Antocianinas PDF

MEMORIAS DEL ENCUENTRO FINAL ALFA LAGROTECH
Cartagena, Colombia, 21-26 de Septiembre de 2008.
ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS EN DIFERENTES

VARIEDADES DE MAÍZ (Zea mays) BOLIVIANO
Cuevas Montilla E.1, Antezana A.2 y Winterhalter P.1
1
Institut für Lebensmittelchemie, Technische Universität Braunschweig, Schleinitzstrasse 20,
38106 Braunschweig, Alemania
2
Universidad Mayor San Simón Cochabamba, Sucre a Parque la Torre, Cochabamba, Bolivia
Palabras clave: Antocianinas, Maíz morado, Zea mays, cromatografía en contracorriente, HSCCC
INTRODUCCION
Estudios epidemiológicos efectuados en varios países evidencian que el consumo de
frutos y vegetales reducen enfermedades coronarias además de minimizar los riesgos de
cáncer Ҟ Se ha descrito que algunos compuestos fenólicos de origen vegetal presentan dentro
de la célula actividad antioxidante, reduciendo la concentración de radicales libres, y en
algunos casos logran establecer grupos de quelación con iones metálicos ҞLos mecanismos
involucrados de los agentes antioxidantes establecen donación de electrones o átomos de
hidrógeno a los radicales libres. Los agentes antioxidantes presentes en alimentos pueden
reducir trombosis, activar macrófagos e inhibir la tendencia a la peroxidaciónҞ[1]җ Entre los
compuestos que han merecido dichos estudios se encuentran las antocianinas, debido a la
presencia de sustituyentes -OH, los cuales son moléculas con alto poder antioxidante [2]
La presencia de antocianinas en las variedades pigmentadas del maíz, lo hace un
producto potencial para el suministro de colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el
estudio de los pigmentos del maíz morado (Zea Mais) ha despertado un interés sin
precedentes. La diversidad genética del maíz se distribuye en razas. En América se han
originado el 90% de todas las razas. Según Goodman y Brown (1988), en América hay 260
razas de las que 132, aproximadamente la mitad, se encuentran en la región andina. Dos
factores son la causa de esa gran diversidad: la variación en usos y la gran variación
ecológica. La diversidad fenotípica del maíz en la región andina se expresa en una
extraordinaria variabilidad en color, tamaño, forma, textura del grano y de la mazorca.[3]
El maíz es un elemento cultural de la misma importancia que el lenguaje, el vestido, la
música, la culinaria, las costumbres y otras manifestaciones culturales. La vigencia de las
razas de maíz es universal. Las razas se mantienen en el tiempo. Hay muchas evidencias de
que las razas de maíz son más perennes que otras manifestaciones culturales. Se mantienen
porque constituyen un fuerte elemento cultural. Si desaparecen las culturas desaparecen
también las razas de maíz.
En Bolivia el maíz es uno de los cultivos más importantes constituyendo uno de los
alimentos básicos de la población. Uno de los objetivos es lograr que en EEUU y en la UE
también se produzcan alimentos a base de maíz pigmentado. La idea es "generalizar" el
consumo, minoritario en la mayoría de países, excepto zonas de México Actualmente el
desarrollo de la tecnología en este país centroamericano ha permitido explotar el maíz como
una materia prima de gran importancia para la industria, tanto en lo básico como en la
complementaria.
OBJETIVOS
Bolivia es uno de los centros de diversificación del género Zea y la producción y
consumo del maíz morado es importante, pero se ha estudiado poco las antocianinas en
variedades bolivianas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar la composición y
perfil de antocianinas en variedades de maíz morado cultivadas en Bolivia.
[79]
El objetivo principal es como mencionamos anteriormente buscar las vías de explotar el

