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Introducción
El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones
extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbiólogo utiliza
técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho
microorganismo.
Para obtener cultivos puros se han de utilizar instrumentos estériles, es decir, libres
de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por
diferentes métodos:
1. Calor seco. Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel o
aluminio) se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90 minutos.
2. Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a
una temperatura de 120°C durante 20 minutos en una atmósfera de vapor de agua a
elevada presión, lo cual evita la ebullición. Se realiza en el autoclave.
3. Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un
filtro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de los
microorganismos.
4. Esterilización química. Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tipos
de plástico) termolábil. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan
una vez finalizado el proceso de esterilización.
5. Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar
habitaciones o algunos plásticos.
2
célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en
obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se
vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.
Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos
de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -80°C, en nitrógeno
líquido a -173°C, o mediante liofilización.
2. El microscopio
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estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y
100.000 aumentos.
De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de
modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000
y 10.000 aumentos.
Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes
fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura.
Oculares
Objetivos
Pletina móvil
Condensador
Diafragma
Filtros
Tornillos de enfoque
Fuente de iluminación
Soporte
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2nsenθ: apertura numérica. Está definida por el valor de 2senθ (característica de
cada microscopio y no se puede variar) y n, el índice de refracción del medio.
2. Observación microscópica
3. Tinciones
Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una
composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno,
safranina) o no (nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta
composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo
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que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de
tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la
tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones
utilizan más de un colorante.
Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta
composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej;
tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos.
Pueden utilizarse uno o más colorantes.
Objetivos
Materiales
Asa de siembra, placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo). Mechero
de alcohol. Microscopio óptico. Portaobjetos, cubreobjetos y colorantes. Suspensión de una
mezcla de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium,
Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Yogurt preincubado a 37°C.
Agar Nutritivo (AN)
Extracto de levadura 2 g/l
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 5 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 20 g/l
pH 7,4
Procedimiento
1. AISLAMIENTO
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2. RESIEMBRA
3. TINCIONES
• Simples
Procedimiento
Procedimiento
1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos.
2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra.
3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra
toda la superficie del primero.
4. Secar al aire.
5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión).
• Selectivas
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Procedimiento
Procedimiento
• Diferenciales
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Procedimiento
Gram(+) Gram(-)
Peptidoglicano Peptidoglicano
Membrana Plasmática
Membrana
Plasmática Espacio periplásmico
Lipopolisacárido
y Proteína
Gram (-)
Exterior
Polisacárido O
Lipopolisacárido
Membrana Núcleo Polisacarídico (LPS)
externa Lípido A
Gram(-) Proteína
Porina 8 nm
Fosfolípido
Lipoproteína
Espacio
Periplásmico Peptidoglicano
Membrana Plasmática
Interior
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Proteína asociada Gram (+) Acidos Teicoicos
a la pared
Acidos
Lipoteicoicos
Peptidoglicano
Membrana
Plasmática
Procedimiento
1. Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus).
2. Fijación.
3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con
Fucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de
vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama,
volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos.
4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua.
5. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.
6. Lavar con agua
7. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Secar.
10. Observar (100×).
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Práctica 2
Introducción
1. El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo
de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.
2. La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio
mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la
fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos
rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que
con galactosa (Gal).
3. Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2
en la atmósfera de cultivo, la agitación, etc... son factores importantes.
4. La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará
dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento
exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a
MM+Glc.
Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen
conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:
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Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre
placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una
única célula. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo.
Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay
que utilizar para que los resultados sean significativos.
Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero
que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..).
Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos
los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse
por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos
indirectos se encuentran:
Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y
estimar el nº de células proporcional a ésta.
Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo.
Determinación del DNA
Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de
oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la
concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material
radiactivo, etc.
Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en
general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece
turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es
proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. El
espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y
detecta la luz no dispersada.
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Este instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después
de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o
densidad óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la
muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo,
esto es así dentro de ciertos límites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse
agregados celulares y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras (en el caso
de S. cerevisiae la relación entre la DO y la concentración de células es lineal hasta un valor
de DO de aproximadamente 0,3). Por tanto, en algunos casos será necesario diluir la muestra
antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilución 1/10 se mezclaría 1 ml de cultivo con 9
ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilución sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer
diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilución 1/50 primero se hace una
dilución 1/10 y despues se hace una dilución 1/5 de la dilución 1/10).
El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se
denomina tiempo de generación (g). Por tanto, g es el tiempo que necesita una población
para duplicar el nº de células. Si consideramos que entre un tiempo inicial (To) y otro final
(Tf) han transcurrido n generaciones, el valor de g se expresará como:
g = (Tf - To)/n (A)
Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 células, después de la primera división el número de
células será N0 × 21; después de la segunda división N0 × 22; después de la tercera división N0
× 23…….; después de n divisiones, el número final de células (Nf) será N0 × 2n. Por tanto, se
trata de una progresión geométrica cuya sucesión se puede expresar como:
Nf = No × 2n (B)
Despejando el valor de n se aplican logaritmos:
Log Nf = log(No × 2n) log Nf = log No + n log 2
n = (log Nf – log No)/log 2
Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de g:
g = 0,3 (Tf - To)/ (log Nf – log No)
El crecimiento de una población en el que el número de células se dobla cada un tiempo g se
conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B).
