Universidad Autónoma de Chiriquí

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

PRODUCCIÓN DE PIRUVATO Y ACETALDEHÍDO DURANTE LA FERMENTACIÓN DE LA

GLUCOSA POR LEVADURA

Carreño Oldemar Rodríguez Dionicio Santamaría Cristel

4-803-1275 4-800-1309 4-807-1915

Ema Obando

II semestre

2019

Objetivos:
1. Comprobar la producción de piruvato en la fermentación de la glucosa por levadura.
2. Comprobar la producción de acetaldehído en la fermentación de la glucosa por levadura.
Introducción
La fermentación se define como el conjunto de reacciones químicas que sufre una sustancia
orgánica (carbohidratos) por medio de ciertos organismos que trabajan bajas condiciones
anaerobias, que generalmente van acompañadas de desprendimiento de gas y producción de
energía (Gálvez, 2018).
La degradación de la glucosa por la vía glucolítica produce piruvato. Éste en condiciones
anaeróbicas puede seguir una fermentación y produce: etanol, lactato, etc. y en condiciones
aerobias se produciría una oxidación completa, degradándose hasta CO 2 (acetil-CoA)
(Martínez, 2016).
La oxidación completa es el proceso de pérdida de electrones que sufren los átomos y
moléculas. Cuando hablamos de oxidación de glucosa, nos referimos a que los enlaces de
carbono-carbono, carbono-hidrógeno y oxígeno-oxígeno, cambian a enlaces carbono-oxigeno
e hidrógeno-oxigeno (Chan, 2015).
Materiales y reactivos
Materiales Capacidad
Balanza ---
Centrifugadora ---
Probetas 25-50 mL
Tubos de ensayo --
Vasos químicos 100 mL
 Nombre Formula PM PF PE Aspecto y Densidad Solubilidad Toxicidad
g/mol °C °C color g/cm3

Contacto ocular:
Peligroso por ser
irritante, causa
inflamación en los
ojos caracterizada
por lagrimeo,
enrojecimiento y
picazón. Busque
Fosfato de sodio Sólido a 20 ºC 75
Na2HPO4 141,96 - - 1,7 atención médica.
dibásico blanco g/ mL Contacto dérmico:
Irrita la piel.
Inhalación: Puede
causar irritación en
las vías
respiratorias,
membranas
mucosas
Contacto ocular:
Causa irritación en
a 0°C 22 g / los ojos Contacto
Fosfato de potasio Solido dérmico: Causa
KH2PO4 135,0679 253 - 2,34 100 mL de irritación leve de la
dibásico blanco
agua piel. Inhalación:
Irritación de la
mucosa salival.
en la piel: No
produce irritaciones.
· en el ojo: No
produce fuertes
irritaciones. ·
Ingestión: Puede ser
Polvo nocivo por ingestión.
a 20 ºC 400
Nitroprusiato de Na2[Fe(CN)5 cristalino · Inhalación: El
297,9 - - 1,72 g/l material es
sodio NO] Color: Rojo
Insoluble extremadamente
oscuro
destructivo para los
tejidos de las
membranas
mucosas y las vías
respiratorias
superiores
Contacto ocular: El
vapor o el líquido
pueden producir
desde irritación y
lagrimeo hasta
daños severos y
ceguera.
89.9 Contacto dérmico:
g/100ml a Irritación y
Hidróxido de Líquido
NH4OH 35,05 -77 27 0.9 0ºC, 7.4 quemaduras
amonio incoloro cáusticas, con
g/ml a
100ºC efectos como
dermatitis y
necrosis.
Inhalación: Vapor o
neblinas pueden
causar irritación e
inflamación del
sistema respiratorio.
Contacto ocular:
Ligeramente
peligroso por ser
irritante, causa
inflamación en los
ojos caracterizada
Sólido a 20 ºC 132
Sulfato de amonio H8N2O4S 132,14 280 - 1,77 por lagrimeo,
incoloro g/L enrojecimiento,
picazón y sensación
abrasiva.
Contacto dérmico:
Irritante para la piel,
produce
 enrojecimiento y
dolor.
Inhalación: Causa
irritación del tracto
respiratorio y
membranas
mucosas. Los
síntomas pueden
incluir tos, dificultad
para respirar y dolor
pectoral.
Contacto ocular:
Irritación y lagrimeo.
Contacto dérmico:
Irritación. Inhalación:
La inhalación del
Sólido 12,54 g/100 polvo causará
Sulfato de sodio Na2SO3 126,04l 500 - 2,64 irritación a la nariz y
blanco mL
garganta y puede
causar tos y
eventualmente
molestias en el
pecho.
Corrosión o irritación
cutánea Lesiones
miscible en oculares graves o
107,2 Líquido
piperidina C₅H₁₁N 85,15 -9 °C 0,862 cualquier irritación ocular
°C incoloro Sensibilización
proporción
respiratoria o
cutánea
Contacto ocular:
Efecto corrosivo
provocando
irritaciones,
enrojecimiento,
quemaduras y dolor.
Contacto dérmico:
Cristales Efecto corrosivo, con
Ácido 198 blancos a enrojecimiento,
C2HCl3O. 163,39 58 °C 1,62 1200 g/L quemaduras y dolor.
tricloroacetico °C ligeramente
amarillos Inhalación: Severas
irritaciones de las
membranas
mucosas y tracto
respiratorio superior.
Posibles
ulceraciones de
nariz y garganta.
Contacto ocular:
Puede causar una
ligera irritación,
enrojecimiento
posible.
Contacto dérmico:
Causa irritación a la
piel. Los síntomas
incluyen
Hidrocloruro de 2,4 Naranja, Insoluble en
C6H6N4O4. 198,14 202°C - - enrojecimiento,
dinitrofenilhidracina rojo agua fría picazón y dolor.
Puede provocar
reacciones cutáneas
alérgicas.
Inhalación: Nocivo
si se inhala. La
absorción en el
cuerpo puede
causar cianosis.
Parte experimental

