LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

Universidad Católica Boliviana INGENIERÍA QUÍMICA

Docente: Alejandro Canaza Jorges Fecha de entrega: 14/03/17

Universitarios: Alejandra Pardo Pinto, Josue

Sánchez Villarroel, Nataly Zuñiga

Contenido
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 3

1.1 CONCEPTO DE INMUNIDAD................................................................................. 3

1.2 TIPOS DE INMUNIDAD .......................................................................................... 4

1.2.1 Inmunidad natural ............................................................................................ 4

1.2.2 Inmunidad adquirida ........................................................................................ 5

1.2.3 Inmunidad artificial ........................................................................................... 5

2 MARCADORES MOLECULARES DE ENFERMEDADES ............................................. 5

2.1 Marcadores moleculares del tipo postranscripción-traducción ................................ 6

2.2 Marcadores moleculares del tipo pretranscripción-traducción ................................. 6

2.2.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphic) ............................................ 7

2.2.2 RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA) ................................................. 8

2.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .......................................... 9

2.3 Marcadores moleculares para el diagnóstico temprano de la diabetes mellitus .... 10

3 TERAPIA CELULAR Y GENICA .................................................................................. 10

4 VACUNAS RECOMBINANTES.................................................................................... 12

4.1 Tipos de vacunas .................................................................................................. 13

4.1.1 Vacunas vivas o atenuadas ........................................................................... 13

4.1.2 Vacunas muertas o inactivadas ..................................................................... 13

4.1.3 Vacunas sintéticas ......................................................................................... 13

4.1.4 Vacunas toxoides .......................................................................................... 13

4.1.5 Vacunas recombinantes ................................................................................ 13

5 OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONO Y POLICLONALES .................................... 14

5.1 Obtención de anticuerpos monoclonales .............................................................. 14

 5.2 Obtención anticuerpos policlonales ....................................................................... 15

6 FARMACOGENÓMICA................................................................................................ 16

6.1 Beneficios previstos de la farmacogenómica ........................................................ 16

7 TOXICOGENÓMICA .................................................................................................... 17

7.1 Genómica estructural ............................................................................................ 18

7.2 Genómica funcional .............................................................................................. 19

8 HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO ................................... 20

8.1 Diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas ............................................ 21

8.2 Técnicas para el diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias................. 21

8.2.1 Métodos de extracción y purificación del ADN y RNA .................................... 22

8.2.2 Métodos para detectar mutaciones en el ADN ............................................... 22

8.2.3 Métodos para detectar mutaciones en el ARN ............................................... 26

8.3 Limitaciones del diagnóstico molecular ................................................................. 27

9 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 27
1 INTRODUCCIÓN

El presente informe expondrá la relación de la biotecnología en la medicina es decir sobre

la Biomédica. Se tocaran temas como la inmunidad, la clasificación de estos, marcadores
moleculares y su uso en el estudio del genoma humano.

También se hablara del método de inmunización dada por la aplicación de vacunas, las
diferencias del tipo de vacunas, la obtención de los anticuerpos monoclonales,
policlonales y como la biotecnología ha aportado para hacer mejoras y tengan mayor
eficiencia lo que nos lleva al estudio de la farmacogénica que estudia la respuesta del
genoma en la aplicación de los medicamentos.

Así mismo la toxico genómica continuará explicando la respuesta del genoma humano
pero a diversos tóxicos o toxinas. Por último se tratará las herramientas de diagnóstico
molecular tanto métodos clásicos como los modernos que implican la reacción en cadena
de polimerasa o la secuenciación de ADN, también se verá como los marcadores
moleculares se aplican en dichos métodos

1. CONCEPTOS BASICOS DE INMUNOLOGIA

1.1 CONCEPTO DE INMUNIDAD

Es el conjunto de mecanismos que un individuo posee para enfrentarse a la invasión de

cualquier cuerpo extraño y para hacer frente a la aparición de tumores. Esta cualidad se
adquiere antes del nacimiento y se madura y afianza en los primeros años de vida. En los
vertebrados implica que los organismos diferencian lo propio de lo ajeno; es decir,
reconocen todos sus tipos celulares.

El Sistema Inmune es el responsable de conferir inmunidad. Este sistema, presente en

vertebrados, alcanza su máxima complejidad en los primates y seres humanos. La ciencia
encargada de estudiar estos procesos se denomina Inmunología (Zarur, 2012).

El significado del término inmune se asocia histórica-mente a un mecanismo de

protección. Deriva de la palabra latina: immunis que significa: libre, exento de ciertos
oficios, obligaciones, impuestos y castigos. El término se extendió para aplicarlo a
personas que, después de haber padecido una enfermedad infecciosa, como la peste o
la viruela, quedaban exentos de ataques ulteriores (Robledo, 2008).
1.2 TIPOS DE INMUNIDAD

1.2.1 Inmunidad natural

Esta inmunidad se conoce bajo el nombre de inmunidad innata o congénita. Con este tipo
de inmunidad se crea una línea a la defensiva ante ciertos agentes patógenos, donde la
persona puede controlar estos agentes. Esta inmunidad se transmite por los genes, de
forma biológica. Ejemplo: el moco, el cual atrapa pequeñas partículas y bacterias, el reflejo
de la tos, el ácido gástrico, etc. Se caracteriza por ser rápida y por desarrollarse a nivel
local (Equipo de redacción, 2016).

Tipos de inmunidad natural

 Inmunidad pasiva: Es la que se muestra de forma pasiva y dura muy poco. Suele
estar presente en el feto y en el recién nacido, ya que es suministrada por la madre
a través de la leche y de la placenta. Esta inmunidad solo duran unos meses.
Ejemplo: el calostro de la madre (Equipo de redacción, 2016).
Los anticuerpos no son sintetizados por el organismo hospedador, sino son
sintetizados por otro organismo e introducidos en el hospedador.

 Inmunidad activa: Este tipo de inmunidad aparece tras una infección o una
inmunización activa, llegando a atacar a un agente patógeno en específico. Esta
inmunidad suele durar mucho más tiempo e inclusive llega a ser permanente
(Equipo de redacción, 2016).

La inmunidad activa es la inmunidad adquirida mediante una enfermedad

determinada, ya sea por sus manifestaciones pre-clínicas, clínicas o, incluso de
naturaleza inaparente (sin manifestaciones); también puede clasificarse como
activa artificial cuando se obtiene mediante la aplicación de vacunas (Jiménez,
2014).

