agua amortiguada.
5. Escurra el agua y deje secar el frotis
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACION
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PRÁCTICA No. 11
CONTEXTUALIZACIÓN
La importancia de este tipo de infecciones es cada vez mayor, pues su incidencia va cada vez
en aumento. Varios son los factores que intervienen: aumento de densidad y movilidad de las
poblaciones, dificultad para lograr cambios en la inadecuada conducta sexual de las personas.
Además se debe tomar en cuenta que para la mayoría de estas infecciones no existen
todavía vacunas disponibles.
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OTROS: Staphylococcus aureus
GRUPO 1: métodos propios, muchas veces el éxito o fracaso der estudio recae en la
experiencia del microbiólogo
GRUPO 2: diagnóstico clínico primario, confirmación por técnicas parasitarias, bacterianas y
pruebas serológicas (inmunológicas)
GRUPO 3: pruebas inmunológicas
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Ureaplasma urealyticum
Puede ser responsable de uretritis no gonococcicas en varones.
Son difíciles de aislar, requiere de medios de cultivo especiales. Las colonias tienen
apariencia de huevos fritos, muy pequeñas.
Cultivos: caldos de peptona con infusión de corazón y 2% de agar (pH7.8), 7% de líquido
ascítico humano o de suero de animal (caballo o conejo), 37°C por 48 a 96 horas.
Muestras: Hisopos rectales, secreciones uretrales o genitales.
El diagnóstico puede también ser serológico.
Cándida albicans
Es una levadura oval que produce un seudomicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Son
Gram positivas. En agar Sabouraud crecen colonias blandas color cremoso.
Puede causar vulvovaginitis, con irritación, prurito y secreción.
Muestras: raspados, exudados
Pruebas: Gram y cultivos en medios comunes o Agar de Nickerson.
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Trichomonas vaginalis
Es un parásito protozoario mastigophoro (flagelado). Tiene forma de pera, con una membrana
ondulante alineada, posee un flagelo posterior recto y 4 flagelos anteriores.
Se la puede observar en ftotis directos de secreciones vaginales.
Muestras: secreciones uretrales y vaginares, los frotis se los puede teñir con hematoxilina,
Wright-Giemsa o tiñción de Gram.
Gardnerella vaginalis
Se lo aísla de mujeres que sufren vaginitis, sepsis neonatal, bacteremia post partum, y de
hombre con uretritis no específica.
En los frotis húmedos produce “células indicadoras” (células guía o clue cells), que son células
epitetiates vaginales con muchos bastoncillos minúsculos. Se ha comprobado que estas
bacterias no requieren ningún factor especial de crecimiento y se los observa como
cocobacilos gram negativos. Las colonias son pequeñas grises, beta hemolíticas.
Una prueba rápida de su presencia es colocar unas gotas de KOH al 10% en preparaoiones
en fresco de secreciones vaginales; es característico encontrar un olor a pescado por la
presencia de aminas.
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Treponerrna pallidum
Son espiroquetas muy mótiles, no se le puede cultivar in vitro.
Se puede hacer la observación directa en microscopio de campo oscuro en líquidos tisulares
exprimidos de las lesiones superficiales tempranas.
El diagnóstico se lo hace en base a pruebas serológicas: tesis no treponémicos para
screening: VDRL o su variante, el RPR. EI test confirmatorio es el FTA-Abs (prueba
Treponémica)
Haemophilus ducreyi
Causa la enfermedad venérea “chancroide" (chancro blando), que es una úlcera desgarrada
de los genitales.
Son cocobacilos Gram-negativos- pequeños, dificiles de cultivar, puesto que requieren del
llamado factor X, crece mejor a partir de raspados de la base de la úlcera sembradas en agar
chocolate con 1% de isovitalex vancomicina (3g/ml).
Se incuba en atmósferáde CO2 al 10%, a 37°C.
Chlamydia trachomatis
Son bacterias parásitas intracelulares estrictias, no mótiles. Gram negativas.
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lntracelularmente forman inclusiones (micro cotonias). Son metabólicamente muy activas, Se
colorean bien con Giemsa
Producen linfogranuloma venéreo (serotipos L1, L2 y L3), que se caracteriza por adenitis
inguinal supurativa, o uretritis inespecífica (serotipos-k).
