INSTUTUTO POLITECNICO NACIONAL

SECRETARIA DE INVESIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“BIOACTIVACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS HALOGENADOS POR LA

ACTIVIDAD DE LA GLUTATIÓN S-TRANSFERASA TETHA Y DEL CYP 2E1 EN EL
CHARAL BLANCO Chirostoma riojai”

TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA:

HIDROBIÓL. ROBERTO DE JESÚS GONZÁLEZ ORTÍZ

DIRECTOR de tesis: DR. ARMANDO VEGA LÓPEZ

Codirectora de tesis: DRA. ALICIA RAMÍREZ RAMÍREZ

México D. F., Enero 2010

Índice

Relación de figuras…………………………………………..……………………………………………………….i
Relación de tablas…………………………………………………………………………………………………..iii
Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………..…..iv
Símbolos……………………………………………………………………………………………………………...iv
RESUMEN…………………………………………………………………………………………………………….v
ABSTRACT…………………………………………………………………………………………………………vii

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………...1
2. ANTECEDENTES…………………………………………………………………………………………………1
2.1 BIFENILOS POLICLORADOS……………………………………………………………………………...1
2.1.1 Toxocinética ambiental………………………………………………………………………………...3
2.1.2. Efectos tóxicos…………………………………………………………………………………………..4
2.1.3 Biotransformación………………………………………………………………………………………5
2.1.4 Normatividad…………………………………………………………………………………………....5
2.2 HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAP´s)..............................................................6
2.2.1 Toxocinética……………………………………………………………………………………………...8
2.2.2 Efectos tóxicos…………………………………………………………………………………………....8
2.2.2.1 Naftaleno…………………………………………………………………………………………8
2.2.3 Biotransformación de los HAP’s………………………………………………………………………8
2.2.3.1 Naftaleno…………………………………………………………………………………………9
2.2.3.2 Benzo[a]pireno…………………………………………………………………………………..9
2.2.4 Normatividad…………………………………………………………………………………………..11
2.3 Biomarcadores…………………………………………………………………………………………………11
2.3.1 Uso de biomarcadores en estudios ecotoxicológicos………………………………………………11
2.3.1.1 Radicales libres y especies reactivas de oxígeno………………………………………….12
2.3.1.2 Estrés oxidativo………………………………………………………………………………...12
2.3.1.3 Lipoperoxidación celular……………………………………………………………………..13
2.3.1.4 Generación de hidroperóxidos lipídicos…………………………………………………...13
2.3.1.5 Oxidación de proteínas……………………………………………………………………….16
2.3.1.6 Generación de formaldehido………………………………………………………………...16
2.4 Biotransformación de los xenobióticos…………………………………………………………………….18
2.4.1 Sistema de oxidasas de función mixta (MFO)………………………………………………………18
2.4.1.1 Citocromo 2E1 (CYP 2E1)………………………………………………………………………19
2.4.2 Glutatión S-transferasas……………………………………………………………………………….19
2.5 ZONA DE ESTUDIO…………………………………………………………………………………………21
2.6 Generalidades sobre el charal de Santiago (Chirostoma riojai)………………………………………...23
2.7 Bioactivación y conjugación de PCB´s y HAP’s en organismos acuáticos……………………………..23
3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………………………...25
4. HIPÓTESIS…………….…...…………………………………………………………………………………….25
5. OBJETIVOS……….………..…………………………………………………………………………………….26
5.1 OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………………………………26
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………………………………...26
6. METODOLOGÍA………………………………………………………………………………………………...27
6.1 Determinaciones realizadas en el laboratorio……………………………………………………………28
6.1.1 Proteínas totales………………………………………………………………………………………...28
6.1.2 Biomarcadores de bioactivación……………………………………………………………………..28
6.1.2.1 Actividad del CYP 2E1………………………………………………………………………..28
6.1.2.2 Actividad de la glutatión S-transferasa isoforma tetha…………………………………..28
6.1.3 Biomarcadores de estrés oxidativo…………………………………………………………….28
6.1.3.1 Anión superóxido………………………………………………………………………..28
6.1.3.2 Peróxido de hidrógeno…………………………………………………………………..28
 6.1.3.3 Formaldehído……………………………………………………………………………..29
6.1.4 Biomarcadores de daño…………………………………………………………………………29
6.1.4.1 Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s)……………………………29
6.1.4.2 Hidroperóxidos lipídicos………………………………………………………………29
6.1.4.3 Oxidación de proteínas (formación de carbonilos)………………………………....29
6.1.5 Determinaciones ambientales………………………………………………………………....29
6.1.5.1 Materia orgánica total en sedimentos y agua………………………………………..29
6.1.5.1.1 Materia orgánica total en sedimentos………………………………………29
6.1.5.1.2 Materia orgánica total en aguas………………………………………………30
6.1.5.1.3 Materia orgánica hidrosoluble……………………………………………….30
6.1.5.3.1 Materia orgánica hidrosoluble en sedimentos…………..……….30
6.1.5.3.2 Materia orgánica hidrosoluble en aguas………………….………30
6.1.5.2 Clorofilas…………………………………...……………………………………………..30
6.1.5.3 HAP´s en agua, sedimento y tejidos…………………………………………………..31
6.1.5.3.1 HAP´s en sedimentos…………………………………………………………31
6.1.5.3.2 HAP´s en aguas por extracción líquido-líquido…………………………...31
6.1.5.3.3 HAP´s en tejidos……………………………………………………………….31
6.1.5.4 PCB´s en sedimentos, agua y tejidos…………………………………………..31
6.1.5.4.1 PCB´s en sedimentos y aguas…...…………………………………….31
6.1.5.4.2 PCB´s en tejidos……………………………………………………...…32
6.2 Determinaciones ambientales (realizadas en campo)…………………………………………………...32
7. RESULTADOS…………………………………………………………………………………………………...33
7.1 PRIMER MUESTREO (sequìa fría)…………………………………………………………………….....33
7.1.1 Contenido de HAP´s en agua y sedimentos………………………………………………………...33
7.1.2. Contenido de HAP´s en hígado y vísceras de peces………………………………………............34
7.1.3. Factor de bioconcentración (FBC)…………………………………………………………………...36
7.1.4. Biomarcadores de estrés oxidativo, radicales libres………………………………………………36
7.1.5. Biomarcadores de daño……………………………………………………………………………….38
7.1.6. Biomarcadores de activación……...………………………………………………………………….40
7.1.7. Análisis de componentes principales……………………………………………………………….42
7.1.7.1 Biomarcadores vs. HAP´s. Hígado…………………………………………………………...42
7.1.7.2 Biomarcadores vs. HAP´s. Víscera…………………………………………………………...43
7.1.7.3 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Agua…………………………………45
7.1.7. 4 Materia orgánica vs. HAP´s. Sedimento……………………………………………………45
7.2 SEGUNDO MUESTREO (lluvias)…………………………………………………………………………47
7.2.1. Contenido de HAP´s en agua y sedimentos………………………………………………………..47
7.2.2 Contenido de HAP´s en hígado y vísceras de peces……………………………………………….48
7.2.3 Factor de bioconcentración……………………………………………………………………………50
7.2.4 Biomarcadores de estrés oxidativo, radicales libres……………………………………………….50
7.2.5 Biomarcadores de daño………………………………………………………………………………..52
7.2.6 Biomarcadores de activación………………………………………………………………………….54
7.2.7 Análisis de componentes principales……………………………………………………………….56
7.2.7.1Biomarcadores vs. HAP´s. Hígado……………………………………………………………56
7.2.7.2 Biomarcadores vs. HAP´s. Víscera…………………………………………………………...56
7.2.7.3 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Agua…………………………………58
7.2.7.4 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Sedimentos…………………………58
8. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………………61
8.1 Niveles de HAP´s en el agua, sedimento y órganos (hígado y vísceras)………...…………………...61
8.2 Factor de bioconcentración (FBC)………………………………………………………………………….63
8.3 Biomarcadores…………………...…………………………………………………………………………...64
9. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………..66
10. LITERATURA CITADA……………………………………………………………………………………….67
RELACIÓN DE FIGURAS

Fig. No. Página

Fig. 1. Estructura básica de los PCB´s. 1
Fig. 2. Estructura química del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno. 6
Fig. 3. Biotransformación del benzo[a]pireno. 3
Fig. 4. Peroxidación de lípidos. 14
Fig. 5. Generación de hidroperóxidos lipídicos. 15
Fig. 6. Formación del sulfóxido de metionina y de la sulfona de metionina. 16
Fig. 7. Formación de alcoholes como resultado de la peroxidación de lípidos. 17
Fig. 8. Ciclo catalítico del citocromo P450. 18
Fig. 9. Laguna de Zumpango. 21
Fig. 10. Zona lacustre del Valle de México, indicando la ubicación actual de las zonas que 22
circundaban a este cuerpo de agua.
Fig. 11. Ejemplares de Chirostoma riojai. 23
Fig. 12. Diagrama de flujo de las determinaciones realizadas en laboratorio y campo. 27

PRIMER MUESTREO (sequía fría)

Fig. 13. Contenido de HAP´s en el agua colectada en las estaciones a diferentes profundidades. 33
Fig. 14. Contenido de HAP´s evaluado en los sedimentos. 34

Determinaciones en peces (hígado y vísceras)

Fig. 15. Contenido de pireno. 35

Fig. 16. Contenido de benzo[a]pireno. 35
Fig. 17. Factor de bioconcentración de los HAP´s. 36
Fig. 18. Niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2). 37
Fig. 19. Niveles de superóxido (O2-). 37
Fig. 20. Niveles de formaldehído. 38
Fig. 21. Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s). 39
Fig. 22. Hidroperóxidos lipídicos . 39
Fig. 23. Oxidación de proteínas. 40
Fig. 24. Actividad del CYP2E1. 41
Fig. 25. Actividad de la GSTT. 41
Fig. 26. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en hígado. 42
Fig. 27. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en víscera. 44

Otras determinaciones

Fig. 28. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en agua. 45
Fig 29. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en 46
sedimento.

i
Fig. No. Página
SEGUNDO MUESTREO (lluvias)

Fig. 30. Contenido de HAP´s en el agua colectada en las estaciones a diferentes profundidades. 47
Fig. 31. Contenido de HAP´s evaluado en los sedimentos. 48

Determinaciones en peces (hígado y vísceras)

Fig. 32. Contenido de pireno. 49

Fig. 33. Contenido de benzo[a]pireno. 49
Fig. 34. Factor de bioconcentración de los HAP´s. 50
Fig. 35 Niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2). 51
Fig. 36. Niveles de superóxido (O2-). 51
Fig. 37. Niveles de formaldehído. 52
Fig. 38. Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s). 53
Fig. 39. Hidroperóxidos lipídicos. 53
Fig. 40. Oxidación de proteínas. 54
Fig. 41. Actividad del CYP2E1. 55
Fig. 42. Actividad de la GSTT. 55
Fig. 43. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en hígado. 56
Fig. 44. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en víscera. 58

Otras determinaciones

Fig. 45. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en agua. 59
Fig. 46. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en 60
sedimento.

ii
RELACIÓN DE TABLAS

Tabla No. Página

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de PCB´s con 5, 6 y 7 sustituciones de cloro en su 2
estructura.
Tabla 2. Toxicidad aguda de algunas formulaciones de PCB´s. 4
Tabla 3. Propiedades físicas del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno. 7
Tabla 4. Propiedades físicoquímicas del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno. 7
Tabla 5. Destino de los contaminantes orgánicos en los sedimentos con base en su Koc y su 7
solubilidad en el agua.
Tabla 6. Clasificación de la peligrosidad del benzo[a]pireno. 9
Tabla 7. Longitudes de onda (λ) para determinar los HAP´s considerados en este estudio. 31

PRIMER MUESTREO (sequía fría)

Tabla 8. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en hígado. 43

Tabla 9. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en víscera. 44
Tabla 10. Matriz de correlaciones entre materia orgánica, pigmentos fotosintéticos e HAP´s, 45
evaluados en agua.
Tabla 11. Matriz de correlaciones entre materia orgánica e HAP´s, evaluados en sedimentos. 46

SEGUNDO MUESTREO (lluvias)

Tabla 12. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en hígado. 57

Tabla 13. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en víscera. 57
Tabla 14. Matriz de correlaciones entre materia orgánica, pigmentos fotosintéticos e HAP´s, 59
evaluados en agua.
Tabla 15. Matriz de correlaciones entre materia orgánica e HAP´s, evaluados en sedimentos. 60

iii
ABREVIATURAS

ACP´s análisis de componentes principales

CYP 2E1 citocromo P450 isoforma E1
DL50 concentración letal media
GSH glutatión reducido
HAP´s hidrocarburos aromáticos policícliclos
H2O2 peróxido de hidrógeno
HOOo hidroperóxido lipídico
Koc coeficiente de distribución en el suelo
Kow coeficiente de partición octanol-agua
FBC factor de bioconcentración
GSTT, GSTθ glutatión S-transferasa isoforma tetha
LMP límite máximo permisible
MAD malondialdehído
m. o. materia orgánica
MOD materia orgánica disuelta
MOP materia orgánica particulada
MOT materia orgánica total
O2- anión superóxido
PCB´s bifenilos policlorinados
TBAR´s substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
USEPA, EPA Agencia de protección ambiental de los E. U.

SÍMBOLOS

mPa milipascales (unidad de presión)

t½ tiempo de vida media

iv
 RESUMEN

Como resultado de las actividades humanas en los ambientes dulceacuícolas pueden

llegar a depositarse contaminantes con la capacidad de generar estrés oxidativo en los
organismos acuáticos, tales como los bifenilos policlorados (PCB´s) y los hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HAP´s). Además, dichas substancias son biotransformados por
las oxidasas de función mixta (tales como el CYP 2E1) y las enzimas dependientes del
glutatión (como la GSTT) hacia compuestos más polares que sean más fácilmente
eliminados por el organismo (detoxificación). Sin embargo, también pueden generarse
especies químicas con mayor toxicidad a la de los compuestos originales (bioactivación).
Por otra parte, ambos procesos pueden ser modificados por la presencia de otros
contaminantes ambientales. En conjunto, la respuesta tóxica sobre los organismos
acuáticos puede variar dependiendo de los xenobióticos en cuestión, la especie de que se
trate, la etapa del ciclo de vida en que se encuentre, sus hábitos alimenticios y la época
del año, entre otros.

En particular, el charal de Santiago (Chirostoma riojai) es una especie dulceacuícola

endémica de la zona central de nuestro país. Fue descrita hace poco más de 50 años,
pero debido a la destrucción de su hábitat, la contaminación, el uso de agua para riego,
actividades agrícolas, industriales y domésticas, el número de localidades donde habita
se ha reducido drásticamente, por lo que actualmente se encuentra en peligro de
extinción.

Por lo anterior, para el presente trabajo se decidió evaluar la respuesta pro-oxidante del
charal de Santiago expuesto a mezclas ambientales complejas de PCB´s e HAP´s en la
Laguna de Zumpango, Estado de México.

