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AISLAMIENTO DE LACTOSA E IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE

CARBOHIDRATOS
Herrera Chávez Sonia, Almanza Torres Andrea, Escalera Pérez Juan Alfonso
Universidad de Guanajuato. División de Ciencias Naturales y Exactas. Laboratorio de Estructura de
Biomoléculas y Cinética Enzimática.

Resumen: Los carbohidratos son compuestos con fórmula estequiométrica (CH2O)n pueden definirse como
derivados aldehídos o cetónicos de alcoholes polihidroxilados o anhídridos de estos. En este trabajo se
presenta el aislamiento de lactosa de leche en polvo y algunas de las pruebas para identificar azúcares
reductores y no reductores en muestras con de azúcares como glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa,
lactosa, miel y una solución problema (Lactosa). Mediante el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) se
determinaron los miligramos de azúcar reductor en la solución problema a partir de curva de valoración.
Los resultados arrojados se analizaron obteniendo 5.9896 mg de lactosa en solución.

1-INTRODUCCIÓN.
Los carbohidratos son biomoléculas compuestas
principalmente por C, H y O. La principal función
en los seres vivos es la de brindar energía
inmediata y la siguiente es estructural.
Los carbohidratos pueden sufrir reacciones de
esterificación, aminación, reducción, oxidación, lo
cual otorga a cada una de las estructuras una
propiedad específica, tal como la solubilidad.
También son reactivos en varias reacciones
orgánicas tales como: Acetilación, reacción con
cianohidrina, reacción de Nef, degradación de
Wohl, reacción de Koenigs-Knorr, pardeamiento
no enzimático, etc.
La lactosa es un disacárido formado por la unión
de una molécula de glucosa y otra de galactosa.
También se conoce como azúcar de la leche
aparece en la leche de las hembras de los
mamíferos. En el caso de los humanos, se
encuentra en una porción del 7%.
La estructura de la lactosa es β-D-
galactopiranosil-(1→4)-D-glucopiranosa; en el
enlace interviene el carbono 1 de la galactosa y el
carbono 4 de la glucosa. Al formarse el enlace
entre los dos monosacáridos se desprende una
molécula de agua.
Fig. 1 Molécula de lactosa.
Existen diferentes pruebas para determinar
azúcares, una prueba de identificación de azúcares
reductores implica el uso del reactivo de Benedict
(sulfato cúprico, citrato de sodio, carbonato
anhidro de sodio y NaOH.), el cual en presencia
de una azúcar reductor y en medio alcalino puede
reducir el Cu2+ a Cu+ (precipitado color naranja-
rojizo).
La prueba de yodo-lugol es una opción si se desea
identificar polisacáridos, se da como consecuencia
de la formación de cadenas de poliyoduro a partir
de la reacción entre yodo y almidón. La amilosa y
la amilopectina son componentes de estructura
lineal con enlaces α (1-4), que forman hélices en
donde se juntan las moléculas de yodo formando
color azul oscuro: la amilopectina es de estructura
ramificada, con enlaces α (1-4) (1-6) que forman
hélices más cortas y las moléculas de yodo son
incapaces de juntarse presentan un color entre
naranja y amarillo. Al calentar, se abren las
cadenas de almidón deshaciendo así los complejos
con el yodo y el mismo es incoloro en solución.
La reacción de Molish se basa en la acción del
ácido sulfúrico con el α-nafatol, los cuales, al
reaccionar forman un anillo de color verde al no
haber presencia de glúcidos. Al tener presencia de
glúcidos, este anillo se vuelve violeta, fácilmente
identificable, debido a una deshidratación de
azúcares en presencia del ácido.

