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Secuenciar todo el genoma en menos de una semana y

por mil dlares


(Creces, 2012)

Parece ser que el genoma a 1000 dlares es una realidad. En febrero del
2012, la empresa Oxford Nanoporo Technologies, ha anunciado que
mediante una nano tecnologa a conseguido desarrollar un equipo de bajo
costo, que permite decodificar el cdigo gentico en forma contnua y en
tiempo record (horas). Por primera vez se es posible ir leyendo las letras
del DNA en forma continua, mientras este va pasando por un pequesimo
mini poro, inserto en una membrana de polmero sinttica. El anuncio ha
impactado y se presuma que no slo revolucionar la medicina
personalizada, sino tambin impactar en la salud pblica y en la
medicina en general, al ir conocindose la interrelacin de las variables,
entre gentica, enfermedad y medio ambiente.
El primer genoma humano se secuenci hace doce aos. En el 2000 se
anunci que el borrador ya estaba listo (Est listo el borrador del genoma
humano) y que el cdigo definitivo demorara aun tres aos ms (para el
2003). (El genoma humano: el gran hito de la biologa). El descifrarlo
completamente fue una enorme tarea y un gran desafo tecnolgico, que
demor 11 aos, con un costo de 10 mil millones de dlares.

En aquel tiempo los escpticos se oponan decididamente al proyecto, ya que


lo consideraban costoso e intil. Nada se podra desprender de esa secuencia
de 3,2 mil millones de bases que constituan el genoma (adenina, guanina,
citosina y timina, las cuatro bases del DNA). "Era un proyecto grandioso que
requera de una enorme cantidad de recursos, que iban en desmedro de la
investigacin cientfica aterrizada", decan los detractores. Irnicamente,
sealaban que si se quisiera leer en voz alta la secuencia de todas las bases
del DNA, tomara nueve aos y no conducira a nada. Que slo la escritura del
genoma, llenara 200 volmenes, cada uno del tamao de una gua telefnica.
Ms an, que ya se conoca que el 95% del genoma no codificaba nada y que
slo era basura que se haba ido acumulando a travs de los millones de aos
de evolucin biolgica y que el 5% restante, ubicado en cualquier parte
indeterminada del genoma, corresponda a genes que parecan codificar
protenas. Que no haba forma de llegar a saber la funcin de cada uno de
esos 100 mil genes por su complejidad e interrelacin metablica (en ese
tiempo se supona que el genoma humano estaba constituido por 100 mil
genes) Cmo saber donde parta un gene y donde terminaba?, cules de
ellos desempeaban roles primarios y cuales solo roles secundarios?, y
finalmente cmo los diferentes genes interactuaban entre s para ir tejiendo el
complejo drama de la vida celular? Eran preguntas que nadie iba a poder
responder, al menos con las tecnologas disponibles en ese entonces.
Afirmaban que para llegar a conocer ese complejo mundo, eran otros los
caminos a seguir. Haba que continuar avanzando en la bioqumica celular, y al
final de ese camino, tal vez se podra llegar a conocer el programa gentico
que la guiaba.
Pero habiendo pasado ya algunos aos y despus que el genoma ya ha sido
secuenciado enteramente (2003), las perspectivas se han ido haciendo ms
atractivas. Los avances se han sucedido ms rpido de lo que se pensaba.
Paulatinamente se ha ido evidenciando que el denominado "DNA basura" no es
tal. Por el contrario, la mayor parte de lo que as se llamaba, se le han ido
describiendo diversos e importantes roles regulatorios y de coordinando para el
complejo funcionamiento de todos y cada uno de los genes, mientras que al
mismo tiempo, y en forma progresiva se han ido individualizando ms de mil
genes que relacionados con diversos estados patolgicos y enfermedades
especficas. Se ha observado tambin que diversas mutaciones genticas
pueden inducir enfermedades similares. Al mismo tiempo se han ido
describiendo genes especficos que interactan con el medio ambiente, ya sea
estimulando o restringiendo su expresin. Se puede afirmar que durante los
ltimos aos, gracias al perfeccionamiento de las tcnicas de secuenciacin, se
ha estado incrementando exponencialmente el conocimiento del genoma y su
traduccin fenotpica. Hasta el ao 2010, ya se haban secuenciado en el
mundo, ms de 30.000 genoma humanos. Con ello ha sido posible ir
correlacionando el genotipo con el fenotipo, mejorando enormemente la
interpretacin del genoma (Rodaje Drmanac. The Ultimate Genetic Test.
Science (2012); 336:1110-1111).

