La tecnología de bio-265 (2018) 52-58

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la síntesis de oleato de etilo continua por las lipasas producidas por fermentación en estado sólido por
microsporus Rhizopus

Antonio Martínez-Ruiz una , Luz Tovar-Castro segundo , Hugo Sergio García do , Gerardo Saucedo-Castañeda una ,
Ernesto Favela-Torres una , •
una Departamento de Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Ciudad de México CP 09340, México
segundo Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Delegación Coyoacán, Ciudad de México

04960 CP, México

do Instituto Tecnológico de Veracruz, Calzada Miguel Ángel de Quevedo 2779, Col. Formando Hogar, Veracruz CP 91897, México

GRÁFICAMENTE ABSTRACTO

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

palabras clave: Las lipasas producidas por fermentación en estado sólido se utilizaron directamente como biocatalizadores para la síntesis continua de oleato de etilo en un
Las lipasas reactor de tanque continuamente agitado. El e ff ect de reutilización biocatalizador, relación molar de sustratos, velocidad de agitación y la velocidad de
éster etílico de estado sólido de alimentación en la esterificación fi Se investigaron catión de ácido oleico con etanol. El catalizador mantiene conversión del 90% para cuatro ciclos de proceso por
fermentación Fatty ácido
lotes con una relación 1: 2 molar (ácido oleico: etanol). La agitación mecánica a 200 y 300 rpm durante 12 h de reacción continua no una ff ect la conversión
microsporas Rhizopus
biocatalítica, conversiones permitiendo de sustrato mayor que 90% que se obtuvieron con 50 mM de ácido oleico en una relación molar de 1: 2 durante 14 h de
reacción. En contraste, la conversión de sustrato fue de 70% con 100 mM de ácido oleico en una Florida velocidad de flujo de 2 ml / min durante 25 h de reacción.
Estos resultados son prometedores y o ff er una alternativa técnica para el desarrollo de biocatalizadores accesibles que pueden ser utilizados en operaciones
continuas.

1. Introducción
Las lipasas (EC 3.1.1.3 acylhydrolases triglicéridos) son una de las clases más importantes de
enzimas utilizadas en la industria. En la actualidad, muchos ésteres se fabrican industrialmente
mediante procedimientos químicos; la participación de alta temperatura y / o alta presión; la cual di FFI
culto
esterificación fi cación de moléculas inestables tales como el ácido ascórbico, polioles y ácidos grasos
poliinsaturados ( Verma et al., 2008 ). En la naturaleza, las lipasas catalizan la hidrólisis de
triacilglicéridos en glicéridos parciales y sus correspondientes ácidos grasos y glicerol. Además, las
lipasas catalizan reacciones tales como esterificación fi catiónico, amidación y interesteri fi de cationes,
entre otros en los sistemas microaqueous ( Mouada et al, 2016.; Nomura
la

• Autor correspondiente.

Dirección de correo electrónico: favela@xanum.uam.mx (E. Favela-Torres).

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.05.080
Recibido el 27 de marzo de de 2018; Recibido en forma 19 de mayo 2018 revisado; 2018: ha aceptado 21 de mayo de
Disponible en línea el 23 de mayo de 2018

0960-8524 / © 2018 Publicado por Elsevier Ltd.