maíz como una materia prima para la industria a largo plazo. Debido a ello se abre una gran
posibilidad de emplear maíces pigmentados para la extracción industrial de sus pigmentos,
debido a que por los volúmenes de producción y por la naturaleza de los mismos, es factible
desarrollar una industria competitiva, orientada a satisfacer una de las grandes necesidades, de
alimentación, cosméticos y salud, al producir pigmentos del tipo de las antocianinas con una
alta capacidad biológica. Por lo que es necesario realizar estudios como el presente, para
poder lograr la extracción, purificación, estabilización y conocimiento químico de estos
componentes de naturaleza pigmentada en el maíz
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
SISTEMA ANTIOXIDANTE
Como respuesta a la permanente producción de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs)
que dañan estructuras biológicas, el organismo atenúa estos efectos deletéreos por medio de la
acción de sistemas antioxidantes. Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en
pequeñas concentraciones en comparación a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe
significativamente la oxidación del sustrato, y también estabiliza las EROS mediante la cesión
de un H+ y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras definiciones hablan de
antioxidante como cualquier sustancia que, al estar presente en bajas concentraciones
comparada a las de un sustrato oxidable, previene o retarda la oxidación de dicho sustrato y
que protege a los sistemas biológicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de
procesos como reacciones que causan excesivas oxidaciones [4].
Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno de ellos está
conformado por sistemas enzimáticos como la superóxido dismutasa, catalasa y glutatión
peroxidasa, siendo éstas la primera defensa contra los radicales libres que actúan
neutralizando a estas especies altamente reactivas en moléculas menos dañinas para la célula.
Otros sistemas, no enzimáticos, están conformados por compuestos como caroteniodes,
glutatión reducido y las vitaminas C y E que estabilizan las EROs o también que provocan la
quelación de iones metálicos de elementos de transición como hierro y cobre, que al estar en
estado reducido potencian su autoxidación y generación de anión superóxido[5].
Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las EROs. Son
variados los alimentos que están constituidos por estas sustancias y cada vez más utilizados
por las personas tanto por medio del consumo directo de vegetales y frutas que los incluyen,
como también por medio del uso de fármacos. Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se
destacan las vitaminas E y C, los betacarotenos, procianidinas y polifenoles.
POLIFENOLES
Compuestos orgánicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido a un anillo
aromático, se conocen como compuestos fenólicos y aquellos en que se repite este radical son
conocidos como polifenoles. Los compuestos de esta familia presentan variados efectos
beneficiosos para la salud: prevención contra cáncer, propiedades antiinflamatorias,
antialérgicas, antitumorales, antimicrobianas, vasorelajantes y antioxidantes. Entre sus
acciones antioxidantes encontramos la inhibición de la formación de EROs por medio de la
inhibición de enzimas productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelación de los
elementos traza involucrados en la producción de los mismos; el atrapamiento directo de
EROs y el up-regulation de los sistemas antioxidantes endógenos [6].
Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical aroxilo (FI-O·),
para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual adquieren una estructura quinona
estable [6].
[80]
memorias * red-alfa lagrotech * comunidad europea * cartagena 2008
Los polifenoles más estudiados actualmente son los provenientes del extracto seco
estandarizado de Vitis vinifera que contienen antocianinas, procianidinas y proantocianidinas,
entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actúan atrapando los radicales libres
para luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibición de la acción enzimática de
elastasa e hialuronidasa. Estudios clínicos demuestran que el uso terapéutico de los
polifenoles provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades
cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de síntomas en
pacientes con insuficiencia venosa.
Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de otros
polifenoles por poseer azúcares dentro de sus grupos funcionales y, en su mayoría, presentar
varios grupos –OH. Las diferencias individuales entre los antocianinas dependen del número
de grupos hidroxilo, la naturaleza y número de azúcares que están unidos a la molécula, a la
posición de esa unión y la naturaleza y número de ácidos aromáticos unidos al azúcar en la
molécula [2].
ANTOCIANINAS
Las antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo más importante de
pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano[7]. Las antocianinas forman parte de
la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenólicos. Los colores rosa, rojo,
azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la presencia de estos
pigmentos[8].
Las antocianinas se localizan principalmente en la piel de frutas como manzanas, peras,
uvas, zarzamoras, ciruelas, de flores como la jamaica, rosas y verduras como col morada y
maíz morado. La función que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos y
pájaros) para propósitos de polinización y dispersión de semillas. La diferencia de color entre
las frutas, flores y verduras depende de la naturaleza y concentración de antocianinas. Existen
factores adicionales que afectan el color como el pH de la célula, el efecto de copigmentación
determinado por la presencia de otros flavonoides, temperatura, luz, etc.[9]
Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenólicas, se encuentran en la
naturaleza en forma de glicósidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas, a las
cuales se les une un azúcar por medio de un enlace ß-glicosídico. Se trata de flavonoides, es
decir, sustancias derivadas del núcleo flavano, con un anillo-A benzoil y un anillo-B
hidroxicinamoil.
La estructura de la antocianina es el 2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio. Cuando el
residuo de azúcar es un hidrolizado de la antocianina, el resultado es la aglicona, conocida
como se menciona anteriormente como antocianidina. Las más comunes formas de
antocianidinas son: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, malvidina y petunidina
En la Figura 1 se muestran los diferentes tipos de antocianinas.
Las clases comunes de glucósidos son: 3-monósido, 3-biósido y 3-triósido, así como
también 3,5-diglicósido y más raramente el 3,7-diglicósido con glucosa, galactosa, arabinosa
(es uno de los más frecuentes) y xilosa. Las antocianinas poseen uniones de azúcar en el
anillo-B 3´ y 5´-hidroxilos. Los dos tipos más importantes de glucósidos son: el 3-monósidos
y el 3-4-diglicósido. Como regla el 3-hidroxil siempre tiene un azúcar, exceptuando 3-
desoxipelargonidina, 3-desoxicianidina y 3-desoxidelfina [10].
Además de la glucosilación, la introducción de moléculas aciladas es un efecto que
ocurre ampliamente. Los grupos comunes de acilo son los ácidos aromáticos de los cuales los
más comúnmente encontrados son ácidos hidroxicinámicos: p-coumárico, cafeico y ferúlico,
y más raramente el hidroxibenzoico. El color particular de cada antocianina depende del
[81]
número y orientación de los grupos hidroxilos y metoxilos. Un incremento en la hidroxilación