Producción de
Piruvato y
acetaldehído
durante la
fermentación.

2,5 g de
2,5 g de 2,5g de
levadura + 25
levadura + 25 levadura + 25
mL Na2HPO4
mL KH2PO4 , mL de agua
,calentar 1 calentar 1 min. caliente.
min.

Tomar 5 mL y Tomar 5 mL y
Tomar 5 mL +
agregar 5 mL agregar 5 mL Tomar 5 mL +
5 mL de
de glucosa y de glucosa y 5 mL de
glucosa + 1 g
reposar a 37°C reposar a 37°C glucosa
Na2SO3
por 1 hora por 1 hora

Agregar 2 mL Agregar 2 mL Reposar por 1 Reposar por 1

de TCA, de TCA, hora a 37°C hora a 37°C
centrifugar a centrifugar a centrifugar a centrifugar a
3500 rpm por 5 3500 rpm por 5 3500 rpm por 5 3500 rpm por 5
min. min. min. min.

Tomar 2 mL Tomar 2 mL
del Tomar 2 mL Tomar 2 mL
del del
sobrenadante del
sobrenadante sobrenadante
+ 1g de + 1g de sobrenadante
(NH₄)₂SO. + 2,4 DNFH. + 2,4 DNFH
(NH₄)₂SO₄

Agregar 5 gotas de
nitroprusiato de Agregar 5 gotas de
sodio + un gotero nitroprusiato de sodio +
amoniaco un gotero amoniaco
concentrado concentrado

Resultados
A. Identificación de piruvato.
Cuadro 1. Producción de Piruvato.
Tubo Contenido Observación/
identificación
Glucosa + Anillo rosado tenue en la
Suspensión interfase de los líquidos.
A de levadura Positivo
en
Na2HPO4
 Anillo rosado fuerte en la
Glucosa + interfase de los líquidos.
B Suspensión Positivo
de levadura
en KH2PO4

Fig.1. Ruta metabólica de la fermentación alcohólica de la glucosa.

B. Identificación de acetaldehído.
Cuadro 2. Producción de acetaldehído.
Tubo Contenido Observación/
identificación
Glucosa + Coloración amarilla.
C Suspensión de Positivo.
levadura en
agua.
Glucosa + Coloración amarilla.
D Suspensión de Positivo.
levadura en
agua +
Na2SO3.

Fig.2. Reacción del acetaldehído con el sulfito de sodio.

