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Guiamediosdecultivo PDF
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Preámbulo
Este proyecto de norma se estudió a través del Comité Técnico Microbiología de los
alimentos, para proporcionar la terminología general relativa al aseguramiento de la calidad
para la preparación de los medios de cultivo, y especificar los requisitos mínimos de
aplicación en los análisis microbiológicos de productos destinados al consumo humano o
animal.
Para los propósitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales
que se indican y justifican en Anexo E.
I
NCh3162
En Anexo E se incluye una lista completa de las desviaciones técnicas, junto con su
justificación.
Este proyecto de norma NCh3162 ha sido preparado por la División de Normas del
Instituto Nacional de Normalización.
II
NCh3162
Contenido
Página
Preámbulo I
0 Introducción 1
2 Referencias normativas 2
3 Términos y definiciones 3
3.1 Generalidades 3
4.1 Documentación 7
4.2 Almacenamiento 7
III
NCh3162
Contenido
Página
Anexos
A.1 Generalidades 16
A.2 Peptonas 16
A.3 Extractos 16
A.4 Agar 17
A.5 Otros 17
B.1 Generalidades 18
IV
NCh3162
Contenido
Página
Figuras
Figura B.1 19
Tablas
V
Vencimiento consulta pública: 2008.06.27
0 Introducción
Estos tres criterios son una parte esencial de los procedimientos de control interno de
calidad y, con la documentación adecuada, permitirán una supervisión eficaz de los
medios de cultivo y contribuirán a la obtención de los datos precisos y fiables.
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NCh3162
Estos requisitos son aplicables a tres categorías de medios de cultivo empleados en los
laboratorios que preparan y/o utilizan medios de cultivo para realizar sus análisis
microbiológicos:
2 Referencias normativas
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NCh3162
3 Términos y definiciones
Para los propósitos de esta norma, se aplican los términos y definiciones siguientes:
3.1 Generalidades
[NCh-ISO 9000]
[NCh-ISO 9000]
3.2.4 lote de los medios de cultivo: unidad que permite una trazabilidad completa referida
a una cantidad definida de producto a granel, producto semiterminado o producto final,
que es coherente en tipo y calidad, y ha cumplido los requisitos de los ensayos de
producción (control durante el proceso) y de garantía de la calidad, y que ha sido
producido durante un período de producción definido al que se le ha asignado el mismo
número de lote
[EN 12322]
NOTA - Cuando se utiliza formando parte de palabras compuetas, este término se abrevia a menudo con la
palabra medio (por ejemplo, medio de enriquecimiento).
[EN 1659]
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NCh3162
3.3.2 Medios de cultivo clasificados según su composición
[EN 1659]
NOTA - Para los diversos componentes no definidos químicamente empleados en los medios de cultivo, el
ISO/TC 34/SC 9 ha establecido una lista armonizada de denominaciones, ver Anexo A.
3.3.3.1 medio de cultivo íquido: medio de cultivo que consiste en una solución acuosa de
uno o más constituyentes (por ejemplo, agua de peptona, caldo nutritivo)
NOTAS
[EN 1659]
3.3.3.2 medio de cultivo sólido y medio de cultivo semisólido: medio de cultivo líquido
que contiene materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar, gelatina, etc.) en diferentes
concentraciones
NOTAS
1) Debido a la utilización mundialmente extendida de los medios de cultivo solidificados con agar-agar, se
utiliza el término abreviado agar de forma sinónima para medios de cultivo sólidos y por lo tanto formando
parte de otros términos (por ejemplo, agar para recuento en placa).
2) Los medios de cultivo sólidos vertidos en placas de Petri se llaman comúnmente placas. Los medios de
cultivo sólidos vertidos en tubos que se mantienen en posiciones inclinadas mientras se solidifican se
denominan a menudo agares inclinados.