A. Martínez-Ruiz et al.
y Casida, 2016 ). En los años 1980 primeras lipasas fueron utilizados principalmente como aditivos en
detergentes y en los modi fi cación de triacilglicéridos ( Bornscheuer et al., 2002 ). Sin embargo,
muchas investigaciones han demostrado que las lipasas son correo ff biocatalizadores ectantes de
transesterificación fi reacciones de cationes para la producción de éster ( Selvakumar y
Sivashanmugam, 2017; Pires-Cabral et al., 2010; Adamczak y Bornscheuer, 2009 ). Los ésteres son
ampliamente utilizados en perfumes, cosméticos, disolventes, plastificantes, Florida avourings, y en la
medicina y en la industria farmacéutica ( Foresti et al., 2005; Mouada et al., 2016 ). En particular,
oleato de etilo es un éster con aplicaciones no sólo en la cosmética y la industria alimentaria, sino
también en la producción de modi fi ed triacilglicéridos y como aditivo para el biodiesel ( Salum et al.,
2008; Li et al., 2015 ).
El uso de lipasas para catalizar la síntesis de éster es una alternativa a los métodos
tradicionales de síntesis química, o ff Ering algunas ventajas importantes. La hidrólisis o la síntesis de
ésteres en condiciones suaves mejora la selectividad de la reacción; la disminución de reacciones
secundarias indeseables y evitando etapas de protección y desprotección en el procesamiento de
alimentos ( Verma et al., 2011 ). A pesar de estas ventajas, la principal limitación de los procesos
catalizada por lipasa es su alto coste ( Séverac et al., 2011 ). Para aplicaciones industriales, muchas
enzimas, incluidas las lipasas, son a menudo inmovilizados sobre soportes sólidos, para mejorar la
estabilidad de la enzima y permitir la reutilización de los biocatalizadores en virtud de lote repetido o
la operación continua. Esto conduce una reducción en los costos de operación y una relativamente
simple de recuperación de producto y biocatalizador. Sin embargo, la actividad enzimática general
producida puede ser reducido o perdido después de la extracción, puri fi procedimientos de cationes y
de inmovilización llevaron a cabo para obtener el biocatalizador inmovilizado; en consecuencia, la
producción de biocatalizadores inmovilizados puede ser más caro que utilizar directamente el
resultante, biocatalizador seco que contiene enzimas nativas ( Xiao-Jun et al., 2008 ). Con el aumento
en el desarrollo de aplicaciones lipasas, las lipasas fúngicas han ganado recientemente mucho
interés. Estos biocatalizadores se pueden producir ya sea por líquido o por fermentación en estado
sólido (SSF). Ventajas de ambos tipos de cultivos están bien documentados ( Shu y Yan, 2009;
Hölker et al., 2004 ). Una de las principales ventajas de la SSF para producir lipasas es que pueden
ser utilizados directamente como biocatalizadores después de secar el material fermentado sólido ( Martínez-Ruiz
exterior.
et al., 2008; Fernandes et al., 2007 ). Esta estrategia permite el uso de biocatalizadores bajo tanto por
lotes y operación continua. Desde el punto de vista industrial, continuo se prefiere sobre la operación
por lotes, debido a un mejor control del proceso y de rendimiento, y el aumento de la productividad ( H-Kittikun
et al., 2008 ).
El principal problema en la esterificación continua fi procesos catión es la acumulación de agua
producido a partir de la reacción ( Sánchez et al., 2000 ). Esta acumulación se invierte la dirección de
la reacción y promueve la hidrólisis en vez de reacciones de síntesis, que conduce a conversiones
bajas del sustrato ( Marty et al., 1997; Rahman et al., 2011; Kawakami y Takahashi, 2011; Lv et al.,
2017 ). relaciones de sustrato y concentraciones deben ser evaluados para conocer las condiciones
de reacción para obtener un rendimiento máximo del producto y la productividad. Por ejemplo, el
etanol usado como sustrato en esterificado fi cationes y transesterificación fi reacciones de cationes
tiene tres posibles e ff ECTS: 1) el desplazamiento del equilibrio de la reacción hacia la síntesis de
éster ( Romero et al., 2005 ), 2) la desnaturalización de la enzima ( Royon et al., 2007; Madalozzo et
al., 2014 ); y 3) el aumento de la inhibición competitiva por etanol ( Bousquet-Dubouch et al., 2001;
Madalozzo et al., 2014 ). Para reducir los inconvenientes asociados a la extracción, purificación fi cationes
y pasos de inmovilización de enzimas para reacciones enzimáticas continuas o semi continuos, el
objetivo de este trabajo fue evaluar las capacidades de un biocatalizador producido por fermentación
en estado sólido para la producción continua de oleato de etilo bajo di ff Erent condiciones de