En la Laguna de Zumpango se colectó agua (en la superficie, en el nivel de

compensación y en el fondo) además de sedimentos, en tres estaciones representativas
del cuerpo de agua para el análisis de compuestos orgánicos halogenados (COH)
[bifenilos policlorados (PCB´s): mono-ortho-substituidos, di-ortho-substituidos y no-
ortho-substituidos e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP´s): naftaleno, pireno y
benzo[a]pireno (BaP)], además de parámetros fisicoquímicos evaluados in situ y en
laboratorio. Los charales fueron divididos en tres grupos de acuerdo a su relación peso-
talla. En hígado y vísceras se analizaron biomarcadores de la respuesta pro-oxidante
(concentración de peróxido de hidrógeno, hidroperóxidos lipídicos, lipoperoxidación,
oxidación de proteínas) y de la bioactivación (actividad del CYP2E1 y de la GSTT).
También se evaluó el contenido de HAP´s en estos órganos. Los resultados se analizaron
por medio de ANOVA seguido de la prueba de Dunnett. Las relaciones entre los
biomarcadores (variables dependientes) y la concentración de HAP (variables
independientes) se probó por regresión lineal y exponencial.

v
No detectaron PCB´s en la columna de agua, mientras que la concentración de HAP´s
presentó un patrón diferencial en los compartimentos ambientales. En el agua sólo se
detectó naftaleno, pero en los sedimentos el compuesto más abundante fue pireno,
seguido del benzo[a]pireno y en la estación más contaminada (embarcadero) se
encontraron los tres HAP’s bajo estudio. Estos hallazgos denotan que la actividad
antropogénica es determinante en la contaminación por HAP´s de este cuerpo de agua.
En hígado y vísceras se cuantificaron elevados factores de bioconcentración (FBC) de
pireno y bajos para el BaP. El hígado tuvo un FBC de pireno >2,000 y en vísceras fue
mayor a 2,500. Sin embargo, para el BaP el FBC fue menor a 10. Al respecto, es posible
sugerir interacciones complejas entre los componentes bióticos y abióticos. Respecto a la
generación de radicales libres todos ellos fueron detectados y además hubo diferencia
entre los tejidos. En ningún caso se halló lipoperoxidación significativa, pero los
hidroperoxidos lipídicos estuvieron incrementados. Esto demuestra que el estrés
oxidativo se detiene en fases tempranas. También se encontró oxidación de proteínas.
En hígado y víscera, los hidroperoxidos lipídicos y la lipoperoxidación, además de la
oxidación de proteínas tuvieron una relación significativa con los niveles de pireno
(p<0.001). Estos resultados sugieren que el daño oxidativo está asociado con el
metabolismo realizado por las enzimas de la función oxidasa, específicamente las
isoenzimas del citocromo P450, por lo que es posible concluir que la relación entre los
HAP’s y las fuerzas endógenas pro-oxidantes generan estrés oxidativo y en el caso de
los fosfolípidos, los daños se detienen en etapas tempranas pero en las proteínas, ocurre
una oxidación significativa.

vi
 ABSTRACT

As a result of the human activities, pollutants in the freshwater ecosystems able to

induce oxidative stress in the aquatic organisms can be loaded, such as polychlorinated
biphenyls (PCB´s) and polyaromatic aromatic hydrocarbons (PAH´s). Also, this
substances are biotransformed by mixed oxidase function enzymes (such as the CYP
2E1) and by the glutathione dependent enzymes (as the GSTT) to a more polar
compounds that could be eliminated by the organism more easily (detoxification).
However, as a consequence of this process, chemical species with higher toxicity
regarding to original compounds can also be generated (bioactivation). On the other
hand, both processes can be modified by the occurrence of other environmental
pollutants. Overall, the toxic response on the aquatic organisms can vary depending of
the type of xenobiotics, of the species, of the stage of lifespan, of its feeding behavior,
and the season, among others.

In particular, the Toluca silverside (Chirostoma riojai) is a freshwater species endemic of

the Central Plateau of Mexico. It was described more than 50 years ago, but due to its
habitat destruction, by the contamination, by the use of water for watering, by
agricultural, industrial and domestic activities, the number of its localities has decreased
drastically. As a consequence, this day its status is endangered. For the above-
mentioned, in the present study we decided to evaluate the pro-oxidant response of the
Toluca silverside exposed to environmental mixtures of PCB´s and PAH´s in Zumpango
Lake, State of Mexico.

In Zumpango Lake, water samples in the surface, in the compensation level and in the
bottom waster, also sediments were collected in three representative stations of the
water body for the analysis of halogenated organic compounds (HOC) [polychlorinated
biphenyls (PCB’s): mono-ortho-substituted, di-ortho-substituted and non-ortho-
substituted, and also polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH´s): naphthalene, pyrene
and benzo[a]pyrene (BaP)] besides physicochemical parameters evaluated in situ and in
laboratory. The specimens were divided in three groups according to its weight-size
relationship. In liver and viscera, biomarkers of pro-oxidant response (concentration of
peroxide of hydrogen, lipid hydroperoxides, lipid peroxidation and carbonyl proteins)
were assayed, also biomarkers of bioactivation (activity of the CYP2E1, and of the GSTT)
as well as the content of PAH´s in the organs were analyzed. The results were analyzed
by means of ANOVA followed by Dunnett test. The relationships among the biomarkers
(dependent variables) and the concentration of HOC (independent variables) it was
proven by lineal and exponential regression.

PCB’s in the water column were not detected, while the concentration of PAH’s have a
differential pattern in the environmental compartments. In the water column only
naphthalene was detected, but in sediments the most copious hydrocarbon was the
pyrene followed by the benzo[a]pyrene. In the most polluted station (harbor) three of
vii
the PAH’s under study were founded. These findings denote that the antropogenic
activity is crucial in the contamination of this water body with PAH’s. In liver and
viscera high bioconcentración factors (FBC) of pyrene followed by BaP were quantified.
The liver had a BCF of pireno >2,000 and in viscera was higher at 2,500. However, for
the BaP, the FBC was smaller at 10. In this respect it is possible to suggest complex
interactions between the biotic and abiotic compartments. Regarding to the generation
of free radicals, all of these were detected, as well as differences among the studied
tissues were noted. In any case lipid peroxidation was observed; however, the lipid
hydroperoxides content were detected. This finding denotes that the oxidative stress
stops in early phases of the chain reaction. Also, carbonyl proteins were noted in both
tissues. In liver and viscera, the lipid hydroperoxides and the lipid peroxidation as well
as the carbonyl proteins had a significant relationship with the levels of pyrene (p
<0.001). These results show that the oxidative damage is associated with the metabolism
carried out by the enzymes of the mixed oxidase function, specifically the cytochrome
P450 isoenzymes. It is possible to conclude that the relationship between the PAH’s with
the pro-oxidizers endogenous forces generates oxidative stress, in the case of the
fosfolipids of membranes the damages stops in early stages, but in case of the proteins, it
occurs in a significant magnitude.

viii
1. INTRODUCCIÓN

El charal de Santiago (Chirostoma riojai ) es una especie dulceacuícola que se encuentra

en la lista roja de especies en peligro de extinción. Se considera la degradación de su
hábitat como la principal causa de la disminución de las poblaciones naturales de esta
especie (Figueroa-Lucero y col., 2003).

Por otro lado, en los ambientes dulceacuícolas se pueden acumular contaminantes

ambientales con el potencial de causar estrés oxidativo en los organismos acuáticos,
tales como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP´s) y los bifenilos
policlorinados (PCB´s) (Di Giulio y col., 1989). Dichos contaminantes son
biotransformados y bioactivados por las enzimas de la función mixta oxidasa, como el
CYP2E1 y por enzimas de la fase II, como las pertenecientes a la familia de la glutatión-
S-transferasa (GST), tal es el caso de la GST isoforma tetha (GSTT).

2. ANTECEDENTES

2.1 BIFENILOS POLICLORADOS

Los bifenilos policlorados (PCB´s por sus siglas en inglés) son una serie de aceites de uso
industrial con alta resistencia al calor, formados por la unión de dos anillos aromáticos
(Fig. 1) los cuales pueden tener hasta 10 substituciones de átomos de cloro (Watts, 1998;
Eljarrat y Barceló, 2003).

Fig 1. Estructura básica de los PCB´s (Merck, 1996).

Estos compuestos se utilizaron por más de ocho décadas en sistemas de refrigeración, la

industria eléctrica (transformadores y condensadores) y en menor grado como fluidos
hidráulicos, lubricantes, plastificantes, impermeabilizantes, retardantes de flama,
pinturas y pigmentos (PNUMA y FAO, 1992; Moltó y col., 1998). Se comenzaron a
producir en 1929 por la compañía Monsanto (Estados Unidos) con el nombre de Aroclor,
debido a la necesidad de contar con un aceite enfriador para transformadores eléctricos
que tuviera propiedades dieléctricas y fuera más estable y menos inflamable que el
aceite mineral utilizado hasta entonces y de esta manera evitar que los arcos voltaicos
producidos en las plantas eléctricas pudieran provocar la ignición del mismo (Watts,
1998; Fernández-Bremauntz y col., 2004).
1
Ejemplos de otros nombres comerciales para los PCB´s son Chlorpen (Alemania) y
Kanechlor (Japón) (Moltó y col., 1998), Chloerxtol, Clophen, Dykanol, Fenclor, Inerteen,
Noflamol, Phenoclor, Pyralene, Pyranol, Santotherm, Sovol y Therminol (PNUMA y
FAO, 1992).

Al nivel mundial, los principales productores son Monsanto (E.U.A), Caffaro (Italia),
Kanegafuchi (Japón), Rhône-Poulenc (Francia), Atochem (Francia), Bayer (Alemania) y
Chemko (Checoslovaquia) (PNUMA y FAO, 1992).

Los bifenilos policlorados son producidos por medio de la cloración de un esqueleto

bifenilo en presencia de un catalizador (Moltó y col., 1998). Teóricamente se pueden
formar hasta 209 productos distintos ó congéneres (denominados así debido a que se
generan de manera simultánea en el proceso de cloración) (Moltó y col., 1998; Eljarrat y
Barceló, 2003).Ya que no es posible controlar el número de substituciones de Cl ó la
posición en que éstas ocurren (Watts, 1998), las formulaciones comerciales de PCB´s no
contienen un solo congénere, sino mezclas complejas de hasta 132 de éstos compuestos
(Bommanna y col., 1994).

Estas características dificultan la determinación de estos compuestos en las diferentes

matrices ambientales (EPA, 1996a; EPA, 1996b; Eljarrat y Barceló, 2003), a la vez que son
de relevancia toxicológica, ya que la respuesta tóxica producida por la mezcla puede ser
diferente a la causada por sus componentes de manera individual. Por ejemplo, si uno
de ellos estimula ó inhibe la biotransformación de otro componente de la mezcla puede
modificar su toxicidad y la forma en que es distribuido y acumulado en los tejidos
(Kleinow y col., 1987)). Otros factores que pueden modificar la respuesta tóxica son el
patrón de sustitución de los átomos de cloro sobre el anillo bifenilo y el porcentaje de
cloración (Ifremer, 2005), ya que al aumentar el número de sustituciones de cloro se
incrementa también su toxicidad (Repetto,1997; Eljarrat y Barceló, 2003). En la tabla 1 se
muestran las propiedades fisicoquímicas de algunos PCB´s:

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de PCB´s con 5, 6 y 7 sustituciones

de cloro en su estructura (Ifremer, 2005).
Compuesto Peso molecular Solubilidad en Presión de Log Kow
agua a 25 oC vapor a 25 oC
(μg/L) (mPa)
PCB 105 (5) 326.4 4-72 0.304-30 6.53-6.93
PCB 156 (6) 360.9 0.40-38 0.2-12 6.7-7.3
PCB 180 (7) 395.3 0.31-6.56 0.086-0.506 7.14-7.36
Nota: Los números entre paréntesis se refieren al número de átomos de Cl - en la molécula.

Por su elevada persistencia y toxicidad, en 1979 se prohibió la producción y se limitó la

distribución de PCB´s en E.U.A. Actualmente son considerados carcinógenos por la
Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) y la Agencia Internacional
2
para la Investigación en Cáncer (IARC, por sus siglas en inglés) (Moltó y col., 1998).
Además, están incluidos en la Lista de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COP´s),
adoptada en el Convenio de Estocolmo, Suecia, en 1991 (Eljarrat y Barceló, 2003;
Fernández-Bremauntz et al., 2004) y en la Lista de Contaminantes Prioritarios de la
Unión Europea (Bro-Rasmussen, 1994).

Sin embargo, en México y otros países dichos compuestos aún se encuentran presentes
en los transformadores y otros dispositivos eléctricos (Watts, 1998). En nuestro país aún
permanecen unas 5,000 ton de PCB´s sin destruir (Fernández-Bremauntz et al., 2004).

2.1.1 Toxocinética ambiental

Los PCB´s con 5 ó más átomos de cloro son muy resistentes a la biodegradación
(PNUMA y FAO, 1992) ya que al aumentar el porcentaje de cloración disminuye su
solubilidad en agua al igual que su capacidad de evaporación y volatilización. Sin
embargo, también se incrementa su afinidad por los tejidos adiposos y su adsorción en
los sedimentos. Estos fenómenos les permiten biacumularse y bioconcentrarse en los
organismos (Ifremer, 2005).

Los principales congéneres de PCB´s que pueden bioacumularse poseen 5 a 7 átomos de

cloro (penta, hexa y heptacloro bifenilos), ya que los compuestos con mayor número de
sustituciones de este halógeno se unen firmemente a los sedimentos y de esta manera se
reduce la biodisponibilidad para los organismos. Aquellos con menor proporción de
cloración son rápidamente biotransformados y eliminados por lo que son biacumulados
de manera reducida (Safe y col., 1982).

En peces y crustáceos se han encontrado factores de bioconcentración (FBC) de hasta

270,000 (PNUMA y FAO, 1992).

Una vez en los sedimentos, los PCB´s se unen fuertemente al carbón orgánico (Manahan,
2005), por lo que la vida media de estos compuestos (t ½) puede alcanzar alrededor de 5
años (PNUMA y FAO, 1992).

Bajo estas condiciones ciertas bacterias anaerobias de los sedimentos pueden modificar
la biodisponibilidad de los PCB´s por su elevado tiempo de residencia reduciendo la
proporción de congéneres con mayor número de átomos de cloro y aumentando de
manera simultánea, el porcentaje de compuestos menos clorados. Ya que los PCB´s con
mayor grado de cloración actúan como aceptores de electrones durante la respiración
microbiana anaerobia a este proceso se le denomina deshalorespiración (Manahan,
2005). Por otro lado, en compuestos con más de cinco átomos de cloro también puede
ocurrir en cierta medida la degradación por fotólisis (PNUMA y FAO, 1992).

3
Watts (1998) sugiere que las formulaciones de PCB´s con más de cinco átomos de Cl
sean consideradas de riesgo elevado debido a su alta persistencia y toxicidad.

2.1.2. Efectos tóxicos

Los PCB´s y sus congéneres pueden ser absorbidos a través de la piel, pulmones y tracto
gastrointestinal. A nivel ocupacional, las principales vías de exposición son la pulmonar
y dérmica. Por vía oral, la principal fuente de exposición es a través de la ingestión de
pescado contaminado (PNUMA y FAO, 1992; Ford y col., 2001).

Algunos de los efectos provocados por los PCB´s son inhibición de la acción de la
dopamina y otros neurotrasmisores (Fielder y Martin, 1994), inmunosupresión,
promoción de tumores e interferencia con la utilización del calcio (Dean y col., 1994).

