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Espectroscopia de
absorción molecular
EDWIN BALDEÓN CH.
MAESTRIA EN TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
UNALM
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INTRODUCCIÓN

Principios básicos de la espectroscopia

De los espectros que

Espectroscopia derivado de la
interacción de la
Producción radiación
Registro electromagnética
Interpretación con la materia.
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INTRODUCCIÓN

La Luz

Ondulatoria Corpuscular

Interferencia, difracción y refracción Absorción y emisión

 INTRODUCCIÓN

RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

 La radiación electromagnética es un tipo de energía

 Tiene un componente eléctrico y un componente
magnético
 Adopta muchas formas: luz visible, calor radiante, rayos x,
luz ultravioleta, microondas y las ondas de radio
 Es un flujo de partículas de energía llamadas fotones =
corriente de paquetes energéticos que se mueven en la
forma ondulatoria
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INTRODUCCIÓN

Las propiedades ondulatorias de REM

La frecuencia.- El número de oscilaciones que, en un punto
dado, experimentará la onda en el transcurso de un
segundo.
La longitud de onda.- Representa la distancia entre dos
máximos sucesivos, para cualquier onda dada.
La amplitud propias de la onda
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INTRODUCCIÓN

 Los estados de energía de la materia

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INTRODUCCIÓN

 Energía interna

- Átomo.- Se describe en términos de sus niveles de energía

electrónico
- Molécula.- Sus energías electrónica, vibracionales y
rotacionales.
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INTRODUCCIÓN

 Los niveles de energía molecular

 INTRODUCCIÓN

 Espectro electromagnético

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 INTRODUCCIÓN

 Espectro electromagnético visible

Longitud de onda Color absorbido Color observado
de la absorción
máxima (nm)
380-420 Violeta Amarrillo-verdoso
420-440 Azul-violeta Amarillo
440-470 Azul Naranja
470-500 Verde-azulado Rojo
500-520 Verde Púrpura
520-550 Verde-amarillento Violeta

550-580 Amarillo Azul-violeta

580-620 Naranja Azul
620-680 Rojo Verde-azuloso
680-780 Púrpura Verde
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INTRODUCCIÓN

Los métodos espectroscópicos

Depende:
- Naturaleza de las especies a ser analizadas
(espectroscopia molecular y atómica).
- El tipo de interacción observada entre la radiación y la
materia (la absorción, la emisión o la difracción).
- La región del espectro electromagnética utilizada en el
análisis.
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INTRODUCCIÓN

Métodos ópticos

 Métodos basados en interacción de la radiación

electromagnética (como la luz y los rayos x) con la materia

 La radiación electromagnética puede interactuar con la

materia en diferentes formas dependiendo en la naturaleza
de la energía radiante (fuente, longitud de onda, intensidad
etc.) Y en la naturaleza de la sustancia (opacidad,
estructura molecular etc.)
 INTRODUCCIÓN

CLASIFICACION DE METODOS OPTICOS:

1. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS:
 existe intercambio de energía entre la radiación
electromagnética y la materia
 en estos métodos se miden espectros, siendo éstos debidos
a transiciones entre distintos niveles energéticos.
A. Técnicas basadas en la absorción de radiación:
 -niveles moleculares: UV-visible, microondas
 -niveles atómicos: absorción atómica, rayos x

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 INTRODUCCIÓN

CLASIFICACION DE METODOS OPTICOS:

B. Técnicas basadas en la emisión de radiación:

 -niveles moleculares: luminiscencia (fluorescencia,
fosforescencia)
 -niveles atómicos: espectrometría de emisión, fotometría de
llama,
 fluorescencia de rayos x, fluorescencia atómica

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 FUNDAMENTO

Espectroscopia de absorción molecular

 La absorción de la radiación por un átomo o una
molécula es el proceso en que la energía de un fotón de
la radiación electromagnética es transferida a las
especies absorbentes
 La absorción ocurre cuando las moléculas e iones del
medio pueden ser excitados y elevados en estados
energéticos mayores
 La absorción causa pérdida en la intensidad de la energía
radiante
 El proceso de absorción depende de la longitud de onda
de la radiación electromagnética
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 FUNDAMENTO

Interacciones de la energía que causan absorción:

1. Rotación: las moléculas entran en rotación

2. Vibración: intermolecular
3. Transición electrónica: un electrón es promovido a un
nivel de energía superior (transición a una órbita
electrónica más alejada del núcleo)
Los movimientos de rotación o vibración de una molécula o
la excitación de un electrón exigen energías diferentes

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 FUNDAMENTO

 Espectro de absorción
 FUNDAMENTO

Ley de Lambert Beer

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FUNDAMENTO

Ley de Lambert Beer

 Ley de Lambert
 Cuando la luz monocromatica incidente de intensidad P0
pasa atravez de una solución de una sustancia que
absorbe la luz, la intensidad (P) de la luz transmitida
disminuye en una función exponencial de la longitud del
recorrido óptico

 Ley de Beer
 La intensidad (P) disminuye en una función exponencial
de la concentración de la sustancia
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FUNDAMENTO

Las desviaciones respecto de la ley de Beer

 La ley de Beer es aplicable solamente a las disoluciones
diluidas, hasta aproximadamente 10 mM

Procesos químicos:
 La asociación-disolución reversibles de las moléculas del analito.
 La ionización de un ácido débil en un disolvente no amortiguado.
Limitaciones de la instrumentación para las medidas de
absorbancias.
 Las curvas de calibración
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INTRUMENTACIÓN
 INTRUMENTACIÓN