funcionamiento. Para eso, los biocatalizadores sólidos eran fi producido rstly por fermentación de
estado sólido; una vez seco, se utilizó el biocatalizador para producir oleato de etilo bajo di ff relaciones
Erent de sustrato y concentraciones, así como sustratos Florida velocidad de flujo en condiciones
continuas.
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2. Materiales y métodos
2.1. microorganismos
El hongo termotolerantes microsporus (Rhizopus cepa 43aIV) fue proporcionado amablemente
por el Dr. J. L. Cordova de la Universidad de Guadalajara, México ( Mateos et al., 2007 ). La cepa se
propagó en patata-dextrosa-agar (PDA) cultivos inclinados (Bioxon) a 45 ° C durante 7 días y se
almacenó a - 20 ° C en 20% de glicerol.
2.2. Preparación del inóculo
Las esporas se usan para inocular el medio de estado sólido se produjeron en 250 ml
Erlenmeyer Florida pide que contiene 60 ml de PDA. Después de incubación a 45 ° C durante 7 días,
se añadió 50 ml de una solución 0,01% de Tween 80 a la Florida preguntar y agitado con un agitador
magnético durante 10 min para la recuperación de las esporas producidas. concentración de esporas
se estimó por recuento en un hemocitómetro Neubauer.
2.3. la composición del medio de cultivo
La composición del medio de cultivo utilizado para la producción de lipasa por SSF era la
siguiente (g / L): lactosa, 5; aceite de oliva, 40; urea, 4; K 2 HPO 4, 5; MgSO 4 · 7H 2 O, 1; alcohol de
polivinilo, 1,6; y la solución de oligoelemento, 4 ml / L ( Rodríguez et al., 2006 ). El pH inicial se ajustó
a 6,5 ​con HCl% 10 (v / v). La composición de la solución de oligoelemento fue la siguiente (g / L):
EDTA, 10; MnCl 2 · 4H 2 O, 1,98; Coso 4 · 7H 2 O, 2,81; CaCl 2 · 2H 2 O, 1,47; CuCl 2 · 2H 2 O, 0,17; ZnSO 4 · 7H 2
O, 0,29. Para disolver los componentes, el pH de esta solución se ajustó a pH 4 con HCl al 10%.
Todos los reactivos fueron de grado analítico de JT Baker. El medio de cultivo se utilizó sin
esterilización. La tasa de crecimiento rápido de esta cepa, junto con un inóculo pesado y un bajo
contenido de agua (véase más adelante), dejó que el cultivo se cultiva sin contaminación microbiana
2.4. producción de lipasa por SSF
Perlite (Dicalite, México) se utilizó como soporte inerte (IS). El material se molió para obtener un
tamaño de partícula de 0,8 - 1,19 mm, después se lavó dos veces con agua del grifo caliente y dos
veces con agua destilada fría, se secó a 60 ° C, y se almacena en bolsas herméticamente selladas.
El medio de cultivo inoculado (3 × 10 7 esporas / g es) se utilizó para impregnar la perlita para
alcanzar un contenido de humedad de 60%. Veinte gramos de esta mezcla fueron colocados en
columnas de vidrio (2,0 cm de diámetro y 20 cm de longitud) y se incubaron a 45 ° C en un baño de
agua durante 20 h, para alcanzar la actividad máxima de la lipasa. Se utilizó una tasa de aireación de
40 ml / min por columna. Se midió la actividad de la lipasa, usando un método colorimétrico basado
en la formación de jabones de cobre de ácidos grasos libres, la metodología descrita anteriormente
por Rodríguez et al. (2006) .
2.5. Producción de biocatalizador
Para producir el biocatalizador, el material sólido fermentado con actividad de la lipasa contenida
en las columnas de vidrio se secó con un aire seco Florida velocidad de flujo de 1000 ml / min durante 24
h a 30 ° C hasta peso constante (contenido de humedad inferior al 1% w / w). Después de que el
material sólido seco fue tomada de las columnas de vidrio y se utiliza como biocatalizador seco.
2.6. esterificación fi de cationes de ácido oleico y etanol
la esterificación fi reacciones de cationes para producir oleato de etilo se llevaron a cabo con norte- hexano
(Baker) como disolvente. El ácido oleico (Baker) y etanol anhidro (Técnica Química, México), disuelto
previamente en norte- hexano, se utilizaron como sustratos. Todos los reactivos se deshidrataron
previamente usando tamices moleculares (Tipo 4A, Fluka).
la esterificación fi reacción de cationes se realizó en un 1 L continuamente
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reactor de tanque agitado (CSTR, Applikon 1025 modelo ADI) con un diámetro interno de 9,5 cm y un
volumen de operación de 0,7 L. El reactor tenía una turbina Rushton situado a 2,5 cm de la parte
inferior, ba dos 1 cm equidistante ffl ES y un sistema de bobinas para controlar la temperatura del
medio de reacción. La alimentación de los sustratos se controló con un Cole Palmer Maestro Florida ex
® bombear L / STM. El volumen de reacción se mantuvo constante mediante el drenaje del medio
con un segundo maestro Cole Palmer Florida ex ®