A nivel agudo, pueden causar náuseas, letargo, pigmentación café en la piel y uñas,
edema subcutáneo en el rostro, aspecto peculiar en los folículos capilares, lagrimeo
excesivo, dificultad en la visión y problemas gastrointestinales (Merck, 1996).

En organismos acuáticos (peces), se han reportado valores de DL50 entre 3 y 3000 ug/L
(PNUMA y FAO, 1992).

A continuación se presentan los valores de DL50 reportados para algunos productos

comerciales (Tabla 2):

Tabla 2. Toxicidad aguda de algunas formulaciones de PCB´s

(PNUMA y FAO, 1992)
Organismo Formulación DL50 (mg/kg)
Rata (vía oral) Aroclor 1221(*) 4,000
Rata (vía oral) Aroclor 1268(*) 10,000
Conejo Aroclor 1242(*) 1,000
Conejo Aroclor 1268(*) 3,000
(*): Los últimos dos dígitos del nombre del producto indican el porcentaje de cloración
en peso en la formulación (p. ej., el Aroclor 1221 posee un 21% de átomos de cloro)

A nivel crónico en humanos, el signo más característico de intoxicación es la aparición

de cloracné en regiones específicas del cuerpo (por debajo y al lado de los ojos, detrás de
las orejas), pero también se puede presentar lesiones cutáneas sobre el cuello, hombros,
abdomen, escroto y pene en el caso de los varones (Ford y col., 2001). Daño hepático,
reducción en la capacidad pulmonar, irritación ocular y disminución en el peso del
producto en madres expuestas (Merck, 1996) y alteración del metabolismo del Ca++ por
vía hormonal (PNUMA y FAO, 1992).

4
También se ha documentado el potencial de los PCB´s y sus metabolitos para alterar los
procesos reproductivos en el hombre y los peces, al interferir con la función endócrina
(Ifremer, 2005).

Sin embargo, tal vez el efecto más importante a nivel crónico sea su carcinogenicidad, la
cual se ha observado en animales de laboratorio y es probable que también ocurra en el
hombre (PNUMA y FAO, 1992). Esto sucede a través de mecanismos epigénicos tales
como la inducción de enzimas, el incremento en la multiplicación celular y alteraciones
en la señalización (Ford y col., 2001). Según los datos epidemiológicos los principales
órganos afectados son el hígado, los conductos biliares y la vesícula biliar (PNUMA y
FAO, 1992).

A consecuencia del elevado número de congéneres de PCB´s que pueden contener las
formulaciones comerciales y para facilitar los estudios relacionados con estos
compuestos se han agrupado en 5 categorías de daño (1A, 1B, 2, 3 y 4). Además, se
reducido su número de 209 a 36 congéneres basándose en su potencial para causar
toxicidad, la capacidad para inducir las enzimas involucradas en su bioactivación,
ocurrencia en el ambiente y abundancia relativa en los tejidos animales (McFarland y
Clarke, 1989).

En el estudio de la toxicidad producida por los PCB´s se ha utilizado el concepto de

Factor Equivalente de Toxicidad (TFE, por sus siglas en inglés), el cual está basado en
los siguientes criterios: a) el compuesto debe poseer similitud estructural con la 2,3,7,8-
tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) considerada el contaminante ambiental más
potente conocido (Safe, 1987), b) la respuesta tóxica del compuesto debe estar mediada
por su unión al receptor aril hidrocarburo (AhR), y 3) el compuesto debe ser persistente
y bioacumularse a lo largo de la cadena alimenticia (Eljarrat y Barceló, 2003).

2.1.3 Biotransformación

Su biotransformación ocurre en el hígado a través de las isoenzimas del citocromo P450

(CYP 450) y de las glucuronil transferasas (Fielder y Martin, 1994). Posteriormente,
pueden ser eliminados a través de la bilis y orina. En el hombre, el tiempo de vida
media varía directamente con el grado de cloración del compuesto, de 6 meses en los
menos sustituidos a más de 2 años en los altamente clorados (Ford y col., 2001).

2.1.4 Normatividad

Se ha establecido un límite máximo permisible (LMP) para la protección de la vida

acuática para los PCB´s de 30 ug/L (ppb) (PNUMA y FAO, 1992).

5
Sin embargo, no existen valores de referencia similares en la legislación ambiental
mexicana para estas substancias y únicamente se hallan considerados en la NOM-133-
ECOL-2000, la cual establece las especificaciones de protección ambiental para el manejo
de PCB´s, materiales contaminados y equipos que los contengan (Fernández-Bremauntz,
2004).

2.2 HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAP´s)

Los hidrocarburos polinucleares (PNA´s, por sus siglas en inglés) son una serie de
compuestos aromáticos heterocíclicos formados por la fusión de dos o más anillos
bencénicos (Furton y Pentzke, 1998), los cuales pueden tener substituciones de átomos
de oxígeno, nitrógeno ó azufre. Entre éstos, se hallan los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAH´s, por sus siglas en inglés) formados únicamente por carbono e
hidrógeno (Watts, 1998).

Los HAP´s son moléculas moderadamente estables; sus fuentes de emisión principales
provienen de la combustión incompleta de combustibles fósiles (tales como carbón,
petróleo y gasolina) y materia orgánica, pero también pueden encontrarse en las
fracciones más pesadas de los derivados del petróleo (p. ej. aceites lubricantes y asfalto)
y en el humo del cigarrillo (Watts, 1998; Cram y col., 2004).

El más sencillo de los HAP´s es el naftaleno, el cual contiene únicamente dos anillos
bencénicos unidos entre sí (Fig. 2). Los otros HAP´s considerados en el presente trabajo
son el naftaleno, pireno y benzo[a]pireno, los cuales poseen 2, 4 y 5 anillos fusionados,
respectivamente (Fig. 2).

Naftaleno Pireno Benzo[a]pireno

Fig. 2. Estructura química del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno (Merck, 1996).

Sin embargo, en al ambiente se pueden encontrar mezclas extremadamente complejas

de HAP´s, incluyendo isómeros y formas alquiladas (Furton y Pentzke, 1998).

Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos están influidas por el número de

anillos bencénicos y en consecuencia, por su peso molecular (Ifremer, 2005).

A continuación, se presentan las propiedades físicas de los compuestos considerados en

este estudio (Tablas 3 y 4):

6
 Tabla 3. Propiedades físicas del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno (Merck, 1996)
Compuesto No. registro Peso Densidad Punto fusión Punto
CAS molecular ebullición
naftaleno 91-20-3 128.17 1.162 80.2 C
o 217.9 oC
pireno 129-00-0 202.26 1.271 156 oC 404 oC
benzo[a]pireno 50-32-8 252.32 179.3 oC 310 oC

Tabla 4. Propiedades físicoquímicas del naftaleno, pireno y benzo[a]pireno

(Cram y col., 2004)
Solubilidad Presión de Log Log
Compuesto en agua vapor (KPa) Kow Koc
(mg/L) (L kg-1)
naftaleno 31.0 0.012 3.37 -
pireno 0.14 3.33 x 10 -7 5.18 4.22-5.65
benzo[a]pireno 3.8 x 10 -3 7.45 x 10 -10 6.04 5.48-6.74
Nota: Kow se refiere al coeficiente de partición octanol-agua y Koc, al coeficiente
de distribución del compuesto orgánico entre el suelo y el agua de poro.

En particular, Ney (1990) ha propuesto un esquema para predecir el comportamiento de

los contaminantes orgánicos en los sedimentos utilizando su coeficiente de distribución
en el suelo (Koc) y su solubilidad en agua (Tabla 5):

Tabla 5. Destino de los contaminantes orgánicos en los sedimentos

con base en su Koc y su solubilidad en el agua (SA) (modificado de Ney, 1990).
Log Koc < 3 Log Koc >4
SA> 1,000 ppm SA< 10 ppm
Adsorción - X
Solubilidad X -
Movilidad X -
Biodegradación X -
Dispersión X -
Acumulación - X
Bioacumulación - X
Persistencia - X

7
2.2.1 Toxocinética

En el hombre la exposición a estos compuestos puede darse a través de alimentos

contaminados, de manera ocupacional ó por el asfalto aplicado a las carreteras (Furton y
Pentzke, 1998).
Al incrementarse el número de anillos de los HAP´s, su solubilidad en agua disminuye
y al igual que en el caso de los PCB´s, su adsorción en los sedimentos y la acumulación
en los tejidos adiposos de los organismos aumenta (Ifremer, 2005). En los sedimentos, se
unen principalmente a la fracción constituida por carbón orgánico (Manahan, 2005).

En el ambiente, los HAP´s pueden sufrir foto-oxidación por la acción de la luz

ultravioleta, al absorber y transferir la energía de la radiación UV hacia el oxígeno
molecular generando de esta manera especies reactivas, las cuales pueden dañar los
tejidos de manera directa ó al promover reacciones de óxido-reducción y provocan la
muerte celular (Ifremer, 2005).

Se ha observado este efecto fototóxico inducido por la luz UV sobre los HAP´s en células
humanas, plantas, peces, anfibios y zooplancton (Cram y col., 2004).

2.2.2 Efectos tóxicos

2.2.2.1 Naftaleno

A nivel agudo, se ha reportado que puede causar envenenamiento sin importar la vía de
absorción (oral, inhalatoria ó dérmica), el cual se manifiesta principalmente por la
presencia de anemia hemolítica (USEPA, 2003). Sin embargo, también pueden ocurrir
náuseas, vómito, dolor de cabeza, diaforesis, hematuria, fiebre, necrosis hepática,
ictericia, agrandamiento del bazo, convulsiones y coma (Merck, 1996).

2.2.3 Biotransformación de los HAP’s

Una vez que han ingresado al organismo, los HAP´s pueden ser biotransformados en
compuestos menos tóxicos y luego eliminados (detoxificación) ó bioactivados hacia
metabolitos reactivos con mayor toxicidad que el compuesto original, con potencial
mutagénico ó carcinogénico (Ifremer, 2005). En particular, el naftaleno y pireno son
bioactivados por el CYP 1A1 y el CYP 2E1 (Yang y col., 1999).

8
2.2.3.1 Naftaleno

En el hígado, este compuesto es oxidado hacia metabolitos reactivos (USEPA, 2003)

como naftol y naftoquinona, pero también puede ser conjugado directamente con el
glutatión para formar tioéteres (Leikin y Paloucek, 2008). Dichos metabolitos reaccionan
posteriormente con enzimas y macromoléculas de membrana, ejerciendo su efecto
tóxico sobre la sangre, el ojo y en estudios animales, afectando también el pulmón
(USEPA, 2003).
Un dato sobresaliente es el hecho que los individuos con deficiencia de la enzima
glucosa 6-fosfato deshidrogenasa son más susceptibles a desarrollar anemia hemolítica
luego de la exposición a este compuesto. Esto se asocia también con niveles de glutatión
reducido (GSH) bajos, el cual se encarga de proteger a los eritrocitos contra daño
oxidativo (USEPA, 2003).

Una situación parecida puede darse en los organismos juveniles, ya que las vías
encargadas de la detoxificación de los metabolitos reactivos aún no se encuentran bien
desarrolladas (USEPA, 2003).

2.2.3.1 Benzo[a]pireno

Después de la oxidación inicial del benzo[a]pireno por el CYP 450 (Fig. 3) se forma un
7,8 epóxido, el cual es transformado por la acción de la enzima epóxido hidrolasa en un
7,8 diol. Este último compuesto es oxidado nuevamente por las oxidasas de función
mixta hacia el antiisómero (+)7,8-diol-9,10-epóxido (Manahan, 2003), el cual ha
demostrado propiedades mutagénicas y carcinogénicas en animales de laboratorio
(Rubin, 2001).

Por lo anterior, este compuesto ha sido considerado como potencialmente carcinógeno

para el hombre por diversas instancias en los E.U.A.(Tabla 6).

Tabla 6. Clasificación de la peligrosidad del benzo[a]pireno (James y Saranko, 2000).

Organismo Clase de peligro
ACGIH A2: sospechoso de ser carcinógeno en el hombre
NIOSH Substancias ocupacionales potencialmente carcinógenas
NTP Agentes potencialmente carcinógenos en el hombre
IARC 2A: Posiblemente carcinógeno para el hombre (de manera individual)

ACGIH: American Conference of Governmental Industrial Hygienists; NIOSH: National Institute for
Occupational Safety and Health; NTP: National Toxicology Program; IARC: International Agency for
Research on Cancers.

9
Además, el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA) ha
considerado ampliar la lista de contaminantes orgánicos persistentes (COP´s) para
incluir a los HAP´s (Fernández-Bremauntz y col., 2004).

CYP 450

Benzo[a]pireno (+)Benzo[a]pireno7,8 epóxido

epóxido H2O
hidrolasa

(+)Benzo[a]pireno7,8 dihidrodiol

CYP 450

(+)Benzo[a] pireno7,8 diol-9, 10-epóxido-2

(carcinogénico)

Fig. 3. Biotransformación del benzo[a]pireno (modificado de Manahan, 2003).

10
2.2.4 Normatividad

En Estados Unidos, se ha establecido un Límite de Referencia para la Salud (HRL, por

sus siglas en inglés) para naftaleno de 140 ug/L, equivalentes a 0.14 ppm (USEPA, 2003).

En nuestro país, las Normas Oficiales Mexicanas no consideran Límites Máximos

Permisibles (LMP´s) para la protección de la vida acuática para los HAP´s (Scram y col.,
2004).

2.3 Biomarcadores

Un biomarcador es una variación ya sea en los componentes ultraestructurales, al nivel

de organelos, en los procesos bioquímicos o fisiológicos y que son medibles en un
sistema biológico ó en muestras y además puede ser inducido por los xenobióticos
(NRC, 1989).

Tales variaciones pueden indicar la magnitud de la respuesta del organismo a los

contaminantes, así como establecer una relación causal entre la presencia de una
substancia química y su efecto (Fosi, 1994).

Los biomarcadores pueden clasificarse en tres tipos (NRC, 1997):

a) De exposición. Se refieren a la cuantificación de un compuesto ó su metabolito, ó

a una respuesta única atribuible a un compuesto ó grupo de ellos.

b) De efecto. Son respuestas en el organismo que puedan estar directamente

relacionadas con la exposición.

c) De susceptibilidad. Es la medición de las capacidades innatas ó inducidas del

organismo para responder a un tóxico ambiental.

2.3.1 Uso de biomarcadores en estudios ecotoxicológicos

En este tipo de estudios, se puede evaluar el estado de salud del ecosistema utilizando
especies centinela como bioindicadores ó de modo más específico, investigar el estado
de salud de una población ó de una especie en riesgo expuesta a contaminantes
ambientales (Fosi, 1994).

11
2.3.1.1 Radicales libres y especies reactivas de oxígeno

Los radicales libres son especies químicas con uno ó más electrones desapareados
(Halliwell y Cross, 1994). Hace más de medio siglo, se propuso que la generación de
radicales libres podría ser la responsable de los efectos tóxicos provocados por el
oxígeno molecular (O2) (Gerschman y col., 1954). Esta hipótesis se popularizó y fue
convertida en la teoría de la toxicidad del O2 causada por el superóxido (O2.), luego del
descubrimiento de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en 1969 por McCord y
Fridovich (Fridovich, 1989). Este radical, junto con el radical hidroxilo (OH.) y el
peróxido de hidrógeno (H2O2), se denominan en conjunto especies reactivas de oxígeno
(ROS, por sus siglas en inglés) (Halliwell y Cross, 1994).