produce un color azul, mientras un incremento en la metoxilación produce un color rojo.
Aglicona R1 R2
Petunidina OH OCH3
Malvidina OCH3 OCH3
Pelargonidina H H
Delfinidina OH OH
Cianidina OH H
Peonidina OCH3 H
Figura 1. Estructura y sustituyentes de las
antocianinas (Rodríguez- Saona y
Wrolstad, 2001)[11]
Todas las antocianinas son derivadas del catión flavilo básico. Se conocen más de 100,
las diferencias entre ellas se debe al número de grupos hidróxilos, el grado de metoxilación de
éstos grupos, así como la naturaleza y el número de los ácidos aromáticos y alifáticos
presentes en la molécula. De todas las antocianinas existentes, sólo seis son de interés enlos
alimentos: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina y malvidina (Figura 1).
Los restantes son menos frecuentes y se encuentran en algunas hojas [9].
Es común que una misma antocianidina interaccione con más de una clase de
carbohidrato para formar diferentes antocianinas; la pelargodina es la que produce el color
rojo escarlata de algunas flores y de las fresas; la delfinidina se encuentra en las berenjenas y
la cianidina en col roja, higos, cerezas, ciruelas, y otros frutos.
BIOSINTESIS DE LAS ANTOCIANINAS

Las antocianinas se sintetizan a partir de la condensación de dos moléculas precursoras
(Figura 2): malonil Co A y p-cumaril-CoA, las que más tarde formarán anillos A y B
respectivamente.
Las antocianinas son sintetizadas por varias rutas. Sobresalen dos, la del ácido
shikímico y la del ácido malónico. En la ruta del ácido shikímico se convierten carbohidratos
simples derivados de la glicólisis, de la ruta de las pentosas fosfato y ciclo de Calvin en
diversos ácidos orgánicos como el cinámico, p-coumárico, cafeico, ferúlico, clorogénico y
fenilalanina
Cabe resaltar que esta ruta sintética también es compartida por otros compuestos
fenólicos. La principal reacción de biosíntesis de los flavonoides es la condensación de los
acilos provenientes de cumaril-CoA y tres moléculas de malonil-CoA catalizada por la
enzima chalcona isomerasa que lleva a cabo la isomerización de chalcona a flavona, misma
que es convertida en flavones o antocianinas. Los pasos finales en la síntesis de antocianinas
son las acilaciones y las glicosilaciones, primero en el C-3, para estabilizar el catión flavilio
[9].
[82]
Phosphoenolpyruvat + Erythrose-Phosphat
OH
HOOC OH Shikimisäure
OH
HO COOH
HO COOH
OH Phenylalanin
Gallussäure NH2
COOH
HO COOH HO COOH
Zimtsäure
HO HO
Ferularsäure Kaffeesäure
COOH
p-Cumarsäure
HO
p-Cumarsäure-CoA
Acetyl-CoA MalonylCoA OH
HO OH
Chalcon
OH O
OH OH
HO O HO O HO O
Flavanon
OH
OH O OH O OH O
OH
Isoflavon Flavanonol
OH OH
HO O HO O
OH
OH O OH OH OH
Flavon + Flavan-3-ol
HO O HO O
OH OH
OH O OH
Flavonol Anthocyanidin
Figura 2. Biosíntesis de Polifenoles (MACHEIX, FLEURIET und BILLOT, 1990)[12]
FACTORES QUE ALTERAN LA ESTABILIDAD DE LA ANTOCIANINA

