Oxidasa.

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la
presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el
oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa
por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa solo se encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y,
excepcionalmente, en alguna microaerófila (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen de
actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que Ésta degrada
el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación
es tóxica.

PRUEBA DE LA OXIDASA

 PROPÓSITO Y ALCANCE: Prueba utilizada para determinar si un microorganismo produce la enzima

citocromooxidasa. La prueba se usa en la caracterización inicial de bacterias gram negativas.
 FUNDAMENTO: En presencia de oxígeno atmosférico la enzima intracelular citocromooxidasa oxida
el reactivo fenilendiamina y forma un compuesto color púrpura (indofenol).

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC
oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa. Todas las bacterias
aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también
llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las
siguientes líneas se dará una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad
de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidas a, entiendase que
todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP. En
la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones
desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le
quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno
siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a
que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando
dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones

que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:

 Tetrametil-p-fenilendiamina.
 Dimetil-p-fenilendiamina.
 Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil -p-fenilendiamina al 1%, es el más

común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos
o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados
con el reactivo.

Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la

enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-

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 fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color
morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliogr áfia en especial el libro de Mac
Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

 Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia
aislada proveniente de un cultivo de 24h.
 La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
 Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea
positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa . Control negativo: Escherichia coli.

Factores a considerar en la prueba de oxidasa.

 No considerar un result ado positivo después de 30 seg ya que el oxígeno molecular del
ambiente oxida al reactivo.
 No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es
capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
 No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos
que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a
la oxidasa dando como resultado fal sos negativos en la prueba.
 Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar
sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

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Prueba de la catalasa.

Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva

pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State
University.

Fundamento de la pruebe de catalasa. El

peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a
esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio -oxidativo.
La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacte rias aerobias y
anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada
catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba El

reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas
para realizar la prueba la más común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y
posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia
aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de
oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa ., hay bacterias que
dan una reacción positiva débil aunque son las menos.

Reacción de la catalasa.

Control positivo: Stahylococcus aureus Control negativo: Streptococcus pyogenes

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BD Triple Sugar Iron Agar (TSI Agar)

USO PREVISTO BD Triple Sugar Iron Agar (agar triple azúcar hierro BD), cuando se utiliza como medio en placa,
se emplea para la diferenciación de Enterobacteriaceae, en especial Salmonella de otras bacterias entéricas.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO

Método microbiológico. Hajna desarrolló la fórmula de agar TSI añadiendo sacarosa a la fórmula de azúcar
doble (glucosa y lactosa) de agar Kligler hierro1,2. El agar triple azúcar hierro contiene tres carbohidratos
(glucosa, lactosa y sacarosa ). Cuando dichos carbohidratos se fermentan, la producción resultante de ácido
es detectada por el indicador rojo fenol. Se producen cambios de color: amarillo para la producción de ácido
y rojo para la alcalinización. Dado que la lactosa y la sacarosa se encuentran presentes en concentraciones
mucho más elevadas que la glucosa, la formación de ácido en la base del tubo se debe a dichos azúcares,
mientras que la formación de ácido a partir de la glucosa es suprimida por la rápida oxidación de una pequeña
cantidad de ácido en el área inclinada del tubo, lo que genera una reacción de pH neutro o alcalino cuando se
fermenta sólo glucosa. La sacarosa añadida permite la exclusión de determinados organismos coliformes y las
especies Proteus que pueden atacar la sacarosa , pero no la lactosa, en un período de incubación de 24 – 48
h. Con un pH neutro o alcalino, el ácido sulfhídrico (producido por el tiosulfato sódico) reacciona con la sal de
amonio ferroso, lo que produce sulfuro de hierro de color negro. El cloruro sódico mantiene el equilibrio
osmótico del medio. La aplicación original de la fórmula de TSI es como medio en tubo, con una base de tubo
y un área inclinada. Permite la diferenciación de los organismos fermentadores de glucosa, lactosa y/o
sacarosa, además de la detección de la producción de sulfuro de hidrógeno. Cuando se utiliza como medio en
placa, las reacciones observadas en la capa de agar en la placa se limitan a la formación de productos alcalinos
(producidos a partir de las peptonas del medio, si no se fermentan la glucosa, lactosa y/o sacarosa) o los
productos ácidos de la lactosa y/o sacarosa que constituyen los azúcares más importantes del medio. Además,
se produce sulfuro de hidrógeno si no se fermenta ningún azúcar hasta formar productos ácidos, dado que la
formación de sulfuro de hidrógeno requiere un pH de neutro a alcalino. La mayoría de las cepas de Proteus,
de las que se sabe que producen sufuro de hidrógeno en pH neutro o alcalino, acidifica el medio, dado que
fermentan sacarosa y no presentarán color negro en este medio, mientras que las cepas de Salmonella no
fermentadoras de sacarosa ni de lactosa producen colonias de color negro.