Discusión
La pasada experiencia se llevó a cabo con la finalidad de comprobar la producción de piruvato
y acetaldehído en la fermentación de glucosa por levadura mediante la aplicación de diversas
pruebas cualitativas.
Inicialmente se prepararon soluciones de levadura en 3 medios diferentes, Na 2HPO4 (Sol. A)
(pH=9,95), KH2PO4 (Sol. B) (pH=4,7) y agua (Sol. C) (pH=7). La solución con pH neutro fue
utilizada para verificar la presencia de acetaldehído, mientras que las restantes para verificar la
producción de piruvato.
Continuando con la preparación de los cultivos, se añade acido tricloroacético como agente
separador. El ácido tricloroacético (TCA) es anchamente usado en bioquímica para la
precipitación de macromoléculas tal como proteínas, ADN y RNA (UDELAR, 2015).
Finalmente se realiza la centrifugación para separar el sobrenadante que fue hervido para
realizar la prueba correspondiente. Tanto al sobrenadante recuperado de la solución A como la
B, fueron añadidos 1 g de sulfato de amonio el cual evita que el piruvato se reoxide. Finalmente
se añade nitroprusiato de sodio y amoniaco concentrado, este último, por efectos de pH alcalino,
logra que se inactive la pirúvico-descarboxilasa, de manera que el piruvato se acumula y se
puede demostrar su presencia con el nitroprusiato de sodio (Mesa, 2014). En ambas soluciones
se logró la producción de piruvato, con la formación de un anillo rosado en la interfase. Se
esperaba que fuese de color azul o verde, sin embargo, esto se debe a la presencia de grupos
tiólicos. (Mesa, 2014). Sin embargo, la presencia de piruvato se detectó con mayor intensidad
en la solución de pH=4,7, ya que este es el rango donde la levadura trabaja más eficazmente.
La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero les resulta favorable un
medio ligeramente ácido con un pH entre 4,5 a 6,5 (Suárez, 2016).
Es importante resaltar de manera rápida como ocurre el proceso de formación de piruvato que
ocurre mediante la glucólisis. La glucólisis es una serie de reacciones que extraen energía de
la glucosa al romperla en dos moléculas de tres carbonos llamadas piruvato. La glucólisis ocurre
en el citosol de una célula y se puede dividir en dos fases principales: -Fase en que se requiere
energía. En esta fase, la molécula inicial de glucosa se reordena y se le añaden dos grupos
fosfato. Los dos grupos fosfato causan inestabilidad en la molécula modificada —ahora llamada
fructosa-1,6-bifosfato—, lo que permite que se divida en dos mitades y forme dos azúcares
fosfatados de tres carbonos. Puesto que los fosfatos utilizados en estos pasos provienen
de ATP, se deben utilizar dos moléculas de ATP. -Fase en que se libera energía: En esta fase,
cada azúcar de tres carbonos se convierte en otra molécula de tres carbonos, piruvato,
mediante una serie de reacciones. Estas reacciones producen dos moléculas de ATP y una de
NADH. Dado que esta fase ocurre dos veces, una por cada dos azúcares de tres carbonos,
resultan cuatro moléculas de ATP y dos de NADH en total (Aguirre, 2013).
Al final de la glucólisis quedan dos moléculas de ATP dos de NADH y dos de piruvato. Si hay
oxígeno presente, el piruvato se puede degradar (oxidar) hasta dióxido de carbono en la
respiración celular y así obtener más moléculas de ATP. Mientras que, si el piruvato continúa la
ruta anaeróbica, puede ocurrir la fermentación alcohólica, la cual tiene como intermediario
metabólico al acetaldehído que se produce por la acción del piruvato descarboxilasa. El
acetaldehído es el analito de la siguiente fase de la experiencia.
Finalizando con el ensayo, se procedió a utilizar la solución C (medio neutro) para determinar
la presencia de acetaldehído. Esta etapa llevaba como variable el uso o no, de bisulfito de sodio.
Luego de centrifugar, se procedió a tratar los sobrenadantes con 2,4 dinitrofenilhidrazina, donde
en ambas soluciones se observaron resultados positivos. Sin embargo, no se pudo diferenciar
en cual caso fue mas efectivo debido a la coloración de intensa de la 2,4-DNFH. Cabe destacar
que se esperaba que la determinación con bisulfito fuese más efectiva ya que la acumulación
de acetaldehído se acompleja con el bisulfito formando un bisulfítico de adición soluble en agua
(UANL, 1996). Podemos señalar que La 2,4-dinitrofenilhidrazina es un reactivo que se utiliza
para detectar cualitativamente los grupos carbonilo de cetonas y aldehídos. El resultado es
positivo cuando hay un precipitado rojo o amarillo (dinitrofenilhidrazona) de acuerdo a la
siguiente reacción: RR'C=O + C6H3(NO2)2NHNH2 → C6H3(NO2)2NHNCRR' + H2O. Esta
reacción puede describirse como una reacción de condensación: se unen dos moléculas y
pierden agua. También es llamada reacción de adición-eliminación: una adición nucleofílica del
grupo -NH2 al grupo carbonilo C=O, seguida de la remoción de una molécula de H 2O (UGR,
2015).

Conclusiones
 Comprobamos que la producción de piruvato en la fermentación de la glucosa por
levadura puede determinarse con mayor efectividad si el proceso se realiza en medio
ácido (pH=4,7), ya que las levaduras trabajan de forma óptima entre un rango de 4,5 y
6,5.
 Se logró evidenciar la producción de acetaldehído en la fermentación de glucosa por
levadura de forma efectiva utilizando 2,4-DNFH, sin embargo, no fue posible comprobar
el efecto del bisulfito de sodio debido a la intensa coloración del 2,4-DNFH, por lo que
recomendamos realizar el procedimiento con piperidina.
 Corroboramos la importancia de alcalinizar el medio para demostrar la presencia de
intermediarios metabólicos que se encuentran en bajas concentraciones.