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Un procedimiento de cuantificación de azúcares es
el método DNS, el cual se fundamenta en la
reacción de los grupos reductores de los azúcares
con el reactivo oxidante ácido dinitrosalicílico
(DNS). El reactivo consiste en una disolución
formada por: DNS, que actúa como oxidante, sal
de Rochelle (tartrato sódico-potásico) que impide
la disolución de oxígeno en el reactivo, hidróxido
sódico, que aporta el medio requerido para que se
produzca la reacción redox. De esta forma, el
DNS se reducen en presencia del grupo reductor
del glúcido, mientras que el grupo aldehído
reductor se oxida para formar un grupo
carboxílico. En este método el DNS está en exceso
frente a los grupos reductores y en todas las
muestras se adiciona la misma cantidad, de tal
forma que mayores concentraciones de azúcar
reductor provocan una mayor coloración de las
muestras. Estas diferencias de coloración pueden
determinarse por espectrofotometría visible a la
longitud de onda de máxima absorbancia de 540
nm.
2-METODOLOGÍA.
Aislamiento de lactosa
El aislamiento implico disolver 25.057g de leche
en polvo semidescremada Alpura en 75 ml de
agua (se ajustó la mezcla a 50°C). Posterior a la
disolución se adicionaron 10 ml de ácido acético
al 10%, la mezcla se agitó en calentamiento por 15
min o hasta completar la precipitación de caseína
debido a la perdida de órdenes en la proteína.
Se filtró la mezcla por gravedad a través de 4
capas de gasa y se colectó el filtrado (líquido
amarillo turbio), al mismo se le adicionaron 2 g de
carbonato de calcio a fin de neutralizar el ácido
presente, se llevó a punto de ebullición por 10
min. Pasados, se filtró eliminando restos de
carbonato de calcio o proteínas restantes, y
concentró a 30 ml. Al enfriar, se adicionaron
125ml de etanol al 96% y se filtró nuevamente
para extraer sólidos ajenos a lactosa. El filtrado se
dejó reposar por 24 h para una posterior colección
de cristales y cálculos de rendimiento.
Identificación de azúcares reductores
En una serie de tubos de ensayo se colocaron 0.5
ml de cada solución de azúcar a analizar (glucosa,
lactosa, galactosa, miel, sacarosa, almidón al 1%,
incluyendo la lactosa previamente aislada). A cada
tubo se adicionaron 0.5ml de reactivo de Benedict.
Se observaron cambios.
Identificación de azúcares no reductores
Con 0.5 ml de los azúcares negativos a prueba de
Benedict se adicionó 10 gotas de HCl a fin de
romper enlaces glucosídicos de disacáridos, se
llevó a calentamiento en baño de agua en punto de
ebullición por 10 min, para posteriormente
adicionar solución alcalina y realizar nuevamente
la prueba de Benedict.
Identificación de almidón
En un tubo de ensayo se adicionó 3 ml de solución
de almidón y 3 gotas de Lugol, se llevó a
calentamiento ligero hasta observar desaparición
del color, resultado de la desaparición de
complejos de yodo.
Reactivo de Molish
Se colocaron 0.5 ml de las soluciones de azúcar,
junto con 2 gotas de α-naftol al 1%. Y 1 ml de
ácido sulfúrico adicionado ligeramente a fin de
observar dos fases, lo cual originaría una
deshidratación de azúcares seguido de la
formación de un furfural que combinado con el α-
naftol generaría una complejo de coloración
característica.
Cuantificación de azúcares
Se preparó una solución de lactosa aislada en agua
al 10%, así como dos series de microtubos de
acuerdo a lo ilustrado en la tabla No.2. Estos tubos
se mezclaron y calentaron en baño de agua a
ebullición por 15 min. Para una posterior dilución
con 0.980 ml de agua a cada tubo, se transfirió
200 µl de cada tubo a una placa de 96 pozos y se
leyó absorbancia a 540 nm.
3-RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Se aislaron y analizaron soluciones de
carbohidratos mediante pruebas cualitativas y
cuantitativas.
1.1.Aislamiento de lactosa.
Se presentan los resultados del aislamiento del
carbohidrato “lactosa” de una muestra de leche en
polvo (25.057 gr.) cuyo valor nutricional
registrado en etiqueta y sitios web oficiales revela
46.9% de carbohidratos (Lactosa). Por lo que del
valor esperado del aislamiento (11.752 gr) se