Células que intervienen en la inmunidad natural

Fagocitos: Estas células fagocitan a los agentes infecciosos que llega a traspasar
las superficies epiteliales. Estos microorganismos son rodeados, engullidos y luego
digeridos por las células. Asesinas naturales: se presenta como un tipo de leucocito
que ante presencia de un virus se activa, al igual ocurre cuando se activan citocinas.
Tienen como función detectar y lisar las células que han sido infectadas por ciertos
virus, o a las células cancerígenas (Equipo de redacción, 2016).
1.2.2 Inmunidad adquirida

Es el tipo de inmunidad que poseen los animales vertebrados mandibulados. Esta

inmunidad luego de enfrentarse ante agentes patógenos evita que el organismo sea
afectado nuevamente por una segunda infección de este tipo, ya que posee una memoria
inmunológica que le permite dar respuesta ante patógenos con una mayor rapidez. Esta
inmunidad dura mucho más tiempo para responder ante patógenos que las inmunidad
natural. Características Al tener memoria ofrece respuestas más energéticas.
Especificidad, donde se crean reacciones distintas por diversas sustancias. Pueden volver
a su estado de reposo. Son tolerantes, por lo cual no atacan al propio organismo. Logran
responden ante una gran diversidad de anticuerpos. Esta se encarga de dar respuestas
ante patógenos de una forma puntual. Las respuestas en este tipo de inmunidad suelen
suceder en un tiempo prolongado, durando hasta días. Esta inmunidad tiene la capacidad
de volver a su estado de reposo, lo cual se conoce como homeostasis. Tipos de inmunidad
adquirida Inmunidad humoral: constituida por anticuerpos de la sangre que se enfrentan
ante los antígenos. Inmunidad celular: compuesta por linfocitos T que se enfrentan a los
microorganismos intracelulares (Equipo de redacción, 2016).

1.2.3 Inmunidad artificial

Se trata de la inmunidad que logra conseguir un ser vivo tras el uso de ciertos tratamientos
o de terapia (Equipo de redacción, 2016).

Tipos de inmunidad artificial

Inmunidad activa: Este tipo de inmunidad hace que el organismo cree anticuerpos que
logren combatir los agentes patógenos. Ejemplo de ello son las vacunas, las cuales
ofrecen sustancias con larga prolongación o que estimulan al organismo de por vida,
siendo la misma un excelente procedimiento preventivo (Equipo de redacción, 2016).

Inmunidad pasiva: Es el tipo de inmunidad que consigue el organismo por medio de la

sueroterapia, ya que a través de un donante inmune ofrece suero sanguíneo, el cual
ayuda a combatir los agentes cuando la respuesta inmunitaria activa no logra frenarlo
(Equipo de redacción, 2016).

2 MARCADORES MOLECULARES DE ENFERMEDADES

Son segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el
análisis del genoma. En 1996, Ferreira y Grattapaglia amplían el concepto definiendo los
marcadores moleculares como cualquier fenotipo molecular originado de la expresión de
un gen o un segmento específico de ADN (Diaz, 2012).
 Tipos de Marcadores

Existen dos grandes clases de marcadores moleculares:

 Los marcadores de postranscripción-traducción, que son aquellos determinados

por análisis indirecto del DNA.
 Los marcadores del tipo pretranscripción-traducción, que han revolucionado la
genética vegetal a partir de la introducción de novedosas tecnologías que
permiten el análisis directo del DNA.

2.1 Marcadores moleculares del tipo postranscripción-traducción

Entre los marcadores moleculares del tipo postranscripción-traducción se encuentran las

isoenzimas; así se definen las múltiples formas moleculares de una misma enzima que
existen en una especie.

Brown y Moran (año?), describen la técnica isoenzimática como el mejor método corriente
para medir variaciones genéticas cercanas al nivel del DNA, relativamente libres de
efectos ambientales y sobre un número de muestras manipulables.

La poca cantidad de tejido que se requiere para la elaboración del ensayo, su

relativamente rápida ejecución, el bajo costo del ensayo y la moderada facilidad para
obtener y analizar resultados, cuentan entre las principales ventajas de este marcador.

Los perfiles electroforéticos se han empleado para varios sistemas enzimáticos en la

clasificación de especies y variedades, y han contribuido significativamente en diversos
aspectos del mejoramiento. Sin embargo, estos marcadores presentan algunas
limitaciones en particular cuando se requiere una cobertura más amplia del genoma,
debido a la escasa disponibilidad de marcadores en el mismo y el bajo número de alelos
por locus. Además de forma general, la especificidad de las formas isoenzimáticas en
algunos tejidos vegetales, la influencia sobre la actividad enzimática de las condiciones
ambientales y los diferentes estadios del desarrollo vegetal, cuentan entre sus
desventajas (Gomez, 2011).

2.2 Marcadores moleculares del tipo pretranscripción-traducción

Los marcadores moleculares de tipo ADN, son aquellos capaces de detectar el

polimorfismo genético directamente a nivel de DNA. En este grupo se encuentran los
RFLP (Fragmentos Polimórficos de Restricción), RAPD (DNA Polimórfico Amplificado al
Azar), AFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados), entre otros y
ocupan un peldaño superior en la escala evolutiva de los marcadores genéticos, por las
 nuevas perspectivas que brindan para identificar y mapear genes útiles, que pueden ser
posteriormente incorporados y expresados en el genoma vegetal (Mackenna, 2008).
2.2.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphic)

Se entiende por RFLP el polimorfismo de los fragmentos de restricción, obtenidos por el

corte con una endonucleasa en la cadena doble del ADN, acoplado en el caso de ADN
genómico eucariótico, por hibridación con sondas de secuencias homólogas de copia
única (Diaz, 2012).
El empleo de los RFLP permite detectar variaciones producidas por procesos como las
deleciones, inserciones, o alteraciones en la secuencia diana de las endonucleasas de
restricción (siendo esta su base genética), tanto en poblaciones de la misma especie
como entre diferentes especies, lo cual resulta ventajoso atendiendo a que muy pocas
variaciones son expresadas en el fenotipo, mientras que muchas otras resultan silentes.
Se pueden distinguir dos campos principales de aplicación de los RFLP en el
mejoramiento de las plantas. El primero está basado en la utilización de los mismos como
marcador genético para determinar las relaciones genéticas, incluyendo aspectos
esenciales como su uso en la identificación de variedades, la protección de los derechos
del mejorador y las determinaciones de parentesco. La segunda área de aplicación, está
basada en el uso de éstos como marcadores genéticos para identificar y mapear
particularmente aquellos genes involucrados directamente en la determinación de
caracteres cuantitativos, y el monitoreo de estos loci durante los programas de
introgresión y selección (Diaz, 2012).