En los organismos aerobios, las especies reactivas de oxígeno pueden formarse de

manera normal durante procesos que involucran la transferencia de electrones, tales
como la cadena respiratoria mitocondrial (Könisberg, 1992), la biotransformación de
xenobióticos por el CYP 450 (Fridovich, 1989), la auto-oxidación de flavinas,
catecolaminas e hidroquinonas catalizada por metales de transición (Fe y Cu) presentes
intracelularmente (Halliwell y Gutteridge, 1989) ó la incidencia de luz ultravioleta sobre
las moléculas (Reppeto, 1997).

En particular, se ha reportado la participación del O2. y H2O2 en funciones celulares de

importancia, p. ej. como segundos mensajeros en cascadas de señalización (Valko y col.,
2006; Gómez-Quiroz y Cuevas-Baena, 2008) y su producción por los neutrófilos y
macrófagos durante los procesos inflamatorios como respuesta a agentes infecciosos
(Valko y col., 2006).

Sin embargo, el O2. y H2O2 son precursores del radical hidroxilo, el cual es el agente
oxidante más potente encontrado en los sistemas biológicos (Halliwell y Gutteridge,
1989; Kruk, 1998).

Debido a su elevada reactividad, el OH. puede reaccionar prácticamente con cualquier

molécula biológica con que entre en contacto (Halliwell y Cross, 1994), por lo que puede
generar estrés oxidativo y dañar importantes componentes celulares, tales como
membranas, proteínas y ácidos nucleicos (Poli y col., 2004).

2.3.1.2 Estrés oxidativo

Es un desbalance entre las fuerzas pro-oxidantes y antioxidantes lo cual puede

desembocar en una serie de daños en la célula ó en los procesos adaptativos frente a
dicho desbalance (Halliwell y Gutteridge, 1999).

12
En los organismos acuáticos, este desequilibrio puede ser producido por variaciones en
la disponibilidad de oxígeno en los tejidos de los organismos (Storey, 1996) ó por la
acción de los contaminantes sobre los organismos.

2.3.1.3 Lipoperoxidación celular

La lipoperoxidación es uno de los principales efectos celulares causados por la

generación de radicales libres (Fig. 4). Es un proceso degenerativo que actúa sobre los
ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares y cuya consecuencia más
importante es la destrucción paulatina de éstas. Dicha ruptura genera una variedad de
compuestos (alcoholes, cetonas, aldehídos y éteres) entre los que se encuentra el
malondialdehído (MAD) (Buege y Aust, 1978). Existen defensas antioxidantes
inespecíficas como las vitaminas A, C y E, ácido úrico y ceruloplasmina y específicas o
enzimáticas como la superóxido-dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y las enzimas
dependientes del glutatión glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa (GR)) para
prevenir este proceso (Comporti, 1993).

2.3.1.4 Generación de hidroperóxidos lipídicos

Los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas biológicas son particularmente

susceptibles de ser atacados por radicales libres. En la fase de iniciación del proceso de
lipoperoxidación, la sustracción de un átomo de hidrógeno por el radical hidroxilo
genera un radical lípidico con un carbono centrado (dieno conjugado); éste reacciona
con el oxígeno molecular (O2) para formar un radical peroxilo (radical lípido peróxido),
dando lugar a hidroperóxidos lipídicos (Fig 5) (Halliwell, 1992).

Los radicales peroxilo pueden sustraer un átomo de hidrógeno de un ácido graso

adyacente, comenzando una serie de reacciones autocatalíticas en cadena (fase de
propagación) que convierten a muchos lípidos de membrana en hidroperóxidos
lipídicos. La presencia de estos daños altera su función al modificar su fluidez y
permitiendo el paso de iones como el Ca++ a través de la misma, lo cual activa a las
fosfolipasas y eventualmente provoca su ruptura. Además, los hidroperóxidos lipídicos
pueden atacar y dañar proteínas de membrana (Halliwell, 1992).

Finalmente, los hidroperóxidos lipídicos pueden ser convertidos en una serie de

productos de bajo peso molecular (alcanos, alquenos, derivados hidroxi ó epoxi, cetonas
y polihidroxiperóxidos), los cuales por sí mismos pueden ser tóxicos para la célula
(Fuller y col., 1988). A este proceso se le denomina lipoperoxidación.

13
Fig. 4. Peroxidación de lípidos (Buege y Aust, 1973).

14
Fig 5. Generación de hidroperóxidos lipídicos
(basado en Halliwell y Gutteridge, 1989)

15
2.3.1.5 Oxidación de proteínas

Las proteínas realizan una gran cantidad de funciones celulares, tales como la recepción
y trasmisión de señales, el transporte de iones, las respuestas a condiciones de estrés, el
metabolismo energético, la duplicación y reparación del DNA, la traducción y la
transcripción. Cuando el O2- y el H2O2 se unen a residuos de metionina ó cisteína,
pueden activarlas ó inactivarlas (Hansberg-Torres, 2002). El O2- también puede
reaccionar con los aminoácidos triptofano, tirosina, histidina y lisina (Davies y Dean,
1997). El grado de oxidación en las proteínas se puede medir cuantificando el número de
carbonilos, los cuales se forman por la oxidación de de los aminoácidos prolina y
arginina, rupturas en la cadena peptídica (Hansberg-Torres, 2002) ó la reacción de los
aldehídos (producto de la peroxidación de lípidos y la oxidación de azúcares) con las
proteínas (Hermes-Lima, 2006).

Cuando esta modificación es irreversible (Fig. 6), un cambio en la estructura de la

proteína puede llevar a un daño funcional, alterando los procesos en los cuales
interviene (Repetto, 1997). La mayoría de los daños producidos por el O 2- son de este
tipo y en términos generales marcan a las proteínas para su degradación proteolítica
(Hansberg-Torres, 2000).

Fig. 6. Formación del sulfóxido de metionina (reversible) y de la sulfona de

metionina(irreversible) (Hansberg-Torres, 2002).

2.3.1.6 Generación de formaldehído

Como se ha mencionado, el radical hidroxilo (OH.) es el radical del oxígeno más reactivo
que se conoce (Halliwell y Gutteridge, 1989; Kruk, 1998) y que debido a su reactividad,
puede sustraer hidrógenos, p. ej. de los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados
de las membranas biológicas (Halliwell y Gutteridge, 1989). La lipoperoxidación genera
una variedad de compuestos, entre los que se puede encontrar alcoholes (Buege y Aust,
1978) (Fig. 7). Estos alcoholes pueden ser oxidados a sus correspondientes aldehídos
(Dorfman y Adams, 1973) por las enzimas contenidas en los microsomas hepáticos
(Cederbaum y Cohen, 1980) ó por las catalasas, en el caso de alcoholes de bajo peso
molecular, tales como metanol y etanol (Halliwell y Gutteridge, 1989). Si el alcohol

16
oxidado es el metanol (CH3OH), el aldehído producido es el metanal (HCHO) ó
formaldehído.

Fig. 7. Formación de alcoholes como resultado de la peroxidación de lípidos

(modificado de Repetto, 1997).

17
2.4 Biotransformación de los xenobióticos

Una vez que han ingresado al organismo, las substancias sufren una serie de reacciones
químicas que cambian sus propiedades químicas y sus efectos toxicológicos. Dichas
reacciones, modifican la polaridad del compuesto, afectando así la forma en que es
distribuido y facilitando su eliminación del organismo (detoxificación). Sin embargo,
también pueden producirse metabolitos con mayor toxicidad que la del compuesto
original, a este proceso se le denomina bioactivación (Alvares y Pratt, 1990).

Las reacciones de biotransformación pueden dividirse en dos clases: las de fase I y las de
fase II. En las primeras, la finalidad es incrementar la polaridad del compuesto al
oxidarlo, reducirlo ó romper enlaces éster ó amida. En las reacciones de fase II ó de
conjugación, el compuesto original ó uno de sus metabolitos es acoplado a substratos
endógenos tales como el ácido glucurónico, ácido acético ó ácido sulfúrico (Alvares y
Pratt, 1990).

2.4.1 Sistema de oxidasas de función mixta (MFO)

Comprende una superfamilia de enzimas mono-oxigenasas que catalizan la

incorporación de oxígeno al sustrato. Se denominan oxidasas de función mixta (MFO,
por sus siglas en inglés) debido a que del oxígeno molecular se reduce un átomo de
oxígeno hacia agua, como lo hacen las oxidasas, mientras el otro es adicionado al
sustrato (Turpein, 2006) dando como resultado alcoholes y epóxidos (Repetto, 1997).

Estas enzimas contienen un átomo de Fe y para realizar su función requieren de

oxígeno, un agente reductor derivado del NADPH y un transporte facilitado a través del
citocromo P450 (CYP) (Martin y col., 1985) (Fig. 8).

Fig 8. Ciclo catalítico del citocromo P450 (Turpein, 2006).

18
La superfamilia de los CYP´s con base en su homología ha sido dividida en familias
(enzimas con más de 40% de la secuencia de aminoácidos idéntica) y éstas a su vez, en
subfamilias (si más del 55% de la secuencia de animoácidos se repite). En el hombre,
actualmente se han descrito hay 18 familias de CYP´s y 42 subfamilias, las cuales
abarcan 57 genes que codifican para dichos CYP´s y 58 pseudogenes. Las enzimas de las
familias 1-3 realizan la mayoría de la biotransformación de los xenobióticos, mientras el
resto está involucrado en funciones fisiológicas como las biosíntesis de ácidos grasos,
hormonas esteroides y ácidos biliares (Turpein, 2006).

De todos los sistemas enzimáticos involucrados en las reacciones de biotransformación,

este trabajo estará enfocado al CYP 2E1 y la GSTT por su importancia en la
biotransformación y/o biactivación de los PCB’s y de los HAP’s.

2.4.1.1 Citocromo 2E1 (CYP 2E1)

Esta subfamilia está codificada por un solo gen. Se encuentra en cantidades

relativamente altas en el hígado (2-4%). Los sustratos para este CYP usualmente son
compuestos hidrofóbicos ó de bajo peso molecular y para su estudio se han empleado
clorzoxazona, acetominofén, enflurano y halotano (Turpein, 2006).

El CYP 2E1 puede ser inducido por varios de sus sustratos (tales como el etanol, acetona
y pirazol); por el contrario, puede ser inhibido por la piridina y el disulfiram (Turpein,
2006).

2.4.2 Glutatión S-transferasas

Consisten en una familia de isoenzimas encargadas de la conjugación de los

xenobióticos y los aldehídos resultado de la peroxidación de lípidos con el glutatión
(GSH) (Hermes-Lima, 2004). Este proceso puede ocurrir con un gran número de
xenobióticos y compuestos endógenos electrofílicos (Jakoby, 1990) y constituye el primer
paso en la vía de la formación del ácido mercaptúrico (Commandeur y col., 1995).

Las GST´s están ampliamente distribuidas en todos los organismos incluyendo

bacterias, hongos, plantas y animales, ya sea en el citoplasma ó el núcleo (Hermes-Lima,
2004).

La conjugación de dichos compuestos electrofílicos con el glutatión, previene que estos

reaccionen con los centros nucleofílicos de moléculas importantes para la célula, tales
como las proteínas y el DNA (Commandeur y col., 1995). Además, las GST´s son
importantes para la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos (Hermes-Lima, 2004).

19
Por otra parte, se ha visto que las glutatión S-transferasas poseen actividad tipo
glutatión peroxidasa independiente de selenio (denotada como GST-Px), por lo que
pueden catalizar peróxidos orgánicos, tales como los hidroperóxidos lipídicos, pero no
los peróxidos inorgánicos (p. ej. el H2O2). Esta capacidad está distribuida de manera
diferencial entre las diferentes clases de GST´s, siendo más alta para la GSTθ (ó GST T),
moderada para la GSTα y baja para las otras isoformas, y se ha visto que juega un papel
importante en la detoxificación de hidroperóxidos orgánicos en mamíferos (Hermes-
Lima, 2006).

En los vertebrados, se han identificado 6 clases de GST´s, 4 en la fracción citosólica

[alpha (α), mu (µ), pi (π) y tetha (θ)] (Mannervik y col., 1992) y 2 en la fracción
microsomal (sigma y kappa). Las diferencias de las isoformas están basadas en las
secuencias del amino terminal, especificidad del sustrato, sensibilidad a los inhibidores,
punto isoeléctrico y análisis inmunológicos (Hermes-Lima, 2006). Dentro de la fracción
citoplasmática se han encontrado dos tipos de la isoforma tetha (θ), la GST T1-1 (Meyer
y col., 1991) y la GST T2-2 (Hussey y Hayes, 1992). Con esta nomenclatura, GST T1-1 se
refiere a una isoenzima GST de la clase tetha, formada por dos subunidades (es decir, un
dímero) del tipo T1.

20
2.5 ZONA DE ESTUDIO

La Laguna de Zumpango (Fig. 9) se encuentra situada al noreste del Estado de México,

en el Municipio de Zumpango de Ocampo (INEGI, 2000).

Fig. 9. Laguna de Zumpango, Estado de México. URL4 (2008) Google Earth, Image© Digital Globe.

Forma parte de los antiguos lagos de la Cuenca del Valle de México (Texcoco, Chalco,
Zumpango y Xochimilco) (Fig. 10) y por sus dimensiones (1,865 Ha de superficie y 18
km de longitud en su bordo), se considera uno de los cuerpos de agua más importantes
del Estado de México (INEGI, 2001) y el más grande de la ex zona lacustre del Valle de
México.

Hasta 1789 fue una cuenca cerrada y de gran extensión, posteriormente el espejo de
agua se redujo tanto por la utilización del agua de sus tributarios y de la tierra para uso
agrícola. A principios del siglo XX se comenzaron a drenar su aguas hacia el Río Tula a
través del Tajo de Nochistongo para tratar de evitar las inundaciones que afectaban a la
Ciudad de México, lo cual redujo considerablemente su superficie (INEGI, 2001).

21
Fig. 10. Zona lacustre del Valle de México, indicando la ubicación actual de las zonas
que circundaban a este cuerpo de agua (INEGI, 2001).

22
Actualmente, este embalse se halla incluido dentro de las Regiones Hidrológicas
Prioritarias de la CONABIO (Comisión Nacional para Conocimiento y Uso de la
Biodiversidad) (Arriaga-Cabrera y col., 1998), es una de las Reservas Naturales
Protegidas bajo el control del Estado de México y fue declarado “Santuario del Agua” en
2003 (INEGI, 2008).

2.6 Generalidades sobre el charal de Santiago (Chirostoma riojai)

Chirostoma riojai (Fig. 11) es una especie de pez zooplanctófaga endémica del Antiplano
Mexicano, de importancia económica para las poblaciones que habitan las riberas de los
lagos del curso alto del sistema Lerma-Santiago (Figueroa-Lucero y col., 2003).

Fig. 11. Ejemplares de Chirostoma riojai

(Laboratorio de Toxicología Ambiental, ENCB-IPN).

