Caracterización del proteoma del veneno de Ovophis Monticola

para la futura elaboración de anticuerpos específicos

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Jesús Eduardo Flores Bustos
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Universidad Politécnica de la Zona metropolitana de Guadalajara, carretera Tlajomulco-santa fe Km 3.5 #595, C.P.
45640, Tlajomulco de Zúñiga, Jalisco, México.
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Jesús Eduardo Flores Bustos, eduardo97fb@gmail.com

Introducción
Las mordeduras de serpiente en el mundo representan un severo problema de salud
pública, afectando principalmente a la población rurales dada la cercanía a los hábitats de
estos animales (Gutiérrez 1995), aunado a esto existen regiones en las cuales no se cuenta
con laboratorios clínicos dedicados a la elaboración de antídotos, lo que agrava más el
problema, la Organización Mundial de la Salud (OMS) considera las mordeduras por ofidios
un problema de salud pública desatendida.
Los venenos son una toxina sumamente impresionante por su complejidad, están
compuesto por varias familias de proteínas las cuales se encargan de los efectos
neurológicos y enzimas que cumplen las funciones digestivas, así como muchos otros
compuestos de bajo peso molecular; este se genera y almacena en unas glándulas salivales
que poseen los ofidios venenosos y es inyectado por medio de dos grandes colmillos huecos.
El cuadro clínico que presenta el individuo en respuesta a la mordedura de Ovophis
Monticola se caracteriza por severos casos de parálisis, necrosis tisular, hemorragias y
respuestas neurológicas, posterior a esto se presentan choques cardiovasculares y
respiratorios que desencadenan la muerte.

El propósito de este trabajo es realizar vía técnicas proteómicas la caracterización de todo

el perfil proteico que constituye el veneno de la serpiente Ovophis Monticola, así como la
determinación de la abundancia relativa de las mismas, con la finalidad de identificar por
completo todos los grupos proteicos que intervienen/desencadenan toda la sintomatología
del envenenamiento de manera que apoyados de herramientas bioinformáticas podamos
desarrollar anticuerpos específicos para estas toxinas, así como contribuir en el estudio y
desarrollo de una gama más amplia de antivenenos polivalentes, logrando así, disminuir
en gran medida el número de defunciones ocasionadas por las mordeduras de ofidios.
Marco Teórico

Ofidios y su situación actual como problema de salud publica

Las serpientes u ofidios son organismos pertenecientes a los saurópsidos, muy

reconocibles por su anatomía carente de extremidades, así como poseer un esqueleto en
extremo flexible el cual les facilita desplazarse por diversos entornos, por ello no resulta
extraño encontrarlos en una gran variedad de ecosistemas, se trata de reptiles
completamente carnívoros que se alimentan principalmente de roedores, aves y otros
mamíferos pequeños así como diversa variedad de reptiles, están diseñados con una serie
de ventajas que les permiten cazar, convirtiéndose así en grandes depredadores, para
realizar esta acción algunas serpientes pueden poseer la capacidad de percibir el calor
mediante unas fosetas termoreceptoras localizadas entre los ojos y los orificios nasales,
otras cuenta con un tamaño y fuerza descomunal para estrangular a sus presas, sin
embargo las más reconocidas resaltan por tener la capacidad de inocular un veneno
altamente peligroso.
En América latina se cuenta con una gran variedad de especies de serpiente venosas, sin
embargo, una gran parte de los envenenamientos ofídicos son causados por especies de la
familia Viperidae (Guiterrez, 2002), más específicamente la subfamilia crotalinea, la cual
también está presente en algunas regiones del continente asiático, por lo que esta misma
problemática se ve reflejada en gran parte del territorio asiático.

El veneno de estos ofidios está comenzando a ser un verdadero problema de salud pública
en muchos países debido a que se está comenzando a entrar en contacto más
frecuentemente con estos organismos y Asia no es la excepción; Según la Organización
Mundial de la Salud las mordeduras de serpiente causan aproximadamente entre 81,000
y 138,000 muertes al año, y alrededor del triple de casos de amputación y discapacidad
permanente y la mayoría de los casos se producen en África, Asia y Latinoamérica (OMS,
2017), en Asia hay hasta 2 millones anuales de personas envenenadas por mordeduras de
serpiente, mientras que en África se calcula que cada año hay 435,000 a 580,000
mordeduras que necesitan tratamiento (OMS 2018). Esta problemática se ve agravada
como resultado de la poca existencia de centros dedicados al desarrollo de antídotos de
calidad, la complejidad de los venenos y la extenuante tarea que resulta la elaboración de
antídotos específicos

veneno de serpiente

El veneno de las serpientes es un líquido viscoso de color amarillento o transparente. Se

trata, básicamente, de un tipo de saliva químicamente muy compleja con gran variedad de
actividades enzimáticas y farmacológicas, y se considera como una de las secreciones
orales más complejas de los vertebrados (cartujano. Et al. 2008), se usan principalmente
para atacar, contiene componentes diseñados para inmovilizar presas y facilitar su
digestión; más del 95% del peso seco de la mayoría de los venenos son polipéptidos que
incluye enzimas, toxinas y pequeños péptidos, siendo cada uno capaz de modular la
respuesta fisiológica de animales envenenados (Karalliedde. 1995),