El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado

usando la técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR, luego tratado
con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes
longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva en el
cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando
fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante
electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido a un campo eléctrico
y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de las muestras según la técnica
utilizada. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular
debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de
restricción varían. Por tanto, se trata de un técnica codominante ya que nos permite
distinguir individuos homocigotos de aquellos heterocigotos, es decir, nos permite
observar cada uno de los alelos que estudiamos. En el gel podemos observar que hay
 dos alelos de distinto tamaño, y nos permite distinguir entre ambos individuos. Las
bandas pueden ser transferidas por Southern Blot a una membrana donde se hibridan
con una sonda que permite determinar la longitud y la separación de los fragmentos. En
este paso las cadenas de ADN tienen que estar desnaturalizadas, es decir, en forma de
cadena sencilla para permitir la hibridación con las sondas específicas. Las
endonucleasas de restricción en su mayoría cortan el ADN de cadena doble en
secuencias específicas y cada enzima reconoce un sitio en particular (Ramos, 2005).

2.2.2 RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA)

En 1990 dos grupos de investigadores desarrollaron prácticamente al unísono una

tecnología basada en la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En
esencia la idea consistió en utilizar un cebador corto y de secuencia arbitraria, que elimina
la necesidad de conocimiento previo de la secuencia. Estos dos grupos denominaron de
forma diferente esta técnica: AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction o
reacción de la polimerasa con cebadores arbitrarios) y RAPD (Ramdom Amplified
Polymorphic DNA o ADN polimórfico amplificado al azar) desarrollada por Williams y
colaboradores) (Ramos, 2005).
El polimorfismo genético detectado con este marcador es binario lo que hace que la
naturaleza de la técnica RAPD sea dominante, los individuos heterocigóticos no pueden
ser diferenciadas directamente de los homocigóticos, esta característica constituye una
de sus principales limitaciones determinando un bajo contenido de información genética
por locus. Sin embargo, las evidencias existentes, indican que los loci de los marcadores
RAPD están distribuidos al azar a lo largo del genoma, lo que permite detectar una gran
cantidad de polimorfismo, incluso en regiones de DNA repetitivo.

Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas específicas
distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento
(36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de
agarosa para obtener perfiles electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los
distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar
característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que además no necesita estar
muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir
rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino
 redundante, y que no da información sobre el número de copias que el DNA genómico
contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para la
catalogación de frutos, selección de variedades, y diferenciación de líneas clonales.
También se está utilizando para el análisis de las variedades de apio, uva, limón y olivo
(Diaz, 2012).

2.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

La técnica del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, se considera una

técnica intermedia entre RFLP y RAPD, pues involucra una digestión del DNA con
enzimas de restricción y la amplificación de los fragmentos generados mediante un PCR
específico. Los productos amplificados son usualmente separados sobre un gel de
secuenciación y pueden ser revelados después por radiografía o fluorescencia. El
polimorfismo creado será el resultado de cambios en los sitios de corte de las
endonucleasas y de la variación en número y longitud del amplicon seleccionado para la
amplificación de los distintos segmento (Ramos, 2005).
Estos marcadores han encontrado un amplio uso en muchas aplicaciones de la biología
molecular, especialmente en plantas, destacándose por la alta identificación de genotipos
y evaluación del germoplasma que permite.

Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas específicas
distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento
(36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de
agarosa para obtener perfiles electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los
distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar
característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que además no necesita estar
muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir
rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino
redundante, y que no da información sobre el número de copias que el DNA genómico
contiene de la secuencia amplificada y olivo (Diaz, 2012).
2.3 Marcadores moleculares para el diagnóstico temprano de la diabetes mellitus

La Diabetes Tipo 2 (DT2) pertenecea un grupo de alteraciones metabólicas de carácter

heterogéneo con grado variable de predisposición hereditaria y participación de diversos
factoresambientales. La DT2 se caracterizapor hiperglucemia persistente debida a la
resistencia a la acción de la insulina o por la deficiencia en la producción de la misma,
afectando el metabolismo de los carbohidratos, proteínas y grasas. La DT2 tiene un origen
complejo y multifactorial, asociándose principalmente con obesidad, concentración elevada
de triacilgliceroles, baja concentración de colesterol HDL y resistencia a la acción de la
insulina.

La participación de factores genéticos relacionados con la susceptibilidad a padecer la DT2,

se asocian fuertemente cuando existen antecedentes heredo-familiares de diabetes (Cruz,
2005).

Herramientas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido

discernir los genes y sus variantes relacionados a la diabetes. estudios previos has
demostrado que los genes capn10 y ppr γ juegan un papel importante para el desarrollo de
la diabetes y en consecuencia pudieran ser genes candidatos para utilizarlos como
diagnóstico molecular y proveer así la detección oportuna de esta enfermedad para evitar
complicaciones de la Diabetes como retinopatías, daño renal, daños en el SNC, entre otros
(Gomez, 2011).

3 TERAPIA CELULAR Y GENICA

Terapia celular: es una estrategia basada en el empleo de células como instrumentos

terapéuticos. Su potencial, ya explorado desde hace décadas con los trasplantes de
médula ósea para el tratamiento de enfermedades hematológicas, se ha visto ampliado
con el descubrimiento y caracterización de células madre en otros tejidos del organismo,
denominadas células madre adultas . Las controversias éticas derivadas del empleo de
células madre embrionarias, se ha visto desbancado con el descubrimiento en la pasada
década de la reprogramación como estrategia para disponer de células con potencial de
diferenciación a casi cualquier tejido a partir de células adultas.
Cualquiera de estas estrategias permite su empleo en diferente extensión en medicina
reparadora, y regenerativa: transferir células funciones a tejidos de pacientes con
deficiencias funcionales que conducen a patologías concretas. La posibilidad de modificar
genéticamente estas células (Terapia Génica) para corregir sus deficiencias justifica la
difícil separación de ambas estrategias terapéuticas con un futuro cargado de expectación
(Perez, 2016).