Esta zona se caracteriza por ser un gran centro ictiológico de endemismos del país, con
58% de especies endémicas (Miller y Smith, 1986). Sin embargo, desde hace tiempo se
han desarrollado importantes núcleos humanos en la región. A lo largo de su cauce,
actualmente se presenta un alto grado de urbanización e industrialización afectando la
calidad del aire, agua, suelo y comunidades naturales que ahí habitan (Figueroa-Lucero
y col., 2003).

El charal de Santiago Chirostoma riojai se describió por primera vez en 1965. Sin
embargo, en 1997 sólo se registró su presencia en 9 localidades del Alto Lerma y en la
actualidad sólo se le reporta en dos localidades: la Laguna de Santiago Tilapa que fue
donde se describió el holotipo y el embalse Ignacio Ramírez (Figueroa-Lucero y col.,
2003), por lo que actualmente se halla incluida en las especies en peligro de extinción
(NOM-059-SEMARNAT-2001).

2.7 Bioactivación y conjugación de PCB´s y HAP’s en organismos acuáticos

Existen trabajos previos realizados en organismos acuáticos y animales de laboratorio

donde se ha estudiado el papel de la GSTT y el CYP 2E1 en la biotransformación y
bioactivación de varios compuestos orgánicos.

23
Por ejemplo, en animales de laboratorio, se ha investigado el papel del CYP 2E1 en la
biotransformación del etanol, la biactivación de varios solventes industriales y como
generador de radicales libres (Turpein, 2006) y la conjugación de epóxidos e
hidroperóxidos a través de la GSTT (Blocki y col., 1994).

En relación con los organismos acuáticos, Wall y Crivello (1998) reportaron por primera
vez la actividad del CYP 2E1 en peces teleósteos y Geter y col. (2003) observaron la
inducción de este CYP en peces Oryzias latipes expuestos a compuestos clorados y
compuestos generadores de radicales libres (etanol y acetona).

Por otro lado, en referencia al estrés oxidativo en organismos acuáticos, se pueden citar
los siguientes trabajos:

Thomas y Wofford (1993), expusieron al pez Micropogonias undulatus a Aroclor 1254,

observando un incremento en los niveles de malondialdehído en el hígado (in vivo e in
vitro) y ovario (in vitro) de los peces.

En otra investigación, en la cual se expuso al bagre de canal Ictalurus punctatus a

sedimentos contaminados con HAP´s, se encontró que a todos los periodos de tiempo
evaluados, los niveles hepáticos de malondialdehído fueron significativamente mayores
que en los controles (Di Giulio y col., 1993).

En relación con la bioacumulación de compuestos orgánicos halogenados (PCB´s), Otto

y Moon (1996) evaluaron la acumulación de estos compuestos en el músculo de peces
Ameriurus nebulosus colectados en un cuerpo de agua contaminado con estas
substancias, hallando un incremento en los niveles de PCB´s de 22 veces con respecto a
los detectados en peces provenientes de un sitio no contaminado utilizado como
referencia.

24
 3. JUSTIFICACIÓN

La presencia en el ambiente de compuestos aromáticos halogenados (PCB´s) e

hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP´s) puede representar un riesgo potencial
para la salud y los ecosistemas acuáticos. En el caso del charal de Santiago (Chirostoma
riojai) además de ser una especie endémica está en peligro de extinción. Aunque no
existen reportes que argumenten las causas de su desaparición, la contaminación de los
cuerpos de agua podría ser un factor importante limitante para su distribución, además
de acelerar la reducción de sus poblaciones naturales.

Se sabe que los HAP´s y PCB´s, ambos grupos de contaminantes ubicuos en los
ecosistemas acuáticos, requieren de la bioactivación para llevar a cabo sus efectos
tóxicos y además pueden acumularse en los organismos generando radicales libres y
causando una serie de daños celulares como la peroxidación de lípidos y la oxidación de
proteínas.

Por lo anterior, son necesarios numerosos estudios donde sobresale evaluar la

biactivación de compuestos aromáticos halogenados (PCB´s y HAP´s) a través de las
enzimas CYP 2E1 y GSTT en el charal de Santiago C. riojai, especie endémica de nuestro
país.

Los resultados obtenidos permitirán por un lado diagnosticar el estado de salud de esta
población del charal de Santiago habitante de la Laguna de Zumpango y por otro lado,
proporcionarán información sobre los niveles de contaminación de este cuerpo de agua
para el establecimiento de medidas preventivas y/o correctivas para la protección de
esta especie en peligro de extinción.

4. HIPÓTESIS

Si la Laguna de Zumpango, Estado de México está contaminada con compuestos

orgánicos halogenados como los PCB´s y HAP´s, entonces sus efectos tóxicos podrán ser
evaluados a través de biomarcadores de biactivación y de estrés oxidativo en el charal
de Santiago (C. riojai) habitante de este cuerpo de agua y será posible encontrar
relaciones entre la respuesta biológica y los niveles de estos contaminantes presentes en
los diferentes compartimentos ambientales (agua y sedimento).

25
 5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la biactivación de compuestos orgánicos halogenados (PCB´s y HAP´s) en el

charal de Santiago Chirostoma riojai, colectado en la Laguna de Zumpango, Estado de
México, durante dos periodos bien diferenciados del año: sequía fría (diciembre 2008) y
lluvias (julio 2009).

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Evaluar los niveles de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP´s) y de los

bifenilos policlorados (PCB´s) presentes en el agua, sedimento y peces de la
Laguna de Zumpango, Estado de México.

2) Determinar el factor de bioconcentración (FBC) de los compuestos mencionados

en el hígado y víscera de los peces.

3) Medir la actividad de los fuerzas endógenas pro-oxidantes como el CYP 2E1 y la

glutatión S-transferasa isoforma tetha en el charal de Santiago (Chirostoma riojai)
expuesto mezclas ambientales complejas y sus relaciones con el estrés oxidativo.

4) Cuantificar la concentración de especies reactivas del oxigeno (peróxido de

hidrógeno y anión superóxido) producidos de manera endógena y sus relaciones
con el estrés oxidativo.

5) Valorar el estrés oxidativo en el hígado y vísceras de los peces, utilizando como

biomarcadores los niveles de lipoperoxidación, hidroperóxidos lipídicos y
oxidación de proteínas.

26
 6. METODOLOGÍA

Fig. 12. Diagrama de flujo de las determinaciones realizadas en laboratorio y campo.

27
 6.1 Determinaciones realizadas en el laboratorio

6.1.1 Proteínas totales

A pH ácido (3.9), el verde de bromocresol se une a las proteínas, dando como resultado
un cambio de coloración de verde hacia azul. De esta manera, la cantidad de proteínas
presentes en la muestra es proporcional a la absorbancia, la cual es evaluada a 625 nm y
determinada por interpolación en una curva patrón de albúmina.

6.1.2 Biomarcadores de bioactivación

6.1.2.1 Actividad del CYP 2E1 (Cannady y col., 2003)

La hidroxilación del p-nitrofenol por el CYP 2E1 es evaluada a pH débilmente ácido (6.8)
en presencia de NADH. La actividad se evalúa mediante la formación de p-nitrocatecol
a 520 nm y se expresa en relación a la cantidad de proteínas totales contenidas en la
muestra, como mM/ min/mg proteína. El coeficiente de extinción molar para el p-
nitrocatecol es de 91 mM cm-1.

6.1.2.2 Actividad de la glutatión S-transferasa isoforma tetha (Warholm y col., 1994)

En esta determinación se cuantifica la producción de formaldehído en presencia de

GSH, usando como sustrato al diclorometano con reactivo de Nash (86 uL de ácido
acético, 62 uL de acetil acetona y 4.6 g de acetato de amonio/ 10 mL). La actividad de la
enzima se evalúa a 414 nm, a pH de 7.4 y se expresa como ug formaldehído/ min/mg
proteína usando una curva estándar de formaldehído.

6.1.3 Biomarcadores de estrés oxidativo

6.1.3.1 Anión superóxido (Schlezinger y col., 1999)

El dihidroetidio es oxidado por el anión superóxido en presencia de NADH. El producto

oxidado se evalúa espectrofluorométricamente a 530 nm de emisión y 624 nm de
excitación. La concentración de anión superóxido se estima mediante un coeficiente de
extinción molar de 7,000 M cm-1.

6.1.3.2 Peróxido de hidrógeno (Schlezinger y col., 1999)

Esta técnica se basa en la oxidación del diacetato de diclorodihidrofluoresceína que

realiza el H2O2. El producto oxidado emite fluorescencia a 485 nm de excitación y 525
nm de emisión en presencia de NADH. Para el cálculo se usa una curva patrón de H2O2.
28
6.1.3.3 Formaldehído (basado en Warholm y col., 1994)

La cuantificación de este compuesto se realiza a 414 nm, por medio de la adición del
reactivo de Nash como se detalló previamente.

6.1.4 Biomarcadores de daño

6.1.4.1 Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s) (Buege y Aust, 1978)

El malondialdehído (MDA) es uno de los productos del proceso de lipoperoxidación. En

esta técnica, se hace reaccionar este compuesto con el ácido tiobarbitúrico (TBA), dando
como resultado un complejo color rosa-anaranjado, el cual es evaluado a 535 nm usando
un coeficiente de extinción molar de 1.56 x 105 M cm-1 y se expresan como sustancias
reactivas al ácido tiobarbitúrico.

6.1.4.2 Hidroperóxidos lipídicos (Furtado-Filho y col., 2007)

En esta reacción, los hidroperóxidos lipídicos son oxidados a pH ácido por un complejo
ferroso-xilenol naranja. El complejo resultante Fe3+-xilenol naranja es evaluado a 530 nm
mediante una curva de calibración de hidroperoxido cumeno (Sigma Aldrich) de 0.1 a
0.5 mM.

6.1.4.3 Oxidación de proteínas (formación de carbonilos) (Ansaldo y col., 2007)

Los productos más importantes del ataque de los radicales libres sobre las proteínas son
los derivados carbonilo, los cuales son evaluados por medio de su derivatización con
2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), seguida de precipitación ácida y su posterior lectura
a 366 nm. La concentración de derivados carbonilo se estima mediante el coeficiente de
extinción molar de 0.022 mM cm-1

6.1.5 Determinaciones ambientales

6.1.5.1 Materia orgánica total en sedimentos y agua (APHA, 1992)

6.1.5.1.1 Materia orgánica total en sedimentos

En esta técnica, la materia orgánica (m. o.) presente en las muestras es oxidada con
K2Cr2O7 y H2SO4. A continuación, se titulan con sulfato ferroso en presencia de un
indicador (ferroína), hasta lograr un vire de color de esmeralda a canela-rojizo.

29
Finalmente, la m. o. es cuantificada al comparar los volúmenes de titulación de las
muestras con la del testigo y normalizada utilizando el peso seco del sedimento.

6.1.5.1.2 Materia orgánica total en aguas

Para cuantificar la m. o., se hace pasar un volumen determinado de agua a través de un

filtro de fibra de vidrio de 0.45 micras, el cual es colocado en un matraz Erlenmeyer. El
resto de la determinación es igual al empleado para las muestras de sedimento.

6.1.5.1.3 Materia orgánica hidrosoluble (APHA, 1992)

6.1.5.3.1 Materia orgánica hidrosoluble en sedimentos

En esta técnica, se agrega un volumen de agua a las muestras de sedimento, se agita en

Vórtex y se centrifuga. A continuación, el sobrenadante es filtrado, acidificado con HCl
y leído a 275 nm. El carbono orgánico hidrosoluble es cuantificado por interpolación en
una curva patrón preparada con biftalato de potasio y normalizada respecto al peso seco
del sedimento.

6.1.5.3.2 Materia orgánica hidrosoluble en aguas

Se toma un volumen determinado de muestra, la cual es filtrada. En seguida, sobre el

filtrado se repite el mismo procedimiento que en inciso anterior.

6.1.5.2 Clorofilas (Axler y Owen, 1994)

La cuantificación de los pigmentos fotosintéticos se realiza espectrofotométricamente,

evaluando a distintas longitudes de onda (430 nm para clorofila “a”, 453 nm para
clorofila “b” y 665 nm para feofitinas) la cantidad de pigmentos contenidos en un
volumen determinado de muestra, los cuales han sido extraídos previamente bajo
condiciones alcalinas (acetona al 90% a pH 10.0), e interpolando posteriormente las
absorbancias leídas en ecuaciones preestablecidas con estándares de clorofila “a” y “b”
(Sigma Aldrich).

30
6.1.5.3 HAP´s en agua, sedimento y tejidos (Livingstone y col., 1993)

6.1.5.3.1 HAP´s en sedimentos

Las muestras de sedimento son pesadas y se realiza una extracción con diclorometano
agitando en vortex por 5 y centrifugadas a 3,500 rpm/15 min. En seguida, el
sobrenadante obtenido es filtrado 3 veces, utilizando lana de fibra de vidrio y colectado
en frascos color ámbar, los cuales son etiquetados y mantenidos en congelación hasta el
momento de las determinaciones. La evaluación de los HAP´s se hace por
espectroscopía de fluorescencia, utilizando las siguientes longitudes de onda (Tabla 7) e
interpolando en una curva patrón.

Tabla 7. Longitudes de onda (λ) para determinar los HAP´s considerados en este
estudio (Livingstone y col., 1993)
Compuesto λ Excitación (nm) λ Emisión (nm)
naftaleno 273 360
pireno 341 380
benzo[a]pireno 380 430

6.1.5.3.2 HAP´s en aguas por extracción líquido-líquido

Utilizando un embudo de separación, se toma un volumen de agua y se adiciona

diclorometano. A continuación, se agita y se deja reposar hasta que se separen las fases.
Enseguida, la fase conteniendo el disolvente se filtra tres veces en lana de fibra de vidrio
y colectada en frascos color ámbar. El resto del procedimiento es igual que en el inciso
anterior.

6.1.5.3.3 HAP´s en tejidos

Los charales son pesados, homogeneizados y adicionados con diclorometano. Luego de

una agitación en vortex y centrifugación, la fase conteniendo al disolvente es separada,
filtrada tres veces con lana de fibra de vidrio y colectada en frascos color ámbar,
repitiendo los mismos pasos que en los dos incisos anteriores.

6.1.5.4 PCB´s en sedimentos, agua y tejidos (Vega-López y col., 2008)

6.1.5.4.1 PCB´s en sedimentos y aguas

La extracción se realiza de manera similar que en el caso de los HAP´s, con la diferencia
de que se utiliza metanol grado HPLC como disolvente. Posteriormente, la fase
31
conteniendo metanol es separada y filtrada 3 veces en lana de vidrio y colectada en
frascos color ámbar. En seguida, se realiza una extracción en fase sólida, haciendo pasar
el filtrado a través de un cartucho C-18 previamente activado. Los compuestos orgánicos
adsorbidos en la fase estacionaria son eluídos con metanol HPLC y colectados en frascos
color ámbar.

Finalmente, los PCB´s son determinados por CG, utilizando un detector de captura de
electrones, blancos de reactivos y estándares con las concentraciones apropiadas.
PCB´s en aguas, extracción líquido-líquido

Nuevamente, el procedimiento de extracción es muy similar a la efectuado con los

HAP´s, sólo que el disolvente utilizado es metanol grado HPLC. Con el filtrado
obtenido, se repiten los mismos pasos que en el inciso anterior.