Bibliografía
 Gálvez, G. (2018). Producción De Piruvato Y Acetaldehído Durante La Fermentación.
Recuperado el 24 de agosto de: http://biologiaexp.blogspot.com/2018/03/produccion-de-
piruvato-y-acetaldehido.html
 Martínez, L. (2016). Metabolismo del Piruvato. Recuperado el 24 de agosto de:
http://www3.uah.es/bioquimica/Tejedor/BBM-II_farmacia/T4-piruvato-pagina.pdf
 Chan, E. (2015). Oxidación de la glucosa. Recuperado el 24 de agosto de:
https://medium.com/@evelynchan/ciclo-de-krebs-y-transporte-de-electrones-
98543bcfe48a
 UDELAR. (2015). Bioquímica II. [Consultado en agosto 2019]. Disponible en:
http://dedicaciontotal.udelar.edu.uy/adjuntos/produccion/440_academicas__academica
archivo.pdf
 Mesa, N. (2014). Pruebas bioquímicas para la detección de metabolitos producidos en
los errores innatos del metabolismo. [Consultado en agosto 2019]. Disponible en:
http://www.redalyc.org/pdf/1805/180532151005.pdf
  Suárez, C. (2016). Levadura Saccharomyces cerevisiae y la producción de alcohol.
Revisión bibliográfica. [Consultado en agosto 2019]. Disponible en:
https://www.redalyc.org/pdf/2231/223148420004.pdf
 Aguirre, I. (2013). Glucólisis. [Consultado en agosto 2019]. Disponible en:
https://es.khanacademy.org/science/biology/cellular-respiration-and-
fermentation/glycolysis/a/glycolysis
 UANL. (1996). Detección de intermediarios en la fermentación alcohólica por levaduras.
[Consultado en agosto 2019]. Disponible en:
http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111465/1020111465_031.pdf
 UGR. (2015). Identificación de grupos funcionales. [Consultado en agosto 2019].
Disponible en: https://www.ugr.es/~quiored/doc/p14.pdf
ANEXOS
Cuestionario.
1. ¿Qué estrategias básicas experimentales se utilizan para estudiar metabolitos?
Para demostrar la existencia de intermediarios metabólicos o metabolitos se pueden utilizar
estrategias como:
-Bloquear la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se está investigando
mediante inhibidores.
-Cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por
debajo de su actividad máxima.
-Usar agentes que atrapen el intermediario y que forme un compuesto que forme un compuesto
que no pueda metabolizarse.
Los activadores e inhibidores alostéricos, que suelen ser metabolitos, pueden alterar
rápidamente la actividad de muchas de esas enzimas, induciendo cambios de conformación
que afectan la actividad catalítica.

2.Explique la función de cada reactivo en las diferentes pruebas.

La presencia de piruvato en la muestra del tubo A debido al pH alcalino proporcionado por el
Na2HPO4 que inactiva la enzima piruvato descarboxilasa que degrada el piruvato. Lo mismo
ocurre empleando la disolución de KH2PO4, pero se inhibe la enzima en menor medida.
El Na2SO3 funciona como agente aductor reteniendo el acetaldehído y formando un compuesto
bisulfítico no reconocible por la enzima alcohol deshidrogenasa. El acetaldehído es regenerado
por tratamiento con ácido o base e identificado por la presencia del carbonilo con la 2,4-
Dinitrofenilhidrazina.
3.Describa a fermentación alcohólica y láctica. ¿Qué organismos la utilizan?
La fermentación alcohólica es un proceso que transforma la glucosa en etanol y CO2, en la cual
el NADH dona sus electrones a un derivado del piruvato y produce etanol como producto final.
Para obtener etanol a partir de piruvato, se usan dos pasos. En el primer paso, al piruvato se le
retira un grupo carboxilo y se libera como dióxido de carbono, con lo que se produce una
molécula de dos carbonos llamada acetaldehído. En el segundo paso, el NADH dona sus
electrones al acetaldehído y regenera el NAD+ a la vez que genera etanol.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaerobia a los
microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno a partir de la glucosa. Las
levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en las
frutas y cereal.
En la fermentación láctica, el NADH transfiere sus electrones directamente al piruvato y se
obtiene lactato como producto de degradación. El lactato, que es la forma desprotonada del
ácido láctico, le da al proceso su nombre. Las bacterias que forman el yogur realizan la
fermentación del ácido láctico al igual que los eritrocitos de tu cuerpo, los cuales no tienen
mitocondrias y, por lo tanto, no pueden llevar a cabo la respiración celular.

Imágenes de las identificaciones observadas.

Fig.3. Identificación de presencia de piruvato con nitroprusiato de sodio.

Fig.4. Identificación de presencia de acetaldehído con 2,4-Dinitrofenilhidrazina.