Terapia Génica: Se puede definir como la transferencia de material genético en un

individuo con finalidad terapéutica, mientras que la terapia celular busca el mismo fin
administrando células. Ambas disciplinas pueden estar íntimamente asociadas. Éste es
el caso del uso terapéutico de células modificadas genéticamente (Perez, 2016).

El material genético que se utiliza en el campo de la terapia génica puede ser de muy
diferentes tipos:

 Es muy común que se trate de ADN codificante de una proteína, en cuyo caso es
necesario que llegue al núcleo de las células para dar lugar a un ARN mensajero
que posteriormente mediará la producción de la proteína terapéutica (Perez,
2016).

 El efecto terapéutico también puede conseguirse inhibiendo la expresión de genes

endógenos responsables de una patología. Esto se puede conseguir transfiriendo
ARN de interferencia o distintos tipos de oligonucleótidos anti sentido (Perez,
2016).

 En una aplicación concreta de la terapia génica se plantea la corrección de los

genes defectuosos en lugar de aportar copias adicionales que restauren su
función (Perez, 2016).

La introducción del material genético puede llevarse a cabo directamente en el individuo,

o puede realizarse en células aisladas que posteriormente son administradas en el
organismo. Por tanto, esta última modalidad se puede considerar también terapia celular.
El material genético como tal tiene dificultades para penetrar en las células, y por eso
necesita unos vehículos que facilitan su introducción.

También se puede forzar la entrada en la célula utilizando métodos físicos como la

electroporación o el “bombardeo” con partículas metálicas.
Las posibles aplicaciones de la terapia génica son muy amplias. Siempre que se haya
identificado un gen como responsable de una enfermedad, éste se convierte en una diana
para la terapia génica. Pero en otros muchos casos de enfermedades con origen
 multifactorial la transferencia génica puede lograr efectos terapéuticos. De hecho,
actualmente se llevan a cabo ensayos en pacientes con cáncer, enfermedades
infecciosas, cardiovasculares, etc (Perez, 2016).

La terapia celular: Es una estrategia basada en el empleo de células como instrumentos

terapéuticos. Su potencial, ya explorado desde hace décadas con los trasplantes de
médula ósea para el tratamiento de enfermedades hematológicas, se ha visto ampliado
con el descubrimiento y caracterización de células madre en otros tejidos del organismo,
denominadas células madre adultas . Las controversias éticas derivadas del empleo de
células madre embrionarias, se ha visto desbancado con el descubrimiento en la pasada
década de la reprogramación como estrategia para disponer de células con potencial de
diferenciación a casi cualquier tejido a partir de células adultas.
Cualquiera de estas estrategias permite su empleo en diferente extensión en medicina
reparadora, y regenerativa: transferir células funciones a tejidos de pacientes con
deficiencias funcionales que conducen a patologías concretas. La posibilidad de modificar
genéticamente estas células (Terapia Génica) para corregir sus deficiencias justifica la
difícil separación de ambas estrategias terapéuticas con un futuro cargado de expectación
(Perez, 2016).

4 VACUNAS RECOMBINANTES

Una vacuna es un método para crear inmunización o una respuesta inmunológica que
proteja al cuerpo humano de agentes extraños también llamados antígenos, esta es
una inmunización pasiva. Una vacuna consiste en introducir el agente que causa la
enfermedad pero en un estado que no es patogénico. La vacunación dará como
resultado la producción de anticuerpos específicos, dirigidos contra el agente
infeccioso.
Para la fabricación de una vacuna hay tres pasos importantes: generación de un
antígeno, que consiste en cultivar una bacteria o un virus, este paso e encarga de
que el virus pierda la capacidad de reproducción pero aun así puede causar la
enfermedad. Luego está el aislamiento del antígeno, que consiste en separarlo del
medio en que se lo cultivo y por último se añaden otros componentes a la vacuna para
que esté listo para su uso, estos componentes pueden ser estabilizadores,
conservantes.
4.1 Tipos de vacunas

4.1.1 Vacunas vivas o atenuadas

Son aquellas que contienen a los microbios vivos que han sido debilitados en el laboratorio
para que no puedan causar la enfermedad. Dado que la vacuna viva atenuada es lo más
parecido a una infección natural, estas vacunas son bastante efectivas. Provocan respuestas
celulares y de anticuerpos fuertes que son de muy larga duración e intensas. Entre las
vacunas más conocidas de este tipo se encuentran: Varicela, Fiebre amarilla, Polio oral,
Sarampión, Rubéola

4.1.2 Vacunas muertas o inactivadas

Se componen de microorganismos inactivados, incapaces de reproducirse, a través de

químicos, calor o radiación y por ello estos microorganismos son incapaces de producir la
enfermedad en el paciente. La respuesta inmunitaria es de menor intensidad y duración que
con las vacunas vivas pero ya que son menos fuertes que las vacunas vivas son más seguras
y de más fácil fabricación.

Las vacunas inactivadas son: rabia, Gripe, Hepatitis A, Encefalitis japonesa.

4.1.3 Vacunas sintéticas

Compuestas por polipéptidos que copian la secuencia primaria de aminoácidos de los

determinantes antigénicos con capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora.
Uno de sus principales obstáculos es la escasa inmunogenicidad de estos péptidos sintéticos.

4.1.4 Vacunas toxoides

Contienen una toxina o químico producido por la bacteria o virus. Estas vacunas hacen que
la persona que las recibe sea inmune a los efectos dañinos de la infección en lugar de a la
infección en sí. Pueden considerarse como vacunas muertas o inactivas, pero a veces reciben
su propia categoría para resaltar el hecho de que contienen una toxina inactiva. Existen dos
vacunas muy conocidas de las toxoides y estas son las que protegen contra el tétanos y la
difteria.

4.1.5 Vacunas recombinantes

Se entiende como vacuna recombinante a aquellas que son obtenidas utilizando la tecnología
del ADN recombinante en alguna etapa de producción. Presentan la misma eficacia de
vacunas vivas convencionales y la seguridad de vacunas inactivadas convencionales. Su
elaboración se realiza a partir de la clonación de genes codificados para una proteína
antigénica específica en una célula huésped recombinante. (Berdasquera Corcho D.; Cruz
Martínez G.; Suárez Larreinaga, C., 2000)
Se requiere la identificación previa del gen, su inserción en un vector (plásmido o célula Viva)
e introducción del complejo gen-vector en la célula huésped. Posteriormente, la proteína
expresada en esta célula se extrae y se purifica.