6.1.5.4.2 PCB´s en tejidos

Al igual que en los dos incisos previos, para la extracción se procede como en el caso de
los HAP´s, pero utilizando metanol grado HPLC. Posteriormente, las proteínas
contenidas en el filtrado, son separadas por precipitación ácida, por la adición de H2SO4
al 0.2% y agitación en el vortex, seguida de centrifugación (modificado de Flanagan y
col., 2006) (Apéndice 1).

Una vez hecho lo anterior, el filtrado es analizado por CG bajo las mismas condiciones
que en el inciso anterior.

6.2 Determinaciones ambientales

(realizadas en campo)

En las muestras de agua y sedimento: pH (NMX-AA-008-SCFI-2000), temperatura

(NMX-AA-007-SCFI-2000) y potencial de óxidoreducción (NMX-AA-008-SCFI-2000).

En las estaciones de muestreo: transparencia por el disco de Secchi y profundidad.

32
 7. RESULTADOS

PRIMER MUESTREO (sequía fría)

7.1.1 Contenido de HAP´s en agua y sedimentos

El naftaleno fue el más abundante en agua y tuvo una distribución localizada en el

embarcadero al nivel superficial y al fondo de la isla, estación cercana al afluente de la
laguna (Fig. 13).

Fig. 13. Contenido de HAP´s en el agua colectada en las estaciones a diferentes

profundidades durante la sequía fría ( I-S: isla-superficie; I-Nc: isla-nivel de
compensación; I-F: isla-fondo; C-S: centro-superficie; C-Nc: centro-nivel de
compensación; C-F: centro-fondo; E-S: embarcadero-superficie; E-Nc: embarcadero-
nivel de compensación; E-F: embarcadero-fondo).

En los sedimentos, el embarcadero fue el sitio más contaminado (Fig. 14). Respecto a los
compuestos el más abundante también fue el naftaleno; sin embargo, el benzo[a]pireno
se detectó en todos los sitios a diferencia de los otros HAP’s.

33
 Fig. 14. Contenido de HAP´s evaluado en los sedimentos durante la sequía fría.

7.1.2 Contenido de HAP´s en hígado y vísceras de peces

En contraste con los compartimentos ambientales, en los peces se detectó pireno, pero
no naftaleno. La concentración de pireno tuvo una relación inversa con la talla de los
organismos, más que entre tejidos (Fig. 15). También se detectó benzo[a]pireno pero en
este caso si se observaron diferencias entre tejidos. Su concentración fue mayor en
vísceras y además presentó relación inversa con la talla (Fig. 16).

34
 d
g c
400
f j b
e a
i
g h
300 c d j
ug Pireno/ g tejido
h
i f
e b
200
a

100

0
II

II
I

III
-II
o-

a-
o-

a-

a-
do
ad

er
ad

er

er
sc
a
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 15. Contenido de pireno en el hígado y vísceras de los peces colectados.

Letras negras: diferencias significativas en los mismos órganos (p< 0.001) (b, d, e, g, h, i)
Letras en color: diferencias significativas entre distintos órganos (p< 0.001) (a, c, f, j)
12
*
10
*
ug Benzo-a-pireno/ g tejido

8
*
6
* *
4

2
*

0
I
I

-II

II
-II

-II
o-

a-

a-
do

ra
o

er
ad

er
ad
a

e
sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 16. Contenido de benzo[a]pireno en el hígado y vísceras de los peces colectados

durante la sequía fría. (*): no se encontró diferencia significativa (p= 0.158)
35
7.1.3 Factor de bioconcentración (FBC)

De los HAP’s en estudio, el pireno mostró un elevado factor de bioconcetración tanto en

vísceras como en hígado (Fig. 17).

Fig. 17. Factor de bioconcentración de los HAP´s en hígado y vísceras de los charales
colectados durante la sequía fría.

7.1.4 Biomarcadores de estrés oxidativo, radicales libres

El contenido de radicales libres presentó una diferencia entre los diferentes tejidos. El
peróxido de hidrógeno se detectó en todas las tallas, tanto en hígado como de vísceras
(Fig. 18). En el caso anión superoxido, su cantidad fue mayor en hígado y en vísceras fue
mínima (Fig. 19).

La concentración de formaldehido fue mayor en hígado que en vísceras (Fig. 20).

También se observó una relación inversa con la talla en el caso del órgano hepático.

36
 250

*
200

150
mM/ g tejido

100

50 * * * *
*
0
II

II
I

I
I

III

a-

-II
o-

o-

a-
o-

er

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ad

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ad

ad

ce
sc

sc
íg

íg

íg

Ví

s
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 18. Niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2) en el hígado y víscera de los charales
colectados durante la sequía fría. (*) no se encontró diferencia significativa (p= 0.326).

1800

1600
*
1400

1200

1000
mM/ g tejido

800

600

400 *
200
*
0 * * *
III
I

II

III

II
o-

a-
o-

a-

a-
o-

er
ad

er
ad

er
ad

sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 19. Niveles de superóxido (O2-) en el hígado y víscera de los charales colectados
durante la sequía fría. (*): no se encontró diferencia significativa (p= 0.012).
37
 400

300
mM formaldehído/ g tejido

200
b
a b
100

a
0
III

III
II
II

I
I

a-
o-

a-
o-

a-
o-

er
ad

er
ad

er
ad

sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 20. Niveles de formaldehído en el hígado y víscera de los charales colectados

durante la sequía fría. (a, b): diferencia significativa (p< 0.001).

7.1.5 Biomarcadores de daño

No se observaron diferencias significativas en la lipoperoxidación de ninguno de los

órganos bajo estudio (Fig. 21).

La cantidad de hidroperóxidos lipídicos, que es un estadio intermedio del daño, fue

mayor en el hígado que en vísceras y además se halló una relación inversa con la talla
(Fig. 22).

La oxidación de las proteínas estuvo más elevada en el hígado que en vísceras (Fig. 23).
En el caso del hígado hubo relación inversa con la talla de los organismos.

38
 100

80
*

60

mM/ g tejido
40

20

* * * * *
0

-I

II
-II
-I

III
I
-II

a-
ra
do

a-
do

do

er
e

er
a

sc

sc
a
íg

íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 21. Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s) en el hígado y víscera de

los charales colectados durante la sequía fría. (*) no se encontró diferencia significativa
(p= 0.472).

80

60
mM/ g tejido

40
b
a
20

a b
0
I

II

II
III

III
o-

a-
o-

-
o-

a-
ra
er
ad

ad

er
ad

ce
sc
íg

sc
íg

s
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 22. Hidroperóxidos lipídicos en el hígado y víscera de los charales colectados

durante la sequía fría. (a,b): diferencia significativa (p= 0.002).
39
 40
c
30
mM/ mg proteína/ g tejido

20
b
a
c
10
b
a
0
II
-II

I
-I

III
a-
-II

a-
do

a-
do

er
do

er

er
a

sc

sc
íg

a
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 23. Oxidación de proteínas en el hígado y víscera de los charales colectados durante
la sequía fría. (a,b,c) diferencia significativa(p< 0.001).

7.1.6 Biomarcadores de activación

No se observaron diferencias significativas entre las tallas ni tejidos en la actividad del

CYP2E1, pero en todos los casos hubo catálisis (Fig. 24).

En contraste con este citocromo, la actividad de la GSTT fue estadísticamente

significativa y mayor en el hígado que en vísceras (Fig. 25). También en el hígado hubo
una relación inversa con la talla.

40
 8

* *
6 *

mM/ g proteína/ g tejido

4

2 *
* *
0
II
I

II
-I
III

III
o-

o-

a-
a
o-

a-
er
ad

er
ad

er
ad

sc

sc
íg

íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 24. Actividad del CYP2E1 en el hígado y víscera de los charales colectados durante
la sequía fría. (*) no se encontró diferencia significativa (p= 0.214).
80
ug formaldehído/ min/ mg proteína/ g tejido

60

40
g
c g
b f e
20
e f
a d d
b c a
0
-II
II

I
-I

III
a-
-II
o-
o

a-
a
er
o
ad

er
ad

er
ad

sc

sc
íg

íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 25. Actividad de la GSTT en el hígado y víscera de los charales colectados durante la
sequía fría. (a,b,c,d,e,f,g): diferencia significativa (p< 0.001).

41
7.1.7. Análisis de componentes principales (ACP´s).

7.1.7.1 Biomarcadores vs. HAP´s. Hígado

La actividad de la GSTT y la oxidación de proteínas estuvieron relacionadas con el

benzo[a]pireno y con el pireno de manera directa. La lipoperoxidación y los
hidroperóxidos lipídicos y el contenido de formaldehido tuvieron relación inversa con
esos hidrocarburos (Fig. 26 y tabla 8).

0.50
Benzo[a]pireno
Pireno
0.40
GSTT
0.30

0.20
Oxidación
0.10 de
proteínas
H2O2
0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
HOOo0.20

-0.10 CYP 2E1 Formaldehído

O2-
Lipoperoxidación
-0.20

Fig. 26. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales

en el hígado del charal colectado durante la sequía fría. GSTT: glutatión S-transferasa
tetha; H2O2: peróxido de hidrógeno. HOOo: hidroperóxidos lipídicos; O2-: anión
superóxido.

42
 Tabla 8. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en hígado.

lipoperoxidación

benzo[a]pireno
Formaldehido

oxidación de
proteínas
CYP 2E1

pireno
HOOo
GSTT
H2O2

O2-

H2O2 1
O2- 0.150 1
formaldehído 0.381 0.921 1
CYP 2E1 0.343 0.447 0.543 1
GSTT 0.121 -0.099 -0.057 0.143 1
lipoperoxidación 0.332 0.919 0.927 0.487 -0.029 1
HOOo 0.389 0.917 0.952 0.588 0.003 0.940 1
oxidación 0.156 0.715 0.761 0.319 0.163 0.751 0.752 1
de proteínas
Pireno 0.208 0.132 0.272 0.268 0.278 0.114 0.354 0.395 1
benzo[a]pireno 0.031 0.213 0.252 -0.082 0.299 0.159 0.323 0.485 0.742 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.

7.1.7.2 Biomarcadores vs. HAP´s. Víscera

En víscera la concentración de benzo[a]pireno y pireno inducen la actividad del CYP2E1

y la producción del anión superóxido y de formaldehido, pero abaten la actividad de la
GSTT. Mientras mayor fue la cantidad de estos hidrocarburos, se redujo la oxidación de
proteínas, la lipoperoxidación y la concentración celular de peróxido de hidrógeno (Fig.
27 y tabla 9).

43
 0.40

Benzo[a]pireno
Oxidación 0.30
de Lipoperoxidación
proteínas O2-
0.20
Formaldehído
H2O2 0.10 Pireno

CYP 2E1
-0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0 0.10 0.20 0.30 0.40
-0.10

-0.20

-0.30 GSTT

-0.40

Fig. 27. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales

en víscera de charal colectado durante la sequía fría. H2O2: peróxido de hidrógeno; O2-:
anión superóxido. GSTT: glutatión S-transferasa tetha.

Tabla 9. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en víscera.

lipoperoxidación

benzo[a]pireno
Formaldehido

oxidación de
proteínas
CYP 2E1

pireno
HOOo
GSTT
H2O2

O2-

H2O2 1
O2- -0.075 1
formaldehído 0.036 -0.147 1
CYP 2E1 0.085 0.143 0.317 1
GSTT 0.055 -0.249 -0.326 -0.242 1
lipoperoxidación 0.717 0.078 0.339 0.052 -0.370 1
HOOo -0.017 -0.102 -0.043 -0.277 -0.226 0.090 1
oxidación -0.017 -0.102 -0.043 -0.277 -0.226 0.090 1.000 1
de proteínas
pireno -0.102 0.452 -0.019 -0.059 0.018 0.040 -0.251 -0.251 1
benzo[a]pireno -0.174 0.673 0.066 0.020 -0.131 0.112 0.082 0.082 0.633 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.

44
7.1.7.3 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Agua

En la sequía fría, la concentración de los hidrocarburos en agua se incrementó conforme

los pigmentos fotosintéticos, las feofitinas y la materia orgánica de partículas. Y
disminuyó con la cantidad de materia orgánica disuelta (Fig. 28 y tabla 10).

Benzo[a]pireno
1.00

0.80 Naftaleno

0.60

0.40

MOT 0.20

-1.00 -0.80 -0.60 -0.40 -0.20 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
-0.20
feofitina
-0.40 Clorofila a
Clorofila b
-0.60 MOP

-0.80
MOD
-1.00
Fig. 28. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en
agua. MOD: materia orgánica disuelta; MOT: materia orgánica total; MOP: materia
orgánica particulada.
Tabla 10. Matriz de correlaciones entre materia orgánica, pigmentos fotosintéticos e HAP´s, evaluados
en agua. MOT: materia orgánica total; MOD: materia orgánica disuelta; MOP: materia orgánica
particulada.
benzo[a]pireno

clorofila b
clorofila a
naftaleno

feofitina
MOD
MOT

MOP

MOT 1
MOD 0.405 1
MOP -0.926 -0.028 1
naftaleno -0.500 -0.994 0.135 1
benzo[a]pireno 0.069 -0.884 -0.441 0.830 1
clorofila a -0.979 -0.212 0.983 0.315 -0.268 1
clorofila b -0.961 -0.135 0.994 0.240 -0.343 0.997 1
feofitina -0.989 -0.266 nafta 0.367 -0.214 0.998 0.991 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.
45
7.1.7.4 Materia orgánica vs. HAP´s. Sedimento

Durante la sequía fría en sedimentos la concentración de pireno tuvo una relación

inversa con la materia orgánica (Fig. 29 y tabla 11).

0.80
MOP
0.60

0.40

0.20
Pireno
MOD
-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
-0.20

-0.40

-0.60
MOT
-0.80

Fig. 29. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en

sedimento. MOT: materia orgánica total; MOD: materia orgánica disuelta;
MOP: materia orgánica particulada.

Tabla 11. Matriz de correlaciones entre materia orgánica e HAP´s,

evaluados en sedimentos.
benzo[a]pireno
naftaleno

pireno
MOD
MOT

MOP

MOT 1
MOD 0.554 1
MOP -0.261 0.659 1
naftaleno -0.606 -0.998 -0.609 1
pireno -0.606 -0.998 -0.609 1.000 1
benzo[a]pireno -0.605 -0.998 -0.610 1.000 1.000 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.
MOT: materia orgánica total; MOD: materia orgánica disuelta; MOP: materia orgánica particulada.

46
 7.2 SEGUNDO MUESTREO (lluvias)

7.2.1. Contenido de HAP´s en agua y sedimentos

En contraste con la sequía fría, durante las lluvias la mayor concentración de HAP’s fue
de pireno y benzo[a]pireno. La estación más contaminada fue nuevamente el
embarcadero, particularmente la superficie (Fig. 30).