La estabilidad de las antocianinas depende de factores como enzimas, pH, temperatura,
oxígeno, luz, metales, etc. Investigaciones recientes demostraron que existen antocianinas con
ciertas características, presentando una mayor estabilidad debido al desarrollo de ciertos
mecanismos:
1. asociación intramolecular: acilación
2. asociación intermolecular: copigmentación
3. interacciones con otros compuestos
4. polimerización [8].
EFECTO DEL PH
Este es uno de los factores más importantes. Las antocianinas son más estables en un
medio ácido que en un medio neutro o alcalino. En medio ácido la forma predominante es la
del ión flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH básico o alcalino, el ión
flavilio es susceptible al ataque nucleofílico por parte del agua, produciéndose la pseudobase
carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras.[13]
[83]
Conociendo esto, las antocianinas tienen su máxima expresión de color a pH ácidos
(pH1), y su forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos, debido a esta característica se
utilizan a las antocianinas a pH ácido o ligeramente neutro en la industria alimenticia. En la
Figura 3 se muestra el comportamiento de la antocianina a diferentes pH’s.
R R
1 1
3' OH 3'
4' 4' OH
+ OH
HO O -OH HO O
5' R 5'
7 7 R
2 2
3 3
OR
H+
5 5 OR
OH OH
Catión flavilio, rojo Pseudobase carbinol, incolora
-OH
H+ -OH H+
R R
1 1
3' OH 3' OH
4' 4'
+ HO O
HO O HO
5' -OH 5'
R
7 R 7
2 2
3 3
OR H+ OR
5 5
OH OH
Base quinoidal, azul Chalcona, amarilla
Figura 3. Estructura de las antocianinas en función al pH
TEMPERATURA
La antocianina es destruida por el calor durante el procesamiento y almacenamiento. Un
incremento logarítmico en la destrucción de la antocianina ocurre con un incremento en la
temperatura. Timberlake (1986) observó que el equilibrio entre las estructuras es endotérmico,
en una dirección de izquierda a derecha:
Base quinoidal ļ Cation flavilio ļ Pseudobase carbinol ļ Chalcona.
A altas temperaturas el equilibrio cambia hacia chalconas. El retorno de chalconas a
flavilio es lento.[14]
COPIGMENTACIÓN
La copigmentación es la interacción electrónica planar en los grupos cromóforo de las
antocianinas. Los cambios producidos por el copigmento en la región visible del espectro del
pigmento es correlacionada con la transformación de la antocianina en agua, estas formas se
producen por el ataque nucleofílico del agua.
El ión flavilio es casi planar y muestra una deslocalización electrónica, que se extiende
por todo el grupo cromóforo, mientras que la forma hemiacetal tiene dos anillos aromáticos
sin conjugar y un anillo central en cual no es planar, por que tiene un carbono tetrahédrico,
por lo tanto el ión flavilio es la única especie capaz de copigmentar, por su forma planar. La
copigmentación provoca un efecto hipercrómico. Debido a la baja estabilidad de la
copigmentación, se requiere de grandes concentraciones de copigmentos[15].
La debilidad de la copigmentación es esencialmente de origen entrópico. De hecho,
experimentos de variación de la temperatura en sistemas diferentes pigmento-copigmento, se
encontró un cambio de entropía negativa por el equilibrio de la copigmentación. El pigmento
y copigmento en su estado inicial son especies independientes, durante su asociación es
[84]
sostenida fuertemente el complejo formado con una reducción simultánea de los grados de
libertad, todo este proceso tiende a una oposición de copigmentación. La copigmentación es
usual en la naturaleza y contribuye a la profusión de colores en las flores y algunos tejidos.
Abe et al (1977) propusieron el término "copigmentación intermolecular" para la asociación
débil de antocianinas con compuestos, modificando así el color y la estabilidad del complejo
formado; y "copigmentación intramolecular para el enlace fuerte que forman grupos de ácidos
orgánicos con las antocianinas [16].
La copigmentación intermolecular de antocianinas con otros flavonoides produce un
incremento en la absorbancia a una longitud de onda visible (efecto hipercrómico), así como
un desplazamiento a longitudes de onda mayores del máximo de absorbancia (efecto
batocrómico); la copigmentación intramolecular es la responsable por la estabilidad del color
de antocianinas que poseen dos o más grupos acilos aromáticos. El color se intensifica al
incrementar el contenido de ácidos orgánicos como el cinámico y malónico[8]
EFECTOS POSITIVOS DE LAS ANTOCIANINAS SOBRE LA SALUD
Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacológicas utilizadas para la terapia
de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones realizadas con extractos de Vitis
vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que disminuyen la fragilidad y permeabilidad
capilar; también efectos antiinflamatorios y actividad antiedema. Además tienen la propiedad
de proteger los vasos sanguíneos del daño ocasionado por los altos niveles de azúcar en la
diabetes.[17]
Las antocianinas protegen de muchas maneras. Primero, neutralizan las enzimas que
destruyen el tejido conectivo. Segundo, su capacidad antioxidativa previene los oxidantes del
tejido conectivo dañado. Finalmente, reparan proteínas dañadas en las paredes de los vasos
sanguíneos.
Experimentos en animales han demostrado que la suplementación con antocianinas
previenen efectivamente la inflamación y el subsecuente daño a vasos sanguíneos. Esta
habilidad antiinflamatoria de las antocianinas también ayuda contra las reacciones alérgicas.
Por otro lado se ha observado que su potencial antioxidante va en contra de radicales
superóxidos y peróxidos de hidrógeno a través de numerosos mecanismos, por ejemplo: la
cianidina: Protege la membrana celular de lípidos de la oxidación por una variedad de
sustancias peligrosas. La cianidina es un antioxidante 4 veces más fuerte que la vitamina E.
La pelargonidina protege el radical amino de la tirosina del peroxinitrilo, un antioxidante
altamente reactivo. Por otro lado, la delfinidina interfiere con el radical hidroxil, uno de los
oxidantes del cuerpo humano[18].
La capacidad antioxidante se relaciona con el número de grupos –OH que presenten y el
lugar de la sustitución.Cuando se ingieren, las antocianinas son destruidas en parte por la flora
intestinal y las que son absorbidas se eliminan por la orina y la bilis, con previas
transformaciones
Gracias a esta capacidad antioxidante, las antocianinas son catalogadas como agentes
nutracéuticos. Varios trabajos reportan sus efectos benéficos al prevenir la proliferación de
células cancerígenas, protección contra enfermedades del corazón y prevención del daño a
lípidos de alimentos.
Debido al interés de la sustitución de los colorantes sintéticos por su posible toxicidad,
se han buscado nuevas fuentes de colores naturales, como las antocianinas presentes en los
maíces pigmentados
[85]
MAÍZ MORADO (Zea Mays) COMO FUENTE DE ANTOCIANINAS
Zea mays es una gramínea anual originaria de las Américas introducida en Europa en el
siglo XVI. Actualmente, es el cereal con mayor volumen de producción en el mundo,
superando al trigo y el arroz. En la mayoría de los países de América, el maíz constituye la
base histórica de la alimentación regional y uno de los aspectos centrales de la cultura
mesoamericana. El uso principal del maíz es alimentario. Puede cocinarse entero, desgranado
(como ingrediente de ensaladas, sopas y otras comidas). La harina de maíz (polenta) puede
cocinarse sola o emplearse como ingrediente de otras recetas. El aceite de maíz es uno de los
más económicos y es muy usado para freir alimentos[19]
El maíz morado es una variedad de maíz que posee la coronta y los granos de color
morado y es originario del altiplano andino (Bolivia y Perú). Contiene diferentes tipos de
Antocianinas, siendo la cianidina-3- ß-glucósido, su pigmento mayoritario el cual es un
importante antioxidante. Figura 4 nos muestra la gran variedad de coloraciones del maíz
morado
Figura 4. Maiz morado
También el extracto de maíz morado puede ser usado en productos ácidos (p. ej.
bevidas, jugos) donde se desee un color rojo. A un colorante extraído a partir del de maíz
morado se le clasifica con el número E-163 (EEC). Además del pigmento principal cianidina-
3-glucósido, se han encontrado en variedades de maíz morado: pelargonidina - 3- glucósido,
peonidina-3-glucósido, cianidina-3-maloilglucósido, pelargonidina-3-malonilglucósido, y
peonidina-3 - malonilglucósido) en extractos comerciales de maíz morado [20] y granos del
mismo [21]. Además, cianidina - 3-dimalonilglucósido como compuesto minoritario en
algunas variedades.
Las Antocianinas del maíz morado son más estables que la Enocianina de la uva, a la
luz, al calor y principalmente a los cambios de pH. Las Antocianinas del maíz Morado a un
pH entre 3 y 3.5 permanecen de un color rojo amarillento, mientras que la Enocianina se torna
azulada en esa condición.
LA CROMATOGRAFÍA CONTRACORRIENTE (CCC)
La cromatografía a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido,
donde tanto la fase estacionaria como a fase móbil son líquidas.La cromatografía
contracorriente es la técnica cromatográfica de separar solutos por sus diferentes coeficientes
de distribución en dos solventes inmiscibles.
Desde su nacimiento hace casi 60 años la tecnología se ha desarrollado cada vez más.
Mediante la eliminación de soportes sólidos, se evita la adsorción permanente de la sustancia
[86]
analizada en la columna, y se puede recuperar casi el 100 %. El instrumento también es de
fácil conmutación entre los distintos modos de funcionamiento con sólo cambiar los
disolventes. Con la cromatografía líquido-líquido, los investigadores no están limitados por la
composición de las columnas disponibles en el comercio para su aparato. Casi cualquier par
de soluciones inmiscibles pueden ser utilizados en cromatografía líquido-líquido, y la mayoría
de los aparatos se pueden manejar en el modo estándar o en fase inversa. Los costes del
disolvente también son generalmente más baratos que para HPLC, y el costo de los
adsorbentes sólidos se elimina por completo. Otra de las ventajas es que los experimentos
realizados en el laboratorio puede ser llevadas fácilmente a escala industrial.
La CCC se puede concebir como un proceso en tres etapas: la mezcla, la estabilización, y la
separación (aunque a menudo se produce de forma continua). La mezcla de las fases es
necesaria para que la superficie de la interfase entre ellos tenga un gran tamaño, y se pueda
mover el analito entre las fases de acuerdo a su coeficiente. Un coeficiente de partición es la
relación de la cantidad de analito encontrada en cada uno de los disolventes en equilibrio, y
está relacionado con la afinidad del analito por uno de los disolventes sobre los otros. La fase
móvil se mezcla con la fase estacionaria a lo largo de toda la columna. El grado de retención
de la fase estacionaria (inversamente proporcional a la cantidad de fase estacionaria perdida o
"sangrada" en el curso de una separación) es un parámetro crucial. Los instrumentos de mayor
calidad tienen una gran retención de la fase estacionaria. El tiempo de estabilización es una
propiedad del sistema de disolvente y la matriz de la muestra, teniendo ambas una gran
influencia en la retención de la fase estacionaria.
A partir de los 80, el Dr Yoichiro
Ito con su desarrollo de la
Bomba centrífuga planetaria inició la era de
Inyector la High Speed Countercurrent
Chromatography (HSCCC) a la que
Detector Disolución pertenecen la mayor parte de
equipos que se fabrican hoy
Coil
día.[22]
Fraccionador
Figura 5. Esquema de un equipo de HSCCC