bombear L / STM. Se tomaron muestras (0,5 ml) a intervalos de tiempo regulares de la salida del reactor.
Para detener la esterificación fi reacción de cationes, las muestras se colocaron en tubos de 1,5 ml que
contienen 1 ml de HCl 6M.
Para evaluar las condiciones de funcionamiento del 1 L CSTR bajo alimentación de sustrato
continuo, los sustratos eran fi primero alimentados a una relación ácido / etanol oleico de 1: 5 con 50
mM de ácido oleico en una Florida velocidad de flujo de 2 ml / min. Para iniciar el reactor, se
añadieron 125 ml de cada sustrato y pre-incubó a 45 ° C. Para iniciar la reacción, se añadieron 37,5
g de biocatalizador.

2.7. esterificado por lotes sucesivos fi catión

Se evaluó el número de lotes sucesivos en 50 ml viales serológicos. los fi primer lote se llevó a
cabo con 1,5 g de biocatalizador y 5 ml de los sustratos de la reacción (ácido oleico 50 mM y etanol
250 mM). Para evaluar el correo ff ect de la relación ácido / etanol oleico en la esterificación fi reacción
de cationes, la fi ensayo de lote primero se llevó a cabo con una relación ácido / etanol oleico de 1: 5,
con una concentración de ácido oleico de 50 mM. Para los siguientes lotes sucesivos, la
concentración de ácido oleico se mantuvo constante y la concentración de etanol fue cambiado de 50
a 250 mM. Para llevar a cabo el segundo lote, el medio de reacción sin biocatalizador se eliminó
completamente a partir de la Florida preguntar y se añadieron 5 ml de sustratos frescos. Los viales
serológicos se incubaron a 45 ° C y 250 rpm en un agitador orbital. Se tomaron muestras (0,5 ml) a
intervalos de tiempo regulares. La reacción se detuvo con la adición de 1 ml de HCl 6M.

Figura 1. mi ff ect de la relación molar de sustratos en la esterificación fi conversión de cationes de ácido oleico
en lotes sucesivos. Las condiciones eran: 1,5 g de biocatalizador, la temperatura de 45 ° C: (a) relación
molar 1: 1 ( △), 1: 2 ( □), 1: 4 ( ♢), 1: 5 (X), (b) E ff ect de la adición de tamices moleculares en la esterificación fi reacción
Todos los resultados se obtuvieron por triplicado a partir de reacciones independientes.
de cationes con relación molar de sustratos 1: 1. 0,5 g ( △), 1,0 g (x), 1,5 g (-), 2,5 g ( ○), 3,5 g ( ♢).

2.8. El análisis de ácidos oleico

El ácido oleico se analizó por un método espectrofotométrico basado en la reacción de ácido previamente reportado ( Martínez-Ruiz et al., 2008 ). Para relaciones ácido / etanol oleico de 1: 5 y 1:

oleico con el reactivo de cooper-piridina como se ha descrito previamente ( Martínez-Ruiz et al., 2008 ). 4, el comportamiento fue similar; la obtención de conversiones de ácido oleico de 77% en el ensayo

conversión de sustrato se calculó a partir de la inicial y fi concentraciones NAL ácido oleico, y la tasa por lotes sucesivos siguientes cuatro Esta reducción en la conversión de sustrato puede ser debido a

de conversión corresponde al sustrato consumido por la velocidad de alimentación del sustrato. la falta de estabilidad de la enzima a concentraciones de etanol por encima de 200 mM ( Nie et al.,
2006; Min-Guan et al., 2016 ). En contraste, con una relación 1: 1molar, la conversión del sustrato en
el segundo lote aumentó a 94% y se redujo a 51% en los siguientes lotes sucesivos ( Figura 1 una).
Esta reducción en la conversión de sustrato puede ser causada por el contenido de agua en la

2.9. análisis de contenido de humedad

reacción de mezcla conducir el equilibrio hacia la hidrólisis del éster producido ( Rahman et al., 2011 ).
Para eliminar el agua formada durante la reacción, di ff cantidades Erent (0,5 - se añadieron 3,5 g) de

El contenido de humedad del medio sólido y el biocatalizador se determinó gravimétricamente a tamices moleculares (Tipo 4A, Fluka).

130 ° C hasta peso constante usando un analizador de humedad (OHAUS MB45; repetibilidad SD de
0,015 - 0,05%).

3. Resultados y discusión La presencia de 3,5 g de tamices moleculares se permiten las conversiones de sustrato hasta
un 96% después de 30 minutos de la conversión con ácido oleico (50 mM) a una relación ácido /

El biocatalizador utilizado para la síntesis de oleato de etilo fue producida por fermentación en etanol oleico de 1: 1 ( Figura 1 segundo). Sin embargo, para mantener esta conversión de sustrato en

estado sólido con perlita como soporte inerte. El contenido de agua bajo en el biocatalizador (menos los siguientes lotes sucesivos el tamiz molecular debe ser reemplazado por tamiz molecular

de 1% w / w) permitió la enzima para mantener su estructura, Florida flexibilidad y la actividad deshidratado. En contraste, pizca de ácido oleico (50 mM) a una relación ácido / etanol oleico de 1: 2,

catalítica, por lo que se puede aplicar en las reacciones catalizadas por lipasas en disolventes no la conversión del sustrato después de 4 lotes sucesivos era hasta el 96% sin cambio ni adición de

polares ( Bornscheuer et al., 2002 ). tamiz molecular deshidratado. Esta positiva e ff ect de un exceso de alcohol en la esterificación fi reacción
de cationes se ha demostrado.

Fernandes et al. (2007) utilizaron una lipasa producida por SSF para catalizar la esterificación fi de
3.1. esterificación fi cationes en lotes sucesivos
cationes de ácido oleico con etanol, estudiaron di ff relaciones molares Erent de sustratos manteniendo
constante la concentración de ácido oleico (70 mM). Ellos informan de sus mejores resultados (94% de
El exceso de etanol en el fi lote primer permitió a los esterificación fi cationes de ácidos grasos
conversión después de 18 h de reacción) cuando la relación de los sustratos es de 1: 5, es decir, el
libres residuales (principalmente palmítico, esteárico, oleico y linoleico) presentes en el biocatalizador
etanol es en exceso. En un estudio previo, Marty et al. (1997) informar de un comportamiento similar.
( Baccouri et al., 2008 ). Durante el fi ensayo de lotes primera, 90% de conversión de ácido oleico se
Utilizan la lipasa comercial Lipozyme ™ para catalizar la síntesis de acetato de
logró después de 60 min de incubación a 45 ° C ( Figura 1 ). Esta conversación es similar a la

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A. Martínez-Ruiz et al.
Figura 2. mi ff ect de la concentración de sustrato en la esterificación fi conversión de cationes de ácido oleico en
lotes sucesivos. Las condiciones eran: 1,5 g de biocatalizador, la temperatura de 45 ° C y la relación molar inicial
de 1: 5 ( ♢), concentración de ácido oleico, relación molar 1: 2, 50 mM ( □), 70 mM ( △), 90 mM (×), 100 (+), 150 mM ( ○). min. 50 mM de ácido oleico, 250 mM de etanol y 37,5 g de biocatalizador, velocidad de agitación de 300 rpm.
oleato de norte- hexano. Ellos informan de 80% de conversión a la concentración de sustratos de 50
mM para el ácido oleico y 100 mM de etanol (proporción de 1: 2molar).
Este resultado es signi fi bisela por dos razones: 1) Con la metodología empleada, se alcanzaron
altas conversiones que se mantuvo constante durante cuatro lotes sucesivos, y no e adversos ff ECTS
debido a la acumulación de agua, o inhibidor e ff Se observaron ECTS de altas concentraciones de
etanol. 2) El biocatalizador era estable y podría ser reutilizado sin signi fi pérdida de peralte de la
actividad, lo que abre la posibilidad de su aplicación en los procesos de funcionamiento continuo.
3.2. mi ff ect de concentración de sustratos sobre los esterificación fi cationes en lotes sucesivos
Para aumentar la concentración de producto, se evaluaron las concentraciones de ácido oleico
más altas, manteniendo la relación de ácido / etanol oleico a 1: 2. Como anteriormente, el lote inicial
para todos los estudios se realizó con una proporción 1: 5molar. En el segundo lote, la concentración
de ácido oleico aumentó de 50 a 300 mM. Las conversiones de ácido oleico más alto (por encima de
90%) se obtuvieron a los 50 y 70 mm concentraciones de ácido oleico ( Figura 2 ). A pesar de utilizar
una proporción de 1: 2molar, una concentración de etanol por encima de 150 mM demostró una
perjudicial e ff ect en la estabilidad de la lipasa. Esta negativa correo ff ect se revela por la reducción en
la conversión de sustrato e FFI ciencia a concentraciones de ácido oleico mayor que 70 mM de la
segunda a la cuarta lote.
3.3. esterificación continua fi catión
La conversión de ácido oleico tras 80 minutos bajo las operaciones por lotes fue del 80%.
Después de alimentar el reactor a 2 ml / min durante 4,5 h, la conversión del sustrato se redujo a
71% ( Fig. 3 ). Esta reducción en la conversión e ffi-
deficiencia se atribuye a la inhibitoria e ff ect de etanol a la concentración utilizada (250 mM); por eso,
el biorreactor se hizo funcionar en las mismas condiciones con una relación ácido / etanol oleico de
1: 2 y una concentración de ácido oleico en 50 mM ( Fig. 4 ).
El reactor se comenzó con una relación 1: ácido / etanol oleico 5 en condiciones discontinuas durante
2 h, la consecución de una conversión de sustrato de 90%. Después de eso, sustratos, en una proporción
de 1: 2, fueron alimentados a una Florida velocidad de flujo de 2 ml / min durante 12 h ( Fig. 4 ). En
condiciones de proceso por lotes, 88% de conversión se logró después de 120 minutos de reacción.
Cuando los sustratos se alimentaron continuamente en el reactor, se observó un período de 2 h de
inestabilidad con una ligera reducción en la conversión de sustrato; sin embargo, después de eso, la
conversión de sustrato se mantuvo casi constante (90 ± 5%) para los siguientes 10 h de operación,
correspondiente a fi cinco tiempos de residencia. Los estudios previos de síntesis de oleato de etilo usando
LipozymeTM como biocatalizador mostraron que el sustrato (50 mM de ácido oleico y etanol 100 mM)
conversión cayeron de
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La tecnología de bio-265 (2018) 52-58
Fig. 3. esterificación fi de cationes en un reactor continuo de tanque agitado a 45 ° C a una Florida velocidad de flujo de 2 ml /
Fig. 4. esterificación fi de cationes en un reactor continuo de tanque agitado a 45 ° C a una Florida velocidad de flujo de
2 ml / min. 50 mM de ácido oleico y 37,5 g de biocatalizador. El ácido oleico inicial: relación molar etanol fue de 1: 5
seguido de 1: 2 (flecha); velocidad de agitación de 300 rpm.
80 a 36% después de 30 h de reacción con una Florida velocidad de flujo de 0,2 ml / min ( Marty et al.,
1997 ). Una reducción similar se ha observado usando lipasas inmovilizadas en PDMS ( Li et al., 2015 ).
El e ff ect de di ff parámetros Erent implicados en lipasa reacción catalizada para sintetizar diversos
ésteres de oleato depende del tipo de las condiciones de lipasa y operacionales ( tabla 1 ).
3.4. mi ff ect de velocidad de agitación
Para evaluar la pérdida de actividad del catalizador debido a los daños mecánicos, se
estudiaron tres velocidades de agitación: 200, 300 y 400 rpm ( Fig. 5 ). conversión de sustrato
disminuyó de 93% a 77% después de 10 h de reacción a 400 rpm. Esta reducción es probablemente
causado por la fuga de la enzima a altas velocidades de agitación. Se obtuvieron resultados similares
durante la reacción de aceite de palma y el alcohol oleico usando Lipozyme RM IM ( Keng et al., 2008 ),
En el que la conversión del sustrato se redujo de 98,5% a 80% en 5 h cuando la velocidad de
agitación se aumentó de 250 a 450 rpm. Sin embargo, la conversión de sustrato se mantuvo casi
constante (90 ± 7%) a 200 y 300 rpm; la conversión de sustrato siendo ligeramente inferior a 200
rpm. El aumento de la conversión del sustrato como una función de la velocidad de agitación es
causado probablemente por un aumento sustancial en la zona interfacial entre el sustrato y la
enzima, como el tamaño de partícula se reduce ( Al-Zuhair et al., 2003; Noor et al., 2003 ).
De los resultados obtenidos, la velocidad de agitación se mantuvo a 300 rpm para evaluar la e ff ect de la
velocidad de alimentación y las concentraciones de sustrato en la conversión de sustrato. La masa Florida velocidad
de flujo se incrementó por el aumento de la concentración de ácido oleico de 12,5 a 100 mM y la Florida velocidad
de flujo de
1,1 a 9.03mL / min, con una relación 1: ácido / etanol oleico 2. Este conjunto de
A. Martínez-Ruiz et al. La tecnología de bio-265 (2018) 52-58

Karra-Chaabouni et al. (2008)

Kantak y Prabhune (2012)
Madalozzo et al. (2014)

Madalozzo et al. (2014)

Ghamgui et al. (2007)

Kanwar et al. (2007)

Foresti et al. (2005)
Bi et al. (2016)
Li et al. (2015)

Li et al. (2008)
Fuente

90 en 14 h de operación continua Este trabajo

Fatty conversión de ácido (%)

92.6 en 14 h

86.4 en 40 h
34 en 30min

80 en 30min
86.5 en 2 h

66 en 24 h
83 en 50 h

58 en 18 h

Fig. 5. mi ff ect de velocidad de agitación en la esterificación fi reacción de cationes en un reactor continuo de tanque
80 en 3 h

80 en 4 h

agitado de 1 litro a 45 ° C y una Florida velocidad de flujo de 2 ml / min. contenido de ácido oleico era 50 mM, y se

añadieron 37,5 g biocatalizador. ácido oleico inicial: relación molar de etanol de 1: 5 se utilizó seguido por 1,2 (flecha)

en: 200 ( □), 300 ( △) y 400 ( ♢) rpm.

terc butanol
norte- heptano

norte- nonano
norte- hexano

norte- hexano
Solvente

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Ninguna

condiciones permitieron la masa Florida velocidad de flujo de ácido oleico y etanol para ser mantenida constante a

una tasa de alimentación de ácido oleico de 0.1125mmol / min.

El cambio en la Florida velocidad de flujo está relacionado con el tiempo de residencia. Cuando se
aumenta el tiempo de residencia, el contacto entre los substratos y lipasas es más largo, lo que resulta
conversión de sustrato a partir de di ff alcoholes Erent y ácido oleico a ésteres de oleato por reacciones de lipasa catalizada en presencia de di ff disolventes orgánicos Erent. preparación de lipasa

en altas conversiones. Sin embargo, los datos mostraron poca di ff erences para el fi primeros tres niveles,
con concentraciones de ácido oleico de 12,5, 25 y 50 mM, y Florida velocidades de flujo de 9,03, 4,05 y
Éster producido, la relación molar de ácido graso a alcohol y régimen de funcionamiento

2.01mL / min, respectivamente ( Fig. 6 una). conversiones ácido oleico se mantuvo bastante constante
a 85% durante 14 h de reacción. conversión de sustrato fue signi fi cativamente reduce en la
concentración de ácido oleico más alto empleado. Esta reducción se atribuyó a la inhibición causada
por la alta concentración de etanol (200 mM) en la alimentación. Dadas las características del
catalizador producido por SSF, este es un resultado importante ya que permite la operación a
relativamente alto Florida velocidades de flujo (9.03mL / min) con alta conversión e FFI eficiencia (85%).
Esto es contrario a lo que se ha informado para la producción de biodiesel por isopropanolysis por
Novozyme 435 en un reactor de lecho empacado, mediante el cual un aumento de la Florida velocidad
de flujo de 0,1 ml / min a 1,0 ml / min causó una disminución en la conversión de 80% a menos del
Etil-oleato, 1: 2, en continuo
Butil-oleato, 1: 1 en el lote
Etil-oleato, 1: 4, en el lote

20% ( Chang et al., 2009 ). Sin embargo, es posible que la enzima y los sustratos no estaban en
Etil-oleato, 1: 1,4, en lote

Etil-oleato, 1: 1,4, en lote

Metil-oleato, 1: 1, en lote
Oleil-oleato, 1: 1, en lote

Butil-oleato, 1: 1, en lote
Etil-oleato, 1: 1, en lote

Etil-oleato, 1: 1, en lote

Etil-oleato, 1: 1, en lote

contacto durante el tiempo suficiente, y por lo tanto la conversión fue menor. Con el fin de verificar
esto, una interrupción en el Florida velocidad de flujo fue impulsada después de 11 h de reacción con
100 mM de ácido oleico. Después de 11 h de operación de la Florida velocidad de flujo se incrementó a
1,5 ml / min y se redujo gradualmente a 0,8 ml / min. Después de eso, la Florida velocidad de flujo fue
restaurado a 1,1 ml / min ( Fig. 6 segundo). El aumento en Florida velocidad de flujo reduce la
conversión considerablemente sustrato, a 10%; que era similar a los datos informados por Chen et al.
(2009) . La reducción de la Florida velocidad de flujo a 0,8 ml / min produjo una conversión de sustrato
de 85%; Sin embargo, una vez que el Florida velocidad de flujo fue restaurada a su valor inicial de la
conversión del sustrato alcanza el mismo valor que la observada antes de la perturbación de la
reacción. Por lo tanto, la reducción de la conversión de sustrato a una concentración de ácido oleico
de 100 mM se atribuyó a limitaciones cinéticas y no a etanol inhibición.
lipasa inmovilizada de hidrogel sintético de Bacillus coagulans MTCC-6375
lipasa de Yarrowia lipolytica inmovilizado en PDMS-modi fi no tejido ed

La lipasa recombinante de R. oryzae inmovilizado sobre Accurel MP 1000

lipasa recombinante de R. oryzae inmovilizado sobre Accurel MP 1000

Candida rugosa lipasa (CRL) inmovilizada sobre resina macroporosa

R. oryzae lipasa inmovilizada en partículas de soporte de biomasa

R. oryzae lipasa inmovilizada sobre la celulosa oxidada fi bras

Para determinar la estabilidad operativa del reactor, que se hizo funcionar durante un período
Rhizopus microsporas lipasa inmovilizada de forma natural

más largo de tiempo (25 h). Para ese propósito, las condiciones fueron las siguientes: una
concentración de ácido oleico de 50 mm con una relación 1: ácido / etanol oleico 2, una Florida velocidad
R. oryzae lipasa inmovilizada sobre CaCO 3

de flujo de 2 ml / min y una velocidad de agitación de 300 rpm. La conversión de sustrato fue casi
constante (de 78% a 82%) durante el 23 h de operación bajo alimentación continua. Estos niveles de
Puri fi ed lipasa de R. oryzae

conversión son similares a los reportados para lipasas comerciales que catalizan di ff reacciones Erent
que operan en modo continuo en los reactores con lecho empacado ( Sánchez et al., 2000; Chang et
al., 2009; Chen et al., 2009; Juntao et al., 2017 ); Sin embargo, eran más altos que en algunos casos
Novozyme 435

viscosa

reportados ( Oliveira et al., 2000; H-Kittikun et al., 2008; Dang-Thuan et al.,

tabla 1

56
A. Martínez-Ruiz et al.
Fig. 6. mi ff ect de la concentración de ácido oleico en la esterificación fi reacción de cationes en un reactor continuo
de tanque agitado de 1 litro a 45 ° C y 37,5 g de biocatalizador. ácido oleico inicial: relación molar etanol fue de 1: 5
seguido de 1,2. La velocidad de agitación fue 300 rpm, la concentración de ácido oleico de: (a) 12,5 ( ♢), 25 ( □) y 50 ( △)
mM, (b) ácido oleico 100 mM, con perturbación en Florida ow tasa hizo después de 11 h de operación (flecha).
2016 ).
4. Conclusiones
El biocatalizador producido por microsporus Rhizopus por SSF sin más puri adicional fi de
cationes y la inmovilización se utilizó para producir oleato de etilo bajo de estado continuo. Las
condiciones de reacción permitidas para altas conversiones e impidieron el inhibidor e ff ECTS de
etanol. La estrategia diseñada para la producción y la aplicación de la preparación de lipasa mostró
que el biocatalizador inmovilizado, naturalmente, no era signi fi cativamente una ff ected por la
velocidad de agitación o la velocidad de alimentación. El catalizador era estable y mantiene su
actividad durante largos períodos de tiempo con altas tasas de conversión y podría ser utilizado para
operar bajo por lotes, por lotes sucesivos o condiciones continuas.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). Los
autores agradecidamente gracias Dr. Jesús A. López Cordova para la cepa de Rhizopus utilizado en
este trabajo.
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