0.50
0.45
0.45
0.40
0.35
0.30
0.30
mg/ L

0.25
0.20
0.15
0.10
0.05 0.05
0.05 0.04 0.03 0.03 0.03 0.040.03 0.04 0.03 0.03 0.040.03
0.01 0.02 0.01
0.00
I-S I-Nc I-F C-S C-Nc C-F E-S E-Nc E-F

ESTACIÓN DE MUESTREO
Naftaleno Pireno Benzo[a]pireno

Fig. 30. Contenido de HAP´s en el agua colectada en las estaciones a diferentes

profundidades durante las lluvias ( I-S: isla-superficie; I-Nc: isla-nivel de compensación;
I-F: isla-fondo; C-S: centro-superficie; C-Nc: centro-nivel de compensación; C-F: centro-
fondo; E-S: embarcadero-superficie; E-Nc: embarcadero-nivel de compensación;
E-F: embarcadero-fondo).

En los sedimentos el benzo[a]pireno fue el más abundante y en sentido horizontal, el

embarcadero resultó ser la estación más contaminada (Fig. 31).

47
 600
553.07

500
mg/ kg peso seco

400

300

200

100

4.71 15.74 2.20 16.46 3.83

0
ISLA CENTRO EMBARCADERO

ESTACIÓN DE MUESTREO

Naftaleno Pireno Benzo[a]pireno

Fig. 31. Contenido de HAP´s evaluado en los sedimentos durante las lluvias.

7.2.2 Contenido de HAP´s en hígado y vísceras de peces

Aunque no hubo diferencia significativa sobre el contenido de pireno en el hígado ni en

víscera de los peces bajo estudio (Fig. 32) se observó una tendencia directa con la talla de
los organismos durante las lluvias y fue mayor su contenido en la viscera.

El contenido de benzo[a]pireno fue mayor en el hígado, particularmente en los peces de

talla intermedia. En el caso de las vísceras hubo una relación inversa con la talla de los
organismos; en (Fig. 33).

48
 3500

3000
*
2500

ug pireno/ g tejido
2000

1500

1000
*
500
* *
0 * *
III

III
II
II

I
I

a-
o-

a-
o-

-
o-

ra
er
ad

r
ad

ad

ce

ce
sc
íg

íg

íg

s
Ví

s
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 32. Contenido de pireno en el hígado y vísceras de los peces colectados durante las
lluvias. (*): no se encontró diferencia significativa (p= 0.145)

14000
a
12000

10000

8000
ug/ g tejido

6000

4000

2000 a
0
II

III

II
I

III
o-

a-
o-

a-
o-

a-
ad

er
ad

er
ad

er
sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 33. Contenido de benzo[a]pireno en el hígado y vísceras de los peces colectados

durante las lluvias. (a): diferencia significativa (p= 0.035)

49
7.2.3 Factor de bioconcentración (FBC)

Al igual que en la sequía fría, durante las lluvias los mayores factores de
bioconcentración se documentaron para el pireno seguido del benzo[a]pireno, pero la
magnitud disminuyó drásticamente comparativamente con el primer muestreo.
Tampoco en estas épocas se encontró naftaleno (Fig. 34).

350
Factor de Bioconcentración

309.132
300
250
(FBC)

200
150
100
50
0.000 0.000 2.468 0.000 9.334
0
Hígado Vísceras
TEJIDO ANALIZADO
Naftaleno Pireno Benzo[a]pireno
Fig. 34. Factor de bioconcentración de los HAP´s en hígado y vísceras de los charales
colectados.

7.2.4 Biomarcadores de estrés oxidativo, radicales libres

En contraste con la sequía fría, la concentración celular de peróxido de hidrógeno fue

substancialmente mayor en víscera que en hígado aunque no hubo relación aparente
con la talla del organismo (Fig. 35). En el hígado se observó una relación inversa con el
tamaño de los ejemplares.

A diferencia del peróxido de hidrógeno, la concentración del anión superóxido fue

mayor en hígado que en víscera (Fig. 36). En los peces de mayor talla su cantidad fue la
más elevada.

Otro de los radicales libres bajo estudio fue el formaldehido. Su concentración fue
mayor en el hígado que en vísceras (Fig. 37) pero no hubo una relación con la talla de los
peces. En contraste, en la víscera tuvo una relación inversa con el tamaño de los
especímenes.

50
 5000
c
b
4000 a
d e
3000
mM/ g tejido

2000
e
1000 d
c a b
0

III
II
II

-I
I

II
o-

a-
o-

ra

a-
o-
ad

er
ad

ce

er
ad
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 35. Niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2) en el hígado y víscera de los charales
colectados durante las lluvias. (a,b,c,d,e): diferencia significativa (p< 0.001).

50000

c f
40000
b e
a d
30000
mM/ g tejido

20000

f
10000 e d
0
c b a
II

III

II
I

III
o-

a-
o-

a-
o-

a-
ad

er
ad

er
ad

er
sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 36. Niveles de superóxido (O2-) en el hígado y víscera de los charales colectados
durante las lluvias. (a,b,c,d,e,f): diferencia significativa (p< 0.001).

51
 180 b
a
160

140
mM formaldehído/ g tejido
120

100

80

60 c
40
c
20 a b
0
I

III
II
II

-I
-I

-II

a-
o-

ra
do

a-
do

er
ad

ce

er
a

a
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 37. Niveles de formaldehído en el hígado y víscera de los charales colectados

durante las lluvias. (a, b,c): diferencia significativa (p< 0.001).

7.2.5 Biomarcadores de daño

Como sucedió durante la sequía fría, en las lluvias no hubo diferencias significativas en
los niveles de lipoperoxidación. Sin embargo, fue mayor en hígado que en víscera (Fig.
38).

Los hidroperóxidos lipídicos fueron más elevados en el hígado de los peces más
pequeños que en víscera (Fig. 39). En éstas, los daños tuvieron una relación inversa con
la talla de los peces.

La oxidación de proteínas fue más alta en víscera que en hígado y además tuvo una
relación inversa con el tamaño de los especímenes. En hígado, el daño fue significativo
sólo en los peces de talla mayor (Fig. 40).

52
 8

7 *
6

mM/ g tejido
4 * *
3
* *
2 *
1

0
III

III
II

-II
I

I
o-

a-
o-

a-
o-

ra
er
ad

ad

er
ad

ce
sc
íg

íg

sc
íg

s
Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 38. Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR´s) en el hígado y víscera de

los charales colectados. (*) no se encontró diferencia significativa (p= 0.020).

1.8

1.6

1.4
c
1.2
b
1.0 a
mM/ g tejido

0.8

0.6
c
0.4
b a
0.2

0.0
III

I
II

II
I

-I

-II
o-

o-

a-
ra
o-

ra
ad

er
ad

ce
ad

ce
íg

sc
íg

s
íg

Ví

s
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 39. Hidroperóxidos lipídicos en el hígado y víscera de los charales colectados.

(a,b,c): diferencia significativa (p< 0.001).

53
 5
b
4
a
mM/ mg proteína/ g tejido

2
b
1
a
0
I

III
II

II
I

I
-II
o-

a-
o-

a-

a-
do

er
ad

er
ad

er
sc
a
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 40. Oxidación de proteínas en el hígado y víscera de los charales colectados.

(a,b) diferencia significativa(p< 0.001).

7.2.6 Biomarcadores de activación

La actividad del CYP 2E1 evaluada en la víscera de los peces superó por mucho a la
hallada en el hígado, donde fue cercana a cero (Fig. 41)

No se encontraron diferencias significativas de la actividad de la GSTT en los órganos de

los peces (Fig. 42).

54
 60 e
50
c d
b
mM/ g proteína/ g tejido
40 a
30
g
20
g
10 e f d
b c a
0

III
-I

-II

II
-II

a-

a-
do

a-
do

do

er

er

er
a

sc
a
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 41. Actividad del CYP2E1 en el hígado y víscera de los charales colectados durante
las lluvias. (a,b,c,d,e,f,g): diferencia significativa (p< 0.001).

2.5

*
g formaldehído/ min/ mg proteína/ g tejido

2.0

1.5

1.0 *
0.5 *
* *
0.0 *
III

III
II
-II

I
I

a-
o-

a-

a-
o-
o

er
ad

er
ad

er
ad

sc
íg

sc
íg

sc
íg

Ví
H

Ví
H

Ví
H

Fig. 42. Actividad de la GSTT en el hígado y víscera de los charales colectados durante
las lluvias. (*): no se encontró diferencia significativa (p= 0.008).
55
7.2.7 Análisis de componentes principales (ACP´s).

7.2.7.1Biomarcadores vs. HAP´s. Hígado

En el hígado, se encontraron elevados niveles de correlación (mayores a 0.9) entre la

concentración de piero y benzo[a] y los biomarcadores de estrés oxidativo (anión
superóxido y formol), entre los biomarcadores de daño (lipoperoxidación e
hidroperóxidos lipídicos) y entre estos dos grupos (producción del anión superóxido y
formaldehído con los niveles de lipoperoxidación e hidroperóxidos lipídicos) (Fig. 26 y
Tabla 8).

O2- 0.60

0.40 Pireno

0.20

Formaldehído
1
3 4 2
-0.10 -0.05 0 0.05 0.10 5 0.20 0.25

-0.20 Oxidación
de
proteínas
-0.40
H2O2
-0.60

Fig. 43. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en

hígado del charal colectado durante las lluvias. H2O2: peróxido de hidrógeno; O2-: anión
superóxido; 1: lipoperoxidación. 2: benzo[a]pireno; 3: hidroperóxidos lipídicos; 4: CYP
2E1; 5: GSTT

7.2.7.2 Biomarcadores vs. HAP´s. Víscera

En las vísceras, en cambio, sólo se encontró una correlación importante (1.0) entre los
niveles de hidroperóxidos lipídicos y la oxidación de proteínas (Fig. y Tabla 9).

56
Tabla 12. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en hígado.

lipoperoxidación

benzo[a]pireno
Formaldehido

oxidación de
proteínas
CYP 2E1

pireno
HOOo
GSTT
H2O2

O2-
H2O2 1
O2- -0.374 1
formaldehído -0.332 -0.086 1
CYP 2E1 0.104 0.024 0.637 1
GSTT -0.205 -0.202 0.621 0.342 1
lipoperoxidación -0.303 -0.050 0.742 0.450 0.583 1
HOOo -0.043 -0.281 0.631 0.431 0.196 0.451 1
oxidación -0.154 -0.306 0.581 0.498 0.432 0.429 0.403 1
de proteínas
pireno -0.290 0.267 0.504 0.245 0.095 0.112 0.465 0.203 1
benzo[a]pireno -0.364 -0.235 0.901 0.489 0.771 0.669 0.604 0.661 0.399 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.

Tabla 13. Matriz de correlaciones entre biomarcadores e HAP´s, evaluados en víscera.

lipoperoxidación

benzo[a]pireno
formaldehído

oxidación de
proteínas
CYP 2E1

pireno
HOOo
GSTT
H2O2

H2O2 1
formaldehído -0.162 1
CYP 2E1 0.081 -0.182 1
GSTT 0.314 -0.352 0.602 1
lipoperoxidación 0.409 -0.067 0.390 0.459 1
HOOo 0.140 0.085 0.247 0.138 -0.045 1
oxidación
0.109 -0.176 0.823 0.655 0.264 0.049 1
de proteínas
pireno 0.300 -0.387 0.456 0.364 0.027 0.212 0.400 1
benzo[a]pireno 0.027 -0.195 0.961 0.488 0.341 0.302 0.677 0.537 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.

57
 0.60 H2O2

0.50

0.40 Lipoperoxidación

0.30

0.20 GSTT
0.10
Pireno

-0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

-0.10
Oxidación de proteínas
-0.20
CYP 2E1
HOOo Benzo[a]pireno
Formaldehído -0.30

-0.40

Fig. 44. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales

en víscera. H2O2: peróxido de hidrógeno; GSTT: glutatión S-transferasa tetha
HOOo: hidroperóxidos lipídicos.

7.2.7.3 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Agua

En las muestras de agua, se encontraron altas correlaciones (mayores a 0.9) entre la

cantidad de pigmentos fotosintéticos (clorofilas a y b, feofitina) y HAP´s con la materia
orgánica total, y entre los HAP´s (pireno y benzo[a]pireno) (Fig. 45 y Tabla 14).

7.2.7.4 Materia orgánica, clorofilas y feofitina vs. HAP´s. Sedimentos

En los sedimentos, se hallaron correlaciones importantes (mayores a 0.9) entre la

cantidad de HAP´s (pireno y benzo[a]pireno) y la cantidad de materia orgánica disuelta
(Fig. 46 y Tabla 15).

58
 MOD 0.80

0.70
0.60

0.50

0.40
MOP
0.30

0.20
Clorofila b
0.10 feofitina
Clorofila a
-0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16
-0.10 pireno
-0.20 MOT

-0.30

Fig. 45. Gráfico bidimensional de puntuaciones sobre los componentes principales en

agua durante las lluvias. MOD: materia orgánica disuelta; MOP: materia orgánica
particulada. MOT: materia orgánica total.

Tabla 14. Matriz de correlaciones entre materia orgánica, pigmentos

fotosintéticos e HAP´s, evaluados en agua.

benzo[a]pireno
clorofila b
clorofila a

feofitina

pireno
MOD
MOT

MOP

MOT 1
MOD -0.414 1
MOP 0.729 0.321 1
clorofila a 0.963 -0.154 0.886 1
clorofila b 0.911 -0.001 0.947 0.988 1
feofitina 0.957 -0.133 0.896 1.000 0.991 1
pireno 0.995 -0.325 0.791 0.985 0.946 0.981 1
benzo[a]pireno 0.995 -0.325 0.791 0.985 0.946 0.980 1.000 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.

59
 1.00

MOP 0.80

0.60
Benzo[a]pireno
0.40 Pireno

0.20 MOD

-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

-0.20

-0.40
MOT

-0.60

Fig. 46. Gráfico bidimensional de componentes principales en sedimento.

MOP: materia orgánica particulada; MOD: materia orgánica disuelta
MOT: materia orgánica total.

Tabla 15. Matriz de correlaciones entre materia orgánica e HAP´s,

evaluados en sedimentos.
benzo[a]pireno
pireno
MOD
MOT

MOP

MOT 1
MOD 0.864 1
MOP -0.950 -0.663 1
pireno 0.782 0.989 -0.547 1
benzo[a]pireno 0.707 0.967 -0.450 0.994 1
Nota: las variables con correlación más alta entre aparecen resaltadas.
MOT: materia orgánica total; MOD: materia orgánica disuelta;
MOP: materia orgánica particulada.

60
 8. DISCUSIÓN

Los estudios toxicológicos relacionados con el estrés oxidativo y la biactivación de

compuestos orgánicos en peces son importantes por varias razones. Por ejemplo,
algunos trabajos indican que los sistemas enzimáticos de detoxificación de los
organismos terrestres, evolucionaron partir de los existentes en los organismos acuáticos
como una adaptación a las condiciones de una atmósfera rica en oxígeno (Alvares y
Pratt, 1990).

Además, pueden proporcionar información valiosa sobre diferencias en la

biotransformación de xenobióticos entre organismos acuáticos y especies roedoras, las
cuales comparten un mayor número de características con el hombre. Por ejemplo, de
manera general, se acepta que la capacidad de detoxificación de los peces es menor
comparada con la de los mamíferos. Sin embargo, en estudios realizados in vitro en
microsomas hepáticos del lenguado y rata con benzo[a]pireno, se encontró que la
cantidad del metabolito benzo[a]pireno-7,8-diol producido fue mayor en los peces que
en la rata (Varanasi y col., 1986).