según SUTHERLAND (1987)[23]
Ventajas de La Cromatografía Contracorriente de Alta Velocidad (HSCCC)
x Gran capacidad de carga, hasta el 10% del volumen de la columna, rango amplio:
desde miligramos hasta decenas de gramos en el mismo equipo
x Adsorción no irreversible, se recupera el 100% del analito. Tanto la fase estacionaria
como la fase móvil son líquidos, por lo que la muestra puede recuperarse sin ningún
tipo de pérdida. (No hay problemas de adsorción o cambios catalíticos)
x Se usa menos solvente (10-25%) que en los procesos equivalentes de HPLC
x Puede trabajar con extractos brutos que contienen partículas
x Reproducible: el perfil de la elución está sólo en función de la relación entre la tasa de
distribución y el volumen de la fase estacionaria
x Puede ser usada como un proceso cromatográfico o de extracción
x Puede ser usada en Fase Inversa o Fase Normal, o intercambiarlas durante el proceso
x Ideal para la automatización
[87]
MATERIALES Y MÉTODOS
Maíces utilizados en el estudio
Se utilizaron seis muestras de grano pigmentado colectadas en cuatro diferentes
departamentos de Bolivia. La información sobre sitios y clave de colecta, color de grano, y la
ubicación del pigmento en el mismo, se presenta en la tabla 1.
Tabla 1. Descriptores de los maices analizados
Denominación Proveniencia Clave Color/Ubicación
(Departamento)
Ayzuma (1) Chuquisaca BO2M - 903 Púrpura/aleurona
Tuimuru (2) Cochabamba BO2M -1876 Púrpura/aleurona
Huaca Songo (3) Cochabamba BO2M -1540 Rojo/pericarpio
Checchi (4) Cochabamba BO2M -1844 Púrpura, moteado/aleurona
Oke (5) Potosí BO2M-1433 Púrpura/aleurona
Kulli (6) Cochabamba BO2M-1866 Negro/pericarpio, tusa =
morada
MÉTODO DE AISLAMIENTO DE ANTOCIANINAS A PARTIR DE MAÍZ MORADO

