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Inhibicion Enzimatica PDF
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RESUMEN
Con el objetivo de controlar el pardeamiento enzimático de las frutas, se ha desarrollado una secuencia
de experimentos de inhibición enzimática basado en el sistema enzima-sustrato-inhibidor (tirosinasa-
pirocatecol-inhibidor). La actividad enzimática de la tirosinasa se ha visto sustancialmente afectada por los
inhibidores de quelatación (EDTA), polimérico (quitosano) y enzimático (papaína). La efectividad inhibitoria
de la papaína se ha atribuido a su acción hidrolítica sobre los sitios activos 176G y 182E de la tirosinasa.
Una aproximación para la constante de Michaelis (Km a 25°C) ha dado el valor de 2,0.
Palabras clave: Actividad, tirosinasa, pirocatecol, EDTA, quitosano, papaína.
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Oxidación enzimática del difenol a quinona Los patrones cinéticos de la actividad en-
zimática de las PPO de las especies vege-
La enzima tirosinasa, aun cuando tiene tales, estudiadas en un proyecto previo[7],
especificidad sobre la tirosina, es también han abierto las posibilidades de controlar el
una fenoloxidasa por lo que se la agrupa pardeamiento de tales especies. La inhibi-
con las PPO y se relaciona con la ecua- ción puede efectuarse por el uso de agentes
ción 1. Según la clasificación internacional reductores, quelatantes, acidulantes, inhibi-
de las enzimas, se encuentran dentro del dores enzimáticos, tratamientos con otras
número 1, clase de las oxidoreductasas y enzimas o por el uso de agentes complejos
de acuerdo al tipo de reacción catalizada como las ciclodextrinas o quitina. También es
son los que transfieren electrones, iones posible inhibir por procedimientos térmicos
o átomos de hidrógeno. Debido a que la o de altas presiones. De todos estos, el uso
tirosinasa presenta el cofactor Cu2+, se las de quelatantes como el EDTA, la quitina
puede relacionar también con las enzimas (que posee propiedades antimicrobianas y
del tipo citocromo oxidasas. biodegradables) así como la papaína han
cobrado especial interés en el control del
El modelo utilizado para la detección y la pardeamiento enzimático de los vegetales.
actividad enzimática de la tirosinasa basado
en la ecuación 1 está generalizado por ser un Existe una gran cantidad de investigaciones
procedimiento sencillo y útil para estudios y realizadas sobre el control del pardeamiento
experimentos del pardeamiento enzimático. enzimático de los vegetales; sin embargo,
El modelo permite estudios con inhibidores, no se han profundizado aún en el uso de
lo que ha posibilitado plantear los esquemas productos naturales como la quitina o la
experimentales para este trabajo. papaína, posibles de ser obtenidos a partir
de recursos marinos o de productos propios
En los estudios realizados por Chunchua como la papaya.
Shi, Ya Dai y colaboradores[5], la purifica-
ción y propiedades espectroscópicas de la En este trabajo se estudia la inhibición
PPO de la Nicotiana tabacum, les posibilitó enzimática basado en el sistema enzima-
determinar espectros de absorción del cate- sustrato-inhibidor (tirosinasa-pirocatecol-
col (como sustrato) transformado a quinona inhibidor), utilizando tres tipos de inhibidores:
luego de la acción enzimática. Los espec- por quelatación sobre el cobre (II) con EDTA,
tros presentan picos de absorción máxima complejo como el quitosano y de desnatu-
comprendidos entre 400 y 425 nm y para las ralización de la tirosinasa con la papaína.
enzimas aisladas del tabaco y champiñones Se plantea que este último –una proteasa-
alrededor de 235 y 350 nm ambos siguiendo posee una alta capacidad inhibitoria sobre
un patrón de absorción similares. la tirosinasa.
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ET S (t )k1 ET S (t )
C (t ) (8)
k1 S (t ) k
1 k 2 k
1 k 2
S (t )
k1
k k
k
1 2
(9)
k
m
1
dP (t ) dS (t )
vRx v
k 2 C (t ) (10)
dt dt
(8) y (9) en (10) :
k E S (t )
v 2 T
(11 )
k S (t )
m
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1 S ( 0) ¨ S (0)
S (t ) ·
ln frente a ©
t S (t ) ª t ¹̧
EXPERIMENTAL
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Pi ro cat ec o l , M o l e s /L
0.0024
0.0022
po infinito para la obtención del espectro VIS
0.0021
de la quinona. 0.0020
0.0017
0.0016
A 0.8
0.0015
0.7 0 720 1440 2160 2880 3600 4320 5040 5760 6480 7200
0.5
Figura N.º 7. Patrón de disminución de la con-
0.4
centración del pirocatecol debido a la acción de
0.3 la tirosinasa.
0.2
(a) Tirosinasa-pirocatecol
0.1 (b) Tirosinasa-pirocat-EDTAl
0.25 (c) Tirosinasa-pirocat-QUITOSANO
(d) Tirosinasa-pirocat-PAPAINA
0.0
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 (a)
λ (nm)
0.20
0.22 (d)
A 0.20 0.05
0.18
0.16
0.00
0.14 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.02 ------------------------------------------------------------
0.00
0.0014 0.0016 0.0018 0.0020 0.0022 0.0024 0.0026
Quinona (moles/L)
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
0.14
actividad enzimática con adición de EDTA,
0.12
quitosano y papaína (Figura N.º 8).
0.10
0.08
El espectro visible presenta un máximo a
0.06
467 nm a pH bufferado de 7,00 la misma que
0 720 1440 2160 2880 3600 4320 5040 5760 6480 7200
difiere en relación al reportado por Chuchua
t (seg)
Figura N.º 6. Comportamiento cinético de la Shi et al.[5] Quienes registran el valor para el
tirosinasa frente al pirocatecol a 25°C. máximo alrededor de 410 nm a pH de 6,5.
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