Mientras por otra parte, ya se ve como posible y necesario conocer la funcin


de todos y cada uno de los genes en el interior de la clula y su inter-regulacin
a nivel molecular. Ya resulta evidente que todas las enfermedades tienen sus
bases en el genoma (sean mono o poligenticas) y que a travs del
conocimiento de los genes respectivos, se puede llegar a conocer los
interacciones de ellos y su impacto en un determinado cuadro patolgico, sea
este de origen psicolgico o somtico. Del mismo modo se ha avanzado en el
conocimiento de la permanente interaccin gentico-ambiental, y sus
consecuencias patolgicas. Incluso ya se podra llegar a conocer los detalles
moleculares del proceso del envejecimiento y quin sabe si su posible
intervencin.

Ahora ya sabemos que el genoma es en un 99% semejante para todos los


seres humanos, y que es esa mnima diferencia restante la que nos hace
genticamente diferentes a unos de otros, tanto en el aspecto fsico, como en
las peculiaridades metablicas, o en la mayor o menor susceptibilidad de
contraer determinadas enfermedades. Ese 1%, significan 150.000 diferencias
genticas de un solo nucletido. La mayor parte de ellas no parecen ser
trascendente. Las restantes marcan las diferencias fenotpicas de una a otra
persona. En todo caso puede ser importante irlas relacionando cada una de
ellas con cambios metablicos moleculares, con la consecuente proyeccin
fenotpica. Para ello es necesario disponer de miles de genomas
adecuadamente secuenciados, y a travs de comparaciones estadsticas,
correlacionar las diferencias fenotpicas que cada una de ellas condicionaba.
De este modo, se podra llegar a conocer la individualidad y funcionalidad de
cada uno de los 20.000 genes que en la actualidad se estima que constituyen
del genoma humano (no eran 100 mil como se supona antes).

Durante las dos dcadas que han transcurrido, desde la secuenciacin del
primer genoma hasta ahora, se han ido logrando evidentes avances
tecnolgicos en la secuenciacin de genomas. Ya los costos no son
exorbitantes, y se ha disminuido considerablemente la demora y complejidad
del proceso (El genoma personal por 1000 dolares). Pero aun as, el genoma
por 1000 dlares, hasta ahora no se ha conseguido. Es que todava, a pesar de
los avances, se requiere de complejas maquinarias secuenciadoras, las que
cuestan cientos de miles de dlares, adems de un completo y bien equipado
laboratorio para todos los procesos de la post-secuenciacin. Aun los mas
avanzados secuenciadores actuales pueden leer solo pequeos trozos de
DNA, de no ms de 200 bases, y posteriormente viene la tediosa tarea de unir
correctamente esos trozos hasta reconstituir el todo (Likam Brunham y Michael
Hayden; Whole-Genome Sequencing: The New Estndar of Care?. Science
2012; 336:1112-1113).

Pero ahora, repentinamente, aparece un mtodo milagroso, que si hace posible


pensar en la realidad del genoma de 1000 dlares. Segn los autores de esta
maravilla, se pueden leer grandes trozos de DNA en pocas horas, y a bajos
costos. Los autores han denominado "Secuenciador Nanoporo" a su milagro, y
lo que han mostrado es un pequeo aparatito que ellos afirman que no requiere
de copiar el DNA tantas veces, ni tampoco marcarlo con substancias
fluorescentes, ni de otros complicados procesos post-secuenciacin. Cuesta
creer tanta maravilla (Elizabeth Pennisi, Search for Pole-fection. Science 2012,
336:534-537)

La solucin estaba por otro lado

En las "Conferencias de la Biologa y Tecnologa del Genoma", celebrada


recientemente en Miami (Febrero 2012), frente a una nutrida audiencia de
cientficos, ingenieros y biotecnlogos, Clive Brown, gerente tecnolgico de la
empresa "Oxford Nanopore Technologie", present a un pequeo dispositivo,
semejante a un pen-drive, afirmando que con l haba secuenciado el genoma
completo de un virus, con una simple pasada de su DNA y que todo haba
demorado seis horas. Mas an, afirmaba que el aparatito estara ya en el
comercio a fines de ao a un precio de 900 dlares ( Duncan Graham-Rove.
Secuence DNA in seconds. NewScientest 2012, 213: 23-24).