[EN 1659]
[EN 1659]
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NCh3162
[EN 1659]
[EN 1659]
[EN 1659]
[EN 1659]
[EN 1659]
3.3.4.6 medio diferencial: medio de cultivo que permite el estudio de una o más
características fisiológicas/bioquímicas de los microorganismo para su identificación
(por ejemplo, medio de urea, agar de Kligler)
NOTA - Los medios diferenciales que se pueden utilizar como medios de aislamiento se denominan medios de
aislamiento/diferencial [por ejemplo, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)].
[EN 1659]
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NCh3162
3.3.4.7 medio de identificación: medio de cultivo diseñado para producir una reacción de
identificación específica que no precisa ningún análisis posterior de confirmación
NOTA - Los medios de identificación que se pueden emplear como medio de aislamiento se denominan medios
de aislamiento/identificación.
[EN 1659]
3.3.4.8 medios para usos múltiples: ciertos medios de cultivo se pueden asignar a varias
categorías, por ejemplo, el agar-sangre es un medio de revivificación según 3.3.4.3, un
medio de aislamiento según 3.3.4.5, y un medio diferencial según 3.3.4.6, utilizado para
la detección de hemólisis
3.3.5.1 medio listo para su empleo: medio de cultivo que se suministra en recipientes bajo
la forma de producto listo para su empleo (por ejemplo, placas de Petri, tubos u otros
recipientes)
[EN 12322]
3.4.3 cepa de reserva de referencia: lote de cultivos obtenido en el laboratorio por una
sola propagación a partir de una cepa de referencia, ya sea en el laboratorio o desde un
proveedor
[EN 12322]
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4.1 Documentación
- número de lote;
- ficha técnica;
- fecha de recepción;
- fecha de caducidad;
4.2 Almacenamiento
4.2.1 Generalidades
En todos los casos se seguirán las instrucciones del fabricante, cuando existan, en lo
referente a condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso.
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NCh3162
La calidad del medio puede depender del ambiente del almacenamiento, especialmente
después de abrir un nuevo recipiente. La pérdida de la calidad de los medios deshidratados
se manifiesta por un cambio en las características de flujo del polvo, homogeneidad,
apelmazamiento, cambios de color, etc. Se debería desechar todo medio deshidratado que
haya absorbido humedad o muestre signos manifiestos de cambio en la apariencia física.
Los medios de cultivo esterilizados dispensados en placas, tubos o frascos y los reactivos
que no vayan a ser utilizados inmediatamente deben ser protegidos de la luz y de la
desecación.
A menos que se haya establecido una fecha de caducidad validada o esté especificado en
la norma en cuestión, los medios parcialmente completos estériles, es decir los medios a
los cuales los componentes finales se añaden inmediatamente antes de su uso, se deben
mantener en refrigerador como máximo tres meses y un mes como máximo a temperatura
ambiente, en condiciones que eviten toda modificación de su composición. Sin embargo,
se recomienda que los medios a los que se les ha añadido suplementos selectivos lábiles
sean usados en el mismo día de su preparación. No es conveniente que los medios sólidos
que contengan reactivos químicos y/o sustancias lábiles se almacenen en masa para
refundirlos posteriormente.
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NCh3162
4.3.1 Generalidades
Se han de respetar las buenas prácticas de laboratorio y las instrucciones del fabricante
respecto a la manipulación de los medios deshidratados y otros componentes,
particularmente aquellos que contengan materiales peligrosos, es decir sales biliares u
otros agentes selectivos.
4.3.2 Agua
El agua utilizada debe ser destilada o agua de calidad equivalente, es decir libre de
sustancias que puedan inhibir o influir en el crecimiento de los microorganismos en las
condiciones de análisis. Si el agua destilada se prepara a partir de agua clorada, neutralizar
el cloro antes de la destilación.
NOTA - En algunos casos puede ser necesario usar agua recién preparada, libre de dióxido de carbono disuelto.
Para que el agua destilada se pueda considerar de buena calidad, debe tener una
resistividad de al menos 300 000 Ωcm.