Para su diagnostico se necesitan técnicas especiales como cultivos celulares, que son
técnicas complejas y poco utilizadas de forma rutinaria, por lo que se prefiere el diagnóstico
inmunológico para encontrar anticuerpos séricos. También existen pruebas para detectar el
antÍgeno en orina o en secreción vaginal.
Calymatobacterium granulomatis
Caúsa de la enfermédad venérea'"granuloma inguinale", caracterizada por la presencia de
hinchazones en los genitales, nalgas y abdomen con lesiones granulornatosas que pueden
ser ulcerativas o sangrantes.
Es un bacilo Gram negativo, no mótil, pleomórfico, con extremos redondeados, que se colorea
bipolarmente y aparece como "imperdibles".
Difícil de cultivar, Requrere de bajas tensiones de oxfgeno. Se pueden utilizar embriones de
pollo de 5 días y se desarrolla después de las 72 horas a 35°C.
Hérpes virus 1
El HSV-2 causa el herpes genital. El herpes genital primario puede ser grave y durar largo
tiempo. Produce lesiones vesículo-ulcerativas en el pene del varón o cuello, vulva, vagina y
periné en la mujer. Las lesiones son dolorosas y se acompañan de fiebre, malestar general y
linfadenopatía inguinal.
El diagnóstico del laboratorio se realiza por aislamiento del virus de las lesiones, pero más
prácticos resultan los tests inmunológicos.
VIH
Pertenece a los retrovirus. La enfermedad (SIDA) se caracteriza por una, depresión del
sistema immunitario y por desarrollo de neoplasias poco comunes como el Sarcoma de
Kaposiy por otras infecciones oportunistas graves.
El diagnóstico de laboratorio se hace por aislamiento del virus por PCR, conteo de linfocitos
CD4 de sangre periférica, médula ósea o plasma. Las pruebas inmunológicas con suero del
paciente por ELISA (test de screening) y la confirmacrón por la técnica de Western-Blot.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
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PRACTICA No. 12
Objetivos:
CONTEXTUALIZACIÓN
Las reacciones de antígeno y anticuerpo son muy específicas. Un antígeno reaccionará sólo
con el anticuerpo estimulado por antígenos de su propia clase o muy relacionados. Debido a
su elevada especificidad, las reacciones entre un antígeno y un anticuerpo pueden usarse
para identificar uno por medio del otro.
Esta especificidad es la base de las reacciones serológicas. Las posibles reacciones cruzadas
entre antígenos relacionados pueden limitar la especificidad de la prueba.
Las reacciones de antígenos con anticuerpos se utilizan para identificar componentes
específicos en mezclas. Los microorganismos y otras células poseen diversos antígenos, y
por tanto, pueden reaccionar con numerosos anticuerpos diferentes.
Antígeno: sustancia que reacciona con anticuerpos o receptores de células T, despertadas por
inmunógenos.
Anticuerpo: Proteína producida a causa de la introducción de un antígeno, y que tiene la
capacidad de combinarse con el antígeno que estimuló su producción.
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REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO EN EL LABORATORIO
Los diferentes tipos de reacciones de antígenos con anticuerpos utilizan la ventaja de las
distintas características físicas o biológicas de sus reactantes y de acuerdo con ellas, se
escogen las más adecuadas con fines de diagnóstico.
Radioinmunoanálisis (RIA): este método cuantifica antígeno que pueden ser marcados con
radioactividad. Se basa en la competencia por el anticuerpo específico entre una
concentración conocida de material marcado y una concentración desconocida de material no
marcado. Más adelante los complejos que se forman entre antígeno y anticuerpo pueden
separarse y la cantidad de radiactividad se mide.
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Análisis inmunosorbente con enzima enlazada (ELlSA): Este método tiene numerosas
variantes depende de la conjugación de una enzima o un antígeno o un anticuerpo. La enzima
se detecta por análisis de su actividad con su sustrato.
Para medir antígenos, anticuerpos conocidos se fijan a una fase sólida, se incuba con
diluciones del suero problema, se lava e incuba de nuevo con una anti- inmunoglobulina
marcada con una enzima. La actividad enzimática medida por adición del sustrato específico
con desarrollo de color es una función directa de la cantidad de anticuerpo unido.
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Fijación de complemento: El sistema de complemento está constituido por 20 o más
proteínas plasmáticas que interactúan entre si y con las membranas celulares. Cada
componente proteínico debe ser activado en secuencia, en condiciones apropiadas para que
la reacción progrese. Los complejos de antígenos con anticuerpos se cuentan entre los
activadores y la prueba de fijación del complemento puede usarse para identificar a uno de
ellos si el otro se conoce.