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
Las muestras analizadas en este trabajo, corresponden a los concentrados obtenidos
apartir de las diferentes variedades de maíz arriba mencionados. Estas muestras fueron
facilitadas por el Dr. Gonzalo Ávila desde el Centro de Investigaciones Ficoecogenéticas de
Pairumani, Fundación Simón I. Patiño, Cochabamba, Bolivia La Figura 6 nos muestra un
esquema del proceso de extracción, caracterización y purificación de las antocianinas del maíz
morado
Maíz molido
1) Extracción con MeOH:ácido acético

19:1
2) Rotaevaporación, liofilización
Extracto crudo
1) Adsorción en amberlita XAD-7

2) Lavado con agua
3) Elución con MeOH/Ác. acético
19:1
4) Rotaevaporación
5) Liofilización
LC-MS/MS Extracto XAD-7 HPLC-DAD
Fraccionamiento con HSCCC
LC-MS/MS Fracciones
Control de pureza con HPLC
Mezcla de
substancias
Purificación por medio de HPLC

preparativa
Substancia pura
Figura 6. Esquema de extracción y procedimiento de purificación de las antocianinas
[88]
Aproximadamente 100 g de grano entero de cada variedad fueron molidos con un

procesador de alimentos doméstico, desengrasados 2 a 3 veces con n-hexano con agitación
por aprox. 5 horas, posteriormente secado a temperatura ambiente por 12 horas y finalmente
extraídos con una mezcla de metanol:ácido acético: (19:1 v/v), a temperatura ambiente y con
agitación, durante 24 h cada una. El extracto así obtenido fue rotaevaporado, congelado a -
24°C y liofilizado en un tiempo aproximado de 48 horas.
Una vez redisuelto en agua, se aplicó a una columna de Amberlita XAD-7 (Sigma-
Aldrich, St Louis, MO), utilizando como disolvente de lavado agua, y como eluyente
metanol:ácido acético: (19:1 v/v) y finalmente rota evaporado y liofilizado nuevamente.
Separación del extracto XAD 7 por medio de cromatografía a contracorriente de alta

velocidad (HSCCC)
El extracto XAD 7 obtenido fue fraccionado con al ayuda de un equipo de HSCCC. La
pureza e identidad de las fracciones así obtenidas fueron controladas por HPLC-DAD y
Cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) sucesivamente. Las
muestras antes de inyectarse se filtraron a través de un acrodisco de 0.45 ȝm (Millipore,
Bedford, MA), inyectando un volumen de 20mL. Se usó como sitema de solventes: éter
terbutilmetílico/n-butanol/acetonitrilo/agua 2:2:1:5, acidificado con 0,1% de ácido
trifluoroacético. La velocidad de flujo fue 4,0 mL miní1. La detección de las antocianinas se
realizó a 520 nm y el modo de elución utilizado fue "Head to tail" (fase liviana = menos densa
como fase estacionaria)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IDENTIFICACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS

Se identificaron dos antocianinas mayoritarias en todas las variedades de maíz morado
estudiadas, independientemente de su origen: cianidina-3-glucósido (42,5%), y cianidina-3-
(6"malonil)-glucósido (30,7%).
Los tiempos de retención de las antocianinas mayoritarias fueron 24,01 y 33,56 min,
respectivamente, valores que coinciden con los estándares utilizados para su identificación
(Figura 8). Los resultados concuerdan con los reportados por Fossen et al. (2001)[24], quienes
encontraron las mismas antocianinas en flores y hojas de maíz morado y señalan, al igual que
De Pascual-Teresa et al. (2002)[21] y Schwarz et al. (2003)[25], a la cianidina-3-glucósido
como la antocianina mayoritaria en maíz morado, seguida por la cianidina-3-(6"malonil)-
glucósido.
Se pudo observar que existen diferencias en el perfil de antocianinas minoritarias entre
especies de maíz; que si bien son mínimas como lo demuestra la Figura 7, ocasionan una
diferencia enorme en el color y pigmentación de las diferentes variedades de maíz morado.
Esta variación se define en colores que van desde el rojo, pasando por el morado (completo o
moteado) hasta el casi negro en el caso del Kulli.
La siguiente Tabla Nr.2 nos presenta de manera resumida identificación y características
espectroscópicas de las antocianinas minoritarias de las diferentes variedades de de Maíz
morado analizadas en nuestro estudio. Una comparación directa entre las 6 variedades
estudiadas la podemos apreciar gráficamente en la Figura 7, en la cual observamos tanto la
similitud en el perfil antociánico (Antocianinas mayoritarias) como las diferencias en el perfil
de las menores (La enumeración va de acuerdo con Tabla 1)
[89]
Tabla 2. Identificación y características espectroscópicas de las antocianinas minoritarias
Variedad Antocianinas (minor) tR [M]+ MS/MS
(min) (m/z) (m/z)
Ayzuma peonidina-3-glucósido 31.78 463 301
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido 36,99 519 271, 433
Tuimuru pelargonidina-3-glucósido 26,63 433 271
Aún no caracterizado 30.51 535 287
Huaca Songo pelargonidina-3-glucósido 26,63 433 271
peonidina-3-glucósido 31.78 463 301
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido 38,81 549 301, 463
Checchi Aún no caracterizado 36,06 635 475, 306
Oke pelargonidina-3-glucósido 26,63 433 271
Aún no caracterizado 30.51 535 287
Kulli Aún no caracterizado 30.51 535 287
pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido 36.99 519 271, 433
cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucósido 37,82 621 287, 449
Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades estudiadas
[90]
Las antocianinas en las semillas de maíz morado de las variedades analizadas, son de
tipo simple y no aciladas, ya que su estructura está conformada por el grupo cromóforo y
únicamente un azúcar, que es la glucosa . Esta estructura química minimiza pues su uso
potencial como colorantes naturales para alimentos, ya que son menos estables a cambios de
pH que las aciladas; sin embargo, poseen una actividad antioxidante sobresaliente, por lo que
las antocianinas del maíz morado pueden considerarse valiosas como agentes antioxidantes
[25]
Para una mejor caracterización y elucidación espectroscópica de las antocianinas
extraídas, sobretodo de aquellas minoritarias, se hace necesario el aislamiento y purificación
de más cantidades de extracto y es pecisamente aquí donde se despliegan todas las ventajas de
la cromatográfia contracorriente , que nos permite llegar de manera fácil, rápida y eficiente a
tal objetivo. A continuación se describen los resultados de la separación HSCCC
ejemplarmente en el Maíz variedad Kulli.
FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO XAD 7 DE MAÍZ KULLI POR MEDIO DE
HSCCC
Para la separación se utilizaron 500 mg del extracto XAD 7. Las separaciones se
realizaron por cromatografía en contracorriente a alta velocidad HSCCC y el equipo utilizado
para tal operación fue un modelo CCC-1000. La Figura 8 nos muestra el cromatograma
HSCCC a una longitud de onda de 520 nm.
Se obtuvo un total de 4 Fracciones
4
más la fracción residuo llamada coil, que
fueron separadas con ayuda de
1
2
cromatografía de capa fina. El control de
la identidad y pureza de las fracciones
separadas fueron monitoreadas con ayuda
Absorbance [520nm]
de HPLC-DAD y Cromatografía de
líquidos acoplada a espectrometría de
masas (LC-MS) sucesivamente. HSCCC
Fr. 1 (llamada fracción de ruptura) está
3 compuesta mayoritariamente por
pigmentos poliméricos, Fracción 2
contiene un pigmento identificado
tentativamente como un dimero de
70 140 210 280 350 Time [min] flavanol y cianidina-3,5-diglucósido,
Figura 8. Cromatograma HSCCC de Maíz
Kulli 520 nm
llamado (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucósido y que ya ha sido identificada en anteriores
estudios en un polvo colorante a base de maíz morado[26]. Una purificación sucesiva y
análisis con Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se encuentran en curso.
Fracción 3 contiene mayormente copigmentos y ningúna antocianina. La fracción 4 contiene
el compuesto mayoritario de la variedad, cianidina-3-glucósido, con una pureza de 80% y el
compuesto minoritario con un ión molecular [M]+ (m/z) de 477 y una fragmentación del ión
molecular de MS/MS 287, lo que nos señala que se trata de un derivado de la cianidina Una
purificación sucesiva y análisis con Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
se encuentran igualmente en curso. Finalmente en la fracción Coil se enriquecieron entre
otros, el segundo pigmento mayoritario cianidina-3-(6"malonil)-glucósido con una pureza de
60% y el resto es una fracción mezclada que contiene pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido,
peonidina-3-(6"malonil)-glucósido y la antocianina no acilada peonidina-3-glucósido como
componentes minoritarios. A continuación nos resumen Figura 9 y Tabla 3 las características
[91]
cromatográficas y espectrometricás de las antocianinas aisladas y caracterizadas a partir de la
variedad de maíz morado denominada Kulli
1 4
a
3 5 7
2 6
Figura 5. Cromatograma HPLC- DAD del extracto XAD 7 de maíz Kulli a 520 nm
Tabla 3. Identificación y características espectroscópicas de las antocianinas de Maíz morado