Logarítmica
Nº de Células
(escala aritmética)
Nº de Células
(escala logarítmica)
Aritmética
Tiempo (horas)
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Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana, midiendo por
ejemplo su DO en función del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene
dada por una gráfica del tipo:
Fases de Crecimiento
Turbidez
Viables (D.O.)
Tiempo
Objetivos
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Materiales
Procedimiento
2. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones
celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrón, calcularemos por extrapolación
el nº de células que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al
espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en función del tiempo.
Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de células por celda y se expresa la
concentración en células por ml:
X cel / 4 × 10-6 ml = X × 25 × 104 células/ml
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Práctica 3
ANTIBIÓTICOS
Introducción
Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por
microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros
microorganismos. Se caracterizan por:
-Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).
-Son efectivos a bajas concentraciones.
-Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador.
-Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas.
-Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro.
-Solubles en agua.
-Poseen estabilidad química.
-Son productos del metabolismo secundario.
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados
antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección.
Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas
(Bacillus, Streptomyces, Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium, Aspergillus,
Cephalosporium)
Se pueden clasificar según:
Su origen
•Naturales: sintetizados por microorganismos.
•Sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química.
•Semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada
químicamente.
Su estructura química
•ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas.
•Macrólidos: eritromicina.
•Aminoglucósidos: estreptomicina.
•Polipeptídicos: bacitracina.
•Poliénicos: anfotericina B
•Tetraciclinas
•Derivados del benceno: cloranfenicol.
Su mecanismo de acción
•Actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas.
•Actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad.
•Inhiben la síntesis proteica.
•Inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina.
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Objetivos
Materiales
Tubos con 20 ml de AN y YED fundido, baño a 50ºC, placas Petri, mecheros, pipetas pasteur,
pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G 25, 50,
100 µg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 10 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml;
microorganismos: Streptomyces, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis.
Procedimiento
Procedimiento
1. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50ºC en un baño a dicha
temperatura.
2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible).
3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía.
4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar, cada
uno con uno de los microorganismos a ensayar.
5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico.
6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del
microorganismo sensible.
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determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante
bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de
Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del
mismo antibiótico.
Procedimiento
Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los
diámetros con una regla, hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3
periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida.
3. “ANTIBIOGRAMA”
El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo
frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres
antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml).
Procedimiento
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Práctica 4
Introducción
En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en
mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas.
Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir
microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las
aguas residuales, las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar
microorganismos patógenos.
Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua
también acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los
microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace disminuir
rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que
no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor
característico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios.
Objetivo
La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas que
se realizan son:
Recuento de aerobios totales
Colimetría
Estreptometría
Clostridiometría
Materiales
Muestra de agua (aprox. 100 ml). Medios de cultivo: Placas de agar nutritivo (AN) (4), tubos
de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida
de Rothe (3 AR concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido),
placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estéril para
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diluciones. 1 tubo de vidrio estéril. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). Parafilm™. Baño a 80°C.
Baño a 60°C. Estufa incubadora a 37°C. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP).
Asa de vidrio, mechero de alcohol y alcohol de quemar.
Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas, aerobias y
anaerobias facultativas, mesófilas, capaces de crecer en un medio rico (AN). El ensayo se
basa en contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha
sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubación a
37 °C. Este ensayo sólo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la
muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Al incubar a 37°C se
seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los
animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona.
Procedimiento
1. Preparar diluciones seriadas de la muestra original: 1/2, 1/4 y 1/8.
1. Sembrar 0,2 ml de la muestra original y de cada una de las diluciones (1/2, 1/4 y 1/8) en
cuatro placas de AN.
2. Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas.
Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que
contenga entre 30 y 300 colonias para la realización de los cálculos. El resultado se expresa
como microorganismos por ml de agua. ¡Hay que tener en cuenta las diluciones!.
Son bacterias de morfología bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa
negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y
gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se
incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar
el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los géneros:
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser vehículos de
transmisión de otras bacterias no coliformes que son patógenas como Salmonella, Proteus y
Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la
disentería bacilar. Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran
en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminación fecal la presencia en las
aguas de los géneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. Se realizan dos
pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas
pruebas.
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Prueba presuntiva:
El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC), que permite
el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada
produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el
crecimiento de cocos Gram (+) y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos
entéricos Gram (-) ni otros ambientales (ej. Pseudomonas). Es un medio de enriquecimiento
y selectivo.
Procedimiento
Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y
acumulación de gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretación
se realiza según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el
número más probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en
cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y aplicando métodos
estadísticos.
Prueba confirmativa:
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3. Estreptococos fecales (Estreptometría)
Prueba presuntiva
El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un medio
líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo
azida de Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de
transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los
estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de
cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida.
Procedimiento
Prueba confirmativa
Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento de los tubos con objeto de reconocer
al microscopio los estreptococos, que se observarán como cadenas de cocos Gram (+).