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
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Efectuar varias pruebas inmunológicas tales como: ASTO, VDRL, HIV y observar sus
resultados.
Realizar el portafolio de la práctica y subirlo a la plataforma Moodle.
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MICOSIS
Hasta que punto debe ser un hongo identificado es una decistión clínica y a veces académica.
Frecuentemente una identificación es realizada para eliminar la posibilidad de que el aislado
sea un patógeno verdadero. La especificación deberá ser interpretada sólo cuando sea
clínicamente relevante o académicamente importante.
COLECCIÓN DE ESPECÍMENES
La técnica para la colección de material para cultivo de hongos es importante, ya que muchas
levaduras y mohos no patógenos: Son frecuentes contaminantes en especímenes clínicos y
pueden crecer más y enmascarar los hongos patógenos significantes.
Piel: Las lesiones cutáneas requieren raspados del borde activo. Material suficiente y
representativo para cultivo y examen microscópico deberá ser colectado y transportado al
laboratorio.
91
Pelo: Los pelos infectados deben ser arrancados y enviados al laboratono.
Uñas: Las uñas infectadas no deben ser cortadas con tijeras. No colecte detritus de debajo de
la uña infectada. Primero, remueva la parte superficial no infectada de la uña por raspado.
Cuando se alcanza la porción enferma, remuévala por raspado y envíela al laboratorio.
Especímenes subcutáneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estéril. Transporte e
inoculación rápida son necesarios ya que muchos especímenes pueden también contener
bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o retardar el
aislamiento de los hongos patógenos.
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Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un buen
especímen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado del árbol
bronquial, con cantidades mlnimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especímenes pequeños de este tipo son mejores que un especimen coleccionado de 24
horas de volumen total igual. El hecho de que el especimen sea obtenido por la mañana
temprano o a otra hora no es importante a pesar que muchos pacientes producen más esputo
poco después de levantarse en la mañana. El esputo debe ser colectado usando un
contenedor estéril. Esputos inducidos deben también ser colectados en un contenedor estéril.
Aspirados traqueales y secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con
tapón de caucho u otros contenedores estériles apropiados,
Lavados gástricos
Lavados gástricos en ayunas deberán ser colectados cuando no sea posible obtener esputo.
Deberán ser colectados en tubos estériles. Una serie de tres especímenes es recomendada.
Orina
El espécimen de elección es la porción media del chorro de la micción de la mañana obtenida
limpiamente. Múltiples especímenes de este tipo son superiores a un especimen recolectado
de 24 horas. Mantener refrigerado antes de procesar.
Médula ósea
Los especímenes de médula ósea son enviados en 0,1 ml de anticoagulante EDTA.
Tejidos
Los especímenes de tejido deben ser remitidos en un contenedor estéril. Si el tejido está seco,
mójelo tigeramente con solución salina al 0.85% y refrigérelo hasta ser procesado. Todo tejido
debe ser molido o finamente cortado cuidadosamente.
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HONGOS
Examen macroscópico
Examen microscópico directo del material clínico (KOH 10%)
Cultivos
Reportes preliminares:
Dentro de 24 horas de la recepción de especfmenes con el resultado de la coloración
Después de 7 días de incubación (si no se detecta crecimiento) reportando “No hay
crecimiento en siete días”
Reportes finales:
Los reportes finales serán enviados al completarse los procedimientos de identificación o
después de 28 días de incubación si no hay evidencia de crecimiento fungal.
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ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIÓN
Examinar microscópicamente con KOH al 10 ó 20% o en forma directa las muestras
entregadas y realizar la interpretación de los elementos entregados.
Observar placas teñidas con Gram y comparar entre las muestras.
Revisar los medios de cultivos con crecimiento de hongos y compare con cultivos
bacterianos.
Realice reflexiones sobre los resultados obtenidos junto con las fotos respectivas
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BIBLIOGRAFIA
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Aires, Argentina: Médica Panamericana.
Gilbert, David N.. (2010). The Sanford guide to antimicrobial therapy 2010(40). Sperryville,
Estados Unidos: s.n..
Ash L. R. (2010), Atlas de Parasitología Humana, 5ta. Edición, Buenos Aires: Editorial Médica
Panamericana.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, (1995) O. M. S., Ginebra.
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