El aparatito lo denominaron "Secuenciador Nanopore", y se basaba en la


utilizacin de un pequesimo poro, que atravesaba la estructura de una
protena, a travs de la cual se poda introducir la hebra del DNA y al mismo
tiempo ir identificando y registrando cada una de las bases en la medida que se
deslizaba entre sus paredes. El poro era tan pequeo, que en una seccin
transversal de un cabello, podan caber 25.000 de esos miniporos. La protena
estaba sostenida en una membrana lipdica que imitaba una pared celular. Los
gestores de esta maravilla eran David Deamer, biofsico de la Universidad de
California, Santa Cruz (UCSC) y Daniel Branton, bilogo de la Universidad de
Harvard. Segn relataron, no haba milagros, sino una laboriosa y larga jornada
de trabajo, de imaginacin y coordinado con diversos otros especialistas.
Durante la conferencia afirmaron haber codificado enteramente el genoma de
un bacterifago (un virus que infecta bacterias), cuyo genoma estaba
constituido por 48.000 bases. Haban separado el inicio de las dos hebras de
su DNA y luego cada hebra la haban pasado por el nanoporo, una primero y la
otra despus (fig 1). En la medida que pasaban, iban registrando el orden de la
secuencia de cada una de las cuatro bases del DNA. Se poda afirmar que era
la primera vez que se lea directamente el genoma. La audiencia qued
estupefacta.

La idea le rondaba en la cabeza a Deamer ya en el ao 1989, muchos aos


antes que se formara la empresa Oxford Nanopore. En aquel tiempo trabajaba
en otro tema, relacionado con el origen de la vida. Su preocupacin lo haba
llevado a hacer pasar la molcula de adenosin trifosfato (ATP), la molcula de
la energa, a travs de una membrana lipdica de una clula sinttica. Su
objetivo era ver como el ATP poda entregar su energa a las enzimas del
interior de la clula. Ello lo lograba a travs de un canal que atravesaba la
membrana. Si el ATP pda atravesar, Por qu no el DNA? Tambin pens
que con cada base poda cambiar la corriente de iones en forma diferente para
cada base del DNA que fuera atravesando el canal. Sera un secuenciador
absolutamente diferente hasta lo que en eses entonces se conoca. El
problema estaba en que no dispona de ese canal ideal.

Mas all de la idea

Mas tarde Deamer convers su teora con Branton y se pusieron a la bsqueda


del canal ideal. Encontraron la posibilidad de utilizar una protena: la a-
hemolisina. Se trataba de una protena que el Staphylococcus aureus utilizaba
para penetrar la pared de los globulos rojos. En esa poca conocieron a John
Kasianowitcz, un investigador del National Institute de Standards y Recnologa
(NIST) en Gaithersburg, Maryland, que estaba ensayando un poro producidos a
travs de esta protena. Fue asi como pudieron disponer de un nanoporo.
Constataron tambin que podan aplicar un voltaje para producir una corriente
elctrica de los iones potasio y cloro. Con esta experiencia, Kasianowitcz y
Branton publicaron en 1996, un trabajo en el Proceeding of the National
Academy of Science, en el que informaban que las bases de cidos nuclicos
podan pasar en hilera por un micropolo proteico y que con ello podan
simultneamente detectar la corriente ionica que produca con el paso de las
bases. En el artculo, finalmente sugeran que la tcnica poda utilizarse para
secuenciar el DNA.

Pero segn Deamer y colaboradores, despus de algn tiempo se


convencieron que este microporo no era el ideal, ya que las bases del DNA
pasaban demasiado rpido como para dar tiempo de ser identificadas. Haba
que buscar cmo hacer ms lento el pasaje. As naci la idea de utilizar la
enzima polimerasa, la enzima que copia el DNA, abriendo las hebras y
separando base a base, como las uniones de una cadena de
bicicleta (Amplificacin de genes: la reaccin de la polimerasa en
cadena) (fig 2). Ensayaron varias polimerasas de diferentes especies y de
otras protenas, hasta encontrar la que les pareci ms apropiada. Se trataba
de la polimerasa de un fago llamado ?29, que era capaz de permitir el paso de
a una base, a travs de la a-hemolisina. Con todo, an haba problema por la
forma de la base muy ancha, en forma de callampa, que produca una seal
confusa de la corriente inica. La seal era poco clara, de modo que no
permita distinguir el paso de una base a otra. Haba que buscar otra alternativa
de poro, que tuviera una geometra diferente a la de la a hemolisina.