Procedimiento
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2. Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80°C, para matar formas
vegetativas e inducir la germinación. Enfriar en el grifo.
3. Añadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x
4. Tapar bien el tubo con algodón y con Parafilm™. Mezclar por inversión.
5. Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en
cuenta las colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en
el volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes).
El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites
establecidos por la ley. Las normas legales exigen:
Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son:
Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml.
Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.
Estreptococos fecales: < 1 / 100ml.
Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.
Con los intervalos de confianza del 95 por 100, entre los cuales pueden variar para diversas
combinaciones de resultados positivos y negativos.
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Composición de los medios de cultivo empleados
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Práctica 5
DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
Introducción
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En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se incluyen las familias
Enterobacteriaceae y Vibrionaceae.
Familia Enterobacteriaceae
Forma: bacilos, cocobacilos
Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos
Catalasa (+) y Oxidasa (-)
La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. La
capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificación de las
distintas especies. Por ejemplo, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa
(coliformes), mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa (no
coliformes).
Familia Vibrionaceae
Forma: bacilos ligeramente curvados.
Movilidad: móviles por flagelos polares
Catalasa (+) y Oxidasa (+)
Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas y se
encuentran en ambientes acuáticos. Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el
agente causal del cólera.
Objetivo
Materiales
Procedimiento
1. AISLAMIENTO
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde
podremos ver la morfología, color y otras características de los distintos tipos de
microorganismos presentes en la muestra. Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de
medios sólidos (Agar nutritivo, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio líquido (Peptona
alcalina), empleando las mezclas A o B.
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Procedimiento
Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar por
estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de Agar
nutritivo, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS.
Agar Nutritivo
Extracto de levadura 2g/l
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 5 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 20 g/l
No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos.
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Medio Agar Verde Brillante
Lactosa 10 g/l
Sacarosa 10 g/l
Peptona 10 g/l
Extracto de levadura 3 g/l
NaCl 5 g/l
Rojo de fenol (indicador de pH) 0,08 g/l
Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) 0,0125 g/l
Agar 20 g/l
pH 6,9
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2. IDENTIFICACIÓN
Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los
aislamientos en placa. Se llevarán a cabo 4 pruebas individuales: Prueba de la oxidasa,
Test de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Además se llevará a cabo una
prueba compuesta por varias reacciones bioquímicas, el API20E.
Procedimiento
1. Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una
suspensión de una colonia en agua) y depositar en un porta.
2. Poner la colonia sobre el porta y añadir una gota de sustrato cromógeno fresco (10
mg/ml).
3. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. Si se pone
azul es (+).
Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo.
2.2. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de
destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Esta enzima está
presente en la mayoría de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias
facultativas.
catalasa
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Procedimiento
1. Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de
EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae)
2. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua.
3. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %.
4. Observar si se forman burbujas de oxígeno.
Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.
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2.3. Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de
Kligler") y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un
microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o ácido sulfhídrico. Es un
medio que requiere un procedimiento de inoculación especial.
Procedimiento
1. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con
el asa de siembra. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por
estría y sembrar la parte interna del medio por picadura.
2. Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.
2º) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero sólamente en aerobiosis
(se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos
amoniacales, produciendo una basificación del medio. El indicador vira a rojo en esta
parte del tubo.
30
Lac +
Glc +
Amarillo
6h 10 h
24 h
Rojo
Lac -
Amarillo Glc +
Rojo Amarillo
Rojo
Amarillo
Medio KIA
Extracto de carne 3 g/l
Extracto de levadura 3 g/l
Peptonas 15 g/l
Lactosa 10 g/l
Glucosa 1 g/l
Tiosulfato sódico 0,3 g/l
Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l
Rojo de fenol 0,024 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 12 g/l
pH 7,4
formiato liasa
H-COOH → CO2 + H2
Por tanto, son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima.
31
c) Producción de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción
a partir del tiosulfato añadido al medio:
tiosulfato reductasa
2+ - +
2 S2O3 + 4 e + 4 H → 2 SO32+ + 2 SH2
El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+)
presentes en el medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita en
gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio.
Medio MM
Peptona de caseina 10 g/l
Nitrato potásico 1 g/l
Manitol 7,5 g/l
Rojo fenol 0,04 g/l
Agar 3,5 g/l
pH 7,6
Procedimiento
1. Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos
microorganismos aislados.
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Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si
el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es móvil. Si el
crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo es móvil.
Procedimiento
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6. Poner la tira en la cámara de incubación. Previamente poner agua en los alveolos de la
cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.
7. Incubar a 37°C durante 24 h.
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con
los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:
Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren
reactivos:
VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos.
Positivo= color rojo o rosa fuerte.
TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrón oscuro.
IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los
dos primeros minutos de la reacción.
Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir
reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API
10S para ver determinados metabolismos especiales.
1. Si la reacción es negativa………… 0
2. Si la reacción es positiva…….…… 1 (primer pocillo de un triplete)
2 (segundo pocillo de un triplete)
4 (tercer pocillo de un triplete)
3. Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.
4. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.
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