Nombre de la práctica COLORIMETRÍA Y DET.

DE LACTATO DESHIDROGENASA Fecha: Semana 4

de laboratorio
Lugar LABORATÓRIO MULTIFUNCIÓN 1

Duración 90 MINUTOS Horario VIERNES

Curso BIOQUÍMICA Grupo 1 Nº de estudiantes 30

Docente/s INDIRA LENGUA UNIDAD

CLEVER ARIAS CURRICULAR COLORIMETRÍA
1
I. OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
 Conocer los principios básicos del método para determinar la concentración de sustancias empleando colorimetría.
 Elaborar una curva de absorción y una curva de calibración y establecer sus diferencias.
 Determinar la concentración de una solución problema empleando el factor de calibración y la curva de calibración.
 Determinar la actividad enzimática de la Láctico Deshidrogenasa en suero.
 Interpretar el significado de la elevación de la Láctico Deshidrogenasa en suero.
II. DESCRIPCIÓN
Actividades/estación n.º 1
Descripción de las Realizar la búsqueda de información acerca de los principios básicos de la colorimetría, método de
actividades determinación de la actividad enzimática de la Láctico Deshidrogenasa y responder los enunciados.
Duración de las actividades 20 minutos
(minutos)
Objetivo Conocer los principios básicos del método para determinar la concentración de sustancias empleando
colorimetría.

Orientación Con la ayuda de los libros y Ipad responder las siguientes preguntas:
1. Defina que es Transmitancia y su relación con la absorbancia.
2. Empleando la Ley de Lambert y Beer, calcular la concentración de una muestra de flavin
mononucleotido (FMN), si su coeficiente de extinción molar es 11.34 mM -1 cm-1 y su D.O. medida es
de 0.44 a una longitud de onda de 450nm. El equipo utiliza cubetas de 1cm.
 3. Mencione tres aplicaciones prácticas del método colorimétrico.
4. Explicar el método de determinación de lactato deshidrogenasa.
5. Interpretar el significado de la elevación de la Láctico Deshidrogenasa en suero.
Materiales necesarios Libro para consulta (o iPAD)
Referencias bibliográficas  Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.; De La Fuente García-Soto, M.M.; Pozas Requejo, F.;
Díaz Lorente, V.M. Experimentación en Química General. Capítulo 5. Ed. Thomson Paraninfo,
2006.
 Hernández-Hernández, L.; González-Pérez, C. Introducción al análisis instrumental. Capítulo 3.
Ed. Ariel Ciencia, 2002.

Actividades/estación 2
n.º
Descripción de las Preparación de una Curva de Absorción
actividades

Duración de las 20 minutos

actividades (minutos)
Objetivo  Elaborar una curva de absorción
Orientación Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente sistema:

 Solución de azul de metileno (10 mg/dL) 1 mL.

 Agua destilada 4 mL
 Luego se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda:
560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
 Graficar utilizando papel milimetrado las densidades ópticas en función de las longitudes de onda y
determinar el pico de máxima absorción del azul de metileno, el cual corresponde al mayor valor
de la densidad óptica.
Materiales necesarios
Materiales:

 36 tubos de ensayo
 6 vasos de 100 ml
 6 juegos pipetas de 1 y 5ml.
 Cubetas para espectrofotómetro
 Gradilla para tubos de ensayo
 Papel parafilm
 Guantes
 Rotulador
 Tijeras
Reactivos:

 Solución de azul de metileno (10mg/dL)

 NaOH 0.5 N
 Agua destilada
Equipos:

 Espectrofotómetro

Referencias  Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed. Reverté, 2007.
bibliográficas
 Higson, S. P. J. Química Analítica. 1ª ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007.
Actividades/estación 3
n.º
Descripción de las PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN
actividades
Duración de las 20 minutos
actividades (minutos)
Objetivo  Elaborar una curva de calibración

Orientación
El experimento consiste en preparar tubos de concentración creciente de un colorante y leerlos al
fotocolorímetro o al espectrofotómetro, llevando a cero (0) el aparato con agua destilada.
Elaborar una gráfica utilizando papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o
papel semilogarítmicos para las lecturas hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al
espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO como en % de
transmitancia.
Preparar el siguiente experimento:

Tubo Nº
1 2 3 4 5
Reactivos

Azul de metileno 10 mg/dL (mL) 0.5 1 2 3 4

Agua destilada (mL) 4.5 4 3 2 1

 Con agua destilada llevar el espectrofotómetro a una D.O. de cero.

 Luego leer los 5 tubos a una longitud de onda de 660 nm.
 Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el eje de
 abscisas y las densidades ópticas (DO) en el eje de ordenadas, luego trazar una recta a través de
los puntos obtenidos experimentalmente.
Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración determinar la concentración de la sustancia
problema que recibirán en la presente práctica.
Materiales necesarios
Materiales:

 36 tubos de ensayo
 6 vasos de 100 ml
 6 juegos pipetas de 1 y 5ml.
 Cubetas para espectrofotómetro
 Gradilla para tubos de ensayo
 Papel parafilm
 Guantes
 Rotulador
 Tijeras
Reactivos:

 Solución de azul de metileno (10mg/dL)

 NaOH 0.5 N
 Agua destilada
Equipos:

 Espectrofotómetro

Referencias  Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed. Reverté, 2007.
bibliográficas
 Higson, S. P. J. Química Analítica. 1ª ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007.
Actividades/estación 4
n.º
Descripción de las Determinar la actividad enzimática de la Láctico Deshidrogenasa en suero y cálculo de los resultados.
actividades
Duración de las 20 minutos
actividades (minutos)
Objetivo Determinar la actividad enzimática de la Láctico Deshidrogenasa en suero.

Orientación En una cubeta de cuarzo mantenida a la temperatura de trabajo de 30-37°C colocar:

- Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro.

- Esperar 30 segundos.
- Leer la Absorbancia inicial y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura a 340 nm.
- Determinar la diferencia promedio de Absorbancia/min (ΔAbs / min), restando cada lectura de la
anterior y promediando los valores.
- Utilizar este promedio para los cálculos.
Materiales necesarios A. REACTIVO PROVISTO:
- Solución de buffer Tris, pH 7,2 conteniendo Piruvato y cloruro de sodio.
- Solución conteniendo NADH.
B. PRECAUCIONES:
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

C. MUESTRA:
Se debe obtener suero de la manera usual libre de hemólisis y separar del coágulo dentro de las dos horas
de su obtención. También puede usarse plasma.

D. MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO:

- Espectrofotómetro.
- Micropipetas.
- Pipetas capaces de medir los volúmenes.
- Tubos de ensayo.
- Cubetas espectrofotométricas.
- Reloj.
- Baño de agua a temperatura indicada en el procedimiento.

Referencias  Tietz, N.W. (ed) Fundamentals of Clinical Chemistry W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976.
bibliográficas
 Gay, R.J., Mc Comb, R.B., and Bowers, G.H. Jr. Clin Chem 14, (740) 1978.
 Young D.S., effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press, 1995.