Guia N°4(cuatro)

CENTRO NACIONAL DE Monitoria grupo 4

HOTELERIA,TURISMO Y ALIMENTOS
Identificación de bacillus cereus Fecha: 17/10/2012
Método siembra por extensión Pag:1

PRÁCTICA

DETERMINACIÓN DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN

Es ubicuo se puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e

industrializados Cuando se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica
aparéntese empezó a asociar a alimentos en los años 50.

En los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados pero si se
dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas, conviene
enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración.

En la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no son
esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la posterior
germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser detectado.

Alimentos que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras,
sopas, salsas, ensaladas, arroz hervido.

Según la norma TNC4679 BACILLUM CEREU gran positivo que puede esporular
forma colonias características en la formación de un medio de cultivo selectivo y
da reacciones de confirmación positiva bajo las condiciones especificadas en esta

2. OBJETIVO

Detectar la presencia de colonias de esta bacteria en los alimentos en alimentos.

TECNICA

Se funde el medio de base y se mantiene en un baño de agua regulado entre 45

c+ 2 c se añaden los otros componentes mezclando bien de cada adición se
mantiene el medio cultivo completo de agua 45c

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PREPARACIÓN DE LAS PLACAS

 Se vierten porciones de 15 ml a 20 ml del medio MYP en cajas de petri

estériles y se deja solidificar
 Las cajas petri pueden conservarse antes de secarse a cinco grados
centígrados durante cuatro días como máximo
 Inmediatamente antes utilizarse, se secan con la superficie de agar hacia
abajo en la incubadora aun temperatura de 37 grados centígrados hasta
que la superficie de agar este seca

Utlizaremos la tecnica siembra por extencion que la que nos indica la imagen en la
parte de abjo

http://www.google.com.co/imgres?um=1&hl=es&biw=1024&bih=678&tbm=isch&tbnid=FhXXVwBT8X8xbM:&imgrefurl=
http://www.oocities.org/r

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3. MEDIOS DE CULTIVO

 Medio de base 90 ml
 Solución de poliximina B
 Emulsión yema de huevo

Para esta práctica utilizaremos MYP (OXID)

MATERIALES Y EQUIPOS
Contador de colonias
Incubadora
Cajas Petri
Erlenmeyer
Tubos de ensayó
Asa de vidrio
Probeta

PROCEDIMIENTO

Transferir 10 mL de la dilución 1:10 a 90mL de diluyente, mezclar bien y continuar

hasta llegar a la dilución 10-4Inocular por duplicado placas de agar MYP (o de
medios de cultivo equivalentes) con 0.1mL de cada una de las diluciones de la
muestra y extender con varilla estéril. Incubar las placas a 30˚C/24 horas.

Observar si existe la presencia de colonias rodeadas por zonas claras que indican
la presencia de la lecitinasa. Las colonias de B. cereus en agar MYP generalmente
son de color rosa, el cual se intensifica conforme continua la incubación.

En agar selectivo para B. cereus (OXOID), las colonias presentes presentan un

tamaño aproximado de 5mm de diámetro con precipitación en su entorno, debido
a la hidrólisis de la lecitina. Al no utilizar manitol, las colonias se presentan de
color azul turquesa rodeadas por un precipitado, debido a la yema de huevo.

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Si la reacción no es clara, incubar las placas 24 horas más antes de efectuar el

cómputo.

Seleccionar placas que tengan en promedio de 15-150 colonias productoras de

lecitinasa y de coloración rosa (MYP) o azules (agar selectivo para B. cereus,
OXOID); esta será la cuenta presuntiva de B. cereus en placa.

Seleccionar 5 o más colonias características de las placas y transferir a tubos con

agar nutritivo para confirmar la presencia de B. cereus, siguiendo la técnica que se
describe en los puntos C y D. Calcular el número de B. cereus/g de muestra,
basado en el porcentaje de colonias, probadas y confirmadas.

Nota: el factor de dilución es 10 veces mayor, debido a que solamente se inoculó

0.1 mL de cada dilución, en lugar de 1mL.

Confirmación de B. cereus

Tomar 5 o más colonias sospechosas provenientes de agar MYP (o su

equivalente) y transferir a tubos con agar nutritivo. Incubar 24 horas a 30˚C.
Preparar una tinción de Gram y observar microscópicamente. El B. cereus, en el
microscopio se presenta como bacilo Grampositivo corto, forma cadenas, las
esporas pueden ser elipsoidales, centrales o subterminales.

Transferir 3 asa as de cada tubo de agar nutritivo a 0.5mL de buffer de fosfatos y

mezclar en el vórtex. Utilizar esta suspensión e inocular los siguientes medios
confirmatorios, (también se puede utilizar el inóculo del tubo de agar nutritivo sin
diluir en buffer).

Caldo glucosa + rojo de fenol

Inocular 3 mL de caldo glucosa rojo de fenol con 1 asada del cultivo descrito en el
punto anterior. Incubar anaeróbicamente 24 horas a 35˚C en jarra de anaerobiosis.
Agitar los tubos después de la incubación y observar si se presenta un vire de
color que va de rojo al amarillo, lo que indica la producción de ácido, en
condiciones anaeróbicas a partir de la glucosa.

Agar MYP

Inocular las placas de agar MYP, con el cultivo descrito en el inciso C, con la
finalidad de confirmar pureza, lecitinasa y manitol de la cepa aislada. Incubar 24
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horas a 35˚C. Observar la producción de lecitinasa alrededor de las colonias (halo

transparente). El B. cereus no fermenta el manitol en el agar MYP ni tampoco en
el agar para B. cereus (OXOID).

Resultados de las diferentes pruebas confirmatorias

1) Bacilo Gram-positivo largo esporulado que no deforma el esporangio

2) Productor de lecitinasa y no fermenta el manitol

3) Crece y produce ácido a partir de la glucosa

4) Reduce los nitratos a nitritos (unos cuantos tipos pueden ser negativos)

5) Produce acetil-metil-carbinol (VP positivo)

6) Descompone la L-tirosina

Pruebas para diferenciar a tres miembros del grupo B. cereus, incluyendo B.

cereus

Variedad mycoides, B thuringiensis, B. anthracis. Prueba de movilidad

Inocular por punción en el medio de SIM para movilidad, a partir de un cultivo de

24 horas.

Incubar 18-24 horas a 30˚C y observar el crecimiento a lo largo de la punción. La

mayoría de los biotipos de B. cereus y B. thuringiensis son móviles mediante
flagelos peritricos, la variedad mycoides es inmóvil, unos cuantos biotipos de B.
cereus no son móviles.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Reportar el número de B. cereus/g de muestra basado en el porcentaje de
colonias probadas y confirmadas, tomando en cuenta que el factor de dilución es
10 veces mayor debido a que el método de inoculación utilizado es el de extensión
de superficie

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BIBILOGRAFIA

 http://es.scribd.com/doc/6669732/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n-
11Recuento-e-identificacion-de-Bacillus-cereus
 http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis404.pdf
 Ntc 4679 para bacillus cereus

ELABORADO POR: MONICA FLOREZ – CARLOS ALBINO - SANDRA RODRIGUEZ- ERIKA MALAGON