variedad Kulli
picoa compuesto tR Área [M]+ MS/MS
(min) (%) (m/z) (m/z)
1 cianidina-3-glucósido (mayor) 23.98 42,5 449 287
2 Aún no caracterizado 30.51 2,5 535 287
3 peonidina-3-glucósido 31.78 1,8 463 301
4 cianidina-3-(6"malonil)-glucósido (mayor) 33.57 30,7 535 287, 449
5 pelargonidina-3-(6"malonil)-glucósido 36.99 1,9 519 271, 433
6 cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucósido 37,82 2.6 621 287, 449
7 peonidina-3-(6"malonil)-glucósido 38,81 3,1 549 301, 463
a (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucósido 6,67 10,8 899 306, 449
a
enumerado de acuedo con Figura 8
Una purificación sucesiva de las fracciones obtenidas con HSCCC y análisis con
Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de las mismas, así como también
estudios preliminares sobre la capacidad antioxidante de los diferentes extractos y sustancias
purificadas se encuentran actualmente en curso
[92]
CONCLUSIONES
x La composición de antocianinas presente en los maíces originarios de Bolivia es muy
similar a la que presentan algunos mesoamericanos ya descritos en estudios anteriores.
x Las antocianinas mayoritarias identificadas en los granos de maíz de las variedades
estudiadas fueron la cianidina-3-glucósido y la cianidina-3-(6"malonil)-glucósido
respectivamente
x Las técnicas de cromatografía en contracorriente y HPLC son herramientas primordiales
para la extracción y caracterización de las antocianinas, ya que permiten una purificación y
separación a gran escala para la ejecución de estudios y análisis posteriores (por ejemplo
TEAC, DPPH, estudios de biodisponibilidad etc..); además de que permiten enriquecer y
concentrar componentes minoritarios para su completa elucidación.
x Por la naturaleza química de las antocianinas identificadas en las variedades de maíz
morado estudiados, su uso potencial sería como fuente de antioxidantes, más que como
colorantes naturales.
EQUIPOS Y PARÁMETROS
1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

a) analítica
Bomba: Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump
Detector: Jasco MD-910 Multiwavelength Detector
Inyector: Rheodyne 7125 con inyector de muestra de 20 µL
Degasificador: Jasco DG-980-50 3-Line Degaser
Software: Borwin-PDA Versión 1.0
Columnas: Luna 5 ȝ C18 (2), 250 × 4,6 mm (Phenomex, Aschaffenburg)
Synergi (250 x 4,6 mm, 5 µm), Phenomenex)
b) preparativa
Bomba: Knauer HPLC-Pump K-1001
Detector: Knauer K-2600 Variable Wavelength Monitor
Inyector: Knauer K-55960 con inyector de muestra de 200 µL
Software: Eurochrom 2000 para Windows V.2.05
Columna: Luna 5 ȝ C18 (2), 250 × 10 mm (Phenomex, Aschaffenburg)
2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

(LC-MS)
Equipo: Esquire-LC, Bruker Daltonics (Bremen); LC-ESI-MS/MS con Ion
Trap Mass Spectrometry
Software: HP ChemStation con EsquireControl, Análisis
Bomba: HP Series 1100 HPLC Pump G1312A BinPump
Detector: Merck Hitachi L-4000 UV Detector
Registrador: Shimadzu C-R6A Chromatopac
Inyector: Rheodyne 7725, on inyector de muestra de 20 µL
[93]
SISTEMA DE SOLVENTES (DISOLUCIONES) Y GRADIENTE

Disolución A: Agua/Acetonitrilo/Ácido fórmico 87:3:10 (v:v:v)
Disolución B: Agua/Acetonitrilo/Ácido fórmico 40:50:10 (v:v:v)
Flujo: 0,5 ml/min
Gradiente: 0 min 6% B, 20 min 20% B, 35 min 40% B, 40 min 60% B, 45 min
90% B, 55 min 6% B
3. HIGH SPEED COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY (HSCCC)
Equipo: High Speed modelo CCC-1000 Pharma-Tech Research Corporation,
Triplecoil;
Volumen total Triplecoil: 850 mL
Bomba: Jasco, Biotronik HPLC-Pump BT 3020
Detector: Knauer K-2501
Inyector : 20 mL
Fraccionador: Pharmacia LKB Super Frac Fraction Collector
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[95]

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MEMORIAS DEL ENCUENTRO FINAL ALFA LAGROTECH

Cartagena, Colombia, 21-26 de Septiembre de 2008.

ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS EN DIFERENTES

El objetivo principal es como mencionamos anteriormente buscar las vías de explotar el

número y orientación de los grupos hidroxilos y metoxilos. Un incremento en la hidroxilación

BIOSINTESIS DE LAS ANTOCIANINAS

Figura 2. Biosíntesis de Polifenoles (MACHEIX, FLEURIET und BILLOT, 1990)[12]

FACTORES QUE ALTERAN LA ESTABILIDAD DE LA ANTOCIANINA

Figura 3. Estructura de las antocianinas en función al pH

Figura 4. Maiz morado

Figura 5. Esquema de un equipo de HSCCC

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE ANTOCIANINAS A PARTIR DE MAÍZ MORADO

1) Extracción con MeOH:ácido acético

1) Adsorción en amberlita XAD-7

LC-MS/MS Extracto XAD-7 HPLC-DAD

Fraccionamiento con HSCCC

Control de pureza con HPLC

Purificación por medio de HPLC

Figura 6. Esquema de extracción y procedimiento de purificación de las antocianinas

Aproximadamente 100 g de grano entero de cada variedad fueron molidos con un

Separación del extracto XAD 7 por medio de cromatografía a contracorriente de alta

IDENTIFICACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS

Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades estudiadas

Tabla 3. Identificación y características espectroscópicas de las antocianinas de Maíz morado

1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

SISTEMA DE SOLVENTES (DISOLUCIONES) Y GRADIENTE

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