Ello lo encontraron en otra bacteria, llamada MspA (para Mycobacterium


smegmatis porin A), cuyo poro de la protena tena una geometra diferente, en
forma de embudo, con una seccin angosta suficiente para permitir el pasaje
de cuatro bases (fig3). Con todo, an haba limitaciones: la seccin angosta
transportaba una seal negativa, lo que haca difcil el paso del DNA por su
similaridad de carga. Para resolver el problema contaron con la ayuda de Jens
Gundlach, fsico gravitacional de la Universidad de Washington, Seattled, quin
logr torcer el gene MspA, cambiando la forma de la protena. Para ello
modific el gene de la bacteria, de modo que la parte angosta del poro fuera
neutro. Pero adems tuvieron que agregar alguna carga positiva en la entrada
del poro, para favorecer el flujo de entrada del DNA. Con estas modificaciones
consiguieron que el DNA pasara a travs del poro a una velocidad razonable, a
razn de una base cada 30 milisegundos. Finalmente tuvieron tambin que
preocuparse de la membrana bilipdica que sostena el poro, que resultaba ser
poco estable. Para ello la remplazaron por un polmero resistente a la
exposicin de sangre o contaminantes. Solo entonces naci la empresa Oxford
Nanopore Technologyes, registrando la patente a nombre de Bayley, Deamer,
Branton, Akesson y otros.

Ellos son los fabricantes del pequeo instrumento que Clive Brown mostr en la
Conferencia de Biologa y Tecnologa del Genoma, en Marco Island, Florida, en
Febrero del 2012. Productos de todas las investigaciones han construido el
llamado MinoOn (figura 4) y una versin ms grande, llamada GridlON para
uso en laboratorios. Ambos con la misma tecnologa. El DNA se agrega a una
solucin que contiene la enzima (polimerasa) que se une al final de cada hebra
de DNA. Cuando se aplica la corriente se une la hebra del DNA a cientos de
agujeros (micro polos de protena) que estn asentados en un polmero de
membrana, de un grosor de 10 micrmetros. A medida que el DNA pasa por el
poro de la protena, la enzima agregada va abriendo las dos hebras del DNA
que comienza a pasar por el micro polo.

Cada una de las cuatro bases del DNA tiene una carga elctrica caracterstica,
de modo que cuando cada una va pasando a travs del micro polo, altera la
corriente y con ello da una seal caracterstica, que modifica la corriente a
travs del poro. Ello es suficiente para determinar cul de las cuatro bases est
atravesando el poro. Cada alteracin es leda por un lector.

Oxford Nanopore afirma que el aparatito tiene dos grandes ventajas sobre
todas los secuenciadores desarrollados hasta ahora: 1.- El DNA no necesita ser
amplificado, un proceso que consume mucho tiempo. 2.- Se pueden secuenciar
hebras de hasta 10.000 bases en forma continua, mientras las otras
tecnologas solo permiten secuenciar pequeos fragmentos de poco ms de
cientos de bases. Segn asegura Brown, se podra secuenciar el genoma
humano completo en 6 horas. La empresa piensa lanzar al comercio aparatos
para secuenciar frecuencias cortas, til para identificar patgenos o realizar
"screening" para identificar mutaciones genticas que pudieran incrementar el
riesgo de ciertas enfermedades. Esperan que cuando salga al mercado, cada
unidad tenga un valor de 900 dlares. "Es que el genoma a menos de 1000
dlares ya est ad portas".

La medicina del futuro ya est en el presente

La verdad es que si todo funciona como ellos afirman, en un futuro muy


prximo va a cambiar completamente, tanto la salud pblica como el mismo
ejercicio de la medicina, y tambin de paso a muchas otras reas de la ciencia.
Se puede prever que las aplicaciones sern muy variadas, desde como poder
hacer la secuenciacin de clulas cancerosas de una biopsia, al lado de la
camilla del enfermo, a conocer la identidad gentica de fragmentos de huesos,
en el mismo sitio del hallazgo arqueolgico.

Cuando ya se vayan identificando cada uno de los 20.000 genes y sus 200.000
codificadores menores (exones) (C.B. Lowe y col., Science 333, 1019 (2011),
pasar a ser rutina pedir un examen para conocer con anticipacin a que
enfermedades cada persona est ms predispuesta y as tomar las medidas
necesarias para su prevencin. Tambin ser posible saber que variedad
gentica posee su genoma, para seleccionar el frmaco ms adecuado para el
tratamiento. Al hacer un diagnstico molecular de cada tipo de cncer se podr
decidir que frmaco sera el ms adecuado. Del mismo modo, el genoma de
cada recin nacido permitir confirmar o descartar las miles de enfermedades
de bases genticas moleculares, como tambin disponer de la informacin
necesaria para tomar los cuidados de salud correspondientes a lo largo de su
vida. Es que el programa gentico no solo las enfermedades mono genticas,
sino tambin las multigenticas, como la diabetes, y tantas ms. De aqu en
adelante, la puerta est abierta.