ADVERTENCIA: El agua procesada a través de un intercambiador de iones (desionizada) puede tener un alto
contenido en microorganismos; es por ello recomendable no utilizar este tipo de agua sin haber verificado
antes que el contenido de microorganismos en el agua es bajo. Es conveniente consultar al fabricante sobre la
mejor manera de minimizar la contaminación microbiana. El agua desionizada muy contaminada que haya sido
esterilizada por filtración, puede todavía contener sustancias inhibidoras para el crecimiento de algunos
microorganismos.
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NCh3162
Los medios deshidratados necesitan para su disolución una dispersión rápida mediante
una agitación inmediata y repetida, seguida por calentamiento si es necesario. Para la
disolución de los medios que contengan agar, es conveniente dejarlos a remojo durante
varios minutos antes de calentarlos con agitación para disolverlos. Para los medios
preparados a partir de sus componentes individuales, cada componente se debería añadir
separadamente y dejarlo disolver antes de completar el volumen final.
NOTA - Los medios de cultivo comerciales pueden mostrar cambios significativos de pH antes y después de
ser sometidos al autoclave. Sin embargo, siempre que se use agua destilada o desionizada de buena calidad, el
ajuste del pH antes de introducir en el autoclave no debería ser necesario.
4.3.6 Dispensación
4.3.7 Esterilización
4.3.7.1 Generalidades
Ciertos medios no necesitan esterilización por autoclave sino que se pueden utilizar
después de haber sido llevados a ebullición. Por ejemplo, medios para Enterobacteriaceae
que contienen verde brillante son particularmente sensibles al calor y a la luz y deberían
ser enfriados rápidamente después de la ebullición y protegidos de la luz intensa.
Igualmente algunos reactivos se pueden usar sin esterilización (referirse a la norma
apropiada o a las instrucciones del fabricante).
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4.3.7.2 Esterilización mediante calor húmedo
Después del calentamiento del medio, es esencial enfriarlo de manera que se evite que se
desborde. Esto es particularmente importante en los medios sensibles como por ejemplo, para
las Enterobacteriaceae y para los medios en grandes volúmenes.
La esterilización por filtración se puede realizar por vacío o por presión. Se usan
membranas o filtros con un diámetro de poro de 0,22 µm. Deben haber sido esterilizados
en el autoclave. Para el empleo de filtros o membranas que se hayan adquirido estériles,
referirse a las instrucciones del fabricante. Los diferentes elementos de los aparatos de
filtración, montados o no, deben ser esterilizados en el autoclave durante 15 min
a 121ºC. Si es necesario, el montaje aséptico se puede realizar en una cámara de flujo
laminar después de ser sometidos al autoclave.
NOTA - Algunos filtros de membrana pueden retener proteínas (como los antibióticos). A fin de obtener la
concentración adecuada, el usuario debería humedecer previamente el filtro.
4.3.7.4 Monitoreo
Los suplementos termolábiles se deberían añadir al medio después de que éste haya sido
enfriado a 47ºC ± 2ºC. Los suplementos estériles se deben estabilizar a temperatura
ambiente antes de añadirlos al medio de agar. Los líquidos fríos pueden hacer que el agar
se solidifique o que se formen copos transparentes. Se mezclan con precaución y
completamente todos los suplementos con el medio y después se transfiere a los
recipientes finales lo más rápidamente posible.
Se vierte el medio de cultivo de agar fundido en placas de Petri de manera que se obtenga
un espesor de al menos 2 mm (por ejemplo, para placas de 90 mm de diámetro, se
necesitan normalmente 15 ml de agar). Se deja el agar solidificar y enfriar situando las
placas de Petri, con las tapas en su lugar, en una superficie fresca y horizontal.
NOTA - Durante la incubación se produce una pérdida de humedad del medio de agar. Una pérdida mayor
que 15% del contenido en agua puede en algunas circunstancias afectar adversamente al crecimiento de
microorganismos. Los factores que influyen en la pérdida de agua son la composición del medio, la cantidad de
medio en las placas, el tipo de estufa de incubación (es decir, con ventilación o de otro tipo), humedad de la
atmósfera en la estufa de incubación, la posición y el número de placas en la estufa de incubación y la
temperatura de incubación.