Se emplea tecnología genética para transferir genes de diferentes patógenos en organismos

de fácil crecimiento como bacterias. De ello deriva el nombre de recombinantes, por la
combinación de genes de dos organismos diferentes.

Estas vacunas atacan directamente el material genético del microbio en lugar de hacerlo en
todo el organismo y sus partes

La vacuna de ADN no podría transmitir la enfermedad porque no contiene el microbio, sino

solo copias de algunos de sus genes

Los tipos de vacunas recombinantes incluye aquellas que utilizan virus o bacterias como
vectores (se incorpora el gen de interés en el genoma de un microorganismo atenuado), las
de DNA desnudo (plásmidos de DNA que contienen el gen de interés y cuya expresión ocurre
dentro de la célula receptora) y las comestibles (producidas a partir de plantas modificadas
genéticamente).( Berdasquera Corcho D.; Cruz Martínez G.; Suárez Larreinaga, C., 2000)

Los vectores más utilizados en este tipo de vacunas son el virus vaccinia, algunas bacterias
lácticas de los géneros Lactobacillus y Lactococcus y variedades atenuadas de M.
tuberculosis y Salmonella typhi.

5 OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONO Y POLICLONALES

5.1 Obtención de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales, son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo
tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una sola célula
madre. Los responsables de esta producción son los linfocitos B

Se inyecta en ratones el antígeno, aun cuando no esté puro. Luego de un período de espera
que permite un aumento de los linfocitos B específicos, se sacrifica el ratón y se extrae el
bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se
mezclan con células mielomatosas (células de un tumor de linfocitos), agregando además
poli etilenglicol, un agente que facilita la fusión. Con esto se consigue que algunas células
mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma.
Se logra así una célula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos,
con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la célula mielomatosa. Los hibridomas
son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un número diferente de determinadas
colonias (Fernando Mönckeberg, 1988).
La etapa final, es separar los distintos hibridomas
resultantes, con el fin de obtener una población
proveniente de una sola célula (clon). Para ello,
las células se diluyen hasta lograr que una célula
quede en un micro pocillo de cultivo. El
anticuerpo producido por esta célula y sus
progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclonal.
De allí en adelante estas células se pueden
guardar congeladas o cultivar y multiplicar por
siempre( Fernando Mönckeberg, 1988).(ver
cuadro adjunto)

Figura 1:Producción de anticuerpos monoclonales

5.2 Obtención anticuerpos policlonales

Se inyecta un conjugado antígeno o adyuvante en un animal de elección para iniciar una

respuesta inmune amplificada. Después de una serie de inyecciones durante un periodo de
tiempo específico, se espera que el animal cree anticuerpos contra el conjugado. Luego se
extrae sangre del animal y después se purifica para obtener el anticuerpo de interés.

La inoculación se realiza en un mamífero adecuado, tal como un ratón, conejo o cabra. A

menudo se prefieren mamíferos mayores, ya que la cantidad de suero que se puede recoger
es mayor. Se inyecta un antígeno en el mamífero. Esto induce a los linfocitos B a producir
inmunoglobulinas IgG específicas para el antígeno. Esta IgG policlonales se purifica a partir
del suero del mamífero (Wikipedia, Polyclonal antibodies, s.f.).

Existen muchas metodologías para la producción de anticuerpos policlonales en animales de

laboratorio. Las directrices institucionales que rigen el uso de los animales y los
procedimientos relativos a estas metodologías se orientan generalmente hacia
consideraciones humanas y conducta apropiada para los adyuvantes (agentes que modifican
el efecto de otros agentes mientras que tienen pocos o ningún efecto directo cuando se
administran por sí mismos). Esto incluye la selección adyuvante, rutas y sitios de
administración, volúmenes de inyección por sitio y número de sitios por animal. Las políticas
institucionales generalmente incluyen volúmenes de sangre permitidos por colección y
precauciones de seguridad incluyendo restricción apropiada y sedación o anestesia de
animales para la prevención de lesiones a animales o personal (Wikipedia, Polyclonal
antibodies, s.f.).

El objetivo principal de la producción de anticuerpos en animales de laboratorio es obtener

antisueros de alta afinidad para su uso en experimentos o pruebas de diagnóstico. Los
adyuvantes se usan para mejorar o mejorar una respuesta inmune a los antígenos. La
mayoría de los adyuvantes proporcionan un sitio de inyección, depósito de antígeno que
permite una liberación lenta de antígeno en los ganglios linfáticos drenantes (Wikipedia,
Polyclonal antibodies, s.f.).

El uso de anticuerpos policlonales (PAbs) sobre anticuerpos monoclonales tiene sus ventajas.
Las habilidades técnicas necesarias para producir anticuerpos policlonales no son tan
exigentes. Son baratos de hacer y pueden ser generados con bastante rapidez, tardando
varios meses en producir. Los PAbs son heterogéneos, lo que les permite unirse a una amplia
gama de epítopos antigénicos. Debido a que los PAbs se producen a partir de un gran número
de clones de células B, es más probable que se unan con éxito a un antígeno específico
(Wikipedia, Polyclonal antibodies, s.f.).

6 FARMACOGENÓMICA

La Farmacogenómica es el término que se utiliza para describir al estudio de la contribución

de las diferencias en los genes de un individuo a la variación en las respuestas a los
medicamentos entre la población (Funes, 2013).

Tales diferencias en los genes tienen que ver con la producción de proteínas específicas que
participan en los distintos procesos del paso de los medicamentos por el organismo, desde
su absorción, su acceso al torrente sanguíneo, su distribución en los tejidos donde se busca
que tengan su efecto terapéutico, su desintegración y su posterior eliminación del cuerpo
(Funes, 2013).

6.1 Beneficios previstos de la farmacogenómica

 Fármacos más potentes. Las compañías farmacéuticas serán capaces de producir

terapias más precisas contra enfermedades específicas, maximizando los efectos
terapéuticos y minimizando la lesión a las células vecinas sanas (Giménez, 2007).

 Fármacos mejores y más seguros, desde la primera toma. El tiempo de

recuperación de la enfermedad se acortará y la seguridad será mayor, puesto que la
 probabilidad de efectos secundarios disminuirá o desaparecerá por
completo (Giménez, 2007).