Fórmula* por litro de agua purificada Digerido pancreático de caseína 10,0 g Digerido péptico de tejido animal
10,0 Cloruro sódico 5,0 Lactosa 10,0 Sacarosa 10,0 Glucosa 1,0 Sulfato ferroso de amonio 0,2 Tiosulfato sódico
0,2 Rojo fenol 0,025 Agar 13,0 pH 7,3 ± 0,2

CARACTERISTICAS DEL RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO BD Triple Sugar Iron Agar es un
medio no selectivo utilizado para la diferenciación de colonias presuntivas de Salmonella de otras
Enterobacteriaceae obtenidas en medios de aislamiento, o como un medio para el subcultivo de caldo de
enriquecimiento de Salmonella. La mayoría de las cepas de Salmonella producen colonias rosas con un centro
negro en este medio, mientras que las colonias de otros organismos son de color rojo o amarillo y no muestran
centros negros. No obstante, ciertas cepas de Salmonella no muestran el centro negro y pueden no detectarse
si no se someten a mayor diferenciación. Asimismo, el medio tampoco permite la diferenciación de Shigella
de otras Enterobacteriaceae determinadas. Por tanto, todas las colonias rosas sin centros negros deben
someterse a análisis de detección de Salmonella y Shigella, por ejemplo, mediante pruebas de aglutinación en
portaobjetos con antisueros adecuados. Los resultados obtenidos en este medio deben confirmarse con
pruebas bioquímicas o serológicas adicionales3 . Las reacciones obtenidas en BD Triple Sugar Iron Agar,
suministrado como medio en placa, pueden ser diferentes de las descritas para Triple Sugar Iron Agar

4
suministrado en tubos4. BD Triple Sugar Iron Agar no es un medio de aislamiento primario para Salmonella ni
otros patógenos.

Prueba con medio MIO

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Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccíon de
indol y descarboxilación de la ornitina.
La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación.
El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que
desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro
pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se
adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta.
Por lo que respecta a la descarboxilacíon de la ornitina como el medio tiene púrpura de
bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un
color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al
descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez
dada por la fermentación de las glucosa resultando en un color morado en el fondo

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Dextrosa 1.0
Extracto de levadura 3.0
Peptona 10.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de agua
destilada. Calentar a ebullición hasta
Tripteína 10.0
completa disolución. Distribuir en tubos y
Clorhidrato de L-ornitina 5.0 esterilizar 15 minutos a 121°C.
Agar 2.0
Púrpura de bromocresol 0.02
pH final: 6.5 ± 0.2
Las peptonas proporcionan las fuentes de nitrógeno y carbono, el extracto de levadura proporciona vitaminas
y la dextrosa es la fuente de energía.

Características del medio

Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.

Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por punción profunda con ansa recta.

Incubación
En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 °C.

Resultados

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1-Movilidad:

-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.

-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color púrpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del
medio.

3-Prueba del indol:

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Lisina, Hierro, Agar (LIA)

Esta prueba se hace para determinar si el microorganismo es capaz de descaroxilar elamino´acido lisina por
medio de la enzima la lisina descarboxilasa, y a la vez producirH2S,por medio de la enzima tiosulfato
reductasa. Este medio de cultivo contiene: peptona degelatina, extracto de levadura, glucosa, lisina,
tiosulfato de sodio, citrato de hierro y amonio,p´urpura de bromocresol como indicador de pH y agar.La lisina
descarboxilasa es una enzima inductiva, porque solo se sintetiza cuando est´a enpresencia del sustrato
lisina; sin embargo, el medio debe ser ´acido para que la enzima puedaactuar sobre el grupo carboxilo,
transform´andolo en cadaverina (amina) yC O 2; como estosproductos alcalinizan el medio, entonces el p´urpura
de bromocresol indicador de pH alcalinocambia a lila, la cadaverina es estable en condiciones anaerobias y se
produce en presenciade la coenzima fosfato de piridoxal. Este proceso es irreversible pero no oxidativo.

I nterpretaci´on de resultadosLa descarboxilaci´on de la lisina se pone de manifiesto por la alcalinizaci´on

del medio produ-ciendo un viraje del p´urpura de bromocresol a un color m´as lila. La producci´on
deH2Sseevidencia por la presencia de un precipitado negro por utilizaci´on de las sales de hierro.En el caso
que se diera una desaminaci´on del amino ´acido, el medio de cultivo se torna rojocobrizo, o si se produce
acidificaci´on cambiando el medio a amarillo y se desplaza el mediode cultivo o se resquebraja fue porque el
microorganismo desdobl´o la glucosa presente en elmedio de cultivo y produjo ´acido m´as gas.

Se utilizan las letras; (A): reacci´on ´acida (color amarillo), (K): reacci´on alcalina (color vio-leta), (R): reacci´on alcalina
(color rojo) (K/K): descarboxilaci´on de lisina. (prueba positiva)(K/A): descarboxilaci´on de lisina y fermentaci´on
de glucosa. (prueba negativa)(R/A): desaminaci´on de lisina y fermentaci´on de glucosa.Ayuda a la determinacion del
grupo bacteriano entre las Enterobacterias;Klebsiella(+),Es-cherichia(+),Salmonella(+

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