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4.4.5 Incubación
Apilar las placas en número no mayor a seis unidades y dejar espacio para que circule el
aire, de tal forma que el medio de cultivo se equilibre con la temperatura de incubación lo
más rápidamente posible. En el caso de medios líquidos, el tiempo para alcanzar la
temperatura de incubación depende de varios factores, por ejemplo, el volumen, la carga,
el recipiente, el tipo de estufa. Si se utilizan jarras de anaerobios puede ser necesario
apilar más de seis placas.
Tanto los medios contaminados como los no utilizados deben ser eliminados de una
manera que sea segura y que cumpla las reglamentaciones locales o nacionales.
y mediante observación:
- color;
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5.2.1 Contaminación
Una cantidad apropiada de cada lote debería ser analizada para verificar la ausencia de
contaminación.
- cepas positivas que crecen débilmente (es decir de una naturaleza más sensible);
NOTA - El grupo de trabajo sobre medios de cultivo (WPCM) del International Committee for Food Microbiolgoy
and Hygiene ha recomendado una colección validada de cepas de control para la evaluación de los medios
(ver Anexo D, [1]).
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Para los propósitos de esta norma, las exigencias mínimas son unas pruebas cualitativas
para cada lote del medio preparado, pero cuando se van a realizar exámenes cuantitativos
de muestras, las pruebas cuantitativas de cada lote darán una mayor seguridad de la
calidad de los medios. Para aquellos medios que no contienen indicadores o agentes
selectivos, es suficiente el uso de una sola cepa de control positiva. Para aquellos medios
que contienen indicadores o agentes selectivos, se deben utilizar cepas que demuestren la
función del (de los) indicador(es) y la selectividad. Para los medios complejos, es decir con
suplementos adicionados, cada lote se debería verificar con cepas con las características
indicadas en 5.2.2. Lo mismo se aplica al caso de los medios listos para su uso a los
cuales se han adicionado suplementos preparados en el laboratorio.
NOTA - Estas son directrices mínimas, pero en la práctica los alimentos pueden contener microorganismos
lesionados. Se debería tener en cuenta la capacidad del medio respecto a la recuperación de las células
lesionadas. Para información sobre las técnicas de conservación, mantenimiento y sobre las colecciones de
cultivos de referencia, ver Anexo B.
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Anexo A
(Informativo)
A.1 Generalidades
A.2 Peptonas
A.3 Extractos
- extracto de carne;
- extracto de cerebro-corazón;
- extracto de levadura;
- sales biliares;
- sales biliares N° 3.
A.4 Agar
- agar bacteriológico.
A.5 Otros
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Anexo B
(Informativo)
B.1 Generalidades
Los cultivos de reserva de cepas de referencia (ver cláusula B.2) para el control de calidad
y para ensayos de rendimiento, se deben mantener y manipular de manera que se reduzca
al mínimo la posibilidad de contaminación cruzada, mutación o alteración de las
características típicas. Las reservas de cepas de referencia se deberían almacenar en
múltiples alícuotas ya sea ultracongeladas (-70°C) o liofilizadas. Se debería documentar
exhaustivamente las características de crecimiento para cada uno de los medios sobre/en
los que serán utilizadas como cepas de control.
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NOTA - No se deberían realizar subcultivos a partir de cultivos de trabajo. Sin embargo, los cultivos de trabajo
se puede utilizar más de una vez, siempre que sean manipulados y conservados adecuadamente, es decir
evitando las contaminaciones cruzadas y/o su deterioro, y nunca durante más de una semana.
Figura B.1
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Anexo C
(Informativo)
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Anexo D
(Informativo)
Bibliografía
[1] Culture media for Food Microbiology - Progress in Industrial Microbiology, Vol. 34
(1995). Eds. Corry J.E.L., Curtis, G.D.W. and Baird, R.M. Elsevier, Amsterdam.
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Anexo E
(Informativo)
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