 Métodos más precisos para la determinación de la dosis apropiada. Los métodos

actuales de determinación de dosis según el peso y la edad serán reemplazados por
dosificaciones basadas en la genética de la persona: la forma en que su cuerpo
metaboliza el fármaco y el tiempo que tarda en metabolizarlo (Giménez, 2007).

 Vacunas mejores. Las vacunas hechas de material genético, sea ADN o ARN,
prometen los beneficios de las vacunas ya existentes sin ninguno de sus riesgos.
Teóricamente podrían activar el sistema inmunitario pero serían incapaces de causar
infecciones (Giménez, 2007).

7 TOXICOGENÓMICA

Es interesante notar que sólo el 0.1% de todas las pares de bases del DNA que forman
el genoma humano varían entre los individuos; al mismo tiempo se debe aceptar que este
bajo porcentaje tiene efectos muy importantes para explicar las muchas diferencias que
existen entre todos nosotros. Este hecho llega a su extremo con las enfermedades
hereditarias, donde muy pequeños cambios pueden dar lugar a muerte prematura o
deficiencias muy importantes (VERICAT, s.f.).

La genómica emergió hace más de una década concurrentemente con la secuenciación

del genoma humano. La identificación de la secuencia del DNA es muy poco útil si no se
sabe nada sobre la función de los genes y de su regulación. Consideremos que cualquier
organismo superior está formado por muchos tipos celulares diferentes, cada uno con
funciones diferentes e integrados en un sistema de complejidad mucho superior a lo que
representaría una mezcla desorganizada de los mismos tipos celulares. Si bien cada
célula contiene los mismos genes, su expresión diferencial da lugar a la diversidad
necesaria para dar lugar a esa complejidad tan impresionante, y que crece desde el tejido,
al órgano, para llegar al organismo. En cada nivel de complejidad, la transcripción de los
genes y la traducción a proteínas da lugar a la función propia de la estructura determinada
(función de un tejido, función de un órgano). El mantenimiento de esta especialización se
mantiene de una forma muy controlada, con el objetivo de evitar la pérdida de la función.
Los sistemas biológicos aplicados en toxicología se denominan “sistemas toxicológicos”,
los cuales se pueden definir como el estudio de las interacciones de todos los elementos
en un sistema biológico determinado, bajo estrés o perturbación tóxica, para alcanzar el
entendimiento mecanístico de la respuesta tóxica. Con el objetivo de entender todos los
 elementos que cambian posterior a la exposición de un tóxico se realizan análisis
integrales de todas las tecnologías toxicogenómicas por ejemplo trascriptómica (perfil de
expresión genética), proteómica, y metabolómica en combinación con las medidas de
toxicidad tradicionales. Cada sustancia generará una serie de datos de expresión de
genes que funciona como una “firma” y que puede emplearse para identificar
biomarcadores específicos que permitan evaluar el riesgo y predecir efectos tóxicos de
nuevas fármacos en desarrollo (VERICAT, s.f.).

Sin tener en cuenta la expresión de genes, está completamente aceptado que los
mecanismos de acción son muy complejos y tienen más efectos que los simples cambios
en algunas macromoléculas intracelulares. Muchos compuestos tóxicos afectan la
actividad enzimática, la integridad del DNA y de las membranas, el potencial redox, así
como muchos otros procesos complejos (Capó M. A.; Frejo Mª T, 2007).

Desde la secuenciación del genoma humano hemos asistido a la aparición de las

denominadas “ciencias omicas” impulsadas por los recientes avances en el proyecto del
genoma humano y los desarrollos tecnológicos asociados. La genómica consiste en la
caracterización molecular de genomas enteros y aporta información acerca de la
secuencia y de la función de cada sector del genoma en diferentes situaciones de
desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, así como de los mecanismos
implicados en la regulación de la expresión e interacción génica (Capó M. A.; Frejo Mª T,
2007).

La Toxicogenómica usa las metodologías e información de la ciencia genómica y de la

informática para mejorar nuestra comprensión sobre las bases biológicas de las
respuestas a los agentes tóxicos, por lo tanto, es una disciplina que nos permite entender
por ejemplo, el rol de las interacciones entre genes y medio ambiente en el desarrollo de
las enfermedades (Capó M. A.; Frejo Mª T, 2007).

La genómica se divide en dos grandes áreas: Genómica estructural y genómica funcional

7.1 Genómica estructural

Se ocupa de la caracterización física de genomas enteros, es decir, descifrar el número,

orden y secuencia de los pilares (nucleótidos) de la molécula de ADN. Cuando esta
secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades:

- Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biológicas y

comprender el papel de dichas secuencias.
- Realizar predicciones acerca de todas las proteínas codificadas por una especie.
 - Establecer las variaciones genéticas entre distintas poblaciones de una misma
especie.
- Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos.

Catalogar las variaciones genéticas entre individuos ayudará a identificar aquellos

cambios que conducen a enfermedades genéticas, investigar nuevas terapias y
establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores (Capó M. A.; Frejo Mª T,
2007).

7.2 Genómica funcional

Consiste en la recolección sistemática de información sobre la función de los genes,

mediante la aplicación de aproximaciones experimentales globales que evalúen la función
de los genes haciendo uso de la información y elementos de la genómica estructural.

Dentro de la genómica funcional existen varios campos de investigación:

Transcriptómica: Puede definirse como la genómica funcional a nivel de la transcripción,

es decir a nivel de la formación del ARN mensajero a partir del ADN. Las técnicas que
utilizan fundamentalmente son el microarray o microplataformas de ADN, que permite el
análisis simultáneo de miles de genes. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos
de hibridación con muestras marcadas radiactivamente o con fluoró- foro apropiados y los
resultados se cuantifican mediante análisis con microscopia confocal.

Proteonómica: Se define como la parte de la genómica funcional que se ocupa del estudio
del conjunto total de proteínas expresadas por un genoma completo, incluyendo las
modificadas después de la traducción. El método mas utilizado para estudiar la
abundancia de proteínas es la electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida.

Metabolómica: : Con este término denominamos al conjunto total de metabolitos de una

célula, consecuencia de la función de ARNm y proteínas. Permite identificar metabolitos
en la célula y determinar perfiles de abundancia en relación a los estudios del
trasnscriptoma y el proteoma (Capó M. A.; Frejo Mª T, 2007).

