FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CURSO FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA

BIOL024

LABORATORIO DE ENZIMAS
Primer Semestre 2019

INTRODUCCIÓN
 La bioquímica de las células se regula de tres maneras: utilizando catalizadores proteicos
llamados enzimas, acoplando reacciones exergónicas y endergónicas y utilizando moléculas
portadoras de energía que transfieren energía dentro de las células. Una energía de activación
elevada hace lentas muchas reacciones, incluso las exergónicas, a un ritmo imperceptible en
condiciones ambientales normales. Los catalizadores disminuyen la energía de activación y así
aceleran la velocidad de las reacciones químicas, sin sufrir ellos mismos cambios permanentes. Los
organismos sintetizan catalizadores proteicos que catalizan reacciones específicas. Los reactivos se
unen temporalmente al sitio activo de la enzima y así permiten la formación de los nuevos enlaces
químicos que darán origen a los productos. La actividad de las enzimas dependerá de factores tales
como la temperatura, el pH, la concentración de sustratos.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:

- por la cantidad de sustrato que desaparece en una unidad de tiempo
- por la cantidad de producto que aparece en una unidad de tiempo.

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato

[S] y de la concentración de enzima [E] en la cinética de la enzima alfa-Amilasa salival, en su
acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del
almidón en la unidad de tiempo, mediante el seguimiento de la desaparición del color que produce
el almidón con el yodo presente en una solución de Ioduro de potasio (Reactivo de yodo).

Propiedades del almidón.

El almidón es el polisacárido de reserva más abundante en vegetales y constituye la principal

fuente de nutrición glucídica para la humanidad. Los almidones están constituidos por una mezcla
de dos componentes:
- alfa-amilosa: cadena lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces α(1→4)
(Figura 1a).
- amilopectina: cadena lineal de D-glucosa unidas por enlaces tipo α(1→4) con numerosas
ramificaciones α(1→6). El polímero contiene unas 1000 unidades de glucosa (Figura 1b).

Figura 1a. Amilosa Figura 1b. Amilopectina

La proporción en que se mezclan la alfa-amilosa y la amilopectina para formar el almidón depende

de la especie vegetal en que aparece el almidón.

La alfa-amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria

característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de hélice comprende seis unidades glucosa.
Esta estructura secundaria, en la que los grupos hidroxilo quedan hacia afuera, permite que el iodo,
al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la disolución una coloración azul violácea intensa
característica que permite la identificación positiva de trazas de almidón (Figura 2).
 Figura 2: Estructura de la alfa-amilosa y su interacción con yodo.

Hidrólisis del almidón.

El almidón puede hidrolizarse por medios químicos o enzimáticos.

La ebullición con ácidos o álcalis hidroliza aleatoriamente los enlaces glucosídicos entre unidades
de glucosa, dando polisacáridos de longitud intermedia denominados dextrinas, cada vez menores
hasta la obtención de unidades de glucosa individuales.
Los compuestos que se obtienen en la hidrólisis del almidón y el color que producen con el yodo
son los siguientes:
- Almidón (azul).
- Amilodextrinas (violeta).
- Eritrodextrinas (rojo).
- Acrodextrinas (incoloro*).
- Maltosa (incoloro*).
- Glucosa (incoloro*).

* Tener en cuenta el ligero color amarillo propio del yodo.

El almidón también puede hidrolizarse enzimáticamente. Una de las enzimas que hidrolizan el
almidón es la amilasa, que se halla presente en el jugo pancreático y la saliva. Esta enzima ataca al
azar los enlaces alfa (1→4) del interior de la cadena. Así, rinde finalmente unidades de glucosa libre
y de maltosa (Figura 3). La amilasa no ataca los enlaces alfa (1→6), base de las ramificaciones de la
amilopectina. Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otra enzima desramificadora.

La amilasa salival es una proteína enzimática presente en la saliva. Como toda enzima, la acción
que ejerce sobre su sustrato (almidón) depende de una serie de parámetros: pH, temperatura,
concentración de enzima.
Figura 3. Degradación del almidón por la acción de la enzima Amilasa

OBJETIVOS

Objetivo General

Analizar la actividad de la enzima amilasa salival.

Objetivos Específicos

1. Conocer la reacción catalizada por la amilasa salival.

2. Identificar el efecto de la concentración de enzima sobre la actividad catalítica de la amilasa
salival.
3. Identificar el efecto del pH en la actividad de la amilasa salival.
4. Relacionar los temas tratados en clase con los experimentos realizados en esta actividad
práctica.
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INFORME DE LABORATORIO
ENZIMAS
Primer Semestre 2019

Alumnos :
Sección :
Fecha de entrega :
Puntaje Total: 12,5 puntos

Puntaje Obtenido: ________

Nota

ACTIVIDADES

Instrucciones

• Siga atentamente el procedimiento detallado en cada actividad experimental.