La proteómica como campo de estudio independiente ha repercutido impresionantemente

en una gran cantidad de estudios, en el caso de los venenos ofídicos, se han utilizado una
gran cantidad de las herramientas proteómicas disponibles para la dilucidación de mezclas
proteicas extremadamente complejas como lo son los venenos de serpiente.

La comprensión de los diversos mecanismos de defensa de los organismos vivos nos

permite utilizarlos como una herramienta clínica para salvar vidas, ejemplificando lo
anterior, los anticuerpos son implementados como sistemas encargados de la
eliminación/inactivación de las toxinas inyectadas debido a la mordedura de una serpiente.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son proteínas que ayudan a eliminar elementos

extraños que ingresan al organismo, tales como bacterias, toxinas, virus o parásitos, entre
otros. En general, las moléculas que son reconocidas por los anticuerpos se denominan
antígenos. Un antígeno puede tener varios sitios a los cuales se puede unir un anticuerpo.
Cada uno de esos sitios es conocido como un epítope. (Baltazar Becerril Luján, 2014).
Área de estudio:

El trabajo se llevó acabo en los laboratorios de biotecnología de la Universidad

Politécnica de la Zona Metropolitana de Guadalajara, situada en carretera Tlajomulco-
santa fe Km 3.5 #595, C.P. 45640, Tlajomulco de Zúñiga, Jalisco, México.

Materiales y métodos

El veneno de serpiente es recolectado en centros especializados, obtenido de serpientes en

edad madura, es almacenado y enviado en un estado liofilizado a -10oC, una vez se cuenta
con el veneno en el laboratorio este debe ser resuspendido para su implementación, se
recomienda utilizar el buffer PBS (phosphate buffer solution) o agua desionizada/agua
MilliQ, realizar una centrifugación para eliminación de material insoluble. Debemos tener
en cuenta que se debe contar con dos muestras independientes, una de estas muestras
será sometida a una técnica electroforética, la segunda en cambio se someterá aun RP-
HPLC

Método de lowry

Se medirán la cantidad relativa de proteínas en todo el conjunto proteómico (veneno), se

realizarán con la metodología de Lowry et, al. (1951), registrando la absorbancia a 280 nm
utilizando como estándar una albumina sérica bovina

Posterior a esto se preparará la muestra que se utilizará en el estudio electroforético, para

ello se deberá mezclar la muestra proteica con el buffer de carga, también es necesario
calentar las muestras a 99oC durante 5 minutos previos a la práctica para propiciar la
desnaturalización de las proteínas, si se desea se puede implementar algún detergente que
genere la desorganización estructural de las proteínas; de esta manera proceder a la
separación por electroforesis.
Electroforesis

La técnica electroforética utilizada será la electroforesis en 2 dimensiones, con la finalidad

de dilucidar más específicamente los diversos grupos proteicos, emplear un gel con 13%
de poliacrilamida ya que se conoce, relativamente, que la mayoría de las familias proteicas
presentes en los venenos de ofidios son pequeñas, por lo cual esta será la concentración
implementada para conseguir la mejor resolución, se utilizaran como ladders albumina
sérica bovina (66 KDa), ovoalbúmina (45 KDa) y lisozima (14.3 KDa), el gel se someterá a
una carga constante de 90 V durante aproximadamente 1 hora y 30 minutos, para la
generación de la gradiente de PH necesaria se utilizaran una mezcla de anfolitos portadores,
de esta manera al aplicar la diferencia de potencial las proteínas que se encuentran en
regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente, y migraran
hacia el cátodo; mientras que aquellas que se encuentran en regiones de pH más altos que su
punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo, la gradiente con la que
se trabajara será de Ph 2 a 9, para la revelación del gel utilizaremos una tinción con plata, la
cual nos brindara un mejor poder de resolución/sensibilidad.

RP-HPLC/HIC (cromatografía liquida de fase reversa)

Se generará una mezcla entre las proteínas previamente resuspendidas con ácido
trifluroacetico (fase A), la fase móvil implementada deberá ser un compuesto acuoso polar,
se agregará a la fase móvil el solvente acetonitrilo (fase B), el cual aumentará gradualmente
su concentración según avance el proceso, todos estos reactivos serán inyectados por el
equipo en una Columna c18 (Grace Vydac”C18, 50 x 4.5 mm, Hesperia, CA, U.S.A.).

Espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray en

acoplamiento a cromatografía liquida

Como su nombre lo indica realizaremos un proceso de espectrofotometría ligado al equipo

para el análisis cromatográfico, se ha demostrado que la ionización por electrospray es
eficaz en conjunto con la cromatografía liquida debido a que se cuenta con un volumen
adecuado de muestra como resultante del proceso anterior; para la ionización se generará
una nebulización neumática (4kV) del analito la cual nos permitirá eliminar el solvente
(por evaporación) y generar iones simples y puros del analito mediante la repulsión
columbica, posteriormente pasan al análisis de masas; el análisis de masas a realizar será
espectrometría en tándem ya que nos conferirá una comprensión estructural del
compuesto, además resulta ser una de las más eficaces para la caracterización de mezclas
complejas, se utilizara el software X!Tamdem (Copyright © 2004-2013, The Global Proteome Machine
Organization) para la interpretación de resultados.

Western blot

Opción 1

Las proteínas provenientes de la electroforesis serán transferidas a un gel PVDF

(polifloruro de vinilideno) mediante electrotransferencia a 100 V, en condiciones de pH
neutro, el bloqueo se realizara con leche en polvo (también es recomendable la
implementación de albumina sérica bovina) y tween 20, en un buffer PBS, debe dejarse
reposar durante 2 horas a temperatura ambiente, se agregara el anticuerpo principal, este
será uno monoclonado generado en cultivo celular de linfocitos B recuperados de Medula
ósea de cabra, reposara nuevamente por un periodo de 1 hora, la elución del anticuerpo
principal será con buffer PBS (realizar varios enjuagues para eliminar los restos), como
anticuerpo secundario se utilizara anti-Goat IgG (H+L) Superclonal™ Secondary Antibody,
Alexa Fluor 594 expresada en linfocitos B de conejo (Thermo Fisher scientific)

Opción 2

Las proteínas provenientes de la electroforesis serán transferidas a un gel PVDF

(polifloruro de vinilideno) mediante electrotransferencia a 100 V, en condiciones de pH
neutro, el bloqueo se realizara con leche en polvo (también es recomendable la
implementación de albumina sérica bovina) y tween 20 en buffer PBS, debe dejarse reposar
durante 2 horas a temperatura ambiente, los anticuerpos primarios y secundarios serán
adquiridos de Thermo Fisher scientific, el anticuerpo secundario será anti-Goat IgG (H+L)
Superclonal™ Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 expresada en conejo, y los anticuerpos
primarios serán determinados de acuerdo a los resultados de la espectrometría de masas,
pero conservando la característica de ser un anticuerpo monoclonado proveniente de cabra.
Discusiones y resultados esperados

La caracterización del veneno de Ovophis Monticola mediante esta metodología nos

permitirá conocer en su totalidad la composición proteica, así como las características del
veneno producido por esta especie de ofidio; identificando así de una manera
completamente eficiente y especifica las familias proteicas que se ven involucradas en la
mordedura de esta serpiente, esto permitirá inferir los cuadros clínicos a los que esta
asociada cada una de estas proteínas, someter las proteínas a una electroforesis
bidimensional nos otorgara información no solo para reconocer y nombrar la proteína
presente sino que nos permitirá recuperar datos de relevancia como lo son la masa
molecular de cada compuesto proteico, su punto isoeléctrico, las similitudes y diferencias
entre las proteínas más allá de sus funciones y su comportamiento bajo un campo eléctrico,
además la prueba de Lowry et.al 1993 nos indicara la cantidad relativa de proteína
implicada en la mordedura de la serpiente.

Este tipo de análisis en adición a la generación de conocimiento sobre estos organismos

son capaces de abrir paso a trabajos en los que se puedan desarrollar antivenenos
ayudados con diversas herramientas, más concretamente herramientas bioinformáticas
los cuales están comenzando a demostrar ser las más ideales para la producción de estos
antídotos, presentando una eficacia y especificidad mucho mayor que las técnicas
convencionales, lo cual permite disminuir en gran medida las defunciones y/o lesiones
permanentes que se generan tras una mordedura ofídica. A su vez los resultados
presentados al finalizar esta práctica también pueden ser recuperables para la realización
de estudios comparativos que busquen la generación de antivenenos polivalentes los
cuales son de alta eficiencia y versatilidad, sobre todo en casos de emergencia. Fuera del
aspecto de salud pública la información recabada permitirá dilucidar las principales
diferencias proteicas generas a partir de la distribución geográfica de esta especie con el
resto de ofidios de los cuales se tenga un registro proteico identificado.
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