Aunque se ha visto que los peces pueden realizar algunas reacciones de

biotransformación observadas en los mamíferos, existen diferencias en la velocidad a
cual se llevan a cabo, la importancia de las vías utilizadas y los productos formados
(Kleinow y col., 1987).

Por otra parte, los resultados sobre la capacidad de biotransformación de peces

obtenidos en especies individuales, pueden ser comparados para tratar de hallar
tendencias generales. Por ejemplo, al exponer microsomas de varias especies de peces a
HAP´s (benzo[a]pireno), se encontró que en los teleósteos (peces óseos) se producía
mayor número de metabolitos con anillos con grupos dioles (Stegeman y Woodin, 1980)
mientras en otros, como en la raya (Leucornia erinacea) se generaban más compuestos
fenólicos (Bend y col., 1979).

8.1 Niveles de HAP´s en el agua, sedimento y órganos (hígado y vísceras)

En los muestreos realizados en agua en las dos épocas del año (sequía fría y lluvias) la
estación más contaminada con HAP´s fue el embarcadero (nivel de superficie). En la
temporada de sequía fría en esta estación predominó el naftaleno, seguido del
benzo[a]pireno y pireno. En cambio, durante la época de lluvias, los mayores niveles de
HAP´s correspondieron al benzo[a]pireno y pireno, siendo detectados en todas las
estaciones (embarcadero, centro e isla) en los tres niveles de profundidad (superficie,
nivel de compensación y fondo), aunque con una diferencia de hasta tres órdenes de
magnitud en comparación con la temporada anterior.

61
Las diferencias en los niveles de HAP´s en la columna de agua, pueden ser causados por
diferencias en el tamaño de la molécula, a mayor peso molecular, menor solubilidad en
el agua, por su coeficiente de partición octanol-agua, por su grado de adsorción a la
materia orgánica, por la degradación microbiana, por la luz ó la temperatura (USEPA,
2003).

El hecho de que la mayor cantidad de estos compuestos fueran encontrados en el

embarcadero, demuestra que el impacto de las actividades antropogénicas, tales como el
derrame de combustible y el uso de lubricantes utilizados por los motores de las
embarcaciones, es determinante en las concentraciones de HAP´s de este cuerpo de
agua.

Por otra parte, la disminución en los niveles de los HAP´s más abundantes en la época
de lluvias en comparación con la sequía fría y su presencia en todas las estaciones de
muestreo, podría explicarse por el incremento en los aportes de agua del exterior a la
laguna. Ya sea por las precipitaciones ó a través de los ríos que desembocan en ella,
generando turbulencias, reduciendo de esta manera las concentraciones de HAP´s en el
agua y distribuyéndolos más uniforme a través de la laguna. Otro factor que podría
contribuir a la mezcla de estos compuestos, sería que al ser un ambiente acuático somero
(su profundidad promedio es menor a 6 m), se dificultaría su estratificación,
permitiendo la combinación de las masas de agua en la laguna; sin embargo, en el caso
de la Laguna de Zumpango se detectó un gradiente de temperaturas de hasta 9º C en la
sequía fría y de 5º C durante las lluvias entre las aguas superficiales y las profundas.

Durante la temporada de sequía fría, los niveles promedio de naftaleno evaluados en las
muestras de agua (59.62 mg/L) fueron muy similares a los obtenidos en muestreos
previos por Ortíz-Cornejo (2008) para este cuerpo de agua con 62.8 mg/L.

En el caso de los niveles de HAP´s en sedimentos, los resultados obtenidos mostraron

similitudes con los observados en la columna de agua. Por ejemplo, las mayores
concentraciones de estos compuestos fueron encontrados en el embarcadero en ambos
periodos de muestreo. Durante la sequía fría el principal contaminante detectado fue el
naftaleno, siendo reemplazado en magnitud por el benzo[a]pireno en la temporada de
lluvias. Además, en ambas temporadas del año, el HAP más abundante fue el
benzo[a]pireno que se halló presente en las tres estaciones de muestreo. Sin embargo,
durante el periodo de lluvias, en todas las estaciones se detectó pireno en los sedimentos
además del BaP.

La distribución más uniforme de los HAP´s durante la temporada de lluvias en los

sedimentos, podría ser explicada por un aumento en el acarreo de materiales con carga
eléctrica, de los ríos hacia la laguna, tales como las arcillas, sobre las cuales podrían ser
adsorbidos los HAP´s (Manahan, 2003) y transportados de esta manera por las
corrientes ó las turbulencias generadas por las precipitaciones, asociándose en
62
conglomerados, aumentando así su peso y finalmente precipitándose hacia el fondo de
este cuerpo de agua.

Por otro lado, los altos niveles de HAP´s en agua y sedimento observados durante la
sequía fría, podría estar relacionada con una disminución en su degradación por
factores abióticos, tales como la luz ultravioleta (fotólisis) ó la temperatura (USEPA,
2003) ya que en esta época del año es menor irradiación solar. Por un lado, el transporte
sucede por vía detritófaga ya que en la base de la pirámide alimenticia del charal, se
encuentras organismos que están en contacto con los sedimentos (Figueroa-Lucero y
col., 2003). Pero tampoco se puede descartar la influencia de los productores primarios y
de los fitoplanctívoros como transportadores de HAP.

En el caso de los órganos bajo estudio se observó un comportamiento diferenciado entre

las dos épocas del año. En la sequía fría, los niveles de pireno fueron similares en ambos
órganos, aunque tuvo relación inversa con el tamaño de los peces. Este fenómeno se
debe posiblemente a que los sistemas enzimáticos de biotransformación se hallan menos
desarrollados en los organismos más jóvenes como es considerado para la mayoría de
los organismos (Repetto, 1997).

8.2 Factor de bioconcentración (FBC)

En ambos periodos de muestreo, los PAH´s más abundantes en el hígado y vísceras

fueron el pireno, seguido del benzo[a]pireno. Sin embargo, a diferencia de la temporada
de sequía fría, en la época de secas únicamente se detectaron los dos compuestos en la
víscera de los peces. Las diferencias en los niveles de ambos PAH´s en estos órganos
pueden reflejar su composición diferencial (p. ej. contenido de lípidos) y por la
capacidad de detoxificación. La primera de estas propiedades está relacionada con el
grado de afinidad de los HAP´s por los tejidos. En el segundo caso, entre mayor sea la
capacidad de detoxificación del compuesto, su eliminación del organismo será más
rápida y su acumulación se reducirá.

Por otro lado, durante la época de sequía fría se obtuvieron FBC´s para el pireno en
hígado y víscera mayores a 2,000 y 2,500, respectivamente, por lo que este HAP cae
dentro de la categoría de los contaminantes orgánicos persistentes propuesta por la EPA
(substancias con un FBC mayor a 1,000). Además, ya que este hidrocarburo posee un log
Kow de 5.18, también cumple con los criterio del PNUMA (log Kow> 4.0) para ser
incluido en la Lista de Contaminantes Orgánicos Persistentes del Convenio de
Estocolmo y por sus niveles de bioacumulación, puede ser altamente tóxico para el
ambiente (ecotóxico) (Cram y col., 2004).

No detectaron PCB en la columna de agua y estos resultados concuerdan con estudios

previos donde tampoco se encontraron estos xenobióticos en la Laguna de Zumpango
63
(Vega-López y col., 2009). Estos hallazgos denotan que la inducción de radicales libres y
el estrés oxidativo observados en ambos muestreos se deben a otros compuestos como
los HAP’s entre otros. En el caso de mezclas de xenobióticos, la presencia de un
componente puede influenciar la toxicidad causada por otro, al inducir ó inhibir su
biotransformación. En particular, la actividad de las monooxigenasas hepáticas
microsomales puede alterarse debido a contaminantes ambientales, tales como los PCB´s
y HAP´s (Kleinow y col., 1987).

8.3 Biomarcadores

En los dos periodos evaluados, los niveles de formaldehído e hidroperóxidos lipídicos

observados en el hígado fueron mayores a los obtenidos en las vísceras, principalmente
en los peces de talla pequeña.

Respecto a la generación de radicales libres, los mayores niveles de H2O2 se encontraron

en charales de talla intermedia particularmente en el intestino, lo que denota
nuevamente la importancia de la vía trófica. En este caso también está implicada en la
generación de estas especies reactivas del oxígeno. El desacoplamiento del flujo
electrónico durante los procesos redox de las enzimas del citocromo P 450 y de los
xenobióticos es responsable de la generación de ROS (Schlezinger y col., 1999).

En el presente trabajo se observó la presencia de formaldehído en los peces,

particularmente en el hígado de los peces durante la sequía fría y las lluvias se
encontraron diferencias significativas entre órganos y entre tallas, presentándose los
valores mayores en el hígado de los charales de talla media a pequeña. En mamíferos se
ha reportado que el CYP2E1 produce metabolitos pro-carcinógenos (Schlezinger y col.,
1999; Moreno Grau, 2003). La GSTT genera metabolitos intermedios como el S-
clorometil glutatión, que es conjugado por la beta-liasa y cuyo resultado son tiocetonas y
iones episulfonio, especies muy electrofílicas capaces de reaccionar con diferentes
biomoléculas como el DNA, además de su metabolito final que es el formaldehido
(Flanagan y col., 1990; Dekant y Vamvakas, 1993; Green, 1997; Landi y col., 1999). Los
resultados del presente trabajo indican que existen inductores de estas enzimas en la
Laguna de Zumpango como pueden ser los halometanos y los HAP’s.

En la temporada de sequía fría, la relación entre los biomarcadores de estrés oxidativo

(formaldehído y anión superóxido) y los de daño (lipoperoxidación e hidroperóxidos
lipídicos) fue más evidente en el hígado de los peces. Ya que no se encontraron
diferencias significativas entre los niveles del CYP 2E1 en los dos órganos evaluados, y
se sabe que el desacoplamiento del flujo electrónico durante los procesos redox de las
enzimas del CYP 450 es responsable de la generación de especies reactivas de oxígeno
(Vega-López y col., 2009). Los niveles del anión superóxido observados podrían ser
generados por otras isoformas del CYP 450 distintas al CYP 2E1 como el CYP 1A1 o el
64
CYP 1A2. En el caso del formaldehído, este compuesto es probable se forme a partir de
los productos generados a consecuencia del proceso de peroxidación de lípidos (Buege y
Aust, 1978), por la oxidación de compuestos por los microsomas hepáticos (Cederbaum
y Cohen, 1980) ó durante la conjugación de compuestos clorados con el glutatión
(Moreno-Grau, 2003).

De manera similar, en la época de lluvias, no se observaron diferencias significativas

entre la actividad de la GSTT en el hígado y víscera de los peces, por lo que en la
conjugación de los metabolitos de los HAP´s podrían estar implicadas otras vías. En
particular, en el pez sol (Solea solea) expuesto a fenantreno y el lenguado (Parophrys
vetulus) se ha documentado la glucorinización como principal vía de conjugación
(Nishimoto y col., 1992; Hillenweck y col., 2008). Sin embargo, en esta última especie se
menciona la conjugación con GSH como la segunda vía más importante, y no ocurre la
conjugación con sulfato.

Algunos de los factores que pueden influir en la respuesta tóxica de los organismos
acuáticos, son la especie bajo estudio, el tiempo de exposición y el tipo de xenobiótico.
En particular, la lipoperoxidación en el hígado de los charales en las dos épocas del año,
fue aproximadamente 18 veces menor que lo observado en el hígado de la carpa común
(Cyprinus Carpio) colectada en este mismo cuerpo de agua (Ortíz-Cornejo, 2008) lo cual
indicaría que Chirostoma riojai es una especie capaz de compensar el daño oxidativo a
través de diferentes rutas. Por otra parte, en una exposición a corto plazo se observó en
el mezclapique amarillo (Girardinichthys viviparus) expuesto a agua de la Laguna de
Zumpango, que la lipoperoxidación presentó una respuesta dependiente del sexo de los
animales. En machos se incrementó hasta 148 veces con respecto a los controles y en
hembras, la respuesta fue irregular (Vega-López y col., 2008). Estos resultados indican la
importancia de los fenómenos de adaptación y tolerancia desarrollados por el charal de
Santiago, más no implica que estos fenómenos puedan mantenerse indefinidamente.

En el intestino los hidroperoxidos lipídicos y la lipoperoxidación tuvieron relaciones

significativas con los niveles de H2O2 (p<0.001 y p<0.05, respectivamente), pero no hubo
diferencias entre tallas. La ausencia de diferencias entre las tallas indica que el grado de
desarrollo de los peces no es un factor determinante en la susceptibilidad para que
sucedan estos daños. Esta respuesta sugiere que el estrés oxidativo se detiene en etapas
tempranas de las reacciones en cadena. Hermes-Lima (2004) reporta que las reacciones
en cadena pueden detenerse a través de polimeración entre radicales libres como los
hidroperóxidos o a través de captadores o defensas inespecíficas como varias vitaminas
o el glutatión. Probablemente estos mecanismos fueron responsables de minimizar el
daño sobre los fosfolípidos de membrana. Sin embargo, destaca la necesidad de otros
estudios para demostrar su participación en el charal de Santiago.

Respecto a la participación de los HAP’s en el estrés oxidativo, en este estudio se

demostró que en hígado, los hidroperoxidos lipídicos y la lipoperoxidación además de
65
la oxidación de proteínas tuvieron una relación significativa con los niveles de pireno
(p<0.001) y de BaP (p<0.05). Estos resultados muestran que el daño oxidativo hepático
está asociado con el metabolismo realizado por las enzimas de la función oxidasa,
específicamente las isoenzimas del citocromo P450 (Di Giulio y col., 1989). Basta
mencionar que los patrones de respuesta del daño oxidativo entre los peces de la misma
clase fueron similares a las enzimas que bioactivan a los COH (CYP2E1 y GSTT) aunque
las relaciones no fueron significativas. Esto probablemente indica que la GSTT no
desempeña un papel fundamental en la conjugación de los metabolitos de los COH.

Probablemente los metabolitos de los COH en esta especie se conjugan por otras vías de
conjugación. En el pez sol (Solea solea) expuesto a fenantreno y en el lenguado (Parophrys
vetulus) se documento la glucorinación como vía principal de conjugación (van der Oost
y col., 2003; Hillenweck y col., 2008). Sin embargo, en esta última especie se menciona la
conjugación con GSH como la segunda vía más importante y no ocurre la
sulfuconjugación.

No existe información disponible sobre la toxicidad de estos compuestos en

Atheriniformes por lo que sobresale la necesidad de continuar estudiando al respecto.

9. CONCLUSIONES

Gracias a los hallazgos del presente estudio es posible concluir que la relación entre los
niveles de H2O2 producidos y el grado de daño oxidativo son producidos por la
biotransformación de los HAP’s hacia metabolitos más tóxicos, particularmente a través
del CYP2E1. Además en los charales de la Laguna de Zumpango prevalece un daño
temprano previo a la destrucción de la membrana y que depende del órgano de los
peces expuestos.
Hacen falta otros estudios como son los reproductivos o demográficos para determinar
el riesgo del charal de Santiago (Chirostoma riojai) habitante de la Laguna de Zumpango.

66
 10. LITERATURA CITADA

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