La tecnología toxicogenómica nos da la posibilidad de analizar miles de genes

simultáneamente de un organismo expuesto a agentes tóxicos o con un padecimiento
definido, para la búsqueda de:

a) Genes de susceptibilidad al daño

b) Detección de patrones y mecanismos de toxicidad.

c) Determinar moléculas endógenas susceptibles al ataque de agentes tóxicos.

 d) Perfiles específicos de expresión de genes que resulten en la generación de
biomarcadores de exposición y de riesgo.

e) Biomarcadores de efecto temprano, que identifiquen el desarrollo precoz de una

enfermedad antes de que sean evidentes cambios clínicos típicos, identificando además,
factores de susceptibilidad que influyen en la respuesta individual frente a las distintas
exposiciones tóxicas, así como las diferencias étnicas de susceptibilidad (Capó M. A.;
Frejo Mª T, 2007).

8 HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO

El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas de

biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando
secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico
(ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de “Biología Molecular” se aplicó a los
trabajos realizados sobre el ADN. Esta molécula, descubierta por el biólogo y médico
suizo Johan Friedrich Miescher en el año 1869, capturó la atención de la comunidad
científica, luego que los investigadores James D. Watson, Francis Crick y Rosalind
Franklin descubrieran la estructura del ADN en el año 1953 (Watson y Crick, 1953). Este
descubrimiento abrió un nuevo horizonte para futuras generaciones en diferentes áreas
de la ciencia, incluida la investigación biomédica (Farfán, 2015).

El campo del diagnóstico molecular ha tenido un sostenido crecimiento en los últimos

años, sobre el 12% anual, esperando que para el 2017 alcance un mercado por sobre los
US$60 billones. En la actualidad, el diagnóstico molecular se ha enfocado principalmente
en el diagnóstico de enfermedades infecciosas (50-60%), sin embargo, existe un aumento
progresivo de técnicas moleculares en el área de cáncer y enfermedades genéticas,
convirtiendo al diagnóstico molecular en una de las áreas de diagnóstico de mayor
dinamismo y crecimiento, revolucionando las estrategias para el tratamiento de diversas
patologías y condiciones de salud, ofreciendo técnicas con altos estándares de calidad
que entregan al equipo clínico información crítica para el cuidado de los pacientes (Farfán,
2015).

En el caso del diagnóstico molecular, la detección de segmentos de ADN en una muestra

problema fue la primera estrategia utilizada en clínica. Mediante técnicas de hibridación
de Southern blot, utilizando fragmentos de ADN denominadas sondas, fue posible
detectar la presencia de una región de ADN que contenía una secuencia complementaria
a la sonda en una muestra problema. Posteriormente, la utilización de enzimas de
restricción, tijeras moleculares que cortan el ADN en regiones específicas, junto con el
 desarrollo de métodos de secuenciación simples, amplió el número de técnicas
disponibles para su uso en clínica (Farfán, 2015).

La reacción de la polimerasa en cadena (RPC), quizás el mayor aporte en la era del

diagnóstico molecular. De forma general, esta técnica permite la amplificación de una
región específica de ADN utilizando partidores o secuencias de ADN que delimitan la zona
de amplificación. A partir de una copia de la región a amplificar se obtienen millones de
copias, lo que permite su detección y de esta forma se evidencia la presencia de la región
de ADN en una muestra determinada. Dada la naturaleza de la técnica, la alta
especificidad de la RPC viene dada por la hibridación de los partidores complementarios
a la secuencia blanco y su elevada sensibilidad a la baja cantidad de ADN que requiere
para iniciar la amplificación. (Farfán, 2015)

8.1 Diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas

Las enfermedades infecciosas se han transformado en la “punta de lanza” para el

desarrollo de test de diagnóstico molecular, siendo más del 50% de las técnicas
disponibles hoy en día. La principal explicación a este desarrollo se debe a la dificultad de
detectar un patógeno mediante la microbiología clásica. Los largos periodos de
crecimiento, las condiciones de cultivo y la obtención de una muestra adecuada son los
mayores factores que afectan el diagnóstico microbiológico tradicional. Considerando que
las técnicas de biología molecular se basan en la detección de segmentos de ADN, no es
necesaria la presencia de un microorganismo viable en la muestra, sino que solo su
material genético. Los altos valores de sensibilidad de especificidad de la técnicas de
diagnóstico molecular, junto con lo rapidez con la que se pueden obtener los resultados
las han transformado en las técnicas de elección para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas y en muchos casos se consideran los estándares de oro (gold standard) para
el diagnóstico de patologías infecciosas, sobre todo en infecciones virales, desplazando
al cultivo como método de referencia. Esta situación ha llevado a desarrollar técnicas que
presenten certificaciones que entregan al equipo clínico seguridad en la calidad de los
resultados, ya que en muchos casos estas técnicas definirán el manejo del paciente.
Muchas de las técnicas disponibles han evolucionado desde test de uso exclusivo para
investigación (RUO: research use only) a productos para el diagnóstico in vivo (IVD: in
vitro diagnosis) con certificación de la comunidad europea (marcados como CE) y la Food
and Drug Administration (FDA) en EEUU (marcados como FDA-cleared). (Farfán, 2015)

8.2 Técnicas para el diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias

Como se puede ver en la siguiente figura, hay un gran número de enfermedades que
pueden ser diagnosticadas con herramientas moleculares.
 Figura 2: Diagnóstico de enfermedades hereditarias

8.2.1 Métodos de extracción y purificación del ADN y RNA

Mediante distintas técnicas se puede purificar, con relativa facilidad, el DNA o RNA de
diversas muestras biológicas, entre ellas la sangre de nuestros pacientes. De entre los
distintos métodos a utilizar, el más sencillo, rápido y limpio es el uso de columnas que
capturan de forma específica el ácido nucleico de interés para nuestro estudio. Para ello
se procede a la lisis controlada de las células sanguíneas nucleadas (linfocitos) con el fin
de liberar el contenido celular al medio. Seguidamente, los extractos celulares se hacen
pasar, mediante centrifugación, por las columnas específicas que capturan el DNA o RNA.
Una vez adheridos a la superficie de estas columnas, se llevan a cabo diversos pasos de
lavado para eliminar el resto de sustancias no deseadas. Finalmente, se lleva a cabo la
elución de la columna del DNA o RNA y su recogida para posteriores procesos analíticos.