 Un espectrofotómetro básico consta de cinco

componentes esenciales:

1. La fuente de Luz
2. El monocromador
3. El soporte para la muestra o la referencia
4. El detector de la radiación
5. Un dispositivo de lectura
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INTRUMENTACIÓN

Partes de un espectrofotómetro
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DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES

Fuentes de luz
 La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las
siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad,
distribución de energía espectral continua y larga vida. Las
fuentes empleadas son:
Lámpara de filamento de wolframio (también llamado
tungsteno) -> rango 350 hasta 2500 nm ->
Espectrofotómetro Vis y espectroscopia del infrarrojo
cercano

Lámpara de deuterio de descarga eléctrica -> medidas en

la región UV -> 160 nm hasta 375 nm
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DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES

Monocromador

 El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda

deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa
para obtener luz monocromática.
 Está constituido por las rendijas de entrada y salida,
colimadores y el elemento de dispersión.
 Un lente lleva el haz de luz que entra con una determinada
longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las
longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige
hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de
salida.
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DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES
 29
DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES

Compartimiento de muestra
 Es donde tiene lugar la interacción, R.E.M con la materia (debe
producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de
onda).
 Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de
Lambert-Beer en su máxima expresión, en base a sus leyes de absorción,
en lo que concierne al paso de la molécula de fundamental-excitado.
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DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES

Detector
 El detector, es quien detecta una radiación a su vez lo deja
en evidencia, para posterior estudio. Hay de dos tipos:
 a) los que responden a fotones
Fototubo
Tubo fotomultiplicador
Fotodiodo -> Espectrofotómetro UV-Vis
 b) los que responden al calor
 DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES

 En general, los espectrometros miden en % de transmitancia

(T) y absorbancia (A)
 El porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de
radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el
detector
 Una solución transparente, no absorbente, mostrará una
lectura de 100% de transmitancia en un espectrófotometro
calibrado
 Las unidades de absorbancia van de 0 a 2
 La absorbancia se relaciona con la transmitancia como
A =- log T, (logaritmo decimal)
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APLICACIÓN

 Determinación de azúcares totales, por el método de fenol-

ácido sulfúrico.
 Una hidrolisis ácida se forman derivados del furfural, y el 5-
hidroximetilfurfural (HMF)
 La presencia del fenol y su interacción con el HMF facilita la
formación de complejos que permiten la coloración de la
solución
 Longitud de onda 490 nm
 Solución estándar: Manosa
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APLICACIÓN

 Determinación de azúcares reductores, por el método de

DNS Miller.
 Los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el
ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido en presencia de calor, por
los azúcares reductores que entran en contacto con él, se
desarrolla un cambio de color parecido al café
 Longitud de onda 540 nm
 Solución estándar: Glucosa
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APLICACIÓN

 Determinación de la capacidad antioxidante por el método

ABTS

 El método se basa en la cuantificación espectrofométrica del

radical ABTS que reacción con la solución estándar o la muestra.
 Longitud de onda 734 nm
 Solución estándar: ácido ascórbico
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APLICACIÓN
 36

 Determinación de la capacidad antioxidante total por el

método de ABTS
El método químico ABTS, técnica que fue desarrollada por Re et al., (1999) y
descrita por Kuskoski et al., (2005), mide la capacidad antioxidante en equivalentes
de trolox (6 - hidroxi- 2, 5, 7, 8 – tetrametilcromo - 2 - ácido carboxílico) el cual es
un análogo hidrosoluble del alfa-tocoferol (vitamina E) con un alto poder
antioxidante o también en equivalentes de ácido ascórbico, en nuestro caso. El
método se basa en la cuantificación espectrofotométrica del radical 2.29-azinobis-(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+) que no ha reaccionado con el
compuesto antioxidante (ácido ascórbico como patrón o sustancias presentes en
disoluciones a evaluar).
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Para la determinación analítica en primer lugar se preparó la solución

madre de trabajo, el radical (ABTS•+), de color azul-verde intenso. Para ello
se mezclaron dos reactivos a partes iguales ABTS (15mM) y persulfato de
potasio (4.8mM) incubados a temperatura ambiente y en la oscuridad durante
16 horas. Pasado el tiempo y una vez formado el radical (ABTS•+) este se
diluye con base fosfato de potasio de 0.01M a pH 4.8, y se ajusta hasta
obtener una lectura con valor de absorbancia (Abs) comprendido entre 1.1 ±
0.02 a la longitud de onda de 734 nm.
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La cuantificación de la capacidad antioxidante de las disoluciones se

realiza mezclando 150 μL de cada disolución a ensayar con 2850 μL del
radical, dejando reaccionar durante 30 minutos en agitación a 20ºC.
Transcurrido el tiempo, las diluciones se miden a 734 nm, utilizándose
como blanco la base fosfato. Todas las disoluciones ensayadas tuvieron
que ser diluidas hasta un valor en el que el resultado de absorbancia final
estuviese entre valores comprendidos entre 0 y 1.
Para cuantificar la capacidad antioxidante de los extractos se elaboró
una curva estándar de equivalentes de ácido ascórbico como antioxidante
de referencia. Para ello se prepararon diluciones a concentraciones desde
100 hasta 625 M en base fosfato de potasio.
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 40

 Determinación de Fenoles por el método Folin-

Ciocalteu (FC)