• En este laboratorio, debido a que la reacción con el reactivo de yodo es muy dependiente de
la cantidad de reactivo utilizado, cualquier diferencia, por mínima que sea, en la cantidad de
reactivo utilizado, generará cambios en la intensidad del color, lo que alterará los resultados
obtenidos. Por este motivo, al agregar este reactivo se debe asegurar que a todos los tubos de cada
serie se les agregue la misma cantidad de reactivo, esto es, 2 gotas. Si en algún tubo se le agregara
una o dos gotas más, se debe corregir el error agregando a todos los demás tubos de la serie, las
gotas que falten para que todos tengan la misma cantidad.

ACTIVIDAD 1: OBTENCIÓN DE LA SOLUCIÓN DE AMILASA SALIVAL

PROCEDIMIENTO:

1. Mastique un trozo de papel absorbente para estimular la salivación.

2. Enjuague la boca con agua destilada y recolecte los líquidos segregados sobre un vaso
precipitado, hasta recoger la suficiente cantidad de solución de enzima para realizar la práctica
(mínimo 30 mL).

ACTIVIDAD 2: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

PROCEDIMIENTO:

1. Tome 5 tubos de ensayo, rotúlelos colocando un 0 al control y los demás los números del 1 al 4,
añada a cada uno 2 mL de solución de almidón al 1 %.
2. Agregue la cantidad de agua destilada indicada, para completar el volumen, según la tabla
siguiente.
3. Por último, añada a cada tubo de 1 a 4 mL de disolución de la enzima según aparece en la tabla.
Es importante que añada primero el agua y luego la solución de la enzima, pues de lo contrario la
reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido.
Inmediatamente después de adicionar la solución de la enzima al último tubo ponga en marcha el
cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento. Incube por 10 minutos a 37°C en
baño termorregulado.
TUBO Nº 0 1 2 3 4
SOLUCIÓN DE ALMIDÓN 1 (mL
2 2 2 2 2
% )
(mL
AGUA DESTILADA 4 3 2 1 -
)
(mL
SOLUCIÓN DE ENZIMA - 1 2 3 4
)
4. Luego de transcurrido el tiempo de incubación, saque los tubos del baño a 37°C y agregue a cada
tubo 2 gotas de reactivo de yodo para verificar la reacción enzimática. Recuerde que el reactivo
de yodo se unirá al almidón sin hidrolizar, por lo tanto, cuando haya más reacción enzimática,
se observará MENOS color, ya que el almidón habrá sido hidrolizado por la enzima y
dejará de tener su estructura helicoidal que interactúa con el iodo.
5. Observe el color para cada tubo de ensayo y dibuje los resultados obtenidos en la tabla siguiente,
de manera que se refleje la diferencia de la intensidad del color observada (puede usar números
que indiquen intensidad, por ejemplo: del 1 al 5, siendo el 1 de menor intensidad y 5 el de mayor
intensidad).

TUBO Nº 0 1 2 3 4

Intensidad de color observado:

(2,5 puntos)

6. Analice sus resultados y concluya respecto al efecto de la cantidad de enzima sobre la

degradación del almidón.

Conclusiones:

(5 puntos)
7. Exprese en un gráfico el efecto de la concentración de enzima sobre la hidrólisis del almidón,
colocando en el eje x la cantidad de enzima agregada en cada tubo (y que están en la siguiente
tabla), y en el eje Y, el producto obtenido (basándose en el color observado en cada tubo luego
de la reacción enzimática).

TUBO Nº 0 1 2 3 4
Cantidad de enzima agregada
(mL) 0 1 2 3 4
(eje x)
Producto obtenido
(eje y)

(5 puntos)

Dibuje su gráfico aquí:

(5 puntos)
ACTIVIDAD 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH.

1. Tome 5 tubos de ensayo, rotúlelos del 1 al 5 y añada 2 mL de HCl 0,2M, NaOH 0,1M y/o
agua destilada, según se indica en la siguiente tabla.

2. Añada a cada tubo 2 mL de solución del enzima (menos a los tubos 4 y 5).

3. En último lugar añada a cada tubo 2 mL de la solución del almidón al 1%.

4. Incube por 10 minutos a 37°C en baño termorregulado.

5. Luego de transcurrido el tiempo de incubación, saque los tubos del baño a 37°C y agregue 2
gotas de reactivo de yodo para verificar la reacción enzimática. Observe y anote el color
para cada tubo ensayado en la tabla anterior.

TUBO Nº 1 2 3 Control Control

1 2
(m -
HCl 0,2M L 2 - - 2
)
(m
AGUA DESTILADA L - 2 - 2 2
)
(m
NaOH 0,1M L - - 2 - 2
)
(m
SOLUCIÓN DE ENZIMA L 2 2 2 - -
)
(m
SOLUCIÓN DE ALMIDÓN 1 % L 2 2 2 2 2
)

Color observado:

(2,5 puntos)

3. Analice sus resultados y concluya respecto al efecto del pH sobre la degradación del
almidón y responda las siguientes preguntas:

a. ¿Cuál es la explicación de los resultados obtenidos a pH extremos?

 (3 puntos)

b. ¿Por qué se hacen los tratamientos de los tubos 4 y 5?, ¿para qué sirven?

(3 puntos)

c. ¿Qué sucede con la amilasa salival cuando Ud. traga el bolo alimenticio y éste llega
al estómago?

(4 puntos)

Conclusiones:

(5 puntos)