8.2.2 Métodos para detectar mutaciones en el ADN

En todos ellos el DNA que se va a analizar es primero amplificado mediante la reacción

en cadena de la DNA polimerasa (PCR), que a su vez ya es un método de detección si la
mutación afecta al tamaño del fragmento (inserción o deleción).
Figura 3: métodos de secuenciación

Reacción en cadena de la polimerasa

Utilizando la reacción en cadena de la DNA polimerasa podemos obtener cantidades

adecuadas de un fragmento de DNA para poder analizarlo. Este procedimiento ha
revolucionado el diagnóstico molecular ya que, partiendo de una cantidad pequeña de
DNA genómico del paciente, podemos amplificar distintas partes de genes en un par de
horas. Primero tenemos que sintetizar un par de cebadores (oligonucleótidos de 15-25
nucleótidos) que reconocen los extremos del fragmento que queremos amplificar. Luego
tenemos que favorecer que ocurra la síntesis de DNA. Para ello, lo primero que debemos
hacer es facilitar la separación de las cadenas (desnaturalización) del DNA molde. A
continuación, permitir el apareamiento de los cebadores a su región complementaria en
el DNA molde y, por último, facilitar que una DNA polimerasa resistente a altas
temperaturas (como la DNA polimerasa Taq) lleve a cabo la síntesis (extensión) de DNA
a partir de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos (dATP, dGTP, dTTP y dCTP). Estos
tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces permite obtener,
como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del fragmento de
interés. Todo esto se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción se
introducen en un termociclador que de forma automática realiza los 40 ciclos de
amplificación.
Figura 4:Reacción en cadena de polimerasa

Secuenciación del DNA

La secuenciación del DNA consiste en determinar el orden exacto de los nucleótidos

(bases, G, A, T y C) a lo largo de un segmento de DNA. De esta secuencia se deduce la
secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. El método que más básico es el de
Sanger de síntesis de DNA. El DNA que se va a secuenciar se desnaturaliza y se mezcla
con un cebador (complementario a un sitio en una de las hebras), polimerasa de DNA y
los cuatro nucleótidos (dNTPs). También se añaden pequeñas cantidades de los cuatro
terminadores de la síntesis (ddNTPs) marcados cada uno con un fluoróforo distinto. Cada
vez que uno de ellos se incorpora previene la incorporación de otros nucleótidos a la
cadena. De esa manera se genera un conjunto de fragmentos de DNA marcados con
fluorescencia que difieren en tamaño solo en un nucleótido. Los fragmentos se separan
mediante electroforesis en un capilar de un analizador automático. Cuando los fragmentos
van migrando por el capilar pasan por un rayo láser que los hace fluorescer. Un detector
de fluorescencia graba el orden del color de las bandas que luego se traduce en la
secuencia. Finalmente, la secuencia de los fragmentos del gen de pacientes se compara
con la secuencia normal para determinar la presencia de mutaciones.
Figura 5: Secuenciación de ADN, método sanger

Micromatrices de oligonucleótidos

Las micromatrices (“microarrays”) permiten el análisis en paralelo de más de cien mil

biomoléculas en volúmenes de reacción muy pequeños. Una de sus aplicaciones es la
detección de mutaciones causantes de enfermedad o mutaciones que predisponen a
enfermedad para diagnóstico. Sobre la superficie de una placa de cristal se sintetizan en
un orden determinado miles de oligonucleótidos (fragmentos cortos de DNA, 20-50
nucleótidos) que contienen todas las mutaciones conocidas de un gen o todas las
variaciones posibles en la región codificante del gen. El DNA de los pacientes y controles
sanos se amplifica y se marca con fluorescencia utilizando PCR, y luego se añade a la
micromatriz. La fluorescencia en una posición determinada indica que el DNA se ha unido
al oligonucleótido.
 Figura 6: Three basic types of microarrays: (A) Spotted arrays on glass, (B) self assembled arrays and (C) in-
situ synthesized arrays.

8.2.3 Métodos para detectar mutaciones en el ARN

Transcripción inversa seguida de amplificación por PCR (RT-PCR)

La presencia de mutaciones puede también detectarse en el RNA de los pacientes. Una

vez aislado este RNA de sangre u otros tejidos, se emplea la técnica de transcripción
inversa seguida de amplificación mediante PCR. Posteriormente, los productos de la
reacción son analizados mediante secuenciación de DNA para determinar si existen
mutaciones en la región codificante del gen. La transcripción inversa utiliza el mRNA como
molde para sintetizar una hebra de DNA complementaria (denominada cDNA). Dicha
molécula es idéntica a la hebra de DNA del correspondiente gen pero carente de los
intrones presentes en el DNA genómico. Seguidamente, se usa el cDNA como molde para
una PCR convencional. Mediante esta técnica, se pueden distinguir alteraciones en el
procesamiento de RNA durante su maduración, presencia de tránscritos alternativos del
gen, etc.

Sistemas de minigenes

La manera idónea de determinar el verdadero efecto de una mutación causante de

enfermedad sobre el procesamiento del pre-RNA mensajero es el análisis directo del RNA
procedente de tejido del individuo afectado mediante RT-PCR. Sin embargo, no siempre
es posible obtener la muestra de tejido y su RNA correspondiente. La solución en estos
casos es construir en un vector plasmídico parte de un gen con algunos de sus exones e
 intrones (sistemas de minigenes). Estos minigenes se introducen en líneas celulares,
donde se expresarán de manera transitoria. El RNA procedente de cultivos celulares es
extraído y analizado mediante RT-PCR. La comparación de los patrones de splicing
resultantes de un minigén con la secuencia normal del exón de interés con el de un
minigén portador de la secuencia exónica mutada permitirá detectar el efecto de esta
mutación a nivel del procesamiento del pre-RNA mensajero.

8.3 Limitaciones del diagnóstico molecular

Una de las grandes limitaciones del diagnóstico molecular es el costo de los test utilizados.
De forma general, estos test superan los valores de los ensayos comúnmente utilizados
en clínica para el mismo propósito y en la mayoría de ellos no es posible obtener un
reembolso por compañías aseguradoras, siendo el paciente el responsable de costear
estos exámenes. Esta situación se ve mayormente reflejada en los hospitales públicos,
donde no existe un presupuesto que contemple la implementación de técnicas
moleculares. Sin embargo, esta situación ha cambiado en los últimos años, la
competencia de mercado y el desarrollo de plataformas más económicas, ha impulsado
la implementación de laboratorios de biología molecular tanto en centros privados como